JP2011525365A - Hiv親和性バリアントの検出のためのシステムおよび方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、世界中で見られる感染の大部分を占めるクレードA、B、C、DおよびGのHIV-1親和性と関連する配列バリアントを検出および解析するためのシステム、方法、試薬およびキットを提供する。また、本発明は、感染の1%未満を占め、入手可能な配列情報量が限られたクレードF、H、JおよびKの配列バリアントの解析のための利用も提供する。本発明の有力な局面は、標的ポリヌクレオチドの集団、例えば、患者試料由来の集団からバリアントが並行して検出され、該集団におけるバリアントの対立遺伝子の頻度が測定されることである。また、本発明は、望ましい結果の見込みが最も高い治療計画の決定ためのバリアント頻度の解析を含む。
ヒト免疫不全ウイルス(一般に、HIVと称される)は、多くの化合物が治療用に承認されているにもかかわらず、世界中で継続して大きな問題となっている。ウイルス逆転写酵素のエラーを生じやすい性質および高いウイルスターンオーバー(t1/2 = 1〜3日間)のため、HIVゲノムは非常に急速に変異する。例えば、逆転写酵素は、平均で、ウイルスの増殖能には劇的に影響しない9.7Kbのゲノムの1回の複製あたり1回の変異が起こると推定されている。これにより、多くの異なる変異体が動的関係で存在する「疑似種」の形成がもたらされる。
本発明の一部の態様は、核酸配列の決定に関する。より詳しくは、本発明の一部の態様は、SBSによる核酸の配列決定の際に得られたデータのエラーを補正するための方法およびシステムに関する。
以下により詳細に記載するように、本記載の発明の一部の態様は、HIVバリアントを含む配列領域を増幅するために特異的なプライマー種を用いて、標的化配列決定するための、および増幅された配列領域をバリアントの高感度検出に使用するためのシステム、方法およびキットを含む。
用語「フローグラム(flow gram)」は、一般的に、SBS法、特に、ピロリン酸系配列決定法(「ピロ配列決定」とも称する)によって作成された配列データのグラフ表示をいい、より具体低に「ピログラム」と称されることもある。
上述のように、本発明は、試料からのHIV親和性配列バリアントの検出、およびバリアント配列組成をR5またはX4親和性型と関連付けることによる前記試料中に存在する親和性型の同定の方法に関する。特定の態様において、本発明は、数千のウイルス粒子から配列情報を並行して生成し、HIV親和性型が試料中に低頻度で存在する場合でもこれらの型の存在の同定を可能にする、配列決定技術(親和性型と試料中のバリアントの検出された配列組成の関係に基づく)と合わせた、親和性バリアントに関連することが知られているHIVの領域を標的化する2期的PCR技術(つまり、上述のように第一および第二のアンプリコンを生成する工程)を含む。実際には、本発明の態様により、非化学量論的な対立遺伝子量でHIVウイルス粒子を含む試料中に存在する親和性配列バリアント、例えば50%未満、25%未満、10%未満、5%未満または1%未満で存在するHIV親和性バリアントなどを検出することができる。記載される態様により、かかる同定を迅速に、高信頼度で、かつ費用効果的な様式で行うことができる。
V3-1Fプライマー 5’ TCAGCACAGTACARTGYACACATGG 3’ (配列番号:1)
V3-1Rプライマー 5’ CATTACAATTTCTRGGTCYCCTCC 3’ (配列番号:2)
V3-2Fプライマー 5’ CAACTCAACTRCTGTTAAATGGYAG 3’ (配列番号:3)
V3-2Rプライマー 5’ TGTTGTATTACAGTAGAARAAYTC 3’ (配列番号:4)
1. 96ウェルプレートを冷却器に置く
2. 1ウェル当たり11.5μlのRNAを添加する
3. 0.5μlのプライマーV3-1Rを添加する
cDNA-V3-1R:
CATTACAATTTCTRGGTCYCCTCC (配列番号:2)
65℃で10分間インキュベートした後、すぐにチューブを氷上に置く。
1. Transcriptor RT反応バッファ(Rocheから入手可能)4μl
2. Protector RNaseインヒビター(Rocheから入手可能)0.5μl
3. dNTPs 2μl
4. DTT(Rocheから入手可能)1μl
5. Transcriptor逆転写酵素(Rocheから入手可能)0.5μl
ボルテックスにより簡単に混合してRNA試料に添加するまで氷上に維持する。
6. 1ウェル当たり8μlのRT混合物を添加する
7. プレートを密封して簡単に遠心分離する
8. サーモサイクラーに入れ、以下のcDNAプログラムを行う
50℃、60分
85℃、5分
4℃長時間(forever)
9. 1ウェル当たり1μlのRNAse H(New England Biolabsから入手可能)を添加する
10. 37℃で20分間サーモサイクラーブロックに置く(50℃以上に設定した過熱された蓋を有する)。
11. すぐにアンプリコン生成に進むか、-80℃で保存する。
1. 一枚の96ウェルプレートには下記の13x混合物で充分である(2アンプリコン、47試料+1対照)。必要に応じて方法をスケールアップまたはスケールダウンし得る。
2. 2本の1.5ml遠心分離チューブを「V3-1」、および「V3-S」とラベル表示する。これらのラベル表示は、以下のアンプリコン/プライマーセットを示す:
V3-1 V3-1F + V3-1R
V3-S V3-2F + V3-1R
(注意:上述の標的特異的プライマー配列の他に、以下のプライマーには以下のエレメント:+6塩基、フォワード=CGTATC、リバース=CTATGC;フォワードおよびリバースプライマーに特異的なSAD配列;ならびにKeyエレメント=TCAGが含まれる)
V3-1F
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGTCAGCACAGTACARTGYACACATGG (配列番号:5)
V3-1R
CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGCATTACAATTTCTRGGTCYCCTCC (配列番号:6)
V3-2F
CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGCAACTCAACTRCTGTTAAATGGYAG (配列番号:7)
3. 実験にマルチプレックス識別因子(MID)が必要な場合には、対応するMIDプライマーをアンプリコンのそれぞれの組に添加する。例えば、MID1を使用する場合には、プライマーセットAの全てのプライマーは、フォワードおよびリバースの両方向のプライマーに添加されたMID1を有するはずである。MID配列は、10塩基対の長さであり、アダプター配列の後で標的プライマー配列の直前に挿入されるべきである。
4. それぞれのチューブ中で、ラベルに示されるプライマーセットを有するPCRマスターミックスを調製する:
5. 22μlの「V3-1」PCRマスターミックスを一列目のそれぞれのウェルにピペットで移す。
6. 22μlの「V3-S」PCRマスターミックスを二列目のそれぞれのウェルにピペットで移す。
7. 以下のスキームに従って、1ウェル当たり3μlのcDNAを添加する(1カラム当たり1試料)
8. カラム11の陽性対照は、公知試料cDNAであり、カラム12の陰性対照は、cDNA合成プレートからの水対照である。
9. プレートをプレートシールで密封する。
10. プレートを30秒間、900xgで遠心分離する。
11. プレートをサーモサイクラーブロックに置き、プログラム「Ti_V3Amp」
94℃、3分
40サイクル:
94℃、15秒
55℃、20秒
72℃、45秒
72℃、8分
4℃長時間、を行う。
12. すぐに次の工程に進まない場合は、プレートを(同日中に進む場合は)氷上または-20℃で保存する。
1. プレートを30秒間、900xgで遠心分離する。
2. 8チャンネルマルチピペッターを使用して、22.5μlの分子等級水を96ウェル丸底PPプレート(Fisher Scientificから入手可能)のカラム1〜11のそれぞれのウェルに移す。
3. PCRプレートから22.5μlのPCR産物を丸底PPプレートのそれぞれのウェルに移し;二枚のプレートについて同じレイアウトを維持する。
4. 72μlのSPRIビーズをそれぞれのウェルに添加して、SPRIビーズ/PCR混合物が均一になるまでピペットで少なくとも12回上下して完全に混合する。
5. 上清が透明になるまでプレートを室温で10分間インキュベートする。
6. プレートを96ウェル磁気リングスタンド(Ambion, Inc.から入手可能)に置き、室温で5分間インキュベートする。
7. プレートを磁気リングスタンド上に置いたまま、ビーズを拡散させることなく注意深く上清を除去して廃棄する。
8. 磁気リングスタンドからPPプレートを取り外し、200μlの新たに調製した70%エタノールを添加する。
9. PPプレートを磁気リングスタンドに戻す。PPプレートを約10回タップするかまたは磁気リングスタンド上で前後/円運動にて動かし、溶液を攪拌してペレットを分散させる(ペレットは完全に分散しなくてもよい;これは許容可能)。
10. PPプレートを磁気リングスタンドに置き、1分間インキュベートする。
11. プレートを磁気リングスタンドに置いたまま、ビーズが分散しないように注意深く上清を除去して廃棄する。
12. 工程8〜11を繰り返す。上清を可能な限り除去する。
13. 全てのペレットが完全に乾燥するまで、PPプレート/磁気リングスタンドを一緒に40℃に設定したヒートブロック上に置く(10〜20分)。
14. 10μlの1X TE(pH7.6±0.1)を各ウェルに添加する。全てのペレットが分散するまでPPプレートをタップ/同じように前後円運動にて動かす。
15. PPプレートを磁気リングスタンドに置き、2分間インキュベートする。
16. 各ウェルの上清を新しい96ウェル(黄色)プレートにピペットで移す。いくつかのウェルでペレットが全く移動しないようにすることは困難である;これは許容可能である。
17. プレートをプレートシールで覆い、-20℃で保存する。
1. 当該技術分野に公知の方法を使用して、PicoGreen(登録商標)試薬でこれらのアンプリコンの1μlを定量する。
2. 5ng/μl以下で定量されたいずれかのアンプリコンは、2100 Bioanalyzer(Agilent Technologiesから入手可能)でさらに評価すべきである:1μlのそれぞれの精製したアンプリコンをBioanalyzer DNAチップに負荷して、DNA-1000シリーズIIアッセイを行う。
a. 予想された大きさのバンドが存在し、プライマーダイマーが明らかに3:1以下のモル比である場合、PicoGreenを使用して定量しアンプリコンプールに進む。
b. 予想された大きさのバンドが存在し、プライマーダイマーが明らかに3:1より高いモル比である場合、SPRIおよびPicoGreen定量を繰り返し、次にBioanalyzer解析を行ない、プライマーダイマーの除去を確認する。
3. 1μlの陰性PCR対照反応をBioanalyzerで解析する。プライマーダイマー以外のバンドは見られないはずである。
1. それぞれの試料について2つのアンプリコンを生成し、そのそれぞれは理想的にはemPCR反応について等モル量で混合すべきである。全てのアンプリコンが同じ効率で生成されるわけではなく、アンプリコンがほとんど作製されずに大量のプライマーダイマーが存在する場合もある。最適な配列決定結果を達成するために、いくつかのアンプリコンの質が標準以下であっても、充分に定量された比較的純粋な(下記参照)アンプリコンのみを、それぞれの試料の最終混合物に使用することが重要である。種々のアンプリコン間でかなりの重複があるために、所定の試料の完全なカバー率には全ての2アンプリコンが必要ではないことがある。二つの高品質なアンプリコンの組が利用可能ではない場合、それぞれの試料についての最終的な混合物についてアンプリコンを選択するために、以下の規則に従う:
i. アンプリコンがBioanalyzerで定量可能なバンドとして認識されない場合、6.2の最終アンプリコン混合物には使用しない。
ii. プライマーダイマー対アンプリコンのモル比が3:1以上である場合、最終アンプリコン混合物には使用しない。この基準は、6.1でAgilent Bioanalyzerアッセイによってさらに定量された低濃度のアンプリコンに対してのみ利用可能である。
iii. アンプリコンが上述の基準に該当しないか、または全くない場合、以下のスキームに従って、他の重複アンプリコンの量を増やす:
2. アンプリコンV3-1がない場合、アンプリコンV3-Sの量を二倍にする。
3. アンプリコンV3-Sがない場合、アンプリコンV3-1の量を二倍にする。
4. アンプリコンV3-1およびV3-Sの両方がない場合、V3領域は配列決定できない。これらのアンプリコンのPCRを繰り返す。
1. 以下の等式を使用して、所定の試料由来の2アンプリコンのそれぞれについて1μl当たりの分子の濃度を計算する:
2. 2アンプリコンのそれぞれの109分子/μl希釈物を作製する:
1μlのアンプリコン溶液に以下の容量の1xTEを添加する:
3. 等容量の2アンプリコン希釈物のそれぞれ、例えば10μlを混合する。アンプリコンのいずれかがない場合、工程505のガイドラインに従って重複アンプリコンの容量を増やす。
4. 1μlの109モル/μl溶液を499μlの1xTEに添加して、混合されたアンプリコンのさらなる希釈物を2x106分子/μlにする。
5. 最終希釈物(2x106分子/μl)を、oリングキャップを有する0.5mlのチューブ中、-20℃で保存する。
1. エマルジョンを設定する直前に、6.3.4からの2x106分子/μlの溶液の10μlを、90μlのビーズ洗浄バッファに添加して、10倍希釈物を作製する。5秒間ボルテックスにかけて混合する。
2. それぞれの試料について、1cpbの1つのAエマルジョンおよび1つのBエマルジョンを作製する(つまり、エマルジョン当たり上述の希釈物の12μl(2,400,000ビーズ))。
3. より簡単な扱いのために、破壊中に所定の試料について2つのエマルジョンをプールし得る。
Claims (12)
- (a) HIV試料集団中のそれぞれのRNA分子から複数のcDNA種を生成する工程;
(b) 該cDNA種から少なくとも1つの第一アンプリコンを増幅する工程、第一アンプリコンのそれぞれは、複数の増幅されたコピーを含み、第一アンプリコンの座を規定する一組の核酸プライマーにより増幅される;
(b) 該第一アンプリコンの増幅されたコピーをクローン増幅して、複数の第二アンプリコンを生成する工程、該複数の第二アンプリコンは、第一アンプリコンの増幅されたコピーの1つに由来する実質的に同じコピーの固定化された集団を含む;
(c) 少なくとも100の固定化された集団に由来する実質的に同じコピーの核酸配列組成を、1つの基材上で並行して決定する工程;および
(d) 該少なくとも100の固定化された集団の核酸配列組成中に5%以下の頻度で存在する1つ以上の配列バリアントを検出する工程;および
(e) 該検出された配列バリアントを、HIV親和性に関連する変形と相関する工程
を含む、薬物耐性に関連する低存在頻度の1つ以上のHIV配列バリアントを検出する方法。 - HIV親和性に関連する変形が、好ましくはCCR5およびCXCR4からなる群より選択されるコレセプターに関連することが知られている、請求項1記載の方法。
- cDNA種を生成する工程により、好ましくは重複する配列組成を有する2つのcDNA種が作製される、請求項1記載の方法。
- 該HIV試料集団が1人の患者に由来する、請求項1記載の方法。
- 該複数の第一アンプリコンが2つのアンプリコンを含む、請求項1記載の方法。
- 該第一アンプリコンに対するプライマーの組が、低変異頻度の領域を標的とする、請求項1記載の方法。
- 該第一アンプリコンに対するプライマーの組が、クレードA、クレードB、クレードC、クレードDおよびクレードGからなる群より選択されるHIVクレードの領域を増幅するように設計される、請求項1記載の方法。
- 該第一アンプリコンに対するプライマーの組が、V3-1F(配列番号:1)とV3-1R(配列番号:2);V3-2F(配列番号:3)とV3-2R(配列番号:4);V3-1F(配列番号:1)とV3-2R(配列番号:4);およびV3-2F(配列番号:3)とV3-1R(配列番号:2)からなる群より選択されるプライマー対の群を含む、請求項7記載の方法。
- 該第一アンプリコンの座が、好ましくはHIVエンベロープ領域であるV3領域に関連するHIVの領域を含む、請求項1記載の方法。
- 該第二アンプリコンが、一般的なプライマーの組を使用して増幅される、請求項1記載の方法。
- 該検出する工程が、複数の配列決定反応から生成されたシグナルを1つの基材上で検出し得る1つの検出デバイスを含む機器を使用する、請求項1記載の方法。
- V3-1F(配列番号:1)とV3-1R(配列番号:2);V3-2F(配列番号:3)とV3-2R(配列番号:4);V3-1F(配列番号:1)とV3-2R(配列番号:4);およびV3-2F(配列番号:3)とV3-1R(配列番号:2)からなる群より選択される1つ以上のプライマーの組を含む、請求項1記載の方法を実行するためのキット。
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