UA76731C2 - Штам mva-bn модифікованого вірусу коров'ячої віспи ankara, фармацевтична композиція, вакцина, застосування mva-bn для приготування лікарського препарату та для приготування вакцини, спосіб введення гомологічної і/або гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в клітини-мішені in vitro, спосіб одержання пептиду або білка, спосіб одержання mva-bn, клітина, набір для основної/бустерної імунізації - Google Patents

Abstract

У даному винаході пропонують ослаблений вірус, що походить від модифікованого вірусу коров'ячої віспи Ankara і який характеризується втратою здатності до репродукції шляхом реплікації в клітинних лініях людини. Крім того, описані рекомбінантні віруси, що походять від даного вірусу, і застосування вірусу або його рекомбінантних варіантів як ліків або вакцин. Додатково пропонують спосіб індукції імунної відповіді навіть у хворих із порушеним імунітетом, у хворих із природно існуючим імунітетом до вірусу або у хворих у процесі проведення противірусної терапії.

Description

12. МУМА-ВМ або його похідна за п.11, де віспа лю- 37. Композиція за п.36, де віспа людини являє со- дини являє собою натуральну віспу. бою натуральну віспу. 13. ММА-ВМ або його похідна за будь-яким з пп.10- 38. Композиція за будь-яким з пп.34-37, де твари- 12, де тварина, включаючи людину, має поруше- на, включаючи людину, має порушений імунітет. ний імунітет. 39. Композиція за будь-яким з пп.34-38, де твари- 14. МУА-ВМ або його похідна за будь-яким з пп.10- на, включаючи людину, має вже існуючий імунітет 13, де тварина, включаючи людину, має вже існу- до вірусів віспи. ючий імунітет до вірусів віспи. 40. Композиція за будь-яким з пп.34-39, де твари- 15. ММА-ВМ або його похідна за будь-яким з пп.10- на, включаючи людину, піддається противірусній 14, де тварина, включаючи людину, піддається терапії. противірусній терапії. 41. Композиція за п.40, де противірусна терапія 16. ММА-ВМ або його похідна за п.15, де противі- являє собою терапію проти ретровірусів. русна терапія являє собою терапію проти ретрові- 42. Вакцина, що містить ММА-ВМ або його похідну русів. за будь-яким з пп.1-9. 17. Геном ММА-ВМ або його похідна за будь-яким з 43. Вакцина за п.42, яка містить принаймні 102 пп.1-9. ТСІО5о ММУА-ВМ або його похідної. 18. Геном за п.17 для впливу на імунну відповідь, 44. Вакцина за будь-яким з пп.42 або 43 для впли- переважно її індукцію, у живій тварині, включаючи ву на імунну відповідь, переважно її індукцію, в людину. живій тварині, включаючи людину. 19. Геном за п.17 для вакцинації живої тварини, 45. Вакцина за будь-яким з пп.42-44 для вакцинації включаючи людину, проти віспи людини. живої тварини, включаючи людину, проти віспи 20. Геном за п.19, який відрізняється тим, що людини. віспа людини являє собою натуральну віспу. 46. Вакцина за п.45, де віспа людини являє собою 21. Геном за будь-яким з пп.17-20, де тварина, натуральну віспу. включаючи людину, має порушений імунітет. 47. Вакцина за будь-яким з пп.42-46, де тварина, 22. Геном за будь-яким з пп.17-21, де тварина, включаючи людину, має порушений імунітет. включаючи людину, має вже існуючий імунітет 48. Вакцина за будь-яким з пп.42-47, де тварина, стосовно вірусів віспи. включаючи людину, має вже існуючий імунітет до 23. Геном за будь-яким з пп.17-22, де тварина, вірусів віспи. включаючи людину, піддається противірусній те- 49. Вакцина за будь-яким з пп.42-48, де тварина, рапії. включаючи людину, піддається противірусній те- 24. Геном за п.23, де противірусна терапія являє рапії. собою терапію проти ретровірусів. 50. Вакцина за п.49, де противірусна терапія являє 25. Фармацевтична композиція, що включає ММА- собою терапію проти ретровірусів.

ВМ або його похідну за будь-яким з пп.1-9 та фар- 51. Вакцина, що містить геном за п.17. мацевтично прийнятний носій, розріджувач і/або 52. Вакцина за п.51 для впливу на імунну відпо- добавку. відь, переважно її індукцію, у живій тварині, вклю- 26. Фармацевтична композиція за п.25, яка містить чаючи людину. принаймні 102 ТСІО5о ММА-ВМ або його похідної. 53. Вакцина за будь-яким з пп.51, 52 для вакцина- 27. Композиція за п.25 або 26 для впливу на імун- ції живої тварини, включаючи людину, проти віспи ну відповідь, переважно для її індукції, в живій людини. тварині, включаючи людину. 54. Вакцина за п.53, де віспа людини являє собою 28. Композиція за пп.25-27 для вакцинації живої натуральну віспу. тварини, включаючи людину, проти віспи людини. 55. Вакцина за будь-яким з пп.51-54, де тварина, 29. Композиція за п.28, де віспа людини являє со- включаючи людину, має порушений імунітет. бою натуральну віспу. 56. Вакцина за будь-яким з пп.51-55, де тварина, 30. Композиція за будь-яким з пп.25-29, де твари- включаючи людину, має вже існуючий імунітет на, включаючи людину, має порушений імунітет. стосовно вірусів віспи. 31. Композиція за будь-яким з пп.25-30, де твари- 57. Вакцина за будь-яким з пп.51-56, де тварина, на, включаючи людину, має вже існуючий імунітет включаючи людину, піддається противірусній те- стосовно вірусів віспи. рапії. 32. Композиція за будь-яким з пп.25-31, де твари- 58. Композиція за п.57, де противірусна терапія на, включаючи людину, піддається противірусній являє собою терапію проти ретровірусів. терапії. 59. ММА-ВМ або його похідна за будь-яким з пп.6-9 33. Композиція за п.32, де противірусна терапія для введення гомологічної і/або гетерологічної являє собою терапію проти ретровірусів. послідовності нуклеїнової кислоти в клітини- 34. Фармацевтична композиція, що включає геном мішені. за п.17 та фармацевтично прийнятний носій, роз- 60. Геном за п.17 для введення гомологічної і/або ріджувач і/або добавку. гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти в 35. Композиція за п.34 для впливу на імунну відпо- клітини-мішені. відь, переважно її індукцію, в живій тварині, вклю- 61. Застосування ММА-ВМ або його похідної за чаючи людину. будь-яким з пп.1-9 для приготування лікарського 36. Композиція за будь-яким з пп.34, 35 для вакци- препарату. нації живої тварини, включаючи людину, проти 62. Застосування за п.61, де лікарський препарат віспи людини. вводять для індукування імунологічної відповіді в живій тварині, включаючи людину.

63. Застосування за будь-яким з пп.61, 62, де ліка- 82. Застосування ММА-ВМ або його похідної за рський препарат призначений проти віспи людини. будь-яким з пп.1-9 як ад'юванта. 64. Застосування за п.63, де віспа людини являє 83. Спосіб введення гомологічної і/або гетерологі- собою натуральну віспу. чної послідовності нуклеїнової кислоти в клітини- 65. Застосування за будь-яким з пп.б1-64, де ліка- мішені іп мійго, що включає інфікування клітин- рський препарат містить принаймні 102 ТСІОво мішеней ММА-ВМ або його похідною за будь-яким

МУА-ВМ або його похідної. з пп.6-9. 66. Застосування за будь-яким з пп.61-65, де ММА- 84. Спосіб введення гомологічної і/або гетерологі-

ВМ або його похідну вводять у терапевтично ефе- чної послідовності нуклеїнової кислоти в клітини- ктивних кількостях при першій інокуляції ("основна мішені іп міго, що включає трансфекцію клітини- (ргітіпд) інокуляція") і при другій інокуляції ("бу- мішені геномом за п.17. стерна інокуляція"). 85. Спосіб одержання пептиду або білка, що вклю- 67. Застосування за будь-яким з пп.6б1-66, коли чає тварина має порушений імунітет. а) інфікування клітини-хазяїна ММА-ВМ або його 68. Застосування за будь-яким з пп.б1-67, коли похідною за будь-яким з пп.1-9, тварина, включаючи людину, має вже існуючий р) культивування інфікованої клітини-хазяїна в імунітет стосовно вірусів віспи. придатних умовах, і 69. Застосування за будь-яким з пп.61-68, коли с) виділення і/або підвищення концентрації пепти- тварина, включаючи людину, піддається противі- ду та/або білка, що продукуються зазначеною клі- русній терапії. тиною-хазяїном. 70. Застосування за п.69, коли противірусна тера- 86. Спосіб одержання ММА-ВМ або його похідної, пія являє собою терапію проти ретровірусів. що включає 71. Застосування ММА-ВМ або його похідної за а) інфікування клітини-хазяїна ММА-ВМ або його будь-яким з пп.1-9 для приготування вакцини. похідною за будь-яким з пп.1-9, 72. Застосування за п.71, де вакцину вводять для р) культивування інфікованої клітини-хазяїна в індукування імунологічної відповіді в живій тварині, придатних умовах, і включаючи людину. с) виділення і/або підвищення концентрації ММА- 73. Застосування за будь-яким з пп.71, 72, де вак- ВМ або його похідної, що продукуються зазначе- цина призначена проти віспи людини. ною клітиною-хазяїном. 74. Застосування за п.73, де віспа людини являє 87. Клітина, що містить ММА-ВМ або його похідну собою натуральну віспу. за будь-яким з пп.1-9. 75. Застосування за будь-яким з пп.71-74, де вак- 88. Клітина за п.87, зокрема клітина людини. цина містить принаймні 102 ТСІОбо ММА-ВМ або 89. Клітина, що містить геном за п.17. його похідної. 90. Клітина за п.89, зокрема клітина людини. 76. Застосування за будь-яким з пп.71-75, де ММА- 91. Набір для основної/бустерної імунізації, що

ВМ або його похідну вводять у терапевтично ефе- включає ММА-ВМ або його похідну за будь-яким з ктивних кількостях при першій інокуляції (основна пп.1-9, для першої інокуляції (основна інокуляція) у інокуляція) і при другій інокуляції (бустерна іноку- першому флаконі/контейнері і для другої інокуляції ляція). (бустерна інокуляція) у другому флако- 77. Застосування за будь-яким з пп.71-76, коли ні/контейнері. тварина має порушений імунітет. 92. Набір для основної/бустерної імунізації, що 78. Застосування за будь-яким з пп.71-77, коли включає композицію за пп.25-41, для першої іно- тварина, включаючи людину, має вже існуючий куляції (основна інокуляція) у першому флако- імунітет до вірусів віспи. ні/контейнері і для другої інокуляції (бустерна іно- 79. Застосування за будь-яким з пп.71-78, коли куляція) у другому флаконі/контейнері. тварина, включаючи людину, піддається противі- 93. Набір для основної/бустерної імунізації, що русній терапії. включає вакцину за пп.42-58, для першої інокуля- 80. Застосування за п.79, коли противірусна тера- ції (основна інокуляція) у першому флако- пія являє собою терапію проти ретровірусів. ні/контейнері і для другої інокуляції (бустерна іно- 81. ММА-ВМ або його похідні за будь-яким з пп.1-9 куляція) у другому флаконі/контейнері. як ад'ювант.

У даному винаході пропонується ослаблений нітетом, хворих із природно існуючим імунітетом вірус, що походить від модифікованого вірусу ко- до вірусу вакцини або хворих у процесі проведен- ров'ячої віспи АпКага і який характеризується ня противірусної терапії. втратою здатності до своєї репродукції шляхом Модифікований вірус коров'ячої віспи АпкКага реплікації в клітинних лініях людини. У ньому до- (ММА) відноситься до вірусу коров'ячої віспи, чле- датково описуються рекомбінантні віруси, що по- ну роду Огпіпорохміги5 сімейства Рохімігідае. ММА ходять від даного вірусу, і застосування вірусу або був створений у результаті 516 серійних пасажів його рекомбінантних варіантів у якості ліків або вірусу коров'ячої віспи (СМА) в ембріональних фі- вакцини. Додатково пропонується засіб індукції бробластах курчат лінії АпКага Гу якості огляду імунної відповіді навіть у хворих із порушеним іму- дивись Мауг, А., еї аї. Іптесійоп 3, 6-14 (1975)|. Вна-

слідок даних численних пасажів отриманий вірус бливо у фібробластах ембріонів курчат (СЕР) і в

ММА загубив приблизно 31 тисячу основ своєї ге- лінії клітин нирки дитинчат хом'ячка ВПК (ЕСАСС номної послідовності і, отже, був описаний як вірус 85011433), але не здатні до репродукції шляхом із вкрай обмеженими клітинами-хазяїнами, що реплікації в клітинних лініях людини. відносяться до клітин птахів (Меуег, Н. еї аї.,». Відомі штами вірусів коров'ячої віспи здатні до

Сеп. Мігої. 72, 1031-1038 (1991)). На різноманітних репродукції шляхом реплікації в, принаймні, де- тваринних моделях було показано, що отриманий яких клітинних лініях людини, зокрема в клітинній

ММА був практично авірулентним (Мауг, А. 8 лінії кератиноцитів людини НасСаї |(Вокатр еї аї.

Оаппег, К. (1978) Оєм. Віо!. єтапа. 41:225-34|. Крім 1988, У Сеї! Віо! 106(3): 761-71). Реплікація в клі- того, даний штам ММА був протестований при клі- тинній лінії НаСаї припускає реплікацію іп мімо, нічних дослідженнях у якості вакцини для імуніза- зокрема реплікацію іп мімо у людини. Звичайно, в ції проти віспи людини ІМауг еї аї., 2рІ. Вакі. Нуд. І, розділі прикладів показано, що всі протестовані

АРІ. Ого. У 167, 375-390 (1987), ЗЙСКІ еї аї., Бівсп. відомі штами вірусу коров'ячої віспи, що виявля- теа. МУзенг. 99, 2386-2392 (1974)|. У даному дос- ють здатність до залишкового відтворення шляхом лідженні було використано більше 120000 людей, реплікації в Насаї, також реплікуються іп мімо. Та- включаючи пацієнтів із високим ризиком захворю- ким чином, винахід переважно відноситься до ві- вання, і було доведено, що в порівнянні з вакци- русів коров'ячої віспи, що не здатні до репродукції нами, що засновані на вірусі коров'ячої віспи, ММА шляхом реплікації в клітинній лінії НаСаї людини. має ослаблену вірулентність або інфекційність, Найбільш переважно винахід стосується штамів зберігаючи в той же час гарну імуногенність. вірусу коров'ячої віспи, що не здатні до репродукції

У наступні десятиріччя були створені генно- шляхом реплікації в будь-якій із таких клітинних інженерні конструкції ММА для застосування їх у ліній людини: клітинної лінії аденокарциноми ший- якості вірусного вектора для експресії рекомбінан- ки матки людини НеГа І(АТСС Мо.ССсІ -21І, лінії клі- тних генів або в якості рекомбінантної вакцини тин нирки ембріона людини 293 (ЕСАСС

ІЗинег, а. єї а). (1994), Массіпе 12:1032-401. Мо.851206021, клітинної лінії остеосаркоми кістки

У даному відношенні найбільш надзвичайним людини 1438 (ЕСАСС Мо.911125021| і клітинної лінії є те, що навіть незважаючи на те, що Мауг еї аї. у Насаї. 1970-ї роки показали, що ММА є вкрай ослабленим Характер росту або ампліфікації/реплікації ві- і авірулентним у людини і ссавців, у даний час у русу звичайно виражається відношенням кількості деяких поданих роботах |Віапаснага еї аї., 1998, у вірусів, що продукуються інфікованою клітиною

Сеп Мігої 79, 1159-1167; Сап-ої 45 Моз5, 1997, (вихід), до кількості, яка спочатку використовуєть-

Мігюіоду 238, 198-211; АнКепрегдег, патент США ся для вихідного інфікування клітин (вхід) ("амплі- 5185146; Атбгозіпі ей аЇ. 1999, У Мешговсі Нев фікаційне відношення"). Відношенням між виходом 55(5), 569| показано, що в клітинних лініях людини і входом, що дорівнює "1", визначається такий ам- і ссавців ММА не є цілком ослабленим, тому що в пліфікаційний статус, при якому кількість вірусу, даних клітинах може відбуватися залишкова реп- що продукується інфікованими клітинами, є тією ж лікація. Передбачається, що результати, які подані самою, що і кількість, що вихідно використовуєть- в даних публікаціях, отримані з різноманітними ся для інфікування клітин. Даний статус вказує на штамами ММА, тому що використані віруси істотно той факт, що інфіковані клітини є пермісивними відрізняються за своїми властивостями, особливо для вірусної інфекції і репродукції вірусу. за характером свого росту в різноманітних клітин- Ампліфікаційне відношення, що складає мен- них лініях. ше 1, тобто зниження ампліфікації нижче рівня

Характер росту розглядається в якості індика- входу є індикатором недостатності реплікації і, тора ослаблення вірусу. Звичайно штам вірусу таким чином, індикатором ослаблення вірусу. От- рахується ослабленим, якщо він загубив свою зда- же, для винахідників особливий інтерес подає іде- тність або тільки знизив свою здатність до своєї нтифікація і, в загальному підсумку, виділення репродукції шляхом реплікації в клітинах-хазяїнах. штаму, що характеризується ампліфікаційним від-

Зазначений вище факт, що ММА не є цілком не ношенням менше 1 у декількох клітинних лініях здатним до реплікації в клітинах людини і ссавців, людини, зокрема у всіх клітинних лініях людини порушує питання про те, наскільки абсолютна без- 1438, Не/ а, 293 і Насаї. пека ММА як вакцини для людини або вектора для Таким чином, термін "не здатний до репродук- рекомбінантних вакцин. ції шляхом реплікації" позначає, що вірус відповід-

Особливо для вакцини, а також для рекомбі- но до винаходу характеризується ампліфікаційним нантної вакцини баланс між ефективністю і безпе- відношенням менше 1 у клітинних лініях людини, кою вірусного вектора вакцини є вкрай важливим. таких як клітинні лінії 293 (ЕСАСС Мо.851206021,

Таким чином, задачею винаходу є забезпе- 1438 (ЕСАСС Мо.91112502І, Нега (АТСС Мо.СсІ - чення новими штамами, що характеризуються 2| і насСаї (ІВошкКатр еї аї. 1988, У СеїІ Віо! 106(3): підвищеною безпекою, для розробки більш безпе- 761-71|, в умовах, що описані у прикладі 1 даного чних продуктів, таких як вакцини або ліки. Більш опису для деяких конкретних штамів ММА. Пере- того, додатковою метою є забезпечення засобами важно, щоб ампліфікаційне відношення для вірусу для поліпшення існуючого режиму вакцинації. відповідно до винаходу складало 0,8 або менше в

Для досягнення перерахованих вище цілей кожній із перерахованих вище лініях Не а, Насаї і відповідно до кращого здійснення даного винахо- 1438. ду, пропонуються нові віруси коров'ячої віспи, що У прикладі 1 і в таблиці 1 показано, що віруси здатні до репродукції шляхом реплікації в клітинах відповідно до даного винаходу не здатні до репро- і в клітинних лініях тварин, які не є людиною, осо- дукції шляхом реплікації в жодній із клітинних ліній

1438, Нега їі НасСаї. Особливий штам відповідно тись іп ммо" відноситься до вірусів, що не репліку- до даного винаходу, що був використаний у прик- ються в клітинах людини і мишиної моделі, що ладах, був призначений на збереження в Євро- описана нижче. "Відсутність здатності реплікува- пейську колекцію клітинних культур під номером тись іп мімо" може бути визначене переважно на

МО00083008. Даний штам позначається у всьому мишах, що не здатні продукувати зрілі В і Т кліти- описі як "ММА-ВМ". ни. Прикладом таких мишей є трансгенні миші мо-

Відомі штами ММА виявляють здатність до за- делі АОК129 (отримані від Мак Зшег, Іпбійше ої лишковій реплікації в, принаймні, однієї з протес- Мігоїоду, Опімегейу ої 2!гісп, Швейцарія). Дана лінія тованих клітинних ліній людини (Фіг.1, приклад 1). мишей характеризується спрямованими генетич-

Всі відомі штами вірусів коров'ячої віспи виявля- ними ушкодженнями в генах рецептора ІРМ типу ють здатність до, принаймні, деякої реплікації в (ІЕМ-а/Р) і типу ІІ (ІРМ-у) і в КАС. Через дані ушко- клітинній лінії НасСаї, у той час як штами ММА від- дження миші не мають системи ІЕМ їі не здатні повідно до даного винаходу, зокрема ММА-ВМ, не продукувати зрілі В і Т клітини й в результаті цього виявляють здатності до відтворення шляхом реп- характеризуються істотно порушеним імунітетом і лікації в клітинах НаСаї. У більш докладному ви- високою сприйнятливістю до реплікації вірусів. кладі ММА-ВМ характеризуються ампліфікаційним Замість мишей АСК129 може бути використана відношенням від 0,05 до 0,2 у лінії клітин нирки будь-яка інша лінія мишей, що не спроможна про- ембріона людини 293 (ЕСАСС Мо.851206021).. У дукувати зрілі В і Т клітини й в результаті цього клітинній лінії остеосаркоми кістки людини 1438 характеризується істотно порушеним імунітетом і

ІЕСАСС Мо.91112502| відношення знаходиться в 1 високою сприйнятливістю до реплікації вірусів. діапазоні від 0,0 до 0,6. Для клітинної лінії адено- Зокрема, віруси відповідно до даного винаходу не карциноми шийки матки людини НеГа ІАТОС вбивають мишей АСК129 протягом періоду часу,

Мо.ССІ -21| і клітинної лінії кератиноцитів людини принаймні, 45 днів, більш переважно протягом,

НасСаї |Воикатр еї аї. 1988, У Сеї! Віо! 106(3): 761- щонайменше, 60 днів, найбільше переважно про- 71) ампліфікаційне відношення знаходиться в діа- тягом 90 днів після інфікування мишей шляхом пазоні від 0,04 до 0,8 і від 0,02 до 0,8, відповідно. внутрішньо очеревинного введення 107 БОЕ віру-

ММУА-ВМ характеризується ампліфікаційним від- су. Переважно, щоб віруси, що виявляють "відсут- ношенням від 0,01 до 0,06 у клітинах нирки афри- ність здатності реплікуватися іп мімо", додатково канської зеленої мартишки (СМ1І: АТСС Мо.СсІ - характеризувалися тим, що жодного вірусу не мо- 70)|. Таким чином, ММА-ВМ, що є зразком штаму гло виявлятися в органах або тканинах мишей відповідно до даного винаходу, не здатний до від- АОК129 через 45 днів, переважно через 60 днів і творення шляхом реплікації в жодній із протесто- найбільше переважно через 90 днів після інфіку- ваних клітинних ліній. вання мишей шляхом внутрішньо очеревинного

Ампліфікаційне відношення ММА-ВМ дорівнює введення 107 БОЕ вірусу. Докладна інформація величині, безсумнівно, вище 1 у фібробластах про дослідження по інфікуванню мишей АОК129 і ембріонів курчат (СЕР: первинні культури) або в тестах, що застосовуються для визначення того, лінії клітин нирки дитинчат хом'ячка ВНК ІАТОС чи може вірус виявлятися в органах або тканинах

Мо.СВІ -1632|. Як відзначалося вище, відношення, інфікованих мишей, може бути знайдена в розділі що складає більше "І", вказує на репродукцію прикладів. шляхом реплікації, тому що кількість вірусів, що У кращому здійсненні штами вірусу коров'ячої продукується інфікованими клітинами, збільшуєть- віспи відповідно до даного винаходу, зокрема ся в порівнянні з кількістю вірусів, що використову- ММА-ВМ і його похідні, характеризуються більш валась для інфікування клітин. Отже, вірус може високою імуногенністю в порівнянні з відомим легко розмножуватися й ампліфікуватися в пер- штамом ММА 575 при визначенні на моделі мишей винних культурах СЕБЕ із відношенням вже 500 або із летальним інфікуванням. Подробиці даного екс- в клітинах ВНК із відношенням вище 50. перименту описані в прикладі 2 поданому нижче.

У конкретному здійсненні даного винаходу ви- Коротенько, у такій моделі невакциновані миші нахід стосується похідних вірусу, що депонований вмирають після інфікування реплікативними ком- під Ме ЕСАСС У0083008. "Похідні" вірусів, що де- понентами штамів вірусів коров'ячої віспи, такими поновані під Ме ЕСАСС У00083008, позначають як штам 929 ТК Ууезіет Резегуе або ІНО-3. У віруси, що виявляють за змістом ті ж самі репліка- контексті описи моделі з летальним зараженням, ційні характеристики, що і депонований штам, але "зараженням" позначається інфікування репліка- такі, що мають відмінності, в однієї або більш час- тивними компонентами вірусів коров'ячої віспи. тин свого генома. Віруси, що мають ті ж самі "реп- Через чотири дні після зараження мишей звичайно лікаційні характеристики", що і депонований вірус, забивають і визначають титр вірусів у яєчниках за являють собою віруси, що реплікуються з подіб- допомогою стандартних тестів утворення бляшок ними ампліфікаційними відношеннями, що і депо- із застосуванням клітин МЕКО (для більш доклад- нований штам, у клітинах СЕРЕ і клітинних лініях ного опису дивися поділ прикладів). Титр вірусів

ВНК, Нега, Насаї і 1438, і який виявляють подібну визначають у невакцинованих мишей і в мишей, реплікацію іп мімо при визначенні на моделі транс- вакцинованих вірусною вакциною відповідно до генної миші ДОК129 (дивися нижче). даного винаходу. Більш конкретно, віруси відпо-

У кращому здійсненні штами вірусу коров'ячої відно до даного винаходу характеризуються тим, віспи відповідно до даного винаходу, зокрема що в даному тесті після вакцинації 102 ТСІОво/мл

МУА-ВМ і його похідні, характеризуються відсутні- вірусами відповідно до даного винаходу титри ві- стю здатності реплікуватися іп мімо. У контексті русів у яєчнику знижені, щонайменше, на 7095, даного винаходу "відсутність здатності реплікува- переважно, щонайменше, на 8095, більш переваж-

но, щонайменше, на 9095 у порівнянні з невакци- чої віспи/повторної імунізації вірусом коров'ячої нованими мишами. віспи був вище, принаймні, в одному із тестів у

У кращому здійсненні віруси коров'ячої віспи порівнянні з режимами первинної імунізації відповідно до даного винаходу, зокрема ММА-ВМ і ДНК/повторної імунізації вірусом коров'ячої віспи. його похідні, придатні для імунізації шляхом пер- Найбільш переважно, щоб СТІ. відповідь була ви- винного/повторного введення вакцини. Існують ще в обох з наступних тестів. численні повідомлення, що припускають, що ре- Тест 1: для первинного введення вірусу коро- жими первинної/повторної імунізації з застосуван- в'ячої віспи/повторного введення вірусу коров'ячої ням ММА у якості вектора для доставки індукують віспи проводять первинну імуніацію 6-38 тижневих слабкі імунні відповіді і поступаються режиму пер- мишей ВАГВ/с (Н-24) шляхом внутрішньовенного винної імунізації за допомогою ДНК і повторної введення 107 ТСІЮзо вірусу коров'ячої віспи відпо- імунізації ММА |Зсппеїдег еї а!Ї., 1998, Маї. Мед. 4; відно до даного винаходу, що експресують миша- 397-402). В усіх даних дослідженнях застосовува- чий політоп, (як описано в Тпотвоп еї аї., 1988, у. лися штами ММА, що відрізняються від вірусів ко- Іттипої. 160, 1717), і повторно імунізують тією ж ров'ячої віспи відповідно до даного винаходу. Для кількістю того ж вірусу, що вводиться тим же шля- пояснення слабкої імунної відповіді при застосу- хом через три тижня. Для даної цілі необхідно ванні ММА для первинного і повторного введення створити конструкцію рекомбінантного вірусу ко- була висунута гіпотеза про те, що антитіла, що ров'ячої віспи, що експресує зазначений полі- вироблені проти ММА при первинному введенні, топ.Способи створення конструкцій таких рекомбі- нейтралізують ММА, які вводяться при повторній нантних вірусів відомі спеціалісту в даній області імунізації, запобігаючи ефективне підвищення іму- техніки й описуються більш докладно нижче. У нної відповіді. На противагу цьому, режими з пер- випадку режимів первинної імунізації винною імунізацією ДНК і повторною імунізацією ДНК/повторної імунізації вірусом коров'ячої віспи

ММА, як повідомляється, є прекрасними в плані первинну вакцинацію проводять шляхом внутріш- генерації антитіл із високою авідністю, тому що ньо м'язового введення мишам 5Омкг ДНК, що при даному режимі здатність ДНК ефективно при- експресують той же самий антиген, що і вірус ко- міювали імунну відповідь сполучається з власти- ров'ячої віспи; при повторному введенні уводять востями ММА посилювати дану відповідь при по- вірус коров'ячої віспи точно тим же шляхом, що й у вторній імунізації у відсутність раніше існуючого випадку первинної імунізації вірусом коров'ячої імунітету по відношенню до ММА. Ясно, що, якщо віспи/повторної імунізації вірусом коров'ячої віспи. раніше існуючий імунітет до ММА і/або вірусу ко- Плазмідна ДНК, що експресує політоп, описана ров'ячої віспи запобігає посиленню імунної відпо- також у зазначеній вище публікації Тпотзоп еї аї. віді після повторної імунізації, то застосування У випадку обох режимів розвиток СТІ. відповіді

ММА у якості вакцини або ліків повинно мати об- проти епітопів ЗМІРБАЕКІ, КРОАБОМУМ імунізації межену силу, особливо в хворих, що були вакци- вірусом коров'ячої віспи/повторної імунізації віру- новані проти віспи. Проте, відповідно до додатко- сом коров'ячої віспи. Плазмідна ДНК, що експре- вого здійснення вірус коров'ячої віспи відповідно сує політоп, описана також у зазначеній вище пуб- до даного винаходу, зокрема ММА-ВМ і його похід- лікації Тпотвоп еї а. У випадку обох режимів ні, також як відповідні рекомбінантні віруси, що розвиток СТІ. відповіді проти епітопів ЗУІРЗАЕКІ, включають гетерологічні послідовності, можуть КРОАБОМУМ і/або УРНЕМРТМІ. визначають через бути використані для ефективних первинної пре- два тижні після повторного введення. Визначення мійованої і наступної посилюючої імунних відпові- СТІ. відповіді переважно здійснюють шляхом ви- дей у інтактних тварин, а також у тварин з імуніте- користання аналізу ЕЇ І5РОТ, (як описано том, що предіснує, стосовно вірусів віспи. Таким Зеппеїадег еї аї!., 1998, Маї. Меа. 4, 397-402, і пода- чином, вірус коров'ячої віспи відповідно до даного но в розділі прикладів нижче для одного конкрет- винаходу індукує, принаймні, за змістом той же ного вірусу відповідно до даного винаходу. Вірус рівень імунітету при режимах первинної імунізації відповідно до даного винаходу характеризується в вірусом коров'ячої віспи/повторної імунізації віру- даному експерименті тим, що імунний СТІ. відпо- сом коров'ячої віспи в порівнянні з режимами пер- відь проти зазначених вище епітопів, що індуку- винної імунізації ДНК/повторної імунізації вірусом ються первинним введенням вірусу коров'ячої віс- коров'ячої віспи. пи/повторним уведенням вірусу коров'ячої віспи, є

Вірус коров'ячої віспи розглядається як такий, за змістом тим же самим, переважно, принаймні, що індукує, принаймні, за змістом той же рівень тим же самим, що і індукує первинним введенням імунітету при режимах первинної імунізації вірусом ДНК/повторним введенням вірусу коров'ячої віспи коров'ячої віспи/повторної імунізації вірусом коро- при оцінці по числу клітин, що продукують ІЄМ- в'ячої віспи в порівнянні з режимами первинної у/106 клітин селезінки (дивися також експеримен- імунізації ДНК/повторної імунізації вірусом коров'- тальний розділ). ячої віспи, якщо СТІ. (ЦТЛ) відповідь при вимірі в Тест 2: даний тест в основному відповідає тес- одному із таких двох тестів ("тест 1" і "тест 2"), ту 1. Проте замість використання в/в введення 107 переважно в обох тестах, є, принаймні за змістом ТСІО»о вірусу коров'ячої віспи, як у випадку тест 1, тим же самим при режимах первинної імунізації у даному тесті 108 ТСІОвзо вірусу коров'ячої віспи вірусом коров'ячої віспи/повторної імунізації віру- відповідно до даного винаходу вводять підшкірно сом коров'ячої віспи в порівнянні з режимами пер- для первинної імунізації і для повторної імунізації. винної імунізації ДНК/повторної імунізації вірусом Вірус відповідно до даного винаходу характеризу- коров'ячої віспи. Більш переважно, щоб СТІ. від- ється в даному експерименті тим, що імунна СТІ. повідь після первинної імунізації вірусом коров'я- відповідь проти епітопів, що зазначені вище, що індукується первинним введенням вірусу коров'я- здатності до репродукції шляхом реплікації в клі- чої віспи/ловторним введенням вірусу коров'ячої тинній лінії кератиноцитів людини Насаї, віспи, є за змістом тим же самим, переважно, при- - відсутність здатності до реплікації іп мімо, наймні, тим же самим, що і індукує первинним - індукція більш високого імунітету в порівнянні введенням ДНК/повторним введенням вірусу ко- з відомим штамом ММА - 575 у моделі летального ров'ячої віспи при оцінці по числу клітин, що про- зараження і/або дукують ІЕМ-у/109 клітин селезінки (дивися також - індукція, принаймні, за змістом того ж самого експериментальний поділ). рівня імунітету при режимах первинної імунізації

Сила СТІ. відповіді, що виміряна в одному із вірусом коров'ячої віспи/повторної імунізації віру- тестів, поданих вище, відповідає рівню захисту. сом коров'ячої віспи в порівнянні з режимами пер-

Таким чином, віруси відповідно до даного ви- винної імунізації ДНК/повторної імунізації вірусом находу особливо підходять для цілей вакцинації. коров'ячої віспи.

У цілому вірус відповідно до даного винаходу Спосіб одержання такого вірусу може включа- характеризується наявністю, принаймні, однієї з ти такі стадії: таких властивостей: () введення відомого штаму вірусу коров'ячої () здатністю до репродукції шляхом реплікації віспи, переважно ММА 574 або ММА 575 (ЕСАСС у фібробластах ембріонів курчат (СЕР) і в клітин- М00120707) у клітини, відмінні від клітин людини, у ній лінії ВНК, але відсутністю здатності до репро- яких вірус здатний до репродукції шляхом реплі- дукції шляхом реплікації в клітинній лінії НаСаї кації, де клітини, відмінні від клітин людини, пере- людини, важно обрані з клітин СЕБЕ і клітинної лінії ВНК, (і) відсутністю здатності до реплікації іп мімо, (ії) виділення/підвищення концентрації вірус- (ії) індукцією більш високого імунітету в порів- них часток із даних клітин і (ії) аналіз того, чи буде нянні з відомим штамом ММА 575 (ЕСАСС МОО отриманий вірус мати, принаймні, одну з бажаних 120707) у моделі летального зараження і/або біологічних властивостей, як зазначено вище, де (ім) індукцією, принаймні, за змістом того ж са- зазначені вище стадії можуть необов'язково по- мого рівня імунітету при режимах первинної імуні- вторюватися доти, поки не буде отриманий вірус із зації вірусом коров'ячої віспи/повторної імунізації бажаними реплікативними характеристиками. Ви- вірусом коров'ячої віспи в порівнянні з режимами нахід додатково відноситься до вірусів, які отри- первинної імунізації ДНК/повторної імунізації віру- мані даним способом відповідно до даного вина- сом коров'ячої віспи. ходу. Способи того, як можуть бути визначені

Переважно вірус коров'ячої віспи відповідно бажані біологічні властивості, пояснені в інших до даного винаходу має, принаймні, дві з зазначе- частинах даного опису. них вище властивостей, більш переважно, при- Застосовуючи даний засіб, винахідники іден- наймні, три з зазначених вище властивостей. Най- тифікували і виділили в результаті декількох цик- більш кращими є віруси коров'ячої віспи, що мають лів очищення клона штам відповідно до даного усі зазначені вище властивості. винаходу, починаючи з пасажу 575 ізолята ММА

У додатковому здійсненні винахід стосується (ММА 575). Даний новий штам відповідає штаму з набору для вакцинації, що включає вірус відповід- депонентним номером ЕСАСС М00883008, що но до даного винаходу для первинної вакцинації зазначений вище. ("приміювання") в одному флаконі/контейнері і для Характер росту вірусів коров'ячої віспи відпо- повторної вакцинації ("бустинга") у другому фла- відно до даного винаходу, зокрема характер росту коні/контейнері. Вірус може являти собою нереко- ММА-ВМ, вказує на те, що штами відповідно до мбінантний вірус коров'ячої віспи, тобто вірус ко- даного винаходу істотно випереджають будь-який ров'ячої віспи, що не містить гетерологічних інший схарактеризований до даного часу ізолят нуклеотидних послідовностей. Прикладом такого ММА у відношенні ослаблення дії в клітинних ліні- вірусу коров'ячої віспи є ММА-ВМ і його похідні. У ях людини і відсутності здатності до реплікації іп альтернативному варіанті вірус може являти со- мімо. Штами відповідно до даного винаходу є, от- бою рекомбінантний вірус коров'ячої віспи, що же, ідеальними кандидатами для розробки більш містить додаткові нуклеотидні послідовності, що є безпечних продуктів, таких як вакцини або ліків, як гетерологічними стосовно вірусу коров'ячої віспи. буде описано нижче.

Як зазначено в інших розділах опису, гетерологічні У однім здійсненні вірус відповідно до даного послідовності можуть кодувати епітопи, що інду- винаходу, зокрема ММА-ВМ і його похідні, застосо- кують відповідь імунної системи. Таким чином, вують у якості вакцини проти вірусних захворю- можна застосовувати рекомбінантний вірус коров'- вань людини, що супроводжуються висипкою, та- ячої віспи для вакцинації проти білків або агентів, ких як віспа. У додатковому здійсненні вірус що включають зазначений епітоп.Віруси можуть відповідно до даного винаходу може бути рекомбі- бути включені до складів, як більш докладно пока- нантним, тобто може експресувати гетерологічні зано нижче. гени, такі як, наприклад, антигени або епітопи,

Кількість вірусу, що може бути використане гетерологічні стосовно вірусу, і може, таким чином, для кожної вакцинації, зазначено вище. бути придатним у якості вакцини для індукції імун-

Спеціалісту в даній області техніки відомо як ної відповіді проти гетерологічних антигенів або можна одержати віруси коров'ячої віспи, що ма- епітопів. ють, щонайменше, одну з таких властивостей: Термін "імунна відповідь" позначає реакцію - здатність до репродукції шляхом реплікації у імунної системи при надходженні в організм чужо- фібробластах ембріонів курчат (СЕР) і в лінії клі- рідної речовини або мікроорганізму. По визначен- тин нирок дитинчат хом'ячка ВНК, але відсутність ню імунна відповідь підрозділяють на специфічну і неспецифічну реакції, хоча обидві вони тісно пе- також "рекомбінантний вірус". реплітаються. Неспецифічна імунна відповідь яв- Відповідно до додаткового здійснення даного ляє собою негайний захист від широкої розмаїтості винаходу гетерологічні послідовності являють со- чужорідних речовин і інфекційних агентів. Специ- бою переважно антигенні епітопи, що обрані з фічна імунна відповідь являє собою захист, що будь-якого джерела, що не є вірусом коров'ячої виникає після лаг-періоду після першого заражен- віспи. Найбільш переважно, щоб зазначений ре- ня організму речовиною. Специфічна імунна від- комбінантний вірус експресував один або більше повідь є високоефективним і визначає той факт, антигенних епітопів від Ріазтодішт "ТаїІсірагит, що індивідуум, що перехворів конкретною інфекці- Мусобасіегіа, ІпЯчепла міги5, від вірусів, що обрані єю, стає захищеним проти даної конкретної інфек- із сімейства Ріамімігизе5, Рагатухомітвев, вірусів ції. Таким чином, повторне інфікування тим же гепатиту, вірусів імунодефіците людини, або від самим або дуже близьким інфекційним агентом вірусів, що викликають геморагічну лихоманку, викликає набагато більше згладжені симптоми або таких як Напіамігизе5 або Рііомігозе5, тобто вірусу зовсім не викликає симптомів, тому що вже є " Ебола або Марбург. імунітет, що предіснує," у відношенні даного аген- Відповідно до ще одного здійснення, але та- та. Такий імунітет і імунологічна пам'ять, відповід- кож на додаток до зазначеного вище вибору анти- но, зберігається протягом тривалого часу, у деяких генних епітопів, гетерологічні послідовності можуть випадках навіть напротязі усього життя. Відповід- бути обрані з інших джерел віспи і коров'ячої віспи. но, індукція імунологічної пам'яті може бути вико- Дані вірусні послідовності можуть бути застосовані ристана при вакцинації. для модифікації спектра хазяїв або імуногенності "І|Імунна система" позначає комплекс органів, вірусу. що беруть участь у захисті організму від чужорід- У додатковому здійсненні вірус відповідно до них речовин і мікроорганізмів. Імунна система даного винаходу може кодувати гетерологічний включає клітинну складову, що включає декілька ген/нуклеїнову кислоту, що експресують терапев- типів клітин, таких як, наприклад, лімфоцити й інші тичну сполуку. "Терапевтична сполука", яка коду- клітини, що відбуваються від білих клітин крові, і ється гетерологічною нуклеїновою кислотою у ві- гуморальну складову, що включає невеличкі пеп- русі, може являти собою, наприклад, терапевтичну тиди і чинники комплемента. нуклеїнову кислоту, таку як антизмістова нуклеїно- "Вакцинація" означає те, що організм наван- ва кислота, або пептид, або білок з бажаною біо- тажують інфекційним агентом, наприклад, ослаб- логічною активністю. леною або інактивованою формою зазначеного Відповідно до додаткового кращого здійснення інфекційного агента, для індукції специфічного експресія гетерологічної послідовності нуклеїнової імунітету. Термін вакцинація також охоплює зара- кислоти знаходиться переважно, але не винятко- ження організму рекомбінантними вірусами коро- во, під транскрипційним контролем промотору ві- в'ячої віспи відповідно до даного винаходу, зокре- русу віспи, більш переважно промотору вірусу ко- ма, рекомбінантним ММА-ВМ і його похідними, що ров'ячої віспи. експресують антигени або епітопи, що є гетероло- Відповідно до ще одного здійснення вставка гічними стосовно вірусу. Приклади таких епітопів гетерологічної послідовності нуклеїнової кислоти даються в інших частинах опису й охоплюють, на- здійснюється в область вірусного генома, що не приклад, епітопи білків, що походять від інших ві- являється необхідною. У іншому переважному русів, таких як вірус Денге, вірус гепатиту С, ВІЛ здійсненні винаходу гетерологічну послідовність або епітопи, що походять від білків, що асоційовані нуклеїнової кислоти вставляють у природно існую- з розвитком пухлин і раку. Після введення реком- чий сайт делеції генома ММА Грозкритий у патенті бінантного вірусу коров'ячої віспи в організм епіто- РСТ/ЕРОб6/02926)|. Методи вставки гетерологічних пи експресуються і презентуються імунній системі і послідовностей у геном вірусу віспи відомі спеціа- може індукуватись специфічна імунна відповідь лістам уданій області техніки. проти даних епітопів. Організм, таким чином, є Відповідно до іншого додаткового кращого імунізованим проти агента/білка, що містить епі- здійснення винахід включає також геном вірусу, топ, що кодується рекомбінантним вірусом коров'- його рекомбінантні варіанти або його функціона- ячої віспи. льні частини. Такі вірусні послідовності можуть "Імунітет" означає частковий або повний за- бути використані для ідентифікації або виділення хист організму від захворювань, що викликаються вірусу або його рекомбінантних варіантів, напри- інфекційним агентом, що обумовлений успішною клад, із застосуванням ПЦР, методів гібридизації ліквідацією попереднього інфікування зазначеним або за допомогою традиційних тестів ЕГІ5А. Більш інфекційним агентом або його характерною части- того, такі вірусні послідовності можуть експресува- ною. Імунітет заснований на існуванні, індукції й тись експресійним вектором з одержанням білка, активації спеціалізованих клітин імунної системи. що кодує або пептида, що потім можуть доповню-

Як підкреслювалося вище, в одному здійсненні вати делеційні мутанти вірусу, у яких відсутня ві- винаходу рекомбінантні віруси відповідно до дано- русна послідовність, що утримується в експресій- го винаходу, зокрема, рекомбінантний. ММА-ВМ і ному векторі. його похідні, містять, принаймні, одну гетерологіч- "Функціональна частина" вірусного генома по- ну послідовність нуклеїнової кислоти. Термін "ге- значає частину повної геномної послідовності, що терологічна" застосовують тут далі для будь-якого кодує фізичний об'єкт, такий як білок, домен білка, сполучення послідовностей нуклеїнової кислоти, епітоп білка. Функціональна частина вірусного ге- що у звичайних умовах не знаходять у близькому нома також описує частини повної геномної послі- зв'язку з вірусом у природі, такий вірус називають довності, що кодує регуляторні елементи або час-

тини таких елементів з індивідуалізованою актив- дини в ампулі, переважно в скляній ампулі. Альте- ністю, такі як промотор, енхансер, цис- або транс- рнативно, вакцина для уколів може бути отримана діючі елементи. за допомогою поетапної ліофілізації вірусу в ком-

Рекомбінантний вірус відповідно до даного ви- позиції. Дана композиція може містити додаткові находу може бути застосований для введення ге- добавки, такі як маніт, декстран, цукор, гліцин, терологічної послідовності нуклеїнової кислоти в лактозу або полівінілпіролідон, або інші добавки, клітину-мішень, причому зазначена послідовність є такі як антиоксиданти або інертний газ, стабіліза- або гомологічною, або гетерологічною стосовно тори або рекомбінантні білка (наприклад, сироват- клітини-мішені. Введення гетерологічної послідов- ковий альбумін людини), що підходять для вве- ності нуклеїнової кислоти в клітину-мішень може дення іп мімо. Скляну ампулу потім запоюють і її бути застосоване для одержання іп міго гетероло- можна бере!ти при температурі між 4" і кімнатної гічних пептидів або поліпептидів і/або повних віру- протягом декількох місяців. Проте коли відсутня сів, кодує зазначеною послідовністю. Даний спосіб необхідність використання ампули її бережуть пе- включає інфікування клітини-хазяїна рекомбінант- реважно при температурі нижче -2026. ним ММА, культивування інфікованої клітини- Для вакцинації або терапії ліофілізат може бу- хазяїна в підхожих умовах і виділення і/або підви- ти розчинений у від 0,1 до 0,5мл водяного розчину, щення концентрації пептиду, білка і/або вірусу, що переважно фізіологічного розчину або Трис буфе- продукуються зазначеною клітиною-хазяїном. ра і введений або системно, або місцево, тобто за

Більш того, спосіб введення гомологічної або допомогою парентерального, внутрішньо м'язово гетерологічної послідовності в клітини може бути або будь-якого іншого шляху введення, що відо- застосований для терапії іп міго і переважно іп мий спеціалісту в даній області техніки. Шлях вве- мімо. Для терапії іп міго виділені клітини, що попе- дення, доза і кількість введень може бути оптимі- редньо (ех мімо) інфікували вірусом, вводять в ор- зовано спеціалістом уданій області техніки ганізм живої тварини для індукції імунної відповіді. відомим засобом.

Для терапії іп мімо вірус або його рекомбінантні Додатково у відповідності до іншого здійснен- варіанти прямо вводять в організм живої тварини ня вірус відповідно до даного винаходу особливо для індукції імунної відповіді. У даному випадку корисний для індукції імунних відповідей у тварин клітини навколо місця інокуляції стають інфікова- із порушеним імунітетом, наприклад, у мавп, інфі- ними вірусом або його рекомбінантними варіанта- кованих 5ІМ (С04«400/мкл крові), або в людей із ми безпосередньо іп мімо. порушеним імунітетом. Термін "порушений імуні-

Оскільки вірус відповідно до даного винаходу тет" описує стан імунної системи індивідуума, у характеризується вкрай обмеженим ростом у клі- якого виникають тільки неповні імунні відповіді або тинах людини і мавп і, таким чином, вкрай ослаб- який характеризується зниженою ефективністю леним, він є ідеальним засобом для лікування ши- захисту від інфекційних агентів. Ще більш цікавим і рокого кола ссавців, включаючи людину. Отже, тим, що знаходиться у відповідності з ще одним уданому винаході пропонується також фармацев- додатковим здійсненням є той факт, що вірус від- тична композиція і вакцина, наприклад, для індук- повідно до даного винаходу може посилювати іму- ції імунної відповіді в організмі живої тварини, нні відповіді у тварин або людей із порушеним включаючи людину. Вірус винаходу є також безпе- імунітетом навіть при наявності в даних тварин чним при будь-яких інших протоколах терапії. або людей імунітету, що предіснує, до вірусу віспи.

Фармацевтична композиція може звичайно Особливо цікавим було те, що вірус відповідно до включати один або більше фармацевтично при- даного винаходу може посилювати імунні відповіді йнятних і/або припустимих носіїв, добавок, антибі- також у тварин або людей, що проходять курс ан- отиків, консервантів, ад'ювантів, розріджувачів тивірусної терапії, наприклад, терапії проти ретро- і/або стабілізаторів. Такими допоміжними речови- вірусів. "Антивірусна терапія" включає концепції нами можуть бути вода, фізіологічний розчин, глі- лікування, що спрямовані на знищення або при- церин, етанол, агенти, що зволожують або емуль- душення вірусної інфекції, включаючи, наприклад, гують, речовини, що буферують, або тому подібне. () застосування аналогів нуклеотидів, (ії) застосу-

Підхожими носіями є звичайно великі молекули, вання інгібіторів ферментативної активності вірусів що повільно метаболізуються, такі як білки, полі- або їх складанню або (ії) застосування цитокінів сахариди, полімолочні кислоти, полігліколеві кис- для впливу на імунні відповіді хазяїна. лоти, полімерні амінокислоти, сополімери аміноки- Відповідно до ще одного додаткового здійс- слот, агрегати ліпідів або тому подібне. нення вакцина є особливо, але не винятково, при-

Для одержання вакцин вірус або його рекомбі- датною в області ветеринарії, наприклад, для іму- нантні варіанти відповідно до винаходу перекла- нізації проти інфекції, що викликається вірусом дають у фізіологічно прийнятну форму. Це може віспи тварин. У дрібних тварин інокуляція для іму- бути зроблено, базуючись на досвіді роботи з оде- нізації переважно виконується парентерально або ржанням вакцин вірусу віспи для вакцинації проти інтраназально, у той час як у більш значних тварин натуральної віспи (як описане 5сСКІ, Н. еї а. (1974) або в людей кращою є підшкірна, внутрішньо м'я-

Оі5сСп. тей. М/вспг. 99, 2386-2392). Наприклад, зова або пероральна інокуляція. очищений вірус із титром 5х108 ТСІОво/мл у приб- Винахідники знайшли, що ін'єкція вакцини, що лизно 10мММ Трис, 140мМ Масі, рн7,4 бережуть містить ефективну дозу тільки 102 ТСІЮОво (дози при -80"С. Для готування вакцини для уколів, на- інфікування в тканинній культурі) вірусу відповідно приклад, 102-108 вірусних часток ліофілізують у до даного винаходу, уже достатня для індукції по- 100мл забуференого фосфатом фізіологічного вного імунітету проти вірусу коров'ячої віспи дико- розчину (РВ5) при 295 пептона і 195 альбуміну лю- го типу при контрольному зараженні їм мишей. Це є особливо несподіваним, тому що такий високий агентів, як відомо в даній області техніки. Перева- ступінь ослаблення вірусу відповідно до даного жно, щоб вірус інактивувався за допомогою В- винаходу повинен, як очікувалось, впливати нега- пропріолактона. Відповідно до даного здійснення тивно і, в результаті цього, знижувати його імуно- винаходу інактивований вірус може бути доданий генність. Таке припущення грунтується на уявленні до вакцин проти численних інфекційних або про- про те, що для індукції імунної відповіді антигенні ліферативних захворювань для збільшення імун- епітопи потребують у презентації імунній системі в ної відповіді хворого на дане захворювання. достатній кількості. Вірус, що є вкрай ослабленим, Винахід серед іншого включає наступне по од- і, таким чином, не реплікується, може презентува- ному або в сполученні: вірус коров'ячої віспи, що ти тільки дуже невеличку кількість антигенних епі- має, принаймні, одну з таких властивостей: топів, тобто стільки, скільки він сам включає. Дана - здатність до репродукції шляхом реплікації у кількість антигену, що несуть вірусні частки, не фібробластах ембріонів курчат (СЕР) і в лінії клі- розглядається як достатня для індукції сильної тин нирок дитинчат хом'ячка ВНК, але відсутність імунної відповіді. Проте вірус відповідно до вина- здатності до репродукції шляхом реплікації в клі- ходу стимулює, навіть при дуже низькій ефектив- тинній лінії кератиноцитів людини Насаї, ній дозі тільки в 102 ТСІОво, сильну й захисну імун- - відсутність здатності до реплікації іп мімо, ну відповідь у моделі миша/зараження вірусом - індукція більш високого імунітету в порівнянні коров'ячої віспи. Вірус відповідно до даного вина- з відомим штамом ММА 575 у моделі летального ходу, таким чином, характеризується несподіва- зараження і/або ною і навіть збільшеною імуногенністю в порівнян- - індукція, принаймні, за змістом того ж самого ні з іншими схарактеризованими до даного часу рівня імунітету при режимах первинної імунізації штамами ММА. Така висока імуногенність робить вірусом коров'ячої віспи/повторної імунізації віру- вірус відповідно до даного винаходу і будь-яку сом коров'ячої віспи в порівнянні з режимами пер- вакцину, що пов'язана з ним, особливо придатни- винної імунізації ДНК/повторної імунізації вірусом ми для застосування у тварин і людей із поруше- коров'ячої віспи. ним імунітетом. Вірус, як описано вище, де вірус не здатний до

Відповідно до ще одного здійснення винаходу репродукції шляхом реплікації у любій із таких клі- вірус застосовують у якості адьюванта. "Адьювант" тинних ліній людини: лінії клітин нирки ембріона у контексті даного опису означає підсилювач спе- людини 293, клітинної лінії остеосаркоми кістки цифічної імунної відповіді у вакцинах. "Застосу- людини 143ВБВ і клітинної лінії аденокарциноми вання вірусу в якості адьюванта" означає вклю- шийки матки людини Нега. чення вірусу у вже існуючу вакцину для додаткової Вірус, як описано вище, призначений на збе- стимуляції імунної системи хворого, що одержує реження в Європейську колекцію клітинних куль- вакцину. Ефект антигенного епітопа, що імунізує, у тур (ЕСАСС) Заїїзригу (ШК) під номером більшості вакцин часто посилюється при добавці М00083008 і його похідні. так називаного адьюванта. Адьювант костимулює Вірус, як описано вище, що включає, принай- імунну систему шляхом індукції більш сильної спе- мні, одну послідовність гетерологічної нуклеїнової цифічної імунної реакції проти антигенного епітопа кислоти. вакцини. Дана стимуляція може регулюватися Вірус, як описано вище, де зазначена послідо- чинниками системи неспецифічного імунітету, та- вність гетерологічної нуклеїнової кислоти обрана з кими як інтерферон і інтерлейкін. Отже, у додатко- послідовності, що кодує, принаймні один антиген, вому здійсненні винаходу вірус застосовують у антигенний епітоп і/або терапевтичну сполуку. ссавців, включаючи людину, для активації, підтри- Геном або його функціональні частини, що по- мки або придушення імунної системи і переважно ходять від вірусу, як зазначено вище. для активації імунної відповіді проти будь-якої ан- Фармацевтична композиція, що включає вірус, тигенної детермінанти. Вірус може бути також за- як зазначено вище, і/або геном, і/або його функці- стосований для підтримки імунної системи у випа- ональну частину, як зазначено вище, і фармацев- дку збільшеної сприйнятливості до інфекцій, як у тично прийнятний носій, розріджувач і/або добав- випадку стресу. ку.

Вірус, що використовується у якості адьюван- Вакцина, що включає вірус, як зазначено ви- та, може бути нерекомбінантним вірусом, тобто ще, і/або геном, і/або його функціональну частину, вірусом, що не містить гетерологічну ДНК у своєму як зазначено вище. геномі. Прикладом даного типу вірусу Є ММА-ВМ. У Вірус, як зазначено вище, геном і/або його фу- альтернативному варіанті, вірус, що використову- нкціональна частина, як зазначено вище, компози- ється в якості ад'юванта, є рекомбінантним віру- ція, як зазначено вище, або вакцина, як зазначено сом, що містить у своєму геномі послідовності ге- вище, у якості ліків для впливу на імунну відповідь, терологічної ДНК, що не присутні у вірусному переважно для його індукції, у живої тварини, геномі в природі. Для застосування в якості адью- включаючи людини. ванта рекомбінантна вірусна ДНК вірусу переваж- Вірус, як зазначено вище, фармацевтична но містить і експресує гени, що кодують імуности- композиція, як зазначено вище, вакцина, як зазна- мулюючі пептиди, або білки, такі як інтерлейкіни. чено вище, або вірус, як зазначено вище, де вірус,

Відповідно до додаткового здійснення пере- композицію або вакцину вводять у терапевтично важно, щоб вірус був інактивованим при викорис- ефективних кількостях при першій інокуляції ("іно- танні в якості адьюванта або додаванні до іншого куляції, що приміює,") і при другій інокуляції ("бу- вакцині. Інактивація вірусу може бути здійснена, стерна інокуляція"). наприклад, за допомогою прогрівання або хімічних Застосування вірусу, як зазначено вище, і/або генома, як зазначено вище, для одержання ліків - аналіз того, чи буде отриманий вірус мати, або вакцини. щонайменше, одне з біологічних властивостей, як

Спосіб введення гомологічної і/або гетерологі- зазначено вище, де зазначені вище стадії можуть чної послідовностей нуклеїнової кислоти в клітині- необов'язково повторюватися доти, поки не буде мішені, що включає інфікування клітин-мішеней отриманий вірус із бажаними реплікативними ха- вірусом, що включає гетерологічні послідовності, рактеристиками. як зазначено вище, або трансфекцію клітини- Набір для примійованої/бустерної імунізації, мішені геномом, як зазначено вище. що включає вірус, як зазначено вище, вакцину, як

Спосіб одержання пептида, білка і/або вірусу, зазначено вище, або вірус у якості ліків, як зазна- що включає чено вище, для першої інокуляції ("інокуляція, що - інфікування клітини-хазяїна вірусом, як за- приміює") у першому флаконі/контейнері і для дру- значено вище, гої інокуляції ("бустерна інокуляція") у другому - культивування інфікованої клітини-хазяїна в флаконі/контейнері. підхожих умовах і Застосування вірусу, як зазначено вище, ком- - виділення і/або підвищення концентрації пеп- позиції, як зазначено вище, і/або вакцини, як за- тида, і/або білка, і/або вірусу, які продукуються значено вище, для одержання вакцини, де вірус, зазначеною клітиною-хазяїном. композицію або вакцину вводять при примійова-

Спосіб впливу на імунну відповідь, переважно ной інокуляції і де той же вірус або вакцину вво- його індукції, в організмі живої тварини, включаючи дять при бустерній інокуляції. людину, що включає введення вірусу, як зазначе- Фіг.1: Кінетика росту різноманітних штамів но вище, генома і/або його функціональної части- МУА у клітинах різних ліній. У частині А) результа- ни, як зазначено вище, композиції, як зазначено ти згруповані по тестованим штамам ММА, тоді як вище, або вакцини, як зазначено вище, тварині у частині В) результати згруповані по тестованим або людині, що піддається лікуванню. лініям клітин. В) Кількість вірусів, виділених із лінії

Спосіб, як зазначено вище, що включає вве- клітин після чотирьох днів (04) культивування, дення, щонайменше, 102 ТСІОвзо (дози інфікування визначали за допомогою тест по бляшках і вира- тканинної культури) вірусу. жали у виді відношення вірусів, виділених через 4

Спосіб, як зазначено вище, у якому вірус, ком- дня, до вихідного прищеплювального матеріалу на позицію або вакцину вводять у терапевтично ефе- 1-й день (01). ктивних кількостях при першій інокуляції ("інокуля- Фіг.2: Захист від летального зараження коров'- ція, що приміює,") і при другій інокуляції ("бустерна ячою віспою, що забезпечується вакцинацією інокуляція"). ММА-ВМ або ММА 575. Захист вимірювали по зни-

Спосіб, як зазначено вище, де тварина має женню оваріальних титрів, що визначені за допо- порушений імунітет. могою стандартного тесту по бляшках через 4 дня

Спосіб, як зазначено вище, де тварина має після контрольного зараження. вже існуючий імунітет стосовно вірусу віспи. Фіг.3: Індукція СТІ. і захист від зараження гри-

Спосіб, як зазначено вище, де тварина підда- пом, що забезпечується застосуванням різномані- ється противірусній терапії. тних режимів приміювання-повторної імунізації.

Спосіб, де тварина піддається противірусній ЗА: Індукція СТІ. відповідей на 4 різноманітних терапії що відрізняється тим, що противірусна Н-23 обмежених епітопа після вакцинації різнома- терапія являє собою терапію проти ретровірусів. нітними сполученнями ДНК або вакцинами ММА-

Застосування вірусу, як зазначено вище, його ВМ, що кодують політоп миші. Мишей ВАГ В/с (по 5 генома і/або функціональної частини, як зазначено на групу) вакцинували або ДНК (внутрішньо м'язо- вище, у якості адьюванта. во), або ММА-ВМ (підшкірно), і мишей піддавали

Засіб збільшення специфічної імунної відповіді бустерним імунізаціям через три тижня. СТІ. від- проти антигену і/або антигенного епітопа, що повіді на 4 різноманітних епітопа, що кодуються включений у вакцину, що включає введення в яко- вакцинами (ТМОКТКАМ, грип; ЗМІРЗАЕКІ, Р. сті адьюванта вірусу, як зазначено вище, або ге- Вегонеї; УРНЕМРТМІ., Суютедаї!омігив; нома, як зазначено вище, в організм живої твари- РКОАБЗОМУМ, І СУ) визначали за допомогою ана- ни, включаючи людини, що піддається лікуванню лізу ЕГІБРОТ через 2 тижні після бустерних імуні- вакциною. зацій.

Вірус, як зазначено вище, або геном, як зазна- ЗВ: Індукція СТІ. відповідей на 4 різноманітних чено вище, у якості адьюванта. епітопа після вакцинації різними сполученнями

Клітина, переважно клітина людини, що міс- ДНК або вакцинами ММА-ВМ, що кодують політоп тить вірус, як зазначено вище, або геном, або його миші. Мишей ВАГ В/с (по 5 на групу) вакцинували функціональну частину, як зазначено вище. або ДНК (внутрішньо м'язово), або ММА-ВМ (внут-

Спосіб одержання вірусу коров'ячої віспи, як рішньо венно), і мишей піддавали бустерним імуні- зазначено вище, що включає такі стадії: заціям через три тижня. СТІ. відповіді на 4 різно- - введення звичайно доступного штаму вірусу манітних епітопа, що кодуються вакцинами коров'ячої віспи, переважно ММА 575 у клітини, що (ТМОРКТКАГМ, грип; ЗМІРЗАЕКІ, Р. Вегопеї; відмінні від клітин людини, у яких вірус здатний до УРНЕМРТМІ, Суютедаїомітв; РВОАБОМУМ, І СМ) репродукції шляхом реплікації, де клітини, що від- визначали за допомогою аналізу ЕГІБРОТ через 2 мінні від клітин людини, переважно обрані з клітин тижні після бустерних імунізацій.

СЕР і клітинної лінії ВНК, ЗС: Частота Т-клітин, що специфічні по відно- - виділення/підвищення концентрації вірусних шенню до пептида і ММА, після гомологічної пер- часток із даних клітин і винної імунізації з застосуванням оптимальної дози (1х108ТСІО5о) рекомбінантного ММА-ВМ, що (р»0,05) відрізняється від ММА 572:ММА 572. вводився підшкірно. Групи з З мишей вакцинували Приклади двома ін'єкціями сполучень, як зазначено на Такі приклади будуть додатково ілюструвати

Фіг Через два тижні після останньої вакцинації даний винахід. Спеціалісту в даній області техніки вимірювали кількість специфічних у відношенні повинно бути добре зрозуміло, що запропоновані пептида спленоцитів за допомогою аналізу ІМЕ- приклади ніякою уявою не можуть бути інтерпре- гама ЕГІ5БРОТ. Стовпчики подають середню кіль- товані як обмежуючі придатність технології, що кість специфічних плям плюс/мінус стандартне запропонована даним винаходом на даних прик- відхилення від середнього. ладах.

Фіг.4А: Зараження ЗІМ мавп, що вакциновані Приклад 1

ММА-ВМ пеї або ММА-ВМ. Кінетика росту нового штаму ММА в окремих

Фіг.5: Виживаність вакцинованих мавп після лініях клітин і реплікація іп мімо ін'єкції ІМ. (і) Кінетика росту в лініях клітин:

Фіг.6: Титри антитіл мавп проти ММА-ВМ. Тит- Для характеристики нового виділеного штаму ри антитіл кожної тварини показані у формі різно- відповідно до даного винаходу (далі що познача- манітних значків, а середній титр показаний у виді ється як ММА-ВМ) порівнювали кінетику росту да- темного прямокутника. ного нового штаму з таких інших штамів ММА, що

Фіг.7: Рівні 5ІМ у мавп із порушеним імунітетом вже були охарактеризовані. (сСО4«400мл крові) після вакцинації ММА-ВМ, що Експеримент проводили шляхом порівняння кодують їаї. Мавпи попередньо одержували три кінетики росту таких вірусів у перерахованих ниж- вакцинації або ММА-ВМ, або ММА-ВМ пеї (0, 8, 16 че первинних клітинах і лініях клітин: тижні), і мавп інфікували патогенним ізолятом 5ІМ ММУА-ВМ (Вірусне збереження й23, 18.02.99 (22 тиждень). На 100, 102 і 106 тиждень (зазначе- сирий, титрований у концентрації но стрілками) мавп вакцинували ММА-ВМ гаї. 2,0х10"ТСІОво/мл);

Фіг.8: Рівні 5ІМ у мавп, що піддані антиретро- ММА, що охарактеризований АКепригдег (па- вірусній терапії і терапевтичних вакцинацій із за- тент США 5185146) і далі позначається як ММА- стосуванням ММА-ВМ. Три групи мавп (п-б) інфі- НІ В; кували ЗІМ і лікували щодня РМРА (відзначені ММА (пасаж 575), що охарактеризований чорною лінією). На 10 і 16 тижні тварин вакцину- Апіоп Мауг ІМауг, А., єї аї. (1975) Іпт'есіоп З; 6-14| і вали (відзначено стрілками) або сумішами реком- далі позначається як ММА-575 (ЕСАСС бінантного ММА, або фізіологічним розчином. М00120707); і

Фіг.9: Гуморальна відповідь, що індукована МУА-Мего, що охарактеризований (в Міжнаро- проти 5ІМ, після інфікування і вакцинацій рекомбі- дній патентній заявці РСТ/ЕРО 1/02703 (МО нантним ММА. Три групи (п-б) мавп інфікували 01/68820)| (Вірусне збереження, пасаж 49, 820, патогенним ізолятом 5ІМ (тиждень 0) і потім підда- 22.03.99 сирий, титрований у концентрації 4,2х107 вали антиретровірусній терапії (РМРА; відзначе- ТСІО5о/мл). ною товстою лінією). Мавп вакцинували сумішами Застосовували такі первинні клітини і лінії клі- рекомбінантного ММА або фізіологічним розчином тин: на 10 їі 16 тижні. Антитіла проти 5ІМ визначали з СЕР Фібробласти ембріонів курчат (щойно застосуванням лізатів інфікованих Т-клітин у якості отримані з яєць 5РЕ); антигену за допомогою стандартного ЕГІЗА. Нега Аденокарцинома (епітеліальна) шийки

Фіг.10: Гуморальна відповідь, що індукована матки людини, АТСС Мо.ССІ -2; проти ММА в інфікованих 5ІМ мавп, які піддані ан- 1438 Остеосаркома кістки людини ТК-, ЕСАСС тиретровірусній терапії. Три групи (п-6) мавп інфі- Мо.91112502; кували патогенним ізолятом 5ІМ (тиждень 0) і по- Насат Клітинна лінія кератиноцитів людини, тім піддавали антиретровірусній терапії (РМРА; Вошикатр еї аї. 1988, У Сеї| Віс! 31 106(3): 761-771; відзначеною товстою лінією). Мавп вакцинували ВНК Нирки дитинчати хом'ячка ЕСАСС сумішами рекомбінантного ММА або фізіологічним 85011433; розчином на 10 і 16 тижні. Антитіла проти ММА Мего Фібробласти нирок африканської зеленої визначали за допомогою стандартного ЕГІЗА із мартишки, ЕСАСС 85020299; поглинанням для ММА. СМ1 Фібробласти нирок африканської зеленої

Фіг.11: Індукція антитіл проти ММА після вак- мартишки, ЕСАСС 87032605. цинації мишей різноманітними вакцинами проти Для інфікування різноманітні клітини висівали віспи. Рівень антитіл, вироблених проти ММА після в б-лункові планшети при концентрації 5х105 клі- вакцинацій ММА-ВМ (0 ї 4 тижні), порівнювали з тин/лунка і інкубували протягом ночі при 372С, 595 традиційними штамами коров'ячої віспи, Еїбвігеє і Со» у ОМЕМ (бірсо, Саї. Мо.61965-026) плюс 295

УМуеєій, що вводились за допомогою скарифікації ЕС5. Середовище клітинної культури видаляли, і хвоста (0 тиждень), ММА 572 (0 і 4 тижні) і ММА-ВМ клітини інфікували при приблизно 0,05 тої протя-

Її ММА 572, що вводились у формі рге-ЕїІ5ігеє вак- гом одного часу при 372С, 595 СО» (для інфіку- цини. ММА 572 був поміщений на збереження в вання приймали, що кількість клітин подвоювалося

Європейську колекцію культур клітин тваринною як за ніч). Кількість вірусів, використаних для кожного

ЕСАСС У94012707. Титри визначали за допомо- інфікування клітин різного типу, складало 5х104 гою ЕМІЗА із поглинанням, розраховували шляхом ТСІОво, і це буде позначатися як запровадження. лінійної регресії з застосуванням лінійної частини Клітини потім промивали З рази ОМЕМ, після чого графіка і визначали як розведення, що давало добавляли їмл ОМЕМ, 295 ЕС5, і планшет лишали оптичну щільність 0,3. "ММА-ВМ:ММА-ВМ значимо інкубуватись протягом 96час (4 днів) при 372С, 595

СО7. Дане інфікування зупиняли заморожуванням лінією клітин. планшет при -80"С, готових до аналізу титруван- Що стосується реплікації в клітинах Мего (лінія ням. клітин нирок мавпи), ММА-Мего, як і очікувалося,

Аналіз титруванням (імунозабарвлення спе- ампліфікувався добре, а саме 1000-разово в порі- цифічним по відношенню до вірусу коров'ячої віс- внянні з вводом. ММА-НЕГ, а також ММА-575 амп- пи антитілом). ліфікувались добре, із 33-разовим і 10-разовим

Для титрування кількості вірусу клітини для підвищенням стосовно запровадження, відповідно. тестування висівали в 96-ямкові планшети в КРМІ Лише ММА-ВМ, як було виявлено, не ампліфіку-

ІСібсо, Саї. Мо.61870-010|, 795 ЕС5, 195 антибіо- ється так само добре в даних клітинах, як інші, як- тик/ протигрибковий агент ІСірсо, Саї. Мо.15240- от, спостерігалося лише 2-кратне перевищення 062 у концентрації 1х104 клітин/лунка і інкубували запровадження. протягом ночі при 37"С, 595 СОз. б-лункові план- Що стосується реплікації в клітинах СМ1 (лінії шети, що містять матеріал експериментів інфіку- клітин нирок мавпи), було виявлено, що ММА-ВМ вання, піддавали заморожування/відтаювання З дуже сильно придушується в даній лінії клітин. рази, і одержували розведення від 10-! до 10-12 із Було показано 200-разове зниження в порівнянні з застосуванням ростового середовища КРМІ. Роз- запровадженням. Подібним чином, ММА-575 не ведення вірусу вносили до клітин для тестування і ампліфікувався вище рівня запровадження і також інкубували протягом п'ятьох днів при 37"С, 5956 СО2 була показана злегка негативна ампліфікація, як- для забезпечення розвитку СРЕ (цитопатичного от 16-кратне зниження в порівнянні з запрова- ефекту). Клітини для тестування фіксували (суміш дженням. Найкраще ампліфікувався ММА-НІК із ацетон/метанол 1:1) протягом 10хв., промивали ЗО-разовим підвищенням у порівнянні з запрова-

РВ5 і інкубували з поліклональним антитілом, дженням, і за ним випливає ММА-Мего із 5-разовим специфічним у відношенні вірусу коров'ячої віспи підвищенням у порівнянні з запровадженням. (Оцапей Вепіп, Саї. Мо.9503-2057| при розведенні Найбільш цікавим було порівняння кінетики 1:1000 у буфері для інкубації протягом однієї го- росту різноманітних вірусів у лініях клітин людини. дини при кімн. темп.Після промивання двічі за до- У відношенні репродуктивної реплікації в клітинах помогою РВ5 |Сірсо, Саї. Мо.20012-019| добавля- 1438 (лінія клітин раку кістки людини) було пока- ли кон'юговане з НРЕ антитіло проти кролика зано, що ММА-Мего є єдиним, що виявляє ампліфі- (Рготеда Мапппеїт, Саї. Мо.М/4011) у розведенні кацію в порівнянні з запровадженням (З-кратне 1:1000 у буфері для інкубації (РВ5, що містить 390 підвищення). Всі інші віруси не ампліфікувались

ЕС5) протягом однієї години при кімн. те- стосовно запровадження, але була велика різниця мп.Клітини знову двічі промивали РВ5 і інкубували між ММА-НІ-К ії ММА-ВМ ії ММА-575. ММА-НІ-К був з розчином, що офарблює, (щойно приготованим "прикордонним" (1-кратне зниження стосовно за- 1бмл РВБ5200мкл насиченого розчину /-о- провадження), а у відношенні ММА-ВМ було пока- діанізидина в 10095 етанолі-15мкл НгО») до про- зано найбільше пригнічення (30-разове зниження яву коричневих плям (друга година). Розчин, що стосовно запровадження), за яким випливає ММА- офарблює, видаляли, і добавляли РВ5О для при- 575 (59-разове зниження стосовно запроваджен- пинення реакції фарбування. Кожну лунку, що ня). У результаті ММА-ВМ є найвищим у відношен- проявила коричнева пляма, відзначали як позити- ні придушення в клітинах 143В людини. вну у відношенні СРЕ, і розраховували титр по Більш того, у відношенні реплікації в клітинах формулі Кербера (на основі аналізу ТСІОво) Неї а (клітинах раку шийки матки людини) було

ЇКаєтрег, С. 1931. Агсй. Ехр. Раїної!ї. Рнаптакої. показано, що в даній лінії клітин ММА-НІ-К добре 162,4801). ампліфікується, навіть краще, ніж у пермісивних

Віруси застосовували для інфікування дубльо- клітинах ВНК (НеГа-25-разове підвищення в порі- ваних рядів, з одного боку, СЕЕ і ВНК, що, як очі- внянні з запровадженням; ВНК-88-разове підви- кувалося, є пермісивними для ММА, і, з іншого бо- щення в порівнянні з запровадженням). ММА-Мего ку, СМ-1, Неїа, 1438 і Насаї, що, як очікувалося, є також ампліфікувався в даній лінії клітин (27- непермісивними для ММА, при низькій множиннос- разове підвищення в порівнянні з запроваджен- ті інфікування (тої), тобто 0,05 одиниць, що - ням). Проте ММА-ВМ, а також, у меншому ступені, інфікують, на клітину (5х107 ТСІЮво) Після цього ММА-575 придушувалися в даних лініях клітин вірусний прищеплювальний матеріал видаляли, і (ММА-ВМ-29-разове зниження в порівнянні з за- клітини три рази промивали для видалення всіх провадженням, а ММА-575-6-разове зниження в що залишилися неабсорбованими вірусів. Інфіко- порівнянні з запровадженням). вані клітини лишали сумарно на чотири дні, коли Що стосується реплікації в клітинах Насаї (клі- одержували вірусні екстракти і потім титрували на тинної лінії кератиноцитів людини), було показано, клітинах СЕРЕ. У таблиці 1 і на Фіг.1 показані ре- що ММА-НІК добре ампліфікується в даній лінії зультати тесту титрування, де розміри подані у клітин (55-кратне підвищення в порівнянні з запро- виді загальної кількості вірусів, що утворилися вадженням). ММА-Мего адаптований і ММА-575 через 4 дні після інфікування. виявляли ампліфікацію в даній лінії клітин (1,2 і

Було показано, що в клітинах СЕЕ (фіброблас- 1,1-кратне підвищення в порівнянні з запрова- тах куриного ембріона) добре ампліфікуються усі дженням, відповідно). Проте ММА-ВМ був єдиним, віруси, що можна було очікувати, оскільки СЕЕ є що виявляв придушення (5-кратне зниження в по- пермісивною лінією клітин для всіх ММА. Крім того, рівнянні з запровадженням). було показано, що усі віруси добре ампліфікують- На закінчення, можна підтверджувати, що ся у ВНК (лінії клітин нирок хом'ячка). ММА діяв ММА-ВМ є найбільш пригніченим вірусним штамом найкращою уявою, оскільки ВНК є пермісивною даної групи вірусів: ММА-ВМ виявляє граничне придушення в лініях клітин людини, показуючи іншими ММАв5. відношення ампліфікації від 0,05 до 0,2 у клітинах 2.1. Різні штами ММА відрізняються за своєю нирок ембріона людини (293: ЕСАСС здатністю стимулювати імунну відповідь.

Мо.85120602) (дані не включені в таблицю 1), він Здатні до реплікації штами коров'ячої віспи ін- дає далі відношення ампліфікації приблизно 0,0 у дукують сильні імунні відповіді в мишей, а у висо- клітинах 143В; відношення ампліфікації приблизно ких дозах є летальними. Хоча ММА є сильно осла- 0,04 у клітинах Не а; відношення ампліфікації бленими і володіють зниженою здатністю до приблизно 0,22 у клітинах НасСаї. Крім того, ММА- реплікації в клітинах ссавців, між різноманітними

ВМ виявляє відношення ампліфікації приблизно штамами ММА є розходження в ступені ослаблен- 0,0 у клітинах СМІ. Лише в клітинах Мего може ня. Дійсно, ММА ВМ, очевидно, є більш ослабле- спостерігатися ампліфікація (відношення 2,33), ним у порівнянні з іншими штамами ММА, навіть у але не в тієї ж ступені, як у пермісивних лініях клі- порівнянні з вихідним штамом ММА 575. Для ви- тин, таких як ВНК і СЕБЕ (порівняй із таблицею 1). значення того, чи впливає дане розходження в

Таким чином, ММА-ВМ є єдиним штамом ММА, що ступені ослаблення на ефективність ММА в індукції демонструє відношення ампліфікації нижче 1 у захисних імунних відповідей, робили порівняння всіх лініях клітин людини 1438, Неїйа, Насаї і 293. різноманітних доз ММА ВМ і ММА 575 на моделі

ММА-575 виявляє профіль, подібний із ММА- летального контрольного зараження коров'ячої

ВМ, але не придушується, як ММА-ВМ. віспою. Ступінь захисту вимірювали по зниженню

ММА-НІК добре ампліфікується у всіх тесто- титрів коров'ячої віспи в яєчниках через 4 дня піс- ваних лініях клітин (за винятком клітин 1438), та- ля контрольного зараження, оскільки це забезпе- ким чином, його можна розглядати як компетент- чувало кількісну оцінку дії різноманітних доз і шта- ний у відношенні реплікації у всіх тестованих лініях мів ММА. клітин, за винятком клітин 143В. В одному випадку Модель летального контрольного зараження він ампліфікується в лінії клітин людини (Не! а) Вільних від даного патогена 6б-8-тижневих са- навіть краще, ніж у пермісивній клітинній лінії мок миші ВАГ В/с (Н-29) (п:5) імунізували (у/б) різ- (ВНЮ). номанітними дозами (102, 107 або 106 ТСІОзо/мл)

ММУА-Мего виявляє ампліфікацію у всіх лініях або ММА ВМ, або ММА 575. ММА ВМ і ММА 575 клітин, але в меншому ступені, чим це демонструє розмножували на клітинах СІРИЙ, очищали в са-

ММУА-НІК (при ігноруванні результату з 1438). харозі і готували в трис, рН7,4. Через три тижня

Проте, із погляду пригнічення його не можна розг- миші одержували повторну ін'єкцію тієї ж дози і лядати як такого, що відноситься до того ж "класу", того ж штаму ММА із наступним через два тижні що ії ММА-ВМ і ММА-575. летальним контрольним зараженням (у/б) здатним 2. Реплікація іп мімо до реплікації штамом коров'ячої віспи. У якості

Приймаючи до уваги те, що деякі штами ММА здатного до реплікації штаму вірусу коров'ячої явно реплікуються іп міго, перевіряли здатність віспи (що позначається як "гМУ") застосовували різноманітних штамів ММА реплікуватись іп мімо із або штам УУБ-І 929 ТК, або штам ІНО-). Контро- застосуванням моделі трансгенних мишей льні миші одержували вакцину-плацебо. Захист

АОК129. У даної лінії мишей є спрямовані ушко- вимірювали по зниженню титрів у яєчниках, що дження генів рецептора типу І ІЕМ (ІЕМ-а/р) і типу ІЇ визначені через 4 дня після контрольного зара- (ІЕМ-У) і в гені КАС. Внаслідок даних ушкоджень у ження за допомогою стандартного тесту плям. Для мишей відсутня система ІЕМ, і вони не здатні про- цього мишей забивали на 4 день після контроль- дукувати зрілі В і Т клітини, і за змістом мають ва- ного зараження, яєчники виділяли, гомогенізували жке порушення імунітету і високочутливі до вірусу, в РВ5З (мл), і титри вірусу визначали за допомо- що реплікується. Групи із шести мишей імунізува- гою стандартного тест по бляшках із застосуван- ли (у/б) 107 БОЕ ММА-ВМ, ММА-НІ-К або ММА 572 ням клітин МЕКО (Тпотзгоп еї аї., 1998, 9. Іттипої. (що застосовувались в 120000 чоловік у Німеччині) 160:1717). і контролювали щодня на предмет клінічних про- Миші, які вакциновані двома імунізаціями 107 явів. Усі миші, що були вакциновані ММА-НІ 2 або або 105 ТСІЮво/мл ММА-ВМ або ММА-575, були

ММА 572, загинули в межах 28 і 60 днів, відповід- цілком захищені, судячи з 10095 зниженню титрів но. При скресанні трупів були виявлені загальні ГММ у яєчниках через 4 дня після контрольного ознаки важкої вірусної інфекції в більшості органів, зараження (Ффіг.2). Вірус контрольного зараження і, за допомогою стандартного тесту по бляшках, у був віддалений. Проте при менших дозах спостері- яєчниках був виявлений ММА (108 БОЕ). На про- галися розходження в ступені захисту, що забез- тивагу цьому, миші, що була вакцинована тієї ж печується ММА-ВМ або ММА-575. Миші, що одер- дозою ММА-ВМ (відповідному штаму ЕСАСС жували дві імунізації 10 ТСІОво/мл. ММА-575, не

М00083008, що зберігається) виживали протягом були захищені, судячи з високих титрів ГММ у яєч- більш 90 днів, і ММА не удавалося витягти з орга- никах (у середньому 3,7х107 БОЕч/-2,11х107). На- нів або тканин. впроти, у мишей, що вакциновані тією ж дозою

Дані досліджень, що взяті разом, іп міго і іп ММУА-ВМ, індукувалось значне зниження (96965) ти- мімо чітко показують, що ММА-ВМ пригнічений у трів ГУМ у яєчниках (у середньому 0,21х107 БОЕ м/- значно більшому ступені, чим вихідний і наявний у 0,287х107). У контрольних мишей, що одержували продажі штам ММА-НІ-В. вакцину-плацебо, середній титр вірусу складав

Прикладад БИЛ1х107 БОЕ(1/-3,59х107) (Фіг.2).

Імунологічні дані і дані іп Ммо , Обидва штаму ММА індукують захисні імунні

Дані експерименти були початі для порівняння відповіді в мишей проти летального контрольного різноманітних доз і режимів вакцинації ММА-ВМ з зараження гум. Хоча обидва штаму ММА однаково ефективні при більш високих дозах, ММА-ВМ є повідей і порівнювали з режимами приміювання більш ефективним, чим його батьківський штам ДНК/бустинга ММА, що, як повідомлялося, є кра-

МУА-575 в індукції захисної імунної відповіді проти щими. Різноманітні режими оцінювали з застосу- летального контрольного зараження гГУМ, що може ванням мишиної політопної конструкції, кодує або бути пов'язане з підвищеним ослабленням ММА- вектором ДНК, або ММА-ВМ, і порівнювали рівні

ВМ у порівнянні з ММА-575. СТІ. індукції за допомогою ЕГІЗРОТ, а авідність 2.2. МУА-ВМ у режимах приміюючої-повторної відповіді вимірювали як ступінь що досягається вакцинації захисту після контрольного зараження грипом. 2.2.1. Індукція антитіл проти ММА після вакци- Конструкції нації мишей різноманітними вакцинами проти Плазмідна ДНК, що кодує політоп миші (10 епі- віспи топів СТІ, включаючи грип, овальбумін), була ра-

Ефективність ММА-ВМ порівнювали з іншими ніше описана (Ппотвзоп еї аї., 1998, 9. Іттипої. штамами ММА і коров'ячої віспи, що раніше засто- 160: 1717). Даний політоп миші був вставлений у совувались для придушення віспи. Дослідження делеційний сайт Ії ММА-ВМ, розмножений у кліти- включало однократні імунізації з застосуванням нах СЕРЕ, очищений у сахарозі і поданий у трис, штамів коров'ячої віспи ЕІ5ігеєе і УУуейй, вирощених рн? 4. у клітинах СЕР і введених шляхом скарифікації Методики вакцинації хвоста, і імунізації з застосуванням ММА 572, що У даному дослідженні конкретного патогена раніше застосовували в програмі придушення віс- застосовували 6б-8-тижневих самок миші ВАСВ/с пи в Німеччині. Крім того, було проведене порів- (Н-24). Для аналізу ЕГІЗРОТ використовували гру- няння ММА-ВМ і ММА 572 у якості пре-вакцини з пи з 5 мишей, а в експериментах із контрольним наступною вакцинацією ЕЇІ5зігее за допомогою ска- зараженням грипом застосовували по 6 мишей на рифікації хвоста. Для кожної групи використовува- групу. Мишей вакцинували з застосуванням різних ли вісім мишей ВА! В/с, і усі вакцинації ММА (1х107 режимів приміювання-бустинга з використанням

ТСІО»о) робили підшкірно на 0 і З тижнях. Через ММА або ДНК, що кодує політоп миші, як докладно два тижні після повторної імунізації мишей підда- описано в результатах. Для імунізації ДНК мишей вали контрольному зараженню коров'ячої віспою анестезували і потім вводили однократну ін'єкцію (ІНО-У), і через 4 дні після контрольного зараження зОмкг вільної від ендотоксина плазмідної ДНК (У визначали титри в яєчниках. Всі вакцини і режими 5Омкл РВ5) у чотириглавий м'яз під наркозом. Іму- забезпечували 10095 захист. нізації, що приміює, із застосуванням ММА здійс-

Імунні відповіді, що індуковані застосуванням нювали або шляхом внутрішньовенного введення даних різноманітних вакцин або режимів, вимірю- 107 БОЕ ММА-ВМ на мишу, або шляхом підшкірно- вали у тварин перед контрольним зараженням. го введення 10'або 108 БОЕ ММА-ВМ на мишу.

Застосовували тести для виміру рівнів що нейтра- Бустингові імунізації проводили через три тижні лізують антитіл, проліферації Т клітин, продукції після приміюючих імунізацій. Бустинг плазмідної цитокінів (ІЕМ-у проти 1--4) і продукції ІЕМ-у Т клі- ДНК робили тим же чином, що і імунізацію, що тинами. Рівень відповідей Т клітин, що індуковані приміює, ДНК (дивися вище). Для встановлення

ММА-ВМ, за результатами виміру за допомогою СТІ відповідей проводили стандартні аналізи

Еї5рої, був у цілому еквівалентний тим, що визи- ЕП5РОТ |бсппеїдег еї аї., 1998, Маї. Мед. 4; 397- валися іншими ММА і вірусами коров'ячої віспи, що 402| на спленоцитах через 2 тижні після останньої показує біологічну еквівалентність. Щотижневий бустингової імунізації з застосуванням епітопного аналіз титрів антитіл проти ММА після застосуван- пептида СТІ. грипу (ТМХОКТКАЇУМ,), епітопного пеп- ня різних режимів вакцинації показав, що вакцина- тида Р. Вегопеї (ЗМІРБЗАЕКІ), епітопного пептида ції ММА-ВМ значно підвищували швидкість і розмір Суотедаіюміги5 (МРНЕМРТМІ) і/або епітопного відповіді антитіл у порівнянні з іншими режимами пептида (СМ (РКОАБОМУМ). вакцинації (Фіг.11). Дійсно, титри антитіл проти Для експериментів із контрольним зараженням

ММА були значно вище (р»0,05) на 2, 4 і 5 тижнях мишей анестезували і інфікували і/н сублетальною (через 1 тиждень після повторної реімунізації на 4 дозою поширеного вірусу грипу, Мет?71 (4,5х105 тижні) при вакцинації ММА-ВМ у порівнянні з вак- БОЕ в 5О0мл РВ5). На 5 день після інфікування цинацією мишей ММА 572. Після бустерної вакци- легені видаляли, і титри вірусу визначали в двох нації на 4 тижні титри антитіл були також значно паралелях на лінії клітин нирок собаки Мадіп- вище в групі ММА-ВМ у порівнянні з мишами, що Оагбу із застосуванням стандартного тесту бляшок одержували однократну вакцинацію штамів коро- грипу. в'ячої віспи ЕІбігее або Умуеїй. Дані результати Результати чітко показують, що 2 вакцинації ММА-ВМ викли- При застосуванні однієї вакцини ДНК СТІ. ін- кають більшу відповідь антитіл у порівнянні з кла- дукція на 4 Н-29 епітопа, кодує політопом миші, сичною однократною вакцинацією традиційними була погана, і лише на два епітопа Р. Вегопеї штамами коров'ячої віспи (ЕіІбігее і УуУуей), і підт- (ЗМІРЗАЕКІ) і віруси лімфоцитарного хоріоменін- верджують дані розділу 1,5 про те, що ММА-ВМ є гита (РЕОАБОМУМ) можна було виявити слабкі більш імуногеним, чим інші штами ММА. відповіді. На противагу цьому, при застосуванні 2.2.2. Режими приміювання і бустинга ММА ви- режиму приміювання ДНК і бустинга ММА (107 БОЕ кликають той же рівень захисту, що і режими при- ММУА-ВМ, що вводився підшкірно) спостерігалася міювання ДНК і бустинга ММА на моделі контроль- значно велика СТІ. індукція на 51 М (8-кратне під- ного зараження грипом. вищення) і РКО (З3-кратне підвищення), і відповіді

Оцінювали ефективність режимів приміюван- також спостерігалися у відношенні третього епіто- ня-бустинга ММА в індукції високоавідних СТІ. від- па, цитомегаловіруса миші (У«РНЕМРТМІ.)) (фіг. ЗА).

Проте застосування 107 БОЕ ММА-ВМ, що вво- лення в межах груп не було значимої різниці між диться підшкірно, при гомологічному режимі при- середніми рівнями 5ІМ у групах, що вакциновані міювання-бустинга індукувало той же рівень відпо- ММА-ВМ пеї або ММА-ВМ. Проте кількість ІМ у відей, що і ДНК із наступним ММА-ВМ (Фіг.ЗА). групі, що вакцинована ММА-ВМ пеї, було в цілому

Зненацька виявилося, що при застосуванні однієї в 10 разів нижче в порівнянні з контрольної (ММА- імунізації ММА-ВМ (107 ТСІОво) немає істотної різ- ВМ) групою. Більш того, через 35 тижнів після інфі- ниці в кількості СТІ, що індуковані проти трьох кування (початок періоду спостережень) лише 1 із епітопів, що вказує на те, що повторна імунізація шести мавп, вакцинованих ММА-ВМ пеї, прийш-

МУА-ВМ не підвищує істотно СТІ. відповіді. лося умертвити у зв'язку з вагою хвороби в порів-

Раніше було показано, що підшкірне введення нянні з 4 із б тварин у контрольній групі (Фіг.5). 107 БОЕ ММА є самим неефективним шляхом і Розвиток хвороби чітко корелювало з великою концентрацією вірусу для вакцинації при застосу- кількістю вірусу, у зв'язку з чим тварин спостеріга- ванні інших штамів ММА, особливо в порівнянні з ли додатково протягом 29 тижнів після інфіку- внутрішньовенними імунізаціями (5сппеїдег еї аї. вання. Вакцина ММА-ВМ пеї, очевидно, уповільню- 1998). Для визначення оптимальних режимів імуні- вала прогресування хвороби в порівнянні з зації зазначений вище експеримент був повторе- контрольною групою, і навіть на 46 тижню після ний із зміною або кількості вірусу, або способу інфікування 5 із 6 тварин із ММА-ВМ пеї залишали- введення. В одному експерименті вакцинації 107 ся живі (Фіг.5). Проте до 59 тижня після інфіку-

БОЕ ММА-ВМ були здійснені внутрішньовенно вання ще двоє тварин із групи, що вакцинована (Фіг.38). В іншому експерименті 108 БОЕ ММА-ВМ пеї, були умерщвлені, у результаті чого в живих уводили підшкірно (Фіг.3С). У даних експеримен- залишилося п'ять тварин (три з групи ММА-ВМ пеї їі тах імунізації приміювання-бустинга ММА-ВМ інду- два, що вакциновані ММА-ВМ). Визначення титрів кували великі середні кількості СТІ. проти всіх антитіл, які вироблені проти ММА-ВМ у даних 12 трьох СТІ. епітопів у порівнянні з режимами при- мавп, чітко показало, що ММА-ВМ може посилюва- міювання ДНК і бустинга ММА. Також на відміну від ти імунну відповідь навіть при наявності імунітету, 107 БОЕ ММА-ВМ, що введений підшкірно, імуніза- що предіснує, проти ММА (Фіг.б). Після імунізації, ція 107 БОЕ ММА-ВМ, що введений внутрішньо- що приміює, ММА-ВМ або ММА-ВМ пеї у всіх мавп венно, і імунізація 109 БОЕ ММА-ВМ, що введений індукувалась відповідь антитіл проти ММА із сере- підшкірно, значно підвищувала СТІ. відповіді, чітко днім титром 1000. Дана відповідь антитіл значно показуючи, що ММА-ВМ може бути застосований збільшувалась після повторної імунізації, що чітко для посилання СТІ. відповідей при наявності імуні- показує, що ММА може бути застосований для тету, що предіснує, проти вектора. індукції імунної відповіді приміюванням-бустингом 2.2.3. Ефективність вакцини ММА-ВМ пеї у ма- у здорових мавп.Дані титри антитіл поступово как резус інфікованих 5ІМ. Визначення ефективно- знижуються, хоча до 49 тижня після імунізації тит- сті вакцини ММА-ВМ пеї здійснюють шляхом оцінки ри виходили на плато, у результаті чого середні кількості вірусу і затримки захворювання після титри проти ММА на 99 тижню рівнялися 2000. контрольного зараження вірулентним первинним П'ять мавп, що вижили, інфікували 5ІМ і мали ізолятом ЗІМ. Крім того, дослідженням повинно імунодефіцит із показником СО4 нижче 400/мкл було бути встановлено, чи може ММА-ВМ бути крові. Для дослідження впливу застосовуваного застосований для безпечно посилених імунних МУА-ВМ у мавп із порушеним імунітетом п'ять тва- відповідей у мавп з імунною недостатністю при рин вакцинували три рази ММА-ВМ гаї на 100, 102 і наявності імунітету, що предіснує, проти ММА. 106 тижнях після вихідної вакцинації. Перша імуні-

Методики вакцинації зація ММА-ВМ їаї значно підвищувала відповідь

Дві групи (п-6) макак резус (Масаса таїака) антитіл проти ММА у даних мавп із порушеним вакцинували болюсною внутрішньом'язовою ін'єк- імунітетом, що додатково підвищувався третьою цією або одним ММА-ВМ, або рекомбінантним імунізацією шість тижнів через (фіг.б). Дані резуль-

МУА-ВМ пеї на 0, 8 і 16 тижнях. На 22 тиждень усіх тати додатково показують, що ММА-ВМ може по- мавп піддавали контрольному внутрішньовенному силювати імунні відповіді при наявності значного зараженню 50 МіІОзо патогенним, що пов'язаний із імунітету, що предіснує, до ММА, навіть у мавп із клітинами матеріалом 5ІМ (1ХС) із первинних не- порушенням імунної системи. Хоча імунна відпо- культивованих РВМС макак резус. Клінічний стан відь мавп посилювався після імунізації ММА-ВМ гаї, тварин відслідковували з високою частотою, і ре- рівні 5БІМ залишалися стабільними, що вказує на гулярно відбирали зразки крові для виміру віремії, те, що імунізації ММА-ВМ є безпечними і не впли- імунологічних показників і повного спектра гемато- вають на рівень 5ІМ у мавп із порушенням імунної логічних параметрів і параметрів клінічної хімії системи (Фіг.7). крові. Тварин, у яких СНІД розвивався у формі Дане дослідження показало, що ММА-ВМ може хвороби, забивали, а мавп, що вижили, відслідко- приміювати-посилювати імунні відповіді в мавп вували протягом 99 тижнів після вакцинації. На резус із порушенням імунної системи і що імуніза- 100 тижню мавп, що вижили, імунізували в/м ММА- ції ММА-ВМ є безпечними і не впливають на рівень

ВМ гаї, і тварини одержували додаткові імунізації віремії у тварин, інфікованих 5ІМ. Затримка в роз- тим же ММА-ВМ гаї на 102 і 106 тижнях. витку СНІД-подібної хвороби у тварин, які вакци-

Не спостерігалося несприятливих ефектів піс- новані вакциною ММА-ВМ пеї, указує на успішне ля будь-якої вакцинації або ММА-ВМ, або ММА-ВМ формування імунної відповіді на пеї. пеї. Після інфікування мавп 5ІМ різко зростав рі- 2.2.4. Терапевтична вакцинація інфікованих вень віремії з максимумом через два тижні після ЗІМ мавп, що були піддані протиретровірусному інфікування (Фіг.4). Через великі стандартні відхи- лікуванню

Терапевтична вакцина проти ВІЛ на основі не було (Фіг.6). За допомогою ЕГІБА для лізатів

ММА-ВМ, очевидно, може бути застосована в інди- інфікованих 5ІМ Т-клітин було показано, що у тва- відуумів, що піддаються протиретровірусному лі- ринних усіх груп виникає відповідь антитіл проти куванню. У зв'язку з цим у даному дослідженні ви- ЗІМ до 4 тижню після інфікування (Фіг.9). Титр ан- вчали безпеку (дія на рівень 5ІМ) і ефективність титіл проти 5ІМ у контрольній групі (фізіологічний рекомбінантних ММА, що кодують множину анти- розчин) знижувався в ході лікування РМРА і швид- генів ІМ (дад, рої, епу, гем, їаг і пе? в інфікованих ко збільшувався після припинення лікування

ЗІМ мавп, що лікувалися РМРА. РМРА являє со- РМРА, що відбиває зниження і наступне підви- бою нуклеозидний аналог і ефективний проти ВІЛ і щення в рівні ЗІМ у період протиретровірусної те- 5ІМ (Козепуіпй, В. еїа!., 2000, 9 Мігої! 74, 1704-11). рапії (Фіг.9). Подібний паттерн титру антитіл проти

Конструкції ЗІМ спостерігався в групі 2, що одержувала ММА-

Всі рекомбінантні конструкції ММА розмножу- їаї, ММА-гем і ММА-пеї що, можливо, відбиває вали на клітинах СЕР, очищали в сахарозі і скла- знижену експресію даних регуляторних білків у дали в трис рін7,4. лізатах інфікованих 5ІМ Т клітин, що показані за

Методика вакцинації допомогою ЕГІЗА. На противагу цьому, проте, тит-

Три групи (п-6) мавп резус (Масаса тшіаца) ри антитіл проти 5ІМ у групі 1 зростали після вак- інфікували 50 МІОзо патогенного первинного ізоля- цинацій ММА дад-рої і ММА-епм на 10 тижню, що ту ЗІМ (ІХС) їі потім щодня гоїли РМРА (бомг/кг, вказує на те, що ММА-ВМ може посилювати імунну вводимого п/к) протягом 19 тижнів. На 10 тиждень відповідь проти 5ІМ в інфікованих (5ІМ) тварин, що тварин вакцинували рекомбінантним ММА-ВМ (у/м) підлягають протиретровірусній терапії. Важливо, або фізіологічним розчином, і тварини одержували що титри антитіл проти 5ЗІМ підвищувалися після ідентичні вакцинації через 6 тижнів. Група 1 одер- повторної імунізації на 16 тижню, що знову пока- жувала суміш ММА дад-рої і ММА-епу, група 2 оде- зує, що ММА може посилювати імунні відповіді у ржувала ММА-йаі ММА-гем і ММА-пеї, а група З тварин із порушенням імунної системи, навіть при одержувала фізіологічний розчин. Клінічний стан наявності імунітету, що предіснує, проти ММА тварин часто перевірявся, і зразки крові регулярно (Фіг.8). Титри антитіл проти ММА у групі 1 також відбиралися для виміру віремії, імунологічних по- відбивали даний паттерн із формуванням відповіді казників і повного спектра гематологічних параме- антитіл після первинної імунізації, і ця відповідь трів і параметрів клінічної хімії крові. значно посилювалася після повторної вакцинації

У усіх тварин установлювався високий рівень (Фіг.10).

ЗІМ із максимумом через 2 тижні після інфікування Посилання (Фіг.8). Після щоденного лікування РМРА рівні 5ІМ осппеїаег, 4., сіре, 5С, Віапспага, ТУ., Напке, знижувалися і стабілізувалися на низькому рівні до Т., Корзоп, К., Наппап, СМ., ВескКег, М., біпаеп, 9 тижня. Як і в попередньому дослідженні, вакци- А., тій, С, апа нії, АМ5. 1998. Еппапсеа нація ММА на 10 і 16 тижнях не впливали на рівні ітітиподепісйу їог СО8- ТТ сеї! іпаисіоп апа 5ІМ, що свідчить про те, що ММА-ВМ є безпечним сотрієїє ейісасу ої таїапйа ОМА массіпайоп бу вакцинним вектором для тварин із порушенням роовііпуд м о тоайейа массіпіа міпиє АпКага. Маї. імунної системи. Після припинення лікування тва- Меа. 4; 397-402. рин РМРА (21 тиждень) рівні 5ІМ збільшуються. Тпотвоп, 5ЗА., ЗПпеп-й, МА., Медмесаку, »9.,

Хоча в трьох тварин у групі 1 рівні ІМ були зниже- ЕїШой, 5, Мов5, 0у., Регтападо, СУР., Вгом/п, І Е., ні в порівнянні з контрольною групою 3, достовір- апа Зипбрієї, А. 1998. Оеєїїмегу ої тиШріеє СО5 них розходжень середньої кількості ЗІМ між будь- суоїохіс Т се ерйоре5 Бу ОМА мабссіпайоп. 9. якими групами після припинення лікування РМРА Ітітипої. 160: 1717.

Таблиця 1 777111. СЕР | неа | наСаг | 1438, | внк | Усю | СУ о МУА-ВМ | 579673 | 004 02? | 000 | 6588 | 233 | 000 о ММА-575 | 796,53 | 015 | 117 | 002 | 13122 | 1066 | 006 (

Ампліфікація вірусу вище рівня запрова- ня ампліфікації - вихід ТСІОЮво запровадження дження через 4 дня після інфікування Відношен- ТОСІО5о- Розміри виражені в ТСІОво.

ваднендения видівівхід тої щоб й дені піспа інфікування дого - пивом я

І що ,

СОН в У НН лини пннжжажжнжнжажашжяжшлжялщаяшяюлЛии г З КВ і і; ме ше вв пек шк ИН ши дор | НЕ ко ваю й . Її ККУ Б | : Й я Ман

М КУ и 5 КАК ноя ВІК У 1 щі ше, А С40СКООНЕЯ Ба 5 «АЖ т

Ша шини й Вис 5 НЕ і ! 50018855 ій ай, й, й. сю НОЙ меня ний нд МВККРКН й. х її ЩІ й МУАМенх вуаля | Б) | іх:

ДУ г вок яоожтетюте життє тю тя тенет ТТ ТТ ТТ тт те пече тет тотьтіт тет зов й У У тт с У са за се

Її дув ВА мкА іКурсатв) (Маєте) Шавна) (нодина; пвадина)

ЗИ, У нннлтнтннннлятсте тт тт тт тет тет тет тет тет тот тент т тюнер тт)

Гек тик же ВЕЛО жів нні вик) еле клічн

ФІГЛА чЧіг. в пули тнтютт тет жт тт тя тя ттятя п АКА КАААКАААКААААКАА НААН 5 51 МУК ВМ

А Н що 8. пчьятв

І ; ке пежею СД

М

Коб. х т ж

З в. й, | 5 1200 пт : ШИ г х ДНК/ДНК 5 | ши ЕОМ ж ДНК / МУ ї | ! . є во С ММА ММА

Кк 1 2 ММА

І що -

ЩІ м

І Я ш й Хор -е пилу ую пл кл в. о 2 я 5 а є о

Доза МУ, ваедена яри прихінованні та бустмигу Вод) Е що | |: я І

ЩЕ І-И |; - ня ж В й с. т ха чага Е в Ра 0 тУб о ХРНО ММА 5

В «Вк у х 3000 1 нання

Е ШМУА/МУА пік тво я ванкІдНЕ «8 25003 м ДНК ММА вів і В ММАЛМУА 2 ! СМУД/ МУХА вів 1400 Но ДНЕМ т 2000 ! ! 5 ММА вів 1200 ТЯ г ще 100 и В 4500 во с 51. об БЕ є 10001 ТІ яю В й Е ія 200 г, їй й в й ; Ії и Бор яна йя:. ВШ ї в М й я ш БИЙ

ММА ву РО УРН . ' 2 У ВРа тУй о УРН ММА

, : х -- МУХА ВМ

Вакцинація МА ве Її ти "МУ ВК не не Я в 5 факчажаняжакия снбетнникихіоккінях я - Н що 1Ф До А - 4 З

МВ - з г ія К Шен ау До е

Ен І. ше : Е 2 ши у са х я і я І і Е 1 г ке | а : т

Е 0 4 8 121519232629 32353943 46.29 53

Е 101 Дні після контрольного зараження

Фо 1 2 3 4 12 20 28 З

ФіГг.5

Контроль: МУА-НИ 191 - - ф-о і пен ИН поь Х, Н і ю Й га (у ден Й я Їй п Н у чо й 4 захо "Я : ї-е М | м: тококо. е «, до й ча х і і ні 54 щі г: і і і У 4 ж ж А ре 8. З х ! г й К-Я ж я ж Ж яю М г ці Е : 5 зла м

Е | Я 7 тіла х 3 З й | і «їз Н де У з

Б 10 | ок; ТІ, 5 г і

Ї щ що у ж -ь

Ї В ох, ча ув Е рн ; м 7 к і : рі ! : 0 1 23 3 ж 12 20 28 36 ж і І з Ка ВАК ВИ "Тижні піспя інфікування З йо 13 25 95 3 40 45 5 85 85 83 Зо На

ТижУ й приманвануй вакцини

ФІГ А Фіг з Див т -- в НІ й 5 не : сн МА НЯ дар епу і

В не Не Шу -а-МУА ВМ ай, тех, пої ї з ур дан ИН І др - Е Б - й фізвлевчний рознин х це ВЕссоррнннняй ост енлжтсй Я Не я 1 і, в дн що х ; НІ

Е | я Е не | і й о В і | В 5 | пове ! ! ! жов 2 і в й і

Е я ПРІ а й

Я їв мом У ще с я і во і це: м ! ж Й | | | і Н : Н в. й 1 : Н і ж У т їі Ж

Е т т : цент плода ро ркоке т елеотрее третя КВК ення

І за м 18 16 8 чів 815 3 5 7 5 15 16 55 25 38 58 35

Тижні піспю пержиниої закцимації У яЖУК кістка Зфікування

ФГ. ФА в її го ув

Е - 5 ї й. во 1 ЯКЕ уяв хі 5 і й й ною. .

Е - в ра і х ни ї ці ою в - МА дадівої, еп | Е "ші ин

ВО ж- ши щи ж ще У оц і Я а МУА гу, бай, по Х ! і-й ї

ДД-н и ІЗ й й і і г ці ММ 00 -А-фрвологічний розчин Е й що й | мож

З Ж РМРА ! Н зо: ; й І Ж оомюло РНКА о 8 130 Б о2о 4 28 55 37 81 45 ла й й пппндрнянткодднклннтяня см І: Из ВИ ЗИ: ПИ: ПИ ЗВ

ХТижні після інфікування

Теоки після інфікування

Фіг Фігло д кві й щ і Н й

КЗ : і р ажудаМ :МуаВВ 5 і ; у І УМАБХВ: ВА ВРХ : і Її У МАКИ Бівех

Її захо - | уж ХоЕнаех

Н і В Юкщох г Ї т їе х ї і і Удав 14 кА . Же ві бонекь Кей В ВН, гі : І ЗИ З

Хижі після взкчаняцї

ФК лі

Комп'ютерна верстка Т. Чепелева Підписне Тираж 26 прим.

Міністерство освіти і науки України

Державний департамент інтелектуальної власності, вул. Урицького, 45, м. Київ, МСП, 03680, Україна

ДП "Український інститут промислової власності", вул. Глазунова, 1, м. Київ - 42, 01601