KR20200100745A - B형 간염 바이러스(hbv)에 대한 면역 반응 유도를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

B형 간염 바이러스(hbv)에 대한 면역 반응 유도를 위한 방법 및 조성물 Download PDF

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다니엘 보덴
헬렌 호튼
쟌-마크 에드몬드 퍼난드 마리 니프스
수미트라 로이
제롬 허버티나 헨리커스 빅터 커스터스
로날드 크리스티안 잔
마커스 칼라
도리엔 데 푸터
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얀센 사이언시즈 아일랜드 언리미티드 컴퍼니
버베리안 노딕 에이/에스
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Abstract

변형된 백시니아 앙카라(Modified Vaccinia Ankara, MVA) 및 HBV 항원을 인코딩하는 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 또한 인간 대상체 내의 면역 반응을 증진하기 위하여 MVA 및 HBV 항원을 인코딩하는 아데노바이러스 벡터를 프라임/부스트 요법에 사용하여 인간 대상체 내의 면역 반응을 증진하는 방법을 제공한다.

Description

B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 면역 반응 유도를 위한 방법 및 조성물
관련된 출원에 관한 상호 참조
본 출원은 2017년 12월 19일자로 출원된 국제특허출원 제 PCT/IB2017/058148호 및 2017년 12월 19일자로 출원된 미국 가출원 제62/607,439호의 우선권을 주장하며, 상기 출원의 기재사항은 전체가 본 명세서에 참조로 통합된다.
전자적으로 제출된　서열 목록에 대한 참조
본 출원은 EFS-Web을 통해 전자적으로 제출된 ASCII 형식 서열 목록으로서 2018년 12월 14일 작성되고, 49.6KB 크기의 파일명 “688097-413 Sequence Listing”인 서열 목록을 포함한다. 상기 EFS-Web을 통해 제출된 서열 목록은 본 명세서의 일부이며 본 명세서에 전체가 참조로서 통합된다.
발명의 기술 분야
본 발명은 생명공학에 관한다. 보다 구체적으로, 본 발명은 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 면역 반응을 이를 필요로 하는 대상체 내에서 증진시키기 위한 방법 및 조성물에 관한다.
발명의 배경 기술
B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus, HBV)는 4개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 및 7개의 단백질을 인코딩하는 3.2-kb의 작은 간친화성(hepatotropic) DNA 바이러스이다. 약 20억명의 인구가 HBV에 감염되며, 대략 2억 4000만 인구가 만성 B형 간염(만성 HBV)에 감염되었으며, 6개월 이상 동안 혈액 내 지속적 바이러스 및 서브바이러스 입자로 특징지어진다 (1). 지속적 HBV 감염은 HBV-특이적 T 세포 수용체의 바이러스 펩티드 및 순환 항원에 의한 만성적인 자극을 통해 순환 T 세포 및 간내 HBV-특이적 CD4+ 및 CD8+ T 세포 소진으로 이어진다. 결과적으로 T 세포 다기능성이 감소된다(즉, IL-2, 종양괴사인자(TNF)-α, IFN-γ 수준 감소, 및 증식 부족).
HBV 감염에 대한 안전하고 효과적인 예방 백신은 1980년대 이래로 활용 가능하였으며 B형 간염 예방의 중심이다(3). 세계보건기구는 모든 유아의 백신접종, 그리고 B형 간염의 풍토성이 낮거나 중도인 국가에서는 모든 어린이 및 사춘기(18세 미만), 및 특정 취약 개체군 카테고리에 속하는 인구의 백신접종을 권장한다. 백신접종 덕분에 세계 감염률은 극적으로 감소해왔다. 그러나 예방 백신은 수립된 HBV 감염을 치유하지 않는다.
만성 HBV는 현재 IFN-α 및 뉴클레오시드 또는 뉴클레오시드 유사체로 치료되지만, 바이러스 RNA의 주형, 및 따라서 새로운 비리온으로서 중요한 역할을 하며 감염된 간세포 내의 세포내 바이러스 복제 중간체, 소위 공유결합 폐환형 DNA(ccc DNA)의 잔존으로 인하여 궁극적 치유는 없다. 유도된 바이러스 특이적 T-세포 및 B-세포 반응이 효과적으로 cccDNA-보유 간세포를 제거할 수 있을 것으로 생각된다. 현재의 HBV 폴리머라제를 표적화하는 요법들은 바이러스 혈증을 억제하지만, 핵에 존재하는 cccDNA 및 관련된 순환 항원의 생산에는 제한된 효과를 제공한다. 가장 철저한 치유 형태는 유기체로부터 HBV cccDNA를 제거하는 것일 것이지만, 천연 결과로서 또는 임의의 치료적 개입의 결과로서 모두 관찰된 바 없다. 그러나, 질환 재발은 오로지 심각한 면역억제의 경우에만 발생하며 이는 예방적 치료에 의해 예방될 수 있기 때문에, HBV 표면 항원(HBsAg) 손실은 임상적으로 치유의 신뢰성 있게 상당한다. 따라서 적어도 임상적 관점에서, HBsAg의 손실은 가장 엄격한 형태의 HBV에 대한 면역 재구성과 연관된다.
예를 들어, 유한형 치료 과정의 지속된 치료중단 반응의 면에서 페길화 인터페론(pegIFN)-α로의 면역 조절은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 요법과 비교하여 더 나은 것으로 입증되어 왔다. 직접적 항바이러스 효과는 물론, IFN-α는 세포 배양 및 인간화 마우스에서 cccDNA의 후성유전적 억제를 가하여 비리온 생산 및 전사의 감소에 이르게 하는 것으로 보고되었다(4). 그러나 이 요법은 여전히 부작용을 안고 있으며 전반적 반응은 상당히 낮고, 어느 정도는 IFN-α는 HBV 특이적 T-세포에 부족한 조절적 영향 만을 주기 때문이다. 구체적으로, 치유율은 낮고(< 10%) 독성은 높다. 유사하게, 직접적으로 작용하는 HBV 항바이러스제, 즉 HBV 폴리머라제 억제제인 엔테카비르(entecavir) 및 테노포비르(tenofovir)는 약제 내성 돌연변이 발생에 대한 높은 유전적 장벽 및 간 질환 진행에 대한 연속적 방지를 갖는 바이러스 억제 유도에서 단일 요법으로서 효과적이다. 그러나, HBsAg 손실 또는 혈청전환에 의해 규정되는 만성 B형 간염의 치유는, 이러한 HBV 폴리머라제 저해제에 의해서는 드물게 달성된다. 따라서, 인간 면역결핍 바이러스(HIV)에 대한 항레트로바이러스 요법과 유사하게, 이론상 이들 항바이러스제는 간 질환의 재발을 방지하기 위해서는 무한정으로 투여될 필요가 있다.
치료적 백신접종은 만성적 감염 환자로부터 HBV를 제거할 잠재성을 갖는다 (5). 많은 전략들이 탐색되어왔지만, 지금까지 치료적 백신접종은 성공적이라고 입증되지 않았다.
발명의 간략한 요지
따라서, B형 간염 바이러스(HBV), 특히 만성 HBV의 치료에서 보다 높은 치유율을 갖는 유한형의 내약성이 우수한 치료를 위한 충족되지 않은 의학적 요구가 존재한다. 본 출원은 이 요구를 만족시킨다. 변형된 백시니아 앙카라(Modified Vaccinia Ankara, MVA) 벡터가 제공된다. 본 출원의 MVA 벡터는 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-천연 핵산 분자를 포함한다. 상기 MVA 벡터의 HBV 폴리머라제 항원은, 예컨대, 포유류에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게, 상기 HBV 폴리머라제 항원은 포유류에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 적어도 90% 동일하다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, MVA 벡터는 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 신호 서열은, 예컨대, 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 신호서열은 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩될 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, MVA 벡터는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된(truncated) HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1과 적어도 90% 동일하다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
또한 본 출원의 MVA 벡터 및 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물이 제공된다.
또한 면역 반응을 이를 필요로 하는 인간 대상체 내에서 증진하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 (a) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-천연 핵산 분자를 포함하는 면역학적 유효량의 아데노바이러스 벡터 제1 조성물 인간 대상체에 투여하는 단계; 및 (b) 본 출원의 MVA 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 를 포함하여 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역반응을 얻는다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는다. 본 출원의 일 구현예에서, 이를 필요로 하는 대상체 내에서 상기 제1 조성물은 면역 반응을 프라임하기 위한 것이고, 제2 조성물은 면역반응을 부스트하기 위한 것이다. 본 출원의 일 구현예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 후 1-12주에 수행된다. 본 출원의 일 구현예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 후 2-12주에 수행된다. 본 출원의 일 구현예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 1주에 수행된다. 본 출원의 일 구현예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 2주에 수행된다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 그리고 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은, 예컨대, 서열번호 19와 적어도 90% 동일할 수 있다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 아데노바이러스 벡터의 핵산 분자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된(truncated) HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은, 예컨대, 서열번호 17와 적어도 90% 동일할 수 있다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 상기 제1 조성물의 융합 단백질은, 예컨대, 링커를 통해 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원을 포함할 수 있다. 상기 제1 조성물의 링커는, 예컨대, (AlaGly)n 의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, n은 2 내지 5의 정수이다. 바람직하게 상기 링커는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 융합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 항체 반응을 포함한다. 상기 증진된 면역 반응은, 예컨대, 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD8+ T 세포 반응을 포함할 수 있다. 상기 증진된 면역 반응은, 예컨대, 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD4+ T 세포 반응을 포함할 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 rAd26 또는 rAd35 벡터이다.
본 출원의 일 구현예에서, 인간 대상체 내에서 면역 반응을 증진하는 방법은 (a) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자를 포함하는 면역학적 유효량의 제1 플라스미드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자를 포함하는 제2 플라스미드를 포함하는 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 및 (b) 본 출원의 MVA 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 를 포함하여 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역반응을 얻는다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물은 면역 반응을 프라임하기 위한 것이고, 제2 조성물은 면역반응을 부스트하기 위한 것이다. 본 출원의 일 구현예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 후 1-12주에 수행된다. 본 출원의 일 구현예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 후 2-12주에 수행된다. 본 출원의 일 구현예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 1주에 수행된다. 본 출원의 일 구현예에서, 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 2주에 수행된다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 그리고 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은, 예컨대, 서열번호 19와 적어도 90% 동일할 수 있다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은, 예컨대, 서열번호 20과 적어도 90% 동일할 수 있다. 상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은, 예컨대, 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 제1 조성물의 제1 플라스미드의 핵산 분자는 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함한다. 상기 신호 서열은, 예컨대, 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함할 수 있고, 바람직하게 상기 신호 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩된다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 18과 적어도 90% 동일하다. 상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은, 예컨대, 서열번호 18을 포함할 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 제1 조성물의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열을 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 조절 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게 상기 프로모터 서열은 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 그리고 상기 추가적인 조절 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 15, 및 서열번호 16의 폴리아데닐화 신호 서열로 이루어진 군에서 선택된다.
본 출원의 일 구현예에서, 상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 항체 반응을 포함한다. 상기 증진된 면역 반응은, 예컨대, 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD8+ T 세포 반응을 포함할 수 있다. 상기 증진된 면역 반응은, 예컨대, 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD4+ T 세포 반응을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 양태들, 특징들 및 유리점들은 발명의 상세한 설명 및 그 바람직한 구현예 및 첨부된 청구항을 포함하는 이하의 개시로부터 명백할 것이다.
전술한 요지뿐만 아니라 뒤따르는 발명의 상세한 설명은 첨부된 도면과 함께 해석하는 경우 보다 잘 이해될 것이다. 본 발명은 도면에 나타난 엄밀한 구현예에 한정되지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도면에서:
도 1a 내지 도 1b는 B형 간염 바이러스의 게놈 및 바이러스 생명주기를 도시한다; 도 1a는 B형 간염 바이러스(HBV)의 게놈의 도식이고; 천연형 바이러스에서, 폴리머라제 단백질(Pol)은 상이한 오픈 리딩 프레임에서 외피 단백질을 위한 코딩 서열을 포함하고; 상기 외피 단백질(pre-S1, pre-S2, 및 S)는 동일한 오픈 리딩 프레임에 있고; 도 1b는 HBV의 바이러스 생명주기를 나타낸다;
도 2a 내지 도 2c는 본 출원의 구현예들에 따른 아데노바이러스 및 MVA 벡터의 발현 카세트의 개략적 표현을 나타낸다; 도 2a는 절두된 HBV 코어 항원을 위한 발현 카세트를 나타내며, 이는 CMV 프로모터, 인트론(ApoAI 제2 인트론을 함유 하는, 인간 ApoAI 유전자 - GenBank accession X01038 염기쌍 295 - 523, 유래의 단편), 인간 면역글로불린 분비 신호, 뒤이어 절두된 HBV 코어 항원 및 SV40 폴리아데닐화 신호를 위한 코딩 서열을 포함한다; 도 2b는 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원의 융합 단백질을 위한 발현 카세트를 나타내며, 이는 HBV 항원을 제외하고는 절두된 HBV 코어 항원을 위한 발현 카세트와 동일하다; 도 2c는 Pr13.5 긴(long) 프로모터에 작동적으로 연결된 HBV 코어 항원을 포함하는 발현 카세트 및 PrHyb 프로모터에 작동적으로 연결된 HBV 코어 항원을 포함하는 발현 카세트를 나타낸다;
도 3은 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA의 상이한 조합으로 면역화된 F1 마우스의 ELISPOT 반응의 그래프를 나타낸다; 다양한 백신접종된 동물군으로부터 단리된 비장세포의 자극에 사용된 HBV 코어 또는 폴리머라제 펩티드 풀은 흑색(core) 및 회색(pol)으로 나타낸다. Pol1 및 pol2 반응은 합산되었다; X-축은 아데노벡터 용량 및 MVA 부스트의 존재 또는 부존을 나타낸다; 반응성 T-세포의 수는 y-축에 106 개 비장세포 당 반점-형성 세포(spot-forming cell, SFC)로서 표현된다;
도 4는 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA의 상이한 조합으로 면역화된 F1 마우스의 세포내 사이토카인 염색(ICS) 반응의 그래프를 나타낸다; 다양한 백신접종된 동물군으로부터 단리된 비장세포의 자극에 사용된 HBV 코어 또는 폴리머라제 펩티드 풀은 흑색(core) 및 회색(pol)으로 나타낸다; Pol1 및 pol2 반응은 합산되었다; X-축은 아데노벡터 용량 및 MVA 부스트의 존재 또는 부존을 나타낸다; IFN γ 에 양성인 CD8(+) T 세포의 퍼센트는 y-축에 나타난다;
도 5는 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA 벡터의 상이한 조합으로 면역화된 F1 마우스의 ICS 반응의 그래프를 나타낸다; 다양한 백신접종된 동물군으로부터 단리된 비장세포의 자극에 사용된 HBV 코어 또는 폴리머라제 펩티드 풀은 흑색(core) 및 회색(pol)으로 나타낸다. Pol1 및 pol2 반응은 합산되었다; X-축은 아데노벡터 용량 및 MVA 부스트의 존재 또는 부존을 나타낸다; IFN γ 에 양성인 CD8(+) T 세포의 퍼센트는 y-축에 나타난다;
도 6은 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA 벡터의 상이한 조합으로 면역화된 NHPs의 ELISPOT 반응의 그래프를 나타낸다; 다양한 백신접종된 동물군으로부터 단리된 PBMCs의 자극에 사용된 HBV 코어 또는 폴리머라제 펩티드 풀은 사각형(core), 원형(pol1) 및 삼각형(pol2)으로 나타낸다; X-축은 상이한 실험군 및 시점을 나타낸다; 반응성 T-세포의 수는 y-축에 106 개 비장세포 당 반점-형성 세포(spot-forming cell, SFC)로서 표현된다; 배경(배지+DMSO 자극) 차감된 데이터가 나타난다; 및
도 7a, 7b 및 7c는 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA 벡터의 상이한 조합으로 면역화된 NHPs의 ICS 반응의 그래프를 나타낸다; 다양한 백신접종된 동물군으로부터 단리된 PBMCs의 자극에 사용된 HBV 코어 또는 폴리머라제 펩티드 풀은 사각형(core), 원형(pol1) 및 삼각형(pol2)으로 나타낸다; X-축은 상이한 실험군 및 시점을 나타낸다; IFN γ 에 양성인 CD4(+) 및 CD8(+) T 세포의 퍼센트는 y-축에 나타난다; 배경(배지+DMSO 자극) 차감된 데이터가 나타난다.
다양한 공보, 기사 및 특허가 배경 및 명세서에 걸쳐 인용되거나 기재된다; 이들 참고문헌은 각각 그 전문이 본 명세서에 참고로 포함된다. 본 명세서에 포함된 문헌, 행동, 물질, 장치, 제품 등의 논의는 본 발명의 맥락을 제공하는 목적을 위한 것이다. 이러한 논의는 이들 대상의 임의의 것이나 전부가 개시되거나 청구되는 임의의 발명에 대해 선행 발명의 일부를 형성한다는 인정이 아니다.
달리 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 당업자에게 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 다르게는, 본 명세서에서 사용되는 소정 용어는 명세서에 나타낸 의미를 갖는다.
본 명세서 및 첨부되는 청구항에서 사용되는 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 문맥상 명백히 달리 나타내지 않는 한 복수의 언급을 포함함이 주지되어야 한다.
달리 언급되지 않는 한, 본 명세서에 기재된 농도 또는 농도 범위와 같은 임의의 수치 값은 모든 경우에 "약"이라는 용어에 의해 변형되는 것으로 이해되어만 한다. 따라서, 수치 값은 전형적으로, 인용된 값의 ± 10%를 포함한다. 예를 들어, 1 mg/mL의 농도는 0.9 mg/mL 내지 1.1 mg/mL를 포함한다. 마찬가지로, 1% 내지 10% (w/v)의 농도 범위는 0.9% (w/v) 내지 11% (w/v)를 포함한다. 본 명세서에 사용된 바와 같이, 수치 범위의 사용은 문맥상 명백히 달리 나타내지 않은 한, 모든 가능한 하위 범위, 상기 범위 내의 정수를 포함한 그 범위 내의 모든 개별 수치 값 및 그 값의 분수를 명백히 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 일련의 요소들 앞에 있는 "적어도"라는 용어는 일련의 모든 요소들을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다. 당업자는 통상의 실험만을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적 구현예에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 그러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.
본 명세서 및 이하의 청구항 전반에서, 문맥상 달리 요구하지 않는 한, "포함하다(comprise)" 라는 단어 및 "포함하다(comprises)" 및 "포함하는(comprising)"과 같은 활용형은 명시된 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 포함하지만 임의의 다른 정수 또는 단계 또는 정수 또는 단계의 그룹을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "포함하는"은 용어 "포함하는(containing)" 또는 "포함하는(including)" 또는 때로는 용어 "갖는(having)"과 함께 사용될 때 대체될 수 있다.
본 명세서에서 "~로 이루어진다(consisting　of)"를 사용할 때 청구항 구성요소에서 특정되지 않은 임의의 요소, 단계 또는 성분을 배제한다. 본 명세서에 사용될 때, "본질적으로 이루어진(consisting　essentially of)"는 청구항의 기본 및 신규한 특성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 재료 또는 단계를 배제하지 않는다. 본 발명의 양태 또는 구현예의 맥락에서 사용될 때마다, "포함하는(comprising)", "포함하는(containing)", "포함하는(including)" 및 "갖는(having)"의 전술한 용어 중 어느 것을 본 발명의 양태 또는 구현예의 내용에 사용할 경우 개시의 범위를 변경하기 위하여 "이루어진(consisting　of)" 또는 "본질적으로 이루어진(consisting　essentially of)"의 용어로 대체할 수 있다. 각 경우에서 "포함하는", "본질적으로 이루어진(consisting essentially of)" 및 "이루어진(consisting of)" 중 어느 용어는 다른 두 용어로 대체될 수도 있다.
본 명세서에 사용되는, 복수의 요소들 간의 연결 용어 "및/또는"은 개별 옵션 및 결합된 옵션 모두를 포괄하는 것으로 이해된다. 예를 들어, 두 요소가 "및/또는"으로 결합된 경우, 첫 번째 옵션은 두 번째 요소가 없는 첫 번째 요소가 적용될 수 있음을 나타낸다. 두 번째 옵션은 첫 번째 요소 없이 두 번째 요소가 적용될 수 있음을 나타낸다. 세 번째 옵션은 첫 번째 요소와 두 번째 요소가 적용될 수 있음을 나타낸다. 이들 옵션들 중 임의의 하나는 의미 내에 포함되는 것으로 이해되고, 따라서 본 명세서에서 사용된 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 만족시킨다. 하나 이상의 옵션에 대한 동시 적용 가능성은 또한 그 의미 내에 해당되므로 "및/또는"이라는 용어의 요구 사항을 만족시킨다.
본 명세서에 사용되는 "대상체"는 그에 대해 본 출원의 구현예에 따른 방법에 의해 처치될 것이거나 처치된 임의의 동물, 바람직하게는 포유류, 가장 바람직하게는 인간을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "포유류"는 임의의 포유류를 포괄한다. 포유류의 예는 비제한적으로 소, 말, 양, 돼지, 고양이, 개, 마우스, 래트, 토끼, 기니아피그, 비-인간 영장류(non-human primates, NHPs), 예컨대 원숭이 또는 유인원 등, 보다 바람직하게는 인간을 포함한다.
용어 "애주번트" 및 "면역 자극제"는 본원에서 상호 교환적으로 사용되고, 면역계의 자극을 유도하는 하나 이상의 물질로서 정의된다. 이 맥락에서, 애주번트는 본 출원의 아데노바이러스 및/또는 MVA 벡터에 대한 면역반응을 증진하기 위해 사용된다.
바람직한 발명의 구성요소의 치수 또는 특징을 언급하는 경우 본원에 사용된 용어 "약", "대략", "일반적으로", "실질적으로" 등은 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 기재된 치수/특징이 엄격한 경계 또는 파라미터가 아니고 기능적으로 동일하거나 유사한 이로부터의 작은 변화를 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다. 최소한, 수치 파라미터를 포함하는 그러한 언급은 당업계에서 허용되는 수학적 및 산업적 원리 (예를 들어, 반올림, 측정 또는 다른 시스템 오류, 제조 공차 등)를 사용하여 최소 유효 숫자를 변화시키지 않는 변화를 포함할 것이다.
2 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열(예컨대, HBV 항원성 폴리펩티드 및 이를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 맥락에서 “동일” 또는 퍼센트 “동일성”은 이하의 서열 대비 알고리즘을 이용하거나 육안 검사에 의해 측정된 바에 따라 최대 상응을 위해 대비 및 정렬할 때, 동일 또는 동일하거나 특정 퍼센트의 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드를 갖는 2 이상의 서열 또는 아서열(subsequence)을 지칭한다.
서열 비교에 있어, 통상적으로 하나의 서열이 시험 서열과 비교되는 참조 서열로서 작용한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 경우, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요에 따라 아서열 좌표를 디자인하고 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 디자인한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 디자인된 프로그램 파라미터에 기초하여 참조 서열에 대한 시험 서열(들)의 % 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 최적의 서열 정렬은, 예컨대 Smith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)의 국부적 상동성 알고리즘, 문헌 Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)의 상동성 정렬 알고리즘, 문헌 of Pearson & Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)의 유사성 방법용 탐색, 상기 알고리즘들의 컴퓨터화된 실행(GAP, BESTFIT, FASTA 및 TFASTA, 제조원: Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) 또는 시각적 검사(일반적으로 참조, Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel et al., eds., Current Protocols, a joint venture between Greene Publishing Associates, Inc. and John Wiley & Sons, Inc., (1995 Supplement) (Ausubel))에 의해 수행할 수 있다.
% 서열 동일성 및 서열 유사성 판별에 적합한 알고리즘의 예시는, 문헌 Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410 및 Altschul et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402에 각각 기술되어 있는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이다. BLAST 분석 수행용 소프트웨어는 National Center for Biotechnology Information 을 통해 공개적으로 이용가능하다. 이 알고리즘은 데이터베이스 서열 내의 동일한 길이의 워드와 정렬되는 경우에 일부 양성-평가된 역치 스코어 T와 매치되거나 이를 만족시키는, 조회 서열내의 짧은 길이의 워드 W를 동정함으로써 높은 스코어의 서열 쌍(HSPs)을 먼저 동정하는 것을 포함한다. T는 근접한 워드 스코어 역치를 지칭한다(전술한 Altschul et al). 이러한 초기의 근접한 워드의 적중은 이들을 함유하는 보다 긴 HSP를 찾기 위해 탐색을 개시하는데 있어 기초로서 작용한다. 이어서 워드 명중은 누적 정렬 스코어가 보다 증가할 수 있는 한은 각 서열을 따라서 두 방향으로 확장된다.
누적 스코어는, 뉴클레오티드 서열의 경우에는 파라미터 M(매치되는 잔기의 쌍에 대한 보상 스코어; 항상 >0) 및 N(미스매치되는 잔기에 대한 페널티 스코어; 항상 <0)을 사용하여 계산한다. 아미노산 서열의 경우에는, 득점 매트릭스를 사용하여 누적 스코어를 계산한다. 각 방향으로의 워드 적중의 확장은, 누적 정렬 스코어가 이의 최대로 성취된 값으로부터 X량 만큼 감소되고 누적 스코어가 하나 이상의 음성-득점 잔기 정렬의 축적으로 인해 0 또는 그 이하로 가까워지거나 서열의 말단에 도달할 경우에 중지된다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T 및 X는 정렬의 민감성 및 속도를 결정한다. BLASTN 프로그램(뉴클레오타이드 서열용)은 디폴트로서 워드길이 11, 기대값(E) 10, M=5, N=-4 및 두 서열의 비교를 사용한다. 아미노산 서열의 경우, BLASTP 프로그램은 디폴트로서 워드길이(W) 3, 기대값(E) 10 및 BLOSUM62 득점 매트릭스(참조: Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989))를 사용한다.
% 서열 동일성을 계산하는 것 이외에, BLAST 알고리즘은 두 서열 간의 유사성에 대한 통계학적 분석을 또한 수행한다(예컨대, Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-5787 (1993) 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공된 유사성의 한가지 척도는 2개의 뉴클레오티드나 아미노산 서열 간의 매치가 우연히 발생할 확률의 지표를 제공하는 최소 총 확률(P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 시험 핵산과 참조 핵산을 비교하여 최소 총 확률이 약 0.1 미만, 보다 바람직하게 약 0.01 미만 및 가장 바람직하게 약 0.001 미만인 경우에 참조 서열과 유사한 것으로 고려된다.
두 핵산 서열 또는 폴리펩티드가 실질적으로 동일하다는 추가적인 표지는 제1 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드가 제2 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드와 면역학적으로 교차 반응성인 것이다. 따라서, 폴리펩티드는 통상적으로 실질적으로 제2 폴리펩티드와 동일하고 여기서 예컨대 두 펩티드가 오로지 보존적 치환에 의해서만 상이하다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 또 다른 지표는 이하에서 기술되는 바와 같이, 상기 두 분자가 엄격한 조건(stringent condition)하에 서로 하이브리드화되는 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “증진된”이 CD4+ T 세포 반응, 항체 반응 또는 CD8+ T 세포 반응과 같은 면역 반응에 관하여 사용될 경우, 본 출원에 따른 MVA 및 아데노바이러스 벡터의 프라임-부스트 조합이 투여된 대상체에서의 면역 반응이, 본 출원의 MVA 벡터 또는 아데노바이러스 단독이 투여된 대상체에서 관찰된 대응 면역 반응과 비교하여 증가함을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “CD4+ 또는 CD8+T 세포 반응”은 백신접종 후 총 반응 T 세포의 개체군 내에서 면역원-특이적 CD4+ T 세포 또는 CD8+T 세포가 높은 비율로 관찰되는 것에 의해 특징지어 지는 T 세포 면역 반응을 지칭한다. 총 면역원-특이적 T-세포 반응은 IFN-감마 ELISPOT 검정에 의해 측정될 수 있다. 총 면역원-특이적 CD4+ 또는 CD8+T 세포 면역 반응은 ICS 검정에 의해 측정될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “증진된 항체 반응”은 본 출원의 MVA 벡터 또는 아데노바이러스 단독이 투여된 대상체에서 관찰된 대응 반응과 비교하여 본 출원에 따른 MVA 및 아데노바이러스 벡터의 프라임-부스트 조합이 투여된 대상체에서 증가된 항체 반응을 지칭한다.
용어 “애주번트”는 면역계의 자극을 유도하는 하나 이상의 물질로서 정의된다. 이 맥락에서, 애주번트는 본 출원의 아데노바이러스 및/또는 MVA 벡터에 대한 면역반응을 증진하기 위해 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “항원성 유전자 산물 또는 그 단편” 또는 “항원성 단백질”은 박테리아 단백질, 바이러스 단백질, 기생충 단백질 또는 진균 단백질, 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 바람직하게, 항원성 단백질 또는 항원성 유전자 산물은 질환 또는 감염에 대하여 대상체를 보호하는 숙주에서의 보호 면역 반응, 예컨대 질환 또는 감염(예컨대, 박테리아, 바이러스, 기생충, 또는 진균 질환 또는 감염)에 대한 면역 반응 증진, 및/또는 질환 또는 감염에 대하여 대상체 내에서의 면역 생성(즉, 면역접종)을 일으킬 수 있다.
본 출원의 독자를 돕기 위해, 본 기술은 다양한 단락 또는 섹션으로 분리되거나, 본 출원의 다양한 구현예를 지시한다. 이러한 분리는 단락 또는 섹션 또는 구현예의 내용을 다른 단락 또는 섹션 또는 구현예의 내용으로부터 분리시키는 것으로 간주되어서는 안된다. 반대로, 당업자는이 기술이 광범위하게 적용되며 고려 될 수 있는 다양한 섹션, 단락 및 문장의 모든 조합을 포함한다는 것을 이해할 것이다. 임의의 구현예에 대한 논의는 단지 예시적인 것으로 의도되며 청구항을 포함하는 본 개시의 범위가 이들 예시로 제한됨을 제안하려는 의도가 아니다. 예를 들어, 본 명세서에 기술된 본 출원의 HBV 벡터 (예를 들어, 플라스미드 DNA 또는 바이러스 벡터)의 구현예는 특정 순서로 배열된 소정 프로모터 서열, 인핸서 또는 조절 서열, 신호 펩티드, 및 HBV 항원의 코딩 펩티드, 폴리아데닐화 신호서열 등을 비한정적으로 포함하는 특정 성분을 포함할 수 있으나, 당업자는 본 명세서에 개시된 개념이 본 출원의 HBV 벡터에 사용될 수 있는 다른 순서로 배열된 다른 성분에도 동일하게 적용될 수 있음을 이해할 것이다. 본 출원은 특정 조합이 명시적으로 기술 되거나 아니거나, 본 출원의 HBV 벡터에 사용될 수 있는 임의의 서열을 갖는 임의의 조합으로 임의의 적용 가능한 성분의 사용을 고려한다.
B형 간염 바이러스(HBV)
본 명세서에서 사용되는 “B형 간염 바이러스(Hepatitis B virus)” 또는 “HBV”는 hepadnaviridae 과의 바이러스를 지칭한다. HBV는 4개의 오픈 리딩 프레임(open reading frame) 및 7개의 단백질을 인코딩하는 작은 (예컨대, 3.2-kb) 간친화성(hepatotropic) DNA 바이러스이다. 도 1a 참조. HBV에 의해 인코딩되는 7개의 단백질은 소형(S), 중형(M), 및 대형(L) 표면 항원(HBsAg) 또는 외피(Env) 단백질, 프리코어 단백질(pre-Core protein), 코어 단백질, 바이러스 폴리머라제(Pol) 및 HBx 단백질을 포함한다. HBV는 3개의 표면 항원, 또는 외피 단백질, L, M 및 S을 발현하며, S는 가장 작고 L이 가장 크다. M 및 L 단백질의 엑스트라 도메인은 각각 Pre-S2 및 Pre-S1으로 명명된다. 코어 단백질은 바이러스 뉴클레오캡시드의 서브유닛이다. Pol은 감염된 간세포의 세포질에 국부화된 뉴클레오캡시드에서 일어나는 바이러스 DNA(역전사효소, RNaseH 및 프라이머) 합성을 위해 필요하다. 프리코어(PreCore)는 소위 B형 간염 e-항원(HBeAg)와 같이, N-말단 신호 펩티드를 가지며 감염된 세포로부터 분비되기 전에 그 N 및 C 말단에서 단백분해적 프로세싱된 코어 단백질이다. HBx 단백질은 공유결합 폐환형 DNA(cccDNA)의 효율적인 전사를 위해 필요하다. HBx는 바이러스 구조 단백질이 아니다. HBV의 모든 바이러스 단백질은 mRNA를 공유하는 코어 및 폴리머라제 이외에 그 자신의 mRNA를 갖는다. 단백질 프리코어 이외에, 모든 HBV 바이러스 단백질은 모두 후-전사 단백분해 프로세싱을 거치지 않는다.
HBV 비리온은 바이러스 외피, 뉴클레오캡시드 및 부분적 이중가닥 DNA 게놈의 단일 카피를 포함한다. 뉴클레오캡시드는 코어 단백질의 120 이량체를 포함하며, S, M 및 L 바이러스 외피 또는 표면 항원 단백질이 내포된 캡시드 멤브레인에 의해 싸여 있다. 세포 내로 진입한 후, 바이러스는 탈각되고 공유결합적으로 결합된 바이러스 폴리머라제를 갖는 캡시드-함유 이완된 환형 DNA(relaxed circular DNA, rcDNA)는 핵으로 이동한다. 이 공정 중 코어 단백질의 포스포릴화는 핵 국재화 신호(nuclear localization signal, NLS)를 노출시켜 캡시드의 소위 임포틴(importin)과의 상호작용을 가능하게 하는 구조적 변화를 유도한다. 이들 임포틴은 코어 단백질이, 캡시드가 분해되는 핵공 복합체(nuclear pore complex)에 결합하는 것을 매개하며, 폴리머라제/rcDNA 복합체는 핵 내로 방출된다. 핵 내에서 rcDNA는 탈단백질되고(폴리머라제 제거) 숙주 DNA 복구 기구에 의해, 이로부터 중복 전사체가 HBeAg, HBsAg, 코어 단백질, 바이러스 폴리머라제 및 HBx 단백질을 인코딩하는 공유결합 폐환형 DNA(cccDNA) 게놈으로 전환된다. 코어 단백질, 바이러스 폴리머라제, 및 전-게놈 RNA(pre-genomic RNA, pgRNA)은 세포질에 연합하고 미성숙 pgRNA-함유 캡시드 입자 내로 자가조립되어, 추가적으로 성숙 rcDNA-캡시드로 전환되고, 피복되어 감염성 바이러스 입자로서 분비되거나 핵으로 반송되어 안정된 cccDNA 풀을 보충 및 유지하는 둘 다의 공통 중간체로서 기능한다. 도 1b 참조.
지금까지, HBV는 외피 단백질 상에 존재하는 항원성 에피토프를 기초로 4가지 혈청형(adr, adw, ayr, ayw)으로 구분되고, 바이러스 게놈의 서열을 기초로 8가지 유전자형(A, B, C, D, E, F, G, 및 H)으로 구분되었다. HBV 유전자형은 상이한 지리적 영역에 따라 분포된다. 예를 들어, 아시아에서 가장 보편적인 유전자형은 유전자형 B 및 C 이다. 유전자형 D는 아프리카, 중동 및 인도에서 우세한 반면, 유전자형 A는 북부 유럽, 사하라 이남 아프리카, 및 서부 아프리카에 널리 퍼져있다.
HBV 항원
본 명세서에서 사용되는 용어 “HBV 항원”, “HBV의 항원성 폴리펩티드”, “HBV 항원성 폴리펩티드”, “HBV 항원성 단백질”, “HBV 면역원적 폴리펩티드” 및 “HBV 면역원”은 모두 면역 반응, 예컨대, 대상체 내에서 HBV에 대한 체액성 및/또는 세포성 매개 반응을 유도할 수 있는 폴리펩티드를 지칭한다. HBV 항원은 HBV의 폴리펩티드, 이들의 단편 또는 에피토프, 또는 복수의 HBV 폴리펩티드의 조합, 이들의 일부 또는 유도체일 수 있다. HBV 항원은 숙주에서 보호 면역 반응을 일으킬 수 있는, 예컨대 바이러스 질환 또는 감염에 대해 면역 반응을 유도하고/하거나 바이러스 질환 또는 감염에 대해 대상을 보호하는, 바이러스 질환 또는 감염에 대해 대상에서 면역성을 생성(즉, 백신접종)할 수 있다. 예를 들어, HBV 항원은 임의의 HBV 단백질로부터의 폴리펩티드 또는 이들의 면역원적 단편(들), 예컨대 임의의 HBV 유전자형, 예컨대 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, 및/또는 H, 또는 이들의 조합 유래의, HBeAg, 프리코어 단백질, HBsAg (S, M, 또는 L 단백질), 코어 단백질, 바이러스 폴리머라제, 또는 임의의 HBV 유전자형, 예컨대 유전자형 HBx 단백질을 포함할 수 있다.
(1) HBV 코어 항원
본 명세서에서 사용되는 각각의 용어 “HBV 코어 항원”, “HBcAg”, 및 “코어 항원”은 면역 반응, 예컨대, 대상체 내에서 HBV에 대한 체액성 및/또는 세포성 매개 반응을 유도할 수 있는 HBV 항원을 지칭한다. 각각의 용어 “코어”, “코어 폴리펩티드" 및 “코어 단백질”은 HBV 바이러스 코어 단백질을 지칭한다. 전장(full-length) 코어 항원은 전형적으로 183 아미노산 길이이고 조립 도메인(아미노산 1 내지 149) 및 핵산 결합 도메인(아미노산 150 내지 183)을 포함한다. 34-잔기 핵산 결합 도메인은 게놈 RNA 캡시드화를 위해 필요하다. 상기 도메인은 또한 핵 유입 신호(nuclear import signal)로서 기능한다. 이는 17 아르기닌 잔기를 포함하고 염기성이고 그 기능에 일관된다. HBV 코어 단백질은 용액 내에서 이량체성이고, 이량체는 20면체(icosahedral) 캡시드로 자가조립된다. 코어 단백질의 각각의 이량체는 양쪽에 α-나선 도메인으로 플랭킹된 4개의 α-나선 번들을 갖는다. 핵산 결합 도메인 결여된 절두된 HBV 코어 단백질 또한 캡시드를 형성할 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, HBV 항원은 절두된 HBV 코어 항원이다. 본 명세서에서 사용되는 “절두된 HBV 코어 항원”은 HBV 코어 단백질의 전체 길이를 포함하지는 않지만 대상체에서 HBV 코어 단백질에 대한 면역 반응을 유도할 수 있는 HBV 항원을 지칭한다. 예를 들어, HBV 코어 항원은 전형적으로 17개 아르기닌(R) 잔기를 포함하는, 코어 항원의 고도로 양전하를 띄는(아르기닌 풍부) C-말단 핵산 결합 도메인 중 하나 이상의 아미노산을 결실하도록 변형될 수 있다. 본 출원의 몇몇 구현예에서, HBV 코어 항원은 절두된 HBV 코어 단백질이다. 본 출원의 절두된 HBV 코어 항원은 바람직하게 HBV 코어 핵 유입 신호를 포함하지 않는 C-말단 절두된 HBV 코어 단백질 및/또는 C-말단 HBV 코어 핵 유입 신호가 결실된 절두된 HBV 코어 단백질이다. 본 출원의 일 구현예에서, 절두된 HBV 코어 항원은 C-말단 핵산 결합 도메인에 결실, 예컨대 C-말단 핵산 결합 도메인의 1 내지 34 아미노산 잔기, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 또는 34의 결실, 바람직하게 34개 아미노산 잔기 모두의 결실을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 절두된 HBV 코어 항원은 C-말단 핵산 결합 도메인에 결실, 바람직하게 34 아미노산 잔기 전부의 결실을 포함한다.
본 출원의 구현예에 따르면, HBV 코어 항원은 복수의 HBV 유전자형(예컨대, 유전자형 A, B, C, D, E, F, G, 및 H)으로부터 유래한 컨센서스 서열(consensus sequence)일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 “컨센서스 서열(consensus sequence)”은 예컨대 동종성 단백질의 아미노산 서열의 정렬(예컨대, Clustal Omega를 사용하여)에 의해 결정된 동종성 단백질의 아미노산 서열의 정렬에 기초한 아미노산의 인공 서열을 의미한다. 적어도 100개의 천연 HBV 단리체로부터의 HBV 항원(예컨대, core, pol, 등)의 서열을 기초로 서열 정렬의 각 위치에서 발견되는 가장 빈번한 아미노산 잔기의 계산된 순서일 수 있다. 컨센서스 서열은 비-천연이며 천연형 바이러스 서열과 상이할 수 있다. 컨센서스 서열은 복수의 서열 정렬 툴을 사용한 상이한 공급원으로부터의 복수의 HBV 항원 서열을 정렬하고, 다양한 정렬 위치에서 가장 빈번한 아미노산을 선택하여 설계될 수 있다. 바람직하게, HBV 항원의 컨센서스 서열은 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래할 수 있다. 용어 “컨센서스 항원”은 컨센서스 서열을 갖는 항원을 지칭하기 위해 사용된다.
본 출원의 일 구현예에 따른 절두된 HBV 코어 항원은 핵산 결합 기능이 결여되고 포유류에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게 절두된 HBV 코어 항원은 포유류에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 보다 바람직하게, 절두된 HBV 코어 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다.
본 출원의 바람직한 구현예에서, HBV 코어 항원은 컨센서스 항원이고, 바람직하게 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 컨센서스 항원이고, 보다 바람직하게 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 절두된 컨센선스 항원이다. 본 출원에 따른 예시적 절두된 HBV 코어 컨센서스 항원은 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 2와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진다. 서열번호 2는 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 코어 컨센서스 항원이다. 서열번호 2는 천연형 코어 항원의 고도로 양전하를 띄는(아르기닌 풍부) 핵산 결합 도메인의 34-아미노산 C-말단 결실을 포함한다.
본 출원의 구체적인 구현예에서, HBV 코어 항원은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 항원이다.
(2) HBV 폴리머라제 항원
본 명세서에서 사용되는 용어 “HBV 폴리머라제 항원”, “HBV Pol 항원”, 또는 “HBV pol 항원”은 대상체 내에서 HBV 폴리머라제에 대한 체액성 및/또는 세포성 매개 반응을 유도할 수 있는 HBV 항원을 지칭한다. 각각의 용어 “폴리머라제”, “폴리머라제 폴리펩티드”, “Pol” 및 “pol”은 HBV 바이러스 DNA 폴리머라제를 지칭한다. HBV 바이러스 DNA 폴리머라제는 N 말단으로부터 C 말단으로, 마이너스 가닥 DNA 합성을 위한 프라이머로 작용하는 DNA 말단 단백질(TP) 도메인; 폴리머라제 기능에 비본질적인 스페이서; 전사를 위한 역전사효소(RT) 도메인; 및 RNase H 도메인을 포함하는 4개의 도메인을 갖는다.
본 출원의 일 구현예에서, HBV 항원은 HBV Pol 항원, 또는 이들의 임의의 면역원적 단편 또는 이들의 조합을 포함한다. HBV Pol 항원은 항원의 면역원성을 향상하기 위한 변형, 예컨대 폴리머라제 및/또는 RNase 도메인의 활성 자리에 돌연변이를 도입하여 소정 효소 활성을 감소 또는 실질적으로 제거할 수 있다.
바람직하게, 본 출원의 HBV Pol 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않으며, 포유류에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게 HBV Pol 항원은 포유류에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 보다 바람직하게, HBV Pol 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다.
따라서, 본 출원의 몇몇 구현예에서, HBV Pol 항원은 불활성화 Pol 항원이다. 본 출원의 일 구현예에서, 불활성화 HBV Pol 항원은 폴리머라제 도메인의 활성 부위에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 다른 구현예에서, 불활성화 HBV Pol 항원은 RNaseH 도메인의 활성부위에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 바람직한 구현예에서, 불활성화 HBV Pol 항원은 폴리머라제 도메인 및 RNaseH 도메인 둘 다의 활성 부위에 하나 이상의 아미노산 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 뉴클레오티드/금속 이온 결합을 위해 필요한 HBV pol 항원의 폴리머라제 도메인의 “YXDD” 모티프는, 예컨대 하나 이상의 아스파테이트 잔기(D)를 아스파라긴 잔기(N)로 교체하여 금속 배위 기능을 제거 또는 감소시키는 돌연변이될 수 있으며, 이에 의해 역전사효소 기능을 감소 또는 실질적으로 제거한다. 대안적으로, 또는 상기 “YXDD” 모티프의 돌연변이에 더하여, Mg2+ 배위를 위해 필요한 HBV pol 항원의 RNaseH 도메인의 “DEDD” 모티프는, 예컨대 하나 이상의 아스파테이트 잔기(D)를 아스파라긴 잔기(N)로 교체하거나/교체하고 글루타메이트 잔기(E)를 글루타민(Q)으로 교체하여 돌연변이될 수 있으며, 이에 의해 RNasH 기능을 감소 또는 실질적으로 제거할 수 있다. 구체적인 구현예에서, HBV pol 항원은 (1) 폴리머라제 도메인의 “YXDD” 모티프의 하나 이상의 아스파테이트 잔기(D)를 아스파라긴 잔기(N)로 돌연변이하고; 및 (2) RNaseH 도메인의 “DEDD” 모티프를 첫번째 아스파테이트 잔기(D)를 아스파라긴 잔기(N)로 교체하고 첫번째 글루타메이트 잔기(E)를 글루타민(Q)으로 돌연변이하는 것에 의하여 변형되어 pol 항원의 역전사효소 및 RNaseH 기능 둘 다를 감소 또는 실질적으로 제거한다.
본 출원의 바람직한 구현예에서, HBV pol 항원은 컨센서스 항원이고, 바람직하게 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 컨센서스 항원이고, 보다 바람직하게 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 불활성화 컨센선스 항원이다. 본 출원에 따른 예시적 HBV pol 컨센서스 항원은 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한, 예컨대 서열번호 4와 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진다. 서열번호 4는 HBV 유전자형 B, C 및 D로부터 유래한 폴리머라제 및 RNaseH 도메인의 활성 부위에 위치한 4개의 돌연변이를 포함하는 pol 컨센서스 항원이다. 구체적으로, 상기 4개의 돌연변이는 “YXDD” 모티프 내의 아스파르트산 잔기(D)의 아스파라긴 잔기(N)로의 돌연변이; 및 RNaseH 도메인의 “DEDD” 모티프 내의 첫번째 아스파테이트 잔기(D)의 아스파라긴 잔기(N)로의 돌연변이 및 글루타메이트 잔기(E)의 글루타민(Q)으로의 돌연변이를 포함한다.
본 출원의 구체적인 구현예에서, HBV pol 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함한다. 본 출원의 다른 구현예에서, HBV pol 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진다.
(3) HBV 코어 항원 및 HBV 폴리머라제 항원의 융합
본 명세서에서 사용되는 용어 “융합 단백질” 또는 “융합”은 단일, 천연 폴리펩티드에서 정상적으로 존재하지 않는 적어도 2개의 폴리펩티드 도메인을 가지는 단일 폴리펩티드 사슬을 의미한다.
본 출원의 일 구현예에서, HBV 항원은, 바람직하게는 링커를 통해, HBV pol 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원, 또는 절두된 HBV 코어 항원에 작동적으로 연결된 HBV pol 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “링커”는 두개의 상이한 분자를 작동적으로 연결하는 분자적 가교로서 작용하는 화합물 또는 모이어티를 지칭하며, 링커의 일부는 제1 분자에 작동적으로 연결되고 링커의 나머지 부분은 제2 분자에 작동적으로 연결된다. 예를 들어, 제1 폴리펩티드 및 제2 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질에서, 링커는 주로 제1 및 제2 폴리펩티드 사이의 스페이서로서 작용한다. 일 구현예에서, 상기 링커는 펩티드 결합으로 서로 연결된 아미노산, 바람직하게 펩티드 결합으로 연결된 1 내지 20 아미노산으로 만들어지고, 상기 아미노산은 20개의 천연 아미노산으로부터 선택된다. 일 구현예에서, 상기 1 내지 20 아미노산은 글리신, 알라닌, 프롤린, 아스파라긴, 글루타민, 및 리신으로부터 선택된다. 바람직하게, 링커는 대부분 입체적 장애가 없는 아미노산, 예컨대 글리신 및 알라닌으로 만들어진다. 예시적 링커는 폴리글리신, 구체적으로 (Gly)5, (Gly)8; poly(Gly-Ala), 및 폴리알라닌이다. 이하의 실시예에 나타난 바와 같은 일 예시적 적합한 링커는 (AlaGly)n 이고, n은 2 내지 5의 정수이다.
바람직하게, 본 출원의 융합 단백질은 포유류에서 적어도 2개의 HBV 유전자형의 HBV 코어 및 HBV Pol에 대한 면역 반응을 유도할 수 있다. 바람직하게 융합 단백질은 포유류에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있다. 보다 바람직하게, 융합 단백질은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 2와 적어도 90%, 예컨대 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 절두된 HBV 코어 항원, 링커, 및 서열번호 4와 적어도 90%, 예컨대 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9%, 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 갖는 HBV pol 항원을 포함한다.
본 출원의 바람직한 구현예에서, 융합 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원, (AlaGly)n을 포함하고 n은 2 내지 5의 정수인 링커, 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HBV Pol 항원을 포함한다. 보다 바람직하게, 본 출원에 따른 융합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 융합 단백질은 신호 서열을 더 포함한다. 바람직하게, 신호 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는다. 보다 바람직하게, 융합 단백질은 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함한다.
폴리뉴클레오티드 및 벡터
다른 일반적 양태에서, 본 출원은 본 출원의 일 구현예에 따른 HBV 항원을 인코딩하는 비-천연 핵산 분자, 및 비-천연 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다. 비-천연 핵산 분자는 본 개시의 관점에서의 기술분야에 알려진 방법을 사용하여 만들어질 수 있는, 본 출원의 HBV 항원을 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 HBV 코어 항원 및 HBV 폴리머라제 항원 중 적어도 하나를 인코딩한다. 재조합 기술(예컨대, 클로닝)에 의해 얻어지거나 합성적으로(예컨대, 화학적 합성) 생산된 RNA의 형태 또는 DNA의 형태일 수 있다. 상기 DNA는 단일가닥 또는 이중가닥일 수 있으며, 이중가닥 및 단일 가닥 서열 둘 다의 부분을 포함할 수 있다. 상기 DNA는 예컨대, 게놈 DNA, cDNA 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드는 또한 DNA/RNA 하이브리드일 수 있다. 본 출원의 상기 폴리뉴클레오티드 및 벡터는 재조합 단백질 생산, 숙주 세포 내에서의 단백질 발현, 또는 바이러스 입자 생산을 위해 사용될 수 있다. 바람직하게, 폴리뉴클레오티드는 DNA이다.
본 출원의 일 구현예에서, 비-천연 핵산 분자는 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 2와 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 출원의 구체적 구현예에서, 비-천연 핵산 분자는 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩한다.
서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하는 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 예시는 비한정적으로 서열번호 1과 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 1과 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 출원의 구체적인 구현예에서, 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 비-천연 핵산 분자는 서열번호 1, 17 또는 18의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 비-천연 핵산 분자는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 서열번호 4와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩한다. 본 출원의 구체적인 구현예에서, 비-천연 핵산 분자는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩한다.
서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원을 인코딩하는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 예시는 비한정적으로 서열번호 3과 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 3과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 3과 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 본 출원의 구체적인 구현예에서, HBV Pol 항원을 인코딩하는 비-천연 핵산 분자는 서열번호 3, 19 또는 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본 출원의 다른 구현예에서, 비-천연 핵산 분자는 HBV Pol 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원, 또는 절두된 HBV 코어 항원에 작동적으로 연결된 HBV Pol 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 구체적 구현예에서, 본 출원의 비-천연 핵산 분자는 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 2와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원; 링커; 및 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 4와 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게는 서열번호 4와 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩한다. 본 출원의 구체적인 구현예에서, 비-천연 핵산 분자는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원, (AlaGly)n을 포함하고 n은 2 내지 5의 정수인 링커; 및 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 본 출원의 구체적인 구현예에서, 비-천연 핵산 분자는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다.
융합 단백질을 인코딩하는 본 출원의 폴리뉴클레오티드 서열의 예시는 비한정적으로, 서열번호 1과 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 1과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 1과 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 서열번호 14와 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 14와 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 14와 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일한 링커 코딩 서열에 작동적으로 연결되고, 이는 서열번호 3과 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 3과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 3과 적어도 98%, 99% 또는 100% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열과 추가적으로 작동적으로 연결된다. 본 출원의 구체적인 구현예에서, 융합 단백질을 인코딩하는 비-천연 핵산 분자는 서열번호 1을 포함하고, 이는 서열번호 14에 작동적으로 연결되고, 이는 추가적으로 서열번호 3에 작동적으로 연결된다.
다른 일반적 양태에서, 본 출원은 HBV 항원을 인코딩하는 단리된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터에 관한다. 본 명세서에서 사용되는 “벡터”는 유전적 물질을 그것이 복제 및/또는 발현될 수 있는 다른 세포로 수송하기 위해 사용되는 핵산 분자이다. 본 개시의 관점에서 당업자에게 알려진 임의의 벡터가 사용될 수 있다. 벡터의 예시는 비한정적으로, 플라스미드, 바이러스 벡터(박테리오파지, 동물 바이러스, 및 식물 바이러스), 코스미드 및 인공 염색체(예컨대, YAC)을 포함한다. 바람직하게, 벡터는 DNA 플라스미드이다. 벡터는 DNA 벡터 또는 RNA 벡터일 수 있다. 당업자는 본 개시의 관점에서 표준 재조합 기술을 통하여 본 출원의 벡터를 작제할 수 있다.
본 출원의 구현예에 따르면, 벡터는 발현 벡터일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “발현 벡터”는 전사될 수 있는 RNA를 코딩하는 핵산을 포함하는 임의의 유형의 유전적 작제물를 지칭한다. 발현 벡터는 비제한적으로 재조합 단백질 발현을 위한 벡터, 예컨대 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터, 및 대상체 조직에서의 발현을 위하여 대상체로 핵산을 전달하기 위한 벡터, 예컨대 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다. 당업자는 발현 벡터의 설계는 혈질전환 될 숙주 세포의 선택, 요망되는 단백질의 발현 수준 등과 같은 인자들에 의존될 수 있음을 이해할 것이다.
본 출원의 구현예에 따른 벡터는 다양한 조절 서열을 포함할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “조절 서열”은 복제(replication), 중첩(duplication), 전사, 스플라이싱, 번역, 안정성(stability) 및/또는 핵산분자 또는 이들의 유도체(즉, mRNA) 중 하나의 숙주 세포 또는 유기체로의 이송을 포함하는 핵산 분자의 기능적 조절을 허용, 기여 또는 조절하는 임의의 서열을 지칭한다.본 개시의 맥락에서, 이 용어는 프로모터, 인핸서 및 다른 발현 조절 요소(예컨대, 폴리아데닐화 신호 및 mRNA 안정성에 영향을 미치는 요소)를 포괄한다.
본 출원의 몇몇 구현예에서, 벡터는 비-바이러스 벡터이다. 비-바이러스 벡터의 예는 비제한적으로 DNA 플라스미드, 박테리아 인공 염색체, 효모 인공 염색체, 박테리오파지 등을 포함한다. 바람직하게, 비-바이러스 벡터는 DNA 플라스미드이다. "DNA 플라스미드"는, "DNA 플라스미드 벡터", "플라스미드 DNA" 또는 "플라스미드 DNA 벡터"와 상호 교환적으로 사용되며, 적합한 숙주 세포에서 자율 복제가 가능한 이중 가닥 및 일반적으로 원형인 DNA 서열을 지칭한다. 인코딩 된 폴리뉴클레오티드의 발현에 사용되는 DNA 플라스미드는 전형적으로 복제 원점, 다중 클로닝 부위, 및 예컨대 항생제 내성 유전자 일 수 있는 선택 가능한 마커를 포함한다. 본 출원에 사용하기에 적합한 DNA 플라스미드의 예는 비제한적으로, 대장균(Escherichia coli)의 단백질의 생성 및/또는 발현에 사용될 수 있는 pSE420(Invitrogen, San Diego, Calif.); 효모의 Saccharomyces cerevisiae 균주에서의 생산 및/또는 발현에 사용될 수 있는 pYES2 (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific); 곤충세포에서의 생산 및/또는 발현에 사용될 수 있는 MAXBAC® 완전 바큘로바이러스 발현 시스템(Thermo Fisher Scientific); 포유동물 세포에서 고수준 구성 단백질 발현에 사용될 수 있는 pcDNATM 또는 pcDNA3TM (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific); 및 대부분의 포유동물 세포에서 관심 단백질의 고수준 일시적 발현에 사용될 수 있는 pVAX 또는 pVAX-1 (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific)과 같은 잘 알려진 발현 시스템(원핵생물 및 진핵생물 시스템 둘 다 포함)에 사용하기 위한 상업적으로 이용 가능한 발현 벡터를 포함한다. 임의의 상업적으로 이용 가능한 DNA 플라스미드의 백본은 숙주 세포에서 단백질 발현을 최적화하기 위해 변형될 수 있으며, 예컨대 특정 요소(예컨대, 복제 원점 및/또는 항생제 내성 카세트)의 배향을 역전시키고, 플라스미드에 내인성인 프로모터를 대체 할 수 있다(예컨대, 항생제 내성 카세트의 프로모터), 및/또는 통상적인 기술 및 용이하게 이용 가능한 출발 물질을 사용하여 전사된 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열(예컨대, 항생제 내성 유전자의 암호화 서열)을 대체한다(예컨대, Sambrook et al., Molecular Cloning a Laboratory Manual, Second Ed. Cold Spring Harbor Press (1989) 참조).
본 출원의 바람직한 구현예에서, DNA 플라스미드는 포유동물 숙주 세포에서의 단백질 발현을 위한 적합한 발현 벡터이다. 포유동물 숙주 세포에서의 단백질 발현에 적합한 발현 벡터는 비제한적으로 pcDNATM, pcDNA3TM, pVAX, pVAX-1, ADVAX, NTC8454 등을 포함한다. 바람직하게, 발현 벡터는 pVAX-1에 기초하며, 이는 포유동물 세포에서의 단백질 발현을 최적화하기 위해 추가적으로 변형될 수 있다. pVAX-1은 DNA 백신에서 통상적으로 사용되는 플라스미드이며 강력한 인간 급초기 사이토메갈로바이러스(human immediate early cytomegalovirus, CMV-IE) 프로모터와 뒤이어 소 성장 호르몬(bovine growth hormone, bGH)-유래 폴리아데닐화 서열(pA)을 포함한다. pVAX-1는 pUC 복제 원점 및 박테리아 플라스미드 증식을 가능하게 하는 소형 원핵 프로모터에 의해 구동되는 카나마이신(kanamycin) 내성 유전자를 추가로 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 일반적으로 바이러스 벡터는 비-감염성으로 만들었으나, 바이러스 프로모터 및 전이유전자를 여전히 포함하여 바이러스 프로모터를 통한 전이유전자의 번역을 가능하게 한 변형된 바이러스 DNA 또는 RNA를 보유하는 유전공학 바이러스이다. 바이러스 벡터는 흔히 감염 서열을 결여하기 때문에 헬퍼바이러스나 대규모 형질감염을 위한 팩키징 라인을 필요로 한다. 본 출원과 사용하기에 적합한 바이러스 벡터의 예는 비제한적으로 아데노바이러스 벡터, 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터, 폭스바이러스 벡터, 창자(enteric) 바이러스 벡터, 베네수엘라 말 뇌염(Venezuelan Equine Encephalitis) 바이러스 벡터, 셈리키 삼림(Semliki Forest) 바이러스 벡터, 담배 모자이크 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 등을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 벡터, 예컨대 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터는 벡터의 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩 되는 HBV 항원의 복제 및 발현을 비제한적으로 포함하는 종래의 벡터의 기능을 수립하기 위한 임의의 조절 요소를 포함할 수 있다. 조절요소는 비제한적으로 프로모터, 인핸서, 폴리아데닐화 신호, 정지 코돈의 번역, 리보솜 결합 요소, 전사 종결자, 선택 마커, 복제 원점 등을 포함한다. 벡터는 하나 이상의 발현 카세트를 포함할 수 있다. “발현 카세트”는 세포 기구로 하여금 RNA 및 단백질을 만들도록 지시하는 벡터의 부분이다. 발현 카세트는 전형적으로 3 요소를 포함한다: 프로모터 서열, 오픈 리딩 프레임, 및 선택적으로 폴리아데닐화 신호를 포함하는 3'-비번역 영역(UTR). 오픈 리딩 프레임(ORF)는 관심 단백질(예컨대, HBV 항원)의 개시 코돈부터 정지 코돈까지 코딩 서열을 포함하는 리딩 프레임이다. 발현 카세트의 조절 요소는 관심 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “작동적으로 연결”은 가장 널리 합리적 맥락에서 해석되어야 하며 기능적 관련성을 갖는 폴리뉴클레오티드 요소의 연결을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드가 다른 폴리뉴클레오티드와 기능적 관련성을 갖는 경우 “작동적으로 연결”된다. 예를 들어, 프로모터는 이것이 코딩 서열의 전사에 영향을 미친다면 코딩 서열에 작동적으로 연결된다.
몇몇 구현예에서, 벡터는 프로모터 서열을, 바람직하게 발현 카세트 내에 포함하여 관심 HBV 항원의 발현을 조절한다. 용어 “프로모터”는 그 관습적 의미에서 사용되며, 작동적으로 연결된 뉴클레오티드 서열의 전사를 개시하는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 프로모터는 이것이 전사하는 뉴클레오티드 서열 인근의 동일 가닥 상에 위치한다. 프로모터는 구성성, 유도성 또는 억제성일 수 있다. 프로모터는 천연 또는 합성일 수 있다. 프로모터는 바이러스, 박테리아, 균류, 식물, 곤충 및 동물을 포함하는 공급원으로부터 유래할 수 있다. 프로모터는 동종성 프로모터(즉, 벡터로서 동일 유전적 공급원 유래) 또는 이종성 프로모터(즉, 상이한 벡터 또는 유전적 공급원 유래). 예를 들어, 사용될 벡터가 DNA 플라스미드이면, 프로모터는 플라스미드에 내인성(동종성)이거나 다른 공급원 유래(이종성)일 수 있다. 바람직하게, 프로모터는 발현 카세트 내에 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한다.
본 출원에서의 사용에 적합한 프로모터는 비제한적으로 시미안 바이러스 40(simian virus 40, SV40) 유래의 프로모터, 마우스 유방 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus, MMTV) 프로모터, 인간 면역 결핍 바이러스(HIV) 프로모터, 예를 들어 소과 면역 결핍 바이러스(bovine immunodeficiency virus, BIV) 긴 말단 반복순서(long terminal repeat, LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스(Moloney virus) 프로모터, 조류 백혈병 바이러스(avian leukosis virus, ALV) 프로모터, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus, CMV) 프로모터, 예를 들어 CMV 급초기 프로모터(CMV immediate early promoter, CMV-IE), 엡스타인 바 바이러스(Epstein Barr virus, EBV) 프로모터, 또는 라우스 육종 바이러스(Rous sarcoma virus, RSV) 프로모터를 포함한다. 본 출원에서의 사용에 적합한 추가적인 프로모터는 비제한적으로 RSV 프로모터, 레트로바이러스 LTR, 아데노바이러스 주후기 프로모터(adenovirus major late promoter), 및 다양한 폭스바이러스 프로모터로서 비제한적으로 이하의 백시니아 바이러스 또는 MVA-유래 및 FPV-유래 프로모터를 포함한다: 30K 프로모터, I3 프로모터, PrS 프로모터, PrHyb, PrS5E 프로모터, Pr7.5K, Pr13.5 긴 프로모터, 40K 프로모터, MVA-40K 프로모터, FPV 40K 프로모터, 30k 프로모터, PrSynIIm 프로모터, PrLE1 프로모터, 및 PR1238 프로모터. 추가적인 프로모터는 WO 2010/060632, WO 2010/102822, WO 2013/189611 및 WO 2014/063832, 및 WO2017/021776에 더 기술되며 이들은 본 명세서에 전체가 참조로서 통합된다.
또한 프로모터는 인간 유전자, 예컨대 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 인간 메탈로티오닌으로부터의 프로모터일 수 있다. 프로모터는 또한 천연 또는 합성의, 조직 특이적 프로모터, 예컨대 근육 또는 피부 특이적 프로모터일 수 있다.
본 출원의 바람직한 구현예에서, 프로모터는 강력한 진핵 프로모터, 바람직하게 사이토메갈로바이러스 급초기(CMV-IE) 프로모터이다. 예시적 CMV-IE 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 7에 나타난다.
본 출원의 다른 바람직한 구현예에서, 프로모터는 폭스바이러스 프로모터, 바람직하게 PrMVA 13.5 긴 및/또는 PrHyb 로부터 선택되는 프로모터이다. 예시적 Pr13.5 긴 프로모터 및 PrHyb 프로모터의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 25 및 26에 각각 나타난다.
몇몇 구현예에서, 벡터는 발현된 전사체를 안정화시키고, RNA 전사체의 핵 유출을 증진하고 및/또는 전사/번역 커플링을 향상하는 추가적인 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 이러한 서열의 예시는 폴리아데닐화 신호 및 인핸서 서열을 포함한다. 폴리아데닐화 신호는 전형적으로 벡터의 발현 카세트 내의 관심 단백질(예컨대 HBV 항원)의 코딩 서열의 하류에 위치한다. 인핸서 서열은 전사 인자에 결합되면 연관 유전자의 전사를 증진하는 조절 DNA 서열이다. 인핸서 서열은 바람직하게 벡터의 발현 카세트 내의 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 상류이지만 프로모터 서열의 하류에 위치한다.
본 개시의 관점에서 당업자에게 알려진 임의의 폴리아데닐화 신호가 사용될 수 있다. 예를 들어 폴리아데닐화 신호는 SV40 폴리아데닐화 신호 (예컨대, 서열번호 16), LTR 폴리아데닐화 신호, 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호, 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리아데닐화 신호, 또는 인간 β-글로빈 폴리아데닐화 신호일 수 있다. 본 출원의 바람직한 구현예에서, 폴리아데닐화 신호는 소 성장 호르몬(bGH) 폴리아데닐화 신호이다. 예시적 bGH 폴리아데닐화 신호의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 9에 나타난다.
본 개시의 관점에서 당업자에게 알려진 임의의 인핸서 서열을 사용할 수 있다. 예를 들어, 인핸서 서열은 인간 액틴, 인간 미오신, 인간 헤모글로빈, 인간 근육 크레아틴, 또는 CMV, HA, RSV, 또는 EBV 중 하나와 같은 바이러스 인핸서일 수 있다. 특정 인핸서의 예는 비제한적으로 우드척 HBV 후-전사 조절 요소(Woodchuck HBV Post-transcriptional regulatory element, WPRE), 인간 아포리포단백질 A1 전구체(human apolipoprotein A1 precursor) 유래 인트론/엑손 서열, 인간 T-세포 백혈병 바이러스 유형 1(human T-cell leukemia virus type 1, HTLV-1)의 긴 말단 반복(LTR)의 비번역 R-U5 도메인, 스플라이싱 인핸서, 합성 토끼 β-글로빈 인트론, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 출원의 바람직한 구현예에서, 인핸서 서열은 HTLV-1 LTR의 비번역 R-U5 도메인, 토끼 β-글로빈 인트론 및 스플라이싱 인핸서의 3개의 연속 요소의 복합체 서열이고 이는 본 명세서에서 “트리플 인핸서 서열”로 지칭된다. 예시적 트리플 인핸서 서열의 뉴클레오티드 서열은 서열번호 8에 나타난다. 다른 예시적 인핸서 서열은 서열번호 15에 나타나는 ApoAI 유전자 단편이다.
몇몇 구현예에서, 벡터는 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 바람직하게, 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열은 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드의 상류에 위치한다. 신호 펩티드는 전형적으로 단백질의 국부화를 지시하고, 단백질이 이것이 생산된 세포로부터의 분비되는 것을 촉진하고, 및/또는 항원 발현 및 항원-제시 세포에 대한 상호-제시를 증진한다. 신호 펩티드는 벡터로부터 발현될 때 HBV 항원의 N-말단에 제시될 수 있으나, 이는 예컨대 세포로부터의 분비 직후 신호 펩티드에 의해 절단된다. 신호 펩티드가 절단된 발현된 단백질은 흔히 “성숙 단백질”이라 지칭된다. 본 개시의 관점에서 기술분야에 알려진 임의의 신호 펩티드를 사용할 수 있다. 예를 들어, 신호 펩티드는 시스타틴 S 신호 펩티드; 면역글로불린(Ig) 분비 신호, 예컨대 Ig 중쇄 감마 신호 펩티드 SPIgG 또는 Ig 중쇄 엡실론 신호 펩티드 SPIgE일 수 있다.
본 출원의 바람직한 구현예에서, 신호 펩티드 서열은 시스타틴 S 신호 펩티드이다. 시스타틴 S 신호 펩티드의 예시적 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 5 및 6에 나타난다. 면역글로불린 분비 신호의 예시적 핵산 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 10 및 27 및 서열번호 11에 나타난다.
벡터, DNA 플라스미드는 또한 박테리아 복제 원점 및 박테리아 세포, 예컨대 대장균(E. coli)의 플라스미드의 선택 및 유지를 위한 항생제 내성 발현 카세트를 포함할 수 있다. 박테리아 복제 원점 및 항생제 내성 카세트는 HBV 항원을 인코딩하는 발현 카세트와 동일 배향으로 또는 반대(역) 배향으로 벡터에 위치할 수 있다. 복제 기점(ORI)은 복제가 개시되는 서열이며 플라스미드가 세포 내에서 재생산 및 생존할 수 있게 한다. 본 출원에서 사용되기에 적합한 ORI의 예는 비제한적으로 ColE1, pMB1, pUC, pSC101, R6K, 및 15A, 바람직하게 pUC를 포함한다. pUC ORI의 뉴클레오티드 서열의 예시는 서열번호 21에 나타난다.
박테리아 세포의 선택 및 유지를 위한 발현 카세트는 전형적으로 항생제 내성 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터 서열을 포함한다. 바람직하게, 항생제 내성 유전자에 작동적으로 연결된 프로모터 서열은 관심 단백질, 예컨대 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터 서열과 상이하다. 항생제 내성 유전자는 코돈 최적화될 수 있고, 항생제 내성 유전자의 서열 조성물은 일반적으로 박테리아, 예컨대 대장균, 코돈 사용에 조정된다. 본 개시의 관점에서 당업자에게 알려진 임의의 항생제 내성 유전자를 사용할 수 있으며, 비제한적으로, 카나마이신 내성 유전자(kanamycin resistance gene, Kanr), 암피실린 내성 유전자(ampicillin resistance gene, Ampr), 및 테트라사이클린 내성 유전자(tetracycline resistance gene, Tetr), 뿐만 아니라 클로르암페니콜(chloramphenicol), 블레오마이신(bleomycin), 스펙티노마이신(spectinomycin), 카르베니실린(carbenicillin) 등에 내성을 부여하는 유전자를 포함한다.
본 출원의 다른 구체적 구현예에서, 벡터는 바이러스 벡터, 바람직하게 아데노바이러스 벡터이고, 서열번호 4에 적어도 98%, 예컨대 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV pol 항원, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 5' 말단부터 3' 말단으로, 바람직하게 서열번호 7의 CMV-IE 프로모터 서열인 프로모터 서열, 바람직하게 서열번호 8의 트리플 인핸서 서열 또는 서열번호 15의 ApoA1 인핸서 서열인 인핸서 서열, 및 바람직하게 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 시스타틴 S 신호 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 면역글로불린 분비 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열인 신호서열을 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 상류 서열; 및 폴리아데닐화 신호로서 바람직하게 서열번호 16의 SV40 폴리아데닐화 신호 또는 서열번호 9의 bGH 폴리아데닐화 신호를 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 하류 서열;을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
본 출원의 다른 구체적 구현예에서, 벡터는, 서열번호 4에 적어도 98%, 예컨대 적어도 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV pol 항원, 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나의 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 5' 말단부터 3' 말단으로, 프로모터 서열, 바람직하게 서열번호 25의 PrMVA13.5 긴 프로모터 서열 또는 서열번호 26의 PrHyb 프로모터 서열, 및 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열, 바람직하게 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 시스타틴 S 신호 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분비 신호를 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 상류 서열; 및 폴리아데닐화 신호 또는 초기 종결 신호를 포함하는 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 하류 서열을 포함하는 발현카세트를 포함하는 바이러스 벡터, 바람직하게 MVA 벡터이되, 상기 초기 종결 신호는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 상기 폴리아데닐화 신호는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 SV40 폴리아데닐화 신호 또는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 bGH 폴리아데닐화 신호로부터 선택되고, 바람직하게 상기 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 하류 서열은 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는 초기 종결 신호이다.
본 출원의 일 구현예에서, 벡터, 예컨대 바이러스 벡터는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HBV Pol 항원을 인코딩한다. 바람직하게 상기 벡터는 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드와 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 3과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 3와 100% 동일한 HBV Pol 항원을 위한 코딩 서열을 포함한다.
본 출원의 다른 구현예에서, 벡터, 예컨대 바이러스 벡터는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩한다. 바람직하게, 상기 벡터는 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열에 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 1과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 1과 100% 동일한 절두된 HBV 코어 항원을 위한 코딩 서열을 포함한다.
본 출원의 또다른 구현예에서, 벡터, 예컨대 바이러스 벡터는 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HBV Pol 항원 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩한다. 바람직하게, 상기 벡터는 융합을 위한 코딩 서열을 포함하되, 서열번호 3과 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 3과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 3과 98%, 99% 또는 100% 동일한 HBV Pol 항원을 위한 코딩 서열에 작동적으로 연결된, 서열번호 1과 적어도 90% 동일한, 예컨대 서열번호 1과 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 1에 98%, 99% 또는 100% 동일한 절두된 HBV 코어 항원을 위한 코딩 서열을 포함한다. 바람직하게, 상기 절두된 HBV 코어 항원을 위한 코딩 서열은, 서열번호 14와 적어도 90% 동일한, 예컨대 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.1%, 99.2%, 99.3%, 99.4%, 99.5%, 99.6%, 99.7%, 99.8%, 99.9% 또는 100% 동일한, 바람직하게 서열번호 14와 98%, 99% 또는 100% 동일한 링커를 위한 코딩서열을 통해 HBV Pol 항원을 위한 코딩 서열에 작동적으로 연결된다. 본 출원의 구체적 구현예에서, 상기 벡터는 서열번호 14에 작동적으로 연결된 서열번호 1을 갖는 융합을 위한 코딩 서열을 포함하며 서열번호 3에 추가적으로 작동적으로 연결된다.
본 출원의 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 발현 벡터는 본 개시의 관점에서 기술분야에 알려진 임의의 방법에 의해 만들어질 수 있다. 예를 들어, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클로레오티드는 예컨대 폴리머라제 연쇄 반응(PCR), 등, 당업자에게 잘 알려진 표준 분자생물학 기술을 사용하여 발현벡터 내로 주입 또는 “클로닝”될 수 있다.
아데노바이러스
일 양태에서, 본 출원은 HBV 코어 항원을 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공한다. 다른 양태에서, 본 출원은 HBV pol 항원을 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 아데노바이러스를 제공한다. 다르게, 본 출원은 항원성 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 이종성 뉴클레오티드 서열 및 항원성 HBV pol 항원을 인코딩하는 제2 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스 벡터를 제공한다. 다른 양태에서, 본 출원은 항원성 HBV 코어-HBV pol 융합 단백질을 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 아데노바이러스를 제공한다.
본 출원에 따른 아데노바이러스는 Adenoviridae 과에 속하며 바람직하게 Mastadenovirus 속에 속하는 것이다. 이는 인간 아데노바이러스일 수 있지만 또한 다른 종을 감염시키는 아데노바이러스일 수 있으며, 비제한적으로 소 아데노바이러스(bovine adenovirus) (예컨대 소 아데노바이러스 3, BAdV3), 개 아데노바이러스(canine adenovirus) (예컨대, CAdV2), 돼지 아데노바이러스(porcine adenovirus)(예컨대, PAdV3 또는 5), 또는 시미안 아데노바이러스(simian adenovirus)(원숭이 아데노바이러스 및 침팬지 아데노바이러스 또는 고릴라 아데노바이러스와 같은 유인원 아데노바이러스를 포함함)를 포함한다. 바람직하게, 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스(HAdV, 또는 AdHu; 본 출원에서 종의 표시 없이 Ad로 지칭되면 인간 아데노바이러스를 의미하며, 예컨대 약기 “Ad5”는 인간 아데노바이러스 혈청형 5인 HAdV5를 의미한다), 또는 침팬지 또는 고릴라 아데노바이러스(ChAd, AdCh, 또는 SAdV)와 같은 시미안 바이러스이다.
대부분의 진보된 연구들은 인간 아데노바이러스를 사용하여 수행되어 왔으며, 인간 아데노바이러스는 본 출원의 소정 양태에 따라 선호된다. 소정 바람직한 구현예에서, 본 출원에 따른 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 기반이다. 바람직한 구현예에서 상기 재조합 아데노바이러스는 인간 아데노바이러스 혈청형 5, 11, 26, 34, 35, 48, 49 또는 50 기반이다. 본 출원의 구체적인 바람직한 구현예에 따르면, 아데노바이러스는 혈청형 26 또는 35 중 하나의 인간 아데노바이러스이다.
이들 혈청형의 이점은 낮은 혈청 유병율 및/또는 인간 개체군에서 중화 항체 역가의 낮은 선재이다. 예컨대, 둘 모두 전체가 본 명세서에 참조로서 통합되는 WO 2007/104792 및 Abbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63에 rAd26 벡터의 제조가 기술된다. Ad26의 예시적 게놈 서열은 GenBank Accession EF 153474 및 WO2007/104792 (예컨대, SEQ ID NO:1 참조)에서 발견된다. 예컨대 Ad35 벡터의 제조는 US Patent No. 7,270,811, WO00/70071, 및 Vogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263-71에 기술되며 이들 모두는 전체가 본 명세서에 참조로서 통합된다. Ad35의 예시적 게놈 서열은 GenBank Accession AC_000019 및 WO00/70071 (예컨대, Fig. 6 참조)에서 발견된다.
시미안 아데노바이러스 또한 전반적으로 낮은 혈청 유병율 및/또는 인간 개체군에서 낮은 선재 중화 항체를 가지며, 침팬지 아데노바이러스 벡터를 사용한 상당한 양의 연구가 보고되어 왔다(예컨대, US6083716; WO2005/071093; WO 2010/086189; WO 2010085984; Farina et al, 2001, J Virol 75: 11603-13; Cohen et al, 2002, J Gen Virol 83: 151-55; Kobinger et al, 2006, Virology 346: 394-401; Tatsis et al., 2007, Molecular Therapy 15: 608-17; 또한 Bangari and Mittal, 2006, Vaccine 24: 849- 62에 의한 리뷰; 및 Lasaro and Ertl, 2009, Mol Ther 17: 1333-39에 의한 리뷰 참조). 따라서 다른 바람직한 구현예에서, 본 출원에 따른 재조합 아데노바이러스는 시미안 아데노바이러스, 예컨대 침팬지 아데노바이러스 기반이다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 재조합 아데노바이러스는 시미안 아데노바이러스 유형 1, 3, 7, 8, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27.1, 28.1, 29, 30, 31.1, 32, 33, 34, 35.1, 36, 37.2, 39, 40.1, 41.1, 42.1, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50 또는 SA7P 기반이다.
아데노바이러스 벡터 rAd26 및 rAd35
본 출원의 바람직한 일 구현예에서, 상기 아데노바이러스 벡터는 두가지 희귀 혈청형: Ad26 및 Ad35로부터의 캡시드 단백질을 포함한다. 전형적인 구현예에서, 상기 벡터는 rAd26 또는 rAd35 바이러스이다.
따라서, 본 출원에서 사용될 수 있는 벡터는 Ad26 또는 Ad35 캡시드 단백질(예컨대, 섬유, 펜톤 또는 헥손 단백질)을 포함한다. 당업자는 전체 Ad26 또는 Ad35 캡시드 단백질이 본 출원의 벡터에 사용된다는 것이 필요하지 않다는 것을 인식할 것이다. 그러므로, 적어도 일부의 Ad26 또는 Ad35 캡시드 단백질을 포함하는 키메릭 캡시드 단백질이 본 출원의 벡터에 사용될 수 있다. 본 출원의 벡터는 또한, 적어도 하나의 캡시드 단백질이 Ad26 또는 Ad35로부터 유래 되는 한, 섬유, 펜톤 및 헥손 단백질이 각각 다른 혈청형으로부터 유래된 캡시드 단백질을 포함할 수 있다. 바람직한 구현예에서, 섬유, 펜톤 및 헥손 단백질은 각각 Ad26으로부터 또는 각각 Ad35로부터 유래된다.
당업자는 다중 혈청형으로부터 유래된 요소들이 단일 재조합 아데노바이러스 벡터에서 결합될 수 있다는 것을 인식할 것이다. 그러므로, 다른 혈청형으로부터 원하는 성질들을 결합한 키메릭 아데노바이러스가 생산될 수 있다. 그러므로, 몇몇 구현예에서, 본 출원의 키메릭 아데노바이러스는 Ad26 및 Ad35 혈청형의 기존 면역의 부재를 온도 안정성, 조립, 정착(anchoring), 생산률, 전가된(redirected) 또는 향상된 감염, 표적 세포에서의 DNA 안정성과 같은 특성과 결합시킬 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 본 출원에서 유용한 재조합 아데노바이러스 벡터는 Ad35 또는 Ad26으로부터 주로 또는 전체로서 유래된다(즉, 벡터는 rAd35 또는 rAd26 이다). 몇몇 구현예에서, 아데노바이러스는 복제결함이고, 예를 들면, 이것은 게놈의 E1 영역에 결실을 함유하기 때문이다. 본 출원의 아데노바이러스의 경우, Ad26 또는 Ad35로부터 유래되므로, 아데노바이러스의 E4-orf6 코딩 서열을 Ad5와 같은 인간 서브그룹 C의 아데노바이러스의 E4-orf6와 교환하는 것이 통상적이다. 이것은 예를 들면, 293 세포, PER.C6 세포 등과 같은 Ad5의 E1 유전자를 발현하는 공지의 보체 세포주에서 이와 같은 아데노바이러스가 증식하는 것을 허용한다(예컨대, Havenga et al, 2006, J Gen Virol 87: 2135-43; WO 03/104467 참조). 본 출원의 일 구현예에서, 아데노바이러스는 항원을 암호화하는 핵산이 클론되어 있는 E1 영역에 결실을 갖고, Ad5의 E4 orf6 영역을 갖는 혈청형 35의 인간 아데노바이러스이다. 본 출원의 일 구현예에서, 아데노바이러스는 항원을 암호화하는 핵산이 클론되어 있는 E1 영역에 결실을 갖고, Ad5의 E4 orf6 영역을 갖는 혈청형 26의 인간 아데노바이러스이다. Ad35 아데노바이러스의 경우, 예를 들면, pIX 오픈 리딩 프레임 또는 Bsu36I 제한 부위에 의해 5' 말단에 표시된 pIX 개시 코돈의 243 bp 단편 바로 상류와 같이 이것을 포함하는 단편의 166 bp 바로 상류에서 아데노바이러스에 E1B 55K 오픈 리딩 프레임의 3' 말단을 보유하는 것이 통상적인데, 이것은 pIX 유전자의 프로모터가 이 면적에 부분적으로 거주하므로 아데노바이러스의 안정성을 증가시키기 때문이다(예컨대, Havenga et al, 2006, supra; WO 2004/001032 참조).
재조합 아데노바이러스 벡터의 제조는 본 분야에 잘 알려져 있다. rAd26 벡터의 제조는 예를 들면, WO 2007/104792 및 Abbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63에 기재되어 있다. 예시적인 Ad26의 게놈 서열은 GenBank Accession EF 153474 및 WO 2007/104792의 SEQ ID NO:1에서 발견된다. rAd35 벡터의 제조는 예를 들면, US 특허 제7,270,811호 및 Vogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263-71에 기재된다. Ad35의 예시적인 게놈 서열은 GenBank Accession AC_000019에 기재된다.
본 출원 일 구현예에서, 본 출원에서 유용한 벡터는 본 명세서에 그 개시가 전체가 참조로서 통합되는 WO2012/082918에 기술된 것을 포함한다.
통상적으로, 본 출원에서 유용한 아데노바이러스 벡터는 전체 재조합 아데노바이러스 게놈을 포함하는 핵산을 사용하여 제조된다(예컨대, 플라스미드, 코스미드, 또는 바쿨로바이러스 벡터). 그러므로, 본 출원은 또한 본 출원의 아데노바이러스 벡터를 암호화하는 단리된 핵산 분자를 제공한다. 본 출원의 핵산 분자는 클로닝에 의해 얻거나 합성에 의해 생산된 RNA 형태 또는 DNA 형태일 수 있다. 상기 DNA는 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다.
본 출원에서 유용한 아데노바이러스 벡터는 통상적으로 복제결함이다. 이들 구현예에서, 바이러스는 E1 영역과 같은, 바이러스의 복제에 중요한 영역의 결실 또는 비활성화에 의해 복제결함이 된다. 영역들은 실질적으로 예를 들면, (일반적으로 프로모터에 연결된) 관심의 유전자의 삽입에 의해 결실 또는 비활성화될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 본 출원의 벡터는 E2, E3, 또는 E4 영역과 같은 다른 영역에서의 결실 또는 프로모터에 링크된 이형 유전자의 삽입을 함유할 수 있다. E2- 및/또는 E-4 돌연변이 아데노바이러스, 일반적으로 E2- 및/또는 E4-보체 세포주가 재조합 아데노바이러스를 생성하는데 사용된다. 아데노바이러스의 E3 영역에서의 돌연변이는 세포주에 의해 보충될 필요가 없는데, E3가 복제에 필요하지 않기 때문이다.
패키징 세포주는 통상적으로 본 출원의 충분한 양의 아데노바이러스 벡터를 생산하는데 사용된다. 패키징 세포는 복제결함 벡터에서 결실되거나 또는 불활성화된 이들 유전자들을 포함하는 세포이고, 그러므로 세포에서 바이러스가 복제되도록 한다. 적절한 세포주는 예를 들면, PER.C6, 911, 293, 및 E1 A549를 포함한다.
상기에서 언급한 바와 같이, 널리 다양한 B형 간염 바이러스(HBV) 항원(예컨대, HBV 코어 및 HBV 폴리머라제 항원)이 벡터에서 발현될 수 있다. 필요한 경우, HBV 항원을 인코딩하는 이종성 유전자가 치료되는 숙주(예컨대, 인간)에서의 적절한 발현을 보장하기 위해 코돈-최적화될 수 있다. 코돈-최적화는 기술분야에 널리 적용되는 기술이다. 전형적으로, 이종성 유전자는 아데노바이러스 게놈의 E1 및/또는 E3 영역 내로 클로닝된다.
상기 이종성 B형 간염 바이러스 유전자는 아데노바이러스 유래 프로모터(예컨대, 메이저 레이트 프로모터(Major Late Promoter))의 제어 하(즉, 작동적으로 연결)에 있을 수 있거나 이종성 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 적합한 이종성 프로모터의 예시는 CMV 프로모터 및 RSV 프로모터를 포함한다. 바람직하게는 상기 프로모터는 발현 카세트 내 관심 이종성 유전자의 상류에 위치한다.
MVA 벡터
본 출원에 유용한 MVA 벡터는 변형된 백시니아 앙카라 바이러스(Modified Vaccinia Ankara virus, MVA)로부터 유래한 약독화된 바이러스를 활용한다. 상기 MVA 벡터는 널리 다양한 HBV 항원(예컨대, HBV 코어 및 HBV 폴리머라제 항원)을 발현한다. 일 양태에서, 본 출원은 항원성 HBV 코어 항원을 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 MVA 벡터를 제공한다. 다른 양태에서, 본 출원은 항원성 HBV pol 항원을 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 MVA 벡터를 제공한다. 일 양태에서, 본 출원은 항원성 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 이종성 뉴클레오티드 서열 및 항원성 HBV pol 항원을 인코딩하는 제2 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 MVA 벡터를 제공한다. 다른 양태에서, 본 출원은 항원성 HBV 코어-HBV pol 융합 단백질을 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 재조합 MVA 벡터를 제공한다.
변형된 백시니아 바이러스 앙카라(“MVA”)
인조 약독화 변형된 백시니아 바이러스 앙카라(“MVA”)는 백시니아 바이러스의 앙카라 균주(CVA)의 닭 배아 섬유아세포 상에서 516 계대배양에 의해 생성되었다(Mayr, A., et al. Infection 3, 6-14 (1975)의 리뷰 참조). 이러한 장기 계대의 결과로 획득된 MVA 바이러스는 그 게놈 서열에서 약 31킬로베이스가 결실되었으며 따라서, 조류(avian) 세포에 한정되는 매우 높은 숙주 세포 제한성을 갖는 것으로 기술되었다(Meyer, H.　et al.,　J.Gen.Virol. 72, 1031-1038 (1991)).　생성된 MVA는 다양한 동물 모델에서 완전 복제 적격 출발 물질과 비교하여 상당히 무독화인 것으로 나타났다(Mayr, A. & Danner, K., Dev. Biol. Stand. 41: 225-34 (1978)).　
본 출원의 실시에 유용한 MVA 바이러스는 비제한적으로 MVA-572 (1994.1.27에 ECACC V94012707로 기탁됨); MVA-575 (2000.12.7.에 ECACC V00120707 로 기탁됨), MVA-I721 (Suter et al., Vaccine 2009에 참조됨), 및 ACAM3000 (2003.3.27.에 ATCC® PTA-5095 로 기탁됨)을 포함할 수 있다.
보다 바람직하게 본 출원에 따라 사용되는 MVA는 MVA-BN 및 MVA-BN의 유도체를 포함한다. MVA-BN은 PCT 국제 공보 제 WO 02/042480에 기술된다. MVA-BN의 “유도체”는 본 명세서에서 기술되는 바와 같이 MVA-BN과 본질적으로 동일한 복제 특성을 나타내지만 그 게놈의 하나 이상의 부분에 차이를 나타내는 바이러스를 지칭한다.
MVA-BN는 물론, 이들의 유도체는 복제 부적격이며, 생체내(in vivo) 및 시험관내(in vitro)에서 생식적으로 복제 불능을 의미한다. 보다 특히 시험관내에서, MVA-BN 또는 이들의 유도체는 닭 배아 섬유아세포(CEF)에서 생식적 복제를 할 수 있지만 인간 각질형성세포 세포주 HaCat(Boukamp et al (1988), J. Cell Biol. 106:761-771), 인간 골육종(human bone osteosarcoma) 세포주 143B (ECACC Deposit No. 91112502), 인간 배아 신장(human embryo kidney) 세포주 293 (ECACC Deposit No. 85120602 및 인간 자궁 경부 선암(human cervix adenocarcinoma) 세포주 HeLa (ATCC Deposit No. CCL-2)에서 생식적 복제를 할 수 없는 것으로 기술되어 왔다. 더욱이, MVA-BN 또는 이들의 유도체는 Hela 세포 및 HaCaT 세포주에서 MVA-575 보다 적어도 2배 낮은, 보다 바람직하게 3배 낮은 바이러스 증폭비를 가진다. 이들 MVA-BN 및 유도체의 특성을 위한 시험 및 검정은 WO 02/42480 (U.S. Patent application No. 2003/0206926) 및 WO 03/048184 (U.S. Patent application No. 2006/0159699)에 기술된다.
이전 단락에서 기술된 바와 같이 용어 시험관내에서 인간 세포주에서 “생식적 복제를 할 수 없는” 또는 “생식적 복제능이 없는”은 예컨대 WO 02/42480에 기술되며, 또한 위에서 언급한 바와 같은 요망하는 특성을 갖는 MVA를 얻는 방법을 교시한다. 상기 용어는 WO 02/42480 또는 U.S. Patent No. 6,761,893에 기술된 검정을 사용하여 시험관내 감염 4일 후 1 미만의 바이러스 증폭비를 갖는 바이러스에 적용된다.
용어 “생식적으로 복제 불능”은 이전 단락에서 기술된 바과 같이 시험관내 인간 세포주에서 감염 4일 후 1 미만의 바이러스 증폭비를 갖는 바이러스를 지칭한다. WO 02/42480 또는 U.S. Patent No. 6,761,893에 기술된 검정이 바이러스 증폭비의 판정을 위해 적용될 수 있다.
이전 단락에서 기술된 바와 같은 시험관내 인간 세포주에서 바이러스의 증폭 또는 복제는 일반적으로 “증폭비”로 지칭되는 보통 최초에 세포를 감염하는 데에 원래 사용된 양(인풋)에 대한 감염된 세포로부터 생산된 바이러스(아웃풋)의 비율로 표현된다. 증폭비 “1”은 감염된 세포로부터 생산된 비이러스의 양이 초기에 세포를 감염하는 데에 사용된 양과 동일한 증폭 상태를 정의하며 이는 감염된 세포가 바이러스 감염 및 복제에 허용적(permissive)임을 의미한다. 반면, 1 미만의 증폭비, 즉, 인풋 수준에 대한 아웃풋의 감소는 생식적 복제의 결핍을 나타내고 따라서 바이러스의 약독화를 나타낸다.
MVA-기반 백신의 이점은 이들의 안전성 프로파일은 물론 대규모 백신 생산 가능성을 포함한다. 전임상 시험은 MVA-BN이 다른 MVA 균주에 비해 우월한 약독화 및 효능을 입증함을 밝혔다(WO 02/42480). MVA-BN 균주의 추가적인 특성은 DNA-프라임/백시니아 바이러스 부스트 요법과 비교할 때 백시니아 바이러스 프라임/백시니아 바이러스 부스트 요법에서 실질적으로 동일 수준의 면역성을 유도할 수 있는 것이다.
본 명세서에서 가장 바람직한 구현예인, 재조합 MVA-BN 바이러스는 이들의 포유동물 세포에서의 구별되는 복제 결함 및 잘-수립된 무독화 때문에 안전한 것으로 여겨진다. 또한 그 효능에 더하여, 산업적 규모의 생산 가능성이 유리할 수 있다. 또한, MVA-기반 백신은 다중 이종성 항원을 전달할 수 있고 체액성 및 세포성 면역의 동시 유도를 가능하게 할 수 있다.
본 출원에서 유용한 MVA 벡터는 기술 분야에 알려진 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 예컨대 WO/2002/042480 및 WO/2002/24224에 기술되며, 이들의 관련된 개시는 본 명세서에 참조로서 통합된다.
본 출원의 바람직한 구현예에서, MVA 벡터는 HBV 코어 항원, HBV pol 항원 및 HBV-코어-HBV pol 융합 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상의 항원성 단백질을 인코딩하는 핵산을 포함한다.
상기 HBV 항원 단백질은 MVA의 하나 이상의 유전자간 영역(intergenic region, IGR) 내로 삽입될 수 있다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 IGR은 IGR07/08, IGR 44/45, IGR 64/65, IGR 88/89, IGR 136/137, 및 IGR 148/149로부터 선택된다. 본 출원의 일 구현예에서, 재조합 MVA의 5, 4, 3, 또는 2 미만의 IGR은 HBV 코어 항원 및/또는 HBV pol 항원의 항원 결정인자를 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 상기 이종성 뉴클레오티드 서열은, 추가적으로 또는 대체적으로, 하나 이상의 천연 결실 영역 내로, 구체적으로 MVA 게놈의 주요 결실 부위 I, II, III, IV, V, 또는 VI 내로 삽입될 수 있다. 본 출원의 일 구현예에서, 재조합 MVA의 5, 4, 3, 또는 2 미만의 천연 결실 부위은 HBV 코어 항원 및/또는 HBV pol 항원의 항원 결정인자를 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
HBV 단백질의 항원 결정인자를 인코딩하는 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MVA 삽입 부위의 수는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 그 이상이다. 본 출원의 구현예에서, 이종성 뉴클레오티드 서열은 4, 3, 2 또는 그 이하의 삽입 부위 내로 삽입된다. 바람직하게, 2 삽입 부위가 사용된다. 본 출원의 일 구현예에서, 3 삽입 부위가 사용된다. 바람직하게, 재조합 MVA는 2 또는 3 삽입 부위 내로 삽입되는 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7 유전자를 포함한다.
본 명세서에서 제공되는 재조합 MVA 바이러스는 기술 분야에 알려진 일상적 방법에 의해 생성될 수 있다. 재조합 폭스바이러스를 얻는 방법 또는 폭스바이러스 게놈 내로 외인성 코딩 서열을 삽입하는 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, DNA 클로닝, DNA 및 RNA 단리, 웨스턴 블롯 분석, RT-PCR 및 PCR 증폭 기술과 같은 표준 분자생물학 기술을 위한 방법은 문헌 Molecular Cloning, A laboratory Manual (2nd Ed.) (J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989))에 기술되어 있고, 바이러스의 처리 및 조작 기술은 문헌 Virology Methods Manual (B.W.J. Mahy et al. (eds.), Academic Press (1996))에 기술된다. 유사하게, MVA의 처리, 조작 및 유전자공학을 위한 기술 및 노하우는 문헌 Molecular Virology: A Practical Approach (A.J. Davison & R.M. Elliott (Eds.), The Practical Approach Series, IRL Press at Oxford University Press, Oxford, UK (1993)(see, e.g., Chapter 9: Expression of genes by Vaccinia virus vectors)) 및 문헌 Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Son, Inc. (1998)(see, e.g., Chapter 16, Section IV: Expression of proteins in mammalian cells using vaccinia viral vector))에 기술된다.
본 명세서에 기재된 다양한 재조합 MVA의 생성을 위해 상이한 방법을 적용할 수 있다. 바이러스 내에 삽입될 DNA 서열은 MVA의 DNA 섹션과 동종성인 DNA가 삽입된 대장균 플라스미드 작제물 내부에 배치될 수 있다. 별개로, 삽입될 DNA 서열은 프로모터에 연결될 수 있다. 프로모터-유전자 결합은 플라스미드 작제물 내에 위치하여 프로모터-유전자 결합이 양 쪽 말단 상에 비-본질적 유전자좌(locus)를 포함하는 MVA의 영역에 플랭킹하는 DNA 서열에 동종성인 DNA에 의해 플랭킹 되게 한다. 결과물 플라스미드 작제물은 대장균 박테리아 내에서의 증식에 의해 증폭되고 단리될 수 있다. 삽입될 DNA 유전자 서열을 포함하는 단리된 플라스미드는 세포 배양물, 예컨대 닭 배아 섬유아세포(CEFs) 내로 형질감염될 수 있으며, 동시에 상기 배양물은 MVA로 감염된다. 플라스미드 내의 동종성 MVA DNA와 바이러스 게놈 간의 재조합은 각각 외부 DNA 서열의 존재에 의해 변형된 폭스바이러스를 생성할 수 있다.
바람직한 구현예에 따르면, 적합한 세포 배양의 세포, 예컨대 CEF 세포는 폭스바이러스로 감염될 수 있다. 감염된 세포는, 이어서, 외래 또는 이종성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제1 플라스미드 벡터로, 바람직하게는 폭스바이러스 발현 조절인자의 전사 제어 하에서, 형질감염된다. 상기에서 설명된 바와 같이, 플라스미드 벡터는 또한 외인성 서열을 폭스바이러스 게놈의 선택된 부분으로의 삽입을 지시할 수 있는 능력이 있는 서열을 포함한다. 선택적으로, 플라스미드 벡터는 또한 폭스바이러스 프로모터에 작동적으로 연결된 마커 및/또는 선택 유전자를 포함하는 카세트를 포함한다.
적합한 마커 또는 선택 유전자는, 예컨대, 녹색 형광 단백질, β-갈라토시다제, 네오마이신-포스포리보실트랜스퍼라제 또는 다른 마커들을 인코딩하는 유전자이다. 선택 또는 마커 카세트의 사용은 생성된 재조합 폭스바이러스의 동정 및 단리를 단순화한다. 그러나, 재조합 폭스바이러스는 또한 PCT 기술에 의해 동정될 수 있다. 이어서, 추가 세포는 상술한 바와 같이 얻어지진 재조합 폭스바이러스로 감염될 수 있고 제2 외래 또는 이종성 유전자 또는 유전자들을 포함하는 제2 벡터로 형질감염될 수 있다. 이 경우, 이 유전자는 폭스바이러스 게놈의 상이한 삽입 부위 내로 도입될 수 있고, 제2 벡터 또한 폭스바이러스의 게놈 내로의 제2 외래 유전자 또는 유전자들의 통합을 지시하는 폭스바이러스-동종성 서열이 상이할 수 있다. 동종성 재조합이 수행된 후, 2 이상의 외래 또는 이종성 유전자를 포함하는 재조합 바이러스가 단리될 수 있다. 추가적 외래 유전자의 재조합 바이러스 내로의 도입을 위해, 감염을 위한 앞선 단계들에서 단리된 재조합 바이러스를 사용하거나 형질감염을 위한 추가적 외래 유전자 또는 유전자들을 포함하는 추가적 벡터를 사용하여 재조합 바이러스 감염 및 형질감염 단계를 반복할 수 있다.
대안적으로, 상술한 감염 및 형질감염 단계는 상호교체될 수 있다. 즉, 적합한 세포는 먼저 외래유전자를 포함하는 플라스미드 벡터에 의해 형질감염될 수 있고, 그리고 나서 폭스바이러스로 감염될 수 있다. 추가적 대안으로서, 또한 각각의 외래 유전자를 상이한 바이러스 내로 도입할 수 있고, 모든 얻어진 재조합 바이러스로 세포를 공-감염하고 모든 외래 유전자를 포함하는 재조합체를 스크리닝할 수 있다. 세번째 대안은 DNA 게놈 및 외래 서열의 시험관내(in vitro) 연결(ligation) 및 재조합된 백시니아 바이러스 DNA 게놈의 헬퍼 바이러스를 사용한 재구성이다. 네번째 대안은 박테리아 인공 염색체(bacterial artificial chromosome, BAC)로 클로닝 된 백시니아 바이러스 게놈, 예컨대 MVA와 백시니아 바이러스 게놈 내의 통합이 요망되는 부위에 플랭킹되는 서열과 동종성인 DNA 서열과 플랭킹된 선형 외래 서열 간의 대장균 또는 다른 박테리아 종 내에서의 동종성 재조합이다.
이종성 HBV 유전자(예컨대, HBV 코어 항원, HBV pol 항원, 및/또는 HBV 코어-HBV-pol 융합 단백질)는 하나 이상의 폭스바이러스 프로모터의 조절 하(즉, 작동적으로 연결)일 수 있다. 본 출원의 일 구현예에서, 상기 폭스바이러스 프로모터는 하이브리드 초기/후기 프로모터인 Pr7.5 프로모터, 하이브리드 초기/후기 프로모터, 또는 합성 또는 천연성 초기 또는 후기 프로모터인 PrS5E 프로모터, 또는 카우폭스 바이러스 ATI 프로모터이다.
조성물, 면역원적 조합물, 및 백신
본 출원은 또한 조성물, 면역원적 조합물, 보다 구체적으로 키트, 및 하나 이상의 HBV 항원, 본 출원에 따른 하나 이상의 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터를 포함하는 백신에 관한다. 본 명세서에 기술된 본 출원의 HBV 항원, 폴리뉴클레오티드(RNA 및 DNA 포함), 및/또는 벡터 중 임의의 것이 본 출원의 조성물, 면역원적 조합물 또는 키트, 및 백신에 사용될 수 있다.
일반적인 양태에서, 본 출원은 서열번호 2와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원 또는 서열번호 4와 적어도 90% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 단리된 또는 비천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA), 상기 단리된 또는 비천연 핵산 분자를 포함하는 벡터, 및/또는 상기 단리된 또는 비천연 핵산 분자에 의해 인코딩되는 단리된 또는 비천연 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 단리된 또는 비천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV pol 항원을 인코딩하는 단리된 또는 비천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 또는 비천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA); 및 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV pol 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 또는 비천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA)를 포함한다. 절두된 HBV 코어 항원 및 HBV Pol 항원을 위한 코딩 서열은 동일한 단리된 또는 비천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA) 내에 또는 두개의 상이한 단리된 또는 비천연 핵산 분자(DNA 또는 RNA) 내에 존재할 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV pol 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터; 및 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV pol 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함한다. 절두된 HBV 코어 항원 및 HBV Pol 항원을 위한 코딩 서열을 포함하는 벡터는 동일한 벡터 또는 상이한 두개의 벡터일 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원에 작동적으로 연결된, 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 바이러스 벡터를 포함하거나, 그 반대로 마찬가지이다. 바람직하게, 상기 융합 단백질은 절두된 HBV 코어 항원을 HBV Pol 항원에 작동적으로 연결시키거나, 그 반대로 마찬가지인 링커를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 링커는 (AlaGly)n의 아미노산 서열을 가지고, n은 2 내지 5의 정수이다.
본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 단리된 또는 비천연 절두된 HBV 코어 항원을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 또는 비천연 HBV pol 항원을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 단리된 또는 비천연 절두된 HBV 코어 항원; 및 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 단리된 또는 비천연 HBV pol 항원을 포함한다.
본 출원의 일 구현예에서, 본 출원의 일 구현예에서, 조성물은 서열번호 4와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV Pol 항원에 작동적으로 연결된, 서열번호 2와 적어도 90% 동일한, 바람직하게는 서열번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 포함하거나, 그 반대로 마찬가지이다. 바람직하게, 상기 융합 단백질은 절두된 HBV 코어 항원을 HBV Pol 항원에 작동적으로 연결시키거나, 그 반대로 마찬가지인 링커를 추가로 포함한다. 바람직하게, 상기 링커는 (AlaGly)n의 아미노산 서열을 가지고, n은 2 내지 5의 정수이다.
다른 양태에서, 본 출원은 본 출원의 구현예에 따른 절두된 HBV 코어 항원 및 HBV pol 항원을 발현하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 면역원적 조합물 또는 키트에 관한다. 본 명세서에 기술된 본 출원의 절두된 HBV 코어 항원 및 HBV pol 항원을 인코딩하는 임의의 폴리뉴클레오티드 및/또는 벡터가 본 출원의 면역원적 조합물 또는 키트에서 사용될 수 있다.
본 출원의 구현예에 따르면, 백신 조합물 또는 키트 내의 폴리뉴클레오티드는 연결되거나 또는 별개일 수 있어, 동일 또는 상이한 폴리뉴클레오티드로부터 발현되거나 상관 없이, 이러한 폴리뉴클레오티드로부터 발현된 HBV 항원이 서로 융합되거나 별개 단백질로서 생산된다. 일 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 동일 또는 별개 조성물에서 조합되어 사용되는 별개의 바이러스 벡터에 존재할 수 있어, 발현된 단백질 또한 별개의 단백질이지만 조합되어 사용된다. 다른 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 HBV 항원은 동일 바이러스 벡터로부터 발현될 수 있어, HBV 코어-pol 융합 항원이 생산된다. 선택적으로, 코어 및 pol 항원은 짧은 링커에 의해 서로 연결 또는 융합될 수 있다. 대안적으로, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 HBV 항원은 코어 및 pol 항원 코딩 서열 사이의 리보좀 슬리파지(slippage) 부위(시스-하이드롤라제 부위로도 알려짐)를 사용하여 단일 벡터로부터 독립적으로 발현될 수 있다. 이 전략은 단일 mRNA 전사체로부터 개별 코어 및 pol 항원이 내부에서 생산되는 바이시스트로닉(bicistronic) 발현 벡터를 초래한다. 이러한 바이시스트로닉 발현 벡터로부터 생산된 코어 및 pol 항원은 mRNA 전사체 상의 코딩 서열의 배치에 의존하여 추가적인 N 또는 C-말단 잔기를 가질 수 있다. 이 목적을 위해 사용될 수 있는 리보좀 슬리파지 부위의 예시는 비제한적으로 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV)로부터의 FA2 슬리파지 부위를 포함한다. 다른 가능성은 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 HBV 항원이 하나는 HBV 코어 항원을 인코딩하고 하나는 HBV pol 항원을 인코딩하는, 두개의 별개의 벡터로부터 독립적으로 발현될 수 있는 것이다.
바람직한 구현예에서, 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드는 별개의 바이러스 벡터에 존재한다. 바람직하게, 별개의 벡터는 동일 조성물에 존재한다.
본 출원의 구체적인 구현예에서, 면역원적 조합물 또는 키트는: 서열번호 2와 적어도 90% 동일하고, 바람직하게 서열번호 2와 100% 동일한 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제1 벡터, 바람직하게 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터; 및 서열번호 4와 적어도 90% 동일하고, 바람직하게 서열번호 4와 100% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 벡터, 바람직하게 DNA 플라스미드 또는 바이러스 벡터를 포함한다.
본 출원의 구체적인 일 구현예에서, 제1 벡터는 제1 DNA 플라스미드이고 제2 벡터는 제2 DNA 플라스미드이다. 제1 및 제2 DNA 플라스미드 각각은 복제 원점, 바람직하게 서열번호 21의 pUC ORI, 및 바람직하게 서열번호 22와 적어도 90% 동일한 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 코돈 최적화된 Kanr (카나마이신 내성) 유전자를 포함하는, 바람직하게 bla 프로모터, 예컨대 서열번호 24에 나타나는 bla 프로모터의 제어하에 놓인, 항생제 내성 카세트를 포함한다. 각각의 제1 및 제2 DNA 플라스미드는 독립적으로 프로모터 서열, 인핸서 서열 및 제1 폴리뉴클레오티드 서열 또는 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열 중 적어도 하나를 추가로 포함한다. 바람직하게, 각각의 제1 및 제2 DNA 플라스미드는 제1 폴리뉴클레오티드 또는 제2 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 상류 서열을 포함하며, 상기 상류 서열은, 5' 말단으로부터 3' 말단으로, 서열번호 7의 프로모터 서열, 서열번호 8의 인핸서 서열, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 각각의 제1 및 제2 DNA 플라스미드는 또한 HBV 항원의 코딩 서열의 하류에 위치한 서열번호 9의 bGH 폴리아데닐화 신호와 같은 폴리아데닐화 신호를 포함할 수 있다.
본 출원의 구체적 일 구현예에서, 제1 벡터는 제1 바이러스 벡터이고 제2 벡터는 제2 바이러스 벡터이다. 바람직하게, 각각의 제1 및 제2 바이러스 벡터는, 아데노바이러스 벡터, 보다 바람직하게 Ad26 또는 Ad35 벡터이고, HBV pol 항원 또는 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 5' 말단부터 3' 말단으로, 바람직하게 서열번호 7의 CMV 프로모터 서열인 프로모터 서열, 바람직하게 서열번호 15의 ApoAI 유전자 단편 서열 또는 서열번호 8의 트리플 인핸서 서열인 인핸서 서열, 및 바람직하게 서열번호 6의 아미노산 서열을 가지는 시스타틴 S 신호 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 가지는 면역글로불린 분비 신호를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열인 신호서열을 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 상류 서열; 및 폴리아데닐화 신호, 바람직하게 서열번호 16의 SV40 폴리아데닐화 신호를 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 하류 서열;을 포함하는 발현 카세트를 포함한다.
본 출원의 구체적 일 구현예에서, 제1 벡터는 제1 바이러스 벡터이고 제2 벡터는 제2 바이러스 벡터이다. 바람직하게, 각각의 제1 및 제2 바이러스 벡터는, MVA 벡터이고, 본 출원의 HBV pol 항원 및/또는 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드; 5' 말단부터 3' 말단으로, 바람직하게 서열번호 25의 PrMVA13.5 긴 프로모터 서열 또는 서열번호 26의 PrHyb 프로모터 서열인 프로모터 서열, 및 바람직하게 서열번호 6의 아미노산 서열을 갖는 시스타틴 S 신호 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 갖는 면역글로불린 분비 신호인 신호 펩티드 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 상류 서열; 및 폴리아데닐화 신호 또는 초기 종결 신호를 포함하는, HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 하류 서열;을 포함하는 발현 카세트를 포함하되, 상기 초기 종결 신호는 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 갖거나, 상기 폴리아데닐화 신호는 서열번호 16의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 SV40 폴리아데닐화 신호 또는 서열번호 9의 폴리뉴클레오티드 서열을 갖는 bGH 폴리아데닐화 신호로부터 선택되고, 바람직하게 상기 HBV 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결된 하류 서열은 서열번호 28의 뉴클레오티드 서열을 갖는 초기 종결 신호이다.
본 출원의 일 구현예서, (a) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역학적 유효량의 아데노바이러스 벡터를 포함하되, 상기 HBV 폴리머라제 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 제1 조성물; 및 (b) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역학적 유효량의 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 벡터를 포함하되, 상기 HBV 폴리머라제 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 제2 조성물;을 포함하되, 상기 제1 조성물은 면역 반응을 프라임하기 위해 인간 대상체에 투여되고, 제2 조성물은 면역 반응을 부스팅하기 위해 인간 대상체에 1회 이상 투여되는, 백신 조합물을 제공한다.
본 출원의 일 구현예서, (a) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역학적 유효량의 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 벡터를 포함하되, 상기 HBV 폴리머라제 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 제1 조성물; 및 (b) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역학적 유효량의 아데노바이러스 벡터를 포함하되, 상기 HBV 폴리머라제 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 제2 조성물;을 포함하되, 상기 제1 조성물은 면역 반응을 프라임하기 위해 인간 대상체에 투여되고, 제2 조성물은 면역 반응을 부스팅하기 위해 인간 대상체에 1회 이상 투여되는, 백신 조합물을 제공한다.
본 출원의 이들 구현예에서, 제1 바이러스 벡터 및 제2 바이러스 벡터를 포함하는 면역원적 조합물 내의 각각의 제1 및 제2 벡터의 양은 구체적으로 한정되지 않는다. 예를 들어, 제1 바이러스 벡터 및 제2 바이러스 벡터는 중량비로 10:1 내지 1:10, 예컨대 중량비로 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10의 비율로 존재할 수 있다. 바람직하게, 제1 및 제2 바이러스 벡터는 중량비로 1:1의 비율로 존재한다.
본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물은 추가적 HBV 항원 및/또는 추가적 HBV 항원 또는 그 면역원적 단편을 인코딩하는 추가적 폴리뉴클레오티드 또는 벡터를 포함할 수 있다. 그러나, 구체적 구현예에서, 본 출원의 상기 조성물 및 면역원적 조합물은 특정 항원을 포함하지 않는다.
구체적인 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물 또는 키트는 HBsAg 또는 HBsAg를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
다른 구체적 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물 또는 키트는 HBV L 단백질 또는 HBV L 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
본 출원의 또 다른 구체적 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물은 HBV 외피 단백질 또는 HBV 외피 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하지 않는다.
본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물은 약학적 허용 담체를 또한 포함할 수 있다. 상기 약학적 허용 담체는 비-독성이고 활성 성분의 효능과 경합하지 않아야 한다. 약학적 허용 담체는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 예컨대 결합제, 붕해제, 팽윤제, 현탁화제, 유화제, 수화제, 윤활제, 풍미제, 감미제, 보존제, 염료, 가용화제 및 코팅을 포함할 수 있다. 담체 또는 다른 물질의 정확한 성질은 투여 경로, 예컨대, 근육내, 피내, 피하, 경구, 정맥내, 피부, 점막내(예컨대, 장), 비내 또는 복강내 경로에 의존할 수 있다. 액체 주사 조제물에 있어서, 예를 들어, 현탁액 및 용액, 적합한 담체 및 첨가제는 물, 글리콜, 오일, 알코올, 보존제, 착색제 등을 포함한다. 고체 경구 조제물에 있어서, 예를 들어, 분말, 캡슐, 캐플릿, 젤캡 및 정제, 적합한 담체 및 첨가제는 전분, 당, 희석제, 과립화제, 윤활제, 결합제, 붕해제 등을 포함한다. 비강 스프레이/흡입제 혼합물에 있어서, 수용액/현탁액은 물, 글리콜, 오일, 연화제, 안정화제, 수화제, 보존제, 방향제, 풍미제 등을 적합한 담체 및 첨가제로서 포함할 수 있다.
본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물은 비제한적으로 경구(장관) 투여 및 비경구 주사를 포함하여, 투여를 촉진하고 유효성을 향상하기 위한 대상에 대한 투여에 적합한 임의의 물질로 제형화될 수 있다. 비경구 주사는 정맥내 주사 또는 주입, 피하 주사, 피내 주사, 및 근육내 주사를 포함한다. 본 출원의 조성물은 또한 점막통과, 눈, 직장, 장기 작용 이식, 설하 투여, 혀 아래, 경구 점막으로부터 문맥 순환, 흡입, 또는 비강내를 포함하는 다른 투여 경로를 위해 제형화될 수 있다.
본 출원의 바람직한 구현예에서, 본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물은 비경구 주사, 바람직하게 피하, 피내 주사 또는 근육내 주사, 보다 바람직하게 근육내 주사로 제형화된다.
본 출원의 구현예에 따르면, 투여를 위한 조성물 및 면역원적 조합물은 전형적으로 약학적 허용 담체 내의 완충용액, 예컨대 완충 식염수와 같은 수성 담체 등, 예컨대 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 포함할 것이다. 상기 조성물 및 면역원적 조합물은 또한 pH 조절제 및 완충제와 같은 생리학적 조건을 근사화하기 위해 요구되는 약학적 허용 물질을 포함할 수 있다. 전형적인 구현예에서, 본 출원의 플라스미드 DNA를 포함하는 조성물 또는 면역원적 조합물은 포스페이트 완충 식염수(PBS)를 약학적 허용염으로서 포함할 수 있다. 상기 플라스미드 DNA는 예컨대, 0.5 mg/mL 내지 5 mg/mL, 예컨대 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 또는 5 mg/mL, 바람직하게 1 mg/mL의 농도로 존재할 수 있다.
본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물은 기술 분야에 잘 알려진 방법에 따라 백신(“면역원적 조성물”이라 지칭되기도 함)으로 제형화될 수 있다. 일한 조성물은 면역 반응을 증진하기 위해 애주번트를 포함할 수 있다. 제형 내 각 성분의 최적 비율은 본 개시의 관점에서 당업자에게 잘 알려진 기술에 의해 결정될 수 있다.
본 출원의 일 구현예에서, 애주번트는 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물에 포함되거나, 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물과 공-투여(co-administer) 된다. 애주번트의 사용은 선택적이며, 조성물이 백신접종 목적을 위해 사용될 때 면역 반응을 보다 증진할 수 있다. 공-투여 또는 본 출원에 따른 조성물 내에 포함시키기에 적합한 애주번트는 인간에게 잠재적으로 안전하고 내약성이 우수하며 효과적인 것이 바람직할 것이다. 애주번트는 작은 분자 또는 항체로서, 비제한적으로, 면역 체크포인트 억제제(예컨대, 항-PD1, 항-RIM-3 등), 톨-유사 수용체 억제제, RIG-1 억제제, IL-15 수퍼아고니스트(Altor Bioscience), 돌연변이 IRF3 및 IRF7 유전적 애주번트, STING 아고니스트(Aduro), FLT3L 유전적 애주번트, IL-12 유전적 애주번트, 및 IL-7-hyFc를 포함할 수 있다.
본 출원의 구현예는 또한 본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물의 제조 방법에 관한다. 본 출원의 구현예에 따르면, 조성물 또는 면역원적 조합물의 제조 방법은 본 출원의 HBV 항원, 벡터 및/또는 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된 폴리 뉴클레오티드를 하나 이상의 약학적 허용 담체와 혼합하는 단계를 포함한다. 당해 분야의 숙련가는 이러한 조성물의 제조에 사용되는 통상적인 기술에 익숙할 것이다.
면역 반응을 유도/증진하는 방법
다른 일반적인 양태에서, 본 출원은 B형 간염 바이러스(HBV)에 대한 면역 반응을 이를 필요로 하는 대상체 내에서 유도하는 방법에 관하며, 상기 방법은 면역학적 유효량의 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물을 대상체에 투여하는 것을 포함한다. 본 명세서에 기술된 본 출원의 임의의 조성물 및 면역원적 조합물이 본 출원의 방법에 사용될 수 있다.
본 출원은 MVA 벡터를 아데노바이러스 벡터와 조합하여 사용하여 인간 대상체 내에서 HBV 항원성 단백질 또는 면역원적 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 프라임 또는 부스트하는 향상된 방법을 제공한다.
본 출원의 일반적 양태에 따르면, 인간 대상체 내에서 면역 반응을 증진하는 방법은:
a. 면역학적 유효량의 본 출원의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 및
b. 면역학적 유효량의 본 출원의 MVA 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계;
를 포함하여, 인간 대상체에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역 반응을 얻는다.
본 출원의 다른 일반적 양태에 따르면, 인간 대상체 내에서 면역 반응을 증진하는 방법은:
a. 면역학적 유효량의 본 출원의 MVA 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 및
b. 면역학적 유효량의 본 출원의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계;
를 포함하여, 인간 대상체에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역 반응을 얻는다.
본 출원의 다른 일반적 양태에 따르면, 인간 대상체 내에서 면역 반응을 증진하는 방법은:
a. 본 출원의 HBV pol 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비천연 핵산을 포함하는 제1 플라스미드의 면역학적 유효량, 및 본 출원의 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비천연 핵산을 포함하는 제2 플라스미드의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 및
b. 면역학적 유효량의 본 출원의 MVA 벡터를 포함하는 제2 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계;
를 포함하여, 인간 대상체에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역 반응을 얻는다.
본 출원의 다른 일반적 양태에 따르면, 인간 대상체 내에서 면역 반응을 증진하는 방법은:
a. 면역학적 유효량의 본 출원의 MVA 벡터를 포함하는 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 및
b. 본 출원의 HBV pol 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비천연 핵산을 포함하는 제1 플라스미드의 면역학적 유효량, 및 본 출원의 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비천연 핵산을 포함하는 제2 플라스미드의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계;
를 포함하여 인간 대상체에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역 반응을 얻는다.
제1 조성물은 이를 필요로 하는 인간 대상체에 투여되어 면역반응을 프라임하고, 제2 조성물은 이를 필요로 하는 인간 대상체에 투여되어 면역 반응을 부스트한다. 면역 반응을 프라임 및 부스트하는 것은 예컨대 면역 반응을 증진할 수 있다.
본 출원의 구체예에 따르면, 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내의 HBV 항원성 단백질에 대한 증진된 항체 반응을 포함한다.
바람직하게, 상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 HBV 항원성 단백질에 대한 증진된 CD4+ T 세포 반응 또는 증진된 CD8+ T 세포 반응을 추가로 포함한다. 본 출원의 일 구현예에 따른 방법에 의해 생성된 증진된 CD4+ T 세포 반응은 예컨대, 인간 대상체 내에서 HBV 항원성 단백질에 대한 우성(dominant) CD4+ T 세포 반응의 증가 또는 유도 및/또는 HBV 항원성 단백질에 특이적인 다기능성(polyfunctional) CD4+ T 세포의 증가 또는 유도일 수 있다. 상기 다기능성 CD4+ T 세포는 하나 이상의 사이토카인, 예컨대 2 이상의 IFN-감마, IL-2 및 TNF-알파를 발현한다. 상기 본 출원의 일 구현예에 따른 방법에 의해 생성된 증진된 CD8+ T 세포 반응은 예컨대 인간 대상체 내에서 HBV 항원성 단백질에 특이적인 다기능성 CD8+ T 세포의 증가 또는 유도일 수 있다.
보다 바람직하게, 상기 본 출원의 일 구현예에 따른 방법에 의해 초래된 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 HBV 항원성 단백질에 대한, 증진된 CD4+ T 세포 반응, 증진된 항체 반응 및 증진된 CD8+ T 세포 반응을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 “감염”은 질환을 야기하는 인자에 의한 숙주의 침입을 지칭한다. 질환을 야기하는 인자는 숙주에 침입할 수 있고, 숙주 내에서 복제 또는 증식할 수 있을 때 “감염성”이라 여겨진다. 감염성 인자의 예는 바이러스, 예컨대, HBV 및 아데노바이러스의 특정 종, 프리온, 박테리아, 균류, 원생동물 등을 포함한다. “HBV 감염”은 특히 숙주 유기체, 예컨대 숙주 유기체의 세포 및 조직의 HBV에 의한 침입을 지칭한다.
본 출원의 구현예에 따르면, 본 명세서에서 기술된 방법에 관하여 사용될 경우 “면역 반응을 유도”하는 것은 HBV 또는 HBV 감염에 대하여 이를 필요로 하는 대상체에서 요망하는 면역 반응 또는 효과를 야기하는 것을 포함한다. “면역 반응을 유도”하는 것은 또한 병원체, 즉 HBV에 대하여 치료를 위한 치료적 면역을 제공하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “치료적 면역” 또는 “치료적 면역 반응”은 HBV-감염된 백신접종된 대상체가 대항하여 백신접종된 병원체, 즉 HBV로의 감염을 제어할 수 있는 것을 의미한다. 일 구현예에서, “면역 반응을 유도”하는 것은 이를 필요로 하는 대상체에 면역을 생산하는 것, 예컨대 질환, 예컨대 HBV 감염에 대하여 치료적 효과를 제공하는 것을 의미한다. 본 출원의 일 구현예에서, “면역 반응을 유도”하는 것은 HBV에 대하여, 세포 면역성, 예컨대 T 세포 반응을 야기 또는 향상하는 것을 지칭한다. 본 출원의 일 구현예에서, “면역 반응을 유도”하는 것은 HBV에 대하여 체액 면역성을 야기 또는 향상하는 것을 지칭한다. 본 출원의 일 구현예에서, “면역 반응을 유도”하는 것은 HBV에 대하여 세포 및 체액 면역 반응을 야기 또는 향상하는 것을 지칭한다.
전형적으로, 본 출원의 구현예에 따른 조성물 및 면역원적 조합물을 투여하는 것은 HBV 감염 또는 HBV 감염의 특징적 증상의 전개 후에 HBV에 대한 면역 반응을 생성하는, 즉 치료적 백신접종을 위한, 치료적 목표를 가질 것이다.
본 명세서에서, “면역원적 유효량” 또는 “면역학적 유효량”은 이를 필요로 하는 대상체에서 요망되는 효과 또는 면역 반응을 충분히 유도하는 조성물, 폴리뉴클레오티드, 벡터 또는 항원의 양을 의미한다. 일 구현예에서, 면역학적 유효량은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 양을 의미한다. 다른 구현예에서, 면역학적 유효량은 이를 필요로 하는 대상체에서 면역을 생산, 예컨대 HBV 감염과 같은 질환에 대한 치료적 효과를 제공하기에 충분한 양을 의미한다. 면역학적 유효량은 다양한 요인, 예컨대 대상체의 신체 상태, 연령, 체중, 건강 등; 특정 적용, 예컨대 보호 면역 또는 치료적 면역을 제공하는지; 및 그에 대한 면역성이 요망되는 특정 질환, 예컨대 바이러스 감염에 따라 변할 수 있다. 면역학적 유효량은 본 개시의 관점에서 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 출원의 특정 구현예에서, 면역학적 유효량은 이하의 효과 중 1, 2, 3, 4 또는 그 이상을 달성하기에 충분한 조성물 또는 면역원적 조합물의 양을 지칭한다: (i) HBV 감염 또는 이와 연관된 증상의 중증도를 감소 또는 개선; (ii) HBV 감염 또는 이와 연관된 증상의 지속기간을 감소; (iii) HBV 감염 또는 이와 연관된 증상의 진행을 예방; (iv) HBV 감염 또는 이와 연관된 증상의 퇴행을 야기; (v) HBV 감염, 또는 이와 연관된 증상의 전개 또는 시작을 예방; (vi) HBV 감염 또는 이와 연관된 증상의 재발을 예방; (vii) HBV 감염을 갖는 대상체의 입원 감소; (viii) HBV 감염을 갖는 대상체의 입원 기간 감소; (ix) HBV 감염을 갖는 대상체의 생존을 증가; (x) 대상체 내의 HBV 감염을 제거; (xi) 대상체 내의 HBV 복제를 억제 또는 감소; 및/또는 (xii) 다른 요법의 예방적 또는 치료적 효과를 증진 또는 향상.
다른 구체적 구현예에서, 면역학적 유효량은 임상적 혈청 전환으로의 진전과 일관되는 HBsAg 수준을 감소; 대상체의 면역계에 의한 감염된 간세포의 감소와 연관된 일관된 HBsAg 제거를 달성; HBV-항원 특이적 활성 T-세포 개체군의 유도; 및/또는 12개월 이내에 HBsAg의 지속적 손실을 달성하기에 충분한 양이다. 표적 지표의 예는 500 카피의 HBsAg IU의 역치 미만의 보다 낮은 HBsAg 및/또는 보다 높은 CD8 수를 포함한다.
일반 지침으로서, 바이러스 벡터와 관련하여 사용될 경우 면역학적 유효량은 약 1 X 107 용량 당 바이러스 입자 내지 약 1 X 1012 용량 당 바이러스 입자의 범위일 수 있다. 면역학적 유효량은 약 1 X 1010, 약 2 X 1010, 약 3 X 1010, 약 4 X 1010, 약 5 X 1010, 약 6 X 1010, 약 7 X 1010, 약 8 X 1010, 약 9 X 1010, 약 1 X 1011, 약 2 X 1011, 약 3 X 1011, 약 4 X 1011, 약 5 X 1011, 또는 약 1 X 1012 용량 당 바이러스 입자일 수 있다. 면역학적 유효량은 하나의 벡터로부터 또는 복수의 벡터로부터일 수 있다. 면역학적 유효량은 단일 조성물에서 또는 복수의 조성물, 예컨대 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 조성물(예컨대, 타블렛, 캡슐 또는 주사제)로 투여될 수 있으며, 복수의 캡슐 또는 주사의 투여는 종합적으로 대상체에 면역학적 유효량으로 투여된다. 또한 소위 프라임-부스트 요법으로, 대상체에 면역학적 유효량을 투여하고, 후속적으로 동일 대상체에 하나 더(another)의 면역학적 유효량의 용량을 투여할 수 있다. 이 프라임-부스트 요법의 일반적 개념은 백신 분야의 당업자에 잘 알려져 있다. 추가적 부스터 투여는 필요한 경우 상기 요법에 선택적으로 추가될 수 있다.
본 출원의 구현예에 따르면, 두 개의 바이러스 벡터, 예컨대 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제1 바이러스 벡터 및 HBV pol 항원을 인코딩하는 제2 바이러스 벡터를 포함하는 면역원적 조합물은 둘 다의 바이러스 벡터를 혼합하고 혼합물을 단일 해부학적 부위에 전달하여 대상체에 투여될 수 있다. 대안적으로, 단일 발현 벡터를 각각 전달하는 두 별개의 면역화가 수행될 수 있다. 이러한 구현예에서, 둘 다의 바이러스 벡터가 단일 면역화로 투여되거나 두 별개의 면역화로 투여되거나, 제1 바이러스 벡터 및 제2 바이러스 벡터는 중량비로 10:1 내지 1:10의 비율로, 예컨대 중량비로 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 또는 1:10로 투여될 수 있다. 바람직하게, 상기 제1 및 제2 바이러스 벡터는 중량비로 1:1의 비율로 투여된다.
몇몇 구현예에서, 본 출원의 방법에 따라 치료되는 대상체는 HBV-감염된 대상체, 구체적으로 만성 HBV 감염을 갖는 대상체이다. 급성 HBV 감염은 적응 면역 반응(예컨대 HBV-특이적 T 세포, 중화 항체)에 의해 보완되는 선천 면역계의 효율적인 활성을 특징으로 하며, 이는 통상적으로 성공적인 복제 저해 또는 감염된 간세포의 제거를 초래한다. 반대로, 이러한 반응은 높은 바이러스 및 항원 로드(load)로 인해 손상 또는 약화되며, 예컨대, HBV 외피 단백질은 풍부하게 생산되며 감염성 바이러스의 1,000배 과량의 서브바이러스 입자로 방출될 수 있다.
만성 HBV 감염은 바이러스 로드, 간 효소 수준(괴사염증(necroinflammatory) 활성), HBeAg, 또는 HBsAg 로드 또는 이들 항원에 대한 항체의 존재를 특징으로 하는 시기(phase)들로 기술된다. 바이러스 혈증은 상당히 다양하지만, cccDNA 수준은 세포 당 대략 10 내지 50 카피로 비교적 일정하게 유지된다. cccDNA 종의 지속은 만성성에 이르게 한다. 보다 구체적으로, 만성 HBV 감염의 시기는: (i) 높은 바이러스 로드 및 정상 또는 최소 상승된 간 효소를 특징으로 하는 면역-내성 시기; (ii) 현저하게 상승되는 간 효소가 관찰되면서 바이러스 복제 수준이 보다 낮거나 감소하는 면역 활성 HBeAg-양성 시기; (iii) HBeAg 혈청전환에 뒤따를 수 있는 낮은 바이러스 로드 및 혈청 내 정상 간 효소 수준을 갖는 저 복제 상태 비활성 HBsAg 담체 시기; 및 (iv) 바이러스 복제가 간 효소 수준의 수반 변동(concomitant fluctuation)으로 주기적으로(재활성화) 일어나고, 프리-코어(pre-core) 및/또는 기저 코어(basal core) 프로모터의 돌연변이가 통상적이어서 HBeAg가 감염된 세포에 의해 생산되지 않는, HBeAg-음성 시기; 를 포함한다.
본 명세서에서, “만성 HBV 감염”은 6개월 이상 HBV 존재가 검출 가능한 대상체를 지칭한다. 만성 HBV 감염을 갖는 대상체는 만성 HBV 감염의 임의의 시기에 있을 수 있다. 바람직한 구현예에서, 본 명세서에서 지칭되는 만성 HBV 감염은 Centers for Disease Control and Prevention (CDC)에 의해 출간된 정의를 따르며, 이에 따르면 만성 HBV 감염은 이하의 실험실 기준을 특징으로 한다: (i) B형 간염 코어 항원(IgM anti-HBc)에 대한 IgM 항체에 음성 및 B형 간염 표면 항원(HBsAg), B형 간염 e 항원(HBeAg), 또는 Bgud 간염 바이러스 DNA를 위한 핵산 시험에 양성 또는 (ii) HBsAg 또는 HBV DNA를 위한 핵산 시험에 양성, 또는 HBeAg에 대해 적어도 6개월 간격으로 2회 양성.
특정 구현예에 따르면, 면역원적 유효량은 만성 HBV 감염을 치료하기에 충분한 조성물 또는 면역원적 조합물의 양을 지칭한다.
몇몇 구현예에서, 만성 HBV 감염을 갖는 대상체는 뉴클레오시드 유사체(NUC) 치료를 겪으며, NUC-저해 된다. 본 명세서에서, “NUC-저해된”은 적어도 6개월 간 검출불가능한 HBV 바이러스 수준 및 안정된 알라닌 아미노트랜스퍼라제(alanine aminotransferase, ALT) 수준을 갖는 대상체를 지칭한다. 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체 치료의 예는 HBV 폴리머라제 억제제, 예컨대 엔타카비르(entacavir) 및 테노포비르(tenofovir)를 포함한다. 바람직하게, 만성 HBV 감염을 갖는 대상체는 진행성 간 섬유증(fibrosis) 또는 간경변(cirrhosis)를 갖지 않는다. 이러한 대상체는 전형적으로 3 미만의 METAVIR 스코어 및 9 kPa 미만의 파이브로스캔(fibroscan) 결과를 가진다. METAVIR 스코어는 B형 간염을 가지는 환자의 간 생검에서 조직병리학적 평가에 의해 염증 및 섬유증의 정도를 평가하기 위해 통상적으로 사용되는 평점 시스템이다. 상기 평점 시스템은 2개의 표준화된 수치를 부여한다: 염증 정도를 나타내는 것 및 섬유증 정도를 나타내는 것.
만성 HBV의 제거 또는 감소는 바이러스-유도 간경변 및 간세포 암종(hepatocellular carcinoma)을 포함하는 중증 간 질환의 조기 질환 차단을 가능하게 한다. 따라서, 본 출원의 방법은 또한 HBV-유도 질환을 치료하는 요법으로서 사용될 수 있다. HBV-유도 질환의 예는, 비제한적으로, 간경변, 암(예컨대, 간세포 암종), 및 섬유증, 구체적으로 METAVIR 스코어 3 이상을 특징으로 하는 진행성 섬유증을 포함한다. 이러한 구현예에서, 면역원적 유효량은 12개월 이내 HBsAg의 지속적인 손실 및 임상 질환(예컨대, 간경변, 간세포 암종 등)의 현저한 감소를 달성하기에 충분한 양이다.
본 출원의 구현예에 따른 방법은 추가로 이를 필요로 하는 대상체에 면역원 제제(예컨대 다른 HBV 항원 또는 다른 항원) 또는 다른 항-HBV 제제(예컨대 뉴클레오시드 유사체 또는 다른 항-HBV 제제)를 본 출원의 조성물과 조합하여 투여하는 것을 포함할 수 있다.
전달 방법
본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물은 본 개시의 관점에서 기술분야에 알려진, 비제한적으로, 비경구 투여(예컨대, 근육내, 피하, 정맥내 또는 피내 주사, 경구 투여, 피부경유 투여, 및 비강 투여를 포함하는 임의의 방법,에 의해 대상체에 투여될 수 있다. 바람직하게, 조성물 및 면역원적 조합물은 비경구(예컨대, 근육내 주사 또는 피내 주사) 또는 피부 경유로 투여된다.
조성물 및 면역원적 조합물이 하나 이상의 바이러스 벡터를 포함하는 본 출원의 몇몇 구현예에서, 투여는 피부를 통한 주사, 예컨대, 근육내 또는 피내 주사, 바람직하게 근육내 주사에 의할 수 있다. 근육내 주사는 전기천공법(electroporation), 즉, DNA 플라스미드의 세포로의 전달을 용이하게 하기 위한 전기장의 적용과 조합될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 용어 “전기천공법(electroporation)”은 생체막의 미세 경로(포어)를 유도하기 위한 막통과 전기장 펄스의 사용을 지칭한다. 생체 내(in vivo) 전기천공법 중, 적절한 세기 및 지속시간의 전기장을 세포에 적용하고, 세포 막 투과성이 증진된 일시적 상태를 유도하고, 이에 따라 그 자체로는 세포 막을 통과하지 못하는 분자의 세포 흡수를 가능하게 한다. 전기천공법에 의한 이러한 포어의 형성은 생체분자, 예컨대 플라스미드, 올리고뉴클레오티드, siRNA, 약제 등의 세포 막 한쪽에서 다른 쪽으로의 통과를 용이하게 한다. DNA 백신의 전달을 위한 생체 내(in vivo) 전기천공법은 주사 부위에 경-중증도 염증을 초래하면서도 숙주 세포에 의한 현저하게 증가된 플라스미드 흡수를 나타낸다. 결과적으로, 종래의 주사와 비교하여 피내 또는 근육내 전기천공법으로 형질주입(transfection) 효율 및 면역 반응이 현저하게 향상되었다(예컨대, 각각 1,000 배 및 100 배까지).
전형적인 구현예에서, 전기천공법은 근육내 주사와 조합된다. 그러나, 전기천공법은 다른 형태의 비경규 투여, 예컨대, 피내 주사, 피하 주사 등과 조합될 수 있다.
전기천공법을 통한 본 출원의 조성물, 면역원적 조합물 또는 백신의 투여는 세포 막에 가역(reversible) 포어를 유발하기에 효과적인 에너지 펄스를 포유류의 요망되는 조직에 전달하도록 구성될 수 있는 전기천공 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 전기천공 장치는 전기천공 요소 및 전극 조립체 또는 핸들 조립체를 포함할 수 있다. 전기천공 요소는 전기천공 장치의 이하의 요소 중 하나 이상을 포함할 수 있다: 컨트롤러, 전류파형 발생기, 임피던스 테스터, 파형 로거, 입력 요소, 상태 보고 요소, 통신 포트, 메모리 구성요소, 전원 및 전원 스위치. 전기천공법은 생체 내 전기천공 장치를 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로 DNA 플라스미드를 포함하는, 본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물의 전달을 용이하게 할 수 있는 전기천공 장치 및 전기천공 방법의 예는 CELLECTRA®(Inovio Pharmaceuticals, Blue Bell, PA), Elgen electroporator (Inovio Pharmaceuticals, Inc.) Tri-GridTM delivery system (Ichor Medical Systems, Inc., San Diego, CA 92121) 및 미국특허 제7,664,545호, 미국특허 제8,209,006호, 미국특허 제9,452,285호, 미국특허 제5,273,525호, 미국특허 제6,110,161호, 미국특허 제6,261,281호, 미국특허 제6,958,060, 및 미국특허 제6,939,862호, 미국특허 제7,328,064호, 미국특허 제6,041,252호, 미국특허 제5,873,849호, 미국특허 제6,278,895호, 미국특허 제6,319,901호, 미국특허 제6,912,417호, 미국특허 제8,187,249호, 미국특허 제9,364,664호, 미국특허 제9,802,035호, 미국특허 제6,117,660, 및 국제특허출원공개공보 제WO2017172838호에 기술된 것을 포함하며, 이들 모두는 전체가 참조로서 본 명세서에 통합된다. 본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물의 전달을 위해 적용이 고려되는 것은 예를 들어, 예컨대 전체가 참조로서 본 명세서에 통합되는 미국특허 제6,697,669호에 기술된 바와 같은, 펄스전기장(pulsed electric field)의 사용이다.
조성물 또는 면역원적 조합물이 하나 이상의 DNA 플라스미드를 포함하는 본 출원의 다른 구현예에서, 투여 방법은 피부경유이다. 피부경유 투여는 DNA 플라스미드의 세포로의 전달을 용이하게 하기 위하여 표피 피부 마찰과 조합될 수 있다. 예를 들어, 피부 패치(dermatological patch)를 제거하고, 조성물 또는 면역원적 조합물이 마찰된 피부 상에 침착될 수 있다.
전달 방법은 상술한 구현예에 제한되지 않으며, 세포내 전달을 위한 임의의 수단을 사용할 수 있다. 본 출원의 방법에 의해 고려되는 다른 세포내 전달 방법은 비제한적으로 리포솜 캡슐화, 나노입자 등을 포함한다.
애주번트
본 출원의 몇몇 구현예에서, HBV에 대한 면역 반응을 유도하는 방법은 추가로 애주번트를 투여하는 것을 포함한다. 용어 “애주번트” 및 “면역 자극제”는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 면역계의 자극을 유발하는 하나 이상의 물질로 정의된다. 이 맥락에서, 애주번트는 본 출원의 HBV 항원 및 항원성 HBV 폴리펩티드에 대한 면역 반응을 증진하기 위해 사용된다.
본 출원의 구현예에 따르면, 애주번트는 본 출원의 면역원적 조합물 또는 조성물 내에 존재하거나, 별개 조성물로 투여될 수 있다. 애주번트는 예컨대 소분자 또는 항체일 수 있다. 본 출원에서 사용되기에 적합한 애주번트의 예는, 비한정적으로 면역 체크포인트 억제제(예컨대, 항-PD1, 항-RIM-3 등), 톨-유사 수용체 억제제, RIG-1 억제제, IL-15 수퍼아고니스트(Altor Bioscience), 돌연변이 IRF3 및 IRF7 유전적 애주번트, STING 아고니스트(Aduro), FLT3L 유전적 애주번트, IL-12 유전적 애주번트, 및 IL-7-hyFc를 포함한다.
본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물은 또한 하나 이상의 다른 항-HBV 제제와 조합하여 투여될 수 있다. 본 출원과 사용되기에 적합한 항-HBV 제제의 예는 비제한적으로 소분자, 항체, 및/또는 캡시드 억제제, TLR 억제제, cccDNA 억제제, HBV 폴리머라제 억제제(예컨대, 엔테카비르(entecavir) 및 테노포비르(tenofovir), 및/또는 면역 체크포인트 억제제 등으로서 기능하는 CAR-T 요법을 포함한다. 이러한 항-HBV 제제는 본 출원의 조성물 및 면역원적 조합물과 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.
프라임/부스트 면역화 방법
본 출원의 구현예는 또한 소위 프라임-부스트 요법으로, 대상체에 면역학적 유효량의 조성물 또는 면역원적 조합물을 투여하고, 그뒤에 동일 대상체에 하나 더의(another) 용량의 면역학적 유효량의 조성물 또는 면역원적 조합물을 투여하는 것을 고려한다. 따라서, 일 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물은 면역 반응을 프라임하기 위해 사용되는 프라이머 백신이다. 다른 구현예에서, 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물은 면역 반응을 부스트하기 위해 사용되는 부스터 백신이다. 본 출원의 구현예에 따른 프라이밍 및 부스팅 백신은 본 명세서에 기술되는 본 출원의 방법에서 사용될 수 있다. 이 프라임-부스트 요법의 일반적인 개념은 백신 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물 중 어느 것이나 HBV에 대한 면역 반응을 프라임 및/또는 부스트하기 위한 프라이밍 및/또는 부스팅 백신으로서 사용될 수 있다.
본 출원의 구현예에 따르면, 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물은 적어도 한번 면역화를 프라임하기 위해 투여될 수 있다. 조성물 또는 면역원적 조합물은 면역화를 부스트하기 위해 재-투여될 수 있다. 조성물 또는 백신 조합물의 추가적 부스터 투여는 필요에 따라 요법에 선택적으로 추가될 수 있다. 애주번트는 면역화를 부스트하기 위해 사용되는 본 출원의 조성물에 존재하거나, 면역화를 부스트하기 위한 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물과 함께 투여될 별개 조성물에 존재하거나, 또는 부스트 면역화로서 그 자체로 투여될 수 있다. 애주번트가 요법에 포함되는 이들 구현예에서, 애주번트는 바람직하게 부스트 면역화를 위해 사용된다.
프라임-부스트 요법의 예시적 및 비제한적 예는 면역 반응을 프라임하기 위해 대상체에 단일 용량의 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물의 면역학적 유효량을 투여하고; 그 후 하나 더(another)의 용량의 본 출원의 조성물 또는 면역원적 조합물의 면역학적 유효량을 투여하는 것을 포함하며, 상기 부스트 면역화는 프라임 면역화가 최초 투여되고 약 2주 내지 12주, 약 2주 내지 12주, 약 2주 내지 10주, 약 2주 내지 6주, 바람직하게 4주 후, 바람직하게 프라임 면역화가 최초 투여되고 약 8주 후에 1차 투여된다. 본 출원의 구현예에서, 상기 부스트 면역화는 프라임 면역화의 적어도 1주 후에 투여된다. 본 출원의 구현예에서, 상기 부스트 면역화는 프라임 면역화의 적어도 2주 후에 투여된다. 선택적으로, 프라임 면역화가 초기 투여된 후 약 10 내지 14주, 바람직하게 12주에, 조성물 또는 면역원적 조합물, 또는 다른 애주번트의 추가적 부스트 면역화가 투여된다.
키트
본 출원은 또한 본 출원의 면역원적 조합물을 포함하는 키트를 제공한다. 키트는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 별개의 조성물에 포함하거나, 키트는 제1 폴리뉴클레오티드 및 제2 폴리뉴클레오티드를 단일 조성물에 포함할 수 있다. 키트는 하나 이상의 애주번트 또는 면역 자극제, 및/또는 다른 항-HBV 제제를 추가로 포함할 수 있다.
동물 또는 인간 유기체에 투여에 따른 항-HBV 면역 반응을 유도 또는 자극하는 능력은 시험관내(in vitro) 또는 생체내(in vivo) 둘 다에서 기술 분야에 표준인 다양한 검정법을 사용하여 평가될 수 있다. 면역 반응의 개시 및 활성화를 평가할 수 있는 기술의 일반적인 기술은, 예를 들어 Coligan et al. (1992 and 1994, Current Protocols in Immunology; ed. J Wiley & Sons Inc, National Institute of Health)를 참조하라. 세포 면역의 측정은 CD4+ 및 CD8+ T-세포로부터 유래된 것을 포함하는 활성화된 이펙터 세포에 의해 분비되는 사이토카인 프로파일의 측정에 의해(예컨대, ELISPOT에 의한 IL-10 또는 IFN 감마-생산 세포의 정량화), 면역 이펙터 세포의 활성화 상태의 결정에 의해(예컨대, 고전적 [3H] 티미딘 흡수에 의한 T 세포 증식 검정), 감작화된 대상체의 항원-특이적 T 림프구에 대한 검정에 의해(예컨대, 세포독성 검정에서 펩티드-특이적 용해, 등) 수행될 수 있다.
세포 및/또는 체액 반응을 자극하는 방법은 항체 결합 및/또는 결합에서의 경합에 의해 결정될 수 있다(예컨대 Harlow, 1989, Antibodies, Cold Spring Harbor Press 참조). 예를 들어, 면역원을 제공하는 조성물의 투여에 대한 반응으로 생산된 항체의 역가는 효소-결합 면역흡착 검정(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)에 의해 측정될 수 있다. 면역 반응은 또한 중화 항체 검정에 의해 측정할 수 있으며, 바이러스의 중화는 특정 항체로의 바이러스의 반응/억제/중화를 통한 감염성 손실로 정의된다. 면역 반응은 추가적으로 항체-의존성 세포 식작용(Antibody-Dependent Cellular Phagocytosis, ADCP) 검정에 의해 측정될 수 있다.
구현예
본 출원은 또한 이하의 비제한적 구현예를 제공한다.
구현예 1은 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-천연 핵산 분자를 포함하는 변형된 백시니아 앙카라(Modified Vaccinia Ankara, MVA) 벡터이다.
구현예 2는 상기 HBV 폴리머라제 항원이 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 구현예 1의 MVA 벡터이다.
구현예 3은 상기 HBV 폴리머라제 항원은 포유류에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 포유류에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는, 구현예 1 또는 2의 MVA 벡터이다.
구현예 4는 상기 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 1-3 중 어느 하나의 MVA 벡터이다.
구현예 5는 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 구현예 1-4 중 어느 하나의 MVA 벡터이다.
구현예 6은 상기 신호 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 신호 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 5의 MVA 벡터이다.
구현예 7은 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 적어도 90% 동일한, 구현예 1-6 중 어느 하나의 MVA 벡터이다.
구현예 8은 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구현예 7의 MVA 벡터이다.
구현예 9는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된(truncated) HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 구현예 1-8 중 어느 하나의 MVA 벡터이다.
구현예 10은 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1과 적어도 90% 동일한, 구현예 9의 MVA 벡터이다.
구현예 11은 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구현예 10의 MVA 벡터이다.
구현예 12는 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 절두된 HBV 코어 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 구현예 9-11 중 어느 하나의 MVA 벡터이다.
구현예 13은 상기 신호 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 신호 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 12의 MVA 벡터이다.
구현예 14는 상기 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는, 구현예 9-13 중 어느 하나의 MVA 벡터이다.
구현예 15는 상기 융합 단백질이 링커를 통해 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는, 구현예 14의 MVA 벡터이다.
구현예 16은 상기 링커가 (AlaGly)n의 아미노산 서열을 포함하고, n은 2 내지 5의 정수이고, 바람직하게 상기 링커는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 15의 MVA 벡터이다.
구현예 17은 상기 융합 단백질이 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 16의 MVA 벡터이다.
구현예 18은 상기 융합 단백질이 신호 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게 상기 신호 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 보다 바람직하게 상기 신호 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 14-17 중 어느 하나의 MVA 벡터이다.
구현예 19는 추가적으로 적어도 하나의 프로모터 서열을 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 조절 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 적어도 하나의 프로모터 서열은 서열번호 25 및/또는 서열번호 26의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 그리고 상기 추가적인 조절 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 15의 인핸서 서열, 및 서열번호 9 또는 서열번호 16은 폴리아데닐화 신호 서열로 이루어진 군에서 선택되는, 구현예 1-18 중 어느 하나의 MVA 벡터이다.
구현예 20은 비천연 핵산 분자가 B형 간염 표면 항원(HBsAg), HBV 외피(Env) 항원, 및 HBV L 단백질 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 HBV 항원을 인코딩하지 않는, 구현예 1-19 중 어느 하나의 MVA 벡터이다.
구현예 21은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비천연 핵산 분자로서, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열을 추가로 인코딩하고, 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 26의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는, 제1 비천연 핵산 분자; 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제2 비천연 핵산 분자로서, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하는 신호 서열을 추가로 인코딩하고, 상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 25의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 프로모터 서열을 추가로 포함하는, 제2 비천연 핵산 분자;를 포함하는 MVA 벡터이다.
구현예 22는 구현예 1-21 중 어느 하나의 MVA 벡터 및 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물이다.
구현예 23은 인간 대상체 내에서 면역 반응을 증진하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-천연 핵산 분자를 포함하는 면역학적 유효량의 아데노바이러스 벡터 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 및 (b) 구현예 1-21 중 어느 하나의 MVA 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 를 포함하여 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역반응을 얻는, 방법이다.
구현예 24는 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원이 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 구현예 23의 방법이다.
구현예 25는 상기 제1 조성물은 면역 반응을 프라임하기 위한 것이고, 제2 조성물은 면역반응을 부스트하기 위한 것인, 구현예 23 또는 24의 방법이다.
구현예 26은 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 그리고 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는, 구현예 23-25 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 27은 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 23-26 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 28은 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 구현예 23-27 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 29는 상기 신호 서열이 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 신호 서열이 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 28의 방법이다.
구현예 30은 상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 19와 적어도 90% 동일한, 구현예 23-29 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 31은 상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구현예 30의 방법이다.
구현예 32는 제1 조성물 내의 아데노바이러스의 핵산 분자가 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 구현예 23-31 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 33는 상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 17과 적어도 90% 동일한, 구현예 32의 방법이다.
구현예 34는 상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구현예 33의 방법이다.
구현예 35는 상기 제1 조성물의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는, 구현예 32-34 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 36은 상기 제1 조성물의 융합 단백질은 링커를 통해 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는, 구현예 35의 방법이다.
구현예 37은 상기 제1 조성물의 링커는 (AlaGly)n의 아미노산 서열을 포함하고, n은 2 내지 5의 정수이고, 바람직하게 상기 링커는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 36의 방법이다.
구현예 38은 상기 제1 조성물의 융합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 37의 방법이다.
구현예 39는 상기 융합 단백질이 신호 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게 상기 신호 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 보다 바람직하게 상기 신호 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 35-38 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 40은 상기 제1 조성물의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열을 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 조절 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게 상기 프로모터 서열은 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 추가적인 조절 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 15, 및 서열번호 16의 폴리아데닐화 신호 서열로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 구현예 23-39 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 41은 상기 제1 조성물의 비천연 핵산 분자가 B형 간염 표면 항원(HBsAg), HBV 외피(Env) 항원, 및 HBV L 단백질 항원으로 이루어진 군에서 선택되는 HBV 항원을 인코딩하지 않는, 구현예 23-40 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 42는 상기 증진된 면역 반응이 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 항체 반응을 포함하는, 구현예 23-41 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 43은 상기 증진된 면역 반응이 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD8+ T 세포 반응을 포함하는, 구현예 42의 방법이다.
구현예 44는 상기 증진된 면역 반응이 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD4+ T 세포 반응을 포함하는, 구현예 42 또는 43의 방법이다.
구현예 45는 상기 아데노바이러스 벡터는 rAd26 또는 rAd35 벡터인, 구현예 23-44 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 46은 단계 (b)는 단계 (a) 후 1-12주에 수행되는, 구현예 23-45 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 47은 단계 (b)는 단계 (a) 후 2-12주에 수행되는, 구현예 23-45 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 48은 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 1주에 수행되는, 구현예 23-45 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 49는 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 2주에 수행되는, 구현예 23-45 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 50은 백신 조합물로서, (a) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역학적 유효량의 아데노바이러스 벡터를 포함하는, 제1 조성물; 및 (b) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역학적 유효량의 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 벡터를 포함하는 제2 조성물; 을 포함하되, 상기 제1 조성물은 면역 반응을 프라임하기 위해 인간 대상체에 투여되고, 제2 조성물은 면역 반응을 부스팅하기 위해 인간 대상체에 1회 이상 투여되는 백신 조합물이다.
구현예 51은 상기 HBV 폴리머라제 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 구현예 50의 백신 조합물이다.
구현예 52는 상기 제1 및 제2 조성물은 HBV 폴리머라제 항원은 포유류에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 포유류에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는, 구현예 50 또는 51의 백신 조합물이다.
구현예 53은 상기 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 50-52 중 어느 하나의 백신 조합물이다.
구현예 54는 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 구현예 50-53 중 어느 하나의 백신 조합물이다.
구현예 55는 상기 신호 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 신호 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 54의 백신 조합물이다.
구현예 56은 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 적어도 90% 동일한, 구현예 50-55 중 어느 하나의 백신 조합물이다.
구현예 57은 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구현예 56의 백신 조합물이다.
구현예 58은 상기 제1 조성물의 아데노바이러스 벡터가 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고 상기 제2 조성물의 MVA 벡터가 제4 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는, 구현예 50-57 중 어느 하나의 백신 조합물이다.
구현예 59는 상기 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1과 적어도 90% 동일한, 구현예 58의 백신 조합물이다.
구현예 60은 상기 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구현예 59의 백신 조합물이다.
구현예 61은 백신 조합물로서, (a) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역학적 유효량의 변형된 백시니아 앙카라(MVA) 벡터를 포함하는, 제1 조성물; 및 (b) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역학적 유효량의 아데노바이러스 벡터를 포함하는 제2 조성물; 을 포함하되, 상기 제1 조성물은 면역 반응을 프라임하기 위해 인간 대상체에 투여되고, 제2 조성물은 면역 반응을 부스팅하기 위해 인간 대상체에 1회 이상 투여되는 백신 조합물이다.
구현예 62는 상기 HBV 폴리머라제 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 구현예 61의 백신 조합물이다.
구현예 63은 상기 제1 및 제2 조성물은 HBV 폴리머라제 항원은 포유류에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 포유류에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는, 구현예 61 또는 62의 백신 조합물이다.
구현예 64는 상기 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 61-63 중 어느 하나의 백신 조합물이다.
구현예 65는 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 구현예 61-64 중 어느 하나의 백신 조합물이다.
구현예 66은 상기 신호 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 신호 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 65의 백신 조합물이다.
구현예 67은 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 적어도 90% 동일한, 구현예 61-66 중 어느 하나의 백신 조합물이다.
구현예 68은 상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구현예 67의 백신 조합물이다.
구현예 69는 상기 제1 조성물의 MVA 벡터가 제3 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고 상기 제2 조성물의 아데노바이러스 벡터가 제4 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하고, 상기 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는, 구현예 61-68 중 어느 하나의 백신 조합물이다.
구현예 70은 상기 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1과 적어도 90% 동일한, 구현예 69의 백신 조합물이다.
구현예 71은 상기 제3 및 제4 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구현예 70의 백신 조합물이다.
구현예 72는 키트인, 구현예 50-71 중 어느 하나의 구현예의 백신 조합물이다.
구현예 73은 인간 대상체 내에서 면역 반응을 증진하는 방법으로, 상기 방법은 (a) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자를 포함하는 면역학적 유효량의 제1 플라스미드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 비천연 핵산분자를 포함하는 제2 플라스미드를 포함하는 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 및 (b) 구현예 1-21 중 어느 하나의 MVA 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 를 포함하여 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역반응을 얻는, 방법이다.
구현예 74는 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원이 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 구현예 73의 방법이다.
구현예 75는 상기 제1 조성물은 면역 반응을 프라임하기 위한 것이고, 제2 조성물은 면역반응을 부스트하기 위한 것인, 구현예 73 또는 74의 방법이다.
구현예 76은 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 그리고 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는, 구현예 73-75 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 77은 상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 73-76 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 78은 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 구현예 73-77 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 79는 상기 신호 서열이 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 신호 서열이 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 78의 방법이다.
구현예 80은 상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20과 적어도 90% 동일한, 구현예 73-79 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 81은 상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구현예 80의 방법이다.
구현예 82는 상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 18과 적어도 90% 동일한, 구현예 73-81 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 83은 상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 18을 포함하는, 구현예 82의 방법이다.
구현예 84는 상기 제1 조성물의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열을 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 조절 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게 상기 프로모터 서열은 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 추가적인 조절 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 15, 및 서열번호 16의 폴리아데닐화 신호 서열로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 구현예 73-83 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 85는 상기 증진된 면역 반응이 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 항체 반응을 포함하는, 구현예 73-84 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 86은 상기 증진된 면역 반응이 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD8+ T 세포 반응을 포함하는, 구현예 85의 방법이다.
구현예 87은 상기 증진된 면역 반응이 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD4+ T 세포 반응을 포함하는, 구현예 85 또는 86의 방법이다.
구현예 88은 단계 (b)는 단계 (a) 후 1-12주에 수행되는, 구현예 73-87 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 89는 단계 (b)는 단계 (a) 후 2-12주에 수행되는, 구현예 73-87 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 90은 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 1주에 수행되는, 구현예 73-87 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 91은 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 2주에 수행되는, 구현예 73-87 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 92는 인간 대상체 내에서 면역 반응을 증진하는 방법으로서, 상기 방법은 (a) 구현예 1-21 중 어느 하나의 MVA 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 및 (b) 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자를 포함하는 면역학적 유효량의 제1 플라스미드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 비천연 핵산분자를 포함하는 제2 플라스미드를 포함하는 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 를 포함하여 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역반응을 얻는, 방법이다.
구현예 93은 상기 제2 조성물의 HBV 폴리머라제 항원이 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 구현예 92의 방법이다.
구현예 94는 상기 제1 조성물은 면역 반응을 프라임하기 위한 것이고, 제2 조성물은 면역반응을 부스트하기 위한 것인, 구현예 23 또는 24의 방법이다.
구현예 95는 상기 제2 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 그리고 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는, 구현예 23-25 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 96은 상기 제2 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 구현예 92-95 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 97은 상기 제2 조성물의 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 구현예 92-96 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 98은 상기 신호 서열이 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 신호 서열이 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 구현예 98의 방법이다.
구현예 99는 상기 제2 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20과 적어도 90% 동일한, 구현예 92-98 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 100은 상기 제2 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 구현예 99의 방법이다.
구현예 101은 상기 제2 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 18과 적어도 90% 동일한, 구현예 92-100 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 102는 상기 제2 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 18을 포함하는, 구현예 101의 방법이다.
구현예 103은 상기 제2 조성물의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열을 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 조절 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게 상기 프로모터 서열은 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 추가적인 조절 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 15, 및 서열번호 16의 폴리아데닐화 신호 서열로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 구현예 92-102 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 104는 상기 증진된 면역 반응이 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 항체 반응을 포함하는, 구현예 92-103 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 105은 상기 증진된 면역 반응이 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD8+ T 세포 반응을 포함하는, 구현예 104의 방법이다.
구현예 106은 상기 증진된 면역 반응이 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD4+ T 세포 반응을 포함하는, 구현예 104 또는 105의 방법이다.
구현예 107은 단계 (b)는 단계 (a) 후 1-12주에 수행되는, 구현예 92-106 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 108은 단계 (b)는 단계 (a) 후 2-12주에 수행되는, 구현예 92-106 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 109는 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 1주에 수행되는, 구현예 92-106 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 110은 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 2주에 수행되는, 구현예 92-106 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 111은 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 4주에 수행되는, 구현예 92-106 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 112는 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 8주에 수행되는, 구현예 92-106 중 어느 하나의 방법이다.
구현예 113은 단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 12주에 수행되는, 구현예 92-106 중 어느 하나의 방법이다.
실시예
본 출원의 이하의 실시예들은 본 출원의 성질을 추가적으로 예시하기 위한 것이다. 이하의 실시예들은 본 발명을 제한하지 않으며 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의하여 결정되는 것으로 이해되어야 할 것이다.
실시예 1: HBV 코어 및 Pol 항원 서열의 생성
간염 코어 단백질 상의 T-세포 에피토프는 B형 간염 감염의 제거를 위해 중요하게 고려되며 B형 간염 바이러스 단백질, 예컨대 폴리머라제는 반응의 폭을 향상시키는 데에 기여할 수 있다. 따라서 B형 간염 코어 및 폴리머라제 단백질은 치료적 B형 바이러스(HBV) 백신의 설계를 위한 항원으로서 선택되었다.
HBV 코어 및 폴리머라제 항원 컨센서스 서열의 도출
HBV pol 및 코어 항원 컨센서스 서열은 HBV 유전자형 B, C 및 D를 기반으로 생성되었다. 상이한 HBV 서열이 상이한 공급원으로부터 얻어졌으며 코어 및 폴리머라제 단백질을 위해 개별적으로 정렬되었다. 모든 서브타입(A 내지 H)의 원본 서열 정렬은 그 후 HBV 유전자형 B, C, 및 D로 한정되었다. 컨센서스 서열은 각 서브타입에서 개별적으로 그리고 모든 공동 BCD 서열에서 각 단백질 정렬에 대하여 정의되었다. 가변 정렬 위치에서, 가장 빈번한 아미노산이 컨센서스 서열에 사용되었다.
HBV 코어 항원의 최적화
HBV 코어 항원 컨센서스 서열은 천연형 바이러스 단백질에 포함된 2개의 결실을 만드는 것에 의하여 최적화되었다. 문헌에서의 보고가 바이러스가 이 서열을 감염된 개인에서 바이러스 단백질에 대한 내성을 유도하기 위해 사용한다고 지시하였기 때문에, 제1 결실은 프리-코어 “아연-핑거” 부위를 구성하는 코어 단백질의 N-말단 연장부의 결실이었다. 제2 결실은 C-말단 고도로 양전하를 띄는 세그먼트에 상응하는 34 아미노산의 결실이었으며, 이는 바이러스 생명주기에서 프리 게놈(pre-genome) 캡시드화 및 생산적 바이러스 양성 가닥 DNA 합성을 위해 요구된다.
HBV Pol 항원의 최적화
HBV pol 항원 컨센서스 서열은 4개 잔기를 변경하여 역전사효소 및 RNAseH 효소 활성을 제거하는 것에 의해 최적화되었다. 구체적으로, 역전사효소 도메인의 “YXDD” 모티프의 아스파테이트 잔기(D)를 아스파라긴 잔기(N)로 교체하여 임의의 배위 기능, 그리고 따라서 뉴클레오티드/금속 이온 결합을 제거하였다. 추가적으로, RNAseH 도메인의 “DEDD” 모티프제1 아스파테이트 잔기(D)는 아스파라긴 잔기(N)으로 교체하고 제1 글루타메이트 잔기(E)를 글루타민 잔기(A)로 교체하여 Mg2+ 배위를 제거하였다. 추가적으로, HBV pol 항원의 서열은 S 단백질 및 N-말단 연장부를 갖는 S 단백질 버전 pre-S1 및 pre-S2을 포함하는 외피 단백질을 위한 내부 오픈 리딩 프레임을 스크램블하기에 최적화된 코돈이었다. 결과적으로 외피 단백질(pre-S1, pre-S2, 및 S 단백질) 및 X 단백질의 오픈 리딩 프레임이 제거되었다.
효율적 단백질 분비를 위한 신호 펩티드의 선택
HBV 코어 항원의 N-말단의 프레임에 도입된 3개의 상이한 신호 펩티드가 평가되었다: (1) Ig 중쇄 감마 신호 펩티드 SPIgG (BAA75024.1); (2) Ig 중쇄 엡실론 신호 펩티드 SPIgE (AAB59424.1); 및 (3) 시스타틴 S 전구체 신호 펩티드 SPCS (NP_0018901.1). 신호 펩티드 절단 부위는 신호 P 예측 프로그램을 사용하여 인 실리코(in silico)로 코어 융합을 위해 최적화되었다. 분비 효율은 상청액 내의 코어 단백질 수준을 분석하여 결정되었다. N-터미널에서 융합된 3개의 상이한 신호 펩티드를 사용한 코어 단백질 분비의 웨스턴 블롯 분석은 시스타틴 S 신호 펩티드가 가장 효율적인 단백질 분비를 초래하였음을 입증했다.
실시예 2: 절두된 HBV 코어 항원의 HBV Pol 항원과의 융합을 발현하는 아데노바이러스 벡터의 생성
아데노바이러스 벡터는 절두된 HBV 코어 항원 및 HBV pol 항원의 융합 단백질을 단일 오픈 리딩 프레임으로부터 발현하기 위해 형성되었다. 예컨대 두개의 별개의 발현 카세트를 사용하는, 또는 2개 서열을 분리하기 위한 2A-유사 서열을 사용하는, 2개 단백질(예컨대, 절두된 HBV 코어 항원 및 HBV pol 항원)의 발현을 위한 추가적인 구성 역시 상정될 수 있다.
아데노바이러스 벡터를 위한 발현 카세트의 설계
발현 카세트(도 2a 및 도 2b에 도시됨)는 CMV 프로모터(서열번호 7), 인트론(서열번호 15)(ApoAI 제2 인트론을 함유하는 인간 ApoAI 유전자 - GenBank accession X01038 염기쌍 295 - 523, 유래의 단편), 뒤이어 인간 면역글로불린 분비 신호 코딩 서열(서열번호 10)을 앞세운 최적화된 코딩 서열 - 코어 단독 또는 코어 및 폴리머라제 융합 단백질, 및 뒤이어 SV40 폴리아데닐화 신호(서열번호 16)을 포함한다.
유발된 T-세포 반응에 영향 없이 분비된 전이유전자를 함유하는 몇몇 아데노바이러스 벡터의 제조능력 향상을 보이는 과거 경험 때문에 분비 신호가 포함되었다(마우스 실험).
코어 단백질의 마지막 2 잔기(VV) 및 폴리머라제 단백질의 최초 2 잔기(MP)가 융합된 경우 플랭킹 상동성과 함께 인간 도파민 수용체 단백질(D3 이소폼) 상에 존재하는 접합부 서열(VVMP)을 초래한다.
코어 및 폴리머라제 서열 사이의 AGAG 링커의 개입은 이 상동성을 제거하며 인간 프로테옴 Blast에서 더 이상의 히트(hit)를 내지 않았다.
실시예 3: HBV 코어 항원 및 HBV Pol 항원을 발현하는 MVA 벡터의 생성
MVA 벡터는 본 출원의 각각의 HBV 코어 및 Pol 코딩 서열을 인코딩하도록 설계되었다. 각각의 HBV 코어 및 Pol 코딩 서열은 각각 별개의 프로모터의 조절 하에 MVA 벡터의 IGR44/45 내로 삽입되었다. 예컨대 코어 및 Pol 항원이 융합 단백질을 포함하는 단일 발현 카세트, 또는 대안적으로 두 서열을 분리하기 위해 2A-유사 서열을 사용하는, 두 단백질을 발현하기 위한 추가적인 구성 역시 상정될 수 있다. 또한 MVA 벡터 내의 추가적 및/또는 대안적 삽입 부위 역시 상정될 수 있으며, 예컨대 HBV 코어 및 Pol 코딩 서열 각각을 동일 또는 상이한 삽입 부위 내로 삽입할 수 있다.
MVA 벡터를 위한 발현 카세트의 설계
발현 카세트(도 2c에 도시함)은 인접하고 HBV 코어 항원의 발현을 지시하는 Pr13.5 긴(long) 프로모터(서열번호 25) 및 인접하고 HBV Pol 항원의 발현을 지시하는 PrHyb 프로모터(서열번호 26)로 구성된다. HBV 코어 코딩 서열은 서열번호 1을 포함하고 및 HBV Pol 코딩 서열은 서열번호 3을 포함한다. 서열번호 1 및 3 각각은 시스-작용 부위를 제거하고 GC 양을 조정하여 변경되었다. 또한 서열번호 1 및 3 각각은 아미노산 서열에 영향 없이 인간 코돈 용도를 위해 코돈 최적화되었다. 서열번호 1 및 3 각각은 정지 코돈과 인접하여 배열된 추가적인 초기 종결 신호(TTTTTNT (서열번호 28)을 포함한다.
실시예 3: 마우스에서 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA 벡터 조합의 면역원성
재료 및 방법
벡터 설계: 코어 단독(서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 HBV 코어 항원), 또는 단일 오픈 리딩 프레임으로부터 발현되는 융합 단백질로서 코어에 더하여 폴리머라제(서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 HBV pol 항원)를 발현하는 2 개의 아데노바이러스 벡터가 사용되었다. 이를 위해, 서열은 인 실리코(in silico)로 설계되어 B형 간염 바이러스의 B, C 및 D 유전자형을 위한 컨센서스를 제공하였다. 발현 카세트는 CMV 프로모터, ApoAI 인트론, 인간 면역글로불린 분비 신호, 뒤이어 코딩 서열 - 코어 단독 또는 코어와 폴리머라제 융합 단백질 및 SV 폴리아데닐화 신호을 포함한다.
재조합 MVA 벡터는 코어 코딩 서열(서열번호 1의 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호 2의 폴리뉴클레오티드 서열)에 연결된 폭스바이러스 프로모터 Pr13.5(서열번호 25) 및 폴리머라제를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 3의 뉴클레오티드 서열, 및 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열)에 연결된 PrHyb(서열번호 26), 둘 다 뒤이어 전사 종결 서열 TTTTTNT(서열번호 28)으로 이루어진다. 코어 코딩 서열은 N-말단 면역글로불린 분비 태그(서열번호 11)을 포함하고, 및 폴리머라제 코딩서열은 N-말단 시스타틴 S 신호 서열(서열번호 6)을 포함한다. 도 2c 참조.
마우스에서의 생체내(In vivo) 면역원성 연구: HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA의 조합의 생체 내 면역원성을 평가하기 위하여 F1 마우스(C57BL/6 x Balb/C)는 상이한 벡터 조합으로 근육내로 프라임-부스트 면역화되었다. 이들 면역원성 연구는 HBV 항원 코어 및 폴리머라제에 의해 유발된 세포 면역 반응을 판별하는 것에 초점을 맞췄다.
항원 특이적 반응은 IFN-γ 효소-결합 면역점(ELISPOT)에 의해 분석되고 정량화되었으며 세포내 사이토카인 생산(TNF-알파, IL-2 및 IFN-γ)은 유세포 분석에 의해 검출되었다. 이들 검정에서, 면역화된 동물의 단리된 비장세포은 코어 단백질, Pol 단백질, 또는 작은 펩티드 리더 및 접합부 서열(각 펩티드 2μg/ml)을 포함하는 펩티드 풀(pool)과 함께 배양되었다. 추가적으로 MVA 특이적 펩티드(2μg/ml)가 사용되었다. 상기 풀은 코어 및 Pol 아데노바이러스 벡터의 유전자형 ABCD 컨센서스 서열에 매칭하는 11 잔기에 의해 중첩되는 15-머 펩티드로 이루어진다. 큰 94 kDa HBV Pol 단백질은 중간이 나뉘어 2 펩티드 풀이 된다. ELISPOT에서, 단일 항원 특이적 T-세포에 의한 IFN-γ 방출은 적절한 항체 및 연이은 발색 검출에 의해 반점-형성 세포(spot-forming cell, SFC)라 지칭되는 마이크로플레이트 상의 착색된 점으로서 시각화되었다. ICS에서, 특정 개체군(CD3-양성, CD4-양성 또는 CD8-양성 세포)에서의 사이토카인 방출 세포의 퍼센트가 판별되었다.
결과
마우스에서의 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA 조합의 면역원성 평가: 본 연구의 목적은 F1 마우스 내로의 IM 전달 후 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA의 조합에 의해 유도되는 면역 반응을 평가하는 것이다. F1 마우스에 대한 투여는 표 1에 요약된 바에 따라 수행되었다. 하나의 HBV 아데노바이러스 벡터 면역화를 수용한 동물은 뒤이어 HBV MVA 면역화를 8주 후에 수용하였다. 비장세포는 마지막 면역화 1주 후에 수집되었다.
표 1: 마우스 면역화 실험 설계
그룹 N 프라임
0일		 R 용량
(vp)		 부스트
56일차		 경로 용량
TCID50		 종점
일
1 4 Core Pol 융합 + Core IM 108 - - - 63
2 4 Core Pol 융합 + Core IM 109 - - - 63
3 4 Core Pol 융합 + Core IM 1010 - - - 63
4 4 Core Pol 융합 + Core IM 108 MVA IM 8.9 x 107 63
5 4 Core Pol 융합 + Core IM 109 MVA IM 8.9 x 107 63
6 4 Core Pol 융합 + Core IM 1010 MVA IM 8.9 x 107 63
7 4 Core Pol 융합 IM 108 - - - 63
8 4 Core Pol 융합 IM 109 - - - 63
9 4 Core Pol 융합 IM 1010 - - - 63
10 4 Core Pol 융합 IM 108 MVA IM 8.9 x 107 63
11 4 Core Pol 융합 IM 109 MVA IM 8.9 x 107 63
12 4 Core Pol 융합 IM 1010 MVA IM 8.9 x 107 63
13 4 빈 벡터 IM 1010 EV IM - 63
IM: 근육내; vp: 바이러스 입자, TCID50: 50% 조직 배양 감염 용량; MVA: 변형된 백시니아 앙카라
HBV 아데노바이러스 단독 및 HBV MVA 벡터와의 조합은, 마우스에서 Pol 특이적 T 세포 반응을 유발했다. 낮은 수준의 코어 반응은 코어 pol 융합 + 코어 아데노바이러스 벡터에 의해 유도되었으며 이들 반응은 HBV MVA 벡터로의 부스트에 의해 증폭되었다. 코어 pol 융합 아데노벡터 및 HBV MVA 벡터의 조합 또한 코어 반응을 유도하였다(도 3).
Pol 반응은 주로 CD8(+) T 세포에 의해 매개되는 한편, 코어 반응은 주로 CD4(+) T 세포를 수반한다(도 4 및 도 5). 코어 pol 융합 + 코어 아데노벡터와 HBV MVA의 조합 역시 CD8(+) T 세포 구동 코어 반응을 유도하였다(도 4).
결론: HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA 벡터의 조합은 F1 마우스에서 코어 및 pol에 대한 T 세포 반응을 유발한다.
실시예 5: 비-인간 영장류(non-human primates, NHPs)에서의 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA 벡터 조합의 면역원성
NHPs에서의 생체 내( in vivo ) 면역원성 연구: HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA 벡터 조합의 생체 내(in vivo) 면역원성을 평가하기 위하여, 모리셔스 시노몰구스(Mauritian cynomolgus) 원숭이는 상이한 벡터 조합으로 근육내로 프라임-부스트-부스트 면역화되었다. 이들 면역원성 연구는 HBV 코어 및 폴리머라제 항원에 의해 유발되는 세포 면역 반응을 판별하는데에 초점을 맞췄다.
항원 특이적 반응은 IFN-γ 효소-결합 면역점(ELISPOT)에 의해 분석되고 정량화되었으며 세포내 사이토카인 생산(TNF-알파, IL-2 및 IFN-γ)은 유세포 분석에 의해 검출되었다. 이들 검정에서, 면역화된 동물의 PBMC는 코어 단백질 또는 Pol 단백질(각 펩티드 2μg/ml)을 포함하는 펩티드 풀(pool)과 함께 배양되었다. 추가적으로 MVA 특이적 펩티드(2μg/ml)가 사용되었다. 상기 풀은 코어 및 Pol 아데노바이러스 벡터의 유전자형 ABCD 컨센서스 서열에 매칭하는 11 잔기에 의해 중첩되는 15-머 펩티드로 이루어진다. 큰 94 kDa HBV Pol 단백질은 중간이 나뉘어 2 펩티드 풀이 된다. ELISPOT에서, 단일 항원 특이적 T-세포에 의한 IFN-γ 방출은 적절한 항체 및 연이은 발색 검출에 의해 반점-형성 세포(spot-forming cell, SFC)라 지칭되는 마이크로플레이트 상의 착색된 점으로서 시각화되었다. 세포내 사이토카인 염색(intracellular cytokine staining, ICS)에서, 특정 개체군(CD3-양성, CD4-양성 또는 CD8-양성 세포)에서의 사이토카인 방출 세포의 퍼센트가 판별되었다.
결과
NHPs에서의 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA 조합의 면역원성 평가: 본 연구의 목적은 모리셔스 시노몰구스 원숭이 내로의 IM 전달 후 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA의 조합에 의해 유도되는 면역 반응을 평가하는 것이다. NHPs에 대한 투여는 표 2에 요약된 바에 따라 수행되었다. 하나의 HBV 아데노바이러스 벡터 면역화를 수용한 동물은 뒤이어 HBV MVA 면역화를 8주 후에 수용하였고 8주 후에 다시 뒤이어 HBV 아데노바이러스 벡터 면역화를 수용하였다. PBMC는 각각의 면역화 2주 후에 수집되었다.
표 2: NHP 면역화 실험 설계
그룹 N 프라임
0일		 R 벡터 당 용량
(vp)		 부스트
56일차		 R 용량
TCID50		 부스트
112일차		 용량
(vp)		 R
1 8 Core Pol 융합 IM 5*1010 MVA IM 5*108 Core Pol 융합 1*1011 IM
2 8 Core Pol 융합
+ Core		 IM 5*1010 MVA IM 5*108 Core Pol 융합 1*1011 IM
IM: 근육내; vp: 바이러스 입자, TCID50: 50% 조직 배양 감염 용량; MVA: 변형된 백시니아 앙카라
코어 pol 융합 아데노바이러스 벡터 단독 및 코어 pol 융합 + 코어 아데노바이러스 벡터와 HBV MVA 벡터의 조합은 NHPs 내에서 강력한 Pol 코어 T 세포 반응을 유발하였다. 또한 코어 pol 융합 아데노바이러스 벡터로의 부스트는 반응을 추가적으로 증가시키지 않았다(도 6).
NHPs에서의 코어 및 Pol 반응은 CD4(+) 및 CD8(+) T 세포 둘 다에 의해 매개된다. 코어 pol 융합 아데노벡터 + 코어 아데노벡터(프라임으로서 사용)와 HBV MVA(부스트로서 사용)의 조합은 가장 높은 CD4(+) 코어 특이적 및 CD8(+) Pol 특이적 T 세포 IFN-γ 반응을 유도하였다(도 7).
이들 결과는 HBV 아데노바이러스 벡터 및 HBV MVA 벡터의 조합이 NHPs에서 코어 및 pol 항원에 대한 강력한 T 세포 반응을 유발함을 입증한다.
기술분야의 숙련자에게 전반적인 발명적 개념에서 벗어나지 않는 한 상술된 구현예들에 변화가 이루어질 수 있음이 인식될 것이다. 따라서, 본 발명은 개시된 구체적 구현예에 제한되지 않으며, 본 기술에 규정된 바에 따른 본 발명의 정신 및 범위 내에서의 변형을 포함하는 것으로 의도된 것으로 이해된다.
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945 950 955 960 Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly 965 970 975 Leu Tyr Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg 980 985 990 Thr Ser Leu Tyr Ala Asp Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp 995 1000 1005 Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Arg Pro Pro 1010 1015 1020 <210> 14 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Linker coding sequence <400> 14 gccggagctg gc 12 <210> 15 <211> 248 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ApoA1 gene fragment <400> 15 ttggccgtgc tcttcctgac gggtaggtgt cccctaacct agggagccaa ccatcggggg 60 gccttctccc taaatccccg tggcccaccc tcctgggcag aggcagcagg tttctcactg 120 gccccctctc ccccacctcc aagcttggcc tttcggctca gatctcagcc cacagctggc 180 ctgatctggg tctcccctcc caccctcagg gagccaggct cggcatttcg tcgacaagct 240 tagccacc 248 <210> 16 <211> 130 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SV40 polyadenylation signal <400> 16 aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca 60 aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct 120 tatcatgtct 130 <210> 17 <211> 447 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV core <400> 17 atggacatcg acccttacaa ggagttcggc gccagcgtgg aactgctgtc ttttctgccc 60 agtgatttct ttccttccat tcgagacctg ctggataccg cctctgctct gtatcgggaa 120 gccctggaga gcccagaaca ctgctcccca caccataccg ctctgcgaca ggcaatcctg 180 tgctgggggg agctgatgaa cctggccaca tgggtgggat ccaatctgga ggaccccgct 240 tcacgggaac tggtggtcag ctacgtgaac gtcaatatgg gcctgaaaat ccgccagctg 300 ctgtggttcc atattagctg cctgactttt ggacgagaga ccgtgctgga atacctggtg 360 tccttcggcg tctggatccg cactccccct gcttatcgac cacccaacgc accaattctg 420 tccaccctgc ccgagaccac agtggtc 447 <210> 18 <211> 447 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV core <400> 18 atggacatcg acccttacaa ggagttcggc gccagcgtgg aactgctgtc ttttctgccc 60 agtgatttct ttccttccat tcgagacctg ctggataccg cctctgctct gtatcgggaa 120 gccctggaga gcccagaaca ctgctcccca caccataccg ctctgcgaca ggcaatcctg 180 tgctgggggg agctgatgaa cctggccaca tgggtgggat cgaatctgga ggaccccgct 240 tcacgggaac tggtggtcag ctacgtgaac gtcaatatgg gcctgaaaat ccgccagctg 300 ctgtggttcc atattagctg cctgactttt ggacgagaga ccgtgctgga atacctggtg 360 tccttcggcg tctggattcg cactccccct gcttatcgac cacccaacgc accaattctg 420 tccaccctgc ccgagaccac agtggtc 447 <210> 19 <211> 2529 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV pol <400> 19 atgcccctgt cttaccagca ctttagaaag ctgctgctgc tggacgatga agccgggcct 60 ctggaggaag agctgccaag gctggcagac gaggggctga accggagagt ggccgaagat 120 ctgaatctgg gaaacctgaa cgtgagcatc ccttggactc ataaagtcgg caacttcacc 180 gggctgtaca gctccacagt gcctgtcttc aatccagagt ggcagacacc atcctttccc 240 aacattcacc tgcaggagga catcattaat agatgcgaac agttcgtggg acctctgaca 300 gtcaacgaaa agaggcgcct gaaactgatc atgcctgcca ggttttaccc aaatgtgact 360 aagtatctgc cactggataa gggcatcaag ccttactatc cagagcacct ggtgaaccat 420 tacttccaga ctagacacta tctgcatacc ctgtggaagg ccggaatcct gtacaaacga 480 gaaactaccc ggagtgcttc attttgtggc tccccatatt cttgggaaca ggagctgcag 540 catggcaggc tggtgttcca gaccagcaca cgccacgggg atgagtcctt ttgccagcag 600 tctagtggca tcctgagcag atcccccgtg gggccttgtc tgcagtctca gctgcggaag 660 agtagactgg gactgcagcc acagcaggga cacctggcac gacggcagca gggaaggtct 720 ggcagtatcc gggctagagt gcatcccaca actagaaggc ctttcggcgt cgagccatca 780 ggaagcggcc acaccacaaa caccgcatca agctcctcta gttgcctgca tcagtcagcc 840 gtgagaaagg ccgcttacag ccacctgtcc acatctaaaa ggcactcaag ctccgggcat 900 gctgtggagc tgcacaacat ccctccaaat tctgcacgca gtcagtcaga aggacccgtg 960 ttcagctgct ggtggctgca gtttcggaac tcaaagcctt gcagcgacta ttgtctgagc 1020 catattgtga atctgctgga ggattggggc ccttgtaccg agcacgggga acaccatatc 1080 aggattccac gaacaccagc acgagtgact ggaggggtgt tcctggtgga caagaacccc 1140 cacaatacta ccgagagccg gctggtggtc gatttcagtc agttttcaag aggcaacaca 1200 agggtgtcat ggcccaaatt cgccgtccct aatctgcaga gtctgactaa cctgctgtct 1260 agtaatctga gctggctgtc cctggacgtg tccgcagcct tttaccacct gcctctgcat 1320 ccagctgcaa tgccccatct gctggtgggg tcaagcggac tgagtcgcta cgtcgcccga 1380 ctgtcctcta actcacgcat cattaatcac cagcatggca ccatgcagaa cctgcacgat 1440 agctgttccc ggaatctgta cgtgtctctg ctgctgctgt ataagacatt cggcagaaaa 1500 ctgcacctgt acagccatcc tatcattctg gggtttagga agatcccaat gggagtggga 1560 ctgagcccct tcctgctggc acagtttacc tccgccattt gctctgtggt ccgccgagcc 1620 ttcccacact gtctggcttt ttcctatatg aacaatgtgg tcctgggcgc caaatccgtg 1680 cagcatctgg agtctctgtt cacagctgtc actaactttc tgctgagcct ggggatccac 1740 ctgaacccaa ataagactaa acgctggggg tacagcctga atttcatggg atatgtgatt 1800 ggatcctggg ggaccctgcc acaggagcac atcgtgcaga agatcaagga atgctttcgg 1860 aagctgcccg tcaacagacc tatcgactgg aaagtgtgcc agcggattgt cggactgctg 1920 ggcttcgccg ctccctttac ccagtgcggg tacccagcac tgatgcccct gtatgcctgt 1980 atccagtcta agcaggcttt cacctttagt cctacataca aggcattcct gtgcaaacag 2040 tacctgaacc tgtatccagt ggcaaggcag cgacctggac tgtgccaggt ctttgcaaat 2100 gccactccta ccggctgggg gctggctatc ggacatcagc gaatgcgggg cacattcgtg 2160 gcccccctgc ctattcacac tgctcagctg ctggcagcct gctttgctag atctaggagt 2220 ggagcaaagc tgatcggcac cgacaatagt gtggtcctgt caagaaaata cacatccttc 2280 ccatggctgc tgggatgtgc tgcaaactgg attctgaggg gcaccagctt cgtgtacgtc 2340 ccctcagccc tgaatcctgc tgacgatcca tcccgcgggc gactgggact gtaccgacct 2400 ctgctgagac tgcccttcag gcctacaact ggccggacat ctctgtatgc cgattcacca 2460 agcgtgccct cacacctgcc tgacagagtc cactttgctt cacccctgca cgtcgcttgg 2520 cggcctcca 2529 <210> 20 <211> 2529 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HBV pol <400> 20 atgcccctgt cttaccagca ctttagaaag cttctgctgc tggacgatga agccgggcct 60 ctggaggaag agctgccaag gctggcagac gaggggctga accggagagt ggccgaagat 120 ctgaatctgg gaaacctgaa cgtgagcatc ccttggactc ataaagtcgg caacttcacc 180 gggctgtaca gctccacagt gcctgtcttc aatccagagt ggcagacacc atcctttccc 240 aacattcacc tgcaggagga catcattaat agatgcgaac agttcgtggg acctctgaca 300 gtcaacgaaa agaggcgcct gaaactgatc atgcctgcca ggttttaccc aaatgtgact 360 aagtatctgc cactggataa gggcatcaag ccttactatc cagagcacct ggtgaaccat 420 tacttccaga ctagacacta tctgcatacc ctgtggaagg ccggaatcct gtacaaacga 480 gaaactaccc ggagtgcttc attttgtggc tccccatatt cttgggaaca ggagctgcag 540 catggcaggc tggtgttcca gaccagcaca cgccacgggg atgagtcctt ttgccagcag 600 tctagtggca tcctgagcag atcccccgtg gggccttgtc tgcagtctca gctgcggaag 660 agtagactgg gactgcagcc acagcaggga cacctggcac gacggcagca gggaaggtct 720 ggcagtatcc gggctagagt gcatcccaca actagaaggc ctttcggcgt cgagccatca 780 ggaagcggcc acaccacaaa caccgcatca agctcctcta gttgcctgca tcagtcagcc 840 gtgagaaagg ccgcttacag ccacctgtcc acatctaaaa ggcactcaag ctccgggcat 900 gctgtggagc tgcacaacat ccctccaaat tctgcacgca gtcagtcaga aggacccgtg 960 ttcagctgct ggtggctgca gtttcggaac tcaaagcctt gcagcgacta ttgtctgagc 1020 catattgtga atctgctgga ggattggggc ccttgtaccg agcacgggga acaccatatc 1080 aggattccac gaacaccagc acgagtgact ggaggggtgt tcctggtgga caagaacccc 1140 cacaatacta ccgagagccg gctggtggtc gatttcagtc agttttcaag aggcaacaca 1200 agggtgtcat ggcccaaatt cgccgtccct aatctgcaga gtctgactaa cctgctgtct 1260 agtaatctga gctggctgtc cctggacgtg tccgcagcct tttaccacct gcctctgcat 1320 ccagctgcaa tgccccatct gctggtgggg tcaagcggac tgagtcgcta cgtcgcccga 1380 ctgtcctcta actcacgcat cattaatcac cagcatggca ccatgcagaa cctgcacgat 1440 agctgttccc ggaatctgta cgtgtctctg ctgctgctgt ataagacatt cggcagaaaa 1500 ctgcacctgt acagccatcc tatcattctg gggtttagga agatcccaat gggagtggga 1560 ctgagcccct tcctgctggc acagtttacc tccgccattt gctctgtggt ccgccgagcc 1620 ttcccacact gtctggcttt ttcctatatg aacaatgtgg tcctgggcgc caaatccgtg 1680 cagcatctgg agtctctgtt cacagctgtc actaactttc tgctgagcct ggggatccac 1740 ctgaacccaa ataagactaa acgctggggg tacagcctga atttcatggg atatgtgatt 1800 ggatcctggg ggaccctgcc acaggagcac atcgtgcaga agatcaagga atgctttcgg 1860 aagctgcccg tcaacagacc tatcgactgg aaagtgtgcc agcggattgt cggactgctg 1920 ggcttcgccg ctccctttac ccagtgcggg tacccagcac tgatgcccct gtatgcctgt 1980 atccagtcta agcaggcttt cacctttagt cctacataca aggcattcct gtgcaaacag 2040 tacctgaacc tgtatccagt ggcaaggcag cgacctggac tgtgccaggt ctttgcaaat 2100 gccactccta ccggctgggg gctggctatc ggacatcagc gaatgcgggg cacattcgtg 2160 gcccccctgc ctattcacac tgctcagctg ctggcagcct gctttgctag atctaggagt 2220 ggagcaaagc tgatcggcac cgacaatagt gtggtcctgt caagaaaata cacatccttc 2280 ccatggctgc tgggatgtgc tgcaaactgg attctgaggg gcaccagctt cgtgtacgtc 2340 ccctcagccc tgaatcctgc tgacgatcca tcccgcgggc gactgggact gtaccgacct 2400 ctgctgagac tgcccttcag gcctacaact ggccggacat ctctgtatgc cgattcacca 2460 agcgtgccct cacacctgcc tgacagagtc cactttgctt cacccctgca cgtcgcttgg 2520 cggcctcca 2529 <210> 21 <211> 671 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pUC Ori <400> 21 cccgtagaaa agatcaaagg atcttcttga gatccttttt ttctgcgcgt aatctgctgc 60 ttgcaaacaa aaaaaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga gctaccaact 120 ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt tcttctagtg 180 tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata cctcgctctg 240 ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac cgggttggac 300 tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg ttcgtgcaca 360 cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg tgagctatga 420 gaaagcgcca cgcttcccga agggagaaag gcggacaggt atccggtaag cggcagggtc 480 ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct ttatagtcct 540 gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc aggggggcgg 600 agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt ttgctggcct 660 tttgctcaca t 671 <210> 22 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Kan resistance <400> 22 atgattgagc aagatggtct tcacgctggc tcgccagctg cgtgggtgga acgcctgttt 60 ggttatgatt gggcgcagca gactattgga tgttccgacg cggctgtatt tcggctgtct 120 gctcagggtc gccccgtgct gtttgtgaag acggatttgt ctggcgcatt aaatgagtta 180 caggacgagg cggctcgtct gagttggttg gccaccaccg gcgtgccctg cgccgcagtg 240 ctggatgtcg tgacagaagc aggccgcgat tggctccttc tcggcgaagt gccgggccag 300 gacctgctca gcagccactt ggcaccggca gaaaaagttt ctatcatggc cgacgccatg 360 cgtcgtcttc acactctcga tccggccacg tgcccctttg accaccaggc caagcatcgt 420 attgaacgtg cgcgtactcg gatggaagca ggtttagtag accaggacga tttggatgag 480 gaacatcaag gcctggcccc ggctgaactg tttgcgcgct taaaagcgtc gatgccagat 540 ggcgaagatt tggtagtcac ccatggagat gcgtgtttgc caaacatcat ggttgaaaat 600 ggccgcttct caggctttat tgactgtggg cgcctgggtg ttgccgaccg ctatcaagat 660 attgcgctcg caactcgtga catcgctgaa gagctgggcg gagaatgggc tgaccgtttc 720 ctggtactgt atggcattgc agcgcccgat tcccaacgca tcgcatttta tcgtctgctg 780 gatgagtttt tctaa 795 <210> 23 <211> 264 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Kan resistance <400> 23 Met Ile Glu Gln Asp Gly Leu His Ala Gly Ser Pro Ala Ala Trp Val 1 5 10 15 Glu Arg Leu Phe Gly Tyr Asp Trp Ala Gln Gln Thr Ile Gly Cys Ser 20 25 30 Asp Ala Ala Val Phe Arg Leu Ser Ala Gln Gly Arg Pro Val Leu Phe 35 40 45 Val Lys Thr Asp Leu Ser Gly Ala Leu Asn Glu Leu Gln Asp Glu Ala 50 55 60 Ala Arg Leu Ser Trp Leu Ala Thr Thr Gly Val Pro Cys Ala Ala Val 65 70 75 80 Leu Asp Val Val Thr Glu Ala Gly Arg Asp Trp Leu Leu Leu Gly Glu 85 90 95 Val Pro Gly Gln Asp Leu Leu Ser Ser His Leu Ala Pro Ala Glu Lys 100 105 110 Val Ser Ile Met Ala Asp Ala Met Arg Arg Leu His Thr Leu Asp Pro 115 120 125 Ala Thr Cys Pro Phe Asp His Gln Ala Lys His Arg Ile Glu Arg Ala 130 135 140 Arg Thr Arg Met Glu Ala Gly Leu Val Asp Gln Asp Asp Leu Asp Glu 145 150 155 160 Glu His Gln Gly Leu Ala Pro Ala Glu Leu Phe Ala Arg Leu Lys Ala 165 170 175 Ser Met Pro Asp Gly Glu Asp Leu Val Val Thr His Gly Asp Ala Cys 180 185 190 Leu Pro Asn Ile Met Val Glu Asn Gly Arg Phe Ser Gly Phe Ile Asp 195 200 205 Cys Gly Arg Leu Gly Val Ala Asp Arg Tyr Gln Asp Ile Ala Leu Ala 210 215 220 Thr Arg Asp Ile Ala Glu Glu Leu Gly Gly Glu Trp Ala Asp Arg Phe 225 230 235 240 Leu Val Leu Tyr Gly Ile Ala Ala Pro Asp Ser Gln Arg Ile Ala Phe 245 250 255 Tyr Arg Leu Leu Asp Glu Phe Phe 260 <210> 24 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> bla promoter <400> 24 acccctattt gtttattttt ctaaatacat tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa 60 ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa aggaagagt 99 <210> 25 <211> 124 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrMVA13.5 Long Promoter <400> 25 taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt agtattgctc ttgtgactag 60 agactttagt taaggtactg taaaaataga aactataatc atataatagt gtaggttggt 120 agta 124 <210> 26 <211> 227 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PrHyb Promoter <400> 26 gttttgaaaa tttttttata ataaatatcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 60 tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt 120 gaaaaactat tctaatttat tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat 180 tgcacggtcc ggtaaaaatt gaaaaactat tctaatttat tgcacgg 227 <210> 27 <211> 81 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Immunoglobulin Secretion Tag <400> 27 atggaattcg gcctgagctg ggtgttcctg gtggccatcc tgaagggagt gcagtgcgag 60 gtgcagctgc tggaaagcgg t 81 <210> 28 <211> 7 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Transcription Termination Sequence <220> <221> n <222> (6)..(6) <223> n, wherein n can be any nucleotide <400> 28 tttttnt 7

Claims (49)

  1. 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-천연 핵산 분자를 포함하는 변형된 백시니아 앙카라(Modified Vaccinia Ankara, MVA) 벡터.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 HBV 폴리머라제 항원은 포유류에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 포유류에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는, MVA 벡터.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, MVA 벡터.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, MVA 벡터.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3과 적어도 90% 동일한, MVA 벡터.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, MVA 벡터.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된(truncated) HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, MVA 벡터.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1과 적어도 90% 동일한, MVA 벡터.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 1의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, MVA 벡터.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항의 MVA 벡터 및 약학적 허용 담체를 포함하는 조성물.
  11. 인간 대상체 내에서 면역 반응을 증진하는 방법으로, 상기 방법은:
    a. 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 비-천연 핵산 분자를 포함하는 면역학적 유효량의 아데노바이러스 벡터 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 및
    b. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 MVA 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계;
    를 포함하여 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역반응을 얻는, 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 그리고 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는, 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 19와 적어도 90% 동일한, 방법.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 19의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 아데노바이러스 벡터의 핵산 분자가 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 17와 적어도 90% 동일한, 방법.
  18. 제17항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 17의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는, 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 융합 단백질은 링커를 통해 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 절두된 HBV 코어 항원을 포함하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 링커는 (AlaGly)n의 아미노산 서열을 포함하고, n은 2 내지 5의 정수이고, 바람직하게 상기 링커는 서열번호 14의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 융합 단백질은 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  23. 제11항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 항체 반응을 포함하는, 방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD8+ T 세포 반응을 포함하는, 방법.
  25. 제23항 또는 제24항에 있어서,
    상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD4+ T 세포 반응을 포함하는, 방법.
  26. 제11항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 아데노바이러스 벡터는 rAd26 또는 rAd35 벡터인, 방법.
  27. 제11항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)는 단계 (a) 후 1-12주에 수행되는, 방법.
  28. 제11항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)는 단계 (a) 후 2-12주에 수행되는, 방법.
  29. 제11항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 1주에 수행되는, 방법.
  30. 제11항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 2주에 수행되는, 방법.
  31. 인간 대상체 내에서 면역 반응을 증진하는 방법으로, 상기 방법은:
    a. 서열번호 4와 적어도 98% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 HBV 폴리머라제 항원을 인코딩하는 제1 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 제1 비-천연 핵산 분자를 포함하는 면역학적 유효량의 제1 플라스미드 및 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 절두된 HBV 코어 항원을 인코딩하는 제2 폴리뉴클레오티드를 포함하는 제2 비-천연 핵산 분자를 포함하는 제2 플라스미드를 포함하는 제1 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계; 및
    b. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 MVA 벡터의 면역학적 유효량을 포함하는 제2 조성물을 인간 대상체에 투여하는 단계;
    를 포함하여 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 면역반응을 얻는, 방법.
  32. 제31항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 역전사효소 활성 및 RNase H 활성을 가지지 않는, 방법.
  33. 제31항 또는 제32항에 있어서,
    상기 제1 조성물은 면역 반응을 프라임하기 위한 것이고, 제2 조성물은 면역반응을 부스트하기 위한 것인, 방법.
  34. 제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 2개의 HBV 유전자형에 대한 면역 반응을 유도할 수 있고, 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 B, C 및 D에 대한 T 세포 반응을 유도할 수 있고, 그리고 보다 바람직하게 상기 HBV 폴리머라제 항원은 인간 대상체에서 적어도 HBV 유전자형 A, B, C 및 D에 대한 CD8 T 세포 반응을 유도할 수 있는, 방법.
  35. 제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원은 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는, 방법.
  36. 제31항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서,
    제1 조성물의 HBV 폴리머라제 항원에 작동적으로 연결된 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 추가로 포함하는, 방법.
  37. 제36항에 있어서,
    상기 신호 서열은 서열번호 6 또는 서열번호 11의 아미노산 서열을 포함하고, 바람직하게 상기 신호 서열은 서열번호 5 또는 서열번호 10의 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는, 방법.
  38. 제31항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20과 적어도 90% 동일한, 방법.
  39. 제38항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 20의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는, 방법.
  40. 제31항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 18과 적어도 90% 동일한, 방법.
  41. 제40항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 서열번호 18을 포함하는, 방법.
  42. 제31항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 제1 조성물의 제1 및 제2 폴리뉴클레오티드 서열은 프로모터 서열을 추가로 포함하고, 선택적으로 하나 이상의 추가적인 조절 서열을 추가로 포함하고, 바람직하게 상기 프로모터 서열은 서열번호 7의 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 상기 추가적인 조절 서열은 서열번호 8 또는 서열번호 15, 및 서열번호 16의 폴리아데닐화 신호 서열로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 방법.
  43. 제31항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 항체 반응을 포함하는, 방법.
  44. 제43항에 있어서,
    상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD8+ T 세포 반응을 포함하는, 방법.
  45. 제43항 또는 제44항에 있어서,
    상기 증진된 면역 반응은 인간 대상체 내에서 HBV 항원에 대한 증진된 CD4+ T 세포 반응을 포함하는, 방법.
  46. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)는 단계 (a) 후 1-12주에 수행되는, 방법.
  47. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)는 단계 (a) 후 2-12주에 수행되는, 방법.
  48. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 1주에 수행되는, 방법.
  49. 제31항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서,
    단계 (b)는 단계 (a) 후 적어도 2주에 수행되는, 방법.
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