CN108660252B - 一种基于焦磷酸测序的人类免疫缺陷病毒耐药性分析方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV‑1的PR区和RT区耐药基因突变的方法和试剂盒。具体而言，本发明公开了检测PR区和RT区耐药基因突变的扩增引物和测序引物。本发明还涉及包含扩增引物和测序引物的用于焦磷酸测序技术检测HIV‑1耐药基因突变的试剂盒。本发明还涉及使用扩增引物和测序引物检测样品中的HIV‑1耐药基因突变的方法。
Description
技术领域
本发明涉及基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1的PR区和RT区耐药基因突变的方法和试剂盒。具体而言，本发明公开了检测PR区和RT区耐药基因突变的扩增引物和测序引物。本发明还涉及包含扩增引物和测序引物的用于焦磷酸测序技术检测HIV-1耐药基因突变的试剂盒。本发明还涉及使用扩增引物和测序引物检测样品中的HIV-1耐药基因突变的方法。
背景技术
人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)是一种经血液传播引起获得性免疫缺陷综合征(艾滋病，AIDS)的RNA病毒。HIV感染是全球性公共卫生问题之一，停止或扭转艾滋病蔓延是联合国千年发展目标之一。根据世界卫生组织(WHO)报告，截止2015年全球HIV感染者约有3670万人(3400-3980万人)，每年HIV感染相关死亡约110万人(94-130万人)，2015年新感染约210万人(150-240万人)。HIV可分为HIV-1和HIV-2两个亚型，其中HIV-1型高度变异，并在中国广泛流行。
随着艾滋病抗病毒治疗的标准化和扩大化，艾滋病服药依从性和治疗效果却并没有显著提高，HIV耐药出现是重要的困扰因素之一。患者体内的HIV病毒，常表现出基因多态性。耐药HIV病毒株产生因素主要包括：病毒的复制水平、复制能力和突变能力，宿主细胞中的病毒库，抗病毒药物选择作用等。HIV耐药导致治疗失败，治疗费用增加，病毒感染扩散风险增大，甚至导致感染死亡增多。因此，HIV耐药检测将有助于判断抗病毒治疗的效果，制定个体化的抗病毒治疗方案，进而更加有效地控制病毒的传播。
目前HIV耐药性检测有两种方法，即表型检测及基因型检测。其中基因型检测的费用较低，技术也相对容易，因此具有广泛的临床应用前景。当前HIV耐药基因检测方法主要有以下几种：
(1)液态芯片法：该方法基于磁珠偶联的核酸杂交技术。每一个磁珠因具有两种荧光染料而具有唯一性和识别性，磁珠上偶联有24bp的寡核苷酸链。分别设计野生型和突变型的两条核酸探针，经过核酸杂交过程及荧光的激发过程，得到一定的荧光值。使用构建成功的质粒，分别优化核酸探针，建立检测体系。该方法优点是：实验检测自动化。该方法缺点是：操作复杂、价格昂贵、不能检测未知突变。
(2)基于Sanger测序(一代测序)技术的自建基因型耐药检测方法：该方法是目前国内主要采取的形式，其优点是：准确度高，是测序的金标准。主要的缺点是：一是无法对发生突变的病毒比例进行定量，二是检测时间较长，三是检测敏感度低。现在临床使用的一代测序用于HIV耐药基因的检测敏感性通常大于20％，我国达安公司注册的HIV耐药基因检测技术敏感性为40％。而根据文献报道，1％的突变就能因为药物治疗的选择作用导致突变病毒的快速增长，从而导致治疗失败。
(3)单基因组测序方法：单基因组测序通过将逆转录获得的cDNA稀释到每个反应体系1个拷贝，再分别扩增，能够最低检测出含量在1％的劣势突变。2005年，Palmer等人通过该方法证实艾滋病患者体内可存在常规方法无法检测到的耐药劣势株(通常在分子检测语境中，将检测到的含量在20％以下的耐药突变称为HIV-1的耐药劣势突变)。但该方法的缺点是：工作量非常大，可用于验证其他方法的精度，但无法作为常规检测使用。
焦磷酸测序是基于酶级联放大反应的边合成边测序的实时测序技术，是介于一代测序和二代测序之间的一种测序手段。它既避免了一代测序操作耗时、繁琐、通量受限的缺点，又避免了二代测序成本高、检测DNA结果信息量过大、结果分析复杂等局限性，因此特别适用于对已知的一定长度序列进行的测序分析。焦磷酸测序的重复性和精确性能与Sanger测序法相媲美，而速度却大大的提高。焦磷酸测序技术产品具备同时对大量样品进行测序分析的能力，为大通量、低成本、适时、快速、直观地进行单核苷酸多态性(SingleNucleotide Potymorphisms，SNPs)研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。目前，焦磷酸测序技术已广泛应用于微生物鉴定、遗传学分析、SNP检测等方面。
综上所述，可以预见，焦磷酸测序技术在HIV基因变异检测中的应用将克服当前HIV耐药检测中灵敏度低、无法明确突变比例、检测操作复杂等弱点，具有极大的临床医学检测应用前景和商业价值。然而，目前尚没有商业化实现焦磷酸测序技术在HIV耐药基因突变检测的方案或试剂盒。
发明内容
本发明的一方面提供了用于基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变的测序引物，所述测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述测序引物是选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。
本发明的另一方面提供了用于基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变的测序引物组，所述测序引物组包括两条、三条、四条、五条或六条互不相同的测序引物。所述测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述测序引物是选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明的测序引物所针对的耐药基因突变是选自L90M、M41L、E44D、D67G、L74V、K101E、V118I、Y181C、M184V、G190S、L210W、K219N和T215Y中的至少一种突变。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:25的核苷酸序列或由SEQ ID NO:25的核苷酸序列组成的测序引物针对耐药基因突变L90M。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:26的核苷酸序列或由SEQ ID NO:26的核苷酸序列组成的测序引物针对选自M41L和E44D中的至少一种耐药基因突变。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:27的核苷酸序列或由SEQ ID NO:27的核苷酸序列组成的测序引物针对选自D67G和L74V中的至少一种耐药基因突变。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:28的核苷酸序列或由SEQ ID NO:28的核苷酸序列组成的测序引物针对选自K101E和V118I中的至少一种耐药基因突变。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:29的核苷酸序列或由SEQ ID NO:29的核苷酸序列组成的测序引物针对选自Y181C、M184V和G190S中的至少一种耐药基因突变。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:30的核苷酸序列或由SEQ ID NO:30的核苷酸序列组成的测序引物针对选自L210W、K219N和T215Y中的至少一种耐药基因突变。
因此，在优选实施方式中，在使用本发明的测序引物基于焦磷酸测序技术对人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变，例如包括但不限于以下L90M、M41L、E44D、D67G、L74V、K101E、V118I、Y181C、M184V、G190S、L210W、K219N和T215Y的突变进行检测时，可以使用本发明的测序引物检测其中的任意一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个或者全部十三个突变。
本发明的另一方面提供了用于基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变的扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条序列。在某些实施方式中，所述扩增引物的核苷酸序列是选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条序列。
本发明的另一方面提供了用于基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变的扩增引物组，所述扩增引物组包括两条、三条、四条、五条、六条、七条、八条、九条、十条、十一条或十二条扩增引物，所述扩增引物的核苷酸序列包含选自SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条序列。在某些实施方式中，所述扩增引物的核苷酸序列是选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条序列。
本发明的另一方面提供了一种用于基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变的试剂盒，其包括测序引物，所述测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述测序引物是选自SEQ IDNO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述试剂盒包括测序引物组，所述测序引物组包括两条、三条、四条、五条或六条互不相同测序引物，所述测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列，在某些实施方式中，所述测序引物是选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述试剂盒还包括扩增引物，所述扩增引物包含选自SEQ IDNO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述扩增引物是选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述试剂盒包括扩增引物组，所述扩增引物组包括两条、三条、四条、五条、六条、七条、八条、九条、十条、十一条或十二条互不相同扩增引物，所述扩增引物包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列，在某些实施方式中，所述扩增引物是选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。
在某些实施方式中，本发明的试剂盒所针对的耐药基因突变是选自L90M、M41L、E44D、D67G、L74V、K101E、V118I、Y181C、M184V、G190S、L210W、K219N和T215Y中的至少一种突变。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列或由SEQ ID NO:1或2的核苷酸序列组成的扩增引物针对耐药基因突变L90M、M41L、E44D、D67G、L74V、K101E、V118I、Y181C、M184V、G190S、L210W、K219N和T215Y中的至少一种突变。在优选实施方式中，包含SEQ IDNO:3或4的核苷酸序列或由SEQ ID NO:3或4的核苷酸序列组成的扩增引物针对耐药基因突变L90M、M41L和E44D中的至少一种突变。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:5或6的核苷酸序列或由SEQ ID NO:5或6的核苷酸序列组成的扩增引物针对耐药基因突变D67G和L74V中的至少一种突变。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:7或8的核苷酸序列或由SEQ ID NO:7或8的核苷酸序列组成的扩增引物针对耐药基因突变K101E和V118I中的至少一种突变。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:9或10的核苷酸序列或由SEQ ID NO:9或10的核苷酸序列组成的扩增引物针对耐药基因突变Y181C、M184V和G190S中的至少一种突变。在优选实施方式中，包含SEQ ID NO:11或12的核苷酸序列或由SEQ ID NO:11或12的核苷酸序列组成的扩增引物针对耐药基因突变L210W、K219N和T215Y中的至少一种突变。
在优选实施方式中，包括由SEQ ID NO:1的核苷酸序列组成的扩增引物和由SEQID NO:2的核苷酸序列组成的扩增引物的扩增引物组针对耐药基因突变L90M、M41L、E44D、D67G、L74V、K101E、V118I、Y181C、M184V、G190S、L210W、K219N和T215Y中的至少一种突变。在优选实施方式中，包括由SEQ ID NO:3的核苷酸序列组成的扩增引物和由SEQ ID NO:4的核苷酸序列组成的扩增引物的扩增引物组针对耐药基因突变L90M、M41L和E44D中的至少一种突变。在优选实施方式中，包括由SEQ ID NO:5的核苷酸序列组成的扩增引物和由SEQ IDNO:6的核苷酸序列组成的扩增引物的扩增引物组针对耐药基因突变D67G和L74V中的至少一种突变。在优选实施方式中，包括由SEQ ID NO:7的核苷酸序列组成的扩增引物和由SEQID NO:8的核苷酸序列组成的扩增引物的扩增引物组针对耐药基因突变K101E和V118I中的至少一种突变。在优选实施方式中，包括由SEQ ID NO:9的核苷酸序列组成的扩增引物和由SEQ ID NO:10的核苷酸序列组成的扩增引物的扩增引物组针对耐药基因突变Y181C、M184V和G190S中的至少一种突变。在优选实施方式中，包括由SEQ ID NO:11的核苷酸序列组成的扩增引物和由SEQ ID NO:12的核苷酸序列组成的扩增引物的扩增引物组针对耐药基因突变L210W、K219N和T215Y中的至少一种突变。
因此，在优选实施方式中，在使用本发明的试剂盒基于焦磷酸测序技术对人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变，例如包括但不限于以下L90M、M41L、E44D、D67G、L74V、K101E、V118I、Y181C、M184V、G190S、L210W、K219N和T215Y的突变进行检测时，可以使用本发明的试剂盒检测其中的任意一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个、十个、十一个、十二个，或者全部十三个突变。
本发明的另一方面提供了一种基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变的方法，所述方法包括使用测序引物对人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸进行测序的步骤，所述测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列，在某些实施方式中，所述测序引物是选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述耐药基因突变是选自L90M、M41L、E44D、D67G、L74V、K101E、V118I、Y181C、M184V、G190S、L210W、K219N和T215Y中的至少一种突变。
在某些实施方式中，本发明的方法还包括提取人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸，并任选地进行纯化的步骤。在某些实施方式中，还包括使用扩增引物对人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸进行扩增的步骤，所述扩增引物包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，还包括提取人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸，并任选地进行纯化的步骤，和使用扩增引物对人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸进行扩增的步骤，所述扩增引物包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。
在优选实施方式中，所述方法包括：(1)提取人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸，并任选地进行纯化的步骤；(2)使用扩增引物对人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸进行扩增的步骤，所述扩增引物包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列；(3)使用测序引物对人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸进行测序的步骤，所述测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。
附图说明
图1是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:25)对检测位点(L90M)的基因突变检测结果的部分截图，其中横坐标表示分配顺序，纵坐标表示荧光信号强度。
图2是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:26)对检测位点(M41L和E44D)的基因突变检测结果的部分截图，其中横坐标表示分配顺序，纵坐标表示荧光信号强度。
图3是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:27)对检测位点(D67G和L74V)的基因突变检测结果的部分截图，其中横坐标表示分配顺序，纵坐标表示荧光信号强度。
图4是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:28)对检测位点(K101E和V118I)的基因突变检测结果的部分截图，其中横坐标表示分配顺序，纵坐标表示荧光信号强度。
图5是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:29)对检测位点(Y181C、M184V和G190S)的基因突变检测结果的部分截图，其中横坐标表示分配顺序，纵坐标表示荧光信号强度。
图6是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:30)对检测位点(L210M、T215Y和K219N)的基因突变检测结果的部分截图，其中横坐标表示分配顺序，纵坐标表示荧光信号强度。
具体实施方式
定义
本文中使用的术语“引物”通常指与目标序列互补和退火的单链寡核苷酸，在核酸合成反应中作为目标序列延长的出发点。在某些实施方案中，本发明的引物长度为约15-35个核苷酸。天然存在的核苷酸(例如腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶，在下文称为“A”、“G”、“C”和“T”)以及核苷酸类似物，都可用于本发明的引物。其中，引物序列的GC含量一般为40-60％，过高或过低都不利于引发反应。
本文中使用的术语“扩增引物”通常是指在核酸扩增反应中，用作核苷酸链延伸出发点的寡核苷酸引物。
本文中使用的术语“测序引物”通常是指用于起始对核酸进行的测序反应的寡核苷酸引物。
本文使用的“扩增产物”是指对核酸模板进行扩增而产生的扩增的核酸。
本文使用的术语“核苷酸类似物”指与天然存在的核苷酸在结构上相似的化合物。核苷酸类似物可以具有改变的磷酸骨架、糖部分、核碱基或其组合。通常具有改变的核碱基的核苷酸类似物尤其赋予不同的碱基配对和碱基堆积特性。具有改变的磷酸-糖骨架的核苷酸类似物(例如肽核酸(PNA)、锁核酸(LNA))通常尤其改变链特性，例如二级结构形成。
本发明的扩增引物和测序引物的核苷酸序列还包括其修饰形式，只要所述引物的扩增或测序效果不受到明显的影响即可。所述修饰可以为例如在核苷酸序列中或两端添加一个或多个(例如1-10个，或1-5个，例如2个、3个或6个)核苷酸残基、在核苷酸序列中缺失一个或多个核苷酸残基、或者将序列中的一个或多个核苷酸残基替换成另外的核苷酸残基，例如将A替换成T，将C替换成G等。本领域技术人员清楚，所述修饰形式的引物也涵盖在本发明之内、特别是权利要求的保护范围之内。
可以使用例如通用DNA合成仪，例如由Applied Biosystems制造的394型，经化学方法合成本发明中的引物，例如扩增引物和测序引物。还可采用本领域众所周知的任何其它方法来合成。
使用从样品中提取的基因组DNA作为模板，并使用PCR扩增引物对人类免疫缺陷病毒(HIV)耐药基因进行扩增反应，以获得扩增产物。扩增反应包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)、连接酶链式反应(LCP)、自动维持序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、多重置换扩增(MDA)和滚环扩增(RCA)等等。
在本发明中优选使用PCR方法对目标核苷酸序列进行扩增。PCR方法是本领域技术人员熟知的常规技术方法。术语“PCR方法”还包括该方法的衍生形式，其包括但不限于巢氏PCR、反转录PCR、实时PCR、重组PCR、复合PCR和定量PCR等。在本发明中优选使用巢氏PCR方法对目标核苷酸序列进行扩增。
PCR方法是在模板DNA、引物和四种dNTP等存在的条件下,依赖于DNA聚合酶(Taq酶)的酶促合成反应。其具体反应分三步：变性、退火、聚合。以上三步为一个循环，每一循环的产物DNA又可以作为下一个循环模板，经25～50次，例如30次循环，得到大量拷贝数的目标核苷酸序列。在一个实施方式中，所述PCR方法是巢氏PCR方法。在一个实施方式中，所述PCR方法使用了本发明的扩增引物，所述扩增引物包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12的至少一条核苷酸序列；或扩增引物组，所述扩增引物组包括两条、三条、四条、五条或六条互不相同扩增引物，所述扩增引物各自分别包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。本领域技术人员应当理解的是，只要能扩增目标核苷酸序列，也可以使用其他PCR方法和扩增引物。
在本发明所使用PCR方法中，可以使用本领域技术人员所熟知的各种常规的耐热DNA聚合酶进行扩增，所述耐热DNA聚合酶包括但不限于FastStart Taq DNA聚合酶(Roche)、Ex Taq、Z-Taq、AccuPrime TaqDNA聚合酶和HotStarTaq Plus DNA聚合酶等。
基于引物Tm值选择合适PCR反应条件是本领域技术人员所熟知的技术，本领域技术人员可以根据引物长度、GC含量、目标特异性和灵敏度、所使用的聚合酶性质等确定进行PCR反应的最佳条件。例如，可使用以下条件进行巢氏PCR反应：94℃2分钟,30个循环(94℃20秒；55℃30秒；72℃15秒)，72℃10分钟。
在获得PCR产物后，可对PCR产物进行处理，以获得与测序引物互补结合的单链PCR产物。可通过本领域技术人员所熟知的方法来进行单链PCR产物的产生和纯化。常见的产生和纯化单链PCR扩增产物的方法包括但不限于T7逆转录法、核酸外切酶法、变性高效液相色谱法和磁珠捕获法等。
在获得单链PCR扩增产物后，可采用本发明的测序引物进行焦磷酸测序。在某些实施方式中，本发明的测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的至少一条核苷酸序列，例如至少两条、三条、四条、五条或六条序列。在某些实施方式中，本发明的测序引物是选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的至少一条核苷酸序列，例如至少两条、三条、四条、五条或六条互不相同的核苷酸序列。
引物的选择对于检测成功率有一定影响。发明人通过一系列实验研究发现，HIV-1基因组序列变异率极高，引物3‘末端碱基的保守性对样本扩增成功率和测序反应成功率至关重要。此外，引物自身互补性、引物二聚等干扰因素也对扩增和测序反应的成功率有重要影响。例如，发明人曾经针对L90M位点设计了5对扩增引物，最终证明其中4对引物的扩增成功率低于60％(即只有不到60％的符合浓度要求的临床样本可以被成功扩增)。在本发明特别优选的实施方式中，发明人采用经过筛选和优化后的引物，使样本扩增的成功率达到98％以上，测序的成功率达到90％以上，因而能够适应大规模临床检测的需求。
分配顺序是测序仪器在进行测序过程中加入的核苷酸底物的顺序。测序时，仪器按照分配顺序按次序将核苷酸底物加入反应池中，如果加入A时检测到荧光信号，就代表这个位点的测序结果为A，以此类推。因此，经过设计得到的良好的分配顺序有助于提高测序效率，排除干扰，减少误差，提高敏感性。在本发明中针对分析位点设计了分配顺序，所述分配顺序选自SEQ ID NO:31、32、33、34、35和36。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:25时的分配顺序为SEQ ID NO:31。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:26时的分配顺序为SEQ ID NO:32。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:27时的分配顺序为SEQID NO:33。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:28时的分配顺序为SEQ ID NO:34。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:29时的分配顺序为SEQ ID NO:35。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:30时的分配顺序为SEQ ID NO:36。
在本发明中所使用的分配顺序设计保证能够包括绝大多数潜在变异型，在出现任何未涵盖的变异序列时也能够及时发现并调整适应，并再次测序。
试剂盒
本发明提供了用于基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变的试剂盒，其包括本发明的测序引物或测序引物组，或者本发明的测序引物或测序引物组与本发明的扩增引物或扩增引物组的组合。在某些实施方式中，所述测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述测序引物是选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述测序引物组包括两条、三条、四条、五条或六条互不相同测序引物，所述测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述测序引物是选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述扩增引物包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述扩增引物是选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述扩增引物组包括两条、三条、四条、五条、六条、七条、八条、九条、十条、十一条或十二条互不相同的扩增引物，所述扩增引物包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述扩增引物是选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。
本发明的试剂盒可包含实施本发明方法所用的材料或试剂(包括扩增引物和测序引物)。本发明的试剂盒还可以包括储存反应试剂(例如在合适容器中的引物、dNTP、酶等)和/或支持材料(例如缓冲液、实施检测的说明书等)的容器。例如，本发明的试剂盒可以包括一个或多个含有相应反应试剂和/或支持材料的容器(例如盒子)，例如，第一容器可含有用于测定的酶，第二容器可含有扩增引物或扩增引物组，第三容器可含有测序引物或测序引物组。所述试剂盒还可含有适合容纳所述试剂或容器的隔室。作为一个实例，试剂盒可含有扩增引物或扩增引物组、测序引物或测序引物组、PCR反应缓冲液、使用说明书。试剂盒还可含有聚合酶和dTNP等。试剂盒还可含有UNG、用于质控的内标、阳性和阴性对照等。试剂盒还可包含用于从样品制备核酸例如DNA的试剂。本发明试剂盒还可包含除了本发明的扩增引物和/或测序引物之外的其它任何扩增引物和/或测序引物，例如能够有效检测人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变的扩增引物和/或测序引物。本发明的实施例不能理解为限制适用于本发明的试剂盒及其内容物。
耐药基因突变检测方法
本发明的另一方面提供了基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变的方法，所述方法包括使用本发明的测序引物或测序引物组对人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸进行测序的步骤。在某些实施方式中，所述测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述测序引物是选自SEQ IDNO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，测序时的分配顺序选自SEQ ID NO:31、32、33、34、35和36。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:25时的分配顺序为SEQ ID NO:31。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:26时的分配顺序为SEQID NO:32。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:27时的分配顺序为SEQ ID NO:33。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:28时的分配顺序为SEQ ID NO:34。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:29时的分配顺序为SEQ ID NO:35。在优选实施方式中，测序引物为SEQ ID NO:30时的分配顺序为SEQ ID NO:36。
在某些实施方式中，所述测序引物组包括两条、三条、四条、五条或六条互不相同测序引物，所述测序引物包含选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述测序引物是选自SEQ ID NO:25、26、27、28、29和30中的任一条核苷酸序列。
在某些实施方式中，还包括提取人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸，并任选地进行纯化的步骤。从样品中提取核酸的方法是本领域技术人员所熟知的，可用例如苯酚和氯仿进行核酸提取，或者使用市售核酸提取试剂进行提取，或者使用市售核酸自动提取仪，例如Qiacube核酸自动提取仪进行核酸提取。本发明的方法还包括对提取的核酸任选地进行纯化，纯化核酸的方法是本领域技术人员所熟知的，可用例如沉淀法去除残留的有机溶剂，用吸附法除去非核酸组分。本文所用的术语“任选”(optional)或“任选地”(optionally)是指非必需的含义。例如，“任选的步骤”，是指可以有该步骤，也可以没有该步骤，这可以由技术人员根据具体需要决定。
在某些实施方式中，还包括使用本发明的扩增引物或扩增引物组对人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸进行扩增的步骤，在某些实施方式中，所述扩增引物包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述扩增引物是选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。
在某些实施方式中，所述扩增引物组包括两条、三条、四条、五条、六条、七条、八条、九条、十条、十一条或十二条互不相同的扩增引物，所述扩增引物包含选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。在某些实施方式中，所述扩增引物是选自SEQ ID NO:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12中的任一条核苷酸序列。
在本发明中优选使用PCR方法对目标DNA序列进行扩增。PCR方法是本领域技术人员熟知的常规技术方法，其包括但不限于巢氏PCR、反转录PCR、实时PCR、重组PCR、复合PCR和定量PCR等。在本发明中优选使用巢氏PCR方法对目标DNA序列进行扩增。
在本文中描述了本发明的各种实施方式和实施例，但是应理解的是，这些实施方式和实施例仅起到举例阐述本发明的作用，而并非用于限定本发明。对本文中的实施方式和实施例可依照本文的公开内容来进行改变和修饰，而不会违背本发明的精神或者超出本发明的范围。
实施例
用于进行实验的各种具体实验方法均为本领域常规的实验方法或者按照制造商所建议的步骤和条件，并能由本领域技术人员根据需要常规地确定。
样本
在征得患者同意的情况下，采集刚确诊的HIV-1患者血液样本进行诊断，其HIV-1病毒载量大于500拷贝/毫升。样本至少采集200微升/管，-80℃保存待用。
材料
除非另外说明，否则本文实施例所用的材料均市购获得。本发明所检测的13个检测位点的氨基酸类型及核苷酸序列详见表1。
表1 检测位点
设备及耗材
核酸提取、扩增和检测：Qiacube核酸自动提取仪和实时荧光定量PCR仪
焦磷酸测序：实时定量焦磷酸序列分析仪
Q24MDx
实施例1 病毒核酸的纯化与扩增
1.病毒核酸纯化
按照Qiacube仪器使用指南，在提取仪的指定位置放置裂解液、蛋白酶、RNACarrier、离心管、枪头。在样品区按序加入800μL血清样品，选择设置好的程序，以100μL洗脱液进行洗脱。开始提取。
2.核酸扩增
本实施例采用巢氏PCR法对病毒核酸进行扩增。
逆转录PCR及第一轮扩增：准备RT-PCR反应体系，试剂盒为TaKaRa PrimeScriptTMOne Step RT-PCR kit Ver 2，反应体系如以下表2，扩增引物序列如以下表3所示。
表2 RT-PCR及第一轮扩增反应体系
表3 PCR反应扩增引物
| 引物名称 | 扩增引物序列 | 5’端修饰 |
| Rev-F | TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC(SEQ ID NO:1) | -- |
| Rev-R | CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG(SEQ ID NO:2) | -- |
配完PCR体系后震荡混匀，然后放入离心机中2000转/分钟离心30秒。PCR程序为50℃40分钟,95℃2分钟,30个循环(95℃20秒；55℃30秒；72℃1分30秒)，72℃10分钟，得到病毒样品核酸的RT-PCR扩增产物。
实施例2 焦磷酸测序样本的制备
在本实施例中进行第二轮PCR扩增，使用5种不同的扩增引物，得到5个不同片段的扩增产物。其中，取4μL RT-PCR产物作为第二轮PCR扩增反应模板，反应体系如以下表4所示。第二轮PCR扩增反应进行5组，每组使用的引物分别为Amp1-F/Amp1-R、Amp2-F/Amp2-R、Amp3-F/Amp3-R、Amp4-F/Amp4-R和Amp5-F/Amp5-R，如以下表5所示，共获得5种不同片段的扩增产物。反应所需试剂购自TAKARA公司。
表4 PCR反应体系
| 试剂 | 体积(μL) |
| Ex-taq缓冲液 | 2 |
| dNTP混合物(2.5mM) | 1.6 |
| 正向引物(20uM) | 0.4 |
| 反向引物(20uM) | 0.8 |
| Ex-taq | 0.1 |
| cDNA/DNA模板 | 1.6 |
| DEPC-H<sub>2</sub>O | 多至20 |
表5 PCR反应扩增引物
配完PCR体系后震荡混匀，然后放入离心机中2000转/分钟离心30秒。PCR程序为94℃2分钟，30个循环(94℃20秒；55℃30秒；72℃1分30秒)，72℃10分钟，12℃保持。PCR时间为1.5小时，共获得5种不同片段的扩增产物。
实施例3 焦磷酸测序
根据焦磷酸测序的特点，从来自患者的病毒样品核酸中划分出6个待测区域来进行测序，每个待测区域所对应的野生型序列和突变型序列如以下表6所示，其中也列出了检测位点，用斜体和下划线标明：
表6 待测区域序列野生型和突变型
其中不同待测区域对应的测序引物序列如以下表7所示：
表7 焦磷酸测序引物SP(Seq Primer)
在实施例2中经扩增引物Amp1-F/Amp1-R扩增得到的扩增产物片段既用于测序引物SP1进行针对检测位点L90M的第1待测区域序列的测序，也用于测序引物SP2针对检测位点M41L和E44D的第2待测区域序列的测序，具体对应关系如以下表8所示：
表8 检测位点与测序引物对照表
采用实时定量焦磷酸序列分析仪，型号：
Q24MDx，按照制造商说明书方法和条件进行测序操作，测序引物的杂交条件为：80℃变性90秒，室温自然冷却20分钟。
根据以下表9配制第二轮扩增产物和微珠的混合液：
表9 测序单链模板制备预混液
根据以下表10准备测序引物工作液，混匀后使用。
表10 引物工作液配比
| 测序引物工作液 | 每孔的用量 |
| 退火缓冲液 | 22.5μL |
| 不同待测区域对应的测序引物 | 2.5μL |
在焦磷酸测序中使用的碱基分配顺序如表11所示：
表11 碱基分配顺序
此处“/”代表同一位点可能出现的不同碱基情况。这种碱基的差异有可能是由于突变所致，也有可能是由于自然界中广泛存在的单碱基多样性(SNP)所致。在分配顺序的过程中，首先加入“/”前的碱基，然后加入“/”后的碱基，从而使具有不同突变或不同单碱基多样性(SNP)的样本的测序反应都能够顺利完成。
经过焦磷酸测序得到来自患者的HIV病毒样品的待测区域的序列。
图1是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:25)对来自患者的HIV病毒样品中检测位点(L90M)的基因突变检测结果的部分截图。
图2是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:26)对来自患者的HIV病毒样品中检测位点(M41L和E44D)的基因突变检测结果的部分截图。
图3是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:27)对来自患者的HIV病毒样品中检测位点(D67G和L74V)的基因突变检测结果的部分截图。
图4是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:28)对来自患者的HIV病毒样品中检测位点(K101E和V118I)的基因突变检测结果的部分截图。
图5是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:29)对来自患者的HIV病毒样品中检测位点(Y181C、M184V和G190S)的基因突变检测结果的部分截图。
图6是使用本发明测序引物(SEQ ID NO:30)对来自患者的HIV病毒样品中检测位点(L210M、T215Y和K219N)的基因突变检测结果的部分截图。
经分析，本例样本耐药突变监测结果如表12所示：
焦磷酸测序技术(Pyrosequencing)是一种新型的酶联级联测序技术，该方法根据可见光信号的有无判断核苷酸是否掺入，根据光信号的强弱判断核苷酸掺入的数量。利用常规方法检测耐药突变时，由于技术所限，仅能检测体内优势株(>20％)的突变情况。与常规测序相比，焦磷酸测序重要的优势之一是敏感性高，可定量测序含量小于20％的突变株序列。
目前，HIV耐药性检测和个性化用药越来越受到重视。我国艾滋病患者应用最为广泛的国家免费一线抗病毒药物是由NRTI和NNRTI类药物组成的，本发明的检测位点囊括了RT区针对以上两类药物的主要耐药突变位点。使用本发明的扩增引物和测序引物能实现对目标序列中的临近的多个检测位点同时测序，并取得了较好的检测结果。
设计碱基分配顺序是焦磷酸测序的难点之一，良好的分配顺序有助于排除干扰，减少误差，提高敏感性。在本发明中所使用的分配顺序设计保证能够包括绝大多数潜在变异型，在出现任何未涵盖的变异序列时也能够及时发现并调整适应，并再次测序。
使用本发明的扩增引物和测序引物的方法具有操作快速灵活的优点，在PCR后仅需半个小时即可完成单链的制备和测序工作，得出对应的基因型，从处理血样到得出结果也仅需一天时间。同时，本发明的方法检测成本较低、通量相对较高、灵敏度高，适合临床常规检测的推广。与传统的Sanger测序法比较，本发明的方法的准确性达到100％，具有在临床开展应用检测的广泛前景。
使用本发明的扩增引物和测序引物的方法能够方便的提供可靠的HIV劣势耐药突变信息，对于需要终生服药抑制病毒复制的艾滋病患者，有助于获得常规测序所不能提供的耐药信息，进而直接起始敏感药物治疗，减少治疗失败，延长患者生存时间和生存质量。此外，本发明的方法对于检测潜在的耐药毒株流行，研究病毒耐药机制等具有重要价值。
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序 列 表
<110> 北京博尔晟科技发展有限公司
<120> 一种基于焦磷酸测序的人类免疫缺陷病毒耐药性分析方法
<130> 0190-I
<160> 36
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR反应扩增引物
<400> 1
ttggaaatgt ggaaaggaag gac 23
<210> 2
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR反应扩增引物
<400> 2
ctgtatttct gctattaagt cttttgatgg g 31
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
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<220>
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<400> 3
ggacctacac ctgtcaacat aat 23
<210> 4
<211> 28
<212> DNA
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<220>
<223> PCR反应扩增引物
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<220>
<223> PCR反应扩增引物
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<220>
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<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR反应扩增引物
<400> 7
ttgggcctga aaatccatac aatactcc 28
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<211> 32
<212> DNA
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<220>
<223> PCR反应扩增引物
<400> 8
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<210> 9
<211> 26
<212> DNA
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<220>
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<211> 26
<212> DNA
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<220>
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<210> 11
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<212> DNA
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<220>
<223> PCR反应扩增引物
<400> 11
gcatagaaca aaaatagagg agctaag 27
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PCR反应扩增引物
<400> 12
ccaaaggaat ggaggttctt tctg 24
<210> 13
<211> 21
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒HIV-1
<220>
<223> HIV-1病毒核酸待测区域野生型
<400> 13
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<400> 14
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<211> 22
<212> DNA
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<220>
<223> HIV-1病毒核酸待测区域野生型
<400> 15
tacagagatg gaaaaggaag gg 22
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒HIV-1
<220>
<223> HIV-1病毒核酸待测区域突变型
<400> 16
tacagagttg gaaaaggatg gg 22
<210> 17
<211> 39
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒HIV-1
<220>
<223> HIV-1病毒核酸待测区域野生型
<400> 17
aaagacagta ctaaatggag aaaattagta gatttcaga 39
<210> 18
<211> 39
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒HIV-1
<220>
<223> HIV-1病毒核酸待测区域突变型
<400> 18
aaaggcagta ctaaatggag aaaagtagta gatttcaga 39
<210> 19
<211> 60
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒HIV-1
<220>
<223> HIV-1病毒核酸待测区域野生型
<400> 19
gttaaaaaag aaaaaatcag taacagtact ggatgtgggt gatgcatatt tttcagttcc 60
<210> 20
<211> 60
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒HIV-1
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<223> HIV-1病毒核酸待测区域突变型
<400> 20
gttagaaaag aaaaaatcag taacagtact ggatgtgggt gatgcatatt tttcaattcc 60
<210> 21
<211> 42
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒HIV-1
<220>
<223> HIV-1病毒核酸待测区域野生型
<400> 21
acatagttat ctatcaatac atggatgatt tgtatgtagg at 42
<210> 22
<211> 42
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒HIV-1
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<223> HIV-1病毒核酸待测区域突变型
<400> 22
acatagttgt ctatcaatac gtggatgatt tgtatgtaag tt 42
<210> 23
<211> 37
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒HIV-1
<220>
<223> HIV-1病毒核酸待测区域野生型
<400> 23
gttgaggtgg ggacttacca caccagacaa aaaacat 37
<210> 24
<211> 37
<212> DNA
<213> 人类免疫缺陷病毒HIV-1
<220>
<223> HIV-1病毒核酸待测区域突变型
<400> 24
gtggaggtgg ggactttaca caccagacaa caaacat 37
<210> 25
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 焦磷酸测序引物
<400> 25
gacctacacc tgtcaacata at 22
<210> 26
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 焦磷酸测序引物
<400> 26
gaaaaaataa aagcattagt agaaatttg 29
<210> 27
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 焦磷酸测序引物
<400> 27
cccagaagtc ttgagttctc ttattaagtt c 31
<210> 28
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 焦磷酸测序引物
<400> 28
caattaggaa taccacatcc agcagg 26
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 焦磷酸测序引物
<400> 29
gccttttagg aaacaaaatc cag 23
<210> 30
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 焦磷酸测序引物
<400> 30
ccaaaggaat ggaggttctt tctg 24
<210> 31
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 碱基分配顺序
<400> 31
tggaacgaaa tactgtatga cc 22
<210> 32
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 碱基分配顺序
<400> 32
tgagaaattg aatatggaag atggaatg 28
<210> 33
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 碱基分配顺序
<400> 33
aaagtctact aacgttttcc tccactttag gtagctcgat ccttt 45
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 碱基分配顺序
<400> 34
tagttaagca agaagaaaaa 20
<210> 35
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 碱基分配顺序
<400> 35
agattgcacc ctta 14
<210> 36
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 碱基分配顺序
<400> 36
tctatcatag tccaatacag tggatgatct tgatatgtag agact 45
Claims (7)
1.测序引物和扩增引物组的组合，其中所述测序引物为如SEQ ID NO: 25所示的核苷酸序列，所述扩增引物组包括两条互不相同的扩增引物，分别为如SEQ ID NO: 3和4所示的核苷酸序列。
2.试剂盒，其包括测序引物和扩增引物组，其中所述测序引物为如SEQ ID NO: 25所示的核苷酸序列，所述扩增引物组包括两条互不相同的扩增引物，分别为如SEQ ID NO: 3和4所示的核苷酸序列。
3.测序引物和扩增引物组联用在制备用于基于焦磷酸测序技术检测人类免疫缺陷病毒HIV-1耐药基因突变的方法的组合产品或试剂盒中的用途，其中所述测序引物为如SEQID NO: 25所示的核苷酸序列，所述扩增引物组包括两条互不相同的扩增引物，分别为如SEQ ID NO: 3或4所示的核苷酸序列。
4.如权利要求3所述的用途，其中所述方法包括（1）使用所述扩增引物组对人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸的RT-PCR扩增产物进行PCR扩增；（2）使用所述测序引物对步骤（1）中获得的PCR扩增产物进行焦磷酸测序。
5.如权利要求4所述的用途，其中所述方法还包括提取人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸；和/或使用扩增引物对人类免疫缺陷病毒HIV-1的核酸进行RT-PCR扩增。
6.如权利要求4所述的用途，其中所述耐药基因突变为L90M。
7.如权利要求6所述的用途，其中所述焦磷酸测序的分配顺序为SEQ ID NO: 31。
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