KR20090016632A - 항바이러스 내성 돌연변이의 검출 및 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 일반적으로 특정 시약에 대해 감소된 감수성 및/또는 면역학적 시약과의 감소된 상호작용성을 나타내는 바이러스 변이체에 관한 것이다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 상기 항체에 대한 감소된 감수성을 비롯한 바이러스 표면 성분에 대한 항체화의 감소된 상호작용성 및/또는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대해 완전하거나 부분적인 내성을 나타내는 B형 간염 바이러스(HBV) 변이체에 대한 것이다. 백신 및 진단 분석 또한 본원에서 고려된다.
Description
본 발명은 일반적으로 특정 제제에 대해 감소된 감수성 및/또는 면역학적 시약과의 감소된 상호작용성을 나타내는 바이러스 변이체에 관한 것이다. 더욱 자세하게는, 본 발명은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대해 완전한 또는 부분적인 내성 및/또는 항체에 대한 감소된 감수성을 포함하는 바이러스 표면 성분에 대한 항체와의 감소된 상호작용성을 나타내는 B형 간염 바이러스(HBV) 변이체에 관한 것이다. 백신 및 진단 분석 또한 본원에 고려된다.
본 명세서에서 언급된 문헌의 세부 목록은 또한 명세서의 마지막 부분에 기재된다.
본 명세서 내 임의의 선행 기술에 대한 참고는 상기 선행 기술이 임의의 국가에서 일반 상식의 일부를 형성한다는 인정 또는 임의 형태의 제안이 아니고, 이로서 간주되어서는 안된다.
B형 간염 바이러스(HBV)는 질병 상태를 악화시킬 수 있고 급성 간부전을 초래할 수 있다. HBV는 RNA 중간체를 통해 복제되고 이의 복제 전략에서 역전사를 이용하는 DNA 바이러스이다(Summers 및 Mason, Cell 29:403-415, 1982). HBV 게놈은 표면, 코어, 폴리머라제 및 X 유전자를 코딩하는 중복된 개방 판독 프레임(open reading frame)을 갖는 부분적인 이중 가닥 DNA 구조의 복잡한 성질을 갖는다. 복잡한 성질의 HBV 게놈은 도 1에 도시된다. 폴리머라제는 4개의 기능 영역, 말단 단백질(TP), 스페이서, 역전사효소(rt) 및 리보뉴클레아제(RNAse)로 이루어진다.
HBV의 폴리머라제 유전자는 엔벨롭 유전자와 중복되므로, 폴리머라제 유전자의 촉매 도메인에서의 돌연변이는 또한 엔벨롭 단백질의 뉴클레오티드 및 추정 아미노산 서열에 영향을 미칠 수도 있으며, 그 역도 성립한다. 특히, HBsAg 내에서 발견되고 아미노산 99 및 169 사이에 위치한, 'a' 결정자로 공지된 HBV 중화 도메인에 대한 유전자 서열은, 실제로 바이러스 폴리머라제 단백질의 주요 촉매 영역 및 특히 도메인 A 및 B와 중복된다.
HBV DNA 폴리머라제의 존재는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체가 효과적인 항바이러스제로 작용할 수 있다고 제안된다. 현재 테스트 중인 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체의 예는 펜시클로비르 및 이의 경구형(FCV)[Vere Hodge, Antiviral Chem Chemother 4: 67-84, 1993; Boyd et al , Antiviral Chem Chemother . 32:358-363, 1987; Kruger et al , Hematology 22:219A, 1994; Main et al , J. Viral Hepatitis 3:211-215, 1996], 라미부딘[(-)-β-2'-데옥시-3'-티아사이티딘]; (3TC 또는 LMV)[Severini et al , Antimicrobial Agents Chemother . 39:430-435, 1995; Dienstag et al , New Engl 및 J Med 333:1657-1661, 1995]이 있다. 이미 임상 실험이 진행되었던 새로운 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 피리미딘 엠트리시타빈, ((-)-β-L-2'-3'-디데옥시-5-플루오로-3'-티아사이디 딘; FTC), 3TC의 5-플루오로 유도체, 및 클레부딘(1-(2-플루오로-5-메틸-β-L-아라비노-퓨라노실)우라실; L-FMAU), 티미딘 유사체를 포함한다. 베타-L티미딘 유사체(LdT)는 최근 FDA의 승인을 얻었고, 다른 유사한 화합물은 베타-L-2'-데옥시시티딘(LdC) 및 베타-L-2'-데옥시아데노신(LdA)[Standring et al, Antivir Chem Chemother . 2001;12 Suppl 1:119-29]을 포함한다. 3TC와 마찬가지로, 비천연 "L"- 배열을 갖는 피리미딘 유도체가 있다. 여러 개의 퓨린 유도체 또한 임상 실험을 진행 중이며; 이들은 엔테카비르(BMS-200, 475; ETV), 탄소환식 데옥시구아노신 유사체, 디아미노퓨린 디옥솔란(DAPD), 디옥솔란 구아닌((-)-β-D-2-아미노퓨린 디옥솔란; DXG)의 경구 프로드러그 및 아데포비르 디피복실, 비환식 데옥시아데노신 모노포스페이트 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 아데포비르(9-[포스포닐-메톡시에틸]-아데닌; PMEA)의 경구 프로드러그를 포함한다. 임상 전 및 임상 실험에서 다른 약물은 FLG[Medivir], ACH-126,443(L-d4C) [Archillion Pharmaceuticals], ICN 2001-3(ICN) 및 라시비르(RCV)[Pharmassett]를 포함한다.
이들 제제는 HBV DNA 합성을 억제하는데 상당히 효과적인 반면, 장기간의 항바이러스 화학요법 동안 HBV의 내성 돌연변이체가 출현할 가능성이 있다. 장기간의 LMV 치료 하의 환자에서, 주요 내성 돌연변이는 rtM204I/V +/- rtL180M 및 다른 돌연변이에서 폴리머라제 내 rt 도메인에서 선택된다. 폴리머라제 돌연변이에 사용된 명칭은 상기 Stuyver 등에 의한 문헌(2001)에 제안된 바에 따른다. LMV는 만성 HBV 감염에 대해 사용하기 위해 승인된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체이다. LMV는 HBV 복제의 특히 강력한 억제제이며 바이러스 DNA 합성을 억제함으로써 동소 간이식(OLT) 후 만성 감염된 환자의 혈청에서 HBV DNA 역가를 감소시킨다. LMV 단일요법(monotherapy)은 장기간 동안 HBV 복제를 조절할 것으로 보이지 않는다. 이는 단일요법 동안 HBV의 LMV 내성 균주의 출현을 거의 피할 수 없어 보이기 때문이다.
아데포비르 디피복실(ADV: 이전에, bis-pom PMEA)은 비환식 데옥시아데노신 모노포스페이트 유사체 아데포비르(이전에, PMEA)의 경구적 허용 프로드러그이다(도 2). ADV 또한 HBV 복제의 강력한 억제제이며 만성 HBV 감염에 대해 사용하기 위해 FDA 승인을 받았다. 아데포비르 디피복실은 뉴클레오티드 (대 뉴클레오시드) 유사체이고 그 자체로 약물 활성화 동안 제1 인산화를 우회한다는 점에서 이러한 부류의 다른 제제와 다르다. 이러한 단계는 종종 속도 제한적이다. 아데포비르 디피복실은 HBV의 야생형 및 라미부딘 내성 균주에 대한 임상적 활성이 입증되었으며 최근에는 III기 임상 테스트 중이다(Gilson et al , J Viral Hepat 6:387-395, 1999; Perrillo et al , Hepatology 32:129-134, 2000; Peters et al , Transplantation 68:1912-1914, 1999; Benhamou et al, Lancet 358:718-723, 2001). II기 연구 동안, 아데포비르 디피복실의 1일 투여량 30 mg이 평균 4 log10을 초래하여 12주 동안 바이러스혈증을 감소시킨다(Heathcote et al, Hepatology 28:A620, 1998).
ADV는 치환된 비환식 뉴클레오시드 포스포네이트이다. 이러한 부류의 화합물은 또한 테노프비르 디소프록실 푸마레이트(테노프비르 DF, 또는 테노프비르, 또는 (TFV) 또는 9-R-(2-포스포노메톡시프로필)아데닌(PMPA)으로도 명명되며 Gilead sciences사에 의해 Viread로서 시판됨)를 포함한다.
TFV는 HBV 및 HIV에 대해 항바이러스 활성을 갖는다(Ying et al , J Viral Hepat. 7 (2): 161-165, 2000; Ying et al , J. Viral Hepat . 7(1):79-83, 2000, Suo et al, J Biol Chem . 273 (42):27250-27258. 1998).
FTC는 HBV 및 HIV에 대해 활성을 갖는다(Frick et al , Antimicrob Agents Chemother 37:2285-2292, 1993).
LdT, LdC 및 LdA는 HBV에 대해 활성을 갖는다(상기, Standring 등)
뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 요법은 단일요법 또는 둘 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체가 투여될 수 있는 병용 요법으로서 투여될 수 있다. 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체는 또한 인터페론 또는 B형 간염 면역글로불린(HBIG)과 같은 다른 항바이러스제와 병용하여 투여될 수도 있다.
HBV의 뉴클레오시드/뉴클레오티드-유사체- 또는 항체- 내성 균주의 출현에 대해 모니터링하고 이러한 내성 바이러스를 검출하기 위한 진단 프로토콜을 개발하고/하거나 항바이러스제로서 유용하게 하는 성질을 갖는 제제에 대해 스크리닝하고/하거나 개발 또는 고안하는 것을 필요로 한다. 이들 내성 균주의 결함 형태 또는 이로부터의 항원 성분은 또한 바이러스 표면 성분에 대한 항체에서와 같이 치료 백신 조성물의 개발에 유용할 것으로 제안된다.
개요
본 명세서 전반에 걸쳐, 달리 요청되지 않는 한, 용어 "포함하다" 또는 "포함하는"과 같은 변형들은 언급된 원소 또는 정수 또는 원소 또는 정수들의 군을 포함하고 임의의 다른 원소 또는 정수 또는 원소 또는 정수의 군을 제외하지 않는 것으로 이해해야 할 것이다.
뉴클레오티드 및 아미노산 서열은 서열 식별 번호(서열 번호)로서 언급된다. 서열 번호는 서열 식별기호 <400>1 (서열 번호 1), <400>2 (서열 번호 2) 등에 수치적으로 상응하다. 서열 식별의 요약을 표 1에 제공한다. 서열 목록은 청구 범위 이후에 제공된다.
본원에서 아미노산 서열 내 특이적 돌연변이는 "Xaa1nXaa2"로 표시되며, 여기서 Xaa1은 돌연변이 전의 원래의 아미노산 잔기이고, n은 잔기 번호이고 Xaa2는 돌연변이 아미노산이다. 약어 "Xaa"는 세문자이거나 또는 일문자(즉, "X") 코드일 수 있다. "Xaa1nXaa2" 앞의 "rt"는 "역 전사 효소"를 의미한다. "s"는 엔벨롭 유전자를 의미한다. HBV DNA 폴리머라제에 대한 아미노산 잔기의 경우 모티브 Tyr Met Asp Asp (YMDD)에서 메티오닌 잔기는 잔기 번호 204로 넘버링된다(Stuyver et al , Hepatology 33:751-757, 2001). B형 간염 바이러스 표면 항원에 대한 아미노산 잔기는 Norder 등에 따라 넘버링된다(J. Gen . Virol . 74:341-1348, 1993). 일문자 및 세문자 약자는 아미노산 잔기를 정의하는데 사용되고 이들은 표 2에 요약된다.
TFV 및/또는 LMV, 또는 LMV 및/또는 ADV 및/또는 ETV를 포함하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함하는 항바이러스제로 치료되는 만성 HBV에 감염된 환자에서 HBV 변이체를 선택된다. 결과적으로, ADV, LMV, TFV, ETV 또는 FTC, 또는 LdT; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV를 포함하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물을 포함하는 항바이러스제에 내성이 있거나 감소된 감수성을 나타내는 HBV rt 변이체가 고려된다. 표면 항원에서 상응한 돌연변이가 또한 발생한다. 이러한 HBV 변이체의 동정은 ADV, LMV, FTC, TFV, LdT 및/또는 ETV 내성 및/또는 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대한 내성을 모니터링하고 대안적인 치료제로서 유용한 제제에 대해 스크리닝하는 분석법 개발을 위해 중요하다.
본원에서 "항 HBV 제제"는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체 뿐 아니라 면역학적 시약(예, HBV 표면 성분에 대한 항체) 및 바이러스 복제, 유지, 감염, 조립 또는 방출을 억제하거나 그렇지 않으면 방해하는 화학 제제, 단백질성 제제 및 핵산 제제를 포함한다.
그러한 HBV 변이체의 검출은 HBV 감염을 치료하기 위해 적당한 제제를 선택하는 것을 비롯한 치료 프로토콜의 관리하는데 특히 중요하다. 이러한 측면의 본 발명의 방법은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물의 존재 하에서 HBV 로드가 증가된 피험체에서의 발달을 모니터링하는데 부분적으로 기초가 된다. 이후 임상의는 기존의 치료 프로토콜을 변형하거나 적당한 치료 프로토콜을 적절히 선택할 수 있다.
따라서, 일 측면은 단리된 B형 간염 바이러스(HBV) 변이체로서, 여기서 상기 변이체는 뉴클레오티드 돌연변이 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자 내에서 상기 DNA 폴리머라제에 대해 하나 이상의 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실을 초래하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하고, ADV, LMV, TFV, ETV, LdT 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대한 감소된 감수성을 나타내는 변이체에 관한 것이다. 변이체 HBV는 HBV DNA 폴리머라제의 하나 이상의 도메인 F 및 G와 도메인 A 내지 E에 의해 규정된 영역 내 게놈에서 중복된 개방 판독프레임의 돌연변이를 포함한다.
다른 측면은 표면 항원에 대해 하나 이상의 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실을 초래하는 S 유전자 내에 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하고 ADV, LMV, TFV, ETV, 또는 LdT 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대한 감소된 감수성을 나타내는 단리된 HBV 변이체를 제공한다:
rt 영역 내 유용한 돌연변이체의 경우, 일 구체예에서는 rtS256R/S 및 rtW257G/W를 포함하고, 다른 구체예에서는 rtH9D, rtL180M, rtM204V, rtT184S 및 rtN238T를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서는 rtQ215S, rtR242K/R, 및 rtW243R/W를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서는 rtN118S, rtR120R, rtT184A 및 rtY257H를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서는 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R 및 rtH248N을 포함하거나 또는 또다른 구체예에서는 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서는 rtY221H/Y, rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서는 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서는 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S를 포함하거나, 또는 마지막으로 또다른 구체예에서는 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V, 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함한다.
특히 유용한 돌연변이체는 코돈 180, 184 및 204, 예컨대 rtL180M 및 rtT184S 및 rtM204V에서, 또는 코돈 85, 180, 184, 202, 204 및 236, 예컨대 rtS85T, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V에서의 부속돌연변이이다. 본원에서 고려되는 대안적인 유용한 돌연변이는 rtP170H, rtT184A, rtY221H/Y, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R, rtR242K/R, rtW243R/W, rtI253V, rtI254I/F, rtS256R/S rtW257G/W, rtY257H 또는 코든 239에서의 돌연변이를 포함한다.
rtN236T 영역에서 추정 3인산염 결합 지역 내 돌연변이는 ADV 및/또는 TFV 및/또는 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 치료에 대한 항바이러스 내성에 중요한 것으로 본원에 제안된다. 코돈 236과는 별도로 중요한 코돈은 고도로 보존된 코돈 239 및 코돈 240, 241, 242 및 243을 포함한다.
특정한 구체예에 있어서, DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자 내에서 상기 DNA 폴리머라제에 대해 하나 이상의 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실을 초래하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하는 단리된 B형 간염 바이러스(HBV) 변이체로서, 상기 돌연변이는
(i) 코돈 239, 240, 241, 242 및/또는 243에서의 돌연변이;
(ii) N236I/D/V 치환을 초래하는 돌연변이;
(iii) S246H/P/Y/S 치환을 초래하는 돌연변이;
(iv) P170H 치환을 초래하는 돌연변이;
(v) I253V 치환을 초래하는 돌연변이;
(vi) rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이(co-mutation);
(vii) rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이; 및
(viii) rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이
로 이루어진 군에서 선택되고, HBV 변이체는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대한 감소된 감수성을 나타내는 변이체를 제공한다.
S 유전자 내 유용한 돌연변이는, 일 구체예에서 sI92T/I, sL175F 및 SI195M을 포함하고, 다른 구체예에서 sS207R을 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sI110V 및 sP120Q를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sF80S, sI208I/L, sS210K, sF220L/F 및 sY225H/Y를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sF134L/F 및 sL173F를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sC76Y 및 sL173F를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F 및 sI195M를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, s210R/S 및 sY225H/Y를 포함하고, 마지막으로 또다른 구체예에서 sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함한다.
특히 유용한 돌연변이체는 sI110V, sP120Q, sF134L/F, sL162I, sL173F, sL175F, sL176V 및 sP178P/L이다.
HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA를 분리하는 단계 및 DNA 폴리머라제 중 도메인 F 및 G와 도메인 A 내지 E 또는 이의 인접 영역 중 어느 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 초래하고 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대한 내성 또는 감소된 감수성과 관련된 HBV DNA 폴리머라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내의 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계에 의해 HBV가 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대한 감소된 감수성을 나타낼 가능성을 측정하는 방법이 추가로 고려된다.
그러한 돌연변이의 존재는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV3 ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대한 내성 가망성의 표시이다.
또한 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 또는 변이체 HBV로부터의 HBV 표면 항원 또는 이의 재조합 또는 유도체 형태 또는 이의 화학적 등가물 및 하나 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제에 대한 변이체 HBV 내성을 포함하는 조성물을 제공한다.
또다른 측면은 B형 간염 바이러스 감염의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서, 전술된 조성물 또는 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자 내에 DNA 폴리머라제에 대해 하나 이상의 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실을 초래하는 뉴클레오티드 돌연변이 및 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대해 감소된 감수성을 포함하는 변이체 HBV의 용도를 제공한다.
또한 HBV 균주가 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 대해 감소된 감수성을 나타내는지에 대한 여부를 측정하거나 또는 HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA를 단리시키는 단계 및 DNA 폴리머라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계에 의한 방법을 고려하고, 여기서 rt 영역 내 다음과 같은 돌연변이가 존재하는 경우, 일 구체예에서 rtS256R/S 및 rtW257G/W를 포함하고, 다른 구체예에서 rtH9D, rtL180M, rtM204V, rtT184S 및 rtN238T를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 rtQ215S, rtR242K/R 및 rtW243R/W를 포함하거나, 또는 다른 구체예에서 rtN118S, rtR120R5 rtT184A 및 rtY257H를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R 및 rtH248N을 포함하거나 또는 다른 구체예에서 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 rtY221H/Y, rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S를 포함하거나, 또는 마지막으로 또다른 구체예에서 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V, 또는 이의 조합물 또는 등가물을 포함하고 하나 이상의 다른 돌연변이는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대해 감소된 감수성을 나타내는 변이체를 나타낸다.
추가 방법은 엔벨롭 유전자 (s)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고 여기서 s 유전자 내 하기 돌연변이의 존재는 일 구체예에서 sI92T/I, sL175F 및 sI195M을 포함하고, 다른 구체예에서 sS207R을 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sI110V 및 sP120Q를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sF80S, sI208I/L, sS210K, sF220L/F 및 sY225H/Y를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sF134L/F 및 sL173F를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sC76Y 및 sL173F를 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F 및 sI195M을 포함하거나, 또는 또다른 구체예에서 sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sWl96stop/W, s210R/S 및 sY225H/Y를 포함하고, 마지막으로 또다른 구체예에서 sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M 또는 이의 조합물 또는 등가물을 포함하고 하나 이상의 다른 돌연변이는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물, 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대해 감소된 감수성을 나타내는 변이체를 나타낸다.
특정 구체예에서, 변이체는 천연 체액을 제거하는 하나 이상의 정제 단계를 실시한 단리된 형태로 존재한다. 대안적으로, 변이체는 단리된 체액으로 유지될 수 있거나 또는 DNA 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 변이체 HBV로부터 게놈 또는 이의 일부분을 포함하는 감염성 분자 클론을 고려한다. 세포, 세포 분해물, 배양된 상등액 및 체액 내 HBV 또는 이의 성분은 임의의 핵산 기초 검출 수단, 예를 들어, 핵산 하이브리드화 기술 또는 하나 이상의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 포함하는 임의의 편리한 수단에 의해 검출될 수 있다. 용어 "체액"은 혈액계, 림프계, 조직계 또는 혈청, 전혈, 생검 및 생검액, 기관 외식편(explant) 및 기관 현탁액, 예컨대 간 현탁액을 포함하는 기관계에서 유래된 임의의 유체를 포함한다.
또다른 측면은 기준 또는 야생형 HBV로부터의 표면 항원과 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 변이체 HBV에 관한 것이고, 여기서 상기 기준 또는 야생형 표면 항원에 대해 발생된 항체는 HBV 변이체에 대해 변경된 면역 프로파일을 제시한다. 변경된 프로파일 중 하나는 HBV를 중화시키는 것에 대해 감소된 능력을 포함한다. 보다 구체적으로는, 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하고, 이때 상기 변이체 HBV는 HBV DNA 폴리머라제의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 중에서 선택된다. 본 발명의 이러한 측면의 변이체 HBV는 또한 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 뉴클레오티드 치환, 부가 및/또는 결실을 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 방법은 변경된 면역 프로파일을 제시하는 변이체 HBV를 검출하는 방법으로서, ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 유사체 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 노출된 피험체로부터 HBV를 단리시키는 단계, 이후 표면 항원에 대한 하나 이상의 항체의 패널과 상기 HBV를 접촉시키는 단계 및 결합 친화력 또는 결합 스펙트럼에서의 임의의 변화에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법을 추가로 고려한다.
관련 측면에서, 본 발명의 방법은 변경된 면역 프로파일을 제시하는 변이체 HBV를 검출하기 위한 방법으로서, ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 노출된 피험체로부터 혈청 샘플을 단리시키는 단계, 이후 HBV 표면 항원의 패널 또는 이의 항체 결합 단편과 혈청을 접촉시키는 단계 및 결합 친화력 또는 결합 스펙트럼에서의 임의의 변화에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
단리된 HBsAg 또는 변이체 HBV에 상응한 이의 재조합 형태 또는 유도체 또는 이의 화학적 등가물을 제공한다. 일반적으로, HBsAg 또는 이의 재조합 또는 유도체 형태 또는 이의 화학적 등가물은 기준 HBV로부터의 HBsAg와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단이 있는 아미노산 서열을 포함하고 여기서 기준 HBV에 대한 항체는 상기 변이체 HBsAg를 보유하는 HBV에 대해 변경된 면역 프로파일을 제시한다. 일 구체예에서, 변경된 면역 프로파일은 변이체 HBV를 중화시키는 능력이 감소된 것을 포함한다.
또다른 측면은 플라스미드 벡터에 함유된 HBV로부터의 복제 가능(competent)-유효량의 게놈을 포함하는 유전제 작제물을 생성한 후 상기 작제물로 세포를 형질감염시키는 단계, 상기 세포를, 형질감염 전, 형질감염 동안 및/또는 형질감염 후에 테스트할 제제와 접촉시키는 단계, 상기 제제에 대해 내성인 경우, HBV가 유전자 서열을 복제, 발현하고/하거나 바이러스 또는 바이러스형 입자를 조립하고/하거나 방출하는데 충분한 시간 및 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계, 및 세포, 세포 분해물 또는 배양 상등액에 바이러스 검출 또는 바이러스 성분 검출 수단을 적용하여 상기 제제의 존재 하에 바이러스가 유전 물질을 복제, 발현하고/하거나 바이러스가 조립되고/되거나 방출되었는지를 측정하는 단계에 의해 HBV에 대해 억제 활성을 나타내는 제제를 검출하는 방법을 고려한다. 바람직한 구체예에서, 바큘로바이러스 벡터 내 플라스미드 벡터 및 방법은 세포를 감염시키기에 효과적인 양의 바큘로바이러스 게놈에 함유되거나 융합된 HBV로부터의 복제 가능-유효량의 게놈을 포함하는 유전자 작제물을 생성한 후 상기 작제물로 상기 세포를 감염시키는 단계, 상기 세포를, 감염 전, 감염 동안 및/또는 감염 후에 테스트할 제제와 접촉시키는 단계, 상기 제제에 대해 내성인 경우, HBV가 유전자 서열을 복제, 발현하고/하거나 바이러스 또는 바이러스형 입자를 조립하고/하거나 방출하는데 충분한 시간 및 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계, 이후 세포, 세포 분해물 또는 배양 상등액에 바이러스 검출 또는 바이러스 성분 검출 수단을 적용하여 제제의 존재 하에 바이러스가 유전 물질을 복제, 발현하고/하거나 바이러스가 조립되고/되거나 방출하였는지를 측정하는 단계를 포함한다.
상기 방법과 관련하여, 플라스미드 벡터는 다른 바이러스 벡터, 예컨대 바큘로바이러스 벡터 또는 아데노바이러스 벡터의 일부분 또는 전부를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있다(문헌 [Ren 및 Nassal, J Virol . 75(3):1104-1116, 2001] 참조).
대안적인 구체예에서, 방법은 감염 HBV 게놈이 2.2.15 또는 AD 세포주로 한정되지 않는 것과 같은 연속 세포주에 안정하게 통합되도록 복제 가능-유효량으로 HBV의 게놈의 감염 카피를 포함하는 연속 세포주를 생성하는 단계, 테스트할 제제와 상기 세포를 접촉시키는 단계, 상기 제제에 대해 내성인 경우, HBV가 유전자 서열을 복제, 발현하고/하거나 바이러스 또는 바이러스형 입자를 조립하고/하거나 방출하는데 충분한 시간 및 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계, 이후 세포, 세포 분해물 또는 배양 상등액에 바이러스 검출 또는 바이러스 성분 검출 수단을 적용하여 바이러스가 제제의 존재 하에 유전 물질을 복제, 발현하고/하거나 바이러스가 조립되고/되거나 방출하였는지를 측정하는 단계를 포함한다.
대안적인 구체예에서, 방법은 시험관내 폴리머라제 분석에서 HBV 폴리머라제에 대해 억제 활성을 나타내는 제제를 검출하는 단계를 고려한다. 확립된 분석을 사용하여 HBV 폴리머라제 활성을 조사할 수 있다(Gaillard et al , Antimicrob Agents Chemother . 46(4):1005-1013, 2002; Xiong et al , Hepatology , 28(6):l669-73, 1998). HBV 폴리머라제는 야생형 또는 기준 HBV 폴리머라제 또는 돌연변이체 HBV 폴리머라제일 수 있다.
바이러스 변이체의 동정은 L, M, S 단백질을 코딩하는 특정 재조합 바이러스 성분, 예컨대 폴리머라제 또는 엔벨롭 유전자 PreS1, PreS2, S를 포함하는 백신 뿐 아니라 결함 HBV 변이체를 포함하는 치료 백신의 생산을 가능하게 한다. 합리적 약물 설계는 L, M, S 단백질을 코딩하는 폴리머라제 또는 엔벨롭 유전자 PreS1, PreS2, S 또는 HBV의 다른 성분과 상호작용할 수 있는 치료 분자를 동정하거나 생성하기 위해 사용될 수 있다. 그러한 약물은 또한 진단 가능성을 가질 수 있다. 또한, 결함 HBV 변이체는 또한 동일, 유사 또는 동종 바이러스에 대해 면역 반응을 생성하기 위한 치료 조성물로서 사용될 수 있다. 대안적으로, HBV 변이체 또는 이의 표면 성분에 대해 생성되는 항체는 HBV 변이체 또는 유사 또는 동종 바이러스에 의한 감염에 대하여 피험체를 수동 면역화하는데 사용될 수 있다. 또한, HBV 성분의 활성을 하향조절하고, 복제, 유지, 감염, 조립 또는 방출을 억제하는 능력을 갖는 제제, 예컨대 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체, RNAi 또는 siRNA 분자(둘다 DNA 유래 또는 합성), 안티센스 또는 센스 올리고뉴클레오티드, 화학 또는 단백질성 분자가 본 발명에 의해 고려된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 약어의 요약은 하기 표 3에 제공된다.
본 명세서 전반에 걸쳐 사용된 서열 식별자의 요약은 하기 표 1에 제공된다.
| 서열 번호 | 설명 |
| 1 | PCR 프라이머 OSI 5' |
| 2 | PCR 프라이머 TTA3 5' |
| 3 | PCR 프라이머 JM 5' |
| 4 | PCR 프라이머 TTA4 5' |
| 5 | PCR 프라이머 OS2 5' |
| 6 | 내성 HBV 환자 A로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 뉴클레오티드 서열 |
| 7 | 내성 HBV 환자 A로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열 |
| 8 | 환자 A의 내성 HBV로부터의 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열 |
| 9 | 내성 HBV 환자 B로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 뉴클레오티드 서열 |
| 10 | 내성 HBV 환자 B로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열 |
| 11 | 환자 B의 내성 HBV로부터의 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열 |
| 12 | 내성 HBV 환자 C로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 뉴클레오티드 서열 |
| 13 | 내성 HBV 환자 C로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열 |
| 14 | 환자 C의 내성 HBV로부터의 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열 |
| 15 | 내성 HBV 환자 D로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 뉴클레오티드 서열 |
| 16 | 내성 HBV 환자 D로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열 |
| 17 | 환자 D의 내성 HBV로부터의 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열 |
| 18 | 내성 HBV 환자 E로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 뉴클레오티드 서열 |
| 19 | 내성 HBV 환자 E로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열 |
| 20 | 환자 E의 내성 HBV로부터의 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열 |
| 21 | 내성 HBV 환자 F로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 뉴클레오티드 서열 |
| 22 | 내성 HBV 환자 F로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열 |
| 23 | 환자 F의 내성 HBV로부터의 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열 |
| 24 | 내성 HBV 환자 G로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 뉴클레오티드 서열 |
| 25 | 내성 HBV 환자 G로부터의 폴리머라제의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열 |
| 26 | 환자 G의 내성 HBV로부터의 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열 |
| 아미노산 | 세문자 약어 | 한문자 기호 |
| 알라닌 | Ala | A |
| 아르기닌 | Arg | R |
| 아스파라긴 | Asn | N |
| 아스파르트산 | Asp | D |
| 시스테인 | Cys | C |
| 글루타민 | Gln | Q |
| 글루탐산 | Glu | E |
| 글리신 | Gly | G |
| 히스티딘 | His | H |
| 이소류신 | Ile | I |
| 류신 | Leu | L |
| 라이신 | Lys | K |
| 메티오닌 | Met | M |
| 페닐알라닌 | Phe | F |
| 프롤린 | Pro | P |
| 세린 | Ser | S |
| 트레오닌 | The | T |
| 트립토판 | Trp | W |
| 티로신 | Tyr | Y |
| 발린 | Val | V |
| 임의의 잔기 | Xaa | X |
| 약어 | 설명 |
| 3TC | (LMV); (-)-β-2'-데옥시-3'-티아사이티딘 |
| ADV | 아데포비르 디피복실 |
| DAPA | 디아미노퓨린 디옥살론 |
| DXG | 디옥살론 구아닌 |
| ETV | 엔테카비르 |
| FAM | 팜시클로비르 |
| FCV | 팜시클로비르 |
| FTC | 엠트리시타빈 |
| HBIG | B형 간염 면역글로불린 |
| HBsAg | B형 간염 표면 항원 |
| HBV | B형 간염 바이러스 |
| LdT | 베타-L티미딘 |
| LMV | 라미비듀인 |
| PMEA | 9-[포스포닐-메톡시에틸]-아데닌;아데포비르 |
| PMPA | 9-R-(2-포스포노메톡시프로필)아데닌 |
| RNase | 리보뉴클레아제 |
| rt("Xaa1nXaa2" 전 "rt"는 역전사효소를 의미함) | 역전사 효소 |
| s(돌연변이에서 사용됨, 예 sF134V) | 엔벨롭 유전자 |
| TFV | 테노포비르 디소프록실 푸마레이트 |
| YMDD | Tyr Met Asp Asp - 폴리머라제 단백질 내 모티브, 여기서 Met 잔기는 역전사 효소의 잔기 수 204로 설계됨 |
발명의 상세한 설명
본 발명은 HBV의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 내성 변이체를 동정 및 분리한 후, 환자를 ADV 또는 LMV 또는 ETV 또는 더욱 구체적으로는 ADV 및 LMV 또는 TFV 및 LMV, 또는 ETV 및 경우에 따라 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 유사체 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제, 예컨대 TFV, LdT, 또는 FTC로 치료하는 것을 부분적으로 포함한다. 특히, ADV 또는 ADV 및 LMV 또는 ETV 치료 환자는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대해 저하되거나 감소된 감수성을 나타내는 HBV의 변이체가 발생하였다. ADV 및/또는 LMV 및/또는 FTC 및/또는 TFV 및/또는 ETV에 대한 감수성과 관련하여 본원에 언급된 "저하된" 또는 "감소된"은 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 대해 완전 또는 상당한 내성 뿐 아니라 부분적인 내성을 포함하고 포괄하며 및 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제의 존재 하에 야생형보다 큰 복제 비율 또는 복제 효율을 포함한다. 일 측면에서, 이것은 치료 동안 바이러스 로딩의 증가에 의해 편리하게 측정되거나, 또는 대안적으로, 치료 동안 치료전 HBV DNA 농도로부터 HBV DNA 바이러스의 실질적인 감소가 없다(즉, 치료에 대한 미반응).
따라서, 일 측면은 단리된 B형 간염 바이러스(HBV) 변이체로서, 여기서 상기 변이체는 상기 DNA 폴리머라제에 대해 하나 이상의 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실을 초래하는 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자에 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하고 상기 변이체는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대해 감소된 감수성을 나타내는 변이체를 고려한다.
또다른 측면은 HBV가 ADV, LMV, TFV, LdT, FTC 및 ETV 또는 이의 조합물 또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에서 선택된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대한 감소된 감수성을 나타낼 가능성을 측정하는 방법으로서, 상기 HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA를 단리시키는 단계, 상기 DNA 폴리머라제 중 도메인 F 및 A 내지 E 또는 이의 인접 영역 중 어느 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 초래하고 하나 이상의 ADV, LMV, TFV, FTC에 대해 내성 또는 감소된 감수성과 관련된 HBV DNA 폴리머라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고/하거나 그러한 돌연변이의 존재는 상기 하나 이상의 ADV, LMV, TFV, LdT, FTC 및/또는 ETV에 대한 내성 가망성의 표시인 방법을 제공한다.
추가 측면은 단리된 B형 간염 바이러스(HBV) 변이체를 제공하고, 여기서 상기 변이체는 DNA 폴리머라제에 대해 하나 이상의 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실을 초래하는 상기 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자에서 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하고, 여기서 돌연변이는
(i) 코돈 239, 240, 241, 242 및/또는 243에서의 돌연변이;
(ii) N236I/D/V 치환을 초래하는 돌연변이;
(iii) S246H/P/Y/S 치환을 초래하는 돌연변이;
(iv) P17OH 치환을 초래하는 돌연변이;
(v) I253V 치환을 초래하는 돌연변이;
(vi) rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이;
(vii) rtF61L, rtS78T5, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이; 및
(viii) rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이
로 이루어진 군에서 선택되고, HBV 변이체는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대해 감소된 감수성을 제시한다.
달리 제시되지 않는 한, 본 발명의 명세서는 성분의 구체적 제형, 제조 방법, 투여 계획 등에 대해 한정하지 않기 때문에, 그 자체로 다양할 수 있다. 또한 본원에 사용된 용어는 특정 구체예를 기술하기 위한 목적이며 한정하는 것으로 간주되지 말아야 하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, 단수 형태 "a", "an" 및 "the"는 본문에 달리 명확하게 제시되지 않는 한 복수의 의미도 포함한다. 따라서, 예를 들어 "뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체"는 단일 유사체뿐 아니라 둘 이상의 유사체를 포함하고; "HBV 변이체"는 둘 이상의 HBV 변이체를 포함하며; "본 발명"은 본 발명의 단일 또는 다중 형태를 포함하는 것 등과 같다.
용어 "유사체", "화합물", "활성제", "약리적 활성제", "약제", "활성" 및 "약물"은 본원에서 HBV DNA 폴리머라제와 같은 효소의 바이러스 복제, 감염, 유지, 조립 및/또는 기능과 같은 바람직한 효과를 포함하는 화학적 화합물과 상호호환하여 사용된다. 용어는 또한 비제한적인 예로서 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그, 활성 대사물, 유사체 등을 포함하는 구체적으로 본원에 언급된 활성제의 약학적 허용 및 약리적 활성 성분을 포함한다. 용어 "유사체", "화합물", "활성제", "약리적 활성제", "약제", "활성" 및 "약물"을 사용하는 경우, 이들은 활성제 자체뿐 아니라 약학적 허용, 약리적 활성 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그, 대사물, 유사체 등을 포함하는 것으로 이해하여야 한다.
따라서, HBV DNA 폴리머라제와 같은 효소의 HBV 복제, 감염, 유지, 조립 및/또는 기능을 억제하는데 유용한 화합물이 고려된다. 용어 "유사체", "화합물", "활성제", "약리적 활성제", "약제", "활성" 및 "약물", 예컨대 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물을 참조한다. "조합물"은 또한 제제가 별도로 제공되어 별도로 투약 또는 분배되거나, 분배 전에 함께 혼합되는 다중 부분 항 HBV 치료 조성물과 같은 두 부분 이상을 포함한다.
본원에 사용된 제제의 용어 "유효량" 및 "치료적 유효량"이란 HBV DNA 폴리머라제와 같은 효소의 HBV 복제, 감염, 유지, 조립 및/또는 기능을 억제하는 소정의 치료 또는 생리적 효과를 제공하기에 충분한 제제의 양을 의미한다. 또한, 제제의 "HBV 억제의 효과적인 양" 또는 "증상 개선의 효과적인 양"은 HBV DNA 폴리머라제와 같은 효소의 복제, 감염, 유지, 조립 및/또는 기능을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는데 충분한 제제의 양이다. 바람직하지 않은 효과, 예컨대 부작용이 때때로 목적하는 치료 효과와 함께 나타나며; 따라서, 당업자는 적절한 "유효량"을 측정하는데 잠재적인 위험성과 잠재적인 이득을 조절한다. 필요한 정확한 양은 피험체의 종, 연령 및 일반적인 상태, 투여 방식 등에 따라 피험체마다 달라질 것이다. 따라서, 정확한 "유효량"을 규격화하는 것은 가능하지 않다. 하지만, 임의의 개체에서 적절한 "유효량"은 일상적인 실험만을 사용하여 당업자에 의해 결정될 수 있다.
"약학적 허용" 담체, 부형제 또는 희석제는 생물학적이지 않거나 그렇지 않으면 바람직하지 못한 재료로 이루어진 약학적 매개체를 의미하며, 즉 재료는 불리한 반응을 전혀 야기하지 않거나 실질적으로 야기함 없이 선택된 활성제와 함께 피험체에 투여될 수 있다. 담체는 부형제 및 다른 첨가제, 예컨대 희석제, 세정제, 착색제, 습윤제 또는 유화제, pH 완충제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
유사하게, 본원에 제공된 화합물의 "약리적 허용" 염, 에스테르, 에미드, 프로드러그 또는 유도체는 생물학적이지 않거나 그렇지 않으면 바람직하지 못한 염, 에스테르, 아미드, 프로드러그 또는 유도체이다.
본원에 사용된 용어 "치료하는" 및 "치료"란 HBV 감염과 관련된 중증도 및/또는 증상의 빈도의 감소, 증상 및/또는 근본적인 원인의 제거, 발병, 증상 및/또는 근본적인 원인의 예방, 및 손상의 개선 또는 치료를 말한다. 따라서, 예를 들어, 환자를 "치료하는" 것은 HBV 감염을 예방하는 것 뿐 아니라 HBV DNA 폴리머라제와 같은 효소의 HBV 복제, 감염, 유지, 조립 및/또는 기능을 억제함으로써 개체에서 임상적인 HBV 증상을 치료하는 것도 포함된다. 따라서, 예를 들어 HBV에 감염되었던 발병 성향이 있는 환자를 "치료하는" 본 발명의 방법은 HBV 감염의 예방 및 HBV 감염 또는 이의 증상을 치료하는 것 모두를 포함한다. 어떤 경우에도, 본 발명은 HBV 감염의 치료 또는 예방을 고려한다.
본원에 사용된 "환자"란 동물, 바람직하게는 포유동물, 더욱 바람직하게는 하위 영장류를 비롯한 영장류, 더욱 더 바람직하게는 본 발명의 조제물 및 방법으로부터 이득을 볼 수 있는 인간을 말한다. 인간 또는 비인간 동물 여부에 개의치 않고 환자는 개체, 피험체, 동물, 숙주 또는 수용자로서 언급될 수 있다. 본 발명의 화합물 및 방법은 인간 의학, 수의학 및 일반적으로 애완 또는 야생 동물 축산학에 적용된다. 편의상, "동물"은 조류 종, 예컨대 가금류(오리, 닭, 칠면조 및 거위 포함), 사육 조류 또는 사냥새를 포함한다. 비인간 동물에서의 상태는 자연적으로 발생한 HBV 감염이 아닐 수 있지만 HBV형 감염을 유도할 수 있다.
상기 제시된 바와 같이, 바람직한 동물은 인간, 비인간 영장류, 예컨대 마멋, 비비, 오랑우탄, 투피아(tupia)와 같은 하위 영장류, 가축 동물, 실험실 실험 동물, 같이 사는 동물 또는 우리에 갇힌 야생 동물이다. 인간은 가장 바람직한 표적이다. 하지만, 비인간 동물 모델을 사용할 수도 있다.
실험실 실험 동물의 예는 마우스, 래트, 토끼, 기니피그 및 햄스터가 포함된다. 토끼 및 설치류 동물, 예컨대 래트 및 마우스는 영장류 및 하위 영장류와 마찬가지로 편리한 실험 시스템 및 동물 모델을 제공한다. 가축 동물은 양, 소, 돼지, 염소, 말 및 당나귀를 포함한다. 비포유류 동물, 예컨대 조류 종, 지브라피쉬, 양서류(수수두꺼비; cane toad) 및 초파리 종, 예컨대 노랑초파리(Drosophila melanogaster)가 또한 고려된다. 살아있는 동물 모델 대신에, 실험 시스템은 또한 조직 배양 시스템을 포함할 수 있다.
"항 HBV 제제"는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체, 단백질, 화학적 화합물, RNA 또는 DNA 또는 RNAi 또는 siRNA 올리고뉴클레오티드(DNA 유래 또는 합성)를 포함한다.
특정 구체예에서, 감소된 감수성은 ETV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 ADV 또는 LMV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 TFV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 FTC에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 ETV 및 경우에 따라 ADV 및 LMV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 ADV 및 TFV 및 경우에 따라 ETV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 LMV 및 TFV 및 경우에 따라 ETV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 ADV 및 FTC 및 경우에 따라 ETV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 FTC 및 TFV 및 경우에 따라 ETV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 FTC 및 LMV 및 경우에 따라 ETV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 ADV 및 LMV 및 TFV 및 경우에 따라 ETV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 ADV 및 TFV 및 FTC 및 경우에 따라 ETV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 LMV 및 TFV 및 FTC 및 경우에 따라 ETV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 ADV 및 LMV 및 FTC 및 경우에 따라 ETV에 관한 것이다. 대안적으로, 감소된 감수성은 ADV 및 FTC 및 TFV 및 LMV 및 경우에 따라 ETV에 관한 것이다.
본원에 언급된 "항 HBV 제제"는 바이러스 복제, 유지, 감염, 조립 또는 방출을 억제하거나 그렇지 않은 경우 방해하는 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드 유사체 뿐 아니라 면역학적 시약 (예, HBV 표면 성분에 대한 항체) 및 화학적, 단백질성 및 핵산제를 포함한다. 본원에 언급된 "핵산"은 센스 또는 안티센스 분자, RNA 또는 DNA, 올리고뉴클레오티드 및 RNAi 및 siRNA 분자 및 이를 함유하는 복합체와 관련이 있다.
HBV 게놈의 중복 성질로 인한 DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자 내 돌연변이체(도 1) 이외에도, 상응한 돌연변이는 또한 표면 항원(HBsAg)을 코딩하는 S 유전자를 코딩하는 유전자 내에 발생하여 HBsAg에 대한 면역학적 시약, 예컨대 항체 및 면역 세포의 상호작용성을 감소시킬 수 있다. 일반적으로 바이러스 표면 성분에 대한 면역학적 시약의 상호작용성 감소는 바이러스 표면 성분을 인식하거나 실질적으로 인식하는 면역 메모리의 부재를 포함한다. 따라서, 본 발명은 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대한 감소된 감수성 또는 HBsAg에 대한 면역학적 시약의 감소된 상호작용성을 제시하는 HBV 변이체에 관한 것이며, 여기서 변이체는 다음의 ADV 및/또는 LMV 조합 또는 순차 치료에서 선택된다. 이때, 용어 "순차적인"이란 ADV 후 LMV 및/또는 TFV 및/또는 ETV, 및/또는 FTC, LMV 후 ADV 및/또는 TFV 및/또는 FTC 및/또는 ETV 또는 ETV 후 하나 이상의 ADV, FTC, LMV 및/또는 TFV, 또는 각 ETV, ADV, LMV 및/또는 TFV 및/또는 FTC의 다중 순차 투여를 의미한다.
따라서, 바이러스 변이체는 DNA 폴리머라제 유전자 단독에만 또는 DNA 폴리머라제 유전자 및 S 유전자 둘다에 돌연변이를 보유할 수 있다. 용어 "돌연변이"는 이의 가장 광범위한 의미로 해석되며 다중 돌연변이를 포함한다.
HBV DNA 폴리머라제의 임의의 도메인 및 특정 영역 F 및 G, 및 도메인 A 내지 E 내 돌연변이는 본원에서 ADV 및/또는 LMV 및/또는 TFV 및/또는 ETV 및/또는 FTC 및/또는 LdT 또는 이의 조합물에 대해 감소된 감수성을 초래하는 돌연변이를 제공하는 것으로 간주된다.
본 명세서에서는, 도메인 A 내지 E에 정의된 바와 같이 DNA 폴리머라제의 보존된 영역이 특히 언급된다. 영역 A 내지 E는 호주 특허 번호 734831에서 화학식 II에 제시된 아미노산 서열에 의해 정의된다.
특히, 돌연변이는 HBV DNA 폴리머라제 중 도메인 F 및 G, 및 도메인 A 내지 E 또는 이의 인접 영역 중 하나 이상의 아미노산 서열을 변경한다.
또다른 측면은 게놈 내에 중복된 개방 판독 프레임에서 돌연변이를 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 상기 돌연변이는 HBV DNA 폴리머라제의 하나 이상의 도메인 F 및 G, 및 도메인 A 내지 E에 의해 규정된 영역 내에 있고 상기 변이체는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대해 감소된 감수성을 나타내는 HBV 변이체를 제공한다.
추가 측면은 HBsAg 내 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실을 초래하는 상기 HBsAg를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 돌연변이를 포함하는 HBV 변이체로서, 상기 변이체는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대해 감소된 감수성을 나타내는 HBV 변이체를 고려한다.
더욱 자세하게는, 변이체 HBV는, 기준 또는 야생형 HBV로부터 표면 항원과 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 것으로서, 여기서 기준 또는 야생형 표면 항원에 발생된 항체는 상기 HBV 변이체를 중화시키는 능력이 감소된 것을 제시하며, 상기 변이체는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 것이 제공된다.
용어 "병용 치료법"이란 ADV, LMV, FTC, LdT, TFV, 및/또는 ETV의 조합물을 동일한 조성물에 공투여하거나 개별 조성물에 동시에 공투여하는 것을 의미한다. 용어 "순차 치료법"이란 두개의 제제를 상호 초, 분, 시간, 일 또는 주 내에 어느 한 순서로 투여되는 것을 의미한다. 순차 치료법은 또한 ADV, LMV, FTC, TFV, LdT 또는 ETV 중 하나 또는 다른 것으로 치료 과정을 완료한 후 다른 ADV, LMV, FTC, TFV, LdT 또는 ETV로 제2 또는 제3 또는 후속 치료 과정을 완료하는 것을 포함한다.
따라서, 또다른 측면은 치료전 HBV과 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ADV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
추가 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열이 있는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 LMV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 FTC 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 TFV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 LdT 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ADV 및 LMV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ADV 및 TFV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ADV 및 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
추가 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 LMV 및 TFV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
추가 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 LMV 및 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ADV 및 FTC 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 TFV 및 FTC 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 TFV 및 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 FTC 및 LMV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 FTC 및 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ADV, LMV 및 TFV 및/또는 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ADV, LMV 및 TFV 및/또는 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
추가 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ADV, LMV 및 FTC 및/또는 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 FTC, LMV 및 TFV 및/또는 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ADV, FTC 및 TFV 및/또는 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
또 다른 측면은 치료전 HBV와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 갖는 표면 항원을 포함하는 HBV 변이체로서, 여기서 변이체 HBV의 표면 항원은 치료전 HBV와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하며, 상기 변이체 HBV는 ADV, LMV, FTC 및 TFV 및/또는 ETV 치료법 또는 하나 이상의 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 의한 치료법에 피험체를 노출시킴으로써 선택되는 HBV 변이체를 고려한다.
특히, 변이체는 하나 이상의 정제 단계를 거쳐 천연 체액을 제거한 단리 형태이다. 대안적으로, 변이체는 단리된 체액에서 유지될 수 있거나 또는 DNA 형태일 수 있다. 본 발명은 또한 변이체 HBV로부터의 게놈 또는 이의 일부를 포함하는 감염성 분자 클론을 고려한다. 또한, 본 발명은 변이체 HBV, 비제한적인 예로, 단리된 HBsAg로부터 단리된 성분을 제공한다. 따라서, 본 발명은 단리된 HBsAg 또는 이의 재조합 형태 또는 유도체 또는 이의 화학적 등가물을 제공하며, 여기서 상기 HBsAg는 하나 이상의 ADV, LMV, FTC, TFV 및/또는 ETV 또는 경우에 따라 하나 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 피험체를 노출시킴으로써 선택된 변이체 HBV로부터 유래된 것이다.
더욱 구체적으로는, 단리된 변이체 HBsAg 또는 이의 재조합 또는 유도체 형태 또는 이의 화학적 등가물을 제공하며, 여기서 HBsAg 또는 이의 재조합 또는 유도체 형태 또는 이의 화학적 등가물은 기준 HBV로부터의 HBsAg와 비교하였을 때 변경된 면역 프로파일을 제시하고, 상기 HBsAg는 하나 이상의 ADV, LMV, FTC, TFV 및/또는 ETV 또는 경우에 따라 하나 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 피험체를 노출시킴으로써 변이체 HBV로부터 유래된 것이다.
더욱 더 구체적으로는, 단리된 변이체 HBsAg 또는 이의 재조합 또는 유도체 형태 또는 이의 화학적 등가물을 제공하며, 여기서 상기 HBsAg 또는 이의 재조합 또는 유도체 형태 또는 이의 화학적 등가물은 기준 HBV로부터의 HBsAg와 비교하였을 때 단일 또는 다중 아미노산 치환, 부가 및/또는 결실 또는 절단된 아미노산 서열을 포함하고, 기준 HBV에 대한 중화 항체는 상기 변이체 HBsAg를 보유하는 HBV에 대한 중화 활성이 없거나 감소되고, 상기 HBsAg는 하나 이상의 ADV, LMV, FTC, TFV 및/또는 ETV 또는 경우에 따라 하나 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 피험체를 노출시킴으로써 선택된 변이체 HBV로부터 유래된 것이다.
HBV DNA 폴리머라제 내 특정 돌연변이는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물의 치료 후 HBV가 재발된 환자에서 선택된 변이체를 포함한다. 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제는 이식 절차 동안, 절차 후 또는 절차 전(예, 골수 이식(BMT) 또는 OLT) 또는 간염으로 진단받은 환자 치료 후에 지시될 수 있다. 변이체의 선택 후, 바이러스 로딩은 치료전 수준과 유사한 수준으로 얻을 수 있거나 치료 중에 증가한다.
rt 영역에서 유용한 돌연변이체는, 일 구체예에서, rtS256R/S 및 rtW257G/W를 포함하고, 다른 구체예에서 rtH9D, rtL180M, rtM204V, rtT184S 및 rtN238T를 포함하거나, 다른 구체예에서 rtQ215S, rtR242K/R, 및 rtW243R/W를 포함하거나, 다른 구체예에서 rtN118S, rtR120R, rtT184A 및 rtY257H를 포함하거나, 다른 구체예에서 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R 및 rtH248N을 포함하거나, 다른 구체예에서 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F를 포함하거나, 다른 구체예에서 rtY221H/Y, rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함하거나, 다른 구체예에서 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V를 포함하거나, 다른 구체예에서 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S를 포함하거나, 마지막으로 다른 구체예에서 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V, 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함한다.
특히 유용한 돌연변이체는 코돈 180, 184 및 204에서 부속돌연변이, 예컨대 rtLlSOM 및 rtT184S 및 rtM204V 또는 코돈 85, 180, 184, 202, 204 및 236에서 부속돌연변이, 예컨대 rtS85T, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V이다. 본원에 고려된 대안적인 유용한 돌연변이는 rtP170H, rtT184A, rtY221H/Y, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R, rtR242K/R, rtW243R/W, rtI253V, rtI254I/F, rtS256R/S rtW257G/W, rtY257H 또는 코돈 239에서의 돌연변이를 포함한다. "부속돌연변이"란 변이체가 모든 언급된 코돈에서의 돌연변이를 포함하는 것을 의미한다. 본 발명은 특히 코돈 180, 184 및 204에서의 부속돌연변이 및 코돈 85, 180, 184, 202, 204 및 236에서의 부속돌연변이에 관한 것이지만, 코돈 180 및 204 단독에서 이중 돌연변이로 확장되지는 않는다.
이러한 HBV 변이체는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대해 감소된 감수성을 나타내는 것으로 제안된다. 아미노산 위치에 대한 명칭 시스템은 YMDD 모티브에서 메티오닌 잔기를 코돈 rtM204로 표시한 것을 기초로 한다는 것을 유념해야 한다. 이러한 넘버링 시스템은 폴리머라제 유전자 내 YMDD 모티브에서 메티오닌 잔기를 코돈 550으로 표시한 호주 특허 번호 734831의 것과는 상이하다. 이러한 점에서, rtL18OM 및 rtM204V는 호주 특허 번호 734831 내에서 각각 L526M 및 M550V와 상응한다. 상응한 돌연변이는 또한 하나 이상의 PreS1, PreS2 및 S와 같은 엔벨롭 유전자에서 발생할 수 있다.
ADV 및 다른 비환식 뉴클레오시드 포스포네이트 또다른 가능한 작용 방법은 면역 자극이다(Calio et al , Antiviral Res . 23:77-89, 1994). 다수의 돌연변이는 HBV 변이체에서 검출된 엔벨롭 유전자의 변화를 초래하여 면역 회피에 회합될 수 있다. 이러한 변화는, 일 구체예에서 sI92T/I, sL175F 및 sI195M을 포함하고, 다른 구체예에서 sS207R을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sI110V 및 sP120Q를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sF80S, sI208I/L, sS210K, sF220L/F 및 sY225H/Y를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sF134L/F 및 sL173F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sC76Y 및 sL173F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F 및 sI195M을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, s210R/S 및 sY225H/Y를 포함하고, 마지막으로 다른 구체예에서 sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함한다.
특히 유용한 돌연변이체는 sI110V, sP120Q, sF134L/F, sL162I, sL173F, sL175F, SL176V 및 sP178P/L이다.
본원에서 변이체의 동정은 그러한 변이체를 검출하는 일정 범위의 분석을 발생시킬 수 있다. 그러한 변이체의 검출은 내성 변이체를 동정하여 적절한 형태의 화학요법을 측정하고/하거나 백신접종 프로토콜을 모니터링하거나, 또는 신규 또는 개선된 백신 조제물을 개발하는데 중요할 수 있다.
또 다른 측면은 HBV가 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 대한 감소된 감수성을 나타낼 가능성을 측정하는 방법으로서, 상기 HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA로부터 단리시키는 단계 및 상기 DNA 폴리머라제 중 도메인 F 및 G, 및 A 도메인 내지 E 또는 이의 인접 영역 중 어느 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가되고 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 대해 내성 또는 감소된 감수성과 관련된 HBV DNA 폴리머라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고, 여기서 이러한 돌연변이의 존재는 상기 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 대한 내성 가망성의 표시인 방법을 고려한다.
따라서, 또다른 측면은 HBV가 상기 DNA 폴리머라제 중 도메인 F 및 A 내지 E 또는 이의 인접 영역 중 어느 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 초래하고 ADV, LMV, TFV, LdT, FTC 및 ETV 또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체로부터 선택된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대한 감소된 감수성을 나타낼 가능성을 측정하는 방법으로서, 상기 HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA를 단리시키는 단계 및 하나 이상의 ADV, LMV, TFV, LdT, FTC 및/또는 ETV에 대해 내성 또는 감소된 감수성과 관련된 HBV DNA 폴리머라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고, 여기서 그러한 돌연변이의 존재는 하나 이상의 상기 ADV, LMV, TFV, LdT, FTC 및/또는 ETV에 대한 내성 가망성의 표시인 방법을 제공한다.
특히, 분석은 하나 이상의 다음과 같은 돌연변이를 검출한다: 일 구체예에서 rtS256R/S 및 rtW257G/W를 포함하고, 다른 구체예에서 rtH9D, rtL180M, rtM204V, rtT184S 및 rtN238T를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtQ215S, rtR242K/R, 및 rtW243R/W를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtN118S, rtR120R, rtT184A 및 rtY257H를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R 및 rtH248N을 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtY221H/Y, rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL18OM, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S를 포함하거나, 또는 마지막으로 다른 구체예에서 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V, 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함하며, 여기서 상기 변이체는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대해 감소된 감수성을 제시한다.
따라서, 다른 측면은 HBV 균주가 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 대해 감소된 감수성을 나타내는지에 대한 여부를 측정하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA를 단리시키는 단계 및 S 유전자의 DNA 폴리머라제 및/또는 상응한 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고, 여기서 돌연변이의 존재는, 일 구체예에서 sI92T/I, sL175F 및 sI195M을 포함하고, 또다른 구체예에서 sS207R을 포함하거나, 또다른 구체예에서 sI110V 및 sP120Q를 포함하거나, 또다른 구체예에서 sF80S, sI208I/L, sS210K, sF220L/F 및 sY225H/Y를 포함하거나, 또다른 구체예에서 sF134L/F 및 sL173F를 포함하거나, 또다른 구체예에서 sC76Y 및 sL173F를 포함하거나, 또다른 구체예에서 sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F 및 sI195M을 포함하거나, 또다른 구체예에서 sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, s210R/S 및 sY225H/Y를 포함하고, 마지막으로 또다른 구체예에서 sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함하고, 또다른 구체예에서 rtS256R/S 및 rtW257G/W를 포함하고, 또다른 구체예에서 rtH9D, rtL180M, rtM204V, rtT184S 및 rtN238T를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtQ215S, rtR242K/R, 및 rtW243R/W를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtN118S, rtR120R, rtT184A 및 rtY257H를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R 및 rtH248N을 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtY221H/Y, rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S를 포함하거나, 마지막으로 또다른 구체예에서 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V, 또는 이의 조합물 또는 등가물을 포함하는 것에서 선택되고, 하나 이상의 다른 돌연변이는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대해 감소된 감수성을 나타내는 변이체를 가리키는 방법을 제공한다.
추가 측면은 HBV 균주가 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제에 대해 감소된 감수성을 나타내는지에 대한 여부를 측정하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA를 단리시키는 단계 및 S 유전자의 DNA 폴리머라제 및/또는 상응한 영역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에서 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고, 여기서 돌연변이의 존재는, 일 구체예에서 sI92T/I, sL175F 및 sI195M을 포함하고, 또다른 구체예에서 sS207R을 포함하거나, 또다른 구체예에서 sI110V 및 sP120Q를 포함하거나, 또다른 구체예에서 sF80S, sI208I/L, sS210K, sF220L/F 및 sY225H/Y를 포함하거나, 또다른 구체예에서 sF134L/F 및 sL173F를 포함하거나, 또다른 구체예에서 sC76Y 및 sL173F를 포함하거나, 또다른 구체예에서 sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F 및 sI195M을 포함하거나, 또다른 구체예에서 sC69Stop, SM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, s210R/S 및 sY225H/Y를 포함하고, 마지막으로 또다른 구체예에서 sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함하고, 또 다른 구체예에서, 일 구체예에서, rtS256R/S 및 rtW257G/W를 포함하고, 또다른 구체예에서 rtH9D, rtL180M, rtM204V, rtT184S 및 rtN238T를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtQ215S, rtR242K/R, 및 rtW243R/W를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtN118S, rtR120R, rtT184A 및 rtY257H를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R 및 rtH248N을 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtY221H/Y, rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V를 포함하거나, 또다른 구체예에서 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S를 포함하거나, 마지막으로 또다른 구체예에서 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V, 또는 이의 조합물 또는 등가물을 포함하는 것에서 선택되고, 하나 이상의 다른 돌연변이는 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대한 감소된 감수성을 나타내는 변이체를 제시하는 방법을 제공한다.
세포, 세포 분해물, 배양된 상등액 및 체액에서 HBV 또는 이의 성분은 임의의 핵산계 검출 수단을 비롯한 임의의 편리한 수단에 의해, 예를 들어, 핵산 하이브리드화 기술에 의해 또는 하나 이상의 폴리머라제 연쇄 반응(PCR)을 통해 검출될 수 있다. 용어 "체액"은 혈액계, 림프계, 조직계 또는 혈청, 전혈, 생검 및 생검액, 기관 외식편 및 기관 현탁액, 예컨대 간 현탁액을 포한하는 기관계로부터 유래된 임의의 유체를 포함한다. 본 발명은 또한 그 중에서 제한 단편 길이 다형성(RFLP), 증폭 단편 길이 다형성(AFLP), 단일 가닥 쇄 다형성(SSCP), 증폭 및 미스매치 검출(AMD), 산재 반복 서열 폴리머라제 연쇄반응(IRS-PCR), 역 폴리머라제 연쇄 반응(iPCR) 및 역 전사 폴리머라제 연쇄 반응(RT-PCR)을 포함한 상기 핵산계 검출 수단의 상이한 분석 포멧의 사용을 추가로 포함한다. 검출의 다른 형태는 노던 블롯, 서던 블롯, PCR 시퀀싱, 항체 검사, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 및 면역조직화학을 포함한다. 특히 유용한 분석은 고정된 올리고뉴클레오티드 매개 검출 시스템 또는 올리고펩티드 매개 검출 시스템을 위해 필요한 시약 및 성분을 포함한다.
특히 유용한 핵산 검출 시스템 중 하나는 역 하이브리드화 기술이다. 이 기술에서, HBV 샘플로부터의 DNA는 비오틴 또는 표지된 앰플리콘을 생성하기 위한 다른 리간드 표지된 프라이머를 사용하여 증폭시킨다. 니트로셀룰로스 막과 같은 고체 지지체에 고정된 올리고뉴클레오티드는 이후 하이브리드화에 의해 증폭된 DNA를 포획하는데 사용된다. 특정한 핵산 단편은 비오틴 또는 리간드를 통해 동정한다. 일반적으로, 표지된 프라이머는 검출될 특정 뉴클레오티드 변이에 특이적이다. 증폭은 검출될 변이가 존재하는 경우에만 발생한다. 다수 형태의 역 하이브리드화 분석이 존재하며 이들 모두가 본 발명에 포함된다.
본원에서 고려되는 또다른 측면은 변경된 면역 프로파일을 제시하는 변이체 HBV를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 노출된 피험체로부터의 HBV를 단리시키는 단계, 이후 상기 HBV를 표면 항원에 대한 하나 이상의 항체의 패널과 접촉시키는 단계 및 결합 친화력 또는 결합 스펙트럼에서의 임의의 변화에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법을 제공한다.
관련된 구체예에서는, 변경된 면역 프로파일을 제시하는 변이체 HBV를 검출하는 단계에 대한 방법으로서, 상기 방법은 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 노출된 피험체로부터 혈청 샘플을 단리시키는 단계, 이후 HBV 표면 항원의 패널 또는 이의 항체 결합 단편과 상기 혈청을 접촉시키는 단계 및 결합 친화력 또는 결합 스펙트럼에서의 임의의 변화에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법을 고려한다.
세포 배양물에서 HBV 복제를 검출하는 것은 특히 유용하다.
상기 및 다른 측면은 특히 HBV의 게놈 서열 또는 전사산물을 하향 조절하는 센스 및 안티센스 분자, RNAi 또는 siRNA 분자 또는 DNA 또는 RNA 결합 분자를 비롯한 올리고뉴클레오티드를 동정하는 것과 같은 마이크로어레이 분석에 적용할 수 있다. 마이크로어레이 분석은 또한 HBV 게놈 내, 예컨대 HBV DNA 폴리머라제 코딩 영역 또는 HBsAg 코딩 영역 내에서 특정 돌연변이를 동정하는데 사용될 수 있다.
또 다른 측면은
플라스미드 벡터에 포함된 HBV로부터의 복제 가능-유효량의 게놈을 포함하는 유전자 작제물을 생성한 후 상기 작제물로 상기 세포를 형질감염시키는 단계;
상기 세포를, 형질감염 전, 형질감염 동안 및/또는 형질감염 후에 테스트할 제제와 접촉시키는 단계;
상기 제제에 대해 내성인 경우, HBV가 유전자 서열을 복제, 발현하고/하거나, 바이러스 또는 바이러스형 입자를 조립하고/하거나 방출하는데 충분한 시간 및 조건 하에 세포를 배양하는 단계; 및
세포, 세포 분해물 또는 배양 상등액에 바이러스 검출 수단 또는 바이러스 성분 검출 수단을 적용하여 상기 제제의 존재 하에 바이러스가 유전 물질을 복제, 발현하고/하거나 바이러스가 조립되고/되거나 방출되었는지를 측정하는 단계
에 의해 HBV에 대한 억제 활성을 나타내는 제제를 검출하는 방법을 고려한다.
특정 구체예에서, 플라스미드 벡터는 바큘로 바이러스 또는 아데노바이러스(상기, Ren 및 Nassal(2001))와 같은 다른 바이러스 벡터의 일부 또는 전부를 코딩하는 유전자를 포함할 수 있고, 방법은
세포를 감염시키기에 효과적인 양의 바큘로바이러스 게놈 또는 아데노바이러스 게놈에 함유되거나 융합된 HBV로부터의 복제 가능-유효량의 게놈을 포함하는 유전자 작제물을 생성한 후 상기 작제물로 상기 세포를 형질감염시키는 단계;
상기 세포를 감염 전, 감염 동안 및/또는 감염 후에 테스트할 제제와 접촉시키는 단계;
상기 제제에 대해 내성인 경우, HBV가 유전자 서열을 복제, 발현하고/하거나, 바이러스 또는 바이러스형 입자를 조립하고/하거나 방출하는데 충분한 시간 및 조건 하에서 세포를 배양하는 단계; 및
세포, 세포 분해물 또는 세포 상등액에 바이러스 검출 수단 또는 바이러스 성분 검출 수단을 적용하여 상기 제제의 존재 하에 바이러스가 유전 물질을 복제, 발현하고/하거나 바이러스가 조립되고/되거나 방출되었는지를 측정하는 단계
를 포함한다.
대안적인 구체예에서, 방법은
감염성 HBV 게놈이 상기 연속적인 세포주, 비제한적인 예로서, 2.2.15 또는 AD에 안정하게 통합되도록 복제 가능 유효량으로 HBV 게놈의 감염성 카피를 포함하는 연속적인 세포주를 생성하는 단계;
상기 세포를 테스트할 제제와 접촉시키는 단계;
상기 제제에 대해 내성인 경우, HBV가 유전자 서열을 복제, 발현하고/하거나, 바이러스 또는 바이러스형 입자를 조립하고/하거나 방출하는데 충분한 시간 및 조건 하에서 세포를 배양하는 단계; 및
이후 세포, 세포 분해물 또는 배양 상등액에 바이러스 검출 수단 또는 바이러스 성분 검출 수단을 적용하여 상기 제제의 존재 하에 바이러스가 유전 물질을 복제, 발현하고/하거나 바이러스가 조립되고/되거나 방출되는지를 측정하는 단계
를 포함한다.
상기 언급된 방법은 HBV 변이체, 예컨대 돌연변이를 보유하는 것에 대해 제제를 동정하거나 개발하는데 특히 유용하며, 일 구체예에서 rtS256R/S 및 rtW257G/W를 포함하고, 다른 구체예에서 rtH9D, rtL180M, rtM204V, rtT184S 및 rtN238T를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtQ215S, rtR242K/R, 및 rtW243R/W를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtN118S, rtR120R, rtT184A 및 rtY257H를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R 및 rtH248N를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtY221H/Y, rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S를 포함하거나, 마지막으로 또 다른 구체예에서 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V, 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함하고; 또 다른 구체예에서 sI92T/I, sL175F 및 sI195M을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sS207R을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sI110V 및 sP120Q를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sF80S, sI208I/L, sS210K, sF220L/F 및 sY225H/Y를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sF134L/F 및 sL173F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sC76Y 및 sL173F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F 및 sI195M을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, s210R/S 및 sY225H/Y를 포함하고, 마지막으로 또 다른 구체예에서 sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함한다.
따라서, 또다른 측면은 HBV 균주가 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 가능한 항 HBV 제제에 대해 감소된 감수성을 나타내는지를 측정하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA를 단리시키는 단계 및 일 구체예에서 rtS256R/S 및 rtW257G/W를 포함하고, 또 다른 구체예에서 rtH9D, rtL180M, rtM204V, rtT184S 및 rtN238T를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtQ215S, rtR242K/R, 및 rtW243R/W를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtN118S, rtR120R, rtT184A 및 rtY257H를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T/I, itT240N/T, rtK241R 및 rtH248N을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtY221H/Y, rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S를 포함하거나, 마지막으로 또 다른 구체예에서 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V를 포함하거나, 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함하고; 추가 구체예에서, 일 구체예에서 sI92T/I, sL175F 및 sI195M을 포함하고, 또 다른 구체예에서 sS207R을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sI110V 및 sP120Q를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sF80S, SI208I/L, sS210K, sF220L/F 및 sY225H/Y를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sF134L/F 및 sL173F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sC76Y 및 sL173F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F 및 sI195M을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, s210R/S 및 sY225H/Y를 포함하거나, 마지막으로 또 다른 구체예에서 sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물을 포함하는 것으로부터 선택된 엔벨롭 유전자 또는 DNA 폴리머라제 유전자의 뉴클레오티드 서열에서의 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법을 고려한다.
DNA 폴리머라제의 아미노산 변이체 검출은 편리하게는 일정 범위의 아미노산 검출 기술에 의해 달성된다. HBV 변이체가 아미노산 변화를 포함하는 경우, 이러한 단리체는 DNA 폴리머라제 활성이 변경된 추정 HBV 변이체로 간주된다.
본원에서 추가의 고려 사항은 HBV 변이체 내성인 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물을 억제하는 제제이다. 이러한 제제는 ADV, LMV, FTC, TFV, LdT 및/또는 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 특히 임상의에 의해 고려되는 TFV에 의해 장기간 치료되는 경우 특히 유용하다. 제제는 DNA 또는 RNA 또는 단백질성 또는 비단백질성 화학 분자일 수 있다. 식물, 산호 및 미생물 등으로부터 스크리닝된 천연 산물은 또한 조합 또는 화학 라이브러리에 대한 스크리닝이기 때문에 마스킹제의 유용한 잠재적 공급원으로 고려된다. 제제는 단리 형태 또는 약학 조성물 또는 조제물의 형태일 수 있고 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 대신 또는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 또한, 예를 들어 HBV DNA 폴리머라제의 결정 또는 NMR 구조를 풀고 효소의 활성 부위에 결합할 수 있는 제제를 설계하는 것을 포함하는 합리적 약물 설계가 고려된다. 이러한 접근은 또한 다른 HBV 성분에도 적용될 수 있다.
따라서, 또다른 측면은 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합에 내성 또는 감소된 감수성을 나타내는 HBV에 대해 억제된 활성을 제시하는 제제를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
플라스미드 벡터 내에 포함된 상기 HBV로부터의 복제 가능-유효량의 게놈을 포함하는 유전자 작제물을 생성한 후 상기 작제물로 상기 세포를 형질감염시키는 단계;
상기 세포를, 형질감염 전, 형질감염 동안 및/또는 형질감염 후에 테스테할 제제와 접촉시키는 단계;
상기 제제에 대해 내성인 경우, HBV가 유전자 서열을 복제, 발현하고/하거나, 바이러스 또는 바이러스형 입자를 조립하고/하거나 방출하기에 충분한 시간 및 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
세포, 세포 분해물 또는 배양 상등액에 바이러스 검출 수단 또는 바이러스 성분 검출 수단을 적용하여 상기 제제의 존재 하에서 바이러스가 유전 물질을 복제, 발현하고/하거나 바이러스가 조립되고/되거나 방출되었는지를 측정하는 단계
를 포함하는 방법이 고려된다.
또 다른 측면은 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 내성 또는 감소된 감수성을 나타내는 HBV에 대해 억제 활성을 나타내는 제제를 검출하는 방법으로서, 상기 방법은
감염 세포에 효과적인 양의 바큘로바이러스 게놈에 함유되거나 융합된 상기 HBV로부터 복제 가능-유효량의 게놈을 포함하는 유전자 작제물을 생성한 후 상기 작제물로 상기 세포를 감염시키를 단계;
상기 세포를, 감염 전, 감염 동안 및/또는 감염 후에 테스트할 제제와 접촉시키는 단계;
상기 제제에 대해 내성인 경우, HBV가 유전자 서열을 복제, 발현하고/하거나 바이러스 또는 바이러스형 입자를 조립하고/하거나 방출시키기에 충분한 시간 및 조건 하에서 상기 세포를 배양하는 단계; 및
세포, 세포 분해물 또는 배양 상등액에 바이러스 검출 수단 또는 바이러스 성분 검출 수단을 적용하여 상기 제제의 존재 하에 바이러스가 유전 물질을 복제, 발현하고/하거나 바이러스가 조립되고/되거나 방출되었는지를 측정하는 단계
를 포함하는 방법을 제공한다.
특히, HBV 게놈은 세포의 게놈에 안정하게 통합된다.
유용한 세포는 2.2.15 세포(Price et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA 86(21): 8541-8544, 1989) 또는 AD 세포(또한 HepAD32 세포 또는 HepAD79 세포로도 공지됨[Ying et al ., Viral Hepat . 7(2): 161-165, 2000])를 포함한다.
바큘로바이러스 벡터가 본 발명의 방법을 실행하는데 특히 유용하지만, 일정 범위의 다른 벡터 또한 비제한적인 예로서 아데노바이러스 벡터 등이 사용될 수 있다.
본 발명은 또한 HBV 게놈의 전부 또는 일부 또는 이로부터의 유전자 또는 유전자의 일부를 포함하는 유전자 작제물을 보유하는 세포주(예, 2.2.15 또는 AD 세포)를 고려한다.
또한 항바이러스제에 대해 스크리닝하기 위한 HBV 변이체의 용도를 제공한다. 이러한 항바이러스제는 바이러스를 억제한다. 용어 "억제하다"는 감염, 복제, 조립 및/또는 방출 또는 임의의 중간 단계를 길항하거나 그렇지 않은 경우 방해하는 것을 포함한다. 특정 항바이러스제는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 항 HBV 제제, 및 비뉴클레오시드 분자를 포함한다.
또한, 뉴클레오시드를 모방하거나 특정 뉴클레오티드 서열 또는 특정 뉴클레오티드와 상호작용하는 화학 분자를 동정하거나 생성하기 위한 합리적 약물 설계 또한 고려된다. 조합 화학 및 두개의 하이브리드 스크리닝은 가능한 치료제 또는 진단제를 동정하는데 사용될 수 있는 다수의 기술 중 일부이다.
일 구체예에서, 폴리머라제 또는 표면 항원의 결정 구조 또는 NMR 구조는 기능 및/또는 항원성에 필요한 분자의 주요 영역과 상호작용할 것 같은 소형 화학 분자를 합리적으로 설계하는데 사용된다. 이러한 제제는 폴리머라제 활성의 억제제로서 유용할 수 있고/있거나 표면 항원 상에 에피토프로 바꿀 수 있다.
HIV로부터의 역 전사효소와의 유사성으로 인해 몇몇 모델의 HBV 폴리머라제가 제조되었다(Das et al , J. Virol 75 (1O):4771-4779, 2001; Bartholomeusz et al , Intervirology 40(5-6):337-342 1997; Allen et al , Hepatology 27(6):1670-l677, 1998). HBV 폴리머라제 모델은 야생형 바이러스 뿐 아니라 내성 돌연변이를 코딩하는 HBV에 대해 효과적인 신규 제제를 합리적 약물 설계하는데 사용되었다. 설계된 합리적 약물은 존재하는 항바이러스제, 예컨대 내성과 관련된 돌연변이를 코딩하는 HBV의 선택에 사용되는 제제의 변형을 기초로 할 수 있다. 돌연변이를 코딩하는 HBV 게놈 재료를 발현하는 바이러스 또는 클론은 또한 신규 항바이러스제에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다.
대안적인 구체예에서는, 시험관내 폴리머라제 분석에서 HBV 폴리머라제에 대해 억제 활성을 나타내는 제제를 검출하는 방법을 고려한다. HBV 폴리머라제 활성은 확립된 분석을 사용하여 실험할 수 있다(상기, Gaillard 등(2002); 상기, Xiong 등(1998)),
상기 제시된 바와 같이, 마이크로어레이 기술은 규정된 HBV 내부 또는 외부 성분과 상호작용할 수 있는 제제를 동정하는 유용한 수단이다. 예를 들어, 상이한 아미노산 변이체를 보유하는 HBV DNA 폴리머라제 또는 이의 펩티드 단편의 분석은 이러한 분자와 결합하거나 그렇지 않은 경우 상호작용할 수 있는 제제에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 이것은 HBV 변이체 간에 제제의 시차 결합 패턴을 측정하는 편리한 방법이다. 항체 어레이는 또한 변경된 HBsAg 분자에 대해 스크리닝하는데 사용될 수 있다. 마이크로어레이는 또한 HBV 성분과 상호작용 능력이 있는 항체, 인터페론 또는 사이토킨과 같은 분자를 동정하기 위한 프로테옴 분석에 유용하다. DNA 및 RNA 분자의 마이크로어레이는 또한 HBV 게놈 또는 이의 전사산물 상의 유전자 영역에 대한 센스 및 안티센스 분자를 동정하는데 사용될 수 있다.
상기 방법은 특히 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 내성 또는 감소된 감수성을 나타내는 HBV의 억제제를 동정하는데 유용하다. 따라서, 본 발명은 억제제 조성물을 포함한다. 상기 억제제는 RNAi의 유도 또는 공억제를 위한 항체 또는 유전자 분자, 예컨대 리보자임, 안티센스 분자 및/또는 센스 분자 형태일 수 있거나 또는 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 공지된 유사체의 유도체일 수 있다. RNAi를 언급할 때는 siRNA(short, interfering RNA)에 대한 언급도 포함하며 모든 RNAi 유형 분자는 DNA 유래 또는 합성일 수 있다.
용어 "조성물"은 "약학 조성물" 또는 조제물을 포함한다.
억제제는 하기 "활성 성분" 또는 "활성 화합물"로 언급되고 상기 제시된 억제제 군에서 선택될 수 있다.
조성물은 HBV의 항원 성분, 결실 HBV 변이체 또는 천연 산물에 대한 스크리닝 또는 합리적 약물 설계 (조합 화학 포함)를 통해 동정된 제제를 포함할 수 있다.
약학적 허용 담체 및/또는 희석제는 임의의 모든 용매, 분산 매질, 코팅, 항박테리아제 및 항진균제, 등장 지연제 및 흡수 지연제 등을 포함한다. 약학적 활성 물질에 대한 이러한 매질 및 제제의 용도는 당업계에 잘 공지되어 있다. 임의의 통상적인 매질 또는 제제가 활성 성분과 비상용성인 경우를 제외하고, 치료 조성물에서의 이의 용도가 고려된다. 보충용 활성 성분은 또한 조성물에 도입될 수도 있다.
약학 조성물은 또한 아스파틸 프로테아제 억제제를 코딩할 수 있는 핵산 분자를 보유하고 표적 세포를 형질감염시킬 수 있는 벡터와 같은 유전자 분자를 포함할 수 있다. 벡터는, 예를 들어 바이러스 벡터일 수 있다.
주사할 수 있는 용도로 적당한 약학 형태는 멸균 수용액(수용성) 및 멸균 주사가능액의 즉석 제조를 위한 멸균 분말을 포함한다. 이는 제조 및 저장 조건 하에서 안정해야하며 박테리아 및 진균과 같은 미생물의 오염 작용에 대항하여 보존되어야 한다. 담체는, 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올(예, 글리세롤, 프로필렌 글리콜 및 액체 폴리에틸렌 글리콜 등), 이의 적당한 혼합물 및 식물유를 포함하는 용매 또는 희석 매질일 수 있다. 예를 들어 계면활성제의 사용에 의해 적절한 유동성이 유지될 수 있다. 미생물 작용의 방해는 다양한 항박테리아제 및 항진균제, 예컨대 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 소르브산, 티메로살 등에 의해 이룰 수 있다. 다수의 경우에, 등장제, 예컨대 당류 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사 가능한 조성물의 장기간 흡수는 흡수 지연제, 예컨대 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 조성물을 사용함으로써 이룰 수 있다.
멸균 주사가능액은 필요량의 활성 화합물을 활성 성분 및 경우에 따라 요구되는 다른 활성 성분들과 함께 적절한 용매에 도입한 후, 여과 멸균 또는 다른 적절한 멸균 수단에 의해 제조된다. 멸균 주사가능액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 적당한 제조 방법은 활성 성분과 임의의 소정의 추가 성분의 분말을 제공하는 진공 건조 및 동결건조 기술을 포함한다.
활성 성분이 적당하게 보호된 경우, 이것은, 예를 들어 불활성 희석제 또는 동화가능한 식용 담체와 함께 경구 투여될 수 있거나, 또는 경질 또는 연질 쉘 젤라틴 캡슐 내에 넣어질 수 있거나, 또는 정제로 압축될 수 있다. 경구 치료 투여의 경우, 활성 성분은 부형제와 함께 도입되어 섭취용 정제, 협측 정제, 트로키제, 캡슐제, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 웨이퍼 등의 형태로 사용될 수 있다. 이러한 조성물 및 조제물은 1 중량% 이상의 활성 화합물을 포함하여야 한다. 조성물 및 조제물의 백분율은 물론 달라질 수 있고 편의상 단위의 약 5∼80 중량%일 수 있다. 치료적으로 유용한 조성물 내 활성 화합물의 양은 적당한 투여량이 얻어지는 양이다. 본 발명에 따른 적당한 조성물 또는 조제물은 경구 투약 단위 형태가 약 0.1 ㎍ 및 200 mg의 활성 화합물을 함유하도록 조제된다. 대안적인 투여량은 약 1 ㎍∼약 1000 mg 및 약 10 ㎍∼약 500 mg을 포함한다. 이러한 투여량은 개체 당 또는 체중 1 kg 당일 수 있다. 매시간, 매일, 매주, 매달 또는 매년마다 투여될 수 있다.
정제, 트로키제, 알약, 캡슐 등은 또한 이하 열거되는 성분을 포함할 수 있다. 바인더, 예컨대 검, 아카시아, 옥수수 전분 또는 젤라틴; 부형제, 예컨대 인산이칼슘; 붕해제, 예컨대 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 등; 윤활제, 예컨대 마그네슘 스테아레이트; 및 감미료, 예컨대 자당, 유당 또는 사카린이 첨가될 수 있거나 또는 풍미제, 예컨대 페퍼민트, 윈터그린 오일 또는 체리향이 첨가될 수 있다. 투약 단위 형태가 캡슐인 경우, 이는 상기 유형의 재료 이외에 액체 담체를 포함할 수 있다. 다수의 다른 재료들은 코팅제로 또는 그렇지 않은 경우 투약 단위의 물리적 형태를 개선시키기 위해 존재할 수 있다. 예를 들어, 정제, 알약 또는 캡슐은 셸락, 당류 또는 둘다로 코팅될 수 있다. 시럽 또는 엘릭시르는 활성 화합물, 감미료로서 자당, 보존제로서 메틸 및 프로필파라벤, 염료 및 풍미제를 함유할 수 있다. 물론, 임의의 투약 단위 형태를 제조하는데 사용된 임의의 재료는 사용된 양에서 약학적으로 순수하고 실질적으로 비독성이어야 한다. 또한, 활성 화합물(들)은 서방형 제조물 및 조제물에 도입될 수 이다.
상기 언급된 바와 같이, 본 발명은 본원에 기술된 HBV 변이체로부터의 단리된 HBsAg를 추가로 포함한다. 더욱 구체적으로는, 본 발명은 HBsAg 또는 이의 재조합 형태 또는 유도체 또는 이의 화학적 등가물을 제공한다. 단리된 표면 성분 및, 더욱 구체적으로는, 단리된 표면 항원 또는 이의 재조합체, 유도체 또는 화학적 등가물은 백신 조제물과 같은 생물학적 조성물의 개발에 유용하다.
또 다른 측면은 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 내성인 변이체 HBV 또는 상기 변이체 HBV로부터의 다른 항 HBV 제제 또는 HBV 표면 항원 또는 이의 재조합 또는 유도체 형태 또는 이의 화학적 등가물 및 하나 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제를 포함하는 조성물을 제공한다. 그러한 조성물은 치료 조성물로 고려될 수 있으며 체액 반응을 포함한 면역 반응을 발생시키는데 유용하다. 일반적으로, HBV 변이체는 "결실"되고 자체적으로 피험체에 지속적인 감염을 야기할 수 없다.
상기 제시된 바와 같이, 항체는 돌연변이체 HBV 제제로 생성되어 이러한 바이러스에 의한 감염에 대항하여 수동 또는 직접 백신접종에 사용될 수 있다. 항체는 인간 또는 비인간 동물에서 발생될 수 있다. 후자의 경우, 비인간 항체는 사용 전에 탈면역화 또는 더욱 구체적으로는 인간화시키는 것이 필요할 수 있다. 탈면역화는, 예를 들어 인간 공통서열 단편 항체 결합(Fab) 폴리펩티드 상에 쥐과 또는 비인간 동물 항 HBV 항체의 가변 영역으로부터 상보 결정 영역(CDR)을 그래프팅하는 것을 포함할 수 있다. 대안적으로, 항체의 가변 영역에서 에피토프를 한정하는 아미노산은 에피토프가 인간 MHC II형 복합체에 의해 더이상 인식되지 않도록 돌연변이시킬 수 있다.
리보자임, 안티센스 또는 공억제(RNAi) 또는 siRNA 또는 이의 복합 억제에 관한 한에 있어서는, 편의상 전사후 유전자 사일런싱(silencing)을 목표로 한다. DNA 또는 RNA가 투여될 수 있거나 HBV mRNA에 특이적인 RNAi 또는 이의 화학적 유사체를 포함하는 복합체가 사용될 수 있다.
모든 그러한 분자는 약학 조성물에 도입될 수 있다.
또다른 구체예에서, 변이체 HBV 또는 상기 변이체 HBV로부터의 HBsAg 또는 L, M 또는 S 단백질 또는 이의 재조합 또는 유도체 형태 또는 이의 화학적 등가물을 포함하는 생물학적 조성물을 제공한다.
일반적으로, HBV가 사용된 경우, 우선 약독화된다. 생물학적 조성물은 일반적으로 하나 이상의 약학적 허용 담체 및/또는 희석제를 추가로 포함한다.
생물학적 조성물은 하나의 HBV 변이체로부터의 HBsAg 또는 유사 분자를 포함할 수 있거나 또는 조성물은 일정 범위의 ADV- 및/또는 LMV- 및/또는, FTC- LdT-, 및/또는 TFV-내성 HBV 변이체로부터의 HbsAgs 또는 L, M 또는 S 단백질 또는 유사 분자 칵테일일 수 있다. 조성물이 HBV를 포함하는 경우 유사 함유물이 적용된다.
특정 뉴클레오티드 서열을 갖거나 특정 폴리머라제 또는 표면 항원 또는 L, M 또는 S 단백질을 코딩하는 HBV 균주에 의한 감염에 대해 개체를 백신접종하기 위한 치료 백신의 제조에 있어서 결실 HBV 변이체의 용도를 추가로 제공한다.
적당한 백신 후보의 예는, 일 구체예에서 rtS256R/S 및 rtW257G/W를 포함하고, 또 다른 구체예에서 rtH9D, rtL180M, rtM204V, rtT184S 및 rtN238T를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtQ215S, rtR242K/R, 및 rtW243R/W를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtN118S, rtR120R, rtT184A 및 rtY257H를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R 및 rtH248N을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtY221H/Y, rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S를 포함하거나, 마지막으로 또 다른 구체예에서 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V, 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이르 포함하고; 추가 구체예에서, sI92T/I, sL175F 및 sI195M, 또 다른 구체예에서 sS207R을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sI110V 및 sP120Q를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sF80S, sI208I/L, sS210K, sF220L/F 및 sY225H/Y를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sF134L/F 및 sL173F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sC76Y 및 sL173F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F 및 sI195M을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, S210R/S 및 sY225H/Y를 포함하고, 마지막으로 또 다른 구체예에서 sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함하는 것에서 선택된 돌연변이를 포함하는 HBV 변이체의 결실 형태이다.
일 구체예에서, 예를 들어 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대해 내성 또는 감소된 감수성을 부여하는 폴리머라제에서 특정 돌연변이를 갖는 HBV 변이체가 동정될 수 있다. 상기 변이체는 이후 돌연변이화되어 결실을 될 수 있는데, 즉 약독화시키거나 감염을 야기하지 못하게 할 수 있다. 그러한 결실 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 내성 바이러스는 이후 이의 폴리머라제에 동일한 돌연변이를 갖는 독성 바이러스에 대한 치료 백신으로 사용될 수 있다.
본 발명은 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 내성인 변이체 HBV에 대한 분석을 위한 키트를 포함한다. 이러한 키트는, 예를 들어 PCR 또는 다른 핵산 하이브리드화 기술로부터의 시약 또는 면역학을 기초로 한 검출 기술로부터의 시약을 포함할 수 있다. 특히 유용한 분석은 고정 올리고뉴클레오티드 매개 또는 올리고펩티드 매개 검출 시스템에 필요한 시약 및 성분을 포함한다.
또 다른 측면은 HBV가 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대한 감소된 감수성을 나타낼 가능성을 측정하는 방법으로서, 상기 HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA를 단리시키는 단계 및 상기 DNA 폴리머라제 중 도메인 F 및 G, 및 도메인 A 내지 E 또는 이의 인접 영역 중 어느 하나 이상에서 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 부가를 초래하고 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 내성 또는 감소된 감수성과 관련된 HBV DNA 폴리머라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고, 여기서 그러한 돌연변이의 존재는 상기 ADV, LMV, TFV, LdT, ETV 또는 FTC; ADV 및 LMV; ADV 및 TFV; LMV 및 TFV; FTC 및 ADV; FTC 및 TFV; FTC 및 LMV; ETV 및 ADV; ETV 및 LMV; ETV 및 FTC; ETV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 TFV; 또는 ADV 및 FTC 및 TFV; TFV 및 FTC 및 LMV; ADV 및 LMV 및 ETV, ADV 및 ETV 및 TFV; ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 LMV 및 FTC; ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ETV 및 FTC 및 LMV 및 TFV; ADV 및 ETV 및 LMV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 ETV 및 TFV; ADV 및 FTC 및 LMV 및 ETV; 또는 ADV 및 FTC 및 LMV 및 TFV 및 ETV 및/또는 경우에 따라 다른 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 다른 항 HBV 제제 또는 이의 조합물에 대한 내성 가망성의 표시인 방법이 고려된다.
가능한 바이러스 변이체의 평가는 적당한 치료 프로토콜을 선택하는데 중요하다. 그러한 평가는 적당하게는 특정 화학 화합물 또는 면역 제제에 대한 바이러스 변이체의 내성 또는 감수성과 상응하는 값을 제공하기 위한 바이러스 변이체와 관련된 둘 일상의 특징에 대한 입력 코드가 특히 추가된 소프트웨어로 프로그램화된 컴퓨터를 사용하여 용이하게 수행된다. 값은 (a) 특정 화합물 또는 면역제에 감소된 감수성에 대한 내성을 제시하는 능력; (b) 야생형 HBV로부터의 변경된 DNA 폴리머라제; (c) 야생형 HBV로부터의 변경된 표면 항원; 또는 (d) 환자의 사망률 또는 회복 가능성에서 선택될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따라, 상기 특징들의 값은 특정 바이러스 변이체 또는 이를 포함하는 생물학적 견본에 대한 값을 제공하기 위한 데이타를 처리할 수 있는 기계 판독가능한 저장 매체에 저장된다.
따라서, 또다른 측면에서, 컴퓨터 프로그램 제품은 피험체에 적당한 치료 프로토콜을 측정하기 위한 바이러스 변이체 또는 이를 포함하는 생물학적 샘플의 적당한 유용성을 평가하는데 고려되며(도 15), 상기 제품은
(1) 상기 바이러스제 또는 이를 포함하는 생물학적 샘플과 관련된 둘 이상의 특징들을 위한 입력 코드로서 수신되는 코드(여기서 상기 특징들은
(a) 특정 화합물 또는 면역제에 감소된 감수성에 내성을 제시하는 능력;
(b) 야생형 HBV로부터의 변경된 DNA 폴리머라제;
(c) 야생형 HBV로부터의 변경된 표면 항원; 또는
(d) 환자의 사망률 또는 회복 가능성
에서 선택됨);
(2) 상기 바이러스 변이체 또는 생물학적 샘플에 대한 값에 상응한 합을 제공하기 위한 상기 입력 코드를 추가하는 코드; 및
(3) 코드를 자장하는 컴퓨터 판독가능한 매체
를 포함한다.
관련 측면에서, 컴퓨터는 피험체에서 바이러스 변이체 또는 이를 포함하는 생물학적 샘플의 적당한 유용성을 평가하기 위한 것을 제공하며, 여기서 상기 컴퓨터는
(1) 기계 판독가능한 데이타로 암호화된 데이타 저장 재료를 포함하는 기계 판독가능한 데이타 저장 매체(여기서 상기 기계 판독가능한 데이타는 상기 바이러스 변이체 또는 생물학적 샘플과 관련된 둘 이상의 특징들을 위한 입력 코드를 포함하고, 상기 특징들은
(a) 특정 화합물 또는 면역제에 감소된 감수성에 내성을 제시하는 능력;
(b) 야생형 HBV로부터의 변경된 DNA 폴리머라제;
(c) 야생형 HBV로부터의 변경된 표면 항원; 또는
(d) 환자의 사망률 또는 회복 가능성
에서 선택됨);
(2) 상기 기계 판독가능한 데이타를 처리하기 위한 명령 저장 수행 메모리;
(3) 상기 화합물(들) 값에 상응한 상기 입력 코드의 합을 제공하기 위한 상기 기계 판독가능한 데이타를 처리하기 위한 상기 수행 메모리 및 상기 기계 판독가능한 데이타 저장 매체에 연결된 중앙 처리 장치; 및
(4) 상기 값을 수신하기 위한 상기 중앙 처리 장치에 연결된 출력 하드웨어
를 포함한다.
임의의 일반적이거나 특정한 목적의 컴퓨터 시스템은 본 발명에 의해 고려되고 터미널과 같은 하나 이상의 입/출력 장치 및 메모리 둘다와 전기적으로 연결된 프로세서를 포함한다. 도 15는 일반적으로 적당한 컴퓨터 시스템을 도시한다. 이러한 시스템은, 비제한적인 예로서, 퍼스널 컴퓨터, 웍스스테이션 또는 메인프레임을 포함할 수 있다. 프로세서는 일반적인 목적의 프로세서 또는 마이크로프로세서 또는 RAM 메모리에 위치한 프로그램 수행 특정화된 프로세서일 수 있다. 프로그램은 디스크 또는 사전 프로그램된 ROM 메모리와 같은 저장 장치로부터 RAM에 위치할 수 있다. RAM 메모리는, 일 구체예에서, 데이타 저장 및 프로그램 수행 둘 다에 사용된다. 컴퓨터 시스템은 또한 프로세서 및 메모리가 상이한 물리적 실체에 존재하지만 네트워크에 의해 전기적으로 연결되어 있는 시스템을 포괄한다.
대안적인 구체예에서, 프로그램은, 일 구체예에서, rtS256R/S 및 rtW257G/W, 다른 구체예에서 rtH9D, rtL180M, rtM204V, rtT184S 및 rtN238T를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtQ215S, rtR242K/R, 및 rtW243R/W를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtN118S, rtR120R, rtT184A 및 rtY257H를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T/I, rtT240N/T, rtK241R 및 rtH248N을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtY221H/Y, rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S를 포함하거나, 마지막으로 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V, 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함하고; 추가 구체예에서 sI92T/I, sL175F 및 sI195M, 또 다른 구체예에서 sS207R을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sI110V 및 sP120Q를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sF80S, sI208I/L, sS210K, sF220L/F 및 sY225H/Y를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sF134L/F 및 sL173F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sC76Y 및 sL173F를 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F 및 sI195M을 포함하거나, 또 다른 구체예에서 sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, s210R/S 및 sY225H/Y를 포함하고, 마지막으로 또 다른 구체예에서 sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M 또는 이의 조합물 또는 등가 돌연변이를 포함하는 것에서 선택된 돌연변이에 대해 스크리닝한다.
본 발명은 하기 비제한적인 실시예에 의해 추가 기술된다.
도 1은 표면(S), 코어(C), 폴리머라제(P) 및 X 유전자를 코딩하는 중복 개방 판독 프레임을 도시하는 부분적인 이중 가닥 DNA HBV 게놈을 도시하는 도면이다.
도 2는 ADV의 화학 구조의 도면이다.
도 3은 테노프비르의 화학 구조의 도면이다.
도 4는 환자 A로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역을 코딩하는 HBV 뉴클레오티드 서열의 비교를 도시하는 도면이다.
도 5는 환자 A로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열의 비교를 도시하는 도면이다.
도 6은 환자 A로부터의 샘플에서 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열의 비교를 도시하는 도면이다.
도 7은 환자 B로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역을 코딩하는 HBV 뉴클레오티드 서열의 비료를 도시하는 도면이다.
도 8은 환자 B로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열의 비교를 도시하는 도면이다.
도 9는 환자 B로부터의 샘플에서 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열의 비교를 도시하는 도면이다.
도 10은 또한 환자 C로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 코딩된 촉매 영역을 포함하는 HBV 뉴클레오티드 서열의 도면이다.
도 11은 환자 C로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 추정 아미노산 서열 의 도면이다.
도 12는 환자 C로부터의 샘플에서 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
도 13은 환자 D로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역을 코딩하는 HBV 뉴클레오티드 서열의 도면이다.
도 14는 환자 D로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
도 15는 환자 D로부터의 샘플에서 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
도 16은 환자 E로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역을 코딩하는 HBV 뉴클레오티드 서열의 도면이다.
도 17은 환자 E로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
도 18은 환자 E로부터의 샘플에서 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
도 19는 환자 F로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역을 코딩하는 HBV 뉴클레오티드 서열의 도면이다.
도 20은 환자 F로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열이다.
도 21은 환자 F로부터의 샘플에서 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열의 도 면이다.
도 22는 환자 G로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역을 코딩하는 HBV 뉴클레오티드 서열의 도면이다.
도 23은 환자 G로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
도 24는 환자 G로부터의 샘플에서 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
도 25는 환자 H로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역을 코딩하는 HBV 뉴클레오티드 서열의 도면이다.
도 26은 환자 H로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
도 27은 환자 H로부터의 샘플에서 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
도 28은 환자 I로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역을 코딩하는 HBV 뉴클레오티드 서열의 도면이다.
도 29는 환자 I로부터의 샘플에서 폴리머라제 유전자의 촉매 영역의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
도 30은 환자 I로부터의 샘플에서 엔벨롭 유전자의 추정 아미노산 서열의 도면이다.
실시예
1
HBV의 중복 게놈
HBV의 중복 게놈은 도 1에 도시된다. DNA 폴리머라제 (P)를 코딩하는 유전자는 바이러스 엔벨롭 유전자, Pre-S1 및 Pre-S2에 중복되고, X 및 코어(C) 유전자와 부분적으로 중복된다. HBV 엔벨롭은 소형, 중간형 및 대형 단백질 HBV 표면 항원을 포함한다. 대형 단백질 성분은 HBV 표면 항원 (HBsAg)으로 언급되고 S 유전자 서열에 의해 코딩된다. Pre-S1 및 Pre-S2 유전자 서열은 다른 엔벨롭 성분을 코딩한다.
실시예 2
TFV 및 LMV 하의 환자 및 HBV DNA 분석
환자 A: TFV 및 LMV 치료 동안, 시퀀싱에 의해 독특한 HBV 돌연변이가 검출되었다(표 4). 본 특허는 치료 하에 바이러스학적 도약 동안 rtS256R/S 및 rtW257G/W에서 독특한 돌연변이(표 4, 도 4, 5, 및 6)가 선택되었다. 이러한 변화는 이들이 HBsAg 판독 프레임에서 종결 코돈 후에 존재하기 때문에 중복 판독 프레임 내 HBsAg를 바꾸지 않는다.
환자 B: TFV 및 LMV 치료 동안, 시퀀싱에 의해 독특한 HBV 돌연변이가 검출되었다(표 5 및 도 7, 8, 및 9). HBV DNA 폴리머라제의 rt 영역 내 독특한 변화는 코돈 184 (rtT184S) 및 rtH9D 및 rtN238T에서의 돌연변이와 함께 LMV 내성 비결합과 관련되어 이전에 증명된 rtL180M+rtM204V를 포함한다. rt 내 코돈 184에서의 변화는 종래에 ETV +/- LMV 내성을 언급하였지만(Tenney et al, Antimicrob Agents Chemother 48(9):3498-507, 2004), TFV + LMV 내성 및 치료 동안의 바이러스학적 도약에 대해서는 기록되지 않았다.
TFV 및 LMV 치료 동안 HBsAg 내 변화는 sI92T/I, sL175F 및 sI195M을 포함한다. 마지막 두개의 변화는 각각 rtT184S 및 rtM204V에서의 폴리머라제 내 변화와 상응하다.
환자 C: LMV 및 TFV 치료 동안의 HBV 돌연변이는 표 6 및 도 10, 11, 12에 열거된다. HBV DNA 폴리머라제의 rt 영역 내 독특한 변화는 rtR242K/R, W243R/W 및 rtQ215S를 포함한다. LMV 및 TFV 치료 동안 HBsAg 내 변화는 sS207R을 포함한다.
환자 D: LMV 및 TFV 치료 동안의 HBV 돌연변이는 Table 7 및 도 13, 14, 15에 열거된다. HBV DNA 폴리머라제의 rt 영역 내 독특한 변화는 rtT184A 및 rtY257H를 포함하고 다른 변화는 rtN118S 및 rtR102E를 포함한다.
LMV 및 TFV 치료 동안 HBsAg 내 변화는 sI110V 및 sP120Q를 포함한다.
실시예 3
항바이러스 치료법 하의 환자 및 HBV DNA 분석
뉴클레오시(티)드 유사체를 이용하여 만성 B형 간염 바이러스를 가진 환자의 치료는 항바이러스제에 대해 감소된 감수성과 관련될 수 있는 돌연변이를 코딩하는 HBV 변이체의 선택을 초래할 수 있다.
ADV에 대한 내성은 rtN236T에서 추정 3인산염 결합 지역 내 돌연변이와 관련되어 있다(Angus et al, Gastroenterolog. 125 (2):292-291, 2003). 따라서 ADV 또는 다른 항바이러스 치료에 의해 선택된 상기 영역 내 다른 돌연변이는 ADV 및/또는 다른 뉴클레오시(티)드 치료에 대한 항바이러스 내성에 중요할 수 있다. 중요한 코돈은 상당히 보존된 240, 241, 242 및 243인 239를 포함한다.
rtN236T에서의 돌연변이 이외에, 다른 돌연변이는 내성 및/또는 복제를 증가시킬 수 있다. 일단 그러한 돌연변이는 코돈 221에 존재한다.
환자 E: LMV 치료 동안의 HBV 돌연변이는 표 8 및 도 16, 17, 및 18에 열거된다. HBV DNA 폴리머라제의 rt 영역 내 독특한 변화는 rtT240N/T 및 rtK241R을 포함한다. 다른 중요한 독특한 돌연변이는 rtH216H/P, rtL229M/L, rtI233T를 포함한다.
LMV 치료 동안 HBsAg 내 변화는 sF80S, sI208I/L, sS210K를 포함한다.
환자 F: LMV 치료 동안의 HBV 돌연변이는 표 9 및 도 19, 20, 및 21에 열거된다. HBV DNA 폴리머라제의 rt 영역 내 독특한 변화는 rtR242R/K 및 rtW243G/W를 포함한다. 다른 중요한 독특한 변화는 rtL180M, rtA181T, rtH216H/P 및 rtE218D/E를 포함하고, 모든 다른 변화에 대해서는 표 9에 언급된다.
LMV 치료 동안 "a" 결정자 내 또는 이에 근접한 HBsAg에서의 중요한 변화는 sF134L/F 및 sL173F를 포함한다(모든 다른 변화에 대해서는 표 9에 언급됨).
환자 G: LMV 치료 동안의 HBV 돌연변이는 표 10 및 도 22, 23 및 24에 열거된다. HBV DNA 폴리머라제의 rt 영역 내 독특한 돌연변이는 rtY221H/Y를 포함한다. 다른 중요한 독특한 변화는 rtV214A, rtA181A/V 및 rtN236T를 포함한다. (모든 다른 변화에 대해서는 표 9에 언급됨).
LMV 치료 동안 "a" 결정자 내 또는 이에 근접한 HBsAg에서의 중요한 변화는 sL173F를 포함한다(모든 다른 변화에 대해서는 표 9에 언급됨).
환자 H
환자 H는 이전에 다수의 뉴클레오시드/뉴클레오티드 유사체로 치료되었고 개별적으로 LMV, 이후 ETV, 이후 ADV에 대해 내성이 있었다. 이 환자는 이후 LMV 및 ADV 및 ETV의 조합으로 치료되었고 현재 모든 상기 제제에 내성이 있다. 치료 동안의 HBV 돌연변이는 도 25, 26 및 27에 열거된다.
상기 환자는 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V, 및 rfN236I/D/V 돌연변이의 독특합 조합에서 선택되었다.
이는 rtL180M 및 rtM204V에서의 공지된 LMV 내성 돌연변이, 또한 rtL180M, rtT184G, rtS202I, 및 rtM204V에서의 공지된 ETV 내성 돌연변이를 포함한다. 상기 환자는 종래에 ADV 내성이 보고되지 않았던 rtN236I/D/V의 코돈 236에서의 독특한 돌연변이에서 선택되었다. 모든 이러한 돌연변이는 조합된 ADV, LMV 및 ETV 내성 돌연변이에 중요할 수 있다.
HBsAg 내 변화는 sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F 및 sI195M을 포함한다.
환자 I
환자 I는 이전에 LMV, 이후 ADV로 치료되었다. 상기 환자는 현재 TFV 및 LMV로 치료 중이며 이러한 제제에 감소된 감수성과 관련될 수 있는 돌연변이를 선택하였다. TDF 및 LMV 치료 동안의 HBV 돌연변이는 도 28, 29 및 30에 열거된다.
이는 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S에서의 돌연변이를 포함한다. 특히, rtI233T/I에서의 돌연변이는 TFV 치료 이전에 상기 환자로부터 단리된 HBV 내에서 종래에는 검출되지 않았다.
HBsAg 내 변화는 sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, S210R/S, 및 sY225H/Y를 포함한다.
환자 J
환자 J는 이전에 LMV로 치료되었고 LMV 내성과 관련된 돌연변이가 있는 HBV가 선택되었으며, 이는 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V에서의 폴리머라제 돌연변이, 및 sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M에서의 엔벨롭 돌연변이를 포함한다.
상기 환자는 이후 ADV로 치료되었고 반응하지 않았으며 ETV 이후에도 반응하지 않았다. 이는 상기 환자가 후속 항바이러스 비반응 또는 ADV 후 ETV에 대한 1차 내성에 영향을 줄 수 있는 LMV 치료 동안 돌연변이를 선택할 수 있었음을 시사한다.
특히 rtI253V 및 rtP170H에서의 돌연변이는 ADV 및 ETV에 대한 1차 내성에 중요할 수 있다.
실시예
4
바이러스
마커의
검출
B형 간염 표면 항원 (HBsAg), B형 간염 e 항원(HBeAg), 항 HBe 및 B형 간염 코어 항원(HBcAg), 특이적 IgG 및 IgM은 구입 가능한 면역측정기(Abbott Laboratories, 미국 일리노이주 노스 시카고 소재)을 사용하여 측정되었다. B형 간염 바이러스 DNA 수준은 제조자의 지시에 따라 포획 하이브리드화 분석(Digene Hybrid Capture II, Digene Diagnostics Inc., 메릴렌드주 벨츠빌 소재)을 사용하여 측정되었다. 임상 견본 내 HBV 바이러스혈증의 검출을 위한 제조자 제시 절사값은 0.7x106 카피/㎖ 또는 2.5 pg/㎖였다[Hendricks et al , Am J Clin Pathol 104:537-46, 1995]. HBV DNA 수준은 또한 다른 시판중인 키트, 예컨대 Cobas 증폭 HBV 모니터 키트(Roche)를 사용하여 평가될 수 있다.
실시예
5
HBV
DNA
의 시퀀싱
HBV DNA는 문헌[Aye et al , J. Hepatol . 26:1148-1153, 1997]에 의해 종래에 기술된 바와 같이 혈청 100 ㎕에서 추출되었다. 올리고뉴클레오티드는 호주 아델라이드 소재의 Geneworks사에서 합성되었다. HBV 폴리머라제 유전자의 증폭은 상기 Aye 등(1997)에 의해 기술되었다.
특이적으로 증폭된 산물은 MO BIO Laboratories Inc (캘리포니아주 라 졸라 소재)로부터의 PCR 정제 컬럼을 사용하여 정제되었고 및 Big Dye terminator Cycle sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer, 코네티컷주 세투스 노워크 소재)를 사용하여 바로 시퀀싱되었다. PCR 프라이머는 산물의 내부 영역을 시퀀싱하기 위한 시퀀싱 프라이머로서 OS1 5'- GCC TCA TTT TGT GGG TCA CCA TA-3' (nt 1408-1430) [서열 번호 1], TTA3 5'-AAA TTC GCA GTC CCC AAA-3'(nt 2128-2145) [서열 번호 2], JM 5'-TTG GGG TGG AGC CCT CAG GCT - 3'(nt 1676-1696) [서열 번호 3], TTA4 5'-GAA AAT TGG TAA CAG CGG -3' (nt 2615-2632) [서열 번호 4], OS2 5' TCT CTG ACA TAC TTT CCA AT 3' (nt 2798-2817) [서열 번호 5]를 사용하였다.
실시예
6
아데포비르
디피복실
(
ADV
)
ADV(이전에는 Bis-pom PMEA)는 강력한 HBV 복제 억제제이다. ADV의 구조는 도 2에 도시되고 이의 합성은 문헌[Benzaria et al , J Med Chem . 39:4958-4965, 1996]에 기술된다.
실시예
7
테노프비르
(
TFV
)
TFV(이전에는 Bis-pom PMPA)는 강력한 HBV 복제 억제제이다. 테노프비르의 구조는 도 3에 도시되고 이의 합성은 문헌[Srinivas 및 Fridl및, Antimicrob Agents Chemother. 42(6):1484-1487, 1998]에 기술된다.
당업자는 본원에 기술된 본 발명이 구체적으로 기술된 것 보다 변화 및 변형에 민감할 수 있음을 알 것이다. 본 발명은 모든 그러한 변화 및 변형을 포함하는 것으로 이해된다. 본 발명은 또한 본 명세서에 언급되거나 제시된 모든 단계, 특징, 조성물 및 화합물, 및 임의의 둘 이상의 상기 단계 또는 특징의 조합 중 개별적으로 또는 선택적으로 임의의 것 및 모두를 포함한다.
참고 문헌
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AUSTIN HEALTH
BAYSIDE HEALTH
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TILLMAN, Hans (US ONLY)
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AYRES, Anna (US ONLY)
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ANGUS, Peter (US ONLY)
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gcctcatttt gtgggtcacc ata 23
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> pcr primer
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aaattcgcag tccccaaa 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> pcr primer
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ttggggtgga gccctcaggc t 21
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
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cccaacctcc aatcactcac caacctcctg tcctccaatt tgtcctggtt atcgctggat 420
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ctcatgttgc tgtacaaaac ctacggatgg aaattgcacc tgtattccca tcccatcgtc 660
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<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
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Cys Leu Pro Pro Ser Ser Ala Gly Ser Gln Ser Gln Gly Ser Val Phe
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Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Glu Tyr
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Cys Leu Ser His Leu Val Asn Leu Arg Glu Asp Trp Gly Pro Cys Asp
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Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val
65 70 75 80
Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala Glu
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Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn
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Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala
130 135 140
Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Ile
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Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser
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Cys Ser Arg Gln Leu Tyr Val Ser Leu Met Leu Leu Tyr Lys Thr Tyr
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Gly Trp Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Val Leu Gly Phe Arg
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Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu
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Gln Asp His Ile Val Gln Lys Ile Lys His Cys
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Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser
420 425 430
Ala Ala Phe Tyr His Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu
435 440 445
Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Pro Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser
450 455 460
Ser Thr Ser Arg Asn Ile Asn His Tyr Gln His Gly Thr Met Gln Asp
465 470 475 480
Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu
485 490 495
Tyr Lys Thr Phe Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile
500 505 510
Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu
515 520 525
Met Ala Gln Phe Ser Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe
530 535 540
Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Val Asp Asp Val Val Leu Gly Ala
545 550 555 560
Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu Phe Thr Ala Val Thr Asn Phe
565 570 575
Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Thr Lys Thr Lys Arg Trp
580 585 590
Gly Tyr Ser Leu His Phe Met Gly Tyr Val Ile Gly Ser Trp Gly Thr
595 600 605
Leu Pro Gln Glu His Ile Val His Lys Ile Lys Gln Cys Phe Arg Lys
610 615 620
Leu Pro Ile Asn Arg Pro Ile Asp Trp Lys Val Cys Gln Arg Ile Val
625 630 635 640
Gly Leu Leu Gly Phe Ala Ala Pro Phe Thr Gln Cys Gly Tyr Pro Ala
645 650 655
Leu Met Pro Leu Tyr Ala Cys Ile Gln Ala Lys Gln Ala Phe Thr Phe
660 665 670
Ser Pro Thr Tyr Lys Ala Phe Leu Cys Lys Gln Tyr Leu His Leu Tyr
675 680 685
Pro Val Ala Arg Gln Arg Ser Gly Leu Cys Gln Val Phe Ala Asp Ala
690 695 700
Thr Pro Thr Gly Trp Gly Leu Ala Ile Gly His Gln Arg Met Leu Arg
705 710 715 720
Gly Thr Phe Val Ala Pro Leu Pro Ile His Thr Ala Glu Leu Leu Ala
725 730 735
Ala Cys Phe Ala Arg Ser Arg Ser Gly Ala Asn Ile Ile Gly Thr Asp
740 745 750
Asn Ser Val Val Leu Ser Arg Lys Tyr Thr Ser Phe Pro Trp Leu Leu
755 760 765
Gly Cys Ala Ala Asn Trp Ile Leu Arg Gly Thr Ser Phe Val Tyr Val
770 775 780
Pro Ser Ala Leu Asn Pro Ala Asp Asp Pro Ser Arg Gly Arg Leu Gly
785 790 795 800
Leu Tyr Arg Pro Leu Leu Arg Leu Pro Phe Arg Pro Thr Thr Gly Arg
805 810 815
Thr Ser Leu Tyr Ala Val Ser Pro Ser Val Pro Ser His Leu Pro Asp
820 825 830
Arg Val His Phe Ala Ser Pro Leu His Val Ala Trp Lys Pro Pro
835 840 845
<210> 11
<211> 227
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 11
Met Glu Ser Thr Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln
1 5 10 15
Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu
20 25 30
Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Ala Pro Thr Cys
35 40 45
Pro Gly Gln Asn Leu Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser
50 55 60
Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe
65 70 75 80
Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Thr Ile Phe Leu Leu
85 90 95
Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Leu Pro
100 105 110
Gly Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro
115 120 125
Ala Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys Cys Thr Lys Pro Ser
130 135 140
Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Ala
145 150 155 160
Arg Phe Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Phe
165 170 175
Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp
180 185 190
Leu Ser Val Met Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn
195 200 205
Ile Leu Asn Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp
210 215 220
Val Tyr Ile
225
<210> 12
<211> 984
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 12
tccgcctcct gcctctacca atcgacagtc aggacggcag cctaccccgc tgtctccacc 60
tctgagaatc actcatcctc aggccatgca gtggaactcc acaaccttcc accaaactct 120
gcaagatccc aragtgagag gcctgkmtct ccctgctggt ggctccagtt caggaacagt 180
aaaccctgtt ccgactactg cctctcccat atcgwcaatc ttctcgagga ttggggaccc 240
tgcgctgaac atggagaaca tcacatcagg attcctagga cccctgctcg tgttacaggc 300
ggggtttttc ttgttgacaa gaatcctcac aataccgcag agtctagact cgtggtggac 360
ttctctcaat tttctagggg gaactaccgt gtgtcttggc caaaattcgc agtccccaac 420
ctccaatcac tcaccaacct cctgtcctcc aacttgtcct ggttatcgct ggatgtgtct 480
gcggcgtttt atcatcttcc tcttcatcct gctgctatgc ctcatcttct tgttggttct 540
tctggactat caaggtatgt tgcccgtttg tcctctaatt ccaggatcat caaccaccag 600
cacgggaccc tgcagaacct gcacgactcc tgctcaagga acctctatgt atccctcctg 660
ttgctgtaca aaaccttcgg atggaaactg cacctgtatt cccatcccat catcctgggc 720
tttcggaaaa ttcctatggg agtgggcctc agcccgtttc tcttggctca gtttactagt 780
gccatttgtt cagtggttcg tagggctttc ccccattgtt tggctttcag ttatatggat 840
gatgtggtat tgggggccaa gtctgtatcg catcttgagt ccctttttac cgctgttacc 900
aattttcttt tgtctttggg tatacattta aaccctaaca aaacaaaaar awggggttat 960
tctctaaatt tcatgggcta tgtc 984
<210> 13
<211> 332
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 13
Ser Ala Ser Cys Leu Tyr Gln Ser Thr Val Arg Thr Ala Ala Tyr Pro
1 5 10 15
Ala Val Ser Thr Ser Glu Asn His Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu
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Leu His Asn Leu Pro Pro Asn Ser Ala Arg Ser Gln Ser Glu Arg Pro
35 40 45
Gly Val Ser Pro Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys
50 55 60
Ser Asp Tyr Cys Leu Ser His Ile Asp Val Asn Leu Leu Glu Asp Trp
65 70 75 80
Gly Pro Cys Ala Glu His Gly Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr
85 90 95
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Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg
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Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro
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Ser Ser Asn Ser Arg Ile Ile Asn His Gln His Gly Thr Leu Gln Asn
195 200 205
Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu
210 215 220
Tyr Lys Thr Phe Gly Trp Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile
225 230 235 240
Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu
245 250 255
Leu Ala Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe
260 265 270
Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala
275 280 285
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Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Thr Lys Lys Arg
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Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val
325 330
<210> 14
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<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
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Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu
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245 250 255
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Leu Ser Pro Ile Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp
275 280 285
Gly Pro Ser Leu Tyr Arg Ile Leu Ser Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro
290 295 300
Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
305 310
<210> 15
<211> 580
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 15
ttgtcctggt tatcgctgga tgtgtctgcg gcgttttatc atcttcctct tcatcctgct 60
gctatgcctc atcttcttgt tggttcttct ggactatcaa ggtatgttgc ccgtctgtcc 120
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<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 16
Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro
1 5 10 15
Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu
20 25 30
Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Ser Ser Glu Ile Phe Asn His
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Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly
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Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met
115 120 125
Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Leu Glu Ser Leu
130 135 140
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Pro Asn Lys Thr Lys Arg Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr
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Val Ile Gly Cys His Gly Ser Leu Pro Gln Asp His Ile Ile Gln Lys
180 185 190
Ile
<210> 17
<211> 158
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 17
Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu
1 5 10 15
Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr
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Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Val Pro Arg Ser Ser Thr Thr
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Ser Ala Gly Gln Cys Arg Thr Cys Thr Thr Thr Ala Gln Gly Thr Ser
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65 70 75 80
Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu Trp Glu
85 90 95
Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val
100 105 110
Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp
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Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Tyr Asn Ile Leu Ser Pro Phe
130 135 140
Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
145 150 155
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<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 18
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gggct 965
<210> 19
<211> 326
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 19
Tyr Gln Ser Thr Val Arg Glu Ala Ala Tyr Pro Ala Val Ser Thr Phe
1 5 10 15
Glu Lys His Ser Ser Ser Gly His Ala Val Glu Leu His Asn Phe Pro
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Pro Asn Ser Thr Arg Ser Gln Gly Glu Arg Pro Val Phe Pro Cys Trp
35 40 45
Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Lys Pro Cys Ser Asp Tyr Cys Leu Ser
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65 70 75 80
Glu His His Ile Arg Ile Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly
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Val Phe Leu Val Asp Lys Asn Pro His Asn Thr Ala Glu Ser Arg Leu
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Val Val Asp Phe Ser Gln Phe Ser Arg Gly Asn His Arg Val Ser Trp
115 120 125
Pro Lys Phe Ala Val Pro Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser
130 135 140
Ser Asp Leu Ser Trp Leu Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His
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Ile Pro Leu His Pro Ala Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser
165 170 175
Gly Leu Ser Arg Tyr Val Ala Arg Leu Ser Ser Asn Ser Arg Ile Val
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Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu Leu Leu Leu Tyr Gln Thr Phe Gly Arg
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Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile
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Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Leu Ala Gln Phe Thr Ser
245 250 255
Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe
260 265 270
Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys Ser Val Gln His Pro
275 280 285
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Gly Thr Ile His Leu Asn Pro Asn Lys Asn Thr Arg Arg Trp Gly Tyr
305 310 315 320
Ser Leu Asn Phe Met Gly
325
<210> 20
<211> 307
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 20
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Leu Ser Pro Pro Leu
1 5 10 15
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20 25 30
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Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Val Pro Thr Thr Ala Ser Pro
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65 70 75 80
Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly
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Phe Phe Leu Leu Thr Lys Ile Leu Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser
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Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu Gly Gly Thr Thr Val Cys Leu Gly
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Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro
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Pro Thr Cys Pro Gly Tyr Arg Trp Met Cys Leu Arg Arg Ser Ile Ile
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Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu
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Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Ser
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Thr Thr Ser Ala Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Thr Ala Gln Gly
195 200 205
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Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp Ala Phe Gly Lys Phe Leu
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Trp Glu Trp Ala Ser Ala Arg Phe Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro
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Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val
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Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly Pro Ser Leu Phe Ser Ile Leu Val
275 280 285
Lys Pro Phe Leu Pro Leu Leu Pro Ile Phe Leu Phe Cys Leu Trp Val
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His Tyr Ile
305
<210> 21
<211> 938
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 21
ctccaccacg ttccaccaaa ctcttcaaga tcccagagtc agggccctgt actttcctgc 60
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tggccaaaat tcgcagtccc aaatctccag tcactcacca acctgttgtc ctccaatttg 360
tcctggttat cgctggatgt gtctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct 420
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tattcccatc ccatcatctt gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg 660
tttctcatgg ttcagtttac tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac 720
tgtctggctt tcagttatat ggatgatgtg gttttggggg ccaagtctgt acaacmtctt 780
gastcccttt atgccgctgt taccaatttt cttctgtctt tgggtataca tttaaaccct 840
gacaaaacaa aaarakgggg atattccctc aacttcatgg gatatgtawt tgggagttgg 900
ggcacattgc cacaggaaca tattgtmcaa aaaatcaa 938
<210> 22
<211> 318
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 22
Leu His His Val Pro Pro Asn Ser Ser Arg Ser Gln Ser Gln Gly Pro
1 5 10 15
Val Leu Ser Cys Trp Trp Leu Gln Phe Arg Asn Ser Glu Pro Cys Ser
20 25 30
Glu Tyr Cys Leu Cys His Ile Val Asn Leu Ile Glu Asp Trp Gly Pro
35 40 45
Cys Thr Glu His Gly Glu His Arg Ile Arg Thr Pro Arg Thr Pro Ala
50 55 60
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65 70 75 80
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165 170 175
Asn Ala Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Thr Ser Leu Met Leu Leu Tyr
180 185 190
Lys Thr Tyr Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His Pro Ile Ile Leu
195 200 205
Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser Pro Phe Leu Met
210 215 220
Val Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val Arg Arg Ala Phe Pro
225 230 235 240
His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala Lys
245 250 255
Ser Val Gln His Pro Leu Asp Glu Ser Leu Tyr Ala Ala Val Thr Asn
260 265 270
Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Asn Pro Asp Lys Thr Lys Lys
275 280 285
Arg Gly Trp Gly Tyr Ser Leu Asn Phe Met Gly Tyr Val Ile Phe Gly
290 295 300
Ser Trp Gly Thr Leu Pro Gln Glu His Ile Val Gln Lys Ile
305 310 315
<210> 23
<211> 280
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 23
Ser Thr Thr Phe His Gln Thr Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Ala Leu
1 5 10 15
Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Ser Pro Ala Gln
20 25 30
Asn Thr Val Ser Ala Ile Ser Ser Ile Leu Ser Lys Thr Gly Asp Pro
35 40 45
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50 55 60
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65 70 75 80
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130 135 140
Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val Cys Pro Leu
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser Ser Trp
195 200 205
Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe Ser Trp
210 215 220
Phe Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu Ser Pro
225 230 235 240
Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp Phe Trp Gly Pro Ser
245 250 255
Leu Tyr Asn Ile Leu Leu Thr Ser Pro Phe Met Pro Leu Leu Pro Ile
260 265 270
Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
275 280
<210> 24
<211> 762
<212> DNA
<213> Hepatitis B virus
<400> 24
cagcgagccc tgctcagaat actgtctctg ccatatcgtc aatcttatcg aagactgggg 60
accctgtacc gaacatggag aacatcgcat caggactcct aggacccctg ctcgtgttac 120
aggcggggtt tttcttgttg acaaaaatcc tcacaatacc acagagtcta gactcgtggt 180
ggacttctct caattttcta ggggggacac ccgtgtgtct tggccaaaat tcgcagtccc 240
aaatctccag tcactcacca acttgttgtc ctccaacttg tcctggttat cgctggatgt 300
atctgcggcg ttttatcatc ttcctctgca tcctgctgct atgcctcatc ttcttgttgg 360
ttcttctgga ctatcaaggt atgttgcccg tatgtcctct aattccagga tcatcaacaa 420
ccagcaccgg accatgcaaa acctgcacga ctcctgctca aggaacctct atgtttccct 480
catgttgctg tacaaaacct acggacggaa actgcacctg tattcccatc ccatcatctt 540
gggctttcgc aaaataccta tgggagtggg cctcagtccg tttctcttgg ytcagtttac 600
tagtgccatt tgttcagtgg ttcgtagggc tttcccccac tgtctggctt tcagttatat 660
ggatgatgtg gttttggggg ccaagtctgc acaacatctt gagtccctty atgccgctgt 720
taccaatttt cttttgtctt tgggtataca tttaacccct ca 762
<210> 25
<211> 255
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 25
Ser Glu Pro Cys Ser Glu Tyr Cys Leu Cys His Ile Val Asn Leu Ile
1 5 10 15
Glu Asp Trp Gly Pro Cys Thr Glu His Gly Glu His Arg Ile Arg Thr
20 25 30
Pro Arg Thr Pro Ala Arg Val Thr Gly Gly Val Phe Leu Val Asp Lys
35 40 45
Asn Pro His Asn Thr Thr Glu Ser Arg Leu Val Val Asp Phe Ser Gln
50 55 60
Phe Ser Arg Gly Asp Thr Arg Val Ser Trp Pro Lys Phe Ala Val Pro
65 70 75 80
Asn Leu Gln Ser Leu Thr Asn Leu Leu Ser Ser Asn Leu Ser Trp Leu
85 90 95
Ser Leu Asp Val Ser Ala Ala Phe Tyr His Leu Pro Leu His Pro Ala
100 105 110
Ala Met Pro His Leu Leu Val Gly Ser Ser Gly Leu Ser Arg Tyr Val
115 120 125
Ala Arg Met Ser Ser Asn Ser Arg Ile Ile Asn Asn Gln His Arg Thr
130 135 140
Met Gln Asn Leu His Asp Ser Cys Ser Arg Asn Leu Tyr Val Ser Leu
145 150 155 160
Met Leu Leu Tyr Lys Thr Tyr Gly Arg Lys Leu His Leu Tyr Ser His
165 170 175
Pro Ile Ile Leu Gly Phe Arg Lys Ile Pro Met Gly Val Gly Leu Ser
180 185 190
Pro Phe Leu Leu Ala Val Gln Phe Thr Ser Ala Ile Cys Ser Val Val
195 200 205
Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser Tyr Met Asp Asp Val
210 215 220
Val Leu Gly Ala Lys Ser Ala Gln His Leu Glu Ser Leu His Tyr Ala
225 230 235 240
Ala Val Thr Asn Phe Leu Leu Ser Leu Gly Ile His Leu Thr Pro
245 250 255
<210> 26
<211> 251
<212> PRT
<213> Hepatitis B virus
<400> 26
Ala Ser Pro Ala Gln Asn Thr Val Ser Ala Ile Ser Ser Ile Leu Ser
1 5 10 15
Lys Thr Gly Asp Pro Val Pro Asn Met Glu Asn Ile Ala Ser Gly Leu
20 25 30
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50 55 60
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65 70 75 80
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85 90 95
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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165 170 175
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180 185 190
Arg Phe Ser Trp Leu Phe Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe
195 200 205
Val Gly Leu Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Val Ile Trp Met Met Trp
210 215 220
Phe Trp Gly Pro Ser Leu His Asn Ile Leu Ser Pro Phe Met Pro Leu
225 230 235 240
Leu Pro Ile Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile
245 250
Claims (37)
- DNA 폴리머라제를 코딩하는 유전자 내에서 상기 DNA 폴리머라제에 대해 하나 이상의 아미노산 부가, 치환 및/또는 결실을 초래하는 뉴클레오티드 돌연변이를 포함하는 단리된 B형 간염 바이러스(HBV) 변이체로서, 여기서 돌연변이는(i) 코돈 239, 240, 241, 242 및/또는 243에서의 돌연변이;(ii) N236I/D/V 치환을 초래하는 돌연변이;(iii) S246H/P/Y/S 치환을 초래하는 돌연변이;(iv) P170H 치환을 초래하는 돌연변이;(v) I253V 치환을 초래하는 돌연변이;(vi) rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이(co-mutation);(vii) rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이; 및(viii) rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이로 이루어진 군에서 선택되고, HBV 변이체는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대해 감소된 감수성을 나타내는 HBV 변이체.
- 제1항에 있어서, 변이체는 ADV, LMV, TFV, ETV, FTC 및 LdT로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대해 감소된 감수성을 나타내는 HBV 변이체.
- 제1항에 있어서, 변이체는 코돈 239, 240, 241, 242 및/또는 243에서의 돌연변이를 포함하는 HBV 변이체.
- 제2항에 있어서, 변이체는 N236I/D/V 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 HBV 변이체.
- 제2항에 있어서, 변이체는 S246H/P/Y/S 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 HBV 변이체.
- 제2항에 있어서, 변이체는 P170H 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 HBV 변이체.
- 제2항에 있어서, 변이체는 I253V 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 HBV 변이체.
- 제2항에 있어서, 변이체는 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이를 포함하는 HBV 변이체.
- 제2항에 있어서, 변이체는 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이를 포함하는 HBV 변이체.
- 제2항에 있어서, 변이체는 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이를 포함하는 HBV 변이체.
- HBV 변이체가 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대한 감소된 감수성을 나타낼 가능성을 결정하는 방법으로서,상기 HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA를 단리시키는 단계; 및(i) 코돈 239, 240, 241, 242 및/또는 243에서의 돌연변이;(ii) N236I/D/V 치환을 초래하는 돌연변이;(iii) S246H/P/Y/S 치환을 초래하는 돌연변이;(iv) P170H 치환을 초래하는 돌연변이;(v) I253V 치환을 초래하는 돌연변이;(vi) rtR242K/R 및 rtW243G/W 치환의 부속돌연변이;(vii) rtS256R/S 및 rtW257G/W 치환의 부속돌연변이;(viii) rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이;(vii) rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이; 및(ix) rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이;(x) rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이로 이루어진 군에서 선택된, HBV DNA 폴리머라제를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내에서 상기 DNA 폴리머라제의 rt의 아미노산 치환을 초래하는 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하고, 그러한 돌연변이의 존재는 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대한 내성의 표시인 방법.
- 제11항에 있어서, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체는 ADV, LMV, TFV, ETV, FTC 및 LdT로 이루어진 군에서 선택된 것인 방법.
- 제12항에 있어서, 변이체는 코돈 239, 240, 241, 242 및/또는 243에서의 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 변이체는 N236I/D/V 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 변이체는 S246H/P/Y/S 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 변이체는 P170H 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 변이체는 I253V 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 변이체는 rtR242K/R 및 rtW243G/W 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 변이체는 rtS256R/S 및 rtW257G/W 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 변이체는 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 변이체는 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, 변이체는 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- 하나 이상의 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체 또는 면역학적 시약에 대한 내성 또는 감소된 감수성을 나타내는 HBV 변이체에 대해 억제 활성을 나타내는 제제를 검출하는 방법으로서,플라스미드 벡터에 포함된 상기 HBV로부터의 복제 가능(competent)-유효량의 게놈을 포함하는 유전자 작제물을 생성한 후 상기 작제물로 세포를 형질감염시키는 단계;상기 세포를, 형질감염 전, 형질감염 동안 및/또는 형질감염 후에 테스트할 제제와 접촉시키는 단계;상기 제제에 대해 내성인 경우, HBV가 유전자 서열을 복제, 발현하고/하거나, 바이러스 또는 바이러스형 입자를 조립하고/하거나 방출하는데 충분한 시간 및 조건 하에 상기 세포를 배양하는 단계; 및세포, 세포 분해물 또는 배양 상등액에 바이러스 검출 수단 또는 바이러스 성분 검출 수단을 적용하여 상기 제제의 존재 하에 바이러스가 유전 물질을 복제, 발현하고/하거나 바이러스가 조립되고/되거나 방출되었는지를 측정하는 단계를 포함하는 방법.
- 제23항에 있어서, HBV 변이체는 ADV, LMV, TFV, ETV, FTC 및 LdT로 이루어진 군에서 선택된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오시드 유사체에 대한 감소된 감수성을 나타내는 방법.
- 제24항에 있어서, 변이체는 코돈 239, 240, 241, 242 및/또는 243에서의 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 변이체는 N236I/D/V 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 변이체는 S246H/P/Y/S 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 변이체는 P170H 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 변이체는 I253V 치환을 초래하는 돌연변이를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 변이체는 rtR242K/R 및 rtW243G/W 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 변이체는 rtS256R/S 및 rtW257G/W 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 변이체는 rtL42L/V, rtS78T, rtS85T, rtT128N, rtL180M, rtT184G, rtS202I, rtM204V 및 rtN236I/D/V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 변이체는 rtF61L, rtS78T, rtV84M/V, rtV142E, rtQ149Q/R, rtM204I/M, rtI233T/I 및 rtS246H/P/Y/S로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 변이체는 rtI29L, rtY50S, rtP170H, rtL180M, rtM204V 및 rtI253V로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, 변이체는 rtL180M, rtA181V, rtM207V, rtH216H/P, rtE218D/E, rtH238D, rtR242K/R, rtW243G/W 및 rtI254I/F로 이루어진 군에서 선택된 둘 이상의 치환의 부속돌연변이를 포함하는 방법.
- sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F, sI195M, sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, s210R/S, sY225H/Y, sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M으로 이루어진 군에서 선택된 표면 항원을 포함하는 단리된 HBV 변이체.
- HBV 변이체가 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 유사체에 대한 감소된 감수성을 나타낼 가능성을 결정하는 방법으로서,상기 HBV로부터 DNA 또는 상응한 mRNA를 단리시키는 단계; 및sD33D/E, sC69 Stop, sC76 Stop, sR79H, sP120T, sL176V, sV194F, sI195M, sC69Stop, sM75I/M, sY134N, sK141K/E, sP178P/L, sW196stop/W, s210R/S, sY225H/Y, sL20F, sI42L, sV144D, sL162I 및 sI195M으로 이루어진 군에서 선택된 돌연변이를 초래하는 HBV 표면 항원을 코딩하는 뉴클레오티드 서열 내 돌연변이에 대해 스크리닝하는 단계를 포함하는 방법.
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