CN101248173A - 对于抗病毒核苷试剂具有抗性的乙型肝炎病毒变异体及其应用 - Google Patents
对于抗病毒核苷试剂具有抗性的乙型肝炎病毒变异体及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
总的说来，本发明涉及显示出对特定试剂的敏感性降低和/或与免疫学反应物的相互作用活性降低的病毒变异体。更具体而言，本发明旨在显示出对核苷或核苷酸类似物的完全或部分抗性和/或与针对病毒表面组分的抗体的相互作用活性降低(包括对这些抗体的敏感性降低)的乙型肝炎病毒(HBV)变异体。本发明进一步考虑了用于检测此类病毒变异体的测定法，所述测定法可用于监控抗病毒治疗方案以及开发针对病毒剂并且特别是HBV变异体的新型或改良型疫苗。本发明还考虑了所述病毒变异体用于筛选和/或开发或设计能够抑制病毒感染、复制和/或释放的试剂的用途。
Description
发明背景
发明领域
总的说来，本发明涉及显示出对特定试剂的敏感性降低和/或与免疫反应物的相互作用活性(interactivity)降低的病毒变异体。更具体而言，本发明旨在显示出对核苷或核苷酸类似物的完全或部分抗性和/或与针对病毒表面组分的抗体的相互作用活性降低(包括对这些抗体的敏感性降低)的乙型肝炎病毒(HBV)变异体。本发明进一步考虑了用于检测此类病毒变异体的测定法，所述测定法可用于监控抗病毒治疗方案以及开发针对病毒剂并且特别是HBV变异体的新型或改良型疫苗。本发明还考虑了所述病毒变异体用于筛选和/或开发或设计能够抑制病毒感染、复制和/或释放的试剂的用途。
现有技术描述
还在说明书的结尾收集了本说明书中参考的出版物的目录细节。
本说明书中对于任何现有技术的参考不是且不应视为承认或以任何形式暗示，那个现有技术在任何国家中构成公知常识的一部分。
乙型肝炎病毒(HBV)可以引起使人虚弱的疾病状态并且可以导致急性肝功能衰竭。HBV是经由RNA中间体复制并在其复制策略中利用逆转录作用的DNA病毒(Summers和Mason，Cell 29：403-415，1982)。HBV基因组具有复杂的性质，其具有部分双链DNA结构，含编码表面、核心、聚合酶和X基因的重叠开放读码框。HBV基因组的复杂性质在图1中表现。聚合酶由4个功能区即末端蛋白(TP)、间隔区、逆转录酶(rt)和核糖核酸酶(RNA酶)组成。
HBV的聚合酶基因与包膜基因重叠，在聚合酶基因的催化结构域中的突变还可以影响包膜蛋白的核苷酸和推导的氨基酸序列，并且反之亦然。特别地，发现称为‘a’决定子的HBV中和结构域的基因序列在HBsAg内且位于氨基酸99和169之间，其实际上与病毒聚合酶蛋白质的主要催化区重叠，特别是结构域A和B。
HBV DNA聚合酶的存在已导致提议，核苷或核苷酸类似物可以充当有效的抗病毒剂。目前测试的核苷或核苷酸类似物的例子是喷昔洛韦及其口服形式(FCV)[Vere Hodge，Antiviral Chem Chemother 4：67-84，1993；Boyd等人，Antiviral Chem Chemother.32：358-363，1987；Kruger等人，Hepatology 22；219A，1994；Main等人，J.ViralHepatitis 3：211-215，1996]，拉米夫定[(-)-β-2’-脱氧-3’-硫代胞苷](3TC或LMV)[Severini等人，Antimicrobial Agents Chemother.39：430-435，1995；Dienstag等人，New England J Med 333；1657-1661，1995]。已经进展至临床试验的新型核苷或核苷酸类似物包括嘧啶类，恩曲他滨(emtricitabine)((-)-β-L-2’-3’-二脱氧-5-氟-3’-硫代胞苷；FTC)，3TC的5-氟衍生物；和克来夫定(1-(2-氟-5-甲基-β-L-阿拉伯呋喃糖基)尿嘧啶；L-FMAU)，胸苷类似物。如同3TC，这些是具有非天然的“L”构型的嘧啶衍生物。几种嘌呤衍生物也已进展至临床试验；它们包括恩替卡韦(BMS-200，475；ETV)，碳环脱氧鸟苷类似物；二氨基嘌呤dioxalone(DAPD)，dioxalone鸟嘌呤((-)-β-D-2-氨基嘌呤dioxalone；DXG)的口服药物前体；和阿德福韦二匹伏酯，非环状脱氧腺苷单磷酸核苷酸或核苷酸类似物阿德福韦(9-[膦酰基-甲氧基乙基]-腺嘌呤；PMEA)的口服药物前体。在临床前和临床试验中的其他药物包括FLG[Medivir]、ACH-126，443(L-d4C)[Archillion Pharmaceuticals]、ICN 2001-3(ICN)和Racivir(RCV)[Pharmassett]。
尽管这些试剂在抑制HBV DNA合成中高度有效，但存在在长期抗病毒化学治疗过程中出现HBV的抗性突变体的可能。在进行延长的LMV治疗的患者中，在聚合酶内的rt结构域中于rtM204I/V+/-rtL180M处选择出关键抗性突变以及其他突变。用于聚合酶突变的命名法依照Stuyver等人，2001(同上)所提议的那种。LMV是已批准用于对抗慢性HBV感染的核苷或核苷酸类似物。LMV是特别有效的HBV复制抑制剂，并在同位肝移植(OLT)后通过抑制病毒DNA合成来减少在慢性感染的患者血清中的HBV DNA滴度。LMV单一疗法看起来不太可能能够在较长期间内控制HBV复制。这是因为LMV抗性HBV毒株的出现看起来在单一疗法过程中几乎是不可避免的。
阿德福韦二匹伏酯(ADV：以前为bis-pom PMEA)是非环状脱氧腺苷单磷酸类似物阿德福韦(以前为PMEA)的口服可用的药物前体(图2)。ADV还是有效的HBV复制抑制剂，并且近期已得到FDA批准用于对抗慢性HBV感染。阿德福韦二匹伏酯与这个类别中的其他试剂的不同之处在于，它是核苷酸(与核苷相对)类似物，并且如此绕过在药物激活过程中的第一个磷酸化反应。这个步骤通常是限制速率的。阿德福韦二匹伏酯已证实具有针对野生型和拉米夫定抗性的HBV毒株的临床活性，并且目前在III期临床实验中(Gilson等人，J Viral Hepat6：387-395，1999；Perrillo等人，Hepatology 32：129-134，2000；Peters等人，Transplantation 68：1912-1914，1999；Benhamou等人，Lancet 358：718-723，2001)。在II期研究过程中，30mg日剂量的阿德福韦二匹伏酯经过12周导致病毒血症平均减少4 log10(Heathcote等人，Hepatology 28：A620，1998)。
ADV是取代的非环状核苷膦酸。这类化合物还包括富马酸替诺福韦二匹伏酯(tenofovir disoproxil fumarate)(也称为替诺福韦DF，或替诺福韦，或(TFV)或9-R-(2-膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤(PMPA)，并且由Gilead sciences作为Viread进行销售)。
TFV具有针对HBV和HIV的抗病毒活性(Ying等人，J Viral Hepat.7(2)：161-165，2000；Ying等人，J.Viral Hepat.7(1)：79-83，2000，2000；Suo等人，J Biol Chem.273(42)：27250-27258.1998)。
FTC具有针对HBV和HIV的活性(Frick等人，Antimicrob AgentsChemother 37：2285-2292，1993)。
核苷或核苷酸类似物疗法可以作为单一疗法或联合疗法进行施用，在所述联合疗法中可以施用两种或更多种核苷或核苷酸类似物。核苷或核苷酸类似物还可以与其他抗病毒剂例如干扰素或乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)联合施用。
需要监控核苷/核苷酸类似物或抗体抗性的HBV毒株的出现，并且开发诊断规程以检测这些抗性病毒和/或使用它们来筛选和/或开发或设计具有使得它们可用作抗病毒剂的性质的试剂。这些抗性毒株的缺陷形式或来自其中的抗原组分也被提议用于开发治疗性疫苗组合物，如针对病毒表面组分的抗体。
发明概述
在整个说明书中，除非上下文另有要求，单词“包括”或其变化形式“包含”或“含有”将理解为暗示包括所述要素或整数或者要素或整数的组，但是不排除任何其他要素或整数或者要素或整数的组。
核苷酸和氨基酸序列由序列标识号(SEQ ID NO：)来提及。这些SEQ ID NO：在数字上对应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)、<400>2(SEQ ID NO：2)等。在表1中提供了序列识别符的概要。序列表在权利要求后给出。
氨基酸序列中的特定突变在本文中表示为“Xaa1nXaa2”，其中Xaa1是突变前的原始氨基酸残基，n是残基编号，和Xaa2是突变型氨基酸。缩写“Xaa”可以是三字母或单字母(即“X”)密码。在“Xaa1nXaa2”之前的“rt”表示“逆转录酶”。“s”表示包膜基因。HBV DNA聚合酶的氨基酸残基通过将在基序Tyr Met Asp Asp(YMDD)中的残基甲硫氨酸定为残基编号204来进行编号(Stuyver等人，Hepatology 33：751-757，2001)。乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸残基根据Norder等人(J.Gen.Virol.74：341-1348，1993)进行编号。单和三字母缩写用于限定氨基酸残基，并且这些概括于表2中。
根据本发明，在用ADV和/或LMV治疗的具有慢性HBV感染的患者中确定了HBV变异体的选择。因此，考虑对下列物质具有抗性或者显示出对下列物质的敏感性降低的HBV rt变异体：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。表面抗原中的相应突变也存在。这些HBV变异体的鉴定对于开发测定法是重要的，所述测定法用于监控ADV、LMV、FTC和/或TFV抗性和/或对于ETV与除LMV以外的任何核苷或核苷酸类似物组合的抗性和/或对于其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合的抗性，并筛选可用作备选治疗剂的试剂。不建议主题变异体显示出对单独的ETV或单独的ETV和LMV的抗性。
本文提及的“抗HBV试剂”包括核苷和核苷酸类似物以及免疫学反应物(例如针对HBV表面组分的抗体)以及化学的、蛋白质的和核酸的试剂，其抑制或者干扰病毒复制、维持、感染、装配或释放。
此类HBV变异体的检测在治疗方案的管理(包括选择用于治疗HBV感染的合适试剂)中特别重要。本发明的这个方面的方法部分地基于在核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合存在下监控受试者中增加的HBV载量的发展。然后，临床医生因而能够修改现行的治疗方案或选择合适的治疗方案。
因此，本发明的一个方面旨在分离的乙型肝炎病毒(HBV)变异体，其中所述变异体在编码DNA聚合酶的基因中包含导致对所述DNA聚合酶的至少一个氨基酸添加、置换和/或缺失的核苷酸突变，并且其中所述变异体显示出对选自下列的一种或多种核苷或核苷酸类似物的敏感性降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。所述变异体HBV在其基因组中的重叠开放读码框中，在由HBV DNA聚合酶的结构域F和G以及结构域A到E中的一个或多个所限定的区域中包含突变。
本发明的另一方面提供了分离的HBV变异体，其在S基因中包含导致对表面抗原的至少一个氨基酸添加、置换和/或缺失的核苷酸突变，并且所述变异体显示出对选自下列的一种或多种核苷或核苷酸类似物的敏感性降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
rt区中的有用突变体在一个实施方案中包括在下列密码子处的突变：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250。特别的突变体包括rtN53、rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204和rtN236，在另一个实施方案中包括rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204和rtH248，或在另外一实施方案中包括rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204和rtM250，在另外一实施方案中包括rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、rtM250，或其组合或等价突变。更加特别的突变体包括rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V和rtN236T，在另一个实施方案中包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V和rtH248N，或在另外一个实施方案中包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V和rtM250L，或在另外一个实施方案中包括rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L，或其组合或等价突变。
特别有用的突变体在下列密码子上：rtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248或rtM250，例如rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N或rtM250L。
S基因中的有用突变在一个实施方案中包括在下列密码子处的突变：stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210，例如sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M，在另一个实施方案中包括sT118A、sP120T、sP127A和sI195M，或在另一个实施方案中包括sT114P、sI195M、sS204N、sI208T和sS210R，并且最后另一个实施方案包括sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R。
本发明进一步考虑了用于测定HBV显示出对下列物质的敏感性降低的可能性的方法：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，所述突变导致在DNA聚合酶的结构域F和G以及结构域A到E中的任何一个或多个或者与其接近区域中的至少一个氨基酸置换、缺失和/或添加，并与对下列物质的抗性或降低的敏感性相关：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
此类突变的存在是对下列物质具有抗性的可能性的指示：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。
本发明还提供了包含变异体HBV或来自该变异体HBV的HBV表面抗原或其重组或衍生形式或其化学等价物，以及一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂的组合物，所述变异体HBV对下列物质具有抗性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
本发明的另外一个方面提供了前述组合物或变异体HBV在制备用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染的药物中的用途，所述变异体HBV在编码DNA聚合酶的基因中包含核苷酸突变，所述突变导致对DNA聚合酶的至少一个氨基酸添加、置换和/或缺失以及对下列物质的敏感性降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
本发明还考虑了用于测定HBV毒株是否显示出对核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的敏感性降低的方法，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在编码DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，其中在rt区域中存在下列突变：在一个实施方案中，在密码子rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250处的突变。特别的突变体包括rtN53、rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204和rtN236，在另一个实施方案中包括rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204和rtH248，或在另外一个实施方案中包括rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204和rtM250，或在另外一个实施方案中包括rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、rtM250，或其组合或等价突变。更加特别的突变体包括rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V和rtN236T，在另一个实施方案中包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V和rtH248N，或另外一个实施方案包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V和rtM250L，或另外一个实施方案包括rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L，或其组合或等价突变。突变还可以是其组合或等价突变，所述突变是变异体显示处对下列物质的敏感性降低的指示：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
更加进一步的方面提供了用于测定HBV毒株是否显示出对核苷或核苷酸类似物的敏感性降低的方法，所述方法包括在编码包膜基因的核苷酸序列中筛选突变，其中在s基因中存在下列突变：在一个实施方案中包括在密码子stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210处的突变，例如sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M，并且在另一个实施方案中包括sT118A、sP120T、sP127A和sI195M，或另外一个实施方案包括sT114P、sI195M、sS204N、sI208T和sS210R，或另外一个实施方案包括sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R或其组合或等价突变或其组合或等价的一个或多个其他突变，是变异体显示出对下列物质的敏感性降低的指示：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
优选地，变异体是分离的形式，从而它们已经历了至少一个纯化步骤，与天然存在的体液相分离。备选地，变异体可以维持在分离的体液中或可以是DNA形式。本发明还考虑了包括来自变异体HBV的基因组或其部分的传染性分子克隆。细胞、细胞裂解物、培养物上清液和体液中HBV或其组分的检测可以通过任何方便的方法，包括任何基于核酸的检测方法，例如，通过核酸杂交技术或经由一次或多次聚合酶链式反应(PCRs)。术语“体液”包括来源于血液、淋巴、组织或器官系统的任何液体，包括血清、全血、活组织检查和活组织检查液体、器官外植体和器官悬浮液例如肝悬浮液。
本发明的另一方面旨在变异体HBV，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与来自参考或野生型HBV的表面抗原相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中针对参考或野生型表面抗原而产生的抗体显示出相对于HBV变异体而言改变的免疫学特性。一种改变的特性包括用于中和HBV的能力减少。更具体而言，变异体HBV的表面抗原显示出与治疗前的HBV相比而言改变的免疫学特性，其中变异体HBV通过核苷或核苷酸类似物或其他对于HBV DNA聚合酶的抗HBV试剂来进行选择。本发明的这个方面的变异体HBV还可以包含与治疗前的HBV相比而言具有单个或多个核苷酸置换、添加和/或缺失的核苷酸序列。
本发明进一步考虑了用于检测显示出改变的免疫学特性的变异体HBV的方法，所述方法包括从暴露于选自下列的核苷或核苷酸类似物或类似物组合的受试者中分离HBV：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，然后使所述HBV与一组针对表面抗原的一种或多种抗体接触，并筛选结合亲和力或结合谱的任何变化。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
在相关发明中，本发明提供了用于检测显示出改变的免疫学特性的变异体HBV的方法，所述方法包括从暴露于选自下列的核苷或核苷酸类似物的受试者中分离血清样品：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，然后使血清与一组HBV表面抗原或其抗体结合片段接触，并筛选结合亲和力或结合谱的任何变化。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
本发明扩展至对应于所述变异体HBV的分离的HBs Ag或其重组形式或其衍生物或化学等价物。一般地，HBsAg或其重组或衍生形式或其化学等价物所包含的氨基酸序列与来自参考HBV的HBs Ag相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中针对参考HBV的抗体显示出对于携带所述变异体HBsAg的HBV的改变的免疫学特性。在一个实施方案中，所述改变的免疫学特性包括中和变异体HBV的能力降低。
本发明的另一方面考虑了用于检测显示出对于HBV的抑制活性的试剂的方法，其包括产生包含在质粒载体中的遗传构建体，所述遗传构建体包含在能够复制方面来说有效量(replicationcompetent-effective amount)的来自HBV的基因组，然后用所述构建体转染所述细胞；在转染之前、期间和/或之后使所述细胞接触待测试的试剂；以一定的时间和条件培养所述细胞，所述时间和条件足够所述HBV复制、表达基因序列和/或装配和/或释放病毒或病毒样颗粒，如果对所述试剂有抗性；和然后对所述细胞、细胞裂解物或培养物上清液实施病毒或病毒组分检测方法，以确定所述病毒在所述试剂存在下是否已复制、表达遗传材料和/或装配和/或释放。在一个优选实施方案中，所述质粒载体是杆状病毒载体，并且所述方法包括产生遗传构建体，所述遗传构建体包含在能够复制方面来说有效量的来自HBV的基因组，所述HBV基因组被包含在对于感染细胞来说有效的量的杆状病毒基因组中或与之融合，然后用所述构建体转染所述细胞；在感染之前、期间和/或之后使所述细胞接触待测试的试剂；以一定的时间和条件培养所述细胞，所述时间和条件足够所述HBV复制、表达基因序列和/或装配和/或释放病毒或病毒样颗粒，如果对所述试剂有抗性；和然后对所述细胞、细胞裂解物或培养物上清液实施病毒或病毒组分检测方法，以确定所述病毒在所述试剂存在下是否已复制、表达遗传材料和/或装配和/或释放。
与这些方法相结合，质粒载体可以包括编码部分或全部其他病毒载体例如杆状病毒载体或腺病毒载体的基因(参见Ren和Nassal，J.Virol.75(3)：1104-1116，2001)。
在一个备选实施方案中，该方法包括产生以在能够复制方面来说有效的量包含HBV基因组的传染性拷贝的连续细胞系，从而使得所述传染性HBV基因组稳定整合到所述连续细胞系中，例如但不限于2.2.15或AD细胞系；使所述细胞接触待测试的试剂；以一定的时间和条件培养所述细胞，所述时间和条件足够所述HBV复制、表达基因序列和/或装配和/或释放病毒或病毒样颗粒，如果对所述试剂有抗性；然后对所述细胞、细胞裂解物或培养物上清液实施病毒或病毒组分检测方法，以确定所述病毒在所述试剂存在下是否已复制、表达遗传材料和/或装配和/或释放。
在一个备选实施方案中，本发明还考虑了用于检测在体外聚合酶测定法中显示出对HBV聚合酶的抑制活性的试剂的方法。HBV聚合酶活性可以使用已建立的测定法来检查(Gaillard等人，AntimicrobAgents Chemother.46(4)：1005-1013，2002；Xiong等人，Hepatology.28(6)：1669-73，1998)。HBV聚合酶可以是野生型或参考HBV聚合酶或突变型HBV聚合酶。
病毒变异体的鉴定使得能够生产包含特定重组病毒组分例如聚合酶或编码L、M、S蛋白的包膜基因PreS1、PreS2、S的疫苗，以及包括缺陷型HBV变异体的治疗性疫苗。推理性药物设计还可以用于鉴定或产生治疗分子，其能够与聚合酶或编码L、M、S蛋白的包膜基因PreS1、PreS2、S或HBV的其他组分相互作用。此类药物还可以具有诊断潜能。另外，缺陷型HBV变异体还可以用作治疗组合物以产生针对相同、相似或同源病毒的免疫应答。备选地，针对HBV变异体或其表面组分而产生的抗体可以用于针对HBV变异体或类似或同源病毒的感染对受试者进行被动免疫接种。此外，本发明考虑了能够下调HBV组分的活性并抑制复制、维持、感染、装配或释放的试剂，例如核苷或核苷酸类似物、RNAi或siRNA分子(DNA-衍生的或合成的)、反义或有义寡核苷酸、化学或蛋白质性质的分子。
如上文指出的，本发明没有扩展至显示出对单独的ETV或单独的ETV和LMV的抗性或降低的敏感性的HBV变异体。
在整个本说明书中使用的缩写的概要在表3中提供。
在整个本说明书中使用的序列标识符的概要在表1中提供。
表1
序列标识符的概要
| 序列ID NO： | 描述 |
| 1 | PCR引物 |
| 2 | PCR引物 |
| 3 | PCR引物 |
| 4 | PCR引物 |
| 5 | PCR引物 |
| 6 | 来自抗性HBV的聚合酶催化区的核苷酸序列患者A：样品A |
| 7 | 来自抗性HBV的聚合酶催化区的推导的氨基酸序列患者A：样品A |
| 8 | 来自抗性HBV的包膜基因的推导的氨基酸序列患者A：样品A |
| 9 | 来自抗性HBV的聚合酶催化区的核苷酸序列患者A：样品B |
| 10 | 来自抗性HBV的包膜基因的推导的氨基酸序列患者A：样品B |
| 11 | 来自抗性HBV的包膜基因的推导的氨基酸序列患者A：样品B |
| 12 | 来自抗性HBV的聚合酶催化区的核苷酸序列患者B |
| 13 | 来自抗性HBV的聚合酶催化区的推导的氨基酸序列患者B |
| 14 | 来自抗性HBV的包膜基因的推导的氨基酸序列患者B |
| 15 | 来自抗性HBV的聚合酶催化区的核苷酸序列患者C |
| 16 | 来自抗性HBV的聚合酶催化区的推导的氨基酸序列患者C |
| 17 | 来自抗性HBV的包膜基因的推导的氨基酸序列患者C |
| 18 | 来自抗性HBV的聚合酶催化区的核苷酸序列患者D |
| 19 | 来自抗性HBV的聚合酶催化区的推导的氨基酸序列患者D |
| 20 | 来自抗性HBV的包膜基因的推导的氨基酸序列患者D |
表2
单和三字母氨基酸缩写
| 氨基酸 | 三字母缩写 | 单字母缩写 |
| 丙氨酸 | Ala | A |
| 精氨酸 | Arg | R |
| 天冬酰胺 | Asn | N |
| 天冬氨酸 | Asp | D |
| 半胱氨酸 | Cys | C |
| 谷氨酰胺 | Gln | Q |
| 谷氨酸 | Glu | E |
| 甘氨酸 | Gly | G |
| 组氨酸 | His | H |
| 异亮氨酸 | Ile | I |
| 亮氨酸 | Leu | L |
| 赖氨酸 | Lys | K |
| 甲硫氨酸 | Met | M |
| 苯丙氨酸 | Phe | F |
| 脯氨酸 | Pro | P |
| 丝氨酸 | Ser | S |
| 苏氨酸 | The | T |
| 色氨酸 | Trp | W |
| 酪氨酸 | Tyr | Y |
| 缬氨酸 | Val | V |
| 任何残基 | Xaa | X |
表3
缩写
| 缩写 | 描述 |
| 3TC | (LMV)；(-)-β-2’-脱氧-3’-硫代胞苷 |
| ADV | 阿德福韦二匹伏酯 |
| DAPD | 二氨基嘌呤dioxalone |
| DXG | dioxalone鸟嘌呤 |
| ETV | 恩替卡韦 |
| FAM | 泛昔洛韦 |
| FCV | 泛昔洛韦 |
| FTC | 恩曲他滨 |
| HBIG | 乙型肝炎免疫球蛋白 |
| HBsAg | 乙型肝炎表面抗原 |
| HBV | 乙型肝炎病毒 |
| LMV | 拉米夫定 |
| PMEA | 9-[膦酰基-甲氧基乙基]-腺嘌呤；阿德福韦 |
| PMPA | 9-R-(2-膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤 |
| RNA酶 | 核糖核酸酶 |
| rt(在“Xaa1nXaa2”之前的“rt”表示逆转录酶) | 逆转录酶 |
| s(在突变例如sF134V中使用) | 包膜基因 |
| TFV | 富马酸替诺福韦二匹伏酯 |
| YMDD | Tyr Met Asp Asp-在聚合酶蛋白质中的基序；其中Met残基指定为逆转录酶的残基编号204 |
附图简述
图1是显示了部分双链DNA HBV基因组的图示，其中显示了编码表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X基因的重叠开放读码框。
图2是ADV的化学结构的图示。
图3显示了在ADV治疗过程中在来自患者A的连续样品中编码聚合酶基因催化区的HBV核苷酸序列的比较(样品A)。
图4显示了在ADV治疗过程中在来自患者A的连续样品中聚合酶基因催化区的推导的氨基酸序列的比较(样品A)。
图5显示了在ADV治疗过程中在来自患者A的连续样品中包膜基因的推导的氨基酸序列的比较(样品A)。
图6显示了在ADV治疗过程中在来自患者A的连续样品中编码聚合酶基因催化区的HBV核苷酸序列的比较(样品B)。
图7显示了在ADV治疗过程中在来自患者A的连续样品中聚合酶基因催化区的推导的氨基酸序列的比较(样品B)。
图8显示了在ADV治疗过程中在来自患者A的连续样品中包膜基因的推导的氨基酸序列的比较(样品B)。
图9显示了在ADV和LMV治疗过程中在来自患者B的连续样品中编码聚合酶基因催化区的HBV核苷酸序列的比较。
图10显示了在ADV和LMV治疗过程中在来自患者B的连续样品中聚合酶基因催化区的推导的氨基酸序列的比较。
图11显示了在ADV和LMV治疗过程中在来自患者B的连续样品中包膜基因的推导的氨基酸序列的比较。
图12表示了在ADV治疗过程中在来自患者C的样品中编码聚合酶基因催化区的HBV核苷酸序列。
图13表示了在ADV治疗过程中在来自患者C的样品中聚合酶基因催化区的推导的氨基酸序列。
图14表示了在ADV治疗过程中在来自患者C的样品中包膜基因的推导的氨基酸序列。
图15是随着时间过去(从第一次抗病毒治疗开始后的天数)HBVDNA水平(病毒载量)和ALT增加的图解表示。
图16表示了在ADV和LMV治疗过程中在来自患者D的样品中编码聚合酶基因催化区的HBV核苷酸序列。
图17表示了在ADV和LMV治疗过程中在来自患者D的样品中聚合酶基因催化区的推导的氨基酸序列。
图18表示了在ADV和LMV治疗过程中在来自患者D的样品中包膜基因的推导的氨基酸序列。
发明详述
本发明部分基于在用ADV或LMV或ETV或更具体而言ADV和LMV或TFV和LMV，或ETV和可选地一种或多种其他核苷类似物或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂例如TFV或FTC治疗患者后，鉴定和分离核苷或核苷酸类似物抗性HBV变异体。特别地，经ADV或ADV和LMV或ETV治疗的患者产生显示出对下列物质的敏感性降低或减少的HBV变异体：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。在本文中当关于对ADV和/或LMV和/或FTC和/或TFV和/或ETV的敏感性提及“降低”或“减少”包括并涵盖对核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的完全或实质抗性以及部分抗性，并包括在核酸或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂存在下超过野生型的复制速率或复制效率。在一个方面，这通过在治疗过程中病毒载量的增加来方便地测量，或备选地，在治疗过程中从治疗前的HBV DNA水平开始HBV DNA病毒载量基本上没有减少(即，对治疗无应答)。
因此，本发明的一个方面提供了分离的乙型肝炎病毒(HBV)变异体，其中所述变异体包括导致在由所述变异体编码的蛋白质中的氨基酸添加、置换和/或缺失的核苷酸突变，并且其中所述变异体显示出对选自下列的一种或多种核苷或核苷酸类似物的敏感性降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；和ADV和FTC和LMV和TFV和ETV。
特别地，突变在DNA聚合酶或表面抗原(S基因产物)中。
因此，本发明的一个方面考虑了分离的乙型肝炎病毒(HBV)变异体，其中所述变异体在编码DNA聚合酶的基因中包含导致对所述DNA聚合酶的至少一个氨基酸添加、置换和/或缺失的核苷酸突变，并且其中所述变异体显示出对选自下列的一种或多种核苷或核苷酸类似物的敏感性降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。
本发明的一个进一步的方面提供了用于测定HBV显示出对选自ADV、LMV、TFV和FTC或ETV的核苷或核苷酸类似物和除LMV以外的另一种类似物或其组合或可选地其他核苷或核苷酸类似物的敏感性降低的可能性的方法，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，所述突变导致在所述DNA聚合酶的结构域F以及A到E中的任何一个或多个或者与其接近区域中的至少一个氨基酸置换、缺失和/或添加，并与对ADV、LMV、TFV、FTC中的一种或多种的抗性或降低的敏感性相关，和/或其中此类突变的存在是对所述ADV、LMV、TFV和/或FTC和/或ETV中的一种或多种和除LMV以外的另一种核苷或核苷酸类似物的抗性的可能性的指示。
在详细描述本发明之前，应当理解，除非另有说明，本发明不限于具体的组分制剂、制备方法、给药方案等，如此可以改变。还应当理解，本文使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的并不希望是限制性的。
必须指出，如本说明书中使用的，单数形式“a”、“an”和“the”包括复数方面，除非上下文另外清楚地指定。因此，例如，提及“anucleoside or nucleotide analog”时，包括单种类似物以及两种或更多种类似物；提及“an HBV variant”时，包括两种或更多种HBV变异体；等等。
在描述和要求保护本发明中，下列术语依照下文所示的定义进行使用。
术语“类似物”、“化合物”、“活性剂”、“药理学活性剂”、“药剂”、“活性成分”和“药物”在本文中可互换地用于指引起所需效应例如抑制病毒复制、感染、维持、装配和/或抑制酶例如HBV DNA聚合酶的功能的化学化合物。该术语还涵盖本文具体提及的那些活性剂的药学上可接受的和药理学活性的成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、药物前体、活性代谢物、类似物等。当使用术语“类似物”、“化合物”、“活性剂”、“药理学活性剂”、“药剂”、“活性成分”和“药物”时，那么应当理解这包括活性剂本身以及药学上可接受的、药理学活性的盐、酯、酰胺、药物前体、代谢物、类似物等。
因此本发明考虑了在抑制HBV复制、感染、维持、装配和/或酶例如HBV DNA聚合酶的功能中有用的化合物。当提及“类似物”、“化合物”、“活性剂”、“药理学活性剂”、“药剂”、“活性成分”和“药物”时，包括例如ADV，LMV，TFV，ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。“组合”还包括两部分的或更多例如多部分的抗HBV治疗组合物，其中试剂分开提供并分开给出或分配或在分配之前混合在一起。
如本文使用的，术语“有效量”和“治疗有效量”的试剂指对于提供抑制HBV复制、感染、维持、装配和/或酶例如HBV DNA聚合酶的功能的所需治疗或生理效应来说足够的量的试剂。此外，“HBV抑制有效量”或“症状改善有效量”的试剂是对于直接或间接抑制复制、感染、维持、装配和/或酶例如HBV DNA聚合酶的功能来说足够的量的试剂。不希望的效应，例如副作用，有时连同所需疗效一起表现出来；因此，从业者在决定什么是合适的“有效量”时要平衡潜在利益对潜在危险。确切的需要量将从受试者到受试者发生变化，取决于受试者的种类、年龄和一般状况以及施用方式等。因此，无法指定确切的“有效量”。然而，任何个别情况下的合适的“有效量”可以由本领域普通技术人员仅使用常规试验来决定。
“药学上可接受的”载体、赋形剂或稀释剂指由不是生物学上或其他方面不希望的材料组成的药学媒介物，即该材料可以连同所选择的活性剂一起施用给受试者，而不引起任何或实质上的不利反应。载体可以包括赋形剂及其他添加剂例如稀释剂、去污剂、着色剂、湿润或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
类似地，如本文提供的化合物的“药理学上可接受的”盐、酯、酰胺、药物前体或衍生物为不是生物学上或其他方面不希望的盐、酯、酰胺、药物前体或衍生物。
如本文使用的，术语“治疗”指减少症状的严重度和/或频率、消除症状和/或根本原因、预防症状出现和/或其根本原因、以及改善或补救与HBV感染有关的损害。因此，例如“治疗”患者涉及通过抑制HBV复制、感染、维持、装配和/或酶例如HBV DNA聚合酶的功能来预防HBV感染以及治疗在临床上有HBV症状的个体。因此，例如，“治疗”具有HBV感染或倾向于形成HBV感染的患者的本方法包括预防HBV感染以及治疗HBV感染或其症状。在任何情况下，本发明考虑了HBV感染的治疗或预防。
如本文使用的，“患者”指可以从本发明的制剂和方法获益的动物，优选哺乳动物，和更优选灵长类动物，包括较低级的灵长类动物，和更加优选人。不管是人还是非人动物，患者可以称为个体、受试者、动物、宿主或受者。本发明的化合物和方法可应用于人医学、兽医学，以及一般地驯养或野生动物畜牧业。为了方便起见，“动物”包括鸟类例如家禽(包括鸭、鸡、火鸡和鹅)、饲养鸟或猎鸟。非人动物中的病状可以不是天然存在的HBV感染，而是可以诱导HBV样感染。
如上文指出的，优选的动物是人，非人灵长类动物例如狨猴、狒狒、猩猩，较低级的灵长类动物例如tupia，家畜类动物，实验室试验动物，伴侣动物或捕获的野生动物。人是最优选的靶。然而，可以使用非人动物模型。
实验室试验动物的例子包括小鼠、大鼠、兔、豚鼠和仓鼠。兔和啮齿类动物例如大鼠和小鼠，提供了如灵长类动物和较低级的灵长类动物一样方便的测试系统或动物模型。家畜类动物包括绵羊、牛、猪、山羊、马和驴。还考虑了非哺乳类的动物例如鸟类、斑马鱼、两栖动物(包括甘蔗蟾蜍(cane toads))和果蝇(Drosophila)类例如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)。不用活动物模型，试验系统还可以包括组织培养系统。
“抗HBV试剂”包括核苷或核苷酸类似物、蛋白质、化学化合物、RNA或DNA或RNAi或siRNA寡核苷酸(DNA衍生的或合成的)。
优选地，降低的敏感性是就ETV而言的。备选地，降低的敏感性是就ADV或LMV而言的。备选地，降低的敏感性是就TFV而言的。备选地，降低的敏感性是就FTC而言的。备选地，降低的敏感性是就ETV和除单独的LMV以外的另一种核苷或核苷酸类似物而言的。备选地，降低的敏感性是就ADV和TFV和可选地ETV而言的。备选地，降低的敏感性是就LMV和TFV和可选地ETV而言的。备选地，降低的敏感性是就ADV和FTC和可选地ETV而言的。备选地，降低的敏感性是就FTC和TFV和可选地ETV而言的。备选地，降低的敏感性是就FTC和LMV和可选地ETV而言的。备选地，降低的敏感性是就ADV和LMV和TFV和可选地ETV而言的。备选地，降低的敏感性是就ADV和TFV和FTC和可选地ETV而言的。备选地，降低的敏感性是就LMV和TFV和FTC和可选地ETV而言的。备选地，降低的敏感性是就ADV和LMV和FTC和可选地ETV而言的。备选地，降低的敏感性是就ADV和FTC和TFV和LMV和可选地ETV而言的。本发明没有扩展至显示出对单独的ETV或单独的ETV和LMV的抗性或降低的敏感性的HBV变异体。
本文提及的“抗HBV试剂”包括核苷和核苷酸类似物以及免疫学反应物(例如针对HBV表面组分的抗体)以及化学的、蛋白质的和核酸的试剂，其抑制或者干扰病毒复制、维持、感染、装配或释放。本文提及的“核酸”包括有义或反义分子，RNA或DNA，寡核苷酸和RNAi和siRNA分子以及包含其的复合物。
除了在编码DNA聚合酶的基因中的突变外，由于HBV基因组的重叠性质(图1)，相应突变还可以存在于编码S基因(编码表面抗原(HBsAg))的基因中，导致免疫学反应物例如抗体和免疫细胞与HBsAg的相互作用活性降低。免疫学反应物与病毒表面组分的相互作用活性的降低一般包括识别或基本上识别病毒表面组分的免疫记忆的缺乏。因此，本发明扩展至显示出对下列物质的敏感性降低的HBV变异体：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合；或者显示出免疫学反应物与HBsAg的相互作用活性降低的HBV变异体，其中在ADV和/或LMV的组合或顺次治疗后选择所述变异体。术语“顺次”在这方面指，ADV，随后为LMV和/或TFV和/或ETV，和/或FTC、LMV，随后为ADV和/或TFV和/或FTC和/或ETV或ETV，随后为ADV、FTC、LMV和/或TFV中的一种或多种，或ETV、ADV、LMV和/或TFV和/或FTC中每一种的多重顺次施用。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
因此，病毒变异体可以携带只在DNA聚合酶基因中或者在DNA聚合酶基因和S基因中的突变。术语“突变”以其最广泛的范围理解并且包括多重突变。
本发明扩展至HBV DNA聚合酶的突变和任何结构域，特别是区域F和G，以及结构域A到E，条件是所述突变导致对ADV和/或LMV和/或TFV和/或ETV和/或FTC或其组合的敏感性降低。
在本说明书中，特别提及的DNA聚合酶的保守区，如结构域A到E所限定的。区域A到E由澳大利亚专利号734831的式II中所示氨基酸序列限定。
优选地，突变导致HBV DNA聚合酶的结构域F和G以及结构域A到E中的任何一个或多个或者与其接近区域中的氨基酸序列发生改变。
本发明的另一方面提供了在其基因组的重叠开放读码框中包含突变的HBV变异体，其中所述突变在由HBV DNA聚合酶的结构域F和G以及结构域A到E中的任何一个或多个所限定的区域中，并且其中所述变异体显示出对下列物质的敏感性降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
本发明的另一优选方面考虑了在编码HBsAg的核苷酸序列中包含突变的HBV变异体，所述突变导致所述HBsAg中的氨基酸添加、置换和/或缺失，其中所述变异体显示出对下列物质的敏感性降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
更具体而言，本发明提供了变异体HBV，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与来自参考或野生型HBV的表面抗原相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中针对参考或野生型表面抗原而产生的抗体显示出用于中和所述HBV变异体的能力降低，所述变异体通过使受试者暴露于下列物质来进行选择：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
术语“联合疗法”指在同一组合物中或在分开的组合物中同时共施用ADV、LMV、FTC、TFV和/或ETV的组合。术语“顺次疗法”指两种试剂以任一顺序在相互间间隔数秒、数分钟、数小时、数天或数周内施用。顺次治疗还涵盖了用ADV、LMV、FTC、TFV或ETV中的任一种来完成一个治疗过程，并随后用ADV、LMV、FTC、TFV或ETV中的另一种来完成第二个或第三个或后续治疗过程。
因此，本发明的另一方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ADV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另一方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于LMV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于FTC治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于TFV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ADV和LMV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ADV和TFV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ADV和ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的一个进一步的方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于LMV和TFV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的一个更进一步的方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于LMV和ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另一方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ADV和FTC治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于TFV和FTC治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于TFV和ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于FTC和LMV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于FTC和ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ADV、LMV和TFV和/或ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ADV、LMV和TFV和/或ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的一个进一步的方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ADV、LMV和FTC和/或ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另一方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于FTC、LMV和TFV和/或ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ADV、FTC和TFV和/或ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
本发明的另外一个方面考虑了HBV变异体，其包含的表面抗原所具有的氨基酸序列与治疗前的HBV相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中变异体HBV的表面抗原与治疗前的HBV相比显示出改变的免疫学特性，其中所述变异体HBV通过使受试者暴露于ADV、LMV、FTC和TFV和/或ETV治疗或经由一种或多种其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
优选地，变异体是分离的形式，从而它们已经历了至少一个纯化步骤，与天然存在的体液相分离。备选地，变异体可以维持在分离的体液中或可以是DNA形式。本发明还考虑了包括来自变异体HBV的基因组或其部分的传染性分子克隆。此外，本发明提供了从变异体HBVs中分离的组分，例如但不限于分离的HBsAg。因此，本发明提供了分离的HBsAg或其重组形式或其衍生物或化学等价物，所述HBsAg来自通过使受试者暴露于ADV、LMV、FTC、TFV和/或ETV中的一种或多种或可选地一种或多种核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂而选择出的变异体HBV。
更具体而言，本发明的另外一个方面旨在分离的变异体HBsAg或其重组或衍生形式或其化学等价物，其中所述HBsAg或其重组或衍生形式或其化学等价物显示出相比来自参考HBV的HBsAg而言改变的免疫学特性，所述HBsAg来自通过使受试者暴露于ADV、LMV、FTC、TFV和/或ETV中的一种或多种或可选地一种或多种核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂而选择出的变异体HBV。
更加具体而言，本发明提供了分离的变异体HBsAg或其重组或衍生形式或其化学等价物，其中所述HBsAg或其重组或衍生形式或其化学等价物所包含的氨基酸序列与来自参考HBV的HBsAg相比含有单个或多个氨基酸置换、添加和/或缺失或截短，并且其中针对参考HBV的中和抗体显示出对于携带所述变异体HBsAg的HBV没有中和活性或中和活性降低，所述HBsAg来自通过使受试者暴露于ADV、LMV、FTC、TFV和/或ETV中的一种或多种或可选地一种或多种核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂而选择出的变异体HBV。
HBV DNA聚合酶中的优选突变包括在用下列物质治疗后从具有HBV复发的患者中选择出的变异体：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂可以在移植操作程序(例如骨髓移植(BMT)或OLT)期间、之后或之前或在治疗经诊断具有肝炎的患者后给予。在选择出变异体后，可以以类似于治疗前水平的水平获得病毒载量，或者尽管在治疗中仍增加。
rt区域中的有用突变体在一个实施方案中包括在下列密码子处的突变：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250，例如rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V和rtN236T，在另一个实施方案中包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V和rtH248N，或另外一个实施方案包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V和rtM250L，或另外一个实施方案包括rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变。特别有用的突变体是rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N或rtM250L。
此类HBV变异体被提议显示出对下列物质的敏感性降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。应当指出，关于氨基酸位置的命名系统基于被指定为密码子rtM204的在YMDD基序中的甲硫氨酸残基。这种编号系统不同于澳大利亚专利号734831中的那种，其中在聚合酶基因内的YMDD基序中的甲硫氨酸残基被指定密码子550。在这方面，rtL180M和rtM204V分别对应于澳大利亚专利号734831中的L526M和M550V。相应的突变还可以发生在包膜基因例如PreS1、PreS2和S中的一个或多个之中。
ADV以及其他非环状核苷膦酸的另一种可能的作用方式是免疫刺激的那种(Calio等人，Antiviral Res.23：77-89，1994)。许多突变导致HBV变异体中检测到包膜基因中的变化，其可能与免疫逃避相关联。这些变化在一个实施方案中包括在下列密码子处的突变：stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210，例如sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M，并且在另一个实施方案中包括sT118A、sP120T、sP127A和sI195M，或另外一个实施方案包括sT114P、sI195M、sS204N、sI208T和sS210R，或另外一个实施方案包括sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R，或其组合或等价突变，或其组合或等价突变。
本发明的变异体的鉴定使得能够产生一系列测定法来检测此类变异体。此类变异体的检测在鉴定抗性变异体中可能是重要的，以确定合适的化学治疗形式和/或监控疫苗接种方案，或开发新型或改良的疫苗制剂。
本发明的另外一个方面考虑了用于测定HBV显示出对下列物质的敏感性降低的可能性的方法：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，所述突变导致在所述DNA聚合酶的结构域F和G以及结构域A到E中的任何一个或多个或者与其接近区域中的至少一个氨基酸置换、缺失和/或添加，并与对下列物质的抗性或降低的敏感性相关：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
因此，本发明的另一方面提供了用于测定HBV显示出对选自ADV、LMV、TFV和FTC和ETV的核苷或核苷酸类似物和除单独的LMV以外的另一种核苷或核苷酸类似物或可选地其他核苷或核苷酸类似物的敏感性降低的可能性的方法，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，所述突变导致在所述DNA聚合酶的结构域F以及A到E中的任何一个或多个或者与其接近区域中的至少一个氨基酸置换、缺失和/或添加，并与对ADV、LMV、TFV、FTC和/或ETV中的一种或多种的抗性或降低的敏感性相关，其中此类突变的存在是对所述ADV、LMV、TFV和/或FTC和/或ETV中的一种或多种和除单独的LMV以外的另一种类似物的抗性的可能性的指示。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
优选地，测定法检测在下列密码子处的一个或多个突变：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250，例如rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V和rtN236T，在另一个实施方案中包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V和rtH248N，或另外一个实施方案包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V和rtM250L，或另外一个实施方案包括rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L，或其组合或等价突变，其是突变体的指示，其中所述变异体显示出对下列物质的敏感性降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。
因此，本发明的另一方面提出了用于测定HBV毒株是否显示出对核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的敏感性降低的方法，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在编码DNA聚合酶的核苷酸序列和/或S基因的相应区域中筛选突变，其中存在选自下列的突变：在一个实施方案中包括在密码子stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210，例如sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M处的突变，并且在另一实施方案中包括sT118A、sP120T、sP127A和sI195M，或另外一个实施方案包括sT114P、sI195M、sS204N、sI208T和sS210R，或另外一个实施方案包括sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R或其组合或等价突变，在另外一个实施方案中包括rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V和rtN236T，在另一实施方案中包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V和rtH248N，或另外一个实施方案包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V和rtM250L，或另外一个实施方案包括rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变，或其组合或等价的一种或多种其他突变，是变异体显示出对下列物质的敏感性降低的指示：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。
本发明的一个进一步的方面提出了用于测定HBV毒株是否显示出对核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的敏感性降低的方法，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在编码DNA聚合酶的核苷酸序列和/或S基因的相应区域中筛选突变，其中存在选自下列的突变：在一个实施方案中，在密码子stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210，例如sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M处的突变，并且在另一实施方案中包括sT118A、sP120T、sP127A和sI195M，或另外一个实施方案包括sT114P、sI195M、sS204N、sI208T和sS210R，或另外一个实施方案包括sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R或其组合或等价突变，在另外一个实施方案中包括rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V和rtN236T，在另一实施方案中包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V和rtH248N，或另外一个实施方案包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V和rtM250L，或另外一个实施方案包括rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变，其组合或等价的一种或多种其他突变，是变异体显示出对下列物质的敏感性降低的指示：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。
细胞、细胞裂解物、培养物上清液和体液中HBV或其组分的检测可以通过任何方便的方法，包括任何基于核酸的检测方法，例如，通过核酸杂交技术或经由一次或多次聚合酶链式反应(PCRs)。术语“体液”包括来源于血液、淋巴、组织或器官系统的任何液体，包括血清、全血、活组织检查和活组织检查液体、器官外植体和器官悬浮液例如肝悬浮液。本发明进一步涵盖了所述基于核酸的检测方法的不同测定法形式的用途，尤其是包括限制性片段长度多态性(RFLP)、扩增片段长度多态性(AFLP)、单链构象多态性(SSCP)、扩增和错配检测(AMD)、散布重复序列聚合酶链式反应(IRS-PCR)、反向聚合酶链式反应(iPCR)和逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)。其他检测形式包括Northern印迹法、Southern印迹法、PCR测序、抗体操作程序例如ELISA、Western印迹法和免疫组织化学。特别有用的测定法包括对于由固定的寡核苷酸或寡肽介导的检测系统所需的反应物和组分。
一种特别有用的核酸检测系统是反向杂交技术。在这种技术中，来自HBV样品的DNA使用生物素或其他经配体标记的引物来进行扩增以产生经标记的扩增子。然后将与固体支持物例如硝化纤维素薄膜固定的寡核苷酸用于通过杂交来捕获扩增的DNA。经由生物素或配体来鉴定特异的核酸片段。一般地，经标记的引物对于待检测的特定核苷酸变异来说是特异的。扩增只在待检测的变异存在时发生。存在许多形式的反向杂交测定法，并且全都由本发明所涵盖。
本发明考虑的另一方面提供了用于检测显示出改变的免疫学特性的变异体HBV的方法，所述方法包括从暴露于选自下列的核苷或核苷酸类似物的受试者中分离HBV：ADV，LMV，TFV，ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，然后使所述HBV与一组针对表面抗原的一种或多种抗体接触，并筛选结合亲和力或结合谱的任何变化。
在一个相关实施方案中，本发明考虑了用于检测显示出改变的免疫学特性的变异体HBV的方法，所述方法包括从暴露于选自下列的核苷或核苷酸类似物的受试者中分离血清样品：ADV，LMV，TFV，ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，然后使血清与一组HBV表面抗原或其抗体结合片段接触，并筛选结合亲和力或结合谱的任何变化。
检测细胞培养物中的HBV复制是特别有用的。
本发明的这个和其他方面特别顺应于微阵列分析，例如从而鉴定下调HBV的基因组序列或转录物的寡核苷酸，包括有义和反义分子、RNAi或siRNA分子或DNA或RNA结合分子。微阵列分析还可以用于鉴定HBV基因组中例如在HBV DNA聚合酶编码区或HBsAg编码区内的特定突变。
本发明的另一方面考虑了用于检测显示出对于HBV的抑制活性的试剂的方法，其包括：
产生包含在质粒载体中的遗传构建体，所述遗传构建体包含在能够复制方面来说有效量的来自HBV的基因组，然后用所述构建体转染所述细胞；
在转染之前、期间和/或之后使所述细胞接触待测试的试剂；
以一定的时间和条件培养所述细胞，所述时间和条件足够所述HBV复制、表达基因序列和/或装配和/或释放病毒或病毒样颗粒，如果对所述试剂有抗性；和
然后对所述细胞、细胞裂解物或培养物上清液实施病毒或病毒组分检测方法，以确定所述病毒在所述试剂存在下是否已复制、表达遗传材料和/或装配和/或释放。
在一个优选实施方案中，所述质粒载体可以包括编码部分或全部其他病毒载体例如杆状病毒或腺病毒的基因(Ren和Nassal，2001，同上)，并且该方法包括：
产生遗传构建体，所述遗传构建体包含在能够复制方面来说有效量的来自HBV的基因组，所述HBV基因组被包含在对于感染细胞来说有效的量的杆状病毒基因组或腺病毒基因组中或与之融合，然后用所述构建体转染所述细胞；
在感染之前、期间和/或之后使所述细胞接触待测试的试剂；
以一定的时间和条件培养所述细胞，所述时间和条件足够所述HBV复制、表达基因序列和/或装配和/或释放病毒或病毒样颗粒，如果对所述试剂有抗性；和
然后对所述细胞、细胞裂解物或培养物上清液实施病毒或病毒组分检测方法，以确定所述病毒在所述试剂存在下是否已复制、表达遗传材料和/或装配和/或释放。
在一个备选实施方案中，该方法包括：
产生以在能够复制方面来说有效的量包含HBV基因组的传染性拷贝的连续细胞系，从而使得所述传染性HBV基因组稳定整合到所述连续细胞系中，例如但不限于2.2.15或AD；
使所述细胞接触待测试的试剂；
以一定的时间和条件培养所述细胞，所述时间和条件足够所述HBV复制、表达基因序列和/或装配和/或释放病毒或病毒样颗粒，如果对所述试剂有抗性；和
然后对所述细胞、细胞裂解物或培养物上清液实施病毒或病毒组分检测方法，以确定所述病毒在所述试剂存在下是否已复制、表达遗传材料和/或装配和/或释放。
上文提及的方法在鉴定或开发针对HBV变异体的试剂中特别有用，所述HBV变异体例如为携带突变的那些，在一个实施方案中，突变在下列密码子处：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或r tM250，例如rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V和rtN236T，在另一实施方案中包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V和rtH248N，或另外一个实施方案包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V和r tM250L，或另外一个实施方案包括rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变，或其组合或等价突变；在一个进一步的实施方案中，突变在下列密码子处：stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210，例如sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M，并且在另一实施方案中包括sT118A、sP120T、sP127A和sI195M，或另外一个实施方案包括sT114P、sI195M、sS204N、sI208T和sS210R，或另外一个实施方案包括sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R或其组合或等价突变。
因此，本发明的另一方面考虑了用于测定HBV毒株是否显示出对核苷或核苷酸类似物或其他可能的抗HBV试剂的敏感性降低的方法，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在包膜基因或DNA聚合酶基因的核苷酸序列中筛选突变，所述突变选自：在一个实施方案中，在密码子rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250，例如rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V和rtN236T处的突变，在另一实施方案中包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V和rtH248N，或另外一个实施方案包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V和rtM250L，或另外一个实施方案包括rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L，或其组合或等价突变，或其组合或等价突变；在一个进一步的实施方案中，在密码子stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210，例如sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M处的突变，并且在另一实施方案中包括sT118A、sP120T、sP127A和sI195M，或另外一个实施方案包括sT114P、sI195M、sS204N、sI208T和sS210R，或另外一个实施方案包括sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R或其组合或等价突变和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。
DNA聚合酶的氨基酸变异体的检测通过一系列氨基酸检测技术来方便地完成。当HBV变异体包含氨基酸变化时，那么此类分离物被视为具有改变的DNA聚合酶活性的推定的HBV变异体。
本发明进一步考虑了抑制对下列物质具有抗性的HBV变异体的试剂：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，抗性HBV变异体。如果临床医生考虑使用ADV、LMV、FTC、TFV和/或ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物例如TFV进行长期治疗，那么此类试剂是特别有用的。所述试剂可以是DNA或RNA或蛋白质性质或非蛋白质性质的化学分子。例如从植物、珊瑚和微生物中筛选天然产物也被考虑作为掩蔽剂的有用的潜在来源，如筛选组合或化学文库一样。所述试剂可以是分离的形式或者药物组合物或制剂的形式，并且可以代替核苷或核苷酸类似物进行施用，或者与核苷或核苷酸类似物顺次或同时施用。此外，考虑了推理性药物设计，包括解析例如HBV DNA聚合酶的晶体或NMR结构，并设计可以结合该酶的活性位点的试剂。这种方法还可以进行调整以适合于其他HBV组分。
因此，本发明的另一方面考虑了用于检测显示出对HBV的抑制活性的试剂的方法，所述HBV显示出对下列物质的抗性或降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，所述方法包括：
产生包含在质粒载体中的遗传构建体，所述遗传构建体包含在能够复制方面来说有效量的来自HBV的基因组，然后用所述构建体转染所述细胞；
在转染之前、期间和/或之后使所述细胞接触待测试的试剂；
以一定的时间和条件培养所述细胞，所述时间和条件足够所述HBV复制、表达基因序列和/或装配和/或释放病毒或病毒样颗粒，如果对所述试剂有抗性；和
对所述细胞、细胞裂解物或培养物上清液实施病毒或病毒组分检测方法，以确定所述病毒在所述试剂存在下是否已复制、表达遗传材料和/或装配和/或释放。
本发明的另外一个方面提供了用于检测显示出对HBV的抑制活性的试剂的方法，所述HBV显示出对下列物质的抗性或降低的敏感性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，所述方法包括：
产生遗传构建体，所述遗传构建体包含在能够复制方面来说有效量的来自HBV的基因组，所述HBV基因组被包含在对于感染细胞来说有效的量的杆状病毒基因组中或与之融合，然后用所述构建体转染所述细胞；
在感染之前、期间和/或之后使所述细胞接触待测试的试剂；
以一定的时间和条件培养所述细胞，所述时间和条件足够所述HBV复制、表达基因序列和/或装配和/或释放病毒或病毒样颗粒，如果对所述试剂有抗性；和
对所述细胞、细胞裂解物或培养物上清液实施病毒或病毒组分检测方法，以确定所述病毒在所述试剂存在下是否已复制、表达遗传材料和/或装配和/或释放。
优选地，HBV基因组稳定地整合到细胞基因组中。
特别有用的细胞是2.2.15细胞(Price等人，Proc.Natl Acad.Sci USA 86(21)：8541-8544，1989)或AD细胞(也称为HepAD32细胞或HepAD79细胞[Ying等人，2000同上])。
尽管杆状病毒载体在实践本发明中特别有用，但本发明可扩展至一系列其他载体，例如但不限于腺病毒载体。
本发明进一步扩展至携带遗传构建体的细胞系(例如2.2.15或AD细胞)，所述遗传构建体包含HBV基因组的全部或部分或来自其的基因或基因的部分。
本发明还提供了主题HBV变异体用于筛选抗病毒剂的用途。这些抗病毒剂抑制所述病毒。术语“抑制”包括拮抗或以者防止感染、复制、装配和/或释放或任何中间步骤。优选的抗病毒剂包括核苷或核苷酸类似物或抗HBV试剂，然而，本发明可扩展至非核苷分子。
另外，还考虑了推理性药物设计以鉴定或产生模拟核苷或与特定核苷酸序列或特定核苷酸相互作用的化学分子。组合化学和双杂交筛选是可以用于鉴定潜在治疗或诊断试剂的许多技术中的一些。
在一个例子中，聚合酶或表面抗原的晶体结构或NMR结构用于推理性地设计可能与对于功能和/或抗原性来说所需的分子的关键区域相互作用的小化学分子。此类试剂可以用作聚合酶活性的抑制剂和/或可以改变表面抗原上的表位。
由于与来自HIV的逆转录酶的相似性已制备了HBV聚合酶的几种模型(Das等人，J.Virol.75(10)：4771-4779，2001；Bartholomeusz等人，Intervirology 40(5-6)：337-3421997；Allen等人，Hepatology27(6)：1670-1677，1998)。HBV聚合酶的模型可以用于新型试剂的推理性药物设计，所述新型试剂针对编码抗性突变的HBV以及野生型病毒是有效的。经设计的推理性药物可以基于现有抗病毒剂的修饰，例如在选择编码与抗性相关的突变的HBV中使用的试剂。表达编码突变的HBV基因组材料的病毒或克隆还可以用于筛选新型抗病毒剂。
在一个备选实施方案中，本发明还考虑了用于检测在体外聚合酶测定法中显示出对HBV聚合酶的抑制活性的试剂的方法。HBV聚合酶活性可以使用已建立的测定法来检查(Gaillard等人，AntimicrobAgents Chemother.46(4)：1005-1013，2002；Xiong等人，Hepatology28(6)：1669-73，1998)。
如上文指出的，微阵列技术也是鉴定能够与指定的HBV内部或外部组分相互作用的试剂的有用手段。例如，HBV DNA聚合酶或其携带不同氨基酸变异体的肽片段的阵列可以用于筛选能够结合或者与这些分子相互作用的试剂。这是测定试剂在HBV变异体之间的差别结合模式的方便方法。抗体阵列还可以用于筛选改变的HBsAg分子。微阵列还可用于蛋白质组分析中以鉴定能够与HBV组分相互作用的分子例如抗体、干扰素或细胞因子。DNA和RNA分子的微阵列还可以用于鉴定对于HBV基因组上的基因区域或其转录物的有义和反义分子。
上文的方法特别可用于鉴定对下列物质具有抗性或显示出降低的敏感性的HBV的抑制剂：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或可任选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。因此，本发明扩展至抑制剂的组合物。抑制剂还可以是用于共抑制或诱导RNAi的抗体或遗传分子例如核酶、反义分子和/或有义分子的形式，或者可以是其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或已知类似物的衍生物。RNAi包括短干扰RNAs(siRNA)，并且所有RNAi-型分子可以是DNA-衍生的或合成的。
术语“组合物”包括“药物组合物”或制剂。
抑制剂在下文中称为“活性成分”或“活性化合物”，并且可以选自上文给出的抑制剂。
组合物可以包括HBV的抗原性组分、缺陷型HBV变异体或通过天然产物筛选或推理性药物设计(包括组合化学)而鉴定的试剂。
药学上可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。对于药学活性物质使用此类介质和试剂是本领域众所周知的。除了在任何常规介质或试剂与活性成分不相容的情况下，否则考虑其在治疗组合物中的使用。补充性活性成分也可以掺入组合物中。
药物组合物还可以包括遗传分子例如能够转染靶细胞的载体，其中所述载体携带能够编码天冬氨酰蛋白酶抑制剂的核酸分子。载体可以是例如病毒载体。
适合于注射使用的药物形式包括无菌水溶液(当是水溶性的时候)和用于即时制备无菌注射液的无菌粉末。它在制备和贮存条件下必须是稳定的，并且必须受到保护以抗微生物例如细菌和真菌的污染性作用。载体可以是溶剂或稀释介质，包括例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。适当的流动性可以例如通过使用表面活性剂来维持。微生物作用的预防可以通过各种抗菌剂和抗真菌剂来达到，例如对羟基苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等。在许多情况下，将优选包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可注射组合物的延长吸收可以通过在组合物中使用延长吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达到。
无菌注射液通过下列方式来制备：以所需量向含有活性成分以及可选地其他活性成分(当需要时)的合适溶剂中掺入活性化合物，随后为过滤灭菌或其他合适的灭菌方法。在用于制备无菌注射液的无菌粉末的情况下，合适的制备方法包括真空干燥和冷冻干燥技术，这产生活性成分加上任何另外所需成分的粉末。
当活性成分经适当保护时，它可以例如与惰性稀释剂或与可同化的可食用载体一起口服施用，或者它可以包封入硬或软壳明胶胶囊中，或者它可以压缩成片剂。对于口服治疗施用，活性成分可以与赋形剂相混合，并以可摄取的片剂、口含片剂、锭剂、胶囊、酏剂、悬浮液、糖浆剂、糯米纸囊剂等的形式使用。此类组合物和制剂应当包含至少1重量％的活性化合物。组合物和制剂的百分比当然可以改变，并且可以方便地为约5-约80％的单位重量。在此类治疗上有用的组合物中的活性化合物的量是这样的，即使得将获得合适的剂量。制备优选的根据本发明的组合物或制剂，从而使得口服剂量单位形式包含约0.1μg-200mg的活性化合物。备选的剂量包括约1μg-约1000mg以及约10μg-约500mg。这些剂量可以是每个个体或每kg体重的。施用可以是每小时、天、周、月或年。
片剂、锭剂、丸剂、胶囊等还可以包含如下文列出的组分。可以添加粘合剂例如树胶、阿拉伯胶、玉米淀粉或明胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；和增甜剂例如蔗糖、乳糖或糖精，或者调味剂例如薄荷油、冬青油或樱桃调味料。当剂量单位形式是胶囊时，除上述类型的材料之外，它还可以包含液体载体。可以存在各种其他材料作为包衣或以其他方式修饰剂量单位的物理形式。例如，片剂、丸剂或胶囊还可以用虫胶、糖或两者包被。糖浆剂或酏剂可以包含活性化合物、作为增甜剂的蔗糖、作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯和对羟基苯甲酸丙酯、染料和调味料。当然，在制备任何剂量单位形式中使用的任何材料应当是药学上纯的，并且在所使用的量下基本上无毒。另外，活性化合物可以掺入缓释制剂和配剂中。
如上所述，本发明进一步扩展至来自本文所述的HBV变异体的分离的HBsAg。更具体而言，本发明提供了HBsAg或其重组形式或其衍生物或化学等价物。分离的表面组分，更具体而言分离的表面抗原或其重组体、衍生物或化学等价物可用于开发生物学组合物例如疫苗制剂。
本发明的另外一个方面提供了包含变异体HBV或来自所述变异体HBV的HBV表面抗原或其重组或衍生形式或其化学等价物，以及一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂的组合物，所述变异体HBV对下列物质具有抗性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂。此类组合物可以被视为治疗组合物并且可用于产生免疫应答包括体液应答。一般地，HBV变异体是“有缺陷的”，并且其自身不能在受试者中引起持续感染。
如上文指出的，可以产生针对突变型HBV剂的抗体并且用于针对这些病毒感染的被动或直接疫苗接种。抗体可以在人或非人动物中产生。在后面一种情况下，非人抗体在使用前可能需要去免疫化(deimmunize)或更具体而言需要人源化。去免疫化可以包括例如将来自鼠类或非人动物抗HBV抗体可变区的互补性决定区(CDRs)移植到人共有片段抗体结合(Fab)多肽上。备选地，抗体可变区中限定表位的氨基酸可以进行突变，从而使得所述表位不再被人MHC II复合物识别。
在涉及核酶、反义或共抑制(RNAi)或siRNA或其复合物阻遏的情况下，这方便地旨在转录后的基因沉默。可以施用DNA或RNA，或可以使用包含对于HBV mRNA特异的RNAi或其化学类似物的复合物。
所有此类分子可以掺入药物组合物中。
在另一实施方案中，本发明提供了生物学组合物，其包含变异体HBV，或来自所述变异体HBV的HBs Ag或L、M或S蛋白或其重组或衍生形式或其化学等价物。
一般地，如果使用HBV，它首先是减毒的。根据本发明这个方面的生物学组合物一般进一步包含一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂。
生物学组合物可以包含来自一种HBV变异体的HBsAg或类似分子，或者组合物可以是来自一系列ADV和/或LMV和/或FTC和/或TFV抗性HBV变异体的HBsAg或L、M或S蛋白或类似分子的混合物(cocktail)。当组合物包含HBV时，可以应用类似内含物。
本发明进一步旨在缺陷型HBV变异体在制备用于针对HBV毒株感染进行个体疫苗接种的治疗性疫苗中的用途，所述HBV毒株具有特定的核苷酸序列或编码特定的聚合酶或表面抗原或L、M或S蛋白。
合适的疫苗候选物的例子是缺陷型的HBV变异体，其包含选自下列的突变：在一个实施方案中，在密码子rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或r tM250，例如rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V和rtN236T处的突变，在另一实施方案中包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V和rtH248N，或另外一个实施方案包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V和rtM250L，或另外一个实施方案包括rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变，或其组合或等价突变；在一个进一步的实施方案中，在密码子stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210，例如sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M处的突变，并且在另一实施方案中包括sT118A、sP120T、sP127A和sI195M，或另外一个实施方案包括sT114P、sI195M、sS204N、sI208T和sS210R，或另外一个实施方案包括sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R或其组合或等价突变。
在一个实施方案中，例如，可以鉴定在其聚合酶中具有特定突变的HBV变异体，所述突变赋予对核苷或核苷酸类似物的抗性或降低的敏感性。然后，可以突变这种变异体以使得其有缺陷，即减毒或不能引起感染。此类缺陷型的、核苷或核苷酸类似物抗性的病毒随后可以用作针对在其聚合酶中具有相同突变的强毒病毒的治疗性疫苗。
本发明扩展至用于测定法的试剂盒，所述测定法用于对下列物质具有抗性的变异体HBV：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。此类试剂盒例如可以包含用于PCR或其他核酸杂交技术的反应物或用于基于免疫学的检测技术的反应物。特别有用的测定法包括对于由固定的寡核苷酸或寡肽介导的检测系统所需的反应物和组分。
本发明的另外一个方面考虑了用于测定HBV显示出对下列物质的敏感性降低的可能性的方法：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，所述突变导致在所述DNA聚合酶的结构域F和G以及结构域A到E中的任何一个或多个或者与其接近区域中的至少一个氨基酸置换、缺失和/或添加，并与对下列物质的抗性或降低的敏感性相关：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，其中此类突变的存在是对下列物质具有抗性的可能性的指示：即所述的ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或可选地其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
潜在的病毒变异体的评估对于选择合适的治疗方案是重要的。借助于用软件进行编程的计算机适当地促进此类评估，所述软件特别添加与病毒变异体有关的至少两种特征的输入码，以提供对应于病毒变异体对特定化学化合物或免疫学试剂的抗性或敏感性的值。该值可以选自(a)显示出对特定化合物或免疫学试剂的抗性或降低的敏感性的能力；(b)相比野生型HBV而言改变的DNA聚合酶；(c)相比野生型HBV而言改变的表面抗原；或(d)患者的发病率或恢复可能性。因此，依照本发明，关于此类特征的值存储于机器可读存储介质中，其能够处理这些数据以提供关于特定病毒变异体或包括其的生物样品的值。
因此，在另一方面，本发明考虑了计算机程序产品，其用于评估病毒变异体或包括其的生物样品用于确定受试者中的合适治疗方案的可能的有效性(图15)，所述产品包括：
(1)接受与所述病毒剂或包括其的生物样品有关的至少两种特征的输入码的代码，其中所述特征选自：
(a)显示出对特定化合物或免疫学试剂的抗性或降低的敏感性的能力；
(b)相比野生型HBV而言改变的DNA聚合酶；
(c)相比野生型HBV而言改变的表面抗原；或
(d)患者的发病率或恢复可能性；
(2)合计所述输入码以提供相应于所述病毒变异体或生物样品的值的总和的代码；和
(3)存储所述代码的计算机可读介质。
在一个相关方面，本发明扩展至计算机，其用于评估病毒变异体或包括其的生物样品在受试者中的可能的有效性，其中所述计算机包括：
(1)包含由机器可读数据编码的数据存储材料的机器可读数据存储介质，其中所述机器可读数据包括与所述病毒变异体或生物样品有关的至少两种特征的输入码，其中所述特征选自：
(a)显示出对特定化合物或免疫学试剂的抗性或降低的敏感性的能力；
(b)相比野生型HBV而言改变的DNA聚合酶；
(c)相比野生型HBV而言改变的表面抗原；或
(d)患者的发病率或恢复可能性；
(2)用于存储用于处理所述机器可读数据的指令的工作存储器；
(3)与所述工作存储器和所述机器可读数据存储介质相偶联的中央处理器，以用于处理所述机器可读数据从而提供相应于所述化合物的值的所述输入码的总和；和
(4)与所述中央处理器相偶联的输出硬件，用于接受所述值。
本发明考虑了任何一般或专用的计算机系统，并包括与存储器和至少一种输入/输出设备例如终端设备具有电联系的处理器。图15显示了一般合适的计算机系统。此类系统可以包括但不限于个人计算机、工作站或大型机。处理器可以是执行位于RAM存储器中的程序的通用处理器或微处理器或专门处理器。程序可以置于来自存储设备例如磁盘或预编程的ROM存储器的RAM中。在一个实施方案中，RAM存储器用于数据存储和程序执行。计算机系统还包含这样的系统，在所述系统中处理器和存储器位于不同物理实体中，但借助于网络而具有电联系。
在一个备选实施方案中，所述程序筛选选自下列的突变：在一个实施方案中，在密码子rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或r tM250，例如rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V和rtN236T处的突变，在另一实施方案中包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V和rtH248N，或另外一个实施方案包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V和rtM250L，或另外一个实施方案包括rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变，或其组合或等价突变；在一个进一步的实施方案中，在密码子stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210，例如sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M处的突变，并且在另一实施方案中包括sT118A、sP120T、sP127A和sI195M，或另外一个实施方案包括sT114P、sI195M、sS204N、sI208T和sS210R，或另外一个实施方案包括sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R或其组合或等价突变。
本发明通过下列非限制性实施例进一步描述。
实施例1
HBV的重叠基因组
HBV的重叠基因组显示于图1中。编码DNA聚合酶的基因(P)与病毒包膜基因Pre-S1和Pre-S2重叠，并与X和核心(C)基因部分重叠。HBV包膜包括小、中和大蛋白HBV表面抗原。所述大蛋白组分称为HBV表面抗原(HBsAg)并由S基因序列编码。Pre-S1和Pre-S2基因序列编码其他包膜组分。
实施例2
用ADV治疗的患者以及HBV DNA的分析
患者A：在ADV治疗过程中，使用实施例4中描述的方法通过PCR扩增测序来检测独特的HBV突变；(表4)。在检测的quasspecies中存在进化。最初对ADV(样品A)进行选择的突变谱包括在rtN53K、rtY54D、rtL180M、rtT184S和rtM204V处的独特突变。关键的独特突变是rtT184S。随后，在样品B中检测到不同的ADV抗性谱rtN53K/N、rtL180M、rtT181A/V和rtN236T。关键的独特突变是rtT181A/V，以及先前在ADV抗性患者中检测到的rtN236T(表4，图3、4、5、6、7和8)。
检测到了HBsAg中的变化，包括样品A中的sT45K、sL175F、sI195M，以及后续样品B中的sT45K和sL173L/F。将这些独特变化与来自8种基因型A-H中每一种的参考序列以及来自治疗前样品的共有序列进行比较以确定独特的变化。
患者B：在ADV治疗过程中的HBV突变列于表5以及图9、10和11中。在HBV DNA聚合酶的rt区域中关键的独特变化包括rtS202C和rtH248N。在ADV治疗时在HBV聚合酶中的其他变化包括rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M和rtM204V。在ADV治疗时在HBsAg中的变化包括sT118A、sP120T、sP127A和sI195M。
患者C：在ADV治疗过程中的HBV突变列于表6以及图12、13和14中。在HBV DNA聚合酶的rt区域中关键的独特变化包括rtM250L。在ADV治疗时在HBV聚合酶中的其他独特变化包括rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M和rtM204V。在ADV治疗时在HBsAg中的变化包括sT114P、sI195M、sS204N、sI208T和sS210R。
患者D：这名患者最初已选择出在rtN236T处的ADV抗性突变(Angus等人，Gastroenterology 125(2)：292-7.2003)。这名患者随后用ADV和LMV进行治疗。在组合抗病毒疗法过程中存在病毒学反弹(breakthrough)(参见图15，其显示了随着时间过去(从第一次抗病毒治疗开始后的天数)HBV DNA水平(病毒载量)和ALT增加的图解表示)。在双重ADV和LMV治疗过程中的HBV突变列于表7以及图16、17和18中。通过HBV基因组的PCR扩增和直接测序，HBV DNA聚合酶的rt区域中的独特变化包括rtD134V、rtN139E/K、rtI233V、rtM250L。这些与在rtA181V和rtN236T处的已知ADV抗性突变相伴发生。关键的独特突变包括rtI233V和rtM250L。在ADV和LMV治疗时在HBV聚合酶中的所有独特变化包括rtN53D、rtS116P、rtD134V、rtN139E、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L。对编码聚合酶基因的PCR扩增产物进行克隆分析，所述聚合酶基因来自在病毒学反弹时分离的HBV(参见实施例15)。在这种PCR扩增产物中检测到在rtS85A处的进一步关键突变，还检测到作为次要种类的在rtN139K/E和rtQ149K处的其他突变(表7脚注)。
在ADV和LMV治疗时在HBsAg中的变化包括sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、sS210R。
实施例3
病毒标记物的检测
乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、抗HBe和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)特异性IgG和IgM使用商购可得的免疫测定法(Abbott Laboratories，North Chicago，IL，USA)来测量。乙型肝炎病毒DNA水平使用捕获杂交测定法根据制造商的指导(Digene Hybrid Capture II，Digene Diagnostics Inc.，Beltsville，MD)来测量。制造商规定的用于检测临床样品中的HBV病毒血症的截断值为0.7×106个拷贝/ml或2.5pg/ml[Hendricks等人，Am J ClinPathol 104：537-46，1995]。HBV DNA水平还可以使用其他商品化试剂盒例如Cobas扩增HBV监控试剂盒(Roche)来进行定量。
实施例4
HBV DNA的测序
如先前Aye等人，J.Hepatol.26：1148-1153，1997所述从100μl血清中提取HBV DNA。寡核苷酸由Geneworks，Adelaide，Australia合成。HBV聚合酶基因或完整HBV基因组的扩增已由Aye等人，1997(同上)和Ayres等人，Methods Mol Med.95：125-49，2004描述。
特异性的扩增产物使用例如来自MO BIO Laboratories Inc(LaJolla，CA)的PCR纯化柱进行纯化，并使用Big Dye terminator Cyclesequencing Ready Reaction Kit(Perkin Elmer，Cetus Norwalk，CT)直接进行测序。PCR引物用作测序引物，OS1 5′-GCC TCA TTT TGTGGG TCA CCA TA-3′(nt1408-1430)[SEQ ID NO：1]，TTA3 5′-AAA TTCGCA GTC CCC AAA-3′(nt2128-2145)[SEQ ID NO：2]，JM 5′-TTG GGGTGG AGC CCT CAG GCT-3′(nt1676-1696)[SEQ ID NO：3]，TTA4 5′-GAAAAT TGG TAA CAG CGG-3′(nt2615-2632)[SEQ ID NO：4]，OS2 5′TCTCTG ACA TAC TTT CCA AT 3′(nt2798-2817)[SEQ ID NO：5]，以测定PCR产物的内部区域的序列。
实施例5
阿德福韦二匹伏酯(ADV)
ADV(以前称为Bis-pom PMEA)是HBV复制的有效抑制剂。ADV的结构显示于图2中，并且其合成由Benzaria等人，J Med Chem.39：4958-4965，1996进行了描述。
实施例6
抗病毒抗性的体外分析
使用重组HBV/杆状病毒在体外检查HBV突变体对阿德福韦、替诺福韦及其他抗病毒剂的敏感性/抗性特性。用于分析抗性特性的操作程序在下列实施例7-14中描述。
实施例7
细胞培养
于28℃在含有CO2的增湿温育箱中，将Sf21昆虫细胞维持在进一步补充有10％v/v热灭活胎牛血清(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)的补充型Grace氏昆虫培养基中。将HepG2细胞维持在补充有10％v/v热灭活胎牛血清的最小必需培养基(MEM-FBS)中。HepG2细胞在增湿的37℃温育箱中在5％v/v CO2下生长。
实施例8
含有特定点突变的HBV/杆状病毒转移载体的制备
用于抗病毒测试的重组HBV/杆状病毒系统先前已描述(Delaney等人，Antimicrob Agents Chemother 45(6)：1705-1013，2001)。简而言之，重组转移载体通过下列方式来制备：切除包含1.3x HBV基因组构建体的片段，并将其克隆到杆状病毒载体pBlueBac4.5(Invitrogen，Carlsbad，CA)的多克隆区域内。使用商品化试剂盒并根据制造商的说明(QuikChange，Stratagene)通过位点定向诱变来形成点突变。所述质粒的核苷酸序列以及通过位点定向诱变产生的点突变通过使用ABI Prism Big Dye Terminator Cycle SequencingReady Reaction Kit并根据制造商的说明(Perkin Elmer，CetusNorwalk，CT)进行测序来证实。该组HBV突变体通过位点定向诱变从野生型(WT)基因型D HBV分离物产生。突变体编码WT HBV聚合酶或在HBeAg阴性(前核[PC]G1896A突变体)背景中含有列于表8中的氨基酸置换的聚合酶。其他HBV突变体可以以类似方式制备并就抗病毒敏感性进行测试。
实施例9
包含1.3HBV构建体的重组杆状病毒的产生
使用来自Invitrogen(Carlsbad，CA)的BacNBlue转染试剂盒，将纯化的重组转移载体和线性AcMNPV杆状病毒DNA共转染到Sf21细胞中；根据制造商的说明书通过空斑测定法来分离重组病毒。通过感染100-mm培养皿的Sf21细胞从分离的空斑中扩增出一系列重组病毒。使用标准操作程序从扩增的病毒中提取病毒DNA。纯化的病毒DNA用限制性内切酶进行消化，并随后在1％v/v琼脂糖凝胶中通过电泳来进行分级。进行Southern印迹法以确定哪个病毒分离物包含完整的1.3HBV构建体。Boehringer Mannheim Random Prime DNA Labeling试剂盒(Indianapolis，IN)用于产生[P32]-放射标记的探针。将全长双链HBV基因组用作关于所有经放射标记的探针的模板。病毒DNA序列通过聚合酶催化区的PCR扩增和测序来证实。
实施例10
制备的杆状病毒的扩增和纯化
通过以0.5pfu/细胞的感染复数(moi)感染对数期的Sf21细胞悬浮培养物来扩增杆状病毒。允许进行感染直至烧瓶中的大部分细胞显示出明显的感染迹象(4-5天)。通过在80,000xg下离心从感染的Sf21培养基中浓缩病毒粒子，并通过20-60％w/v的蔗糖梯度进行纯化。纯化的病毒通过终点稀释在Sf21细胞中一式四份地进行滴定。将每个高滴度贮液的等分试样用于DNA提取。扩增聚合酶基因，并进行测序以证实位点定向诱变的存在。
实施例11
用表达杆状病毒的重组HBV与抗病毒剂
一起感染(即转导)HepG2细胞
在大约20-40％的汇合时种植HepG2细胞，并随后在感染前生长16-24小时。在感染当天，一式三份的细胞平板进行胰蛋白酶消化，并使用台盼蓝排除法用血细胞计数器测定活细胞数目。计算平均细胞计数，并用于确定对于以所标明的moi感染细胞所需的高滴度病毒贮液的体积。HepG2细胞用无血清MEM洗涤1次以去除痕量血清。将杆状病毒稀释到无血清的MEM中以达到适当的moi，使用1.0、0.5和0.25ml的体积来分别感染100-mm、60-mm和35-mm培养皿。于37℃让杆状病毒吸附至HepG2细胞1小时，伴随每15分钟的轻微摇动，以确保接种物平均分配。然后抽吸出接种物，和将HepG2细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次，并重新给予含或不含各种浓度的试剂的MEM-FBS。
借助于杆状病毒载体用WT或突变型HBV转染复制的HepG2细胞培养物，并随后连续暴露于不同浓度的每种药物7天。对于每种测定法，5种不同浓度的每种药物一式两份地进行测试。关于核苷类似物(LMV、FTC、L-dT和ETV)的药物浓度为(nM)1、10、100、1,000和10,000。关于核苷酸类似物(ADV和TFV)，所使用的浓度为100、500、1,000、5,000和10,000nM。一式两份未处理的培养物充当对照。培养7天后，提取DNA并进行分析。
实施例12
分泌的HBV抗原的分析
乙型肝炎e抗原(HBeAg)的检测通过使用从Abbott Laboratories(Abbott Park，IL，USA)购买的试剂盒进行放射免疫测定法和微粒酶免疫测定法来施行。收集来自HepG2细胞的培养基，在6,000g下离心以去除细胞碎片，转移至干净的管中，并贮存于20℃直至分析。HBeAg值表示为阳性对照的倍数。适当稀释培养基样品，从而使得放射免疫测定法结果低于关于HBeAg的阳性对照值。
实施例13
细胞内复制中间体的检测
从在0.5％w/v NP-40中裂解的HepG2细胞的细胞质级分中分离HBV核心颗粒。将细胞质提取物调整至10mmol/l McC 12，并通过与500g/ml蛋白酶K一起于37℃孵育1.5小时来去除未保护的DNA。然后，通过使用商品化DNA提取试剂盒例如Qiagen(DNA提取)或采用连续苯酚和氯仿提取的内部(in-house)方法来提取样品中的HBV DNA，并通过乙醇沉淀来回收核酸。将核酸重悬浮于50μl/l TE(10mmol/lTris，1mmol/l乙二胺四乙酸)中，通过OD260进行标准化，并于37℃用100g/ml RNA酶(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)消化1小时，然后通过实时PCR或电泳和使用全长[32P]-标记的HBV的Southern印迹法进行分析，并借助于Bio-Rad磷成像屏(phosphorimaging screen)进行放射自显影。使用配备有“QuantityOne”软件的Bio-Rad Model FX Molecular Imager记录并分析图像。
经药物处理的细胞中的HBV DNA量表示为未处理对照中的HBV DNA平均量的分数，所述未处理对照基于图像密度被定义为1.0。对来自一式两份重复的成对值进行平均以产生对于3个独立测定法中每一个的单个值，由其计算平均值和标准差。所得到的数据使用TableCurve2D进行分析，这产生剂量应答曲线，由其估计EC50、EC90和AUC(曲线下面积)。
实施例14
用野生型和编码聚合酶突变的HBV/杆状病毒
进行抗病毒测试
所述抗病毒剂对该组突变体的影响显示于表9中。抗病毒测试显示，以前对于ETV而选择出的在与LMV抗性突变体相关的密码子184和202处的突变也影响对ADV和TDF的敏感性。184和202突变通过使用单独的ADV治疗的患者进行选择(参见患者A和B)。编码其他突变的HBV将使用类似方法进行测试。
实施例15
在抗病毒治疗过程中选择出的
HBV聚合酶突变体的克隆分析
在LMV和ADV治疗的病毒学反弹时进行克隆分析以确定多重HBV突变是否在患者D的相同基因组上。使用引物OS1和OS2(参考实施例4)分开扩增逆转录酶/聚合酶的催化结构域，并如先前所述(Ayres等人，2004，同上)进行测序。根据制造商的指示，将从这些样品中获得的OS1/OS2 PCR产物克隆到PCRScript Amp SK+(Stratagene)中。从每个克隆直接进行PCR扩增，并且如上所述，对每种样品，使用OS1/OS2 PCR引物作为测序引物来对PCR产物进行测序。在ADV单一疗法失败期间，患者先前选择出rtN236T和rtA181T。在双重ADV和LMV抗性时，通过扩增完整基因组和直接测序检测的突变谱包括rtN53D、rtS116P、rtD134V、rtN139E、rtA181V、rtI233V、rtN236T、rtM250L。rtN236T和rtA181T在100％的克隆中检测到。检测到两种主要克隆谱：分别为，在55％的克隆中的rtN139E+rtQ149K+rtM250L+rtI233V，和在45％的克隆中的rtS85A+rtN139K+rtN238D。通过在HBV基因组的最初扩增中的直接测序以及PCR测序没有检测到在rtS85A处的关键突变以及在rtN139E/K和rtQ149K处的突变，但通过克隆以及用于克隆分析的PCR产物的直接测序而检测到。
如先前在ETV治疗过程中选择出在密码子rt250处的另一种突变一样，rtM250L突变可以影响对恩替卡韦的敏感性。在与HIV逆转录酶的序列比对中，rtI233V位于与HIV密码子215类似的位置中(Batholomeusz等人，Antivir Ther.9(2)：149-6，2004)。在ADV和LMV联合疗法的病毒学反弹时的克隆分析中没有检测到rtM204I/V+/-rtL180M LMV抗性突变。
本领域技术人员将理解，本文描述的本发明容许除本文具体描述的那些以外的变化和修改。应当理解，本发明包括所有此类变化和修改。本发明还包括在本说明书中个别地或共同地提及或指出的所有步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两种或更多种所述步骤或特征的任何和所有组合。
表4
在ADV治疗过程中检测到的
患者A的HBV聚合酶和包膜突变
| 治疗 | HBV RT突变 | HBs Ag突变 |
| LMVADV前 | rtM132LrtL/M180MrtA/V200AM/I204M | sT189I/TsL/P192LsT195T/IsW/L196L |
| ADV | rtN53KrtY54DrtL180MrtT184T/SrtA200A/VrtM204M/I/V | sT45KsL175FsI195M |
| ADV(样品A) | rtN53KrtY54DrtL180MrtT184SrtM204V | sT45KsL175FsI195M |
| ADV(样品B) | rtN53K/NrtL180MrtT181A/VrtN236T | sT45KsL173L/F |
表5
在ADV治疗过程中检测到的
患者B的RT和聚合酶突变
| 治疗 | HBV RT突变 | HBsAg突变 |
| ADV | rtY124HrtH126R，rtT128NrtS135C，rtL180MrtS202C，rtM204VrtH248N | sT118AsP120TsP127AsI195M |
表6
在ADV治疗过程中检测到的
患者C的RT和聚合酶突变
| 治疗 | HBV RT突变 | HBs Ag突变 |
| ADV | rtI16TrtI53VrtS54TrtN122TrtM145LrtL180MrtM204VrtM250L～ | sT114PsI195MsS204NsI208TsS210R |
表7
在ADV和LMV治疗过程中通过直接PCR扩增测序检测到的
患者D的RT和聚合酶突变*
| 治疗 | HBV RT突变 | HBsAg突变 |
| ADV和LMV | rtN53D，rtS116P，rtD134V，rtL180M，rtA181V，rtN238D | sL173FsS204G，sS210R |
| ADV和LMV*(最初治疗开始后1946天) | rtN53D，rtS116P，rtD134V，rtN139E，rtA181VrtS219A，rtI233V，rtN236T，rtM250L | sV14A，sG130R，sM133T，sW172L，sS204G，sS210R |
*在克隆分析中，关键突变在rtS85A处，并且还检测到作为次要种类的在rtN139K/E和rtQ149K处的其他突变。
表8
HBV突变体的描述
表9
抗病毒结果概括
参考书目
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<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>1
gcctcatttt gtgggtcacc ata 23
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>2
aaattcgcag tccccaaa 18
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>3
ttggggtgga gccctcaggc t 21
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>4
gaaaattggt aacagcgg 18
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>5
tctctgacat actttccaat 20
<210>6
<211>1023
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>6
caagcgccag tcaggaaggc agcctacccc gctgtctcca cctttgagaa acacgcatcc 60
tcaggccacg cagtggaaca ccacaacctt ccaccaaact ctgcaagatc ccagagtgaa 120
aggcctgtat ttccctgctg gtggctccag ttcaggaaca gtaaaccctg ttccgactac 180
tgcctctccc ttatcgtcaa tcttctcgag gattggggac cctgcactga acatggagaa 240
catcacatca ggactcctag gaccccttct cgtgttacag gcggggtttt tcttgttgac 300
aaaaatcctc acaataccgc agagtctaga ctcgtggtgg acttctctca attttctagg 360
gggaaagacc gtgtgtcttg gccaaaattc gcagtcccca acctccaatc actcaccaac 420
ctcctgtcct ccaacttgtc ctggttatcg ctggatgtgt ctgcggcgtt ttatcatctt 480
cctcttcatc ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt cttctggact atcaaggtat 540
gttgcccgtg tgtcctctaa ttccaggatc ctcaaccacc agcacgggac catgccgaac 600
ctgcacgact cctgctcaag gaacctctat gtatccctcc tgttgctgta ccaaaccttc 660
ggacggaaat tgcacctgta ttcccatccc atcatcctgg gctttcggaa aattcctatg 720
ggagtgggcc tcagcccgtt tctcatggct cagttttcta gtgccatttg ttcagtggtt 780
cgtagggctt tcccccactg tttggctttc agttatgtgg atgatgtggt attgggggcc 840
aagtctgtac agcatcttga gtcccttttt accgctgtta ccaattttct tttgtctttg 900
ggtatacatt taaatcctaa caaaacaaaa cgatggggtt actctctgaa ttttatgggt 960
tatgtcattg gatgttatgg gtccttgcca caagaacaca tcgtacaaaa aatcaaagaa 1020
tgt 1023
<210>7
<211>341
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>7
Gln Ala Pro Val Arg Lys Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe Glu
1 5 10 15
Lys His Ala Ser Ser Gly His Ala Val Glu His His Asn Leu Pro Pro
20 25 30
Asn Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp Trp
35 40 45
Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser Leu
50 55 60
Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Thr Glu His Gly Glu
65 70 75 80
His His Ile Arg Thr Pro Arg Thr Pro Ser Arg Val Thr Gly Gly Val
85 90 95
Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val
100 105 110
Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Lys Asp Arg Val Ser Trp Pro
115 120 125
Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser
130 135 140
Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu
145 150 155 160
Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly
165 170 175
Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Val Ser Ser Asn Ser Arg Ile Leu Asn
180 185 190
His Gln His Gly Thr Met Pro Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn
195 200 205
Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu
210 215 220
His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met
225 230 235 240
Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Met Ala Gln Phe Ser Ser Ala Ile
245 250 255
Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr
260 265 270
Val Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser
275 280 285
Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu
290 295 300
Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly
305 310 315 320
Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Glu His Ile Val Gln
325 330 335
Lys Ile Lys Glu Cys
340
<210>8
<211>303
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>8
Lys Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu Arg
1 5 10 15
Asn Thr His Pro Gln Ala Thr Gln Trp Asn Thr Thr Thr Phe His Gln
20 25 30
Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Lys Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly
35 40 45
Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Leu
50 55 60
Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn
65 70 75 80
Ile Thr Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe
85 90 95
Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp
100 105 110
Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Lys Thr Val Cys Leu Gly Gln
115 120 125
Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro
130 135 140
Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe
145 150 155 160
Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp
165 170 175
Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr
180 185 190
Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr
195 200 205
Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys
210 215 220
Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp
225 230 235 240
Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Phe Leu Val Pro Phe
245 250 255
Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Met
260 265 270
Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro
275 280 285
Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
290 295 300
<210>9
<211>985
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>9
aaatccgcct cctgcctcca ccaakcgcca gtcaggaagg cagcctaccc cgctgtctcc 60
acctttgaga aacacgcatc ctcaggccac gcagtggaac accacaacct tccaccaaac 120
tctgcaagat cccagagtga aaggcctgta tttccctgct ggtggctcca gttcaggaac 180
agtaaaccct gttccgacta ctgcctctcc cttatcgtca atcttctcga ggattgggga 240
ccctgcactg aacatggaga acatcacatc aggactccta ggaccccttc tcgtgttaca 300
ggcggggttt ttcttgttga caaaaatcct cacaataccg cagagtctag actcgtggtg 360
gacttctctc aattttctag ggggaamtac cgtgtgtctt ggccaaaatt cgcagtcccc 420
aacctccaat cactcaccaa cctcctgtcc tccaacttgt cctggttatc gctggatgtg 480
tctgcggcgt tttatcatct tcctcttcat cctgctgcta tgcctcatct tcttgttggt 540
tcttctggac tatcaaggta tgttgcccgt gtgtcctcta attccaggat cctcaaccac 600
cagcacggga ccatgccgaa cctgcacgac tcctgctcaa ggaacctcta tgtatccctc 660
ctgttgctgt accaaacctt cggacggaaa ttgcacctgt attcccatcc catcatcctg 720
ggctttcgga aaattcctat gggagtgggc ctcagcccgt ttctcmtggy tcagtttact 780
agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt cagttatatg 840
gatgatgtgg tattgggggc caagtctgta cagcatcttg agtccctttt taccgctgtt 900
accaattttc ttttgtcttt gggtatacat ttaaccccta acaaaacaaa acgatggggt 960
tactctctga attttatggg ttatg 985
<210>10
<211>332
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>10
Lys Ser Ala Ser Cys Leu His Gln Ala Ser Pro Val Arg Lys Ala Ala
1 5 10 15
Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe Glu Lys His Ala Ser Ser Gly His Ala
20 25 30
Val Glu His His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu
35 40 45
Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro
50 55 60
Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser Leu Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp
65 70 75 80
Gly Pro Cys Thr Glu His Gly Glu His His Ile Arg Thr Pro Arg Thr
85 90 95
Pro Ser Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His
100 105 110
Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg
115 120 125
Gly Lys Asn Tyr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu
130 135 140
Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu
145 150 155 160
Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met
165 170 175
Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg
180 185 190
Val Ser Ser Asn Ser Arg Ile Leu Asn His Gln His Gly Thr Met Pro
195 200 205
Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu
210 215 220
Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile
225 230 235 240
Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe
245 250 255
Leu Met Leu Ala Val Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg
260 265 270
Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val
275 280 285
Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val
290 295 300
Thr Asn Phc Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Thr Pro Asn Lys Thr
305 310 315 320
Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr
325 330
<210>11
<211>313
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>11
Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Lys Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro
1 5 10 15
Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Thr Gln
20 25 30
Trp Asn Thr Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Lys
35 40 45
Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro
50 55 60
Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Leu Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly
65 70 75 80
Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Leu Leu Gly Pro
85 90 95
Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr
100 105 110
Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly
115 120 125
Gly Asn Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser
130 135 140
Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp
145 150 155 160
Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys
165 170 175
Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val
180 185 190
Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg
195 200 205
Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys
210 215 220
Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser
225 230 235 240
Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe
245 250 255
Ser Trp Leu Phe Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly
260 265 270
Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp
275 280 285
Gly Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro
290 295 300
Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
305 310
<210>12
<211>1043
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>12
atttcctcct cctgcctcca ccaatcggca gtcaggaagg cagcctactc ccatctctcc 60
acctctaaga gacagtcatc ctcaggccat gcagtggaat tccactgcct tccaccaagc 120
tctgcaggat cccagagtca ggggtctgta tcttcctgct ggtggctcca gttcagaaac 180
agtaaaccct gctccgaata ctgcctctca catatcgtca atctccgcga ggactgggga 240
ccctgtgacg aacatggaga acatcacatc aggactccta ggacccctgc tcgtgttaca 300
ggcggggttt ttcttgttga caagaatcct cacaataccg cagagtctag actcgtggtg 360
gacttctctc agttttctag gggggtcacc cgtgtgtctt ggccaaaatt cgcagtcccc 420
aacctccaat cactcaccaa cctcctgtcc tccaacttgt cctggttatc gctggatgtg 480
tctgcggcat tttatcatat tcctcttcat cctgctgcta tgcctcatct tcttattggt 540
tcttctggat tatcaaggta tgttgcccgt ttgtcctcta attccaggat caccaacaac 600
cagtacggga ccatgcaaaa cctgcacgac tcctgctcaa ggcaactcta tgtttccctc 660
ctgttgctgt acaaaaccta cggatggaaa ttgcacctgt attcccatcc catcgtcctg 720
ggctttcgca aaatacctat gggagtgggc ctcagtccgt ttctcatggc tcagtttact 780
agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt cagctatgtg 840
gatgatgtgg tattgggggc caaatctgta cagcaccgtg aggcccttta taccgctgtt 900
accaattttc ttttgtctct gggtatacat ttaaacccta acaaaacaaa aagatggggt 960
tattccctaa acttcctggg ttacataatt ggcagttggg gaacattacc acaggatcat 1020
attgtacaaa agatcaaaca ctg 1043
<210>13
<211>347
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>13
Ile Ser Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Ala Ala Tyr
1 5 10 15
Ser His Leu Ser Thr Ser Lys Arg Gln Ser Ser Ser Gly His Ala Val
20 25 30
Glu Phe His Cys Leu Pro Pro Ser Ser Ala Gly Ser Gln Ser Gln Gly
35 40 45
Ser Val Ser Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys
50 55 60
Ser Glu Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Arg Glu Asp Trp Gly
65 70 75 80
Pro Cys Asp Glu His Gly Glu His His Ile Arg Thr Pro Arg Thr Pro
85 90 95
Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn
100 105 110
Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly
115 120 125
Val Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser
130 135 140
Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val
145 150 155 160
Ser Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His
165 170 175
Leu Leu Ile Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser
180 185 190
Ser Asn Ser Arg Ile Thr Asn Asn Gln Tyr Gly Thr Met Gln Asn Leu
195 200 205
His Asp Ser Cys Ser Arg Gln Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr
210 215 220
Lys Thr Tyr Gly Trp Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Val Leu
225 230 235 240
Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Met
245 250 255
Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro
260 265 270
His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Val Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys
275 280 285
Ser Val Gln His Arg Glu Ala Leu Tyr Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu
290 295 300
Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly
305 310 315 320
Tyr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Tyr Ile Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu
325 330 335
Pro Gln Asp His Ile Val Gln Lys Ile Lys His
340 345
<210>14
<211>310
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>14
Phe Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr
1 5 10 15
Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp
20 25 30
Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly
35 40 45
Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Glu Thr Val Asn Pro Ala
50 55 60
Pro Asn Thr Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp
65 70 75 80
Pro Val Thr Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu
85 90 95
Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
100 105 110
Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Ser Phe Leu Gly Gly
115 120 125
Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His
130 135 140
Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys
145 150 155 160
Leu Arg His Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile
165 170 175
Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro
180 185 190
Leu Ile Pro Gly Ser Pro Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys
195 200 205
Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
210 215 220
Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
225 230 235 240
Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
245 250 255
Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro
260 265 270
Thr Val Trp Leu Ser Ala Met Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Asn
275 280 285
Leu Tyr Ser Thr Val Arg Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe
290 295 300
Cys Leu Trp Val Tyr Ile
305 310
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acctctaaga gacagtcatc ctcaggccat gcagtggaat tccactgcct tccaccaagc 120
tctgcaggat cccagagtca ggggtctgta tcttcctgct ggtggctcca gttcagaaac 180
agtaaaccct gctccgaata ctgcctctca catatcgtca atctccgcga ggactgggga 240
ccctgtgacg aacatggaga acatcacatc aggactccta ggacccctgc tcgtgttaca 300
ggcggggttt ttcttgttga caagaatcct cacaataccg cagagtctag actcgtggtg 360
gacttctctc agttttctag gggggtcacc cgtgtgtctt ggccaaaatt cgcagtcccc 420
aacctccaat cactcaccaa cctcctgtcc tccaacttgt cctggttatc gctggatgtg 480
tctgcggcat tttatcatat tcctcttcat cctgctgcta tgcctcatct tcttattggt 540
tcttctggat tatcaaggta tgttgcccgt ttgtcctcta attccaggat caccaacaac 600
cagtacggga ccatgcaaaa cctgcacgac tcctgctcaa ggcaactcta tgtttccctc 660
ctgttgctgt acaaaaccta cggatggaaa ttgcacctgt attcccatcc catcgtcctg 720
ggctttcgca aaatacctat gggagtgggc ctcagtccgt ttctcatggc tcagtttact 780
agtgccattt gttcagtggt tcgtagggct ttcccccact gtttggcttt cagctatgtg 840
gatgatgtgg tattgggggc caaatctgta cagcaccgtg aggcccttta taccgctgtt 900
accaattttc ttttgtctct gggtatacat ttaaacccta acaaaacaaa aagatggggt 960
tattccctaa acttcctggg ttacataatt ggcagttggg gaacattacc acaggatcat 1020
attgtacaaa agatcaaaca ctg 1043
<210>16
<211>347
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>16
Ile Ser Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Ala Ala Tyr
1 5 10 15
Ser His Leu Ser Thr Ser Lys Arg Gln Ser Ser Ser Gly His Ala Val
20 25 30
Glu Phe His Cys Leu Pro Pro Ser Ser Ala Gly Ser Gln Ser Gln Gly
35 40 45
Ser Val Ser Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys
50 55 60
Ser Glu Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Arg Glu Asp Trp Gly
65 70 75 80
Pro Cys Asp Glu His Gly Glu His His Ile Arg Thr Pro Arg Thr Pro
85 90 95
Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn
100 105 110
Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly
115 120 125
Val Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser
130 135 140
Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val
145 150 155 160
Ser Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His
165 170 175
Leu Leu Ile Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser
180 185 190
Ser Asn Ser Arg Ile Thr Asn Asn Gln Tyr Gly Thr Met Gln Asn Leu
195 200 205
His Asp Ser Cys Ser Arg Gln Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr
210 215 220
Lys Thr Tyr Gly Trp Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Val Leu
225 230 235 240
Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Met
245 250 255
Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro
260 265 270
His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Val Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys
275 280 285
Ser Val Gln His Arg Glu Ala Leu Tyr Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu
290 295 300
Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly
305 310 315 320
Tyr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Tyr Ile Ile Gly Ser Trp Gly Thr Leu
325 330 335
Pro Gln Asp His Ile Val Gln Lys Ile Lys His
340 345
<210>17
<211>310
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>17
Phe Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr
1 5 10 15
Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp
20 25 30
Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly
35 40 45
Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Glu Thr Val Asn Pro Ala
50 55 60
Pro Asn Thr Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp
65 70 75 80
Pro Val Thr Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu
85 90 95
Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
100 105 110
Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Ser Phe Leu Gly Gly
115 120 125
Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His
130 135 140
Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys
145 150 155 160
Leu Arg His Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile
165 170 175
Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro
180 185 190
Leu Ile Pro Gly Ser Pro Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys
195 200 205
Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
210 215 220
Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
225 230 235 240
Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
245 250 255
Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro
260 265 270
Thr Val Trp Leu Ser Ala Met Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Asn
275 280 285
Leu Tyr Ser Thr Val Arg Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe
290 295 300
Cys Leu Trp Val Tyr Ile
305 310
<210>18
<211>1016
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>18
aatccgcctc ctgcctctac caatcgccag tcaggaaggc agcctacccc tcygactcca 60
cctttgagaa acactcatcc tcaggccatg yagtggaact ccacaaactt ccaccgaact 120
ctacaagatc ccagagtgaa aggcctgtat ctccctgctg gtggctccag ttcaggaaca 180
gtaaaccctg ttccgactac tgtctctcac acatcgtcaa tcttatcgag gattggggac 240
cctgcactga acatggagaa catcacatca ggattcctag gacccctgct cgcgttacag 300
gcggggtttt tctcgttgac aagaatcctc acaataccgc agagtctaga ctcgtggtgg 360
acttctctca attttctagg ggagaccacc gtgtgccttg gccaaaattc gcagtcccca 420
acctccaatc actcaccaac ctcctgtcct ccaacttgtc ctggttatcg ctggatgtgt 480
ctgcggcgtt ttatcatatt cctcttcatc ctgctgctat gcctcatctt cttgttggtt 540
cttctggact atcaaggtat gttgcccgtt tgccctctaa ttccaggatc ctcaaccacc 600
agcacgggac catgcagaac ctgcacgtct cctgctcaaa ggaactctac gtatccctcc 660
tgttgctgta caaaaccttc ggacggaaat tgcacctgta ttcccatccc atcatcctgg 720
gctttcggaa aattcctatg ggagtgggcc tcagcccgtt tctccttact cagtttacta 780
gtgccatttg ttcagtggtt cgtagggctt tcccccactg tttggctttc agttatatgg 840
atgatgtggt attgggggcc aggtctgtac agcatcgtga ggcccttttt accgctgtta 900
ccaattttct tttgtctctg ggtgtacatt taaccccgaa caaaacaaaa agatggggtt 960
actctttaca tttcctgggc tatgtcattg gatgttatgg gtcattgcca caagat 1016
<210>19
<211>338
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(30)..(30)
<223>″x″＝任何氨基酸
<400>19
Ser Ala Ser Cys Leu Tyr Gln Ser Pro Val Arg Lys Ala Ala Tyr Pro
1 5 10 15
Ser Asp Ser Thr Phe Glu Lys His Ser Ser Ser Gly His Xaa Val Glu
20 25 30
Leu His Lys Leu Pro Pro Asn Ser Thr Arg Ser Gln Ser Glu Arg Pro
35 40 45
Val Ser Pro Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser
50 55 60
Asp Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Ile Glu Asp Trp Gly Pro
65 70 75 80
Cys Thr Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala
85 90 95
Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr
100 105 110
Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asp
115 120 125
His Arg Val Pro Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu
130 135 140
Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser
145 150 155 160
Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu
165 170 175
Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Pro Ser
180 185 190
Asn Ser Arg Ile Leu Asn His Gln His Gly Thr Met Gln Asn Leu His
195 200 205
Val Ser Cys Ser Lys Glu Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Lys
210 215 220
Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly
225 230 235 240
Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Thr
245 250 255
Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His
260 265 270
Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Arg Ser
275 280 285
Val Gln His Arg Glu Ala Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu
290 295 300
Ser Leu Gly Val His Leu Thr Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr
305 310 315 320
Ser Leu His Phe Leu Gly Tyr Val Ile Gly Cys Tyr Gly Ser Leu Pro
325 330 335
Gln Asp
<210>20
<211>310
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(18)..(18)
<223>″x″＝任何氨基酸
<220>
<221>MISC_FEATURE
<222>(31)..(31)
<223>″x″＝任何氨基酸
<400>20
Asn Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr
1 5 10 15
Pro Xaa Thr Pro Pro Leu Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Xaa Trp
20 25 30
Asn Ser Thr Asn Phe His Arg Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Lys Gly
35 40 45
Leu Tyr Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val
50 55 60
Pro Thr Thr Val Ser His Thr Ser Ser Ile Leu Ser Arg Ile Gly Asp
65 70 75 80
Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu
85 90 95
Leu Ala Leu Gln Ala Gly Phe Phe Ser Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile
100 105 110
Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Glu
115 120 125
Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His
130 135 140
Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys
145 150 155 160
Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile
165 170 175
Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro
180 185 190
Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys
195 200 205
Thr Ser Pro Ala Gln Arg Asn Ser Thr Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr
210 215 220
Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
225 230 235 240
Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Leu
245 250 255
Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro
260 265 270
Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Gly
275 280 285
Leu Tyr Ser Ile Val Arg Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe
290 295 300
Cys Leu Trp Val Tyr Ile
305 310
Claims (63)
1. 分离的乙型肝炎病毒(HBV)变异体，其中所述变异体包括导致在由所述变异体编码的蛋白质中的氨基酸添加、置换和/或缺失的核苷酸突变，并且其中所述变异体显示出对选自下列的一种或多种核苷或核苷酸类似物的敏感性降低：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；和ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，条件是所述HBV变异体对单独的ETV或者单独的ETV和LMV没有抗性。
2. 权利要求1的分离的HBV变异体，其中所述突变在编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中。
3. 权利要求1的分离的HBV变异体，其中所述突变在编码表面抗原的HBV S基因中。
4. 权利要求1或2的分离的HBV变异体，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250。
5. 权利要求4的分离的HBV变异体，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：rtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248和rtM250。
6. 权利要求4的分离的HBV变异体，其中所述突变选自rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变。
7. 权利要求5的分离的HBV变异体，其中所述突变选自rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N和rtM250L。
8. 权利要求1或3的分离的HBV变异体，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210。
9. 权利要求8的分离的HBV变异体，其中所述突变选自sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M，在另一实施方案中包括sT118A、sP120T、sP127A、sI195M.sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G和sS210R。
10. 用于测定HBV显示出对下列物质的敏感性降低的可能性的方法：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在HBV核苷酸序列中筛选与对下列物质的抗性或降低的敏感性相关的突变：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，条件是所述HBV变异体对单独的ETV或者单独的ETV和LMV没有抗性。
11. 权利要求10的方法，其中所述突变在编码HBV DNA聚合酶的核苷酸序列中。
12. 权利要求10的方法，其中所述突变在编码表面抗原的HBV S基因中。
13. 权利要求10或11的方法，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250。
14. 权利要求12的方法，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：rtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248和rtM250。
15. 权利要求13的分离的HBV变异体，其中所述突变选自rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变。
16. 权利要求15的方法，其中所述突变选自rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N和rtM250L。
17. 权利要求10或12的方法，其中所述突变在下列密码子处：stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210。
18. 权利要求17的方法，其中所述突变选自sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G和sS210R。
19. 组合物，其包含变异体HBV以及一种或多种药学上可接受的载体和/或稀释剂，所述变异体HBV对下列物质具有抗性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
20. 权利要求19的组合物，其中所述变异体HBV包含突变，所述突变选自在下列密码子处的突变：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250。
21. 权利要求20的组合物，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：rtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248和rtM250。
22. 权利要求19或20的组合物，其中所述变异体HBV包括选自下列的突变：rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变。
23. 权利要求22的组合物，其中所述突变选自rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N和rtM250L。
24. 权利要求19的组合物，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210。
25. 权利要求24的组合物，其中所述突变选自sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G和sS210R。
26. 变异体HBV在制备用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染的药物中的用途，所述变异体HBV在编码DNA聚合酶或表面抗原的基因中包含导致对下列物质的敏感性降低的核苷酸突变：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
27. 权利要求26的用途，其中所述突变在HBV DNA聚合酶和/或编码表面抗原的HBV S基因中。
28. 权利要求26或27的用途，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250。
29. 权利要求26或28的用途，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：rtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248和rtM250。
30. 权利要求28的用途，其中所述突变选自rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变。
31. 权利要求29的用途，其中所述突变选自rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N和rtM250L。
32. 权利要求26或27的用途，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210。
33. 权利要求32的用途，其中所述突变选自sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L和sS204G。
34. 用于测定HBV毒株是否显示出对核苷或核苷酸类似物的敏感性降低的方法，所述方法包括从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并在编码DNA聚合酶的核苷酸序列中筛选突变，其中在rt区域中存在选自密码子rtN53、rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236和rtM250的这些突变是变异体显示出对下列物质的敏感性降低的指示：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
35. 权利要求34的方法，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250。
36. 权利要求34的方法，其中所述突变选自在下列密码子处的突变：rtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248和rtM250。
37. 权利要求36的方法，其中所述突变选自rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变。
38. 用于测定HBV毒株是否显示出对核苷或核苷酸类似物的敏感性降低的方法，所述方法包括在编码包膜基因的核苷酸序列中筛选突变，其中在s基因中存在选自密码子sT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204和sS210的这些突变是变异体显示出对下列物质的敏感性降低的指示：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，条件是所述HBV变异体对单独的ETV或者单独的ETV和LMV没有抗性。
39. 权利要求38的方法、其中所述突变选自stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210。
40. 权利要求39的方法、其中所述突变选自stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210。
41. 用于检测显示出改变的免疫学特性的变异体HBV的方法，所述方法包括从暴露于选自下列的核苷或核苷酸类似物或类似物组合的受试者中分离HBV：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，所述方法包括使所述HBV与一组针对表面抗原的一种或多种抗体接触，并筛选结合亲和力或结合谱的任何变化，条件是所述HBV变异体没有显示对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
42. 权利要求41的方法，其中所述突变在HBV DNA聚合酶或编码表面抗原的HBV S基因中。
43. 权利要求41或42的方法，其包括在下列密码子处的突变体：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250。
44. 权利要求43的方法，其包括突变，所述突变选自在下列密码子处的突变：rtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248和rtM250。
45. 权利要求43的方法，其中所述突变选自rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变。
46. 权利要求44或45的方法，其中所述突变选自rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N和rtM250L。
47. 权利要求41或42的方法，其包括在下列密码子处的突变：stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210。
48. 权利要求47的方法，其中所述突变选自sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L和sS204G。
49. 用于检测显示出改变的免疫学特性的变异体HBV的方法，所述方法包括从暴露于选自下列的核苷或核苷酸类似物的受试者中分离血清样品：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，然后使所述血清与一组HBV表面抗原或其抗体结合片段接触，并筛选结合亲和力或结合谱的任何变化，条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
50. 权利要求49的方法，其中所述突变在HBV DNA聚合酶或编码表面抗原的HBV S基因中。
51. 权利要求49或50的方法，其包括突变，所述突变选自在下列密码子处的突变：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250。
52. 权利要求49或50的方法，其包括突变，所述突变选自在下列密码子处的突变：rtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248和rtM250。
53. 权利要求51或52的方法，其中所述突变选自rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L或其组合或等价突变。
54. 权利要求52的方法，其中所述突变选自rtT184S，rtS202C，rtS219A，rtI233V，rtH248N和rtM250L。
55. 权利要求49或50的方法，其中所述突变在下列密码子处：stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、6sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204或sS210。
56. 权利要求55的分离的HBV变异体，其中所述突变选自sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L和sS204G。
57. 用于检测显示出对于HBV的抑制活性的试剂的方法，其包括产生包含在质粒载体中的遗传构建体，所述遗传构建体包含在能够复制方面来说有效量的来自HBV的基因组，然后用所述构建体转染所述细胞；在转染之前、期间和/或之后使所述细胞接触待测试的试剂；以一定的时间和条件培养所述细胞，所述时间和条件足够所述HBV复制、表达基因序列和/或装配和/或释放病毒或病毒样颗粒，如果对所述试剂有抗性；和然后对所述细胞、细胞裂解物或培养物上清液实施病毒或病毒组分检测方法，以确定所述病毒在所述试剂存在下是否已复制、表达遗传材料和/或装配和/或释放。
58. 权利要求57的方法，其备选地包括产生以在能够复制方面来说有效的量包含HBV基因组的传染性拷贝的连续细胞系，从而使得所述传染性HBV基因组稳定整合到所述连续细胞系中，例如但不限于2.2.15或AD细胞系；使所述细胞接触待测试的试剂；以一定的时间和条件培养所述细胞，所述时间和条件足够所述HBV复制、表达基因序列和/或装配和/或释放病毒或病毒样颗粒，如果对所述试剂有抗性；和然后对所述细胞、细胞裂解物或培养物上清液实施病毒或病毒组分检测方法，以确定所述病毒在所述试剂存在下是否已复制、表达遗传材料和/或装配和/或释放。
59. HBV变异体在制备针对HBV感染的治疗性疫苗中的用途，所述HBV变异体选自rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、和rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G；以及在制备用于治疗HBV感染的药物中的用途，其中所述HBV对下列物质具有抗性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
60. 针对HBV感染的疫苗，其中所述HBV对下列物质具有抗性：ADV，LMV，TFV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV，ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；和ADV和FTC和LMV和TFV和ETV，所述疫苗包括选自在下列密码子处的突变的HBV疫苗：rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236或rtM250，条件是所述HBV变异体没有显示出对单独的ETV或者单独的ETV或LMV的抗性。
61. 权利要求60的疫苗，其中所述HBV包含突变，所述突变选自在下列密码子处的突变：rtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248和rtM250。
62. 权利要求60的疫苗，其包括HBV变异体以及一种或多种疫苗上可接受的载体和/或稀释剂，所述HBV变异体包含选自下列的突变：rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V，和rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145I、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L和sS204G。
63. 权利要求61的疫苗，其中所述HBV包含选自下列的突变：rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N和rtM250I。
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