CN116949223A - 一种乙型肝炎病毒用药指导系统及其应用 - Google Patents

一种乙型肝炎病毒用药指导系统及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种乙型肝炎病毒用药指导系统及其应用，并提供了一种引物组，含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物。并基于上述引物组提供了一种乙型肝炎病毒用药指导，所述乙型肝炎病毒用药指导系统以利用引物组扩增待测样品并结合Sanger测序得到的ab1文件作为输入数据，即可实现氨基酸层面的突变分析，不仅能够基于氨基酸位点的突变分析指导乙肝病毒感染者的核苷酸药物用药，而且还能够发现新的氨基酸突变位点；同时该乙型肝炎病毒耐药突变位点检测模型能够准确高效地对大批量数据进行处理，相较于传统借助比对软件逐一判读，不仅显著提高了判读准确性，还大大缩短了时间。

Description

一种乙型肝炎病毒用药指导系统及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术检测领域，具体地，涉及一种乙型肝炎病毒用药指导系统及其应用。
背景技术
乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）所引起的，在全球广泛传播的传染病。HBV属于双链环状DNA病毒，基因组长约3.2 KB，包括正链和负链；正链没有开放阅读框，负链存在4个开放阅读框（分为S区、C区、P区和X区），其中P区最长，约占乙型肝炎病毒基因组全长的75%以上，编码病毒体DNA多聚酶。
近几十年来，针对HBV感染的治疗药物主要依赖于干扰素以及核苷类药物。核苷类药物主要包括拉米夫定（LAM）、阿德福韦酯（ADV）、恩替卡韦（ETV）、替比夫定（LDT）、替诺福韦酯（TDF）和恩曲他滨（FTC）等，这些核苷类药物的作用靶点均位于HBV-DNA的P区编码聚合酶/逆转录酶的RT基因区域上。因此乙型肝炎病毒RT基因区域上的突变常常会导致其产生耐药性，当前已知替诺福韦酯（TDF）耐药相关突变为RT基因区域的181、194和236位点；替比夫定（LDT）耐药相关突变为RT基因区域的204位点；拉米夫定（LAM）耐药相关突变为RT基因区域的173、180、204、207和213位点；恩曲他滨（FTC）耐药相关突变为RT基因区域的173、180和204位点；阿德福韦酯（ADV）耐药相关突变为RT基因区域的181、214、215、236、237和238位点；恩替卡韦（ETV）耐药相关突变为RT基因区域的169、173、180、184、202、204和250位点。
目前，针对这些突变位点开发的检测HBV耐药的技术主要包括实时荧光PCR技术（qPCR）、PCR-限制性酶切片段多态性片段分析技术（PCR-RFLP）、基因芯片技术、线性探针杂交技术、Sanger测序技术等。其中Sanger测序技术因其具有结果直观可靠、能够分析未知DNA序列和突变位点、单向反应的读序能力较长且准确度高等特点，已经成为HBV耐药基因突变位点检测的金标准。
利用Sanger测序进行检测得到的结果中包含一个储存序列信息的seq文件和一个储存测序峰图的ab1文件，这两个文件需要利用特定的生物软件如BioEdit、MEGA、DNAMAN进行处理，对突变位点进行逐一判读；而HBV耐药位点较为分散，且密码子本身具备简并性，这也导致一个碱基的突变可能不会改变翻译后的氨基酸序列，在判读过程中需要将DNA序列翻译成氨基酸序列或者将DNA序列对照密码子表进行判读，同时同一位点在测序的过程中会测到不同的碱基，导致形成重叠峰，进一步使判读过程更加费时费力，容易出现错误，且由于需要人工判读，因此难以处理大批量样本。
基于上述问题，目前急需一种既能够实现精准检测HBV耐药突变位点，又能同时处理大批量样本，同时还具备优异精确度的检测技术。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术的上述不足，提供一种乙型肝炎病毒用药指导系统及其应用。
本发明的第一目的是提供一种引物组。
本发明的第二目的是提供上述引物组在制备用于指导乙型肝炎病毒感染者用药的产品中的应用。
本发明的第三目的是提供一种乙型肝炎病毒用药指导系统。
本发明的第四目的是提供上述乙型肝炎病毒用药指导系统在制备用于指导乙型肝炎病毒感染者用药的产品中的应用。
本发明的第五目的是提供上述乙型肝炎病毒用药指导系统在制备筛选乙型肝炎病毒耐药突变位点的产品中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
一种引物组，所述引物组含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物。
正向引物（SEQ ID NO：1）：5’-AAACTGCACCTGTATTCCCA-3’；
反向引物（SEQ ID NO：2）：5’-GAGGAGACACAAAGGTTCCA-3’。
本发明还请求保护上述引物组在制备用于指导乙型肝炎病毒感染者用药的产品中的应用。
优选地，所述指导乙型肝炎病毒感染者用药为指导乙型肝炎病毒感染者用拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯和/或恩曲他滨。
一种乙型肝炎病毒用药指导系统，包括引物模块、测序模块和分析模块；
引物模块包含上述引物组；
测序模块利用引物模块中的引物组对待测样品扩增得到扩增引物，并利用核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示反向引物作为测序引物并进行Sanger测序，得到ab1文件；
分析模块包括数据输入组件、数据预处理组件和突变位点识别组件；
其中，数据输入组件将测序模块得到的ab1文件作为输入数据输入分析模块；
数据预处理组件用于提取数据输入组件输入的ab1文件中的DNA序列并进行反向互补得到互补DNA序列，以互补DNA序列5’端第一个“ATC”为翻译起始位点翻译氨基酸序列，取1～102位氨基酸序列作为突变分析氨基酸序列；
突变位点识别组件用于将数据预处理组件得到的突变分析氨基酸序列的102个氨基酸位点依次与标准氨基酸序列进行比对得到比对结果BXO，并基于比对结果BXO得到位点突变结果；标准氨基酸序列为登录号QIN91274.1的氨基酸序列的52～153位氨基酸序列；
所述比对结果BXO中X取自1～102中的任一整数，B代表标准氨基酸序列的第X个氨基酸，O代表突变分析氨基酸序列的第X个氨基酸；
B与O相同时，突变分析氨基酸序列上的位点未发生氨基酸突变，位点突变结果为“位点未突变”，如“B未突变”；
B与O不同时，突变分析氨基酸序列上的位点发生氨基酸突变，位点突变结果为“位点→突变位点+突变”，如“B→O突变”。
优选地，测序模块中所述待测样品为乙型肝炎病毒感染者的血液样品。
优选地，还包括判断模块；
所述判断模块对上述乙型肝炎病毒用药指导系统中的突变位点识别组件得到的比对结果BXO进行筛选，保留X=1、8、12、19、20、23、33、41、43、46、52、53、54、75、76、77或89的结果，并筛选得到指导用药突变结果BUO，其中U=X+161。
更优选地，还包括指导用药模块；
所述指导用药模块根据判断模块得到的指导用药突变结果BUO，得到耐药信息；
具体为：指导用药突变结果BUO为V173L、L180M、M204V、M204I、M204S、V207I、V207IL、V207IG或S213T中的一个或几个，拉米夫定耐药；
指导用药突变结果BUO为A181T、A181V、V214A、Q215S、N236T、P237H、N238T、N238D、H238T或H238D中的一个或几个，阿德福韦酯耐药；
指导用药突变结果BUO为I169T、V173L、L180M、T184A、T184G、T184S、T184I、S202G、S202I、M204V、M204I、M204S或M250V中的一个或几个，恩替卡韦耐药；
指导用药突变结果BUO为M204V、M204I或M204S中的一个或几个，替比夫定耐药；
指导用药突变结果BUO为A181T、A181V、A194T或N236T中的一个或几个，替诺福韦酯耐药；
指导用药突变结果BUO为V173L、L180M、M204V、M204I或M204S中的一个或几个，恩曲他滨耐药。
进一步优选地，还包括结果输出模块；所述结果输出模块将突变位点识别组件得到的位点突变结果和/或判断模块得到的指导用药突变结果输出。
本发明还请求保护上述任一所述的乙型肝炎病毒用药指导系统在制备用于指导乙型肝炎病毒感染者用药的产品中的应用。
优选地，所述指导乙型肝炎病毒感染者用药为指导乙型肝炎病毒感染者用拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯和/或恩曲他滨。
本发明还请求保护上述任一所述的乙型肝炎病毒用药指导系统在制备筛选乙型肝炎病毒耐药突变位点的产品中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明提供了一种引物组，所述引物组含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物。并基于上述引物组提供了一种乙型肝炎病毒用药指导，所述乙型肝炎病毒用药指导系统以利用引物组扩增待测样品并进行Sanger测序得到的ab1文件作为输入数据，即可实现氨基酸层面的突变分析，不仅能够基于氨基酸位点的突变分析指导乙肝病毒感染者的核苷酸药物用药，而且还能够发现新的氨基酸突变位点；同时该乙型肝炎病毒耐药突变位点检测模型能够准确高效地对大批量数据进行处理，相较于传统借助比对软件逐一判读，不仅显著提高了判读准确性，还大大缩短了时间。
附图说明
图1为实施例1中两对引物组的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显影图；
图2为实施例1中PCR扩增产物1的测序峰图；
图3为实施例2所述乙型肝炎病毒用药指导系统的模型图；
图4为实施例3中9名乙型肝炎病毒感染者PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显影图；
图5为测试例1中9名乙型肝炎病毒感染者各个耐药突变位点的测序峰图。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 乙型肝炎病毒特异性引物的筛选
1、实验方法
（1）引物设计
根据常见病毒分型网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage）中的乙型肝炎病毒基因组序列，在HBV-RT基因的保守区域设计如下两组引物：
引物组1（扩增产物的序列长度为670 bp）：
正向引物（SEQ ID NO：1）：5’-AAACTGCACCTGTATTCCCA-3’；
反向引物（SEQ ID NO：2）：5’-GAGGAGACACAAAGGTTCCA-3’。
引物组2（扩增产物的序列长度为1170 bp）：
正向引物1（SEQ ID NO：3）：5’-CGTGTTACAGGCGGGGTTTTTCTT-3’；
反向引物1（SEQ ID NO：4）：5’-ATACTTGCGGGAGAGCACGACAGAA-3’。
（2）PCR扩增及电泳鉴定
S1.将20 μL的QIAGEN Protease、200 μL的乙型肝炎病毒感染者血清样品和200 μL的Buffer AL置于1.5 mL离心管中，震荡离心充分混匀，接着置于56℃金属浴中孵育10min，孵育结束后瞬离，加入200 μL无水乙醇，充分混匀后转移至QIAamp Mini spin column离心柱中，以6000×g，8000rpm的条件离心1 min，收集离心柱并加入500 μL的Buffer AW1，在6000×g，8000rpm的条件下离心1 min，收集离心柱再加入500 μL的Buffer AW2，在6000×g，8000rpm的条件下离心1 min，收集离心柱转移至新的收集管中，在20000×g，14000rpm的条件下离心3 min，收集离心柱并加入40 μL的Buffer AE，室温静置1 min后，在6000×g，8000rpm的条件下离心1 min，收集液体即为乙型肝炎病毒感染者血清DNA；
S2.以步骤S1得到的乙型肝炎病毒感染者血清DNA作为模板DNA，使用引物组1和引物组2分别进行PCR扩增，得到PCR扩增产物1和PCR扩增产物2；
PCR扩增反应体系为：5 μL的10×PCR Buffer、2.5 μL的正向引物（SEQ ID NO：1，10μM）、2.5 μL的反向引物（SEQ ID NO：2，10μM）、1 μL的dNTPs Mix（10 mM）、33.75 μL的蒸馏水、0.25 μL的DNA聚合酶（5U/μL）和5 μL的模板DNA；
PCR扩增程序为：95℃预变性15 min；98℃，30 s，58℃，1 min，72℃，1 min，45个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；
PCR扩增得到PCR扩增产物1；将PCR扩增反应体系中的正向引物（SEQ ID NO：1）和反向引物（SEQ ID NO：2）替换成正向引物1（SEQ ID NO：3）和反向引物1（SEQ ID NO：4），扩增得到PCR扩增产物2；
S3.PCR扩增产物1和PCR扩增产物2分别通过2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行显影。
（3）PCR扩增产物测序
S11.以步骤（2）S3中能够出现条带的PCR扩增产物作为模板，以核苷酸序列如SEQID NO：2所示的反向引物作为测序引物，进行PCR扩增，得到测序PCR产物；
测序扩增体系为：1.75 μL的5×BigDye Sequencing Buffer、0.5 μL的BigDye3.1 Ready Reaction Mix、1 μL的反向引物（SEQ ID NO：2，3.2 μM），5.75 μL的蒸馏水、1 μL的PCR扩增产物（10ng/μL）；
测序扩增程序为：96℃预变性1 min；96℃，10 s，50℃，5 s，60℃，4 min，25个循环；4℃保存；
S12.将步骤S11得到的测序PCR产物、1 μL的EDTA（pH=8.0，125 mM）、1 μL的NaAc（pH=5.2，3M）和20 μL无水乙醇在PCR管中充分混合，在-20℃冰箱中静置5 min，接着在3000rfc，4℃的条件下离心15 min，将PCR管倒扣于吸水纸上，瞬离8～10 s后收集沉淀，与35 μL的70%乙醇震荡混匀，在3000 rfc，4℃的条件下离心15 min，将PCR管倒扣于吸水纸上，瞬离8～10 s后收集沉淀，待附着于沉淀表面的乙醇会发后，加入10 μL的Hi-Di甲酰胺，混合均匀后转入0.2 mL的96孔PCR板底部，短暂离心后将96孔PCR板转移至基因分析仪（AppliedBiosystems，3500xl）中测序，得到ab1文件；
S13.将步骤S12得到的ab1文件利用BioEdit软件进行可视化，得到ab1文件测序峰图。
2、实验结果
引物组1扩增得到的PCR扩增产物1和引物组2扩增得到的PCR扩增产物2的琼脂糖凝胶电泳显影结果如图1所示，结果显示：引物组1能够扩增出目的条带，引物组2无法扩增出目的条带。
PCR扩增产物1得到的ab1文件的可视化结果如图2所示，结果显示：ab1文件测序峰图正常，序列正确，没有出现杂峰，且覆盖主要的突变位点（I169T→M250V）。
因此，引物组1，即核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQID NO：2所示的反向引物能够作为扩增引物有效扩增RT基因区域。
实施例2 一种乙型肝炎病毒用药指导系统
一种乙型肝炎病毒用药指导系统，包括引物模块、测序模块、分析模块、判断模块、指导用药模块和结果输出模块；乙型肝炎病毒用药指导系统的模型图如图3所示。
引物模块包含核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示的反向引物；
正向引物（SEQ ID NO：1）：5’-AAACTGCACCTGTATTCCCA-3’；
反向引物（SEQ ID NO：2）：5’-GAGGAGACACAAAGGTTCCA-3’。
测序模块利用引物模块中的引物组对待测样品扩增并利用核苷酸序列如SEQ IDNO：2所示反向引物作为测序引物进行Sanger测序，得到ab1文件，具体包括以下步骤：
S1.将20 μL的QIAGEN Protease、200 μL的乙型肝炎病毒感染者血清样品和200 μL的Buffer AL置于1.5 mL离心管中，震荡离心充分混匀，接着置于56℃金属浴中孵育10min，孵育结束后瞬离，加入200 μL无水乙醇，充分混匀后转移至QIAamp Mini spin column离心柱中，以6000×g，8000rpm的条件离心1 min，收集离心柱并加入500 μL的Buffer AW1，在6000×g，8000rpm的条件下离心1 min，收集离心柱再加入500 μL的Buffer AW2，在6000×g，8000rpm的条件下离心1 min，收集离心柱转移至新的收集管中，在20000×g，14000rpm的条件下离心3 min，收集离心柱并加入40 μL的Buffer AE，室温静置1 min后，在6000×g，8000rpm的条件下离心1 min，收集液体即为乙型肝炎病毒感染者血清DNA；
S2.以步骤S1得到的乙型肝炎病毒感染者血清DNA作为模板DNA，使用核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物进行PCR扩增得到PCR扩增产物；
PCR扩增反应体系为：5 μL的10×PCR Buffer、2.5 μL的正向引物（SEQ ID NO：1，10μM）、2.5 μL的反向引物（SEQ ID NO：2，10μM）、1 μL的dNTPs Mix（10 mM）、33.75 μL的蒸馏水、0.25 μL的DNA聚合酶（5U/μL）和5 μL的模板DNA。
PCR扩增程序为：95℃预变性15 min；98℃，30 s，58℃，1 min，72℃，1 min，45个循环；72℃延伸10 min，4℃保存；
S3.以步骤S2得到的PCR扩增产物作为模板，以核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物作为测序引物，进行PCR扩增，得到测序PCR产物；
测序扩增体系为：1.75 μL的5×BigDye Sequencing Buffer、0.5 μL的BigDye3.1 Ready Reaction Mix、1 μL的反向引物（SEQ ID NO：2，3.2 μM），5.75 μL的蒸馏水、1 μL的PCR扩增产物（10ng/μL）；
测序扩增程序为：96℃预变性1 min；96℃，10 s，50℃，5 s，60℃，4 min，25个循环；4℃保存；
S4.将步骤S3得到的测序PCR产物、1 μL的EDTA（pH=8.0，125 mM）、1 μL的NaAc（pH=5.2，3M）和20 μL无水乙醇在PCR管中充分混合，在-20℃冰箱中静置5 min，接着在3000rfc，4℃的条件下离心15 min，将PCR管倒扣于吸水纸上，瞬离8～10 s后收集沉淀，与35 μL的70%乙醇震荡混匀，在3000 rfc，4℃的条件下离心15 min，将PCR管倒扣于吸水纸上，瞬离8～10 s后收集沉淀，待附着于沉淀表面的乙醇挥发后，加入10 μL的Hi-Di甲酰胺，混合均匀后转入0.2 mL的96孔PCR板底部，短暂离心后将96孔PCR板转移至基因分析仪（AppliedBiosystems，3500xl）中测序，得到ab1文件。
分析模块包括数据输入组件、数据预处理组件和突变位点识别组件：
数据输入组件用于将测序模块得到的ab1文件作为输入数据输入分析模块；
数据预处理组件包括sangerseqR程序包和Biostrings程序包，其中sangerseqR程序包负责对数据输入组件输入的ab1文件进行读取并提取ab1文件中主峰的DNA序列；Biostrings程序包负责将sangerseqR提取得到的主峰的DNA序列进行反向互补，并将反向互补后的序列翻译成氨基酸序列（翻译起始位点为反向互补后的序列5’端第一个“ATC”），取1～102位氨基酸序列作为突变分析氨基酸序列；其中突变分析氨基酸序列包含RT基因区域的162～263位点的氨基酸序列，突变分析氨基酸序列的第1位点为RT基因区域的162位点。
突变位点识别组件包含用R语言的switch函数编写的条件判断模型，条件判断模型用于判断数据预处理组件得到的突变位点的氨基酸序列与对应位点的标准氨基酸序列（登录号为QIN91274.1的第52～153位点）进行比对得到比对结果BXO，并基于比对结果BXO得到位点突变结果；
所述比对结果BXO中X取自1～102中的任一整数，B代表标准氨基酸序列的第X个氨基酸，O代表突变分析氨基酸序列的第X个氨基酸；
B与O相同时，突变分析氨基酸序列上的位点未发生氨基酸突变，位点突变结果为“位点未突变”，如“B未突变”；
B与O不同时，突变分析氨基酸序列上的位点发生氨基酸突变，位点突变结果为“位点→突变位点+突变”，如“B→O突变”。
判断模块对突变位点识别组件得到的比对结果BXO进行筛选，保留X=1、8、12、19、20、23、33、41、43、46、52、53、54、75、76、77或89的结果，并得到筛选得到指导用药突变结果BUO，其中U=X+161。
指导用药模块根据判断模块得到的指导用药突变结果BUO，得到耐药信息；
具体为：指导用药突变结果BUO为V173L、L180M、M204V、M204I、M204S、V207I、V207IL、V207IG或S213T中的一个或几个，拉米夫定耐药；
指导用药突变结果BUO为A181T、A181V、V214A、Q215S、N236T、P237H、N238T、N238D、H238T或H238D中的一个或几个，阿德福韦酯耐药；
指导用药突变结果BUO为I169T、V173L、L180M、T184A、T184G、T184S、T184I、S202G、S202I、M204V、M204I、M204S或M250V中的一个或几个，恩替卡韦耐药；
指导用药突变结果BUO为M204V、M204I或M204S中的一个或几个，替比夫定耐药；
指导用药突变结果BUO为A181T、A181V、A194T或N236T中的一个或几个，替诺福韦酯耐药；
指导用药突变结果BUO为V173L、L180M、M204V、M204I或M204S中的一个或几个，恩曲他滨耐药。
结果输出模块包括openxlsx程序包，openxlsx程序包用于将判断模块得到的指导用药突变结果汇总于Excel表格中，并输出至指定位置。
实施例3 乙型肝炎病毒用药指导系统的效果评价
1、实验方法
分别以9名乙型肝炎病毒感染者（编号为42～50）的血清样本作为待测样品，先利用实施例2所示乙型肝炎病毒用药指导系统中的引物模块和测序模块处理待测样品，分别得到9名乙型肝炎病毒感染者对应的ab1文件；其中在得到PCR扩增产物后，将PCR扩增产物通过2%（w/v）琼脂糖凝胶电泳进行显影。
再利用实施例2所示乙型肝炎病毒用药指导系统中的分析模块、判断模块、指导用药模块和结果输出模块对9名乙型肝炎病毒感染者对应的ab1文件进行分析，得到对应的突变位点分析结果。
2、实验结果
9名乙型肝炎病毒感染者的PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显影结果如图4所示，结果显示：9名乙型肝炎病毒感染者均能扩增出670 bp的特异性条带，说明PCR扩增产物能够用于后续测序分析。
9名乙型肝炎病毒感染者的突变位点分析结果在输入ab1文件后不到1分钟的时间内即可输出分析结果，分析结果如表1所示。
表1 乙型肝炎病毒感染者的突变位点分析结果
表1结果显示：只有编号为42和编号为45的乙型肝炎病毒感染者在238位点出现了突变，由N/H突变为T。
3、结果判定
结果判定参照《2019感染性疾病相关个体化医学分子检测技术指南》中常见的HBV基因型耐药与药物敏感性。
结合表1和指南可以说明编号为42和编号为45的乙型肝炎病毒感染者临床对阿德福韦酯耐药，即阿德福韦酯不能起到治疗的效果。
测试例1 常规方法对乙型肝炎病毒耐药突变位点的分析检测
1、实验方法
运行BioEdit软件逐一打开实施例3中步骤1得到的9名乙型肝炎病毒感染者对应的ab1文件并进行分析，分析步骤为：将序列反向互补，按Find快捷键，找到序列“CCCATCCC”作为翻译起点，以三个核苷酸为一组往后数，第8组为I169T突变位点，第12组为V173L突变位点，第19组为L180M突变位点，第20组为A181T/V/S突变位点，第23组为T184A/G/S/I突变位点，第33组为A194T突变位点，第41组为S202G/I突变位点，第43组为M204V/I/S突变位点，第46组为V207I/L/G突变位点，第52组为S213T突变位点，第53组为V214A突变位点，第54组为Q215S突变位点，第75组为N236T突变位点，第76组为P237H突变位点，第77组为N/H238T/D突变位点，第89组为M250V突变位点。
对照如下表2密码子表，将核苷酸序列翻译成氨基酸序列即可判断对应位点是否发生突变。
表2 密码子表
2、实验结果
9名乙型肝炎病毒感染者耐药基因各个突变位点的测序峰图如图5所示，参照密码子表2将9个样本中各个位点的核苷酸序列翻译成氨基酸序列（从峰图中找到各个突变位点的位置再翻译成氨基酸序列，大概每个样本要分析15分钟左右），最后得到以下结果表3。
表3 常规方法对乙型肝炎病毒感染者的突变位点分析结果
表3结果显示：只有编号为42和编号为45的乙型肝炎病毒感染者在238位点出现了突变，由N/H突变为T。
该结果与实施例3的分析结果一致，说明实施例2所示乙型肝炎病毒用药指导系统得到的结果可靠，并且实施例2所示乙型肝炎病毒用药指导系统分析耗时短，且避免了人工判读产生的偏差，更适合对大批量数据进行处理，缩短分析时间。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种乙型肝炎病毒用药指导系统，其特征在于，包括引物模块、测序模块和分析模块；
引物模块包含引物组，所述引物组含有核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示的反向引物；
测序模块利用引物模块中的引物组对待测样品扩增得到扩增产物，并利用核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示反向引物作为测序引物进行Sanger测序，得到ab1文件；
分析模块包括数据输入组件、数据预处理组件和突变位点识别组件；
其中，数据输入组件将测序模块得到的ab1文件作为输入数据输入分析模块；
数据预处理组件用于提取数据输入组件输入的ab1文件中的DNA序列并进行反向互补得到互补DNA序列，以互补DNA序列5’端第一个“ATC”为翻译起始位点翻译氨基酸序列，取1～102位氨基酸序列作为突变分析氨基酸序列；
突变位点识别组件用于将数据预处理组件得到的突变分析氨基酸序列的102个氨基酸位点依次与标准氨基酸序列进行比对得到比对结果BXO，并基于比对结果BXO得到位点突变结果；标准氨基酸序列为登录号QIN91274.1的氨基酸序列的52～153位氨基酸序列；
所述比对结果BXO中X取自1～102中的任一整数，B代表标准氨基酸序列的第X个氨基酸，O代表突变分析氨基酸序列的第X个氨基酸；
B与O相同时，突变分析氨基酸序列上的位点未发生氨基酸突变，位点突变结果为“位点未突变”，如“B未突变”；
B与O不同时，突变分析氨基酸序列上的位点发生氨基酸突变，位点突变结果为“位点→突变位点+突变”，如“B→O突变”。
2.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒用药指导系统，其特征在于，测序模块中所述待测样品为乙型肝炎病毒感染者的血液样品。
3.根据权利要求1所述的乙型肝炎病毒用药指导系统，其特征在于，还包括判断模块；
所述判断模块对权利要求1所述乙型肝炎病毒用药指导系统中的突变位点识别组件得到的比对结果BXO进行筛选，保留X=1、8、12、19、20、23、33、41、43、46、52、53、54、75、76、77或89的结果，并得到筛选得到指导用药突变结果BUO，其中U=X+161。
4.根据权利要求3所述的乙型肝炎病毒用药指导系统，其特征在于，还包括指导用药模块；
所述指导用药模块根据判断模块得到的指导用药突变结果BUO，得到耐药信息；
具体为：指导用药突变结果BUO为V173L、L180M、M204V、M204I、M204S、V207I、V207IL、V207IG或S213T中的一个或几个，拉米夫定耐药；
指导用药突变结果BUO为A181T、A181V、V214A、Q215S、N236T、P237H、N238T、N238D、H238T或H238D中的一个或几个，阿德福韦酯耐药；
指导用药突变结果BUO为I169T、V173L、L180M、T184A、T184G、T184S、T184I、S202G、S202I、M204V、M204I、M204S或M250V中的一个或几个，恩替卡韦耐药；
指导用药突变结果BUO为M204V、M204I或M204S中的一个或几个，替比夫定耐药；
指导用药突变结果BUO为A181T、A181V、A194T或N236T中的一个或几个，替诺福韦酯耐药；
指导用药突变结果BUO为V173L、L180M、M204V、M204I或M204S中的一个或几个，恩曲他滨耐药。
5.根据权利要求4所述的乙型肝炎病毒用药指导系统，其特征在于，还包括结果输出模块；所述结果输出模块将突变位点识别组件得到的位点突变结果和/或判断模块得到的指导用药突变结果输出。
6.权利要求1～5任一所述的乙型肝炎病毒用药指导系统在制备用于指导乙型肝炎病毒感染者用药的产品中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述指导乙型肝炎病毒感染者用药为指导乙型肝炎病毒感染者用拉米夫定、阿德福韦酯、恩替卡韦、替比夫定、替诺福韦酯和/或恩曲他滨。
8.权利要求1～5任一所述的乙型肝炎病毒用药指导系统在制备筛选乙型肝炎病毒耐药突变位点的产品中的应用。
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