CN101548014B - 抗病毒抗性突变的检测和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明大体上涉及对特定试剂表现出减少的敏感性和/或表现出与免疫反应试剂的减少的相互作用活性的病毒变体。更特别地，本发明针对乙型肝炎病毒(HBV)变体，其对核苷或核苷酸类似物表现出完全的或部分的抗性，和/或表现出与针对病毒表面成分的抗体的减少的相互作用活性，包括对这些抗体的减少的敏感性。这里也考虑疫苗和诊断性化验。

Description

抗病毒抗性突变的检测和应用
技术领域
本发明大体上涉及对特定试剂表现出减少的敏感性和/或表现出与免疫反应试剂的减少的相互作用活性的病毒变体。更特别地，本发明针对乙型肝炎病毒(HBV)变体，其对核苷或核苷酸类似物表现出完全的或部分的抗性，和/或表现出与针对病毒表面成分的抗体的减少的相互作用活性，包括对这些抗体的减少的敏感性。这里也考虑疫苗和诊断性化验。
背景技术
本说明书中所引用出版物的文献目录细节也收集于本说明书的末尾。
本说明书所引用的任何现有技术不是也不应该被认为是承认或以任何形式来建议该现有技术为任何国家的公知常识。
乙型肝炎病毒(HBV)能引起衰竭性疾病(debilitating disease)病况并可导致急性肝脏衰竭。HBV是DNA病毒，其通过RNA中间体进行复制且在其复制策略中采用逆转录(Summers和Mason，Cell 29：403-415，1982)。HBV基因组为具有部分双链DNA结构的复杂本态，部分双链DNA结构具有编码表面、核心、聚合酶和X基因的交迭读码框。在图1中显示HBV基因组的复杂本态。聚合酶由四个功能区组成：末端蛋白(TP)、间隔体(spacer)、逆转录酶(rt)和核糖核酸酶(RNAse)。
HBV的聚合酶基因与被膜(envelope)基因交迭，聚合酶基因的催化结构域也能影响核苷酸和所形成的被膜蛋白的氨基酸序列，反之亦然。特别地，HBV的中和结构域的遗传序列(称为“a”决定簇，发现其处于HBsAg内，位于99至169位氨基酸之间)，实际上与病毒聚合酶蛋白的主要催化区域特别是A和B结构域交迭。
HBV的DNA聚合酶的存在已引起建议，即核苷或核苷酸类似物可作为有效的抗病毒试剂。如今所测试的核苷或核苷酸类似物的例子为喷昔洛韦(penciclovir)及其口服形式(FCV)[Vere Hodge，Antiviral Chem Chemother 4：67-84，1993；Boyd等人，Antiviral Chem Chemother.32：358-363，1987；Kruger等人，Hepatology22：219A，1994；Main等人，J.Viral Hepatitis 3：211-215，1996]，拉米夫定(Lamivudine)[(-)-β-2′-脱氧-3′-硫代胞苷]；(3TC或LMV)[Severini等人，Antimicrobial Agents Chemother.39：430-435，1995；Dienstag等人，New England JMed 333：1657-1661，1995]。已经进入临床试验的新的核苷或核苷酸类似物包括嘧啶恩曲他滨(Emtricitabine)[(-)-β-L-2’-3’-双脱氧-5-氟-3’-硫代胞苷；FTC]，其为3TC的5-氟衍生物和克来夫定(Clevudine)[1-(2-氟-5-甲基-β-L-arabino-furanosyl)尿嘧啶；L-FMAU]，其为一种胸苷类似物。β-L胸苷类似物(LdT)最近已获得FDA通过，其他的类似化合物包括β-L-2′-脱氧胞苷(LdC)和β-L-2′-脱氧腺苷(LdA)[Standring等人，Antivir Chem Chemother.2001；12 Suppl 1：119-29]。像3TC一样，这些是带有非天然的“L”构型的嘧啶衍生物。几个嘌呤衍生物也已进入临床试验；它们包括恩替卡韦(Entecavir)(BMS-200，475；ETV)，其为碳环形脱氧鸟苷类似物；二氨基嘌呤二氧戊烷(diaminopurine dioxalone)(DAPD)，其为二氧戊烷鸟嘌呤(dioxolane guanine)[(-)-β-D-2-氨基嘌呤二氧戊烷；DXG]的可用口服前药，和阿德福韦酯(Adefovir dipivoxil)，其为非环化单磷酸脱氧腺苷核苷或核苷酸类似物阿德福韦(Adefovir)(9-[膦酰基-甲氧基乙基]-腺嘌呤；PMEA)的口服前药。其他的临床前和临床试验中的药物包括FLG[Medivir]、ACH-126，443(L-d4C)[Archillion Pharmaceuticals]、ICN 2001-3(ICN)和Racivir(RCV)[Pharmassett]。
虽然这些试剂高效地抑制HBV的DNA合成，在长期抗病毒化疗中需要出现抗性的HBV突变体。在接受延长的LMV治疗的病人中，在rt结构域中聚合酶内在rtM204I/V+/-rtL180M以及其他的突变中选择重要抗性突变。用于聚合酶突变的命名法与Stuyver等人2001(见上)所建议的一致。LMV是已经被批准用于抵抗慢性HBV感染的核苷或核苷酸类似物。LMV是HBV复制的特别有力的抑制剂，在原位肝移植(OLT)之后的慢性感染病人的血清中通过抑制病毒DNA的合成来减少HBV的DNA效价。LMV单一治疗似乎不能长期控制HBV的复制。这是由于HBV的LMV抗性株的出现在单一治疗中似乎是几乎不可避免的。
阿德福韦酯(ADV；旧称bis-pom PMEA)是非环化单磷酸脱氧腺苷类似物阿德福韦(Adefovir)(旧称PMEA)的可口服前药(图2)。ADV也是HBV复制的有力抑制剂，已被FDA通过可用于抵抗慢性HBV感染。阿德福韦酯与本类中的其他试剂不用的是它是核苷酸类似物(相对于核苷类似物)，因此在药物激活中越过第一次磷酸化反应。这个步骤通常是限速性的。已证明阿德福韦酯对野生型和拉米夫定抗性HBV株都有临床活性，目前在临床III期试验(Gilson等人，J ViralHepat 6：387-395，1999；Perrillo等人，Hepatology 32：129-134，2000；Peters等人，Transplantation 68：1912-1914，1999；Benhamou等人，Lancet 358：718-723，2001)。在II期研究中，阿德福韦酯每日30mg的剂量在病毒血症中在12周之内引起平均4log10的减少(Heathcote等人，Hepatology 28：A620，1998)。
ADV是取代的非环化单磷酸核苷。这类化合物也包括富马酸泰诺福韦酯(tenofovir disoproxil fumarate)(也称为泰诺福韦DF或泰诺福韦或(TFV)或9-R-(2-膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤(PMPA)，被Gilead sciences标为替诺福韦(Viread))。
TFV具有同时针对HBV和HIV的抗病毒活性(Ying等人，J Viral Hepat.7(2)：161-165，2000；Ying等人，J.Viral Hepat.7(1)：79-83，2000，Suo等人，J Biol Chem.273(42)：27250-27258.1998)。
FTC具有针对HBV和HIV的活性(Frikc等人，Antimicrob Agents Chemother37：2285-2292，1993)。
LdT、LdC和LdA具有针对HBV的活性(Standring等人，见上)。
核苷或核苷酸类似物治疗可作为单一治疗或组合治疗(其中使用两个或两个以上核苷或核苷酸类似物)来使用。核苷或核苷酸类似物也可与其他的抗病毒试剂例如干扰素或乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG)组合来使用。
业界有监视核苷/核苷酸类似物或抗体抗性的HBV株的出现的需要，和发展诊断程序来检测这些抗性病毒和/或使用它们来筛选和/或发展或设计具有特性(该特性能使其用作抗病毒试剂)的试剂的需要。这些抗性株的缺陷型形式或由其而来的抗原性成分也被建议用于发展治疗性疫苗组合物，如针对病毒表面成分的抗体。
发明内容
在本说明书的通篇，除非上下文需要，否则词语“包含(comprise)”或变体例如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解为意味着包括所述元素或整体或者元素或整体的组，但是不排除任何其他元素或整体或者元素或整体的组。
核苷酸和氨基酸序列由序列标识符编号(SEQ ID NO：)来指称。SEQ ID NO：在数字上对应于序列标识符<400>1(SEQ ID NO：1)，<400>2(SEQ ID NO：2)等。在表1中提供序列标识符总结。在权利要求后提供序列表。
氨基酸序列中的特定突变在这里由″Xaa1nXaa2″代表，其中Xaa1是突变前的原始氨基酸残基，n是残基号码，Xaa2是突变的氨基酸。缩写″Xaa″可以是三字符或单字符(即″X″)代码。″Xaa1nXaa2″前面的″rt ″意思是“逆转录酶”。″s″意思是被膜(envelope)基因。HBV的DNA聚合酶的氨基酸残基这样编号：基序Tyr Met AspAsp(YMDD)中的蛋氨酸残基编号为204号残基(Stuyver等人，Hepatology33：751-757，2001)。乙型肝炎病毒表面抗原的氨基酸残基根据Norder等人(J.Gen.Virol.74：341-1348，1993)来编号。单字符和三字符缩写均用于定义氨基酸残基并于在表2中总结。
在接受包括核苷和核苷酸类似物(包括TFV和/或LMV，或者LMV和/或ADV和/或ETV)的抗病毒试剂治疗的慢性HBV感染病人中鉴定HBV变体的选择。因此，考虑HBV rt变体，其对抗病毒试剂为抗性或对抗病毒试剂表现出减少的敏感性，所述抗病毒试剂包括核苷和核苷酸类似物，包括ADV、LMV、TFV、ETV或FTC或LdT；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他的抗HBV试剂或其组合。表面抗原也发生相应的突变。对这些HBV变体的鉴定是重要的，可用于发展化验方法来监视ADV、LMV、FTC、TFV、LdT和/或ETV抗性和/或对其他核苷或核苷酸类似物或其他的抗HBV试剂或其组合的抗性，以及筛选可用作替代性治疗试剂的试剂。
这里所提及的“抗HBV试剂”包括抑制或干扰病毒的复制、维持、感染、组装或释放的核苷和核苷酸类似物以及免疫反应试剂(例如针对HBV表面成分的抗体)和化学的、蛋白质的和核酸试剂。
对这样的HBV变体的检测对于管理治疗程序(包括选择合适的用于治疗HBV感染的试剂)来说是特别重要的。本发明这个方面的方法部分预期监视(在核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合存在的情况下)个体中HBV载量的增加的发展。临床医生然后可以调整已存在的治疗程序或者相应地选择合适的治疗程序。
相应地，一个方面针对于分离的乙型肝炎病毒(HBV)变体，其中所述变体包含编码DNA聚合酶的基因中的核苷酸突变，这导致对于所述DNA聚合酶来说至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失，且其中所述变体对一种或多种核苷或核苷酸类似物表现出减少的敏感性，所述核苷或核苷酸类似物选自ADV、LMV、TFV、ETV、LdT或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。HBV变体在由一个或多个的HBV DNA聚合酶的F和G结构域和A至E结构域所定义的区域中，在其基因组的交迭开放读码框中包含突变。
另一个方面提供分离的HBV变体，在S基因中包含核苷酸突变，这导致对于表面抗原来说至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失，且该变体对一种或多种核苷或核苷酸类似物表现出减少的敏感性，所述核苷或核苷酸类似物选自ADV、LMV、TFV、ETV或LdT或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。
rt区域的有用的突变包括，在一个具体实施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W，在另一个具体实施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一个具体实施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一个具体实施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一个具体实施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一个具体实施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtI254I/F，或另一个具体实施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一个具体实施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一个具体实施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一个具体实施方式中包括rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V，或其组合或等价的突变。
特别有用的突变为在密码子180、184和204处的共同突变，例如rtL180M和rtT184S和rtM204V，或在密码子85、180、184、202、204和236处的共同突变，例如rtS85T、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V。这里考虑的替代的有用的突变包括rtP170H、rtT184A、rtY221H/Y、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R、rtR242K/R、rtW243R/W、rtI253V、rtI254I/F、rtS256R/S、rtW257G/W、rtY257H或在密码子239处的突变。
在这里建议：rtN236T区域的位于推定的三磷酸结合位点处的突变对于针对ADV和/或TFV和/或其他核苷或核苷酸的治疗来说是重要的。除密码子236外重要的密码子包括高度保守的密码子239和密码子240、241、242和243。
在一个特别的具体实施方式中，提供分离的乙型肝炎病毒(HBV)变体，其中所述变体在编码DNA聚合酶的基因处包含核苷酸突变，突变导致对所述DNA聚合酶来说至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失，其中突变选自：
(i)密码子239、240、241、242和/或243处的突变；
(ii)导致N236I/D/V取代的突变；
(iii)导致S246H/P/Y/S取代的突变；
(iv)导致P170H取代的突变；
(v)导致I253V取代的突变；
(vi)两个或两个以上选自以下的取代的共同突变：rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V或rtN236I/D/V；
(vii)两个或两个以上选自以下的取代的共同突变：rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I或rtS246H/P/Y/S；或
(viii)两个或两个以上选自以下的取代的共同突变：rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V或rtI253V；
其中HBV变体对核苷或核苷酸类似物表现出减少的敏感性。
S基因内的有用的突变包括，在一个具体实施方式中包括sI92T/I、sL175F和sI195M，在另一个具体实施方式中包括sS207R，或另一个具体实施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一个具体实施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一个具体实施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一个具体实施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一个具体实施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL162I和sI195M或其组合或等价的突变。
特别有用的突变为sI110V、sP120Q、sF134L/F、sL162I、sL173F、sL175F、sL176V和sP178P/L。
进一步考虑到确定HBV针对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合而表现出减少的敏感性的潜力的方法，该方法为从HBV中分离DNA或相应的mRNA并筛选编码HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突变，该突变导致在DNA聚合酶的任何一个或多个的F和G结构域和A至E结构域或其临近区域内的至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失并和针对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合的减少的敏感性相关联。
这样的突变的存在是对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合的可能的抗性的指征。
同时提供组合物，其包含HBV变体以及药物学上可接受的载体和/或稀释剂，所述HBV变体对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合或来自HBV变体的HBV表面抗原或其重组或衍生形式或其化学等价物呈抗性。
另一个方面提供前述组合物或HBV变体在制备用于治疗和/或预防乙型肝炎病毒感染的药物中的用途，所述HBV变体包含编码DNA聚合酶的基因中的核苷酸突变，这导致对于DNA聚合酶来说至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失并且导致对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合的减少的敏感性。
同时考虑确定HBV株是否对核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂表现出减少的敏感性的方法，该方法通过从HBV中分离DNA或相应的mRNA并筛选编码HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突变，其中rt区域中存在以下突变：在一个具体实施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W，在另一个具体实施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一个具体实施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一个具体实施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一个具体实施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一个具体实施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtI254I/F，或另一个具体实施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一个具体实施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一个具体实施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一个具体实施方式中包括rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V，或其组合或等价的一个或多个其他突变，这些突变的存在可作为对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出减少的敏感性的变体的指征。
另一个方法包括筛选编码被膜基因的核苷酸序列中的突变，其中在s基因中存在以下突变：在一个具体实施方式中包括sI92T/I、sL175F和sI195M，在另一个具体实施方式中包括sS207R，或另一个具体实施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一个具体实施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一个具体实施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一个具体实施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一个具体实施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL162I和sI195M或其组合或等价的一个或多个其他的突变，这些突变的存在可作为对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出减少的敏感性的变体的指征。
在一个特别的具体实施方式中，变体为分离的形式，以致除了体液中天然发生的步骤以外，它们已经进行了至少一个纯化步骤。或者，变体可保持在分离的体液中或者可以是DNA形式。本发明也考虑到感染的分子克隆，其包含来自HBV变体的基因组或其部分。对细胞、细胞裂解物、培养物上清液和体液中的HBV或其成分的检测可以是任何常规的方法，包括任何基于核酸的检测方法，例如，通过核酸杂交技术或通过一个或多个聚合酶链反应(PCR)。术语“体液”包括任何源自血液、淋巴、组织或器官系统的液体，包括血清、全血、活组织检查(biopsy)和活组织检查液、器官移植和器官悬液例如肝悬液。
另一个方面针对HBV变体，其与来自参考或野生型HBV的表面抗原相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中针对参考或野生型HBV的表面抗原而产生的抗体相对于该HBV变体表现出改变的免疫学图谱(immunological profile)。一种改变的图谱包括中和HBV的能力减少。更特别地，HBV变体的表面抗原相对于经预处理的HBV表现出改变的免疫学图谱，其中该HBV抗体通过核苷或核苷酸类似物或其他的HBV DNA聚合酶的抗HBV试剂来选择。本发明的这个方面的HBV变体也可包含核苷酸序列，该核苷酸序列相对于经预处理的HBV，包含单个或多个核苷酸取代、增加和/或去除。
进一步考虑的是用于检测表现出改变的免疫学图谱的HBV变体的方法，所述方法包括从暴露于核苷或核苷酸类似物或类似物组合的个体中分离HBV，核苷或核苷酸类似物或类似物组合选自ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，然后将所述HBV与一组一种或多种针对表面抗原的抗体接触并筛选任何结合亲和力或结合频谱上的变化。
在一个相关的方面，提供检测表现出改变的免疫学图谱的HBV变体的方法，所述方法包括从暴露于核苷或核苷酸类似物的个体中分离血清样品，核苷或核苷酸类似物选自ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，然后将该血清与一组HBV表面抗原或其抗体结合片段接触并筛选任何结合亲和力或结合频谱上的变化。
对应于HBV变体，提供分离的HBsAg或其重组形式或其衍生物或其化学等价物。通常，HBsAg或其重组或衍生物形式或其化学等价物相对于来自参考HBV的HBsAg来说，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列，且其中针对参考HBV的抗体对携带所述HBsAg变体的HBV表现出改变的免疫学图谱。在一个具体实施方式中，该改变的免疫学图谱包含中和HBV变体的能力减少。
另一个方面考虑检测对HBV表现出抑制活性的试剂的方法，该方法为产生遗传构建体，其在质粒载体中包含复制能力有效量的来自HBV的基因组，然后用所述构建体转染所述细胞，在转染前、中和/或后将待测试剂与所述细胞接触，将细胞在足以允许HBV复制的条件下培养足以允许HBV复制的时间，如果对所述试剂呈抗性，则表达遗传序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；将细胞、细胞裂解物或培养物上清液置于病毒或病毒成分检测器，以确定在该试剂存在的情况下，病毒是否已经复制、表达遗传材料和/或组装和/或被释放。在一个优选的具体实施方式中，质粒载体为杆状病毒属载体且该方法包含产生遗传构建体，其包含复制能力有效量的来自HBV的基因组(包含于或融合至能有效感染细胞的数量的杆状病毒属的基因组)，然后用所述构建体转染所述细胞，在感染前、中和/或后将待测试剂与该细胞接触，将细胞在足以允许HBV复制的条件下培养足以允许HBV复制的时间，如果对所述试剂呈抗性，则表达遗传序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；然后将细胞、细胞裂解物或培养物上清液置于病毒或病毒成分检测器，以确定在该试剂存在的情况下，病毒是否已经复制、表达遗传材料和/或组装和/或被释放。
与这些方法相关，质粒载体可包括编码部分或全部其他病毒载体例如杆状病毒属载体或腺病毒载体)的基因(参见Ren和Nassal，J.Virol.75(3)：1104-1116，2001。
在一个替代的具体实施方式中，方法包含产生持续细胞系，其包含复制能力有效量的HBV基因组的有感染性的拷贝(以使所述感染性HBV基因组被稳定地整合进入所述持续细胞系，例如但不限于，2.2.15或AD细胞系)，将待测试剂与细胞接触，将细胞在足以允许HBV复制的条件下培养足以允许HBV复制的时间，如果对所述试剂呈抗性，则表达遗传序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；然后将细胞、细胞裂解物或培养物上清液置于病毒或病毒成分检测器，以确定在该试剂存在的情况下，病毒是否已经复制、表达遗传材料和/或组装和/或被释放。
在一个替代的具体实施方式中，考虑用于检测试剂的方法，该试剂在体外聚合酶测试中对HBV聚合酶表现出抑制活性。HBV聚合酶活性可使用已建立的方法来检测(Gaillard等人，Antimicrob Agents Chemother.46(4)：1005-1013，2002；Xiong等人，Hepatology，28(6)：1669-73，1998)。HBV聚合酶可以是野生型或参考HBV聚合酶或突变的HBV聚合酶。
对病毒变体的鉴定使得能够生产包含特别的重组病毒成分例如聚合酶或被膜基因PreS1、PreS2，编码L、M、S蛋白的S的疫苗，以及包含缺陷型HBV变体的治疗性疫苗。也可使用合理的药物设计来鉴定或产生治疗性分子，其能够与聚合酶或被膜基因PreS1、PreS2，编码L、M、S蛋白的S或HBV的其他成分进行相互作用。这样的药物也可具有诊断性潜力。而且，缺陷型HBV变体也可用作治疗性组合物以产生针对同样的、类似的或同源病毒的免疫反应。或者，针对HBV变体或其表面成分而产生的抗体可用于个体的被动免疫以抵抗HBV变体或类似的或同源病毒所引起的感染。而且，本发明考虑试剂(例如核苷或核苷酸类似物、RNAi或siRNA分子(源自DNA的或合成的)、反义或正义寡核苷酸、化学的或蛋白质的分子)，其具有下调HBV成分活性的能力并抑制复制、保持、感染、组装或释放。
在表3中提供本说明书所用的缩写总结。
在表1中提供本说明书所用的序列标识符的总结。
表1
序列标识符的总结
  SEQUENCE ID NO：   描述
  1   PCR引物OSI 5′
  2   PCR引物TTA3 5′
  3   PCR引物JM 5′
  4   PCR引物TTA4 5′
  5   PCR引物OS2 5′
  6   来自抗性HBV病人A的聚合酶的催化区域的核苷酸序列
  7   抗性HBV病人A的聚合酶的催化区域的推定氨基酸序列
  8   来自抗性HBV病人A的被膜基因的推定氨基酸序列
  9   来自抗性HBV病人B的聚合酶的催化区域的核苷酸序列
  10   来自抗性HBV病人B的被膜基因的推定氨基酸序列
  11   抗性HBV病人B的被膜基因的推定氨基酸序列
  12   来自抗性HBV病人C的聚合酶的催化区域的核苷酸序列
  13   抗性HBV病人C的聚合酶的催化区域的推定氨基酸序列
  SEQUENCE ID NO：   描述
  14   抗性HBV病人C的被膜基因的推定氨基酸序列
  15   来自抗性HBV病人D的聚合酶的催化区域的核苷酸序列
  16   抗性HBV病人D的聚合酶的催化区域的推定氨基酸序列
  17   抗性HBV病人D的被膜基因的推定氨基酸序列
  18   来自抗性HBV病人E的聚合酶的催化区域的核苷酸序列
  19   抗性HBV病人E的聚合酶的催化区域的推定氨基酸序列
  20   抗性HBV病人E的被膜基因的推定氨基酸序列
  21   来自抗性HBV病人F的聚合酶的催化区域的核苷酸序列
  22   抗性HBV病人F的聚合酶的催化区域的推定氨基酸序列
  23   来自抗性HBV病人F的被膜基因的推定氨基酸序列
  24   来自抗性HBV病人G的聚合酶的催化区域的核苷酸序列
  25   抗性HBV病人G的聚合酶的催化区域的推定氨基酸序列
  26   来自抗性HBV病人G的被膜基因的推定氨基酸序列
表2
氨基酸缩写的单字符和三字符
  氨基酸   三字符缩写   单字符缩写
  丙氨酸   Ala   A
  精氨酸   Arg   R
  天冬酰胺   Asn   N
  天冬氨酸   Asp   D
  半胱氨酸   Cys   C
  谷氨酰胺   Gln   Q
  谷氨酸   Glu   E
  甘氨酸   Gly   G
  组氨酸   His   H
  异亮氨酸   Ile   I
  亮氨酸   Leu   L
  赖氨酸   Lys   K
  蛋氨酸   Met   M
  苯丙氨酸   Phe   F
  脯氨酸   Pro   P
  丝氨酸   Ser   S
  苏氨酸   The   T
  色氨酸   Trp   W
  酪氨酸   Tyr   Y
  缬氨酸   Val   V
  任意残基   Xaa   X
表3
缩写
  缩写  描述
  3TC  (LMV)；(-)-β-2′-脱氧-3′-硫代胞苷
  ADV  阿德福韦酯
  DAPD  二氨基嘌呤二氧戊烷
  DXG  二氧戊烷鸟嘌呤
  ETV  entecavir
  FAM  泛昔洛韦
  FCV  泛昔洛韦
  FTC  恩曲他滨
  HBIG  乙型肝炎免疫球蛋白
  HBsAg  乙型肝炎表面抗原
  HBV  乙型肝炎病毒
  LdT  β-L胸苷
  LMV  拉米夫定
  PMEA  9-[膦酰基-甲氧基乙基]-腺嘌呤，阿德福韦
  PMPA  9-R-(2-膦酰基甲氧基丙基)腺嘌呤
  RNase  核糖核酸酶
  rt(″Xaa1nXaa2″前的″rt″意思是逆转录酶) 逆转录酶
  s(如突变中所用，例如sF134V) 被膜基因
  TFV  富马酸泰诺福韦酯
  YMDD  Tyr Met Asp Asp-聚合酶蛋白中的基序；其中Met残基被
  指定为逆转录酶的第204号残基
附图说明
图1是图表性示意图，显示部分双链的DNA HBV基因组，该HBV基因组显示出编码表面(S)、核心(C)、聚合酶(P)和X基因的交迭开放读码框。
图2是ADV的化学结构的图表性示意图。
图3是泰诺福韦的化学结构的图表性示意图。
图4为显示来自病人A的样品中编码聚合酶基因的催化区域的HBV核苷酸序列的比较的示意图。
图5为显示来自病人A的样品中聚合酶基因的催化区域的推定氨基酸序列的比较的示意图。
图6为显示来自病人A的样品中被膜基因推定氨基酸序列的比较的示意图。
图7为显示来自病人B的样品中编码聚合酶基因的催化区域的HBV核苷酸序列的比较的示意图。
图8为显示来自病人B的样品中聚合酶基因的催化区域的推定氨基酸序列的比较的示意图。
图9为显示来自病人B的样品中被膜基因推定氨基酸序列的比较的示意图。
图10为来自病人C的样品中编码聚合酶基因的催化区域的HBV核苷酸序列的示意图。
图11为来自病人C的样品中聚合酶基因的催化区域的推定氨基酸序列的示意图。
图12为来自病人C的样品中被膜基因推定氨基酸序列的示意图。
图13为来自病人D的样品中编码聚合酶基因的催化区域的HBV核苷酸序列的示意图。
图14为来自病人D的样品中聚合酶基因的催化区域的推定氨基酸序列的示意图。
图15为来自病人D的样品中被膜基因推定氨基酸序列的示意图。
图16为来自病人E的样品中编码聚合酶基因的催化区域的HBV核苷酸序列的示意图。
图17为来自病人E的样品中聚合酶基因的催化区域的推定氨基酸序列的示意图。
图18为来自病人E的样品中被膜基因推定氨基酸序列的示意图。
图19为来自病人F的样品中编码聚合酶基因的催化区域的HBV核苷酸序列的示意图。
图20为来自病人F的样品中聚合酶基因的催化区域的推定氨基酸序列的示意图。
图21为来自病人F的样品中被膜基因推定氨基酸序列的示意图。
图22为来自病人G的样品中编码聚合酶基因的催化区域的HBV核苷酸序列的示意图。
图23为来自病人G的样品中聚合酶基因的催化区域的推定氨基酸序列的示意图。
图24为来自病人G的样品中被膜基因推定氨基酸序列的示意图。
图25为来自病人H的样品中编码聚合酶基因的催化区域的HBV核苷酸序列的示意图。
图26为来自病人H的样品中聚合酶基因的催化区域的推定氨基酸序列的示意图。
图27为来自病人H的样品中被膜基因推定氨基酸序列的示意图。
图28为来自病人I的样品中编码聚合酶基因的催化区域的HBV核苷酸序列的示意图。
图29为来自病人I的样品中聚合酶基因的催化区域的推定氨基酸序列的示意图。
图30为来自病人I的样品中被膜基因推定氨基酸序列的示意图。
发明详述
本发明部分预期，在病人接受ADV或LMV或ETV或更特别地，ADV和LMV或TFV和LMV，或ETV和任选的一种或多种核苷类似物或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂例如TFV、LdT或FTC治疗之后，对核苷或核苷酸类似物呈抗性的HBV变体的鉴定和分离。特别地，经ADV或ADV和LMV或ETV治疗的病人产生对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出降低的或减少的敏感性的HBV变体。这里对于ADV和/或LMV和/或FTC和/或TFV和/或ETV的敏感性相关联而引用的“降低的”或“减少的”包括并包含对核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂呈全部或实质上的抗性以及部分的抗性，并包括(核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂存在的情况下)比野生型更高的复制速率或复制效率。在一个方面，通过治疗中病毒载量(viral load)而方便地测定，或者，在治疗中HBV DNA病毒载量没有比预处理的HBV DNA水平实质地降低(即，对治疗无反应)。
相应地，一个方面考虑到分离的乙型肝炎病毒(HBV)变体，其中所述变体包含编码DNA聚合酶的基因中的核苷酸突变，该突变导致对于所述DNA聚合酶来说至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失，且其中所述变体对一种或多种核苷或核苷酸类似物表现出减少的敏感性，所述核苷或核苷酸类似物选自ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。
另一个方面提供确定HBV针对核苷或核苷酸类似物(选自ADV、LMV、TFV、LdT、FTC和ETV或其组合或任选的其他核苷或核苷酸类似物)而表现出减少的敏感性的潜力的方法，所述方法包含从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并筛选编码HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突变，该突变导致在所述DNA聚合酶的任何一个或多个的F和G结构域和A至E结构域或其临近区域内的至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失并和针对一个或多个的ADV、LMV、TFV、FTC的抗性或减少的敏感性相关，和/或其中这样的突变的存在是对所述一个或多个的ADV、LMV、TFV、LdT、FTC和/或ETV的可能的抗性的指征。
另一个方面提供分离的乙型肝炎病毒(HBV)变体，其中所述变体在编码DNA聚合酶的基因处包含核苷酸突变，该突变导致对所述DNA聚合酶的至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失，其中突变选自：
(i)密码子239、240、241、242和/或243处的突变；
(ii)导致N236I/D/V取代的突变；
(iii)导致S246H/P/Y/S取代的突变；
(iv)导致P170H取代的突变
(v)导致I253V取代的突变；
(vi)两个或两个以上选自以下的取代的共同突变：rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V或rtN236I/D/V；
(vii)两个或两个以上选自以下的取代的共同突变：rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I或rtS246H/P/Y/S；或
(viii)两个或两个以上选自以下的取代的共同突变：rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V或rtI253V；
其中HBV变体对核苷或核苷酸类似物表现出减少的敏感性。
除非另有指明，本公开不限于成分的特定制剂、生产方法、给药方案(dosageregimen)等，因为这些可变。也应理解，这里所用的术语只是为了描述特定的具体实施方式而不是为了限定。
必须注意，除非上下文另外清楚说明，否则如本说明书所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数方面。因此，例如，提及“核苷或核苷酸类似物”包括单一的类似物，以及两个或两个以上类似物；提及“HBV变体”包括提及两个或两个以上HBV变体；提及“本发明”包括提及本发明的单个或多个方面；等等。
术语“类似物”、“化合物”、“活性试剂”、“药理学上活性试剂”、“药物(medicament)”、“活性的”和“药物(drug)”在这里可相互替换地使用，用来指称诱导所需效应(例如抑制病毒复制、感染、维持、组装和/或酶例如HBV DNA聚合酶的功能)的化学化合物。该术语也包括这里特别提及的那些活性试剂的药学上和药理学上的活性成分，包括但不限于盐、酯、酰胺、前药、活性代谢物、类似物等。当使用术语“类似物”、“化合物”、“活性试剂”、“药理学上活性试剂”、“药物(medicament)”、“活性的”和“药物(drug)”时，则应该理解为包括活性试剂本身以及药学上可接受的，药理学上活性的盐、酯、酰胺、前药、代谢物、类似物等。
因此，考虑可用于抑制病毒复制、感染、维持、组装和/或酶例如HBV DNA聚合酶的功能的化合物。提及“类似物”、“化合物”、“活性试剂”、“药理学上活性试剂”、“药物(medicament)”、“活性的”和“药物(drug)”例如ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。“组合”也包括两部分的或两部分以上的例如多部分的抗HBV治疗性组合物，其中分别提供试剂并分别给药或分配，或者在分配之前混合在一起。
如这里所用的术语试剂的“有效量”和“治疗上有效量”意思是足以提供所需的治疗性的或生理学上的效应(抑制病毒复制、感染、维持、组装和/或酶例如HBV DNA聚合酶的功能)的该试剂的量。此外，试剂的“有效的HBV抑制性的量”或“有效的症状改善性的量”是足以直接或间接抑制复制、感染、维持、组装和/或酶例如HBV DNA聚合酶的功能的该试剂的量。不需要的效应，例如副作用，有时候与所需要的治疗性效应一起表现；因此，从业者在确定什么是合适的“有效量”时对潜在的益处相对于潜在的风险进行平衡。所需的精确数量将在个体中有差异，取决于物种、年龄和个体的通常的状况、给药方式等。因此，不可能指定精确的“有效量”。但是，在任何个人情况下合适的“有效量”可由本领域普通技术人员只使用常规实验来确定。
“药学上可接受的”载体、赋形剂或稀释剂意思是由材料组成的药学载体，该材料不是生物学或其他方面所不需要的，即该材料可与所选活性试剂一起向个体使用而不引起任何或实质上的不利反应。载体可包括赋形剂和其他的添加剂例如稀释剂、去垢剂、着色剂、加湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、防腐剂等。
类似地，如这里所提供的“药理学上可接受的”盐、酯、酰胺、前药或化合物的衍生物为不是生物学或其他方面所不需要的盐、酯、酰胺、前药或衍生物。
如这里所用的术语“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”是指相对于HBV感染：减轻症状的严重程度和/或频率、消除症状和/或其起因、预防症状和/或其起因的发生以及改善或补救损伤。因此，例如，“治疗”病人包括预防HBV感染以及通过抑制HBV复制、感染、维持、组装和/或酶例如HBV DNA聚合酶的功能来治疗临床上有HBV症状的个体。因此，例如，本方法中的“治疗”患有HBV感染或者具有发展倾向的病人的方法包括预防HBV感染以及治疗HBV感染或其症状。在任何情况下，本发明考虑到HBV感染的治疗或预防。
如这里所用的“病人”是指动物，优选为哺乳动物，更优选为灵长类包括低等灵长类，再更优选为可从本发明的制剂和方法受益的人。不论是人类还是非人类动物，病人均可被称为个体(individual)、个体(subject)、动物、宿主或接受者。本发明的化合物和方法在人类医药、兽医医药以及一般的、家养或野生动物管理上具有用途。为了方便起见，“动物”包括鸟类种例如家禽鸟类(包括鸭、鸡、火鸡和鹅)，鸟舍中的鸟(aviary bird)或猎鸟(game bird)。非人类动物中的病状可能不是天然发生的HBV感染但是HBV样感染可被诱导。
如上所述，优选的动物为人、非人类灵长类例如绒猴、狒狒、猩猩、低等灵长类例如tupia、家畜动物、实验室试验动物、宠物或被俘的野生动物。人是最优选的目标。但是，也可使用非人类动物模型。
实验室试验动物的例子包括小鼠、大鼠、兔子、天竺鼠和仓鼠。兔子和啮齿动物例如大鼠和小鼠提供方便的试验系统或动物模型(如灵长类和低等灵长类)。也考虑家畜动物包括绵羊、母牛、猪、山羊、马和驴。非哺乳动物例如鸟类种、斑马鱼、两栖类(包括蟾蜍)和果蝇(Drosophila)种例如黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)。除了活体动物模型，试验系统也可包含组织培养系统。
“抗HBV试剂”包括核苷或核苷酸类似物、蛋白、化学化合物、RNA或DNA或RNAi或siRNA寡聚核苷酸(源自DNA的或合成的)。
在一个特别的具体实施方式中，减少的敏感性为ETV相关。或者，减少的敏感性为ADV或LMV相关。或者，减少的敏感性为TFV相关。或者，减少的敏感性为FTC相关。或者，减少的敏感性为ETV和人选的ADV和LMV相关。或者，减少的敏感性为ADV和TFV和任选的ETV相关。或者，减少的敏感性为LMV和TFV和任选的ETV相关。或者，减少的敏感性为ADV和FTC和任选的ETV相关。或者，减少的敏感性为FTC和TFV和任选的ETV相关。或者，减少的敏感性为FTC和LMV和任选的ETV相关。或者，减少的敏感性为ADV和LMV和TFV和任选的ETV相关。或者，减少的敏感性为ADV和TFV和FTC和任选的ETV相关。或者，减少的敏感性为LMV和TFV和FTC和任选的ETV相关。或者，减少的敏感性为ADV和LMV和FTC和任选的ETV相关。或者，减少的敏感性为ADV和FTC和TFV和LMV和任选的ETV相关。
这里提及的“抗HBV试剂”包括核苷或核苷酸类似物以及免疫反应试剂(例如针对HBV表面成分的抗体)和抑制或干扰病毒的复制、维持、感染、组装或释放的化学的、蛋白质的和核酸试剂。这里提及的“核酸”包括提及正义或反义分子、RNA或DNA、寡聚核苷酸和RNAi和siRNA分子和含有同样物质的复合体。
除了编码DNA聚合酶的基因中的突变之外，由于HBV基因组的交迭本性(图1)，在编码S的基因、编码表面抗原(HBsAg)的基因也可发生相应的突变，这导致免疫反应试剂(例如抗体和免疫细胞)与HBsAg的相互作用活性减少。免疫反应试剂与病毒表面成分的相互作用活性减少通常包括识别或实质上识别病毒表面成分的免疫记忆的缺失。因此本发明延伸至HBV变体，其对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出减少的敏感性或者表现出免疫反应试剂对HBsAg减少的相互作用活性，其中该变体选作以下ADV和/或LMV组合或顺序治疗。本方面中的术语“顺序”意思是ADV紧接着LMV和/或TFV和/或ETV和/或FTC，LMV紧接着ADV和/或TFV和/或FTC和/或ETV，或者ETV紧接着一个或多个的ADV、FTC、LMV和/或TFV，或ETV、ADV、LMV和/或TFV和/或FTC中每个的多个顺序施药。
因此病毒变体可携带只存在于DNA聚合酶基因中的或者同时存在于DNA聚合酶基因和S基因中的突变。术语“突变”被理解为其最宽的意义并包括多个突变。
这里考虑HBV DNA聚合酶中的任何结构域特别是结构域F和G，以及结构域A至E中的突变，提供引起对ADV和/或LMV和/或TFV和/或ETV和/或FTC和/或LdT或其组合的突变。
在本说明书中，特别提及DNA聚合酶的保守区域，其由结构域A至E所定义。区域A至E由澳大利亚专利号734831中的通式II中的氨基酸序列所定义。
特别的，突变导致HBV DNA聚合酶的任意一个或多个的结构域F和G中，以及结构域A至E或其临近区域中的氨基酸序列改变。
另一个方面提供HBV变体，其在基因组中交迭的开放读码框中包含突变，其中所述突变位于由HBV DNA聚合酶的一个或多个的结构域F和G，以及结构域A至E所定义的区域，且其中所述变体对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出减少的敏感性。
另一个方面考虑到HBV变体，其包含编码HBsAg的核苷酸序列中的突变，突变导致对于所述HBsAg来说至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失，其中所述变体对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出减少的敏感性。
更特别地，提供HBV变体，其与来自参考或野生型HBV的表面抗原相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中针对参考或野生型表面抗原产生的抗体表现出减少的中和所述HBV变体的能力，所述变体通过将个体暴露于ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合进行选择。
术语“组合治疗”意思是ADV、LMV、FTC、LdT、TFV和/或ETV在相同组合物中共同使用或在分开的组合物中同时使用。术语“顺序治疗”意思是两个试剂在彼此使用几秒钟、几分钟、几小时、几天或几周内之内以任意顺序使用。顺序治疗也包括用ADV、LMV、FTC、TFV、LdT或ETV中的一个或另一个完成一个治疗过程，然后用ADV、LMV、FTC、TFV、LdT或ETV中的另一个完成第二个或第三个或顺序治疗过程。
相应地，另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ADV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于LMV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于FTC治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于TFV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于LdT治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ADV和LMV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ADV和TFV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ADV和ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于LMV和TFV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于LMV和ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ADV和FTC治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于TFV和FTC治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于TFV和ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于FTC和LMV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于FTC和ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ADV、LMV和TFV和/或ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ADV、LMV和TFV和/或ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ADV、LMV和FTC和/或ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于FTC、LMV和TFV和/或ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ADV、FTC和TFV和/或ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
另一个方面考虑到HBV变体，其与预处理HBV相比，包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列的表面抗原，且其中HBV变体的表面抗原与预处理HBV相比，表现出改变的免疫学图谱，其中所述HBV变体通过将个体暴露于ADV、LMV、FTC和TFV和/或ETV治疗或一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的治疗来进行选择。
特别地，变体为分离的形式，以致除了体液中天然发生的步骤以外，它们已经进行了至少一个纯化步骤。或者，变体可保持在分离的体液中或者可以是DNA形式。本发明也考虑包含来自HBV变体的基因组或其部分的感染性分子克隆。而且，本发明提供来自HBV变体的分离的成分，例如但不限于分离的HBsAg。相应地，本发明提供分离的HBsAg或其重组或衍生物形式或其化学等价物，所述HBsAg来自通过将个体暴露于一个或多个的ADV、LMV、FTC、TFV和/或ETV或任选的一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂而进行选择的HBV变体。
更特别地，提供分离的HBsAg变体或其重组或衍生物形式或其化学等价物，且其中所述HBsAg或其重组或衍生物形式或其化学等价物相对于来自参考HBV的HBsAg表现出改变的免疫学图谱，所述HBsAg来自通过将个体暴露于一个或多个的ADV、LMV、FTC、TFV和/或ETV或任选的一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂而进行选择的HBV变体。
更特别地，提供分离的HBsAg变体或其重组或衍生物形式或其化学等价物，且其中所述HBsAg或其重组或衍生物形式或其化学等价物相对于来自参考HBV的HBsAg来说包含具有单个或多个氨基酸取代、增加和/或去除或截尾的氨基酸序列，且其中针对参考HBV产生的中和抗体对携带所述HBsAg变体的HBV表现出无中和活性或减少的中和活性，所述HBsAg来自通过将个体暴露于一个或多个的ADV、LMV、FTC、TFV和/或ETV或任选的一个或多个的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂而进行选择的HBV变体。
HBV DNA聚合酶中的特别的突变包括变体，其选自在ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合之后具有HBV复发的病人。可在移植程序(例如骨髓移植(BMT)或OLT)中、之后或之前，或者在被诊断为肝炎的病人接受治疗之后标明核苷或核苷类似物或其他抗HBV试剂。在选择变体之后，病毒载量以类似于预处理的水平获得或在治疗中增加。
rt区域中有用的突变包括，在一个具体实施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W，在另一个具体实施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一个具体实施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一个具体实施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一个具体实施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一个具体实施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtI254I/F，或另一个具体实施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一个具体实施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一个具体实施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一个具体实施方式中包括rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V，或其组合或等价的突变。
特别有用的突变为在密码子180、184和204处的共同突变，例如rtL180M和rtT184S和rtM204V，在密码子85、180、184、202、204和236处的共同突变，例如rtS85T、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V。这里考虑的替代的有用的突变包括rtP170H、rtT184A、rtY221H/Y、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R、rtR242K/R、rtW243R/W、rtI253V、rtI254I/F、rtS256R/S、rtW257G/W、rtY257H或在密码子239处的突变。“共同突变”意思是变体包含在所有提及的密码子处的突变。本发明特别针对在密码子180、184和204处的共同突变以及在密码子85、180、184、202、204和236处的共同突变，但不延伸至只在密码子180和204处的双突变。
这样的HBV变体被提议为对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出减少的敏感性。应该注意，氨基酸位置命名系统是基于将YMDD基序中的蛋氨酸残基指定为密码子rtM204。这个编号系统与澳大利亚专利号734831中的不同，澳大利亚专利号734831中聚合酶基因内的YMDD基序中的蛋氨酸残基被指定为密码子550。由此，rtL180M和rtM204V分别对应于澳大利亚专利号734831中的L526M和M550V。相应的突变也可发生于被膜基因里例如一个或多个的PreS1、PreS2和S。
ADV和其他非环化磷酸核苷的另一个潜在的作用模式为免疫刺激(Calio等人，Antiviral Res.23：77-89，1994)。一些突变导致HBV变体中所检测到的被膜基因中的改变，这可能与免疫逃逸(immune escape)相关。这些变化包括，在一个具体实施方式中包括sI92T/I、sL175F和sI195M，在另一个具体实施方式中包括sS207R，或另一个具体实施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一个具体实施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一个具体实施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一个具体实施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一个具体实施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL162I和sI195M或其组合或等价的突变。
特别有用的突变为sI110V、sP120Q、sF134L/F、sL162I、sL173F、sL175F、sL176V和sP178P/L。
这里对变体的鉴定允许产生一系列测试来检测这样的突变。对这样的突变的检测对于鉴定抗性变体以确定化疗的合适形式和/或监视疫苗接种程序或发展新的或改良的疫苗制备物来说是重要的。
另一个方面考虑确定HBV针对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂而表现出减少的敏感性的潜力的方法，所述方法包含从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并筛选编码HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突变，该突变导致在DNA聚合酶的任何一个或多个的F和G结构域和A至E结构域或其临近区域内的至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失并和针对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的抗性或减少的敏感性相关联，其中这样的突变的存在是对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂的可能的抗性的指征。
相应地，另一个方面提供确定HBV针对核苷或核苷酸类似物(选自ADV、LMV、TFV、LdT、FTC和ETV或任选的其他核苷或核苷酸类似物)而表现出减少的敏感性的潜力的方法，所述方法包含从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并筛选编码HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突变，该突变导致在所述DNA聚合酶的任何一个或多个的F结构域和A至E结构域或其临近区域内的至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失并和针对一个或多个的ADV、LMV、TFV、LdT、FTC和/或ETV的抗性或减少的敏感性相关联，其中这样的突变的存在是对所述一个或多个的ADV、LMV、TFV、LdT、FTC和/或ETV的可能的抗性的指征。
特别地，测试检测一个或多个的如下突变：在一个具体实施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W，在另一个具体实施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一个具体实施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一个具体实施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一个具体实施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一个具体实施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtI254I/F，或另一个具体实施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一个具体实施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一个具体实施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一个具体实施方式中包括rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V，或其组合或等价的突变，为变体的指征，其中所述变体对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出减少的敏感性。
相应地，另一个方面产生确定HBV株是否对核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂表现出减少的敏感性的方法，所述方法通过从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并筛选编码HBV的DNA聚合酶和/或S基因的相应区域中的核苷酸序列的突变，其中选自如下突变的存在为变体的指征：在一个具体实施方式中包括sI92T/I、sL175F和sI195M，在另一个具体实施方式中包括sS207R，或另一个具体实施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一个具体实施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一个具体实施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一个具体实施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一个具体实施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL162I和sI195M或其组合或等价的突变，在一个具体实施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W，在另一个具体实施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一个具体实施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一个具体实施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一个具体实施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一个具体实施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtI254I/F，或另一个具体实施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一个具体实施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一个具体实施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一个具体实施方式中包括rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V，或其组合或等价的突变，其中所述变体对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出减少的敏感性。
另一个方面产生确定HBV株是否对核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂表现出减少的敏感性的方法，所述方法通过从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并筛选编码HBV的DNA聚合酶和/或S基因的相应区域中的核苷酸序列的突变，其中选自如下突变的存在为变体的指征：在一个具体实施方式中包括sI92T/I、sL175F和sI195M，在另一个具体实施方式中包括sS207R，或另一个具体实施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一个具体实施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一个具体实施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一个具体实施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一个具体实施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL162I和sI195M或其组合或等价的突变，在一个具体实施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W，在另一个具体实施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一个具体实施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一个具体实施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一个具体实施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一个具体实施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtI254I/F，或另一个具体实施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一个具体实施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一个具体实施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一个具体实施方式中包括rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V，或其组合或等价的突变，其中所述变体对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出减少的敏感性.
对细胞、细胞裂解物、培养物上清液和体液中的HBV或其成分的检测可以是任何常规的方法，包括任何基于核酸的检测方法，例如，通过核酸杂交技术或通过一个或多个聚合酶链反应(PCR)。术语“体液”包括任何源自血液、淋巴、组织或器官系统的液体，包括血清、全血、活组织检查(biopsy)和活组织检查液、器官移植和器官悬液例如肝悬液。本发明还包括使用不同形式的所述基于核酸的检测方法，包括，尤其，限制性片段长度多态性(restriction fragment lengthpolymorphism，RFLP)、扩增片段长度多态性(amplified fragment lengthpolymorphism，AFLP)、单链多态性(single-strand chain polymorphism，SSCP)、扩增及错配检测(amplification and mismatch detection，AMD)、散布重复序列聚合酶链反应(interspersed repetitive sequence polymerase chain reaction，IRS-PCR)、反向聚合酶链反应(inverse polymerase chain reaction，iPCR)和逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR)。其他形式的检测包括Northern杂交、Southern杂交、PCR测序、抗体程序例如ELISA、Western杂交和免疫组化。特别有用的检测包括固定化的寡聚核苷酸或寡肽介导的检测系统所需的反应试剂和化合物。
一个特别有用的核酸检测系统是反向杂交技术(reverse hybridizationtechnique)。在这个技术中，使用生物素或其他配体标记的引物来扩增来自HBV样品的DNA以产生标记的扩增子(amplificon)。然后使用固定在固体支持物例如硝化纤维薄膜上的寡聚核苷酸通过杂交来捕获经扩增的DNA。通过生物素或配体来鉴定特定的核算片段。通常，经标记的引物对于特定的待测核苷酸变异是特异性的。只有当待测变异存在时扩增才会发生。反向杂交检测有很多形式，均为本发明所包括。
这里考虑的另一个方面提供检测HBV变体的方法，该HBV变体表现出改变的免疫学图谱，所述方法包含从个体中分离HBV，该个体暴露于选自以下的核苷或核苷酸类似物：ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，然后将所述HBV与一组一种或多种针对表面抗原的抗体接触并筛选任何结合亲和力或结合频谱上的变化。
在一个相关的具体实施方式中，考虑检测HBV变体的方法，该HBV变体表现出改变的免疫学图谱，所述方法包含从个体中分离血清样品，该个体暴露于选自以下的核苷或核苷酸类似物：ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合，然后将血清与一组HBV表面抗原或其抗体结合片段接触并筛选任何结合亲和力或结合频谱上的变化。
检测细胞培养物中的HBV复制是特别有用的。
这个方面和其他方面应特别服从微阵列分析(microarray analysis)以鉴定下调HBV的基因组序列或转录子的寡聚核苷酸(包括正义和反义分子、RNAi或siRNA分子或DNA或RNA结合分子)。微阵列分析也可用于鉴定HBV基因组中的特别的突变，例如位于HBV DNA聚合酶编码区域内或者HBsAg编码区域内的。
另一个方面考虑检测对HBV表现出抑制活性的试剂的方法，该方法通过：
产生遗传构建体，其在质粒载体中包含复制能力有效量的来自HBV的基因组，然后用所述构建体转染所述细胞；
在转染前、中和/或后将待测试剂与所述细胞接触；
将细胞在足以允许HBV复制的条件下培养足以允许HBV复制的时间，如果对所述试剂呈抗性，则表达遗传序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；和
然后将细胞、细胞裂解物或培养物上清液置于病毒或病毒成分检测器，以确定在该试剂存在的情况下，病毒是否已经复制、表达遗传材料和/或组装和/或被释放。
在一个特别的具体实施方式中，质粒载体可包括编码部分或全部其他病毒载体例如杆状病毒属载体或腺病毒载体(参见Ren和Nassal，2001，见上)的基因，方法包含：
产生遗传构建体，其包含复制能力有效量的来自HBV的基因组(包含于或融合至能有效感染细胞的数量的杆状病毒属的基因组)，然后用所述构建体转染所述细胞；
在感染前、中和/或后将待测试剂与该细胞接触；
将细胞在足以允许HBV复制的条件下培养足以允许HBV复制的时间，如果对所述试剂呈抗性，则表达遗传序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；和
然后将细胞、细胞裂解物或培养物上清液置于病毒或病毒成分检测器，以确定在该试剂存在的情况下，病毒是否已经复制、表达遗传材料和/或组装和/或被释放。
在一个替代的具体实施方式中，方法包含：
产生持续细胞系，其包含复制能力有效量的HBV基因组的有感染性的拷贝(这样的话所述感染性HBV基因组被稳定地整合进入所述持续细胞系，例如但不限于，2.2.15或AD细胞系)；
将待测试剂与细胞接触；
将细胞在足以允许HBV复制的条件下培养足以允许HBV复制的时间，如果对所述试剂呈抗性，则表达遗传序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；和
然后将细胞、细胞裂解物或培养物上清液置于病毒或病毒成分检测器，以确定在该试剂存在的情况下，病毒是否已经复制、表达遗传材料和/或组装和/或被释放。
以上提及的方法在鉴定或发展针对HBV变体的试剂方面是特别有用的，所述HBV变体为例如那些携带以下突变的：在一个具体实施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W，在另一个具体实施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一个具体实施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一个具体实施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一个具体实施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一个具体实施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtI254I/F，或另一个具体实施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一个具体实施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一个具体实施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一个具体实施方式中包括rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V，或其组合或等价的突变；在一个具体实施方式中包括sI92T/I、sL175F和sI195M，在另一个具体实施方式中包括sS207R，或另一个具体实施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一个具体实施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一个具体实施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一个具体实施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一个具体实施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL162I和sI195M或其组合或等价的突变。
相应地，另一个方面考虑确定HBV株是否对核苷或核苷酸类似物或其他潜在的抗HBV试剂表现出减少的敏感性的方法，所述方法通过从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并筛选被膜基因或DNA聚合酶的核苷酸序列的突变，所述突变选自：在一个具体实施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W，在另一个具体实施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一个具体实施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一个具体实施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一个具体实施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一个具体实施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtI254I/F，或另一个具体实施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一个具体实施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一个具体实施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一个具体实施方式中包括rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V，或其组合或等价的突变；在另一个具体实施方式中，在一个具体实施方式中包括sI92T/I、sL175F和sI195M，在另一个具体实施方式中包括sS207R，或另一个具体实施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一个具体实施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一个具体实施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一个具体实施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一个具体实施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL162I和sI195M或其组合或等价的突变和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合。
检测DNA聚合酶的氨基酸变体可通过一系列氨基酸检测技术方便地实现。当HBV变体包含氨基酸变化时，则这样的分离体被认为是具有改变的DNA聚合酶活性的推定HBV变体。
这里还考虑抑制对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV 和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合呈抗性的HBV变体。如果临床医生考虑ADV、LMV、FTC、TFV、LdT和/或ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物例如TFV的长期治疗，这些试剂是特别有用的。该试剂可以是DNA或RNA或蛋白质的或非蛋白质的化学分子。也考虑从天然产物(例如植物、珊瑚和微生物)筛选作为有用的掩蔽剂(masking agent)的潜在来源，如组合文库或化学文库的筛选。该试剂可以是分离的形式或作为药物组合物或制剂的形式，可代替核苷或核苷酸类似物、与核苷或核苷酸类似物顺序使用或同时使用。此外，考虑合理的药物设计包括解决例如HBV DNA聚合酶的晶体或NMR结构，设计能结合至酶的活性位点的试剂。这个方法也可适合于其他的HBV成分。
相应地，另一个方面考虑检测对HBV表现出抑制活性的试剂的方法，所述HBV对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出抗性或减少的敏感性，所述方法包含：
产生遗传构建体，其在质粒载体中包含复制能力有效量的来自HBV的基因组，然后用所述构建体转染所述细胞；
在转染前、中和/或后将待测试剂与所述细胞接触；
将细胞在足以允许HBV复制的条件下培养足以允许HBV复制的时间，如果对所述试剂呈抗性，则表达遗传序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；和
将细胞、细胞裂解物或培养物上清液置于病毒或病毒成分检测器，以确定在所述试剂存在的情况下，病毒是否已经复制、表达遗传材料和/或组装和/或被释放。
另一个方面考虑检测对HBV表现出抑制活性的试剂的方法，所述HBV对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合表现出抗性或减少的敏感性，所述方法包含：
产生遗传构建体，其包含复制能力有效量的来自HBV的基因组(包含于或融合至能有效感染细胞的数量的杆状病毒属的基因组)，然后用所述构建体感染所述细胞；
在感染前、中和/或后将待测试剂与所述细胞接触；
将细胞在足以允许HBV复制的条件下培养足以允许HBV复制的时间，如果对所述试剂呈抗性，则表达遗传序列和/或组装和/或释放病毒或病毒样颗粒；和
将细胞、细胞裂解物或培养物上清液置于病毒或病毒成分检测器，以确定在该试剂存在的情况下，病毒是否已经复制、表达遗传材料和/或组装和/或被释放。
特别地，HBV基因组被稳定地整合入细胞的基因组。
有用的细胞包括2.2.15细胞(Price等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86(21)：8541-8544，1989)或AD细胞(也称为HepAD32细胞或HepAD79细胞[Ying等人，2000，见上])。
虽然杆状病毒载体在实践本方法时是特别有用的，但是也可使用一系列其他载体例如但不限于腺病毒载体。
这里也考虑携带遗传构建体(包含全部或部分的HBV基因组或其基因或基因的一部分)的细胞系(例如2.2.15或AD细胞)。
也提供本HBV变体用于筛选抗病毒试剂的用途。这些抗病毒试剂抑制病毒。术语“抑制”包括对抗或者防止感染、复制、组装和/或释放或任何中间步骤。特别的抗病毒试剂包括核苷或核苷酸类似物或抗HBV试剂以及非核苷分子。
而且，也考虑合理的药物设计以鉴定或产生化学分子，所述化学分子模拟特定的核苷或者与特定的核苷酸序列或特定的核苷酸相互作用。组合化学和双杂交筛选是能够用于鉴定潜在的治疗性或预防性试剂的一些技术中的一些。
在一个实施例中，使用聚合酶或表面抗原的晶体结构或NMR结构来合理地设计小化学分子，其可能与功能和/或抗原性所需分子的主要区域相互作用。这样的试剂可用作聚合酶活性的抑制剂和/或可改变表面抗原的表位。
由于和来自HIV的逆转录酶的相似性，已经制备HBV聚合酶的几个模式(Das等人，J.Virol.75(10)：4771-4779，2001；Bartholomeusz等人，Intervirology40(5-6)：337-3421997；Allen等人，Hepatology 27(6)：1670-1677，1998)。HBV聚合酶的模式可被用于新试剂(可有效抵抗编码抗性突变以及野生型病毒的HBV)的合理药物设计。所设计的合理药物可基于对已存在的抗病毒试剂(例如那些用于选择编码与抗性相关突变的HBV的试剂)的修饰。也可使用病毒或表达编码突变的HBV基因组材料的克隆来筛选新的抗病毒试剂。
在一个替代的具体实施方式中，考虑用于检测试剂的方法，该试剂在体外聚合酶测试中对HBV聚合酶表现出抑制活性。HBV聚合酶活性可使用已建立的方法来检测(Gaillard等人，2002，见上；Xiong等人，1998，见上)。
如上所述，微阵列技术也是有用的鉴定能够与确定的HBV内部或外部成分相互作用的试剂的方法。例如，HBV DNA聚合酶或其携带不同氨基酸变体的肽片段的阵列可用于筛选能够结合至或者与这些分子相互作用的试剂。这是确定HBV变体之间不同的结合样式的方便的方法。也可使用抗体阵列来筛选改变的HBsAg分子。微阵列也可用于蛋白质组分析以鉴定具有与HBV成分相互作用能力的分子例如抗体、干扰素或细胞因子。DNA和RNA分子的微阵列也可用于鉴定HBV基因组或其转录子上的遗传区域的正义和反义分子。
以上方法在鉴定HBV的抑制剂方面是特别有用的，所述HBV对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合呈抗性或表现出减少的敏感性。因此本发明延伸至抑制剂的组合物。抑制剂也可以是抗体形式或用于共抑制或诱导RNAi的遗传分子形式例如核酶、反义分子和/或正义分子，或其他的核苷或核苷酸类似物或其他的抗HBV试剂或已知类似物的衍生物。提及RNAi包括提及短的干扰RNA(siRNA)，所有的RNAi类型的分子可以是源自DNA的或合成的。
术语“组合物”包括“药物组合物”或制剂。
以下将抑制剂称为“活性成分”或“活性化合物”，可选自以上所列抑制剂。
组合物可包括HBV的抗原性成分，缺陷型HBV变体或经天然产物筛选或合理药物设计(包括组合化学)而鉴定的试剂。
药学上可接受的载体和/或稀释剂包括任何和所有的溶剂、分散介质、包被、抗细菌和抗真菌试剂、等压和吸附延迟试剂等。这样的用于药学上活性物质的介质和试剂在本领域是熟知的。除了与活性成分不相容的任何常规介质或试剂之外，考虑其在治疗性组合物中的应用。也可在组合物中引入补充性活性成分。
药物组合物也可包括遗传分子例如能够转染靶细胞的载体，其中该载体携带能够编码天冬氨酰蛋白酶抑制剂的核酸分子。载体可以是例如病毒载体。
适合于注射用途的药学形式包括无菌水溶液(其中水可溶)和用于无菌注射溶液的临时制备的无菌粉末。它在生产和贮存条件下必须稳定，且必须能抗微生物例如细菌和真菌的污染作用而保藏。载体可以是溶剂或稀释介质，其包含例如水、乙醇、多羟基化合物(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)、其合适的混合物和植物油。可通过使用例如superfactant来保持正确的流动性。可通过各种抗细菌和抗真菌试剂例如对羟基本甲酸酯(paraben)、三氯叔丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来防止微生物的作用。在很多情况下，优选为包括等压试剂，例如糖或氯化钠。注射性组合物的延长的吸附可通过在组合物中使用延迟吸附试剂(例如单硬脂酸铝和凝胶)来实现。
无菌注射溶液通过将合适溶剂中的所需数量的活性化合物引入活性成分和任选的其他所需要的活性成分，然后进行过滤杀菌或其他合适的杀菌方法来制备。在用于无菌注射溶液的制备物的无菌粉末的情况下，合适的制备方法包括真空干燥和冻干技术，其产生活性成分的粉末加任何其他的所需成分。
当活性成分被合适地保护时，可通过口服来使用，例如使用惰性稀释药或使用可同化的可食用的载体，或者可包含于硬壳或软壳凝胶胶囊，或可压缩成药片。对于口服的治疗性施药，活性成分可引入赋形剂，以可摄取的药片、口腔药片、片剂、胶囊、西也剂(elixir)、悬浮液、糖浆、干胶片等形式使用。这样的组合物和制备物应含有至少1％重量的活性化合物。组合物和制备物的百分比当然可以改变，可方便地介于单位重量的大约5％至大约80％。这样的治疗上有用的组合物中的活性化合物的量为可获得合适的剂量。根据本发明所述的优选的组合物或制备物制成口服剂量单位，含有介于大约0.1μg至200mg的活性化合物。替代的剂量包括从大约1μg至大约100mg和从大约10μg至大约500mg。这些剂量可以是每个个体或者每千克体重。施药可以是每小时、每天、每周、每月或每年。
药片、片剂、药丸、胶囊等也可含有下列的成分。可加入粘合剂例如橡胶、阿拉伯树胶、玉米淀粉或凝胶；赋形剂例如磷酸二钙；崩解剂例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、褐藻酸等；润滑剂例如硬脂酸镁；以及甜味剂例如蔗糖、乳糖或糖精或芳香剂例如薄荷油、鹿蹄草油或樱桃芳香。当剂量单元形式为胶囊时，除了以上类型的材料外，它可含有液态载体。各种其他材料可以包被而存在或者改变剂量单元的物理形式。例如药片、药丸或胶囊可以虫漆(shellac)、糖或二者同时包被。糖浆或西也剂可含有活性化合物、作为甜味剂的蔗糖，作为防腐剂的对羟基苯甲酸甲酯(methylparaben)和对羟基苯甲酸丙酯(propylparaben)，色素和芳香剂。当然，用于制备任何计量单元形式的任何材料必须是药学上纯的和在所用的量上为实质上无毒性的。而且，可将活性化合物引入缓释制备物和制剂。
如上所述，本发明还延伸至来自如这里所述的HBV变体的分离的HBsAg。更特别地，本发明提供HBsAg或其重组形式或其衍生物或化学等价物。分离的表面成分和(更特别的)分离的表面抗原或其重组、衍生物或化学等价物可用于发展生物组合物例如疫苗制剂。
另一个方面提供包含HBV变体和一个或多个药学上可接受的载体和/或稀释剂的组合物，该HBV变体对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或来自所述HBV变体的HBV表面抗原或其重组或衍生物形式或其化学等价物呈抗性。这样的组合物可认为是治疗性组合物，可用于产生免疫反应包括体液反应。通常，HBV变体为“缺陷型”，其本身不能在个体中引起持续的感染。
如上所述，可产生针对突变HBV试剂产生抗体并用于针对这些病毒感染的被动或直接疫苗接种。抗体可在人或非人类动物中产生。如果是后者，则非人类抗体在使用前需要去免疫或更明确地，人源化。去免疫可包括例如从鼠科或非人类动物的抗HBV抗体的可变区移植补体决定区(CDR)至人的共有抗体结合片段(Fab)多肽。或者，抗体的可变区内的决定表位的氨基酸可被突变以致表位不能再被人类MHC II复合体所识别。
在核酶、反义或共抑制(RNAi)或siRNA或其复合物的范围内涉及到抑制，这是为了便利地在转录后基因沉默。可使用DNA或RNA或者可应用包含对HBV的mRNA特异性的RNAi或其化学类似物的复合物。
所用这样的分子可被引入药物组合物。
在另一个具体实施方式中，提供生物组合物，其包含HBV变体或HBsAg或来自所述HBV变体的L、M或S蛋白或其重组或衍生物形式或其化学等价物。
通常，如果使用HBV，它首先被削弱。生物组合物通常还包含一个或多个药学上可接受的载体和/或稀释剂。
生物组合物可包含来自一个HBV变体的HBsAg或类似分子或者组合物为来自一系列ADV-和/或LMV-和/或FTC-LdT-和/或TFV抗性HBV变体的HbsAg或L、M或S蛋白或类似分子的鸡尾酒。当组合物包含HBV时，可适用类似的包含物。
还提供缺陷型HBV变体在制备用于接种个体来抵抗HBV株(其具有特别的核苷酸序列或编码特别的聚合酶或表面抗原或L、M或S蛋白)感染的治疗性疫苗中的用途。
合适的候选疫苗的例子为HBV变体的缺陷型形式，其包含选自以下的突变：在一个具体实施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W，在另一个具体实施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一个具体实施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一个具体实施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一个具体实施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一个具体实施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtI254I/F，或另一个具体实施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一个具体实施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一个具体实施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一个具体实施方式中包括rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V，或其组合或等价的突变；在一个具体实施方式中包括sI92T/I、sL175F和sI195M，在另一个具体实施方式中包括sS207R，或另一个具体实施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一个具体实施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一个具体实施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一个具体实施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一个具体实施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL162I和sI195M或其组合或等价的突变。
例如在一个具体实施方式中，HBV变体可通过其聚合酶内对核苷或核苷酸类似物引起抗性或减少的敏感性的特别的突变来进行鉴定。然后可将这种变体突变以使其成为缺陷型，即削弱或不能引起感染。然后这样的缺陷型的、核苷或核苷酸类似物抗性的病毒可用作治疗性疫苗以抵抗在聚合酶里具有相同突变的的剧毒性病毒。
本发明延伸至用于检测HBV变体的试剂盒，所述HBV变体对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合呈抗性。这样的试剂盒可含有例如来自PCR或其他核酸杂交技术的反应试剂或用于基于免疫的检测技术的反应试剂。特别有用的检测包括固定化寡核苷酸或寡肽介导的监测系统所需的反应试剂和成分。
另一个方面考虑确定HBV针对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合而表现出减少的敏感性的潜力的方法，所述方法包含从所述HBV中分离DNA或相应的mRNA并筛选编码HBV的DNA聚合酶的核苷酸序列中的突变，该突变导致在所述DNA聚合酶的任何一个或多个的F和G结构域和A至E结构域或其临近区域内的至少一个氨基酸的增加、取代和/或缺失并和针对ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合的抗性或减少的敏感性相关联，其中这样的突变的存在是对所述ADV、LMV、TFV、LdT、ETV或FTC；ADV和LMV；ADV和TFV；LMV和TFV；FTC和ADV；FTC和TFV；FTC和LMV；ETV和ADV；ETV和LMV；ETV和FTC；ETV和TFV；ADV和LMV和TFV；或ADV和FTC和TFV；TFV和FTC和LMV；ADV和LMV和ETV、ADV和ETV和TFV；ETV和LMV和TFV；ADV和LMV和FTC；ADV和FTC和LMV和TFV；ETV和FTC和LMV和TFV；ADV和ETV和LMV和TFV；ADV和FTC和ETV和TFV；ADV和FTC和LMV和ETV；或ADV和FTC和LMV和TFV和ETV和/或任选的其他核苷或核苷酸类似物或其他抗HBV试剂或其组合的可能的抗性的指征。
评价潜在的病毒变体对于选择合适的治疗性程序来说是重要的。这样的评价可合适地通过带有软件的计算机程序的帮助来促进，所述软件还特别加入与病毒变体相关的至少两个特征的输入代码以提供对应于病毒变体针对特别的化学化合物或免疫试剂的抗性或敏感性的数值。该数值可选自(a)针对特别的化合物或免疫试剂的减少的敏感性表现出抗性的能力；(b)来自野生型HBV的改变的DNA聚合酶；(c)来自野生型HBV的改变的表面抗原；或(d)病人的发病率或恢复潜力。因此，根据本发明，这样特点的数值被存储于机器可读贮存介质，该介质能够处理数据以提供特别的病毒变体或包含特别病毒变体的生物样品的数值。
因此，在另一个方面，考虑计算机程序产品以评估病毒变体或包含病毒变体的生物样品的可能的有用性，以确定个体中合适的治疗程序(图15)，所述产品包含：
(1)作为至少两个特征的输入代码而接收的代码，所述特征为与病毒试剂或包含病毒试剂的生物样品相关，其中所述特征选自：
(a)针对特别的化合物或免疫试剂的减少的敏感性表现出抗性的能力；
(b)来自野生型HBV的改变的DNA聚合酶；
(c)来自野生型HBV的改变的表面抗原；或
(d)病人的发病率或恢复潜力；
(2)将所述输入代码加入的代码，以提供对应于所述病毒变体或生物学样品的总和；和
(3)存储代码的计算机可读性介质。
在一个相关的方面，提供计算机以评估个体中病毒变体或包含病毒变体的生物样品的可能的有用性，其中所述计算机包含：
(1)机器可读的数据存储介质，其包含由机器可读数据编码的数据存储材料，其中所述机器可读数据包含与所述病毒变体或生物样品相关的至少两个特点的输入代码；其中所述特点选自：
(a)针对特别的化合物或免疫试剂的减少的敏感性表现出抗性的能力；
(b)来自野生型HBV的改变的DNA聚合酶；
(c)来自野生型HBV的改变的表面抗原；或
(d)病人的发病率或恢复潜力；
(2)用于储存处理所述机器可读数据的指令的工作内存；
(3)中央处理器，其与所述工作内存和所述机器可读数据的贮存介质相连，用于处理所述机器可读数据以提供对应于所述化合物数值的所述输入代码的总和；和
(4)与所述中央处理器相连的输出硬件，用于接收所述数值。
本发明考虑任何一般的或特别目的的计算机系统，包括处理器，处理器同时与内存和至少一个输入/输出设备进行电子通讯。图15显示通常合适的计算机系统。这样的系统可包括但不限于，个人电脑、工作站或主机。处理器可以是一般目的的处理器或微处理器或特别处理器，其执行位于RAM内存中的程序。程序可置于来自贮存设备的RAM，例如磁盘或预编程的ROM内存。在一个具体实施方式中RAM内存同时用于数据存储和程序执行。计算机系统也包含一种系统，其中处理器和内存位于不同物理实体，但通过网络的方式进行电子通讯。
在一个替代的具体实施方式中，程序筛选以下突变：在一个具体实施方式中包括，rtS256R/S和rtW257G/W，在另一个具体实施方式中包括rtH9D、rtL180M、rtM204V、rtT184S和rtN238T，或另一个具体实施方式中包括rtQ215S、rtR242K/R、和rtW243R/W，或另一个具体实施方式中包括rtN118S、rtR120R、rtT184A和rtY257H，或另一个具体实施方式中包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T/I、rtT240N/T、rtK241R和rtH248N，或另一个具体实施方式中包括rtL180M、rtA181V、rtM207V、rtH216H/P、rtE218D/E、rtH238D、rtR242K/R、rtW243G/W和rtI254I/F，或另一个具体实施方式中包括rtY221H/Y、rtV214A、rtA181A/V和rtN236T，或另一个具体实施方式中包括rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，或另一个具体实施方式中包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S或者最后在另一个具体实施方式中包括rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V，或其组合或等价的突变；在一个具体实施方式中包括sI92T/I、sL175F和sI195M，在另一个具体实施方式中包括sS207R，或另一个具体实施方式中包括sI110V和sP120Q，或另一个具体实施方式中包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y，或另一个具体实施方式中包括sF134L/F和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sC76Y和sL173F，或另一个具体实施方式中包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M，或另一个具体实施方式中包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y，最后在另一个具体实施方式中包括sL20F、sI42L、sV144D、sL162I和sI195M或其组合或等价的突变。
本发明由以下非限定性实施例进一步描述。
实施例
实施例1
HBV的交迭基因组
HBV的交迭基因组显示于图1。编码DNA聚合酶(P)的基因与病毒被膜基因Pre-S1和Pre-S2交迭，并与X和核心(C)基因部分交迭。HBV被膜包含小的、中的和大的HBV表面抗原。大的蛋白成分被称为HBV表面抗原(HBsAg)并由S基因序列所编码。Pre-S1和Pre-S2基因序列编码其他的被膜成分。
实施例2
接受TFV和LMV的病人以及HBV DNA的分析
病人A：在TFV和LMV治疗中，通过测序检测到独特的的HBV突变(表4)。这个病人在治疗中病毒突破(virological breakthrough)中选择独特的rtS256R/S和rtW257G/W突变(表4，图4、5和6)。这些变化不改变交迭读码框中的HBsAg，因为它们位于HBsAg读码框的终止密码子之后。
病人B：在TFV和LMV治疗中，通过测序检测到独特的HBV突变(表5和图7、8和9)。HBV DNA聚合酶的rt区域的独特变化包括rtL180M+rtM204V，其以前曾被证明与密码子184处的突变(rtT184S)和rtH9D和rtN238T协力而与LMV抗性相关。以前曾注意到在rt内密码子184处的变化与ETV+/-LMV抗性有关(Tenney等人，Antimicrob Agents Chemother 48(9)：3498-507，2004)但未报道与TFV+LMV抗性和治疗中的病毒突破有关。
TFV和LMV治疗中HBsAg的变化包括sI92T/I、sL175F和sI195M。后两个变化分别对应于聚合酶中rtT184S和rtM204V。
病人C：在表6和图10、11、12中列出在LMV和TFV治疗中的HBV突变。HBV DNA聚合酶的rt区域的独特变化包括rtR242K/R、W243R/W和rtQ215S。LMV和TFV治疗中HBsAg的变化包括sS207R。
病人D：在表7和图13、14、15中列出在LMV和TFV治疗中的HBV突变。HBV DNA聚合酶的rt区域的独特变化包括rtT184A和rtY257H，其他的变化包括rtN118S和rtR102E。
LMV和TFV治疗中HBsAg的变化包括sI110V和sP120Q。
实施例3
抗病毒治疗中的病人和HBV DNA的分析
用核苷(核苷酸)类似物治疗慢性乙型肝炎病毒的病人可导致对编码突变(该突变与对抗病毒试剂的减少的敏感性相关)的HBV变体的选择。
对ADV的抗性与位于rtN236T的推定的三磷酸结合位点处的突变相关(Angus等人，Gastroenterolog.125(2)：292-297，2003)。因此在这个区域的通过ADV或其他抗病毒治疗而选择的其他突变对于ADV和/或其他核苷(核苷酸)治疗的抗病毒抗性来说是重要的。重要的密码子包括239(其为高度保守的)、240、241、242和243。
除了在rtN236T处的突变，其他的突变可增加抗性和/或复制。一个这样的突变位于密码子221。
病人E：在表8和图16、17和18中列出LMV治疗中HBV的突变。HBV DNA聚合酶的rt区域的独特变化包括rtT240N/T和rtK241R。其他重要的变化包括rtH216H/P、rtL229M/L、rtI233T。
LMV治疗中HBsAg的变化包括sF80S、sI208I/L、sS210K、sF220L/F和sY225H/Y。
病人F：在表9和图19、20和21中列出LMV治疗中HBV的突变。HBV DNA聚合酶的rt区域的独特变化包括rtR242R/K和rtW243G/W。其他重要的变化包括rtL180M、rtA181T、rtH216H/P和rtE218D/E，所有其他的变化见表9。
LMV治疗中HBsAg的变化和靠近“a”决定簇的变化包括sF134L/F和sL173F(所有其他的变化见表9)。
病人G：在表10和图22、23和24中列出LMV治疗中HBV的突变。HBV DNA聚合酶的rt区域的独特变化包括rtY221H/Y。其他重要的独特变化包括rtV214A、rtA181A/V和rtN236T(所有其他的变化见表9)。
LMV治疗中HBsAg的变化和靠近“a”决定簇的变化包括sL173F(所有其他的变化见表9)。
病人H：病人H曾经经过一些核苷/核苷酸类似物治疗，并单独对LMV、然后是ETV，然后是ADV呈抗性。然后以LMV和ADV和ETV的组合来治疗该病人，现在对所有这些试剂呈抗性。在图25、26和27中列出治疗中HBV的突变。这个病人选择以下突变的独特的组合：rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V。
这包括已知的LMV抗性突变(位于rtL180M和rtM204V)也包括已知的ETV抗性突变(位于rtL180M、rtT184G、rtS202I和rtM204V)。这个病人在密码子236处在rtN236I/D/V选择独特突变(其以前未被报道与ADV抗性相关)。所有这些突变可能对于组合的ADV、LMV和ETV抗性突变来说是重要的。
HBsAg的变化包括sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M。
病人I：病人I曾经经过LMV然后是ADV治疗，这个病人现在由TFV和LMV进行治疗，并选择与对这些试剂呈减少的敏感性相关的突变。在图28、29和30中列出TDF和LMV治疗中HBV的突变。。
这包括rtF61L、rtS78T、rtV84M/V、rtV142E、rtQ149Q/R、rtM204I/M、rtI233T/I和rtS246H/P/Y/S的突变。特别地，从这个病人TFV治疗前分离的HBV中以前未检测到rtI233T/I的突变。
HBsAg的变化包括sC69Stop、sM75I/M、sY134N、sK141K/E、sP178P/L、sW196stop/W、s210R/S和sY225H/Y。
病人J：病人J曾经经过LMV治疗，并选择与LMV抗性相关的突变，这包括聚合酶突变(rtI29L、rtY50S、rtP170H、rtL180M、rtM204V和rtI253V)以及被膜突变(sL20F、sI42L、sV144D、sL162I和sI195M)。
接下来这个病人以ADV进行治疗而没有反应，然后以ETV治疗还是没反应。这建议这个病人可以在LMV治疗中选择可以影响接下来的抗病毒无反应或对ADV然后是ETV的初级抗性的突变。
特别地，在rtI253V和rtP170H的突变对于针对ADV然后是ETV的初级抗性来说是重要的。
实施例4
病毒标记的检测
使用市面有售的免疫检测(Abbott Laboratories，North Chicago，IL，USA)测定乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、乙型肝炎e抗原(HBeAg)、抗HBe和乙型肝炎核心抗原(HBcAg)特异性IgG和IgM。使用捕获杂交测试，根据生产商的说明(DigeneHybrid Capture II，Digene Diagnostics Inc.，Beltsville，MD)测定乙型肝炎病毒DNA水平。生产商指明的检测临床样品中HBV病毒血症的切断(cut-off)为0.7x106拷贝/ml或2.5pg/ml[Hendricks等人，Am J Clin Pathol 104：537-46，1995]。也可使用其他商售试剂盒来对HBV DNA水平进行定量，例如Cobas amplification HBVmonitor kit(Roche)。
实施例5
HBV DNA的测序
从100μl血清中提取HBV DNA，如Aye等人J.Hepatol.26：1148-1153，1997所述。用Geneworks，Adelaide，Australia合成寡聚核苷酸。HBV聚合酶基因的扩增由Aye等人1997如上所描述。
使用来自MO BIO Laboratories Inc(La Jolla，CA)的PCR纯化柱对特定的扩增产物进行纯化，然后使用Big Dye terminator Cycle sequencing Ready Reaction Kit(Perkin Elmer，Cetus Norwalk，CT)直接进行测序。PCR引物用作测序引物，OS15′-GCC TCA TTT TGT GGG TCA CCA TA-3′(nt 1408-1430)[SEQ ID NO：1]，TTA35′-AAA TTC GCA GTC CCC AAA-3′(nt2128-2145)[SEQ ID NO：2]，JM 5′-TTGGGG TGG AGC CCT CAG GCT-3′(nt1676-1696)[SEQ ID NO：3]，TTA4 5′-GAA AATTGG TAA CAG CGG-3′(nt 2615-2632)[SEQ ID NO：4]，OS2 5′TCT CTG ACA TACTTT CCA AT 3′(nt 2798-2817)[SEQ ID NO：5]，以对PCR产物的中间区域进行测序。
实施例6
阿德福韦酯(ADV)
ADV(以前为Bis-pom PMEA)为HBV复制的有力抑制剂。在图2中显示ADV的结构，其合成由Benzaria等人，J Med Chem.39：4958-4965，1996所描述。
实施例7
泰诺福韦(TFV)
TFV(以前为Bis-pom PMPA)为HBV复制的有力抑制剂。在图3中显示泰诺福韦的结构，其合成由Srinivas和Fridland，Antimicrob Agents Chemother.42(6)：1484-1487，1998所描述。
本领域技术人员认识到，这里所描述的本发明可进行除那些所特别描述之外的改变和修改。应该理解本发明包括所有这些改变和修改。本发明也个别地或联合地包括本说明书中所提及或指明的个别的或全体的所有的步骤、特点、组合物和化合物，以及任何两个或两个以上所述步骤或特点的任何和所有组合。
表4
在TFV/LMV治疗中所检测到的病人A的HBV聚合酶和被膜的突变
                 ALT
病毒载量
                 (IU/ml)           G′型        聚合酶#
(IU/ml)
                 114               A            野生型
                 25                PCR-ve
                 24                PCR-ve
                                                S256R/S
1.79E+07                           A            W257G/w
表5
在TFV/LMV治疗中所检测到的病人B的HBV聚合酶和被膜的突变
              ALT
病毒载量
              (IU/ml)      G′型      聚合酶#      HBsAG#
(IU/ml)
                           C           H9D         I92T/I
                                       L180M       L175F
                                       T184S       I195M
                                       M204V
1.99E+07                   C           H9D         I92T/I
                                       L180M       L175F
                                       T184S       I195M
                                       M204V
                                       N238T
1.06E+06                   C           H9D         I92T/I
                                       L180M       L175F
                                       T184S       I195M
                                       M204V
                                       N238N/T
1.42E+05                   C           H9D         I92T/I
                                       L180M       L175F
                                       T184S       I195I/M
                                       M204/V
1.00E+08                   C           H9D         I92T/I
                                       L180M       L175F
                                       T184S       I195M
                                       M204V
                                       N238T
表6
在TFV/LMV治疗中所检测到的病人C的HBV聚合酶和被膜的突变
              ALT
病毒载量
              (IU/ml)      G′型      聚合酶#      HBsAG#
(IU/ml)
1.70E+09      71           D          V191I/V      W182＊/W
                                      Q215P/S      S207R
              55           D          V191I/V      W182＊/W
                                      Q215P/S      S207R
2.82E+05                   D          Q215S        S207R
                                      R242K/R
                                      W243R/W
表7
在TFV和LMV治疗中所检测到的病人D的HBV聚合酶和被膜的突变
              ALT
病毒载量
              (IU/ml)      G′型      聚合酶#      HBsAG#
(IU/ml)
                           D          N118S        I110V
                                      R120R        P120Q
                                      T184A
                                      Y257H
表8
在LMV治疗中所检测到的病人E的HBV聚合酶和被膜的突变
              ALT
病毒载量
              (IU/ml)      G′型      聚合酶#      HBsAG#
(IU/ml)
                           D          F122V/F      F80S
                                      S135Y        I208I/L
                                      H216H/P      S210K
                                      L229M/L      F220L/F
                                      I233T/I      Y225H/Y
                                      T240N/T
                                      K241R
表9
在LMV治疗中所检测到的病人F的HBV聚合酶和被膜的突变
              ALT
病毒载量
              (IU/ml)      G′型      聚合酶#      HBsAG#
(IU/ml)
                           B          N124D        F134L/F
                                      S135A        L173F
                                      S143T/S      I208I/L
                                      L180M        S210T/S
                                      A181V
                                      H216H/P
                                      E218D/E
                                      H238D
                                      R242K/R
                                      W243G/W
                                      I254I/f
表10
在ADV治疗中所检测到的病人G的HBV聚合酶和被膜的突变
              ALT
病毒载量
              (IU/ml)      G′型      聚合酶#      HBsAG#
(IU/ml)
1.98E+06      467          B          L115M        W196S
                                      M204I
                                      V214A
                                      M250I
1.42E+05                              PCR-ve
1.61E+04                              PCR-ve
2.00E+03                              PCR-ve
                           B          N53D         C76Y
                                      L115M        L173L/F
                                      A181A/V
                                      V214A
                                      Y221H/Y
                                      N236T
参考文献
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Benzaria等人，J Med Chem.39：4958-4965，1996
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Kruger等人，Hepatology 22：219A，1994
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Ying等人，J.Viral Hepat.7(1)：79-83，2000
Ying等人，J Viral Hepat.7(2)：161-165，2000
序列表
<110>墨尔本保健公司
奥斯丁保健公司
贝赛德保健公司
圣文森特医院墨尔本有限公司
南方保健公司
A·巴托洛梅乌兹(只是美国)
H·蒂利曼(只是美国)
T·博克(只是美国)
A·艾尔斯(只是美国)
L·然(只是美国)
P·安格斯(只是美国)
J·萨萨德兹(只是美国)
P·德斯蒙德(只是美国)
B·西弗茨(只是美国)
S·莱温(只是美国)
S·洛卡尼(只是美国)
<120>抗病毒抗性突变的检测和应用
<130>30233875/EJH
<150>AU 2006903065
<151>2006-06-06
<160>26
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>23
<212>DNA
<213>pcr引物
<400>1
gcctcatttt gtgggtcacc ata                                      23
<210>2
<211>18
<212>DNA
<213>pcr引物
<400>2
aaattcgcag tccccaaa                                            18
<210>3
<211>21
<212>DNA
<213>pcr引物
<400>3
ttggggtgga gccctcaggc t                                        21
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>pcr引物
<400>4
gaaaattggt aacagcgg                                            18
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>pcr引物
<400>5
tctctgacat actttccaat                                          20
<210>6
<211>987
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>6
tccacctcta agagacagtc atcctcaggc catgcagtgg aattccactg ccttccacca    60
agctctgcag gatcccagag tcaggggtct gtattttcct gctggtggct ccagttcagg    120
aacagtaaac cctgctccga atattgcctc tcacatctcg tcaatctccg cgaggactgg    180
ggaccctgtg acgaacatgg agaacatcac atcaggattc ctaggacccc tgctcgtgtt    240
acaggcgggg tttttcttgt tgacaagaat cctcacaata ccgcagagtc tagactcgtg    300
gtggacttct ctcaattttc tagggggatc acccgtgtgt cttggccaaa attcgcagtc    360
cccaacctcc aatcactcac caacctcctg tcctccaatt tgtcctggtt atcgctggat    420
gtgtctgcgg cgttttatca tattcctctt catcctgctg ctatgcctca tcttcttatt    480
ggttcttctg gattatcaag gtatgttgcc cgtttgtcct ctaattccag gatcaacaac    540
aaccagtacg gggccatgca aaacctgcac gactcctgct caaggcaact ctatgtttcc    600
ctcatgttgc tgtacaaaac ctacggatgg aaattgcacc tgtattccca tcccatcgtc    660
ctgggctttc gcaaaatacc tatgggagtg ggcctcagtc cgtttctctt ggctcagttt    720
actagtgcca tttgttcagt ggttcgtagg gctttccccc actgtttggc tttcagctat    780
atggatgatg tggtattggg ggccaagtct gtacagcatc gtgagtccct ttataccgct    840
gttaccaatt ttcttttgtc tctgggtata catttaaacc ctaacaaaac aaaaagatgg    900
ggttattccc taaacttcat gggttacata attggaagkk ggggaacatt gccacaggat    960
catattgtac aaaagatcaa acactgt                                        987
<210>7
<211>331
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>7
Ser Thr Ser Lys Arg Gln Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Phe His
1               5                   10                  15
Cys Leu Pro Pro Ser Ser Ala Gly Ser Gln Ser Gln Gly Ser Val Phe
            20                  25                  30
Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Glu Tyr
        35                  40                  45
Cys Leu Ser His Leu Val Asn Leu Arg Glu Asp Trp Gly Pro Cys Asp
    50                  55                  60
Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val
65                  70                  75                  80
Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala Glu
                85                  90                  95
Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Ile Thr Arg
            100                 105                 110
Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn
        115                 120                 125
Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala
    130                 135                 140
Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Ile
145                 150                 155                 160
Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser
                165                 170                 175
Arg Ile Asn Asn Asn Gln Tyr Gly Ala Met Gln Asn Leu His Asp Ser
            180                 185                 190
Cys Ser Arg Gln Leu Tyr Val Ser Leu Met Leu Leu Tyr Lys Thr Tyr
        195                 200                 205
Gly Trp Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Val Leu Gly Phe Arg
    210                 215                 220
Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe
225                 230                 235                 240
Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu
                245                 250                 255
Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln
            260                 265                 270
His Arg Glu Ser Leu Tyr Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu
        275                 280                 285
Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu
    290                 295                 300
Asn Phe Met Gly Tyr Ile Ile Gly Arg Ser Gly Trp Gly Thr Leu Pro
305                 310                 315                 320
Gln Asp His Ile Val Gln Lys Ile Lys His Cys
                325                 330
<210>8
<211>291
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>8
Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr
1               5                   10                  15
Ala Phe His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe
            20                  25                  30
Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile
        35                  40                  45
Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr
    50                  55                  60
Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu
65                  70                  75                  80
Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser
                85                  90                  95
Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ser Pro Val
            100                 105                 110
Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr
        115                 120                 125
Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg
    130                 135                 140
Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu
145                 150                 155                 160
Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro
                165                 170                 175
Gly Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro
            180                 185                 190
Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr
        195                 200                 205
Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala
    210                 215                 220
Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu
225                 230                 235                 240
Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp
                245                 250                 255
Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Ser
            260                 265                 270
Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp
        275                 280                 285
Val Tyr Ile
    290
<210>9
<211>3197
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>9
atgcccctat cttatcaaca cttccggaaa ctactgttgt tagacgacga ggcaggtccc    60
ctagaagaag aactccctcg cctcgcagac gaaggtctca atcgccgcgt cgcagaagat    120
ctaaatctcg ggaatctcaa tgttagtatc ccttggactc ataaggtggg aaactttact    180
gggctttatt cttctactgt acctgtcttt aatcctgact ggcaaactcc ctcttttcct    240
cacattcatt tgaaagagga tattattgat agatgtcaac aatatgtagg ccctcttaca    300
gttaacgaaa aaaggagatt aaaattgatt atgcctgcta gattctatcc taaccgtacc    360
aaatatttgc ccttagataa aggcattaar ccttattatc ctgaacacac agttaatcat    420
tacttccaaa ctaggcatta yttacatact ctgtggaagg ctggtatttt atataagaga    480
gaaactactc gcagcgcctc attctgtggg tcaccatatt cttgggaaca agagctacag    540
catgggaggt tcgtattcca aacctcgaca aggcatgggg acgaatcttt ctgttcccaa    600
tcctctggga ttctttcccg atcaccagtt ggacccggca ttcagagcca attcaaacaa    660
tccagattgg gacttcaacc ccaacaagga tcaatggcck gcggcacacc aggtaggagt    720
gggatccttc gggccagggt tcactccacc acacggcaat cttttggggt ggagccctca    780
ggctcagggc atrttgacaa cagtrccagc rgcgcctcct cctgcctcca ccaatcggca    840
gtcaggaaga cagcctactc ccatctctcc acctctraga gacagtcatc ctcaggccac    900
attccaccaa gctctgctag atcccagagt gaggggccta tacyttcctg ctggtggctc    960
cagttccgga acagtraacc ctgttccgac tactgcctct cccatatcgt caatcttctc    1020
gaggactggg gaccctgcac cgaagatgga gagcaccaca tcaggattcc taggacccct    1080
gctcgtgtta caggcggggt ttttcttgtt gacaagaatc ctcacaatac cacagagtct    1140
agactcgtgg tggacttctc tcaattttct agggggagca cccacgtgtc ctggccaaaa    1200
tttgcagtcc ccaacctcca atcactcacc aacctcttgt cctccaattt gtcctggtta    1260
tcgctggatg tgtctgcggc gttttatcat attcctcttc atcctgctgc tatgcctcay    1320
cttcttgttg gttcttctgg actaycaagg tatgttgccc gtttgtcctc tacttccagg    1380
aacatcaacy accagcacgg gaccatgcaa gacctgcacg actcctgctc aaggaacctc    1440
tatgtttccc tcttgttgct gtacaaaacc ttcggacgga aattgcactt gtattcccat    1500
cccatcatct tgggctttcg caagattcct atgggagtgg gcctcagtcc gtttctcatg    1560
gctcagtttt ctagtgccat ttgttcagtg gttcgtaggg ctttccccca ctgtttggct    1620
ttcagttatg tggatgatgt ggtattgggg gccaagtctg tacaacatct tgaatccctt    1680
tttaccgctg ttaccaattt tcttttgtct ttgggtatac atttaaaccc tactaaaact    1740
aaacgttggg gctactccct tcacttcatg ggwtatgtaa ttggaagttg gggtacctta    1800
ccacaggaac atattgtaca caaaatcaaa caatgttttc ggaaacttcc tataaataga    1860
cctattgatt ggaaagtatg tcaacgaatt gtggggcttc taggctttgc cgctcccttt    1920
acacaatgtg gttacccagc attaatgcct ttgtatgcat gtatacaagc taaacaggct    1980
ttcacttttt cgccaactta caaggccttt ctgtgtaaac aatatctgca cctttacccc    2040
gttgctcggc aacggtcagg tctttgccaa gtgtttgctg acgcaacccc cactggttgg    2100
ggcttggcca taggccatca gcgcmtgcgt ggaacctttg tggctcctct gccgatccat    2160
actgcggaac tcctagcagc ttgttttgct cgcagccggt ctggagcaaa cattatcggc    2220
accgacaact ctgttgtcct ctctcggaaa tacacctcct ttccatggct gctaggctgt    2280
gctgccaact ggatcctgcg cgggacgtcc tttgtctacg tcccgtcrgc gctgaatccc    2340
gcggacgacc cgtctcgggg caggttggga ctctaccgtc cccttcttcg tctgccgttc    2400
cggccgacca cggggcgcac ctctctttac gcggtctccc cgtctgtgcc ttctcatctg    2460
ccggaccgtg tgcacttcgc ttcacctctg cacgtcgcat ggaaaccacc gtgaacgccy    2520
gccaggtctt gcccaaggtc ttacataaga ggactcttgg actctcagca atgtcaacga  2580
ccgaccttga ggcatacttc aaagactgtg tatttacaga ctgggaggag ttgggggagg  2640
agactaggtt aatgatcttt gtactaggag gctgtaggca taaattggtc tgttcaccag  2700
caccatgcaa ctttttcacc tctgcctaat catctcttgt tcatgtccca ctgttcaagc  2760
ctccaagctg tgccttgggt ggctttgggg catggacatt gacacctata aagaatttgg  2820
agcttctgtg gagttactct cttttttgcc ttctgacttc tttccgaata ttcgtgatct  2880
cctcgacacc gcctctgctc tgcatcggga kgccttagag tctcmggaac attgttcmcc  2940
tcaccataca gcactaaggc aagctattgt gtgttggggt gagttgatga atctggccac  3000
ctgggtggga agtaatttgg aagacccagc atccagggaa ttagtagtaa gctatgtcaa  3060
cgttaatatg ggcctaaaaa tcagacaact attgtggttt cacatttcct gtcttacttt  3120
tggaagagaa actgttcttg agtatttggt gtcttttgga gtgtggattc gcactcctcc  3180
cgcttacaga ccaccaa                                                 3197
<210>10
<211>847
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>10
Met Pro Leu Ser Tyr Gln His Phe Arg Lys Leu Leu Leu Leu Asp Asp
1              5                   10                  15
Glu Ala Gly Pro Leu Glu Glu Glu Leu Pro Arg Leu Ala Asp Glu Gly
            20                  25                  30
Leu Asn Arg Arg Val Ala Glu Asp Leu Asn Leu Gly Asn Leu Asn Val
        35                  40                  45
Ser Ile Pro Trp Thr His Lys Val Gly Asn Phe Thr Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Ser Thr Val Pro Val Phe Asn Pro Asp Trp Gln Thr Pro Ser Phe Pro
65                  70                  75                  80
His Ile His Leu Lys Glu Asp Ile Ile Asp Arg Cys Gln Gln Tyr Val
                85                  90                  95
Gly Pro Leu Thr Val Asn Glu Lys Arg Arg Leu Lys Leu Ile Met Pro
            100                 105                 110
Ala Arg Phe Tyr Pro Asn Arg Thr Lys Tyr Leu Pro Leu Asp Lys Gly
        115                 120                 125
Ile Lys Pro Tyr Tyr Pro Glu His Thr Val Asn His Tyr Phe Gln Thr
    130                 135                 140
Arg His Tyr Leu His Thr Leu Trp Lys Ala Gly Ile Leu Tyr Lys Arg
145                 150                 155                 160
Glu Thr Thr Arg Ser Ala Ser Phe Cys Gly Ser Pro Tyr Ser Trp Glu
                165                 170                 175
Gln Glu Leu Gln His Gly Arg Phe Val Phe Gln Thr Ser Thr Arg His
            180                 185                 190
Gly Asp Glu Ser Phe Cys Ser Gln Ser Ser Gly Ile Leu Ser Arg Ser
        195                 200                 205
Pro Val Gly Pro Gly Ile Gln Ser Gln Phe Lys Gln Ser Arg Leu Gly
    210                 215                 220
Leu Gln Pro Gln Gln Gly Ser Met Ala Gly Cys Gly Thr Pro Gly Arg
225                 230                 235                 240
Ser Gly Ile Leu Arg Ala Arg Val His Ser Thr Thr Arg Gln Ser Phe
                245                 250                 255
Gly Val Glu Pro Ser Gly Ser Gly His Ile Val Asp Asn Ser Thr Ala
            260                 265                 270
Ser Ser Gly Ala Ser Ser Cys Leu His Gln Ser Ala Val Arg Lys Thr
        275                 280                 285
Ala Tyr Ser His Leu Ser Thr Ser Lys Glu Arg Gln Ser Ser Ser Gly
    290                 295                 300
His Ile Pro Pro Ser Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu Gly Pro Ile Pro
305                 310                 315                 320
Leu Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Glu Pro Cys Ser
                325                 330                 335
Asp Tyr Cys Leu Ser His Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro
            340                 345                 350
Cys Thr Glu Asp Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala
        355                 360                 365
Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr
    370                 375                 380
Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Ser
385                 390                 395                 400
Thr His Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu
                405                 410                 415
Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser
            420                 425                 430
Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu
        435                 440                 445
Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Pro Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser
    450                 455                 460
Ser Thr Ser Arg Asn Ile Asn His Tyr Gln His Gly Thr Met Gln Asp
465                 470                 475                 480
Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu
                485                 490                 495
Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile
            500                 505                 510
Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu
        515                 520                 525
Met Ala Gln Phe Ser Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe
    530                 535                 540
Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Val Asp Asp Val Val Leu Gly Ala
545                 550                 555                 560
Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe
                565                 570                 575
Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Thr Lys Thr Lys Arg Trp
            580                 585                 590
Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly Thr
        595                 600                 605
Leu Pro Gln Glu His Ile Val His Lys Ile Lys Gln Cys Phe Arg Lys
    610                 615                 620
Leu Pro Ile Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val
625                 630                 635                 640
Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala
                645                 650                 655
Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Ala Phe Thr Phe
            660                 665                 670
Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu His Leu Tyr
        675                 680                 685
Pro Val Ala Arg Gln Arg Ser Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala
    690                 695                 700
Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Leu Arg
705                 710                 715                 720
Gly Thr Phe Val Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu Ala
                725                 730                 735
Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn Ile Ile Gly Thr Asp
            740                 745                 750
Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu
        755                 760                 765
Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val
    770                 775                 780
Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly
785                 790                 795                 800
Leu Tyr Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg
                805                 810                 815
Thr Ser Leu Tyr Ala Val Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp
            820                 825                 830
Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Lys Pro Pro
        835                 840                 845
<210>11
<211>227
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>11
Met Glu Ser Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1               5                   10                  15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
            20                  25                  30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Aan Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys
        35                  40                  45
Pro Gly Gln Asn Leu Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
    50                  55                  60
Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65                  70                  75                  80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ile Phe Leu Leu
                85                  90                  95
Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro
            100                 105                 110
Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro
        115                 120                 125
Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser
    130                 135                 140
Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala
145                 150                 155                 160
Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Phe
                165                 170                 175
Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp
            180                 185                 190
Leu Ser Val Met Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn
        195                 200                 205
Ile Leu Asn Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp
    210                 215                 220
Val Tyr Ile
225
<210>12
<211>984
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>12
tccgcctcct gcctctacca atcgacagtc aggacggcag cctaccccgc tgtctccacc    60
tctgagaatc actcatcctc aggccatgca gtggaactcc acaaccttcc accaaactct    120
gcaagatccc aragtgagag gcctgkmtct ccctgctggt ggctccagtt caggaacagt    180
aaaccctgtt ccgactactg cctctcccat atcgwcaatc ttctcgagga ttggggaccc    240
tgcgctgaac atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc    300
ggggtttttc ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac    360
ttctctcaat tttctagggg gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac    420
ctccaatcac tcaccaacct cctgtcctcc aacttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct    480
gcggcgtttt atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct    540
tctggactat caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcat caaccaccag    600
cacgggaccc tgcagaacct gcacgactcc tgctcaagga acctctatgt atccctcctg    660
ttgctgtaca aaaccttcgg atggaaactg cacctgtatt cccatcccat catcctgggc    720
tttcggaaaa ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcttggctca gtttactagt    780
gccatttgtt cagtggttcg tagggctttc ccccattgtt tggctttcag ttatatggat    840
gatgtggtat tgggggccaa gtctgtatcg catcttgagt ccctttttac cgctgttacc    900
aattttcttt tgtctttggg tatacattta aaccctaaca aaacaaaaar awggggttat    960
tctctaaatt tcatgggcta tgtc                                           984
<210>13
<211>332
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>13
Ser Ala Ser Cys Leu Tyr Gln Ser Thr Val Arg Thr Ala Ala Tyr Pro
1               5                   10                  15
Ala Val Ser Thr Ser Glu Asn His Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu
            20                  25                  30
Leu His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu Arg Pro
        35                  40                  45
Gly Val Ser Pro Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys
    50                  55                  60
Ser Asp Tyr Cys Leu Ser His Ile Asp Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp
65                  70                  75                  80
Gly Pro Cys Ala Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr
                85                  90                  95
Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His
            100                 105                 110
Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg
        115                 120                 125
Gly Asn Tyr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln
    130                 135                 140
Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp
145                 150                 155                 160
Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro
                165                 170                 175
His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu
            180                 185                 190
Ser Ser Asn Ser Arg Ile Ile Asn His Gln His Gly Thr Leu Gln Asn
        195                 200                 205
Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu
    210                 215                 220
Tyr Lys Thr Phe Gly Trp Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile
225                 230                 235                 240
Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu
                245                 250                 255
Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe
            260                 265                 270
Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala
        275                 280                 285
Lys Ser Val Ser His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe
    290                 295                 300
Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Lys Arg
305                 310                 315                 320
Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val
                325                 330
<210>14
<211>313
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>14
Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Set Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu
1               5                   10                  15
Ser Pro Pro Leu Arg Ile Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser
            20                  25                  30
Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Lys Arg Val Arg Gly Leu
        35                  40                  45
Asp Ala Tyr Ser Leu Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn
    50                  55                  60
Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro Ile Ser Thr Ser Ile Phe Ser Arg
65                  70                  75                  80
Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu
                85                  90                  95
Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile
            100                 105                 110
Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe
        115                 120                 125
Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr
    130                 135                 140
Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg
145                 150                 155                 160
Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu
                165                 170                 175
Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro
            180                 185                 190
Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys
        195                 200                 205
Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys
    210                 215                 220
Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro
225                 230                 235                 240
Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg
                245                 250                 255
Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly
            260                 265                 270
Leu Ser Pro Ile Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp
        275                 280                 285
Gly Pro Ser Leu Tyr Arg Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro
    290                 295                 300
Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
305                 310
<210>15
<211>580
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>15
ttgtcctggt tatcgctgga tgtgtctgcg gcgttttatc atcttcctct tcatcctgct    60
gctatgcctc atcttcttgt tggttcttct ggactatcaa ggtatgttgc ccgtctgtcc    120
tctagttccg agatcttcaa ccaccagcgc gggacaatgc agaacctgca cgactactgc    180
tcaaggaacc tctatgtatc cctcctgttg ctgtaccaaa ccttcggacg gaaattgcac    240
ctgtattccc atcccatcat cctgggcttt cggaaaattc ctatgggagt gggcctcagt    300
ccgtttctcc tggctcagtt tgctagtgcc atttgttcag tggttcgtag ggctttcccc    360
cactgtttgg ctttcagtta tatggatgat gtggtattgg gggccaagtc tgtacaacat    420
cttgagtccc tttttaccgc tgttaccaat tttcttttgt ctttgggtat acatttaaat    480
cctaacaaaa ctaaaagatg gggttactct ttaaatttca tgggctatgt cattggatgt    540
catgggtcct tgccacaaga tcacatcata cagaaaatca                          580
<210>16
<211>193
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>16
Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro
1               5                   10                  15
Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu
            20                  25                  30
Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Ser Ser Glu Ile Phe Asn His
        35                  40                  45
Gln Arg Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp Tyr Cys Ser Arg Asn Leu
    50                  55                  60
Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg Lys Leu His
65                  70                  75                  80
Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly
                85                  90                  95
Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Ala Ser Ala Ile Cys
            100                 105                 110
Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met
        115                 120                 125
Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu
    130                 135                 140
Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn
145                 150                 155                 160
Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr
                165                 170                 175
Val Ile Gly Cys His Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile Gln Lys
            180                 185                 190
Ile
<210>17
<211>158
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>17
Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu
1               5                   10                  15
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr
            20                  25                  30
Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Val Pro Arg Ser Ser Thr Thr
        35                  40                  45
Ser Ala Gly Gln Cys Arg Thr Cys Thr Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser
    50                  55                  60
Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn Cys Thr
65                  70                  75                  80
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
                85                  90                  95
Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
            100                 105                 110
Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp
        115                 120                 125
Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe
    130                 135                 140
Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
145                 150                 155
<210>18
<211>965
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>18
ctaccaatcg acagtcaggg aggcagccta ccccgctgtc tccacctttg agaaacactc    60
atcctcaggc catgcagtgg aactccacaa ctttccacca aactctacaa gatcccaggg    120
tgagaggcct gtatttccct gctggtggct ccagttcagg aacagtaaac cctgttccga    180
ctactgcctc tcccatatcg tcaatcttct cgaggattgg ggaccctgcg ctgaacatgg    240
agaacatcac atcaggattc ctaggacccc tgctcgtgtt acaggcgggg tttttcttgt    300
tgacaaaaat cctcacaata ccgcagagtc tagactcgtg gtggacttct ctcaattttc    360
tagggggaac caccgtgtgt cttggccaaa attcgcagtc cccaacctcc aatcactcac  420
caacctcctg tcctccgact tgtcctggtt atcgctggat gtgtctgcgg cgttctatca  480
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gtatgttgcc cgtctgtcct ctaattccag gatcktcaac caccagcgcg ggaccatgca  600
gaacctgcac gactactgct caaggaacct ctatgtatcc ctcctgttgt tgtaccaaac  660
cttcggacgg aaattgcacc tgtattccca tcccatcatc ctgggctttc ggaaaattcc  720
tatgggagtg ggcctcagcc cgtttctcct ggctcagttt actagtgcca tttgttcagt  780
ggttcgtagg gctttccccc actgtttggc tttcagttat atggatgatg tggtattggg  840
ggccaagtct gttcagcmtc gtgaagccct ttttaccgct gttaccaatt ttcttwtgtc  900
tttgggtaya catttaaacc ctaacaaaam tagaagatgg ggttattcct taaatttcat  960
gggct                                                              965
<210>19
<211>326
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>19
Tyr Gln Ser Thr Val Arg Glu Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe
1               5                   10                  15
Glu Lys His Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu His Asn Phe Pro
            20                  25                  30
Pro Asn Ser Thr Arg Ser Gln Gly Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp
        35                  40                  45
Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser
    50                  55                  60
His Ile Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp Gly Pro Cys Ala Glu His Gly
65                  70                  75                  80
Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly
                85                  90                  95
Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu
            100                 105                 110
Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn His Arg Val Ser Trp
        115                 120                 125
Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser
    130                 135                 140
Ser Asp Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His
145                 150                 155                 160
Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser
                165                 170                 175
Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Val
            180                 185                 190
Phe Asn His Gln Arg Gly Thr Met Gln Asn Leu His Asp Tyr Cys Ser
        195                 200                 205
Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg
    210                 215                 220
Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile
225                 230                 235                 240
Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser
                245                 250                 255
Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe
            260                 265                 270
Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Pro
        275                 280                 285
Arg Glu Ala Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe Leu Met Leu Ser Leu
    290                 295                 300
Gly Thr Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Asn Thr Arg Arg Trp Gly Tyr
305                 310                 315                 320
Ser Leu Asn Phe Met Gly
                325
<210>20
<211>307
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>20
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu
1               5                   10                  15
Arg Asn Thr His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Thr Phe His
            20                  25                  30
Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly
        35                  40                  45
Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro
    50                  55                  60
Ile Ser Ser Ile Phe Ser Arg Ile Gly Asp Pro Ala Leu Asn Met Glu
65                  70                  75                  80
Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly
                85                  90                  95
Phe Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser
            100                 105                 110
Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly
        115                 120                 125
Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro
    130                 135                 140
Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Ser Ile Ile
145                 150                 155                 160
Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu
                165                 170                 175
Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser
            180                 185                 190
Thr Thr Ser Ala Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Thr Ala Gln Gly
        195                 200                 205
Thr Ser Met Tyr Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser Asp Gly Asn
    210                 215                 220
Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu
225                 230                 235                 240
Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro
                245                 250                 255
Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val
            260                 265                 270
Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Phe Ser Ile Leu Val
        275                 280                 285
Lys Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Leu Phe Cys Leu Trp Val
    290                 295                 300
His Tyr Ile
305
<210>21
<211>938
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>21
ctccaccacg ttccaccaaa ctcttcaaga tcccagagtc agggccctgt actttcctgc    60
tggtggctcc agttcaggaa cagtgagccc tgctcagaat actgtctctg ccatatcgtc    120
aatcttatcg aagactgggg accctgtacc gaacatggag aacatcgcat caggactcct    180
aggacccctg ctcgtgttac aggcggggtt tttctcgttg acaaaaatcc tcacaatacc    240
acagagtcta gactcgtggt ggacttctct caattttcta ggggaaacac ccgtgtgtct    300
tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acctgttgtc ctccaatttg    360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct    420
atgcctcatc ttcttgttgg ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tttgtcctct    480
aattccagga tcatcaacga ccagcaccgg accatgcaaa acctgcacaa cgcctgctca    540
aggaacctct atgttwccct catgttgctg tacaaaacct acggacggaa actgcacctg    600
tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg    660
tttctcatgg ttcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac    720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gttttggggg ccaagtctgt acaacmtctt    780
gastcccttt atgccgctgt taccaatttt cttctgtctt tgggtataca tttaaaccct    840
gacaaaacaa aaarakgggg atattccctc aacttcatgg gatatgtawt tgggagttgg    900
ggcacattgc cacaggaaca tattgtmcaa aaaatcaa                            938
<210>22
<211>318
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>22
Leu His His Val Pro Pro Asn Ser Ser Arg Ser Gln Ser Gln Gly Pro
1               5                   10                  15
Val Leu Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Glu Pro Cys Ser
            20                  25                  30
Glu Tyr Cys Leu Cys His Ile Val Asn Leu Ile Glu Asp Trp Gly Pro
        35                  40                  45
Cys Thr Glu His Gly Glu His Arg Ile Arg Thr Pro Arg Thr Pro Ala
    50                  55                  60
Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr
65                  70                  75                  80
Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn
                85                  90                 95
Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu
            100                 105                 110
Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser
        115                 120                 125
Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu
    130                 135                 140
Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser
145                 150                 155                 160
Asn Ser Arg Ile Ile Asn Asp Gln His Arg Thr Met Gln Asn Leu His
                165                 170                 175
Asn Ala Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Thr Ser Leu Met Leu Leu Tyr
            180                 185                 190
Lys Thr Tyr Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu
        195                 200                 205
Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Met
    210                 215                 220
Val Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro
225                 230                 235                 240
His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys
                245                 250                 255
Ser Val Gln His Pro Leu Asp Glu Ser Leu Tyr Ala Ala Val Thr Asn
            260                 265                 270
Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asp Lys Thr Lys Lys
        275                 280                 285
Arg Gly Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Phe Gly
    290                 295                 300
Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Gln Lys Ile
305                 310                 315
<210>23
<211>280
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>23
Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Ala Leu
1               5                   10                  15
Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Ser Pro Ala Gln
            20                  25                  30
Asn Thr Val Ser Ala Ile Ser Ser Ile Leu Ser Lys Thr Gly Asp Pro
        35                  40                  45
Val Pro Asn Met Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu Leu Gly Pro Leu Leu
    50                  55                  60
Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Ser Leu Thr Lys Ile Leu Thr Ile Pro
65                  70                  75                  80
Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Glu Thr
                85                  90                  95
Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln Ile Ser Ser His Ser
            100                 105                 110
Pro Thr Cys Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu
        115                 120                 125
Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe
    130                 135                 140
Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu
145                 150                 155                 160
Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr
                165                 170                 175
Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Leu Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr
            180                 185                 190
Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
        195                 200                 205
Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
    210                 215                 220
Phe Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro
225                 230                 235                 240
Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Phe Trp Gly Pro Ser
                245                 250                 255
Leu Tyr Asn Ile Leu Leu Thr Ser Pro Phe Met Pro Leu Leu Pro Ile
            260                 265                 270
Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
        275                 280
<210>24
<211>762
<212>DNA
<213>乙型肝炎病毒
<400>24
cagcgagccc tgctcagaat actgtctctg ccatatcgtc aatcttatcg aagactgggg    60
accctgtacc gaacatggag aacatcgcat caggactcct aggacccctg ctcgtgttac    120
aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc acagagtcta gactcgtggt    180
ggacttctct caattttcta ggggggacac ccgtgtgtct tggccaaaat tcgcagtccc    240
aaatctccag tcactcacca acttgttgtc ctccaacttg tcctggttat cgctggatgt    300
atctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct atgcctcatc ttcttgttgg    360
ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tatgtcctct aattccagga tcatcaacaa    420
ccagcaccgg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca aggaacctct atgtttccct    480
catgttgctg tacaaaacct acggacggaa actgcacctg tattcccatc ccatcatctt    540
gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg tttctcttgg ytcagtttac    600
tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac tgtctggctt tcagttatat    660
ggatgatgtg gttttggggg ccaagtctgc acaacatctt gagtccctty atgccgctgt    720
taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaacccct ca                       762
<210>25
<211>255
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>25
Ser Glu Pro Cys Ser Glu Tyr Cys Leu Cys His Ile Val Asn Leu Ile
1               5                   10                  15
Glu Asp Trp Gly Pro Cys Thr Glu His Gly Glu His Arg Ile Arg Thr
            20                  25                  30
Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys
        35                  40                  45
Asn Pro His Asn Thr Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln
    50                  55                  60
Phe Ser Arg Gly Asp Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro
65                  70                  75                  80
Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu
                85                  90                  95
Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala
            100                 105                 110
Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val
        115                 120                 125
Ala Arg Met Ser Ser Asn Ser Arg Ile Ile Asn Asn Gln His Arg Thr
    130                 135                 140
Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu
145                 150                 155                 160
Met Leu Leu Tyr Lys Thr Tyr Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His
                165                 170                 175
Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser
            180                 185                 190
Pro Phe Leu Leu Ala Val Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val
        195                 200                 205
Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val
    210                 215                 220
Val Leu Gly Ala Lys Ser Ala Gln His Leu Glu Ser Leu His Tyr Ala
225                 230                 235                 240
Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Thr Pro
                245                 250                 255
<210>26
<211>251
<212>PRT
<213>乙型肝炎病毒
<400>26
Ala Ser Pro Ala Gln Asn Thr Val Ser Ala Ile Ser Ser Ile Leu Ser
1               5                   10                  15
Lys Thr Gly Asp Pro Val Pro Asn Met Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu
            20                  25                  30
Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Lys
        35                  40                  45
Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn
    50                  55                  60
Phe Leu Gly Gly Thr Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Gln
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser His Ser Pro Thr Cys Cys Pro Pro Thr Cys Pro Gly Tyr
                85                  90                  95
Arg Trp Met Tyr Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Cys Ile Leu Leu
            100                 105                 110
Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu
        115                 120                 125
Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro
    130                 135                 140
Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser
145                 150                 155                 160
Cys Cys Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile
                165                 170                 175
Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val
            180                 185                 190
Arg Phe Ser Trp Leu Phe Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe
        195                 200                 205
Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp
     210                 215                 220
Phe Trp Gly Pro Ser Leu His Asn Ile Leu Ser Pro Phe Met Pro Leu
225                 230                 235                 240
Leu ProIle Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
               245                 250

Claims (2)

1.一种分离的乙型肝炎病毒变体，其对阿德福韦、恩替卡韦和拉米夫定表现出减少的敏感性，所述变体包含编码DNA聚合酶的逆转录酶部分的基因内的核苷酸突变，所述突变导致rtN236I/D/V取代，且其聚合酶变化为rtL42L/V、rtS78T、rtS85T、rtT128N、rtL180M、rtT184G、rtS202I、rtM204V和rtN236I/D/V，HBsAg的变化为sD33D/E、sC69Stop、sC76Stop、sR79H、sP120T、sL176V、sV194F和sI195M。
2.一种如权利要求1所述的乙型肝炎病毒变体在制备用于治疗个体中乙型肝炎病毒感染的药物中的用途。
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