JP2008534020A - 抗ウイルス性のヌクレオシド剤に耐性を示すb型肝炎ウイルスのバリアントおよびその応用法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は一般に、特定の薬剤に低い感受性を、および/または免疫学的試薬との低い相互作用力を示すウイルスのバリアントに関する。具体的には本発明は、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に完全な耐性もしくは部分的な耐性を、および/またはウイルスの表面成分に対する抗体との低い相互作用力(それらの抗体に対する低い感受性を含む)を示すB型肝炎ウイルス(HBV)のバリアントに向けられる。本発明はさらに、抗ウイルス治療レジメンのモニタリングに、およびウイルス性因子、特にHBVのバリアントに対する新規または修飾型のワクチンの開発に有用な、上記のウイルスのバリアントを検出するアッセイ法を企図している。本発明は、ウイルスの感染、複製、および/または放出を阻害可能な薬剤をスクリーニングするか、および/または開発もしくは設計するための、ウイルスのバリアントの使用も企図している。
本明細書で言及された出版物の書誌的詳細は、本明細書の最後にもまとめて記載してある。
本明細書の全体を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除いて、「〜を含む(comprise)」という表現、または「〜を含む(comprises)」または「〜を含む(comprising)」などの類似表現は、記載された要素もしくは整数、または要素群もしくは整数群が含まれるが、他の任意の要素もしくは整数、または要素群もしくは整数群が除外されないことを意味すると理解される。
本発明は部分的に、ADVもしくはLMVもしくはETV、または特にADVおよびLMVもしくはTFVおよびLMV、またはETV、ならびに任意で1種類もしくは複数の他のヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体、またはTFVやFTCなどの他の抗HBV剤のいずれかによる患者の治療後における、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に耐性のHBVのバリアントの同定および単離に基づいている。特に、ADVまたはADVおよびLMVまたはETVで治療された患者は、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETV、および/または任意で他のヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤、またはそれらの組合わせに対して低下した感受性すなわち低い感受性を示すHBVのバリアントを生じる。ただし、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件とする。本明細書において、ADVおよび/またはLMV、および/またはFTC、および/またはTFV、および/またはETVに対する感受性に関して「低下した」もしくは「低い」という場合は、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤に対する完全な耐性もしくは実質的な耐性、ならびに部分的な耐性を含みかつ包含し、ならびにヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または他の抗HBV剤の存在下で野生型を上回る複製速度もしくは複製効率を含む。1つの局面では、これは、治療中におけるウイルス量の増加によって簡便に測定されるか、または治療中に、治療前のHBVのDNAレベルからHBVのDNAウイルス量の実質的な減少はない(すなわち治療に対する反応がない)。
プラスミドベクターに含まれる、HBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製し、次に、細胞に該コンストラクトをトランスフェクトする段階;
細胞に、トランスフェクション前、トランスフェクション中、および/またはトランスフェクション後に、被験薬剤を接触させる段階;
該薬剤に耐性を示す場合に、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階;ならびに
続いて、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階。
細胞感染に有効な量の、バキュロウイルスゲノムまたはアデノウイルスゲノムに含まれるか、または融合された、HBVに由来する、複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製し、次に、細胞に該コンストラクトを感染させる段階;
細胞に、感染前、感染中、および/または感染後に、被験薬剤を接触させる段階;
該薬剤に耐性を示す場合に、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階;ならびに
続いて、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階。
感染性HBVゲノムが、2.2.15またはADなどであるがそれらに限定されない連続細胞系中に安定に組込まれるように、複製可能な有効量のHBVのゲノムの感染性コピーを含む連続細胞系を作製する段階;
細胞に、被験薬剤を接触させる段階;
薬剤に耐性を示す場合に、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階;ならびに
続いて、細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階。
プラスミドベクターに含まれる、HBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製し、次に、細胞に該コンストラクトをトランスフェクトする段階;
該細胞に、トランスフェクション前、トランスフェクション中、および/またはトランスフェクション後に、被験薬剤を接触させる段階;
該薬剤に耐性を示す場合に、該細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階;ならびに
細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、該薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階。
細胞への感染に有効な量のバキュロウイルスゲノムに含まれるか、または融合されたHBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製し、次に、該細胞に該コンストラクトを感染させる段階;
該細胞に、感染前、感染中、および/または感染後に、被験薬剤を接触させる段階;
該薬剤に耐性を示す場合に、該細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階;ならびに
細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、該薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階。
(1)以下から選択される、ウイルス性因子、またはこれを含む生物学的試料と関連する少なくとも2つの特性に関する入力コードとして受信するコード:
(a)特定の化合物もしくは免疫学的薬剤に対する低い感受性に耐性を示す能力;
(b)野生型HBVからのDNAポリメラーゼの変化;
(c)野生型HBVからの表面抗原の変化;または
(d)患者の罹患率もしくは回復の可能性;
(2)該ウイルスのバリアントまたは生物学的試料に関する値に対応する合計値を提供するために該入力コードを加えるコード;および
(3)コードを保存する、コンピューター可読媒体。
(1)機械可読データが、該ウイルスのバリアント、もしくは生物学的試料と関連する、以下から選択される少なくとも2つの特性に関する入力コードを含む、機械可読データでコード化されたデータ記憶媒体を含む機械可読データの記憶媒体:
(a)特定の化合物もしくは免疫学的薬剤に対する低い感受性に耐性を示す能力;
(b)野生型HBVからのDNAポリメラーゼの変化;
(c)野生型HBVからの表面抗原の変化;または
(d)患者の罹患率もしくは回復の可能性;
(2)機械可読データを処理するための指示を蓄積するための作業メモリ;
(3)該機械可読データを処理して、該化合物の値に対応する該入力コードの総和を提供するために、作業メモリに、および機械可読データ記憶媒体に接続された中央演算処理装置;ならびに
(4)該値を受信するために中央演算処理装置に接続された出力ハードウェア。
HBVの重複性のゲノム
HBVの重複性のゲノムを図1に示す。DNAポリメラーゼをコードする遺伝子(P)は、ウイルスのエンベロープ遺伝子であるPre-S1およびPre-S2と重複しており、X遺伝子およびコア(C)遺伝子と部分的に重複している。HBVのエンベロープは、小型、中型、および大型のタンパク質である、HBVの表面抗原を含む。大型タンパク質成分は、HBVの表面抗原(HBsAg)と呼ばれ、S遺伝子配列にコードされている。Pre-S1およびPre-S2の遺伝子配列は、他のエンベロープ成分をコードしている。
ADV療法を受ける患者、およびHBVのDNAの解析
患者A:
ADV療法中に、固有のHBV変異が、実施例4に記載された方法によるPCR増幅配列決定法で検出された(表4)。検出された準種に変化が認められた。ADV(試料A)に関して当初選択された変異プロファイルは、rtN53K、rtY54D、rtL180M、rtT184S、およびrtM204Vの固有の変異を含む。重要な固有の変異はrtT184Sである。次に、異なるADV耐性プロファイルが試料B中のrtN53K/N、rtL180M、rtT181A/V、およびrtN236Tで検出された。重要な固有の変異は、ADV耐性患者で過去に検出されたrtT181A/VおよびrtN236Tである(表4、図3、図4、図5、図6、図7、および図8)。
ADV治療中におけるHBVの変異を、表5、ならびに図9、図10、および図11に挙げる。HBVのDNAポリメラーゼのrt領域における重要な固有の変化はrtS202CおよびrtH248Nを含む。ADV治療中におけるHBVのポリメラーゼ中の他の変化は、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、およびrtM204Vを含む。ADV治療中におけるHBsAgの変化は、sT118A、sP120T、sP127A、およびsI195Mを含む。
ADV治療中におけるHBVの変異を、表6、ならびに図12、図13、および図14に挙げる。HBVのDNAポリメラーゼのrt領域における重要な固有の変化はrtM250Lを含む。ADV治療中におけるHBVのポリメラーゼ中の他の固有の変化は、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、およびrtM204Vを含む。ADV治療中におけるHBsAgの変化は、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、およびsS210Rを含む。
この患者は当初、rtN236TにおけるADV耐性変異を有するとして選択された(Angus et al., Gastroenterology, 125 (2):292-7. 2003)。この患者は後に、ADVおよびLMVによる治療を受けた。併用抗ウイルス療法中に、ウイルス学上のブレークスルーがあった(経時的な(第1の抗ウイルス療法の開始後の日の)HBVのDNAレベル(ウイルス量)の増加、およびALTのグラフ表示に関しては図15を参照)。ADVおよびLMV二重治療におけるHBV変異を、表7、ならびに図16、図17、および図18に挙げる。HBVのゲノムのPCRによる増幅、および直接的な配列決定によって、HBVのDNAポリメラーゼのrt領域における固有の変化は、rtD134V、rtN139E/K、rtI233V、rtM250Lを含むことが判明した。それらは、rtA181VおよびrtN236Tにおける既知のADV耐性変異と関連して存在していた。重要な固有の変異はrtI233VおよびrtM250Lを含む。ADVおよびLMV治療中におけるHBVのポリメラーゼにおける全ての固有の変化は、rtN53D、rtS116P、rtD134V、rtN139E、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250Lを含む。ウイルス学上のブレークスルーの時点で単離されたHBVに由来するポリメラーゼ遺伝子をコードするPCR増幅産物を対象にクローン解析を実施した(実施例15参照)。他の重要な変異が、このPCR増幅産物中でrtS85Aに検出され、他の変異もrtN139K/EおよびrtQ149Kにおいてマイナーな種として検出された(表7の脚注)。
ウイルスマーカーの検出
B型肝炎表面抗原(HBsAg)、B型肝炎e抗原(HBeAg)、抗HBe、およびB型肝炎コア抗原(HBcAg)に特異的なIgGおよびIgMを市販の免疫アッセイ法で測定した(Abbott Laboratories, North Chicago, IL, USA)。B型肝炎ウイルスのDNAレベルを、キャプチャーハイブリダイゼーションアッセイ法で、製造業者の指示通りに測定した(Digene Hybrid Capture II, Digene Diagnostics Inc., Beltsville, MD)。製造業者は、臨床標本中のHBVウイルス血症の検出時のカットオフが0.7x106コピー/mlまたは2.5 pg/mlであると述べている[Hendricks et al., Am J Clin Pathol 104: 537-46, 1995]。HBVのDNAレベルは、Cobas増幅HBVモニターキット(Roche)などの他の市販のキットで定量可能でもある。
HBVのDNAの配列決定
HBVのDNAを100 μlの血清から、Aye et al., J. Hepatol. 26: 1148-1153, 1997に記載された手順で抽出した。オリゴヌクレオチドは、Geneworks(Adelaide, Australia)によって合成された。HBVのポリメラーゼ遺伝子、またはHBVゲノムの全体の増幅については、Aye et al., 1997、前記、およびAyres et al., Methods Mol. Med. 95:125-49, 2004に記載されている。
を使用した。
アデフォビルジピボキシル(ADV)
ADV(旧名Bis-pom PMEA)は、HBVの複製の強力な阻害剤である。ADVの構造を図2に示す。この合成については、Benzaria et al., J Med Chem. 39: 4958-4965, 1996に記載されている。
抗ウイルス耐性のインビトロ解析
アデフォビル、テノホビル、および他の抗ウイルス剤に対するHBV変異体の感受性/耐性プロファイルをインビトロで、組換え型のHBV/バキュロウイルスを使用して調べた。耐性プロファイルの解析手順については、以下の実施例7〜14で概説する。
細胞培養
Sf21昆虫細胞を、10% v/v熱不活性化ウシ胎児血清(Gibco BRL, Gaithersburg, MD)をさらに補充した補充グレース培地中で、加湿インキュベーター内で28CでCO2を加えて維持した。HepG2細胞を、10% v/v熱不活性化ウシ胎児血清(MEM-FBS)を添加した最小必須培地で維持した。HepG2細胞を加湿インキュベーター内で37℃で5% v/v CO2の条件で成長させた。
特異的な点変異を有するHBV/バキュロウイルス輸送ベクターの調製
抗ウイルス性の検討に使用した組換え型HBV/バキュロウイルス系は、文献に記載されている(Delaney et al., Antimicrob Agents Chemother 45(6): 1705-1013, 2001)。簡単に説明すると、組換え型の輸送ベクターを、1.3x HBVゲノムコンストラクトを含む断片を切り出し、これをバキュロウイルスベクターpBlueBac4.5(Invitrogen, Carlsbad, CA)のマルチクローニング領域にクローニングすることで作製した。点変異は、製造業者(QuikChange, Stratagene)の仕様書に従って市販のキットを使用する部位特異的変異誘発法で作製した。プラスミド、および部位特異的変異誘発法で作製された点変異のヌクレオチド配列を、ABI Prism Big Dye Terminator Cycle Sequencing Ready Reactionキットを、製造業者(Perkin Elmer, Cetus Norwalk, CT)の仕様書に従って使用した配列決定によって確認した。HBV変異体のパネルを、野生型(WT)の遺伝子型DのHBV単離物から部位特異的変異導入法で作製した。変異体は、WTのHBVのポリメラーゼ、またはHBeAg陰性(precore [PC] G1896A変異体)のバックグラウンドで、表8に挙げたアミノ酸置換を有するポリメラーゼいずれかをコードするものとした。他のHBV変異体を作製して、抗ウイルス感受性に関して同様の手順で検討することができる。
1.3 HBVコンストラクトを含む組換え型バキュロウイルスの作製
精製済みの組換え体輸送ベクターおよび直鎖状のAcMNPVバキュロウイルスのDNAを、Invitrogen(Carlsbad, CA)のBacNBlueトランスフェクションキットを使用してSf21細胞に同時にトランスフェクトし;組換え型ウイルスをプラークアッセイ法で製造業者の指示書に従って単離した。一連の組換え型ウイルスを、単離されたプラークから、Sf21細胞の100-mmのディッシュに感染させて増幅した。ウイルスDNAを、増幅後のウイルスから標準的な手順で抽出した。精製後のウイルスDNAを制限酵素で切断後に、1% v/vアガロースゲル電気泳動で分画した。サザンブロッティングを行って、どのウイルス単離物が、完全な1.3 HBVコンストラクトを含むかを判定した。Boehringer Mannheim Random Prime DNA Labelingキット(Indianapolis, IN)を使用して、[32P]-放射標識プローブを作製した。完全長の2本鎖のHBVゲノムを、全ての放射標識プローブのテンプレートとして使用した。ウイルスのDNA配列は、ポリメラーゼの触媒領域を対象としたPCR増幅および配列決定によって確認した。
バキュロウイルスの増幅および精製の準備
バキュロウイルスを、対数増殖期のSf21細胞の懸濁培養物に、0.5 pfu/細胞の感染多重度(moi)時に感染させることで増幅した。感染は、フラスコ内の細胞の大半が、明らかな感染の兆候を示すまで進めた(4〜5日)。ウイルス粒子を感染Sf21培地から、80,000×gで遠心分離し、20〜60%(w/v)のショ糖勾配で精製して濃縮した。精製後のウイルスの滴定をSf21細胞を対象にエンドポイント希釈法で4回行った。個々の高力価ストックのアリコートをDNAの抽出に使用した。ポリメラーゼ遺伝子を増幅し、配列を決定して、部位特異的変異導入の存在を確認した。
抗ウイルス剤によりバキュロウイルスを発現する組換え型HBVによるHepG2細胞の感染(すなわち形質導入)
HepG2細胞を約20〜40%のコンフルエンシーの時点で添加し、16〜24時間成長させてから感染させた。感染させる日に、細胞の3枚のプレートをトリプシン処理し、生きている細胞数を血球計数器でトリパンブルー排除法で決定した。平均細胞数を計算し、指定のmoiにおける細胞の感染に必要な高力価ウイルスストックの容積を決定した。HepG2細胞を無血清MEMで1回洗浄して微量の血清を除去した。バキュロウイルスを、血清を含まないMEMで希釈し、適切なmoiを、1.0 ml、0.5 ml、および0.25 mlの容積で、それぞれ100 mm、60 mm、および35 mmのディッシュに感染させて達成した。バキュロウイルスをHepG2細胞に1時間、37℃で、15分毎に穏やかに振盪しながら吸収させ、接種細胞が均一に分布するようにした。次に接種細胞を吸引し、HepG2細胞をリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、さまざまな濃度の薬剤を含むか、または薬剤を含まないMEM-FBSに添加した。
分泌型HBV抗原の解析
B型肝炎e抗原(HBeAg)の検出を、ラジオイムノアッセイ法および微粒子酵素イムノアッセイ法で、Abbott Laboratories (Abbott Park, IL, USA)から購入したキットを使用して行った。HepG2細胞由来の培地を回収し、6,000 gで遠心分離して細胞破片を除去し、清浄なチューブに移し、解析を行うまで20℃で保存した。HBeAgの値を、正の対照に対する倍率で表す。培地試料を、ラジオイムノアッセイ法の結果がHBeAgに関して正の対照における値を下回るように適切に希釈した。
細胞内複製中間体の検出
HBVのコア粒子を、0.5% w/vのNP-40に溶解したHepG2細胞の細胞質フラクションから単離した。細胞質抽出物を、10 mmol/l McC 12となるように調整し、非保護状態のDNAを、500 g/ml Proteinase Kと37℃で1.5時間インキュベートして除去した。次に試料中のHBVのDNAを、Qiagen(DNA抽出用)などの市販のDNA抽出キットで、またはフェノールおよびクロロホルムによる連続抽出によるインハウスの方法で抽出して、核酸をエタノール沈殿法で回収した。核酸を50 μl/lのTE(10 mmol/l Tris、1 mmol/lエチレンジアミン四酢酸)に再懸濁し、OD260で標準化し、および100 g/mlのRNase(Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN)で37℃で1時間かけて消化した後に、リアルタイムPCRまたは電気泳動、および完全長の[32P]標識HBVを使用するサザンブロッティングによる解析を行い、Bio-Radの蛍光体イメージング用スクリーンを使用してオートラジオグラフを得た。画像を記録し、「Quantity One」ソフトウェアを備えたBio-Rad Model FX Molecular Imagerで解析した。
野生型およびポリメラーゼ上の変異をコードするHBV/バキュロウイルスによって実施される抗ウイルス性の検討
変異体のパネルに対する抗ウイルス剤の影響を表9に示す。抗ウイルス性の検討の結果、ETVに関して、LMV耐性変異体と関連してコドン184およびコドン202において過去に選択された変異が、ADVおよびTDFに対する感受性にも影響を及ぼすことがわかった。184変異および202変異が、ADV治療のみを受けた患者によって選択された(患者Aおよび患者Bを参照)。他の変異をコードするHBVを類似の方法で検討する。
抗ウイルス療法中に選択されたHBVのポリメラーゼ変異体のクローン解析
LMV療法時およびADV療法時のウイルス学的ブレークスルーの時点でクローン解析を行い、患者Dにおいて複数のHBV変異が同じゲノム上に存在するか否かを判定した。逆転写酵素/ポリメラーゼの触媒ドメインを、文献(Ayres et al., 2004、前記)に記載の手順で配列が決定済みのプライマーOS1およびOS2(実施例4参照)を使用して個別に増幅した。それらの試料から得られたOS1/OS2 PCR産物をPCRScript Amp SK+(Stratagene)中に、製造業者の指示書に従ってクローニングした。PCR増幅を個々のクローンから直接実施し、上記の各試料に関してPCR産物の配列を、OS1/OS2 PCRプライマーを配列決定用プライマーとして使用して決定した。ADV単独療法の失敗時には、患者は事前にrtN236TおよびrtA181Tを選択していた。ADVおよびLMVの二重耐性の時点で、ゲノム全体の増幅および直接配列決定によって検出された変異プロファイルは、rtN53D、rtS116P、rtD134V、rtN139E、rtA181V、rtI233V、rtN236T、rtM250Lを含んでいた。rtN236TおよびrtA181Tは100%のクローンで検出された。55%のクローンにおけるrtN139E+rtQ149K+rtM250L+rtI233Vと、45%のクローンにおけるrtS85A+rtN139K+rtN238Dについて2つの主なクローンプロファイルがそれぞれ検出された。rtS85Aにおける重要な変異、ならびにrtN139E/KおよびrtQ149Kにおける変異は、HBVゲノムの初期増幅における直接配列決定、およびPCR配列決定では検出されなかったが、クローンの直接配列決定によって検出され、PCR産物もまたクローン解析用に使用された。
*クローン解析では、rtS85Aにおいて重要な変異が、ならびにrtN139K/EおよびrtQ149Kにおいて他の変異もマイナーな種として検出された。
Claims (63)
- バリアントにコードされたタンパク質にアミノ酸の付加、置換、および/または欠失をもたらすヌクレオチド変異を含み、およびHBVのバリアントがETVのみまたはETVおよびLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;ならびにADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択される1種類もしくは複数のヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体に低い感受性を示す、単離されたB型肝炎ウイルス(HBV)のバリアント。
- 変異が、HBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中に存在する、請求項1記載の単離されたHBVのバリアント。
- 変異が、表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項1記載の単離されたHBVのバリアント。
- 変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される、請求項1または2記載の単離されたHBVのバリアント。
- 変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項4記載の単離されたHBVのバリアント。
- 変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項4記載の単離されたHBVのバリアント。
- 変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項5記載の単離されたHBVのバリアント。
- 変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異から選択される、請求項1または3記載の単離されたHBVのバリアント。
- 変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195Mからなり、別の態様では、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、およびsS210Rを含むリストから選択される、請求項8記載の単離されたHBVのバリアント。
- DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびにHBVのバリアントがETVのみまたはETVおよびLMVのみには耐性を示さないことを条件として、HBVのヌクレオチド配列中の変異、ならびにADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに対する耐性もしくは低い感受性に関与する変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBVが、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに低い感受性を示す可能性を示すことを見極める方法。
- 変異が、HBVのDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中に存在する、請求項10記載の方法。
- 変異が、表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項10記載の方法。
- 変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される、請求項10または11記載の方法。
- 変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項12記載の方法。
- 変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項13記載の単離されたHBVのバリアント。
- 変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項15記載の方法。
- 変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210に存在する、請求項10または12記載の方法。
- 変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、およびsS210Rからなるリストより選択される、請求項17記載の方法。
- HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに耐性を示すバリアントHBV、ならびに1種類もしくは複数の薬学的に許容される担体および/または希釈剤を含む組成物。
- バリアントHBVが、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項19記載の組成物。
- 変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項20記載の組成物。
- バリアントHBVが、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される変異を含む、請求項19または20記載の組成物。
- 変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項22記載の組成物。
- 変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異から選択される、請求項19記載の組成物。
- 変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204G、およびsS210Rからなるリストより選択される、請求項24記載の組成物。
- B型肝炎ウイルス感染の治療用および/または予防用の薬物の製造において、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに低い感受性をもたらす、DNAポリメラーゼまたは表面抗原をコードする遺伝子中にヌクレオチド変異を含むバリアントHBVの使用。
- 変異が、HBVのDNAポリメラーゼ遺伝子、および/または表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項26記載の使用。
- 変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択される、請求項26または27記載の使用。
- 変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される、請求項26または28記載の使用。
- 変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項28記載の使用。
- 変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項29記載の使用。
- 変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210における変異から選択される、請求項26または27記載の使用。
- 変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される、請求項32記載の使用。
- DNAもしくは対応するmRNAをHBVから単離する段階、ならびにDNAポリメラーゼをコードするヌクレオチド配列中の変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBV株がヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に低い感受性を示すか否かを判定する方法であって、コドンrtN53、rtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、およびrtM250から選択されるrt領域における変異の存在が、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに低い感受性を示すバリアントであることを示す、方法。
- 変異が、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異からなるリストより選択される、請求項34記載の方法。
- 変異が、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される請求項34記載の方法。
- 変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K 、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項36記載の方法。
- エンベロープ遺伝子をコードするヌクレオチド配列中の変異に関するスクリーニングを行う段階を含む、HBV株がヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体に低い感受性を示すか否かを判定する方法であって、コドンsT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、およびsS210から選択される、s遺伝子中における変異の存在が、HBVのバリアントがETVのみまたはETVおよびLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに低い感受性を示すバリアントであることを示す、方法。
- 変異が、stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210からなるリストより選択される、請求項38記載の方法。
- 変異が、stT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、sI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、またはsS210からなるリストより選択される、請求項39記載の方法。
- ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択される、ヌクレオシド類似体もしくはヌクレオチド類似体、または類似体の組合わせに曝露された対象からHBVを単離する段階を含み、該HBVを、表面抗原に対する1種類もしくは複数の抗体のパネルに接触させる段階、ならびにHBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、結合親和性または結合スペクトルにおける任意の変化に関するスクリーニングを行う段階を含む、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVを検出する方法。
- 変異が、HBVのDNAポリメラーゼ遺伝子中、または表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項41記載の方法。
- コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異体を含む、請求項41または42記載の方法。
- コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項43記載の方法。
- 変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項43記載の方法。
- 変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項44または45記載の方法。
- コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、SI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、もしくはsS210に変異を含む、請求項41または42記載の方法。
- 変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される、請求項47記載の方法。
- 血清試料を、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVからなるリストより選択されるヌクレオシド類似体またはヌクレオチド類似体に曝露された対象から単離する段階、および続いて血清を、HBVの表面抗原、またはその抗体結合断片のパネルに接触させる段階、ならびにHBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、結合親和性または結合スペクトルにおける任意の変化に関するスクリーニングを行う段階を含む、変化した免疫学的プロファイルを示すバリアントHBVを検出する方法。
- 変異が、HBVのDNAポリメラーゼ遺伝子中、または表面抗原をコードするHBVのS遺伝子中に存在する、請求項49記載の方法。
- コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、もしくはrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項49または50記載の方法。
- コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項49または50記載の方法。
- 変異が、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、rtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、またはそれらの組合わせ、または同等の変異から選択される、請求項51または52記載の方法。
- 変異が、rtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Lから選択される、請求項52記載の方法。
- 変異が、コドンstT45、sL173、sL175、sI195、sT118、sP120、sP127、sI195、sT114、SI195、sS204、sI208、sS210、sV14、sG130、sM133、sW172、sS204、もしくはsS210における変異である、請求項49または50記載の方法。
- 変異が、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される、請求項55記載の単離されたHBVのバリアント。
- プラスミドベクターに含まれる、HBVに由来する複製可能な有効量のゲノムを含む遺伝子コンストラクトを作製する段階、次いで、細胞に該コンストラクトをトランスフェクトする段階、トランスフェクション前、トランスフェクション中、および/またはトランスフェクション後に、細胞に被験薬剤を接触させ、該薬剤に耐性を示す場合に、細胞を、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階;ならびに細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、薬剤の存在下でウイルスが複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階により、HBVに阻害活性を示す薬剤を検出する方法。
- 感染性のHBVゲノムが、2.2.15細胞系もしくはAD細胞系などを含むがそれらに限定されない連続細胞系中に安定に組入れられるように、HBVのゲノムの感染性コピーを複製可能な有効量で含む、連続細胞系を作製する段階、細胞に被験薬剤を接触させる段階、細胞を、薬剤に耐性を示す場合に、HBVが複製する、遺伝子配列を発現する、ならびに/またはウイルスもしくはウイルス様粒子を組み立てる、および/もしくは放出するのに十分な時間および条件で培養する段階、ならびに続いて細胞、細胞溶解物、または培養上清液を、ウイルス検出手段もしくはウイルス成分検出手段に供することで、ウイルスが薬剤の存在下で複製されたか否か、遺伝子材料が発現されたか否か、ならびに/または組み立てられたか否か、および/もしくは放出されたか否かを判定する段階を代替的に含む、請求項57記載の方法。
- HBV感染の治療用の薬物の製造における、rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、sS204Gを含むリストから選択される、HBV感染に対する治療用ワクチンの製造におけるHBVのバリアントの使用であって、ここで、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;またはADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVにHBVが耐性を示す、使用。
- HBVが、ADV、LMV、TFV、もしくはFTC;ADVおよびLMV;ADVおよびTFV;LMVおよびTFV;FTCおよびADV;FTCおよびTFV;FTCおよびLMV;ETVおよびADV;ETVおよびFTC;ETVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびTFV;またはADVおよびFTCおよびTFV;TFVおよびFTCおよびLMV;ADVおよびLMVおよびETV;ADVおよびETVおよびTFV;ETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびLMVおよびFTC;ADVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ETVおよびFTCおよびLMVおよびTFV;ADVおよびETVおよびLMVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびETVおよびTFV;ADVおよびFTCおよびLMVおよびETV;ならびにADVおよびFTCおよびLMVおよびTFVおよびETVに耐性を示し、HBVのバリアントがETVのみまたはETVもしくはLMVのみには耐性を示さないことを条件として、コドンrtN53、rtY54、rtL180、rtT181、rtT184、rtM204、rtN236、rtY124、rtH126、rtT128、rtS135、rtL180、rtS202、rtM204、rtH248、rtI53、rtS54、rtN122、rtM145、rtL180、rtM204、rtM250、rtN53、rtS85、rtS116、rtD134、rtN139、rtQ149、rtA181、rtS219、rtI233、rtN236、またはrtM250における変異から選択されるHBVワクチンを含む、HBV感染に対するワクチン。
- HBVが、コドンrtT184、rtS202、rtS219、rtI233、rtH248、およびrtM250における変異から選択される変異を含む、請求項60記載のワクチン。
- rtN53K、rtN53K/N、rtY54D、rtL180M、rtT181A/V、rtT184S、rtM204V、およびrtN236T、rtY124H、rtH126R、rtT128N、rtS135C、rtL180M、rtS202C、rtM204V、rtH248N、rtI53V、rtS54T、rtN122T、rtM145L、rtL180M、rtM204V、rtM250L、rtN53D、rtS85A、rtS116P、rtD134V、rtN139E/K、rtQ149K、rtA181V、rtS219A、rtI233V、rtN236T、rtM250L、sT45K、sL173L/F、sL175F、sI195M、sT118A、sP120T、sP127A、sI195M、sT114P、sI195M、sS204N、sI208T、sS210R、sV14A、sG130R、sM133T、sW172L、およびsS204Gからなるリストより選択される変異を含むHBVのバリアント、ならびに1種類もしくは複数のワクチンに許容される担体および/または希釈剤を含む、請求項60記載のワクチン。
- HBVがrtT184S、rtS202C、rtS219A、rtI233V、rtH248N、およびrtM250Iから選択される変異を含む、請求項61記載のワクチン。
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