CN110106288B

CN110106288B - 一种检测hiv-1 pr和rt区耐药突变的引物组、方法及其应用

Info

Publication number: CN110106288B
Application number: CN201910394849.4A
Authority: CN
Inventors: 夏雪山; 杨婉汝; 冯悦; 张春月
Original assignee: Kunming University of Science and Technology
Current assignee: Yunnan Keyao Bio Tech Co ltd
Priority date: 2019-05-13
Filing date: 2019-05-13
Publication date: 2021-08-31
Anticipated expiration: 2039-05-13
Also published as: CN110106288A

Abstract

本发明提供了一种检测HIV‑1 PR和RT区耐药突变的引物组、方法及其应用，基于新发现的重组型CRF103_BC同时兼容HIV‑1的B亚型、C亚型、BC重组亚型或CRF01_AE亚型提供一种筛查蛋白酶和逆转录酶基因耐药突变的引物组，并构建用于检测蛋白酶和逆转录酶基因耐药突变的下一代半导体测序技术，对流行病研究或临床用药等具有重要意义。

Description

一种检测HIV-1 PR和RT区耐药突变的引物组、方法及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种检测HIV-1 PR和RT区耐药突变的引物组、方法及其应用，尤其涉及一种检测HIV-1的PR和RT区基因耐药突变的引物组、利用下一代半导体测序技术检测PR和RT区耐药突变的方法及其应用。

背景技术

人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)侵染人体后，会引起获得性免疫缺陷综合症(Acquired Immune Deficiency Syndrome，AIDS)即艾滋病。HIV会直接侵犯人体的免疫系统，破坏人体的细胞免疫和体液免疫，人体免疫系统受到破坏，就会成为许多伺机性疾病的攻击目标，促成多种临床症状。常见症状表现为持续广泛淋巴结肿大，特别是颈、腋和腹股沟淋巴结。淋巴结肿大直径1厘米左右，坚硬、不痛、可移动。HIV不仅使人体的免疫系统难以抵御其侵害，而且给特效治疗药物和预防用疫苗的研制带来困难。

艾滋病毒/艾滋病在全球流行。截至2016年，全球约有3670万人感染艾滋病毒。2016年，约有一半是男性，一半是女性。全球发病率从1997年到2005年迅速下降至每年约260万，但从2005年至2015年保持稳定。2016年新增感染人数1800万人，其中儿童16万人。每天约有5000人感染HIV，其中小于15周岁的儿童约400人，每天约4500名15周岁的成人感染HIV，其中近43％是女性，约37％是年轻人(15～24岁)，约22％是年轻女性(15～24岁)。

艾滋病毒通过三种主要途径传播：性传播、血液传播、母婴传播。高效抗逆转录病毒治疗(Highly Active Antiroviral Therapy)，简称HAART疗法，是目前已被证实的针对艾滋病毒感染者最有效的治疗方法，通过三种或三种以上的抗病毒药物联合使用来治疗艾滋病。用于治疗HIV感染的抗病毒药物，按其作用原理分为核苷类逆转录酶抑制剂(NRTIs)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTIs)、蛋白酶抑制剂(PIs)、融合抑制剂(FIs)、共受体抑制剂(co.receptor inhibitors)和整合酶抑制剂(integrase inhibitors)。这些药物的联合使用大大延长了HIV感染者的存活时间，但与之相伴的耐药性的出现又成为抗病毒治疗失败的最主要原因。

耐药病毒的出现促进了耐药病毒检测方法的发展，而耐药检测的目的在于帮助医师根据患者的个体状况选择最合适的有效治疗方法。目前HIV耐药性的检测方法可分为表型分析法和基因型分析法。

表型分析法是从患者体内直接分离病毒以制得高滴度的毒株，在含有药物的培养液中传代培养，然后直接测定HIV-1在不同浓度抗病毒药物存在时外周血单个核细胞(PBMC)所产生的p24抗原量。根据其剂量-反应曲线得到50％抑制浓度(50％inhibitoryconcentration，IC50)，与标准参比毒株的IC50相比以确定对药物的敏感性。此方法能够比较直观地反映病毒株对药物的敏感情况。但耗时长，操作复杂、费用昂贵。而且在培养过程中还可能诱导出新的突变。

基因型分析法是最常用的方法，也是最早用于HIV耐药检测的方法之一。

基因型分析法首先通过RT-PCR扩增HIV-1毒株的PR基因区全长和RT20～230氨基酸位点，然后以核酸测序为基础，可获得较多的突变信息，但需要较多的扩增产物，若患者血浆病毒滴度过低，常出现扩增失败。目前HIV基因序列的测定主要还是使用Sanger技术。Sanger法作为一代测序技术，其通量低，价格高，效率低，依赖于电泳分离技术，且只能检测20％～30％以上的准种，满足不了日益增长的数据要求。

现在国外市场上已经出现商业化检测试剂盒，成功应用于HIV耐药检测相关临床研究。然而，这些试剂盒对于中国主要流行的CRF01_AE亚型、B亚型、CRF07_BC亚型、CRF08_BC亚型或C亚型以及其它流行重组型病毒株的耐药检测效果并不理想。此外，这种商业化的耐药检测试剂盒价格昂贵，不利于在我国大规模临床应用。而国内一些研究机构自建的In-house方法，虽然对国内的HIV耐药检测起到了一定的作用，但是操作繁琐，操作过程和分析方法不统一，难以真正有效的用于大规模的临床检测。基于以上原因，研制开发一种适用于中国HIV耐药检测的方法迫在眉睫。

通过下一代半导体测序技术，在检测未治疗患者、已治疗的患者以及抗病毒治疗失败或成功的患者体内的劣势耐药方面均有应用，充分证明其在检测耐药劣势突变的优势，为预测患者体内病毒的耐药进化情况和观察耐药性的产生以及发展情况提供依据，也对抗病毒治疗后患者的药物治疗方案选择具有参考价值。

CN105624333A公开了一种检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂主要耐药突变位点的引物，包括检测HIV-1病毒pol基因的突变位点M41L、D67N、K65R、K70R、K70E、M184V、M184I、L210W、T215Y和T215F的ASPCR引物，每个突变位点均包括一对野生型PCR扩增引物及一对突变型PCR扩增引物，每个突变位点引物对的特异上游引物分别为SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20，通用下游引物为SEQ ID NO.21。所述的引物用于检测艾滋病治疗药物核苷类逆转录酶抑制剂的耐药突变位点，具有特异性强、灵敏度高、简便快速、成本低等优点。

CN109439800A公开了一种检测HIV-1基因PR区和RT区基因突变的试剂盒及方法，具体地，本发明公开了一种检测HIV患者血浆中的HIV-1病毒pol基因PR区与RT区基因突变的方法、引物、及包括该引物混合液的试剂盒。本发明基于一代测序平台，具有同时检测突变位点多、准确度高、样本易获取等优点。

随着时间的推移，HIV-1的耐药突变呈增加趋势，因此，提供一种涵盖范围广、兼容多种针对中国流行毒株的PR和RT区基因耐药突变的引物组、筛查方法及其应用具有重要意义。

发明内容

针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提供一种检测HIV-1 PR和RT区耐药突变的引物组、方法及其应用，基于新发现的重组型CRF103_BC同时兼容HIV-1的B亚型、C亚型、BC重组亚型或CRF01_AE亚型提供一种筛查蛋白酶和逆转录酶基因耐药突变的引物组，并构建用于检测PR和RT基因耐药突变的下一代半导体测序技术，对流行病研究或临床用药等具有重要意义。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种检测HIV-1 PR和RT区耐药突变的引物组，所述引物组包括如SEQ ID NO.1-52所示的核苷酸序列。

HIV-1基因组中逆转录酶区(Reverse transcriptase,RT)和蛋白酶区(Protease，PR)发生耐药突变的频率最高，且尚无关于针对中国流行株的相关报道，本发明针对HIV-1的PR区和RT设计一组多重PCR引物组，用于将靶基因片段化，便于测序分析其耐药突变情况，所述引物组的灵敏度高，特异性好，能兼容多种亚型或重组型的HIV-1基因组，更有效地检测中国范围内的HIV-1流行株。

优选地，所述基因型包括HIV-1的B亚型、C亚型、B/C重组亚型或CRF01_AE亚型中的任意一种或至少两种的重组亚型。

优选地，所述B/C重组亚型包括CRF07_BC、CRF08_BC、CRF31_BC、CRF57_BC、CRF60_BC、CRF60_BC、CRF61_BC、CRF62_BC、CRF64_BC、CRF85_BC、CRF86_BC、CRF88_BC或CRF103_BC中的任意一种或至少两种的组合。

本发明中，发明人通过比对B亚型、C亚型、所有BC重组亚型和CRF01_AE亚型的基因序列，设计得到一组引物组，用于多重PCR扩增靶基因，进而构建下一代半导体测序体系，实现高通量，高灵敏度，高特异性地对PR和RT区基因耐药性突变的筛查，检测范围覆盖B亚型、C亚型、所有BC重组亚型、CRF01_AE亚型以及其中任意两种或以上的亚型重组得到的新的独特重组型，其中还涵盖本发明新发现的重组型CRF103_BC，其覆盖范围更广，兼容性更佳，有利于流行病研究或临床辅助诊断等。发明人通过大量序列比对以及实践，得到的引物简并了CRF01_AE/B/C三种基因型的随机重组型，对中国范围内相对流行的HIV-1有较好的特异性与灵敏度。

本发明中，发明人通过长期实践在云南筛查得到多条HIV-1全长序列，云南地区的HIV-1亚型颇具代表性且亚型种类覆盖面最广，其中新发现的287_78、287_65、23_II、287_168四个毒株的全长单独形成一簇，不同于其他的流行重组型(CRF)，其NJ进化树如图1所示。所述四个独特重组型毒株具有相同的基因结构，因此将其命名为新的B/C重组型，即CRF103_BC，以287_65为例，将全长序列经jpHMM分析其基因结构如图2，其余3个样本的基因结构相同。图2中，A区即为目标检测区域-PR和RT区基因，且该区域为B/C重组。

优选地，所述耐药突变的位点包括蛋白类抑制剂耐药突变位点或/和逆转录酶抑制剂耐药突变位点。

优选地，所述蛋白类抑制剂耐药突变位点包括L23I、L24I、D30N、V32I、M46I/L、I47V/A、G48V/M、I50V/L、F53L/Y、I54V/A/S/T/L/M、G73S/T/C/A、L76V、V82A/T/S/F/L/M/C、N83D、I84V/A/C、I85V、N88D/S或L90M中的任一种或至少两种的组合。

优选地，所述逆转录酶抑制剂耐药突变位点包括核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点或/和非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点。

优选地，所述核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点包括M41L、K65R、D67N/G/E、T69D、K70R/E、L74V/I、V75T/M/A/S、F77L、Y115F、F116Y、Q151M、M184V/I、L210W、T215Y/F/I/S/C/D/V/E或K219Q/E/N/R中的任一种或至少两种的组合。

优选地，所述非核苷类逆转录酶抑制剂耐药突变位点包括L100I、K101E/P、K103N/S、V106A/M、V179F、Y181C/I/V、Y188L/C/H、G190A/S/E、P225H或M230L/I中的任一种或至少两种的组合。

本发明中，通过对多重PCR引物组的设计与优化，使其兼容多重中国流行亚型或重组型的HIV-1，能针对PR和RT区的基因耐药突变起到筛查作用，覆盖全部的耐药突变位点，检测更加全面高效。

第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的引物组用于检测HIV-1 PR和RT区基因耐药突变，或制备检测HIV-1 PR和RT区基因耐药突变的试剂或试剂盒中的应用。

第三方面，本发明提供一种检测HIV-1 PR和RT区基因耐药突变的试剂盒，包括如第一方面所述的引物组。

优选地，所述试剂盒还包括HIV-1 PR和RT区基因的RT-PCR引物和多重PCR扩增预混液。

本发明中，所述多重PCR扩增预混液是进行多重PCR反应体系中除了引物和模板以外所有组分之和，提供反应必须的dNTP、缓冲液和酶等，在某一具体实施例中采用的多重PCR扩增预混液为北京艾德莱生物科技有限公司291732AX，但并不局限于此，凡是满足多重PCR反应要求的预混液Mix都可以兼容本发明的筛查方法。

优选地，所述试剂盒还包括阳性质控、阴性质控和ddH₂O。

本发明中，阳性质控为HIV-1RNA阳性样本，包含HIV-1 PR和RT区全部耐药突变位点，所述阴性质控为HIV-1RNA阴性样本，即未发生突变的HIV-1基因。

优选地，所述RT-PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.53-54所示。

本发明的RT-PCR引物具有较高的特异性，能特异性扩增HIV而不与其他干扰基因组发生交叉，同时兼容多种HIV-1亚型的PR和RT区，扩大筛查范围，为后续测序提供良好的模板。

第四方面，本发明提供一种如第三方面所述的试剂盒用于制备检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的产品，或鉴定HIV-1的耐药性中的应用。

第五方面，本发明提供一种HIV-1 PR和RT区基因的基因型或耐药突变的筛查方法，所述方法通过下一代半导体测序技术进行筛查，包括如下步骤：

(1)样品RNA提取；

(2)以步骤(1)所得RNA为模板，逆转录PCR扩增cDNA；

(3)采用多重PCR方法扩增靶基因；

(4)靶基因文库构建；

(5)对步骤(4)所得文库进行下一代半导体测序，筛选对蛋白酶抑制或/和逆转录酶抑制产生耐药的突变位点。

对于HIV耐药检测，我国主要应用的是in-house检测方法，但是这种方法检测不到占HIV-1准种20％以下的劣势突变。所以，急需开发一种新方法以高效、快速、准确地检测HIV-1基因耐药突变以及劣势突变。随着科学技术的发展，也为了建立更有效的HAART方案，基因型分析检测耐药相关突变已广泛应用于临床环境。最近，下一代测序技术的使用极大地促进了这一实践，它以一种经济高效且高度敏感的方式提供了大量数据。值得注意的是，下一代测序技术可以检测由Sanger测序无法检测到的HIV低频率突变，其在病毒群体中的检测限为10-25％。最近使用下一代测序技术进行HIV-1测序的研究能够在病毒群体中检测频率低于1％的低频率突变，从而研究这些低频率突变对治疗效果的影响。此外，通过下一代测序技术进行HIV-1测序有助于分析病毒的遗传多样性、进化和流行过程。通过下一代半导体测序技术，在检测未治疗患者、已治疗的患者以及抗病毒治疗失败或成功的患者体内的劣势耐药方面均有应用，充分证明其在检测耐药劣势突变的优势，为预测患者体内病毒的耐药进化情况和观察耐药性的产生以及发展情况提供依据，也对抗病毒治疗后患者的药物治疗方案选择具有参考价值。由此，我们建立了基于下一代测序技术对HIV-1耐药突变基因的测序方法和体系。

优选地，步骤(5)所述半导体测序采用314半导体芯片进行测序。

本发明中，利用多重PCR对靶基因进行扩增后，在下一代半导体测序平台的基础上，采用314半导体芯片对靶基因进行大规模的测序，利用Life Technologies公司不同通量的芯片，一次可检测最多96个样本的16个靶基因，大大降低了每个样品的检测成本，具有通量高、成本低、灵敏性好、准确性高等特点。314芯片是一种DNA芯片，Ion PGM^TM System测序平台是依据芯片进行数据的读取，本发明某一实施例中具体应用的为赛默飞公司的芯片，全称“Ion 314chip”，其读取的数据量大小适中，约100M，满足实验的情况下价格低廉，但需要说明的是，根据芯片读取数据量的不同，本领域技术人员可以自行选择其他芯片进行实验，例如316芯片、318芯片等。

优选地，步骤(2)所述逆转录PCR的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.53-54所示。

优选地，步骤(3)所述多重PCR的反应体系包括5×多重PCR Mix、如第二方面所述的引物组和模板cDNA。

本发明通过设计多重PCR引物，构建得到的文库，再通过下一代半导体测序技术，实现对HIV-1 PR和RT区基因耐药突变的筛查，检测的突变位点全面，灵敏度高，不仅兼容现有技术中的B亚型、C亚型、所有BC重组亚型、CRF01_AE以及所述亚型间的进一步重组亚型，还能检测出新发现的CRF103_BC，覆盖的范围更广，对于流行病研究或辅助临床诊断、用药指导等具有重要意义。

本发明中所述5×多重PCR Mix包含多重PCR反应所必须的酶、缓冲液、dNTP等原料，典型非限定地可以是北京艾德莱生物科技有限公司生产的291732AX。

优选地，所述引物组的终浓度为5-20μM，优选为10μM。

优选地，所述模板cDNA的终浓度为100-1000ng/μL，例如可以是100ng/μL、150ng/μL、200ng/μL、250ng/μL、300ng/μL、350ng/μL、400ng/μL、450ng/μL、500ng/μL、550ng/μL、600ng/μL、650ng/μL、700ng/μL、750ng/μL、800ng/μL、850ng/μL、900ng/μL、950ng/μL或1000ng/μL。

优选地，所述多重PCR的反应条件为：

(1’)94-97℃预变性5分钟；

(2’)94℃变性30秒，50-55℃退火25-30秒，72℃延伸40-50秒，共35-40个循环；

(3’)72℃延伸5分钟。

优选地，所述方法具体包括如下步骤：

(1)样品RNA提取；

(2)以步骤(1)所得RNA为模板，逆转录PCR扩增cDNA：

A)混合反应体系：2×1Step Buffer，PrimeScript 1Step Enzyme Mix，RNaseFree dH₂O，RT-PCR引物和RNA模板；

B)逆转录PCR的反应条件为：(a)50℃逆转录25-30分钟；(b)94℃预变性5分钟；(c)94℃变性25-30秒，50-55℃退火25-30秒，72℃延伸1.5-2.5分钟，共35-40个循环；(d)72℃延伸3-6分钟；

(3)采用多重PCR方法扩增靶基因：

A’)多重PCR的反应体系为：5×多重PCR Mix，第一方面所述的引物组，ddH₂O和模板cDNA；

B’)多重PCR的反应条件为：(a’)94-97℃预变性5分钟；(b’)94℃变性30秒，50-55℃退火25-30秒，72℃延伸40-50秒，共35-40个循环；(c’)72℃延伸5分钟；

C’)对每个样品进行柱纯化，去除反应液和杂质，得到180～380bp的多条DNA，再将此DNA溶液经磁珠纯化后进行定量检测，并将每个样品统一到相同浓度进行下一步操作；

(4)靶基因文库构建：

A”)将相同浓度的每个样品进行DNA的末端修复，补为平末端；

B”)每个样品加上特异性的barcode序列标签接头和通用的测序接头；

C”)将加了接头的DNA片段应用通用引物进行8-10个循环的PCR扩增反应；

(5)对步骤(4)所得文库纯化定量后，进行下一代半导体测序，以HIV-1参考株HXB2的2253-3539bp的碱基序列为参考序列，筛选对蛋白酶和逆转录酶抑制产生耐药的突变位点。

本发明某一实施例中选择的下一代测序平台为Ion Torrent测序平台，相比于其他下一代测序方法，此方法较简单快捷，灵敏度高，通量高，结果准确可靠且不需要光学系统。而且模板的DNA片段化是选择的多重PCR方法，相比于超声机械片段化和酶切两种方法，此方法得到的片段大小根据引物设计决定，大小可控，可符合测序需要的100～400bp大小的片段，所以此方法得到的片段化DNA更有利于进行下一代测序与结果的分析。

作为本发明的最优方案，筛查HIV-1 PR和RT区基因的基因型或耐药突变的方法包括以下步骤：

(1)样品RNA提取；

(2)以步骤(1)所得RNA为模板，逆转录PCR扩增cDNA：

A)逆转录PCR的反应体系为：2×1Step Buffer 6μL，PrimeScript 1Step EnzymeMix 0.5μL，RNase Free dH₂O 1μL，10μM的上下游引物各1μL，RNA模板2μL，共11.5μL体系；

B)逆转录PCR的反应条件为：(a)50℃逆转录30分钟；(b)94℃预变性5分钟；(c)94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸2.5分钟，共40个循环；(d)72℃延伸5分钟；

(3)采用多重PCR方法扩增靶基因：

A’)多重PCR的反应体系为：5×多重PCR Mix 4μL，10μM的上下游引物的预混液4μL，ddH₂O 10μL，模板cDNA 2μL，共20μL体系；

B’)多重PCR的反应条件为：(a’)94℃预变性5分钟；(b’)94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，共40个循环；(c’)72℃延伸5分钟；

(4)靶基因文库构建：

C”)将加了接头的DNA片段应用通用引物进行8个循环的PCR扩增反应；

(5)对步骤(4)所得文库纯化定量后，进行下一代半导体测序，以HIV-1参考株HXB2的2253-3539bp的碱基序列为参考序列，筛选对蛋白酶抑制或/和逆转录酶抑制产生耐药的突变位点。

第六方面，本发明提供一种如第五方面所述的筛查方法筛选得到的突变基因。

第七方面，本发明提供一种包括第六方面所述突变基因的核酸片段。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明提供的用于检测HIV-1 PR和RT区基因的基因型或耐药突变的引物组能用于扩增得到B亚型、C亚型、所有BC重组亚型、CRF01_AE以及其进一步重组得到的重组型的PR和RT区短序列，序列长度均在180-380bp，涵盖了所有的PR和RT区耐药突变位点；

(2)本发明在下一代半导体测序平台的基础上，采用314半导体芯片对靶基因进行大规模测序，一次可检测多个样本，具有简便、快速、经济等特点，大大降低了每个样品的检测成本；

(3)本方法利用下一代半导体测序技术HIV-1 PR和RT区基因耐药突变的筛选，适用性广，通量高，准确性好，且一次可以检测出多个样本的耐药突变位点，为不同HIV-1亚型基因耐药情况的检测提供了简便方法。

附图说明

图1为四个独特重组型287_78、287_65、23_II和287_168的NJ进化树；

图2为287_78的全长序列经jpHMM分析得到的基因结构图，A区为蛋白酶和逆转录酶区；

图3为实施例3中多重PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，Maker的最大量程为500bp，左边为10个样本引物池1(pool-1)的电泳结果，右边为10个样本引物池2(pool-2)的电泳结果；

图4为实施例6中应用314芯片进行下一代半导体芯片测序的ISP热图报告；

图5为实施例6中应用314芯片进行下一代半导体芯片测序的ISP统计分析报告；

图6为实施例6中应用314芯片进行下一代半导体芯片测序的读长直方图报告；

图7为实施例6中应用314芯片进行下一代半导体芯片测序结果与参考靶基因比对分析报告；

图8为实施例6中应用314芯片进行下一代半导体芯片测序准确率统计分析报告；

图9为实施例6中07_BC-1下一代半导体芯片测序IGV分析结果中第115号氨基酸突变情况；

图10为为实施例6中07_BC-1下一代半导体芯片测序IGV分析结果中第106号氨基酸突变情况；

图11为为实施例6中07_BC-1下一代半导体芯片测序IGV分析结果中第70号氨基酸突变情况；

图12为测试例3中A组样本的多重PCR电泳结果；

图13为测试例3中B组样本的多重PCR电泳结果。

具体实施方式

为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。

以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术人员应当掌握使用常规材料及仪器的相关知识。

实施例1引物设计及优化

1、逆转录PCR(RT-PCR)引物设计

a.通过HIV Databases下载HIV-1 PR/RT区基因，包括B型、C型、CRF 01_AE各10个基因序列，以及B/C重组型、01_AE/B重组型、01_AE/C重组型和01_AE/B/C重组型各3个基因序列，整合成一个txt文档，通过clustalx软件进行比对，选取可以包含PR和RT基因区10个耐药突变位点的保守区序列来设计包含简并碱基的引物，再经过Primer Select软件分析其GC含量、Tm值、发夹结构以及引物二聚体，全部合格才说明引物初步设计完成。

b.设计的引物简并了CRF 01_AE/B/C三种基因型的随机重组型，这也是在中国HIV-1相对流行的基因型，这样的引物扩增效率更高，适用性更广。

本发明中，用于扩增HIV-1 Pol区的PR和RT区段，相对于HXB2基因组的2253-3539bp的碱基序列的RT-PCR引物对如SEQ ID NO.53-54所示：

正向引物(SEQ ID NO.53):5’-TTGGAAATGTGGAAAGGAAGGAC-3’；

反向引物(SEQ ID NO.54):

5’-CTGTATTTCTGCTATTAAGTCTTTTGATGGG-3’.

2、多重PCR引物设计

a.通过HIV Databases下载云南地区近几年的HIV-1的PR和RT区基因，包括B型、C型、CRF 01_AE、CRF 07_BC、CRF 08_BC各一个基因序列，用320个碱基G将5基因隔开，整合成一条序列。将此序列导入Ion AmpliSeq Designer系统，会生成一定的引物对数和序列以及引物的分组情况。

b.通过HIV Databases下载具有代表性的B型、C型、CRF 01_AE、CRF 07_BC、CRF08_BC各50个PR和RT区基因序列，包含步骤a下载的5个基因序列，各自整理成一个txt文档，共五个txt文档通过clustalx软件进行比对。将步骤a设计的各引物以比对后的文件为参考加入简并碱基，得到26对含有简并碱基的多重PCR引物。

c.设计的多重PCR引物包含了许多简并碱基，基本可以扩增所有的B型、C型、CRF01_AE、CRF07_BC、CRF08_BC基因样本，而且可以扩增CRF 01_AE/B/C三种基因型间随机重组型的PR和RT区基因，这都是在中国HIV-1相对流行的基因型，这样的引物扩增效率更高，适用性更广，设计得到的多重PCR引物组如表1所示，共26对优化的引物。

表1多重PCR引物序列

将B型、C型、CRF01_AE以及众多B/C重组型的基因序列输入Ion AmpliSeqDesigner系统设计引物时不能涵盖简并碱基，因此选择国内流行亚型和重组型进行引物设计，即B亚型、C亚型、CRF07_BC、CRF08_BC和CRF01_AE亚型，设计得到的26对引物(表1)。

表1中的多重PCR引物为经过简并优化后的引物，考虑多种HIV-1亚型或重组型的基因序列，软件设计出的引物数量多且引物之间容易相互影响，具体实践中导致多重PCR扩增效率不高、非特异性产物较多，发明人通过对所有引物的所有碱基进行逐个分析并逐次简并优化，对简并碱基出现的位置、数量、对应的引物进行大量摸索，最终确定如表1所示引物序列，使得多重PCR引物扩增效率一致，减少非特异性扩增，能够用于检测B亚型、C亚型、所有B/C重组亚型或CRF01_AE亚型中的任一种，或至少两种的进一步重组亚型。

实施例2样品RNA的提取

在云南省传染病专科医院收集的10例通过HAART治疗的艾滋病患者(患者知情，收集人口统计学资料)通过下一代半导体测序技术对HIV-1 PR/RT区基因耐药突变情况进行筛查，此10例样本包括通过Sanger测序结果确定的五种亚型：CRF01_AE亚型、B亚型、CRF07_BC亚型、CRF08_BC亚型和C亚型，每种亚型包括1个Sanger测序结果耐药样品与1个Sanger测序结果不耐药样品。

本实施例中应用商业化的TIANamp Virus RNA Kit(TIANGEN，北京)对患者血浆进行RNA的提取(具体做法详见说明书)。

实施例3逆转录PCR与多重PCR反应

1、逆转录PCR

以实施例2所得RNA为模板进行RT-PCR，反应体系见表2，反应条件见表3.

表2 RT-PCR反应混合液组分

表3反应条件

由SEQ ID NO.37-38所示引物对扩增出的产物长度为1511bp，采用的DNA聚合酶为TaKaRa公司的PrimeScript 1Step Enzyme。

2、多重PCR反应

多重PCR是在同一个PCR反应体系里加上二对以上的扩增引物，通过程序运行同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。由于二代测序对模板的长度要求在100～400bp之间，所以我们通过引物设计软件设计出适当大小的条带进行多重PCR扩增。为了增加体系稳定性，发明通过大量实践验证，将本发明表1所述26对引物分为两个引物池可以更好的实现扩增，具体地，引物池1为B.2、B.4、C.1、C.3、C.5、01_AE.1、01_AE.3、01_AE.5、07_BC.2、07_BC.4、08_BC.2、08_BC.4共12对引物，引物池2为B.1、B.3、B.5、C.2、C.4、C.6、01_AE.2、01_AE.4、07_BC.1、07_BC.3、07_BC.5、08_BC.1、08_BC.3、08_BC.5共14对引物，先将2个引物池的引物对分别进行预混后再进行PCR扩增反应体系的配制。以步骤1所得逆转录PCR反应产物为模板DNA进行多重PCR反应，反应体系见表4，反应条件见表5.

表4多重PCR反应体系

试剂成分Reagent	体积Volume(μL)
		反应预混液Mix(TaKaRa/Aidlab)	4
ddH<sub>2</sub>O	10
		引物(Pool-1或Pool-2预混液)	4
RT-PCR反应产物	2
		总体积	20

表5多重PCR反应条件

3、多重PCR扩增结果检测

多重PCR反应结束后，将反应产物进行水平琼脂糖凝胶电泳检测。应用2％的琼脂糖凝胶，取3μL多重PCR产物，与2μL loading buffer混匀，缓慢加入胶孔中，并在第一个电泳孔中加入DNA Marker 1000，调试电泳电压为120V恒压进行电泳，电流180mA，约30min后观察结果。电泳结束后，在凝胶成像仪上观察有无目的条带，鉴定扩增结果，结果见图3。

由图3可知，将引物分为两个引物池进行多重PCR扩增，10个样本都可以有效地扩增出目的条带，条带清晰，大小与目的条带一致，说明26对多重PCR引物成功进行了模板的扩增。

4、多重PCR产物的纯化

1)产物柱纯化

应用普通DNA产物纯化试剂盒(TIANGEN，北京)将多重PCR产物进行纯化，最大限度除去蛋白质、离子及引物小片段等杂质。

2)DNA浓度检测

将每个样品的2个反应体系(即每个样品包括引物池1与引物池2进行扩增的体系)分别测浓度，然后将两个体系等浓度混合。

3)磁珠纯化

对每个样品用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)进行磁珠纯化，加入15μL的ddH₂O用于洗脱。

4)产物定量

将纯化产物用Life Technologies公司的Qubit 2.0定量仪对其进行定量，定量后，将每个样品取100ng进行下一步。

实施例4靶基因文库构建

将多重PCR纯化产物进行文库构建的大致步骤为：样品纯化→末端修复→纯化→添加接头→纯化→文库扩增→纯化→文库稀释。应用赛默飞公司Ion Plus FragmentLibrary Kit提供的标准方案进行，为实现上述技术方案，按以下操作步骤进行：

1、采用实施例3纯化产物进行末端修复，根据表6所示体系，10个样本分别在1.5mL的EP管中混合体系，吹打混匀，避免气泡产生，室温放置20min。

表6末端修复的反应体系

试剂组分	每个反应管用量
		样本DNA	100ng
5×末端修复缓冲液	20μL
		末端修复酶(End Repair Enzyme)	1μL
ddH<sub>2</sub>O	XμL
		总共	100μL

2、对修复后的产物进行纯化，用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)进行磁珠纯化，加入25μL的Low TE进行洗脱。

3、连接adapters和barcode序列标签

按照表7所示体系在PCR管中配制体系：

表7接头添加过程的体系

注：X＝接头编号；Ion P1Adapter处于接头试剂盒中，区别于建库试剂盒中的Adapters。

混合好体系后，吹打混匀瞬时离心，置于PCR仪中，反应条件为25℃反应15min，72℃5min，4℃至多保存1h。程序运行结束后，将PCR管中溶液转移至干净的EP管中。

4、添加接头后的纯化

对连接后的产物进行纯化，用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)进行磁珠纯化，加入20μL的Low TE进行洗脱。

5、文库扩增

将上一步洗脱后的PCR文库进行扩增，配制扩增反应体系如表8所示：

表8文库的扩增体系组分

文库扩增的反应液混匀后将体系分为两管，每管65μL进行文库的扩增。PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；8个循环中包括95℃变性15s、58℃退火15s和70℃延伸1min，4℃可保存1h。反应结束后，将两个PCR管中的液体全部转移到一个干净的EP管中。

6、扩增结束后，用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)进行磁珠纯化，加入20μL的Low TE进行洗脱。

7、文库定量

将纯化产物用Life Technologies公司的Qubit 2.0定量仪对其进行定量，定量后，将每个样品的文库稀释至100pM，计算公式如下：

其中c为样品浓度(ng/μL)；n为文库片段大小(bp)；m为1μL原始文库稀释倍数。将构建好的文库稀释后，每个文库样品取5μL放置于同一个1.5mL的EP管中，混合均匀后，置于4℃待用。

实施例5油包水PCR与模板富集(OT2与ES)

1、油包水PCR反应

首先，将试剂从-20℃取出后置于于冰上融解，融解后震荡5s，瞬离后重置冰上，开始配制体系，所需试剂与配制比例如表9所示。

表9

试剂	体积
		ddH<sub>2</sub>O	48μL
Ion PGM Hi-Q View Enzyme Mix	50μL
		实施例4所得待用文库	2μL
Ion PGM Hi-Q View ISPs	100μL
		Ion PGM Hi-Q View Reagent Mix	800μL
总共	1000μL

将扩增反应液配制完成后，震荡5s混合均匀，瞬离2s后，缓慢加入到反应器中，再缓慢向反应器中加入1.7mL的Ion OonTouch Reaction Oil，然后放置到进行油包水PCR反应的OT2上进行反应，约6.5h后反应结束，在OT2仪器上按下run，将硅胶珠进行离心，吸走上清，每管留约100μL，放置4℃备用。

2、模板富集

首先进行用来富集所用试剂的准备，包括Melt-Off Solution、Dynabeads MyOneStreptavidin C1Beads的配制，然后将上一步油包水PCR反应产物与配制的试剂加入相应的八连排管中，用ES仪器对含有DNA模板的硅胶珠进行富集，大约35min后结束反应，放置4℃准备上机测序。

实施例6上机测序

当OT2程序结束之后，要准备Ion PGM^TM System测序。首先对PGM仪器进行水洗与氯洗，再进行初始化，然后进行314芯片的检查与加样，最后进行上机测序。测序过程中所应用的试剂来自于Life Technologies公司，测序所有步骤参照Life Technologies公司的测序流程。具体步骤如下：

1.测序Plan的创建

将电脑用网线连接到PGM服务器上，在服务器中上传参考序列文件和靶向文件，在Ion Torrent Server的Plan中选择Templates后继续选择AmpliSeq DNA，点击Create Plan后按照提示、所使用试剂和测序目的来创建Plan，全部设置完成后点击Plan Run将Plan上传至服务器中以供使用。

2.Ion PGM^TM System的开机前准备及测序用清洗瓶的预处理

先打开氮气总阀门再调节压力阀，使指针处于10每小时空气变化；按机器正面的开机按钮等待仪器开机；将测序程序运行时用的瓶W1、W2和W3使用18MΩ水涮洗三遍，并将W2中添加18MΩ水直至瓶子最上方的刻度线；按照相同方法涮洗2个1L的玻璃瓶，并添加18MΩ水至瓶子最上方的刻度线，将测序前清洗用瓶W2、W3、水洗瓶和氯洗瓶用18MΩ水涮洗三遍。(注：第一次使用W2测序用瓶时，需要进行预处理才能使用，预处理步骤如下：将装有2L18MΩ水的新测序用瓶W2中加入整瓶的Wash 2 Bottle Conditioning Solution，混匀后室温放置至少8h后丢弃溶液才可正常使用。)

3.Ion PGM^TM System的水洗

①点击主界面上“Clean”，勾选“18MΩwater cleaning”后点击“Next”。

②清空清洗用瓶W2、W3和废液缸中的残余液体，将W2、W3和装有250mL 18MΩ水的水洗瓶安装至对应位置；确保dNTP接口处吸管下面放置有收集废液的废液缸；确保有一张水洗芯片在PGM仪器上。

③继续点击“Next”，根据提示进行检查，检查无误后进行水洗程序，待水洗结束后点击“Next”返回主界面。

4.Ion PGM^TM System的氯洗

①将装有1L 18MΩ水的氯洗用玻璃瓶中加入一整片Ion Cleaning Tablet，待其完全溶解后加入1mL1M的NaOH溶液，上下颠倒混匀后用0.22或0.45μm的滤膜过滤出250mL的氯液至氯洗瓶中待用。

②点击主界面上“Clean”选项后勾选“Chlorite cleaning”，点击“Next”。

③清空清洗用瓶W2、W3和废液缸中的残余液体，将W2、W3和装有250mL氯水的氯洗瓶安装至对应位置；确保dNTP接口处吸管下面放置有收集废液的废液缸；确保有一张氯洗芯片在机器上。

④继续点击“Next”，根据提示进行检查，检查无误后进行氯洗程序。

⑤氯洗结束后，清空清洗用瓶W2、W3和废液缸中的残余液体，将W2、W3和装有250mL18MΩ水的水洗瓶安装至对应；确保dNTP接口处吸管下面放置有收集废液的废液缸；确保有一张水洗芯片在机器上。

⑥点击“Next”进行水洗，水洗结束后点击“Next”返回主界面。

5.Ion PGM^TM System的初始化

①初始化试剂的配制

W1的配制：清空润洗后的残留液体，添加350μL新配的100mM的NaOH。W2的配制：在已经添加2L的18MΩ水的W2中，加入一整瓶的Ion PGM^TM Hi-Q^TM View SequencingW2Solution和70μL新配的100mM的NaOH，立即拧紧盖子，上下颠倒5次混匀。W3的配制：清空润洗后的残留液体，添加50mL的Ion PGM^T ^MHi-Q^TM View Sequencing W3 Solution。

②初始化

确保Ion PGM^TM System中有一张水洗芯片，注意不要移除dNTP接口处吸管并保证下方有废液缸。主界面上点击“Initialize”后，下拉选择“Ion PGM^TM Hi-Q^TM ViewSequencing Kit”；点击“Enter barcode”后扫描Ion PGM^TM Hi-Q^TM View SequencingW2Solution bottle上的条形码或输入编号。点击“Next”仪器会检查气压，检查显示气压充足后，换上干净的手套，更换W1、W2和W3处吸管，同时将配制好的W1、W2和W3安装在对应位置。点击“Next”，按照提示进行检查，检查无误后，进行pH的调节。

将四种dNTP取出置于冰上溶解，溶解后涡旋混匀瞬时离心置于冰上备用。取出4个新的Reagent Bottles并分别贴上标签：dGTP、dCTP、dATP和dTTP。按照Reagent Bottles管上标记，分别加入20μL的dNTP，冰上放置待用。

待初始化完成后，按照屏幕提示将dNTP接口处的旧吸管移除，更换新手套后安装新的吸管，同时将标记有dGTP、dCTP、dATP和dTTP的Reagent Bottles按照Ion PGM^TM System上标记的顺序依次进行安装。点击“Next”，按照提示检查是否完成所述操作，如果各项指标均通过，屏幕会显示绿色的“PASS”，点击“Next”后返回主界面。

6.测序步骤

①添加Control ISPs：涡旋Control Ion Sphere^TM Particles至少30s后瞬离，吸取5μL加入到2.4.9中制备的阳性ISPs中。

②测序引物的添加：将上一步ISPs吹打混匀后15500g离心2min；环吸留15μL。加入12μL的Sequencing Primer使总体积达到27μL。吹打混匀瞬离后置于PCR仪上运行程序：95℃ 2min，37℃ 2min，程序运行结束后置于常温备用。

③芯片检查：点击主界面的“Run”，根据提示清除废液缸中的废液后点击“Next”，确保有一张干净的水洗芯片在仪器中后点击“Next”，仪器将进行清洗管路的操作。清洗完成后，选择OT2程序所用的试剂盒，点击“Next”。脱去手套去静电后拆开一张新的314芯片标记后放入仪器中，点击“Next”。扫描芯片外包装上的条形码，检查外包装上条形码与屏幕中显示的条形码是否一致，确认一致后点击“Chip Check”；当芯片检查成功后点击“Next”，取下芯片放入Ion centrifuge adapter/rotor篮中，同时将水洗芯片再次放入PGM仪器中。

④向②中常温备用的的ISPs中加入3μL的Ion PGM^TM Hi-Q^TM View SequencingPolymerase使总体积达到30μL，吹打混匀后室温放置5min备用。

⑤芯片加样：使芯片与桌面呈45°并保持加样孔在下方，将枪头垂直于芯片表面插入加样孔后尽量吸干净芯片中的液体，随后将芯片倒置标签朝里置于Ion centrifugeadapter/rotor篮中离心5s以除净芯片中的液体。将芯片水平放置，吸取10μL上一步备用的ISPs，不锁枪，将枪头垂直于芯片表面插入加样孔，通过旋转移液枪旋钮进行加样，保持每秒1μL的速率加样，为了避免气泡的进入，剩余0.5μL不打入芯片中。将芯片正置标签朝里放置在Ion centrifuge adapter/rotor篮，离心30s，再将芯片正置标签朝外，离心30s，从Ioncentrifuge adapter/rotor篮中取下。

使芯片与桌面呈45°并保持加样孔在下方，将枪调至5μL后，枪头垂直于芯片表面插入加样孔后慢慢吹吸1次，避免产生气泡，随后尽量吸除残余的液体。将芯片倒置标签朝里离心5s以除去残留液体。最后将添加好样品的芯片放入Ion PGM^TM System中点击“Next”。

⑥测序计划的选择及运行：点击“Browse”选择第一步中创建的程序，点击“Next”后会出现所创建程序的相关信息，检查是否有误，确认无误后，按照提示进行选择，开始进行测序。

⑦测序结束后返回主界面，进行水洗，水洗结束后关闭Ion PGM^TM System(依次点击“Tool”、“shutdown”，出现水洗界面后，点掉18MΩ水洗前的“√”，点“Next”关机结束)。

7.测序数据的处理

测序结束后，在Ion Torrent Server服务器中查看ISP热图报告、统计分析报告、读长直方图报告以及fast QC等报告，确定结果的可取性。若测序结果可用，下载所需处理的数据，主要包括BAM/BAI/VCF等文件。将BAM文件用IGV可视化软件打开，查找耐药位点上的突变情况，结合VCF文件进行耐药位点突变情况的统计，通过一次应用314芯片的半导体测序反应，测序结果中，图4-8所示，10个样品共获得93.2M的数据量，共计508,356条序列，序列平均长度183bp，1×覆盖度的碱基读取准确率为98.9％，平均测序深度为1388.7×。图9-11说明了下一代半导体芯片测序IGV分析结果中的部分氨基酸位点碱基突变情况。

图4为半导体芯片测序的ISP热图报告，由图4可知，314半导体芯片表面约有1,474,560个微孔，在进行芯片加样时覆盖了1,105,920个微孔，覆盖率达75％，测序关键信号为82％，一共获得93.2M的数据量。

图5为半导体芯片测序的ISP统计分析报告，93.2M的数据量中，可用的reads数约为54％。芯片表面含有模板的微孔为75％，其中有100％含有阳性模板，在这些含有阳性模板的珠子中，64％含有单一模板。在64％含有单一阳性模板的珠子上，有84％为测序质量较好的微孔。最后经过滤可得到508,356条可用的reads数。

图6为半导体芯片测序的读长直方图报告，该图的reads为过滤后的分布密度图，从图中可以看出大部分的reads主要集中于200-300bp，测序质量较高，平均长度为183bp。

图7为半导体芯片测序结果与参考靶基因比对分析报告，由图7可知测序后的碱基序列与导入的HIV参考序列HXB2的PR和RT区基因组比对的结果，98％的碱基序列能比对上，2％不能比对上。这2％分为两种碱基序列，一种是测序深度较低而导致测序不准确的序列，另外一种是发生变异的序列。

图8为半导体芯片测序准确率统计分析报告，即测序深度为1×时，不同长度reads的测序准确率，由图8可知，本发明方法的平均测序准确率为98.9％。

图9为07_BC-1下一代半导体芯片测序IGV分析结果中第115号氨基酸突变情况，密码子由TAT变为TTT，导致氨基酸由酪氨酸变为了苯丙氨酸(Y115F)，导致对核苷类逆转录酶抑制剂产生耐药。

图10为07_BC-1下一代半导体芯片测序IGV分析结果中第106号氨基酸突变情况，密码子由GTA变为ATG，导致氨基酸由缬氨酸变为了甲硫氨酸(V106M)，导致对非核苷类逆转录酶抑制剂产生耐药。

图11为07_BC-1下一代半导体芯片测序IGV分析结果中第70号氨基酸突变情况，密码子由AAA变为GAG，导致氨基酸由赖氨酸变为了谷氨酸(K70E)，导致对核苷类逆转录酶抑制剂产生耐药。

测试例1

将实施例6得到的测序数据以HXB2为参考序列，通过10个样本在43个耐药位点上的reads值(表10)，分析10个样本耐药突变情况，并与Sanger测序结果进行对比。通过下一代半导体测序技术，检测出Sanger测序未检出的耐药突变位点，并且将下一代半导体测序与Sanger测序耐药突变检测结果进行对比，结果如表11所示。

表10

表10说明在PR/RT区的43个主要耐药突变位点上，均有很高的覆盖值，根据IGV软件与参考序列对比，分析每个位点上的突变频率，突变频率分析结果如表11所示。

表11

由表11可知，通过本发明设计的RT-PCR引物、多重PCR引物组配合下一代半导体测序技术，可以检测出Sanger测序检测不到的低频率耐药突变位点，也可以对Sanger测序的结果起到纠正作用。

测试例2

选择10个经过Sanger测序结果显示基因型为URF(独特重组型)的样本，经过上机测序，分析各位点的reads值如表12所示。

表12 10个URF样本各耐药位点上的reads值

表12说明，PR/RT区43个位点耐药位点上均有大于10×的reads值，说明本发明方法可以覆盖多数HIV-1亚型及重组型。

此外，由测试例1和测试例2共试验20个样本，均显示PR/RT区43个耐药位点上有reads值，证明了本发明方法可以覆盖所有PR和RT区突变位点。

测试例3多重PCR产物的特异性验证

为了验证此多重PCR引物的特异性，特别设计两组对照实验，与实施例3相比，除了待测样本不同，其他条件同实施例3，两个对照组模板设计如下：

A.选取HIV、HBV、HCV、KSHV、HSV五种病毒的核酸，进行多重PCR，电泳结果见图12；

B.选取已知重组型样品78_cpx(1个)、96_cpx(1个)、64_BC(2个)、85_BC(2个)、86_BC(2个)、100_01C(3个)和鉴定为独特重组型(URF-3个)，进行多重PCR扩增，电泳结果见图13.

由图12可知，只有HIV样本对应的泳道有目的条带出现，证明本发明设计的RT-PCR引物配合多重PCR引物可以特异性识别HIV病毒的核酸，而其他易与HIV-1共感染的样本无目的条带出现。

由图13可知，HIV-1的不同亚型或重组型对应的泳道均出现目的条带，而阴性对照无条带，证明本发明的设计的RT-PCR引物配合多重PCR引物可以兼容多种HIV-1的亚型和重组型，覆盖范围广。

实施例7检测HIV-1 PR和RT区基因耐药突变的试剂盒

试剂盒包括如下成分：

检测HIV-1 PR和RT区基因耐药突变的RT-PCR引物，核苷酸序列如SEQ ID NO.53-54所示；

多重PCR引物预混液1，包括如SEQ ID NO.3-4、SEQ ID NO.7-8、SEQ ID NO.11-12、SEQ ID NO.15-16、SEQ ID NO.19-20、SEQ ID NO.23-24、SEQ ID NO.27-28、SEQ ID NO.31-32、SEQ ID NO.35-36、SEQ ID NO.39-40、SEQ ID NO.45-46、SEQ ID NO.49-50所示的引物；

多重PCR引物预混液2，包括如SEQ ID NO.1-2、SEQ ID NO.5-6、SEQ ID NO.9-10、SEQ ID NO.13-14、SEQ ID NO.17-18、SEQ ID NO.21-22、SEQ ID NO.25-26、SEQ ID NO.29-30、SEQ ID NO.33-34、SEQ ID NO.37-38、SEQ ID NO.41-42、SEQ ID NO.43-44、SEQ IDNO.47-48、SEQ ID NO.51-52所示的引物；

5×多重PCR Mix；

阳性质控(-20℃)：HIV-1RNA阳性样本经表1中26对引物单独扩增出26个目的片段的胶回收产物，此阳性质控包含HIV-1 PR/RT区所有耐药突变位点。

阴性质控(-20℃)：HIV-1RNA阴性样本，并且经过表1中26对引物单独扩增也为阴性，阴性质控上机测序结果显示和参考序列无可比对基因；

ddH₂O以及说明书。

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 昆明理工大学

<120> 一种检测HIV-1 PR和RT区耐药突变的引物组、方法及其应用

<130> 2019

<160> 54

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 1

actctttggs arcgacccmt 20

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 2

ttaacyyttg ggccatccat tcc 23

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 3

gytgcacttt aaattttccy attagtccta 30

<210> 4

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 4

yacatcyarg actgwyrydg atttrytctt 30

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 5

tgggaagttc arttaggaat accacatc 28

<210> 6

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 6

yaacaratgy tstctyagtt cctct 25

<210> 7

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 7

tagsmtctga cttagaaata grgcarcay 29

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 8

ttaacyyttg ggccatccat tcc 23

<210> 9

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 9

tggcacydyt ataggctgta ct 22

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 10

ctgtatttct gctattaagt cttttgatgg g 31

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 11

ccctkgtywc aataararta gg 22

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 12

tgycttactt trataaaacc tccaattcc 29

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 13

atttgccagg raaatggaaa ccaa 24

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 14

ttccttytcc atttchkyac aaattkcygt 30

<210> 15

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 15

arrgtwaaac aatggccatt gacagaag 28

<210> 16

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 16

tccttcytyt ttatggcaaa taytggagt 29

<210> 17

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 17

graaaattwc aaaaattggg cctgava 27

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 18

tgayccyttc cawccytgyg grag 24

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 19

acaatgarac wccagggatt agrtatc 27

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 20

attgacagtc cagctatcyt tttc 24

<210> 21

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 21

acaartggac agtacagcct a 21

<210> 22

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 22

ctgtatttct gctattaagt cttttgatgg g 31

<210> 23

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 23

cccttgtcac artaaaarta ggaggr 26

<210> 24

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 24

gggaaattta ragtacaacc aakctgagtc 30

<210> 25

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 25

taggacctac acctrtyaac ataattggr 29

<210> 26

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 26

tbtaawcctg cyggatgygg tat 23

<210> 27

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 27

yaataaaaga actcaggayt tttgggarg 29

<210> 28

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 28

agytcytcta yttttrytct rtght 25

<210> 29

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 29

crtrgatgay ttrtatgtrg satctgaytt 30

<210> 30

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 30

yttttctggc arttctayag gct 23

<210> 31

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 31

cattyctttg gatgggrtat gract 25

<210> 32

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 32

ctgtatttct gctattaagt cttttgatgg g 31

<210> 33

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 33

gggcarttaa argaagctct attagay 27

<210> 34

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 34

ttrtgtccrc aratttctay rggta 25

<210> 35

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 35

rggaattgga ggttttatca aagtaarrca 30

<210> 36

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 36

atggattktc aggcccaaty tttgtaatt 29

<210> 37

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 37

cattaayrgm aatttgtrak gaaatggar 29

<210> 38

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 38

tccyttccaw ccctgtggaa gya 23

<210> 39

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 39

acaatgarac accagggatt agrtat 26

<210> 40

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 40

tgacagtcca gctatcyttt tctgg 25

<210> 41

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 41

ctgacaartg gacagtacag ccta 24

<210> 42

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 42

ctgtatttct gctattaagt cttttgatgg g 31

<210> 43

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 43

gggcctcara tcactctttg g 21

<210> 44

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 44

rcatccaagc tgrgycaaca k 21

<210> 45

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 45

ggaccyacrc ctgtcaacat aa 22

<210> 46

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 46

ggattktcag gcccaatttt tgyaattt 28

<210> 47

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 47

aamagmaatt tgtrakgara tgga 24

<210> 48

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 48

cctgyggrag yacattrtac tga 23

<210> 49

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 49

catacctagt rtraayaatg mracrcca 28

<210> 50

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 50

tcattgacag tccagctrtc yttttc 26

<210> 51

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 51

tgayaartgg acagtacarc cta 23

<210> 52

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 52

ctgtatttct gctattaagt cttttgatgg g 31

<210> 53

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 53

ttggaaatgt ggaaaggaag gac 23

<210> 54

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工合成序列

<400> 54

ctgtatttct gctattaagt cttttgatgg g 31

Claims

1.一种检测HIV-1 PR和RT区耐药突变的引物组，其特征在于，所述引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO.1-52所示；

所述引物组的模板的基因型包括HIV-1的B亚型、C亚型、B/C重组亚型或CRF01_AE亚型中的任意一种或至少两种的重组亚型；

所述B/C重组亚型包括CRF07_BC、CRF08_BC、CRF31_BC、CRF57_BC、CRF60_BC、CRF61_BC、CRF62_BC、CRF64_BC、CRF85_BC、CRF86_BC、CRF88_BC或CRF103_BC中的任意一种或至少两种的组合。

2.一种如权利要求1所述的引物组用于制备检测HIV-1 PR和RT区基因耐药突变的试剂或试剂盒中的应用。

3.一种检测HIV-1 PR和RT区基因耐药突变的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的引物组。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括HIV-1 PR和RT区基因的RT-PCR引物和多重PCR扩增预混液；

所述RT-PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.53-54所示。

5.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括阳性质控、阴性质控和ddH₂O。

6.一种如权利要求3-5任一项所述的试剂盒用于制备检测待测HIV-1基因组的基因型或耐药突变位点的产品中的应用。

7.一种以非疾病诊断和/或治疗为目的的HIV-1 PR和RT区基因的基因型或耐药突变的筛查方法，其特征在于，所述方法通过下一代半导体测序技术进行筛查，包括如下步骤：

（1）样品RNA提取；

（2）以步骤（1）所得RNA为模板，逆转录PCR扩增cDNA；

（3）采用多重PCR方法扩增靶基因；

（4）靶基因文库构建；

（5）对步骤（4）所得文库进行下一代半导体测序，筛选对蛋白酶抑制或/和逆转录酶抑制产生耐药的突变位点；

步骤（2）所述逆转录PCR的引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.53-54所示；

步骤（3）所述多重PCR的反应体系包括5×多重PCR Mix、如权利要求1所述的引物组和模板cDNA。

8.根据权利要求7所述的筛查方法，其特征在于，所述引物组的终浓度为10μM。

9.根据权利要求7所述的筛查方法，其特征在于，所述模板cDNA的终浓度为100-1000ng/μL。

10.根据权利要求7所述的筛查方法，其特征在于，所述多重PCR的反应条件为：

（1’）94℃预变性5分钟；

（2’）94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，共40个循环；

（3’）72℃延伸5分钟。

11.根据权利要求7-10任一项所述的筛查方法，其特征在于，所述方法具体包括如下步骤：

（1）样品RNA提取；

（2）以步骤（1）所得RNA为模板，逆转录PCR扩增cDNA：

A）混合反应体系：2× 1 Step Buffer，PrimeScript 1 Step Enzyme Mix，RNase FreedH₂O，RT-PCR引物和RNA模板；

B）逆转录PCR的反应条件为：（a）50℃逆转录30分钟；（b）94℃预变性5分钟；（c）94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸2分钟，共40个循环；（d）72℃延伸5分钟；

（3）采用多重PCR方法扩增靶基因：

A’）多重PCR的反应体系为：5×多重PCR Mix，权利要求1所述的引物组，ddH₂O和模板cDNA；

B’）多重PCR的反应条件为：（a’）94℃预变性5分钟；（b’）94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸45秒，共40个循环；（c’）72℃延伸5分钟；

C’）对每个样品进行柱纯化，去除反应液和杂质，得到180~380bp的多条DNA，再将此DNA溶液经磁珠纯化后进行定量检测，并将每个样品统一到相同浓度进行下一步操作；

（4）靶基因文库构建：

A’’）将相同浓度的每个样品进行DNA的末端修复，补为平末端；

B’’）每个样品加上特异性的barcode序列标签接头和通用的测序接头；

C’’）将加了接头的DNA片段应用通用引物进行8个循环的PCR扩增反应；

（5）对步骤（4）所得文库纯化定量后，进行下一代半导体测序，以HIV-1参考株HXB2的2253-3539bp的碱基序列为参考序列，筛选对蛋白酶抑制或/和逆转录酶抑制产生耐药的突变位点。