CN111676325A - 一种用于检测SARS-CoV-2全基因组的引物组合及应用方法 - Google Patents

一种用于检测SARS-CoV-2全基因组的引物组合及应用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于检测SARS‑CoV‑2全基因组的引物组合，其包括用于SARS‑CoV‑2 RNA逆转录的特异性引物、扩增全基因组的引物组；采用该引物组合，利用逆转录和巢式PCR对靶基因进行扩增后，在下一代半导体测序平台的基础上，构建用于检测SARS‑CoV‑2全基因组及突变位点的下一代半导体测序技术，该方法具有适用性广、通量高、准确性好，一次可检测出多个样本的优点，为SARS‑CoV‑2基因组的深度分析提供了便捷方法，对流行病学研究及临床早期分子诊断等具有重要意义。

Description

一种用于检测SARS-CoV-2全基因组的引物组合及应用方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种检测SARS-CoV-2全基因组的引物组、方法及其应用，利用下一代半导体测序技术检测SARS-CoV-2全基因组及突变位点的方法。
背景技术
新型冠状病毒肺炎(Corona Virus Disease 2019，COVID-19)，简称“新冠肺炎”，是由新型冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2)引起的一种有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等体征的传染疾病；在较严重病例中，感染可导致肺炎、严重急性呼吸综合征、肾衰竭、甚至导致死亡。
新型冠状病毒已被鉴定为一种β冠状病毒，其包裹着呈圆形或椭圆形的病毒，直径为60-140nm，广泛分布于人类和其他哺乳动物中，其基因组与严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)距离较远。目前关于新型冠状病毒的研究主要集中在快速检测、疫苗和药物等方面。快速检测主要使用荧光定量PCR核酸检测和血清抗体检测的方法，其存在用时短，检测方便，诊断准确等优点。为了更加深入的探究SARS-CoV-2的基因序列等特征，目前有很多关于新冠病毒部分区段的一代或二代测序的研究，而关于新冠病毒全长基因组序列的研究较少。
目前新型冠状病毒PCR基因序列的测定主要还是使用Sanger技术。Sanger测序技术以其操作简单、测序片段长等优点被广泛应用。但同时，Sanger法作为一代测序技术，其通量低、价格高、效率低、依赖于电泳分离技术，且只能检测20％～30％以上的准种，满足不了深度分析数据要求。随着测序技术的快速发展，DNA测序技术向着高通量低成本的方向发展。
下一代半导体测序仪由美国Life Technologies公司在2010年发布，是一款专门针对临床遗传疾病基因检测而开发的一款台式个体化高通量基因测序仪，其以布满微孔的高密度半导体芯片为测序基础，具有通量高、用时短、经济、灵敏性好、准确率高等特点。
发明内容
本发明应用全长基因组扩增和下一代半导体测序技术，提供了一种检测新型冠状病毒全基因组的引物组、方法及应用，包括用于SARS-CoV-2RNA逆转录的5条特异性引物及检测SARS-CoV-2全基因组的引物组；并构建用于检测SARS-CoV-2全基因组及突变位点的下一代半导体测序技术，对新冠病毒流行病学研究及临床早期分子诊断等具有重要意义。
本发明利用巢式PCR技术对新冠病毒全长的38个片段进行全基因组扩增后，等比混合后建库，并在下一代半导体测序平台的基础上，采用314半导体芯片对靶基因进行大规模的测序，一次可检测多个样本，具有简便、快速、准确和经济等特点，为新冠肺炎的深度分析和临床早期诊断建立新的方法。
本发明采用以下技术方案实现本发明目的：
一、本发明用于检测新型冠状病毒全基因组的引物组合包括用于SARS-CoV-2 RNA逆转录的特异性引物、扩增全基因组的引物组；通过PCR的方法扩增有重叠区的38个片段，得到38个DNA产物，步骤如下：
(1)样品RNA提取；
所述的样品为咽拭子或鼻拭子；
(2)以步骤(1)所得RNA为模板，采用SARS-CoV-2 RNA逆转录的特异性引物，逆转录出cDNA；
所述用于SARS-CoV-2 RNA逆转录的特异性引物cDNA的5条反向引物，其核苷酸序列如SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：60和SEQ ID NO：76所示；
所述逆转录分两步进行，具体反应体系及反应条件为：
A、第一步反应体系为20μL：
Figure BDA0002572544440000021
反应条件为65℃，5min；
B、第二步反应体系为40μL：
Figure BDA0002572544440000022
反应条件为：47℃，80min；70℃，15min；
(3)本发明提供用于SARS-CoV-2全长基因组扩增的引物组，扩增包括38个有重叠区的片段，扩增全基因组的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：152所示；
以步骤(2)cDNA作为模板，进行巢式PCR的扩增，巢式PCR分两步进行：
A、外围PCR
外围PCR扩增的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：1-SEQ ID NO：76所示；
外围PCR的反应体系为20μL：
试剂成分 Premix Taq dd H<sub>2</sub>O 上游引物 下游引物 cDNA
体积(μL) 10μL 6μL 1μL 1μL 2μL
外围PCR的反应条件为：
(a)94℃预变性5min；(b)94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共40个循环；(c)72℃延伸7min；
B、内围PCR
内围PCR扩增的引物核苷酸序列如SEQ ID NO：77-SEQ ID NO：152所示；
内围PCR的反应体系为20μL：
试剂成分 Premix Taq dd H<sub>2</sub>O 上游引物 下游引物 cDNA
体积(μL) 10μL 6μL 1μL 1μL 2μL
内围PCR的反应条件为：
(a)94℃预变性5min；(b)94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共40个循环；(c)72℃延伸7min；
二、本发明提供一种SARS-CoV-2全基因组的测序方法，通过下一代半导体测序技术进行，本发明中利用逆转录和巢式PCR对靶基因进行扩增后，在下一代半导体测序平台的基础上，采用314半导体芯片对靶基因进行大规模的测序，具有通量高、成本低、灵敏性好、准确性高等特点，包括如下步骤：
(1)靶基因文库构建的步骤如下：
A、将步骤一所得38个PCR产物进行柱纯化，去除反应液和杂质，得到纯化后产物；
B、将步骤A所得产物进行浓度的测定；
C、测定浓度后，将每个样品的38个DNA片段进行等比混合；
D、将每个样品的DNA溶液经磁珠纯化后进行定量检测，以达到建库的最低模板量；
E、将质检合格的每个样品进行DNA的末端修复，补为平末端；
F、每个样品加上特异性的barcode序列标签接头和通用的测序接头；
G、将加了接头的DNA片段应用通用引物进行8-10个循环的PCR扩增反应；
(2)对步骤(1)所得文库纯化定量，等比混匀后进行下一步半导体测序，以SARS-CoV-2参考株NC_045512.2为参考序列，对测序结果进行全长基因组的拼接，筛选产生突变的位点。本发明与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：
1、本发明提供的用于扩增SARS-CoV-2全基因组的引物组，扩增效率高，扩增结果准确，38个片段可拼接出完整的新冠病毒全基因组序列；
2、本发明在下一代半导体测序平台的基础上，采用314半导体芯片对靶基因进行大规模测序，一次可检测多个样本，具有快速、简便、经济等特点，大大降低了每个样品的检测成本；
3、本方法利用下一代半导体测序技术对SARS-CoV-2全基因组进行测序，并筛选突变位点，适用性广、通量高、准确性好，且一次可检测出多个样本，为SARS-CoV-2基因组的深度分析提供了便捷方法。
附图说明
图1为SARS-CoV-2的全长序列基因结构图，以及5个逆转录引物和38套引物扩增区段示意图；
图2为实施例3中扩增SARS-CoV-2全基因组的38个片段PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果，Maker的最大量程为2000bp；
图3为实施例6中应用314芯片进行下一代半导体芯片测序的ISP热图报告；
图4为实施例6中应用314芯片进行下一代半导体芯片测序的ISP统计分析报告；
图5为实施例6中应用314芯片进行下一代半导体芯片测序的读长直方图报告；
图6为实施例6中应用314芯片进行下一代半导体芯片测序结果与参考靶基因比对分析报告；
图7为实施例6中应用314芯片进行下一代半导体芯片测序准确率统计分析报告；
图8为实施例6中2号样品的下一代半导体芯片测序IGV全长拼接情况；
图9为实施例6中2号样品的下一代半导体芯片测序IGV分析结果中82-86位氨基酸缺失情况。
具体实施方式
为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
以下实施例中采用的材料不限于上述列举，可用其他同类材料替代，仪器未注明具体条件的，按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件，本领域技术人员应当掌握使用常规材料及仪器的相关知识。
实施例1：引物设计及优化
1、引物的设计
A、由于新型冠状病毒的高度保守性，因此在全球共享流感数据倡议组织(GISAID)网站中下载G型、S型、V型各五条作为参考序列，通过clustalx软件进行比对，选取保守区序列，经Primer Select软件分析其GC含量、Tm值、发夹结构以及引物二聚体，全部合格才说明引物初步设计完成，SARS-CoV-2的全长序列基因结构图以及5个特异性逆转录引物位置和38套引物扩增区段如图1所示；
B、38个片段每两个片段都存在100-200bp的重叠区，以方便拼接且拼接完整，引物序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:152所示，见下表；
Figure BDA0002572544440000051
Figure BDA0002572544440000061
Figure BDA0002572544440000071
Figure BDA0002572544440000081
C、选取大概每段间隔7000-8000bp的5条外围反向引物用作逆转录引物，获得cDNA基因组序列，这样的引物对获得全长cDNA扩增效率更高，适用性更广，引物序列如SEQ IDNO:20、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76所示。
实施例2：样品RNA的提取
本实施例中应用商业化的TIANamp Virus RNA Kit(TIANGEN，北京)对20例新冠肺炎患者的咽拭子或鼻拭子进行RNA的提取，提取方法参照试剂盒的说明书。
实施例3：逆转录巢式PCR反应
1、逆转录
以实施例2所得RNA为模板进行RT-PCR，反应分两步进行，反应体系和反应条件如下：A、反应体系如下：
第一步反应体系为20μL：
Figure BDA0002572544440000082
第二步反应体系为40μL：
Figure BDA0002572544440000083
B、反应条件如下：
第一步：65℃，5min
第二步：47℃，80min；70℃，15min。
2、巢式PCR反应
将步骤1所得逆转录反应产物cDNA进行一倍稀释后作为巢式PCR反应的模板，反应体系和条件如下，所述巢式PCR分两步进行：
(1)外围PCR：
反应体系为20μL：
试剂成分 Premix Taq dd H<sub>2</sub>O 上游引物 下游引物 cDNA
体积(μL) 10μL 6μL 1μL 1μL 2μL
反应条件为：
(a)94℃预变性5min；(b)94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共40个循环；(c)72℃延伸7min；
(2)内围PCR
反应体系为20μL：
试剂成分 Premix Taq dd H<sub>2</sub>O 上游引物 下游引物 cDNA
体积(μL) 10μL 6μL 1μL 1μL 2μL
反应条件为：
(a’)94℃预变性5分钟；(b’)94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸3分钟，共40个循环；(c’)72℃延伸7分钟；
3、巢式PCR扩增结果检测
PCR反应结束后，将反应产物进行水平琼脂糖凝胶电泳检测；采用2％的琼脂糖凝胶，取3μL PCR产物，缓慢加入胶孔中，并在第一个电泳孔中加入DNA Marker 2000，调试电泳电压为120V恒压进行电泳，电流180mA，约30min后观察结果；电泳结束后，在凝胶成像仪上观察有无目的条带，鉴定扩增结果，结果表明，20例样品均可成功扩增出38个目的DNA片段，其中一例全长38个片段电泳结果见图2。
4、PCR产物的纯化
(1)产物柱纯化
应用普通DNA产物纯化试剂盒(TIANGEN，北京)将每个PCR产物进行纯化，最大限度除去蛋白质、离子及引物小片段等杂质；
(2)DNA浓度检测
将每个样品的38个纯化产物分别测浓度，然后将38个片段等比混合；
(3)磁珠纯化
对每个样品用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)进行磁珠纯化，加入15μL的ddH2O用于洗脱；
(4)产物定量
将纯化产物用Life Technologies公司的Qubit 2.0定量仪对其进行定量，定量后，将每个
样品取100ng进行下一步。
实施例4：基因文库构建
将混合后的PCR纯化产物进行文库构建的大致步骤为：样品纯化→末端修复→纯化→添加接头→纯化→文库扩增→纯化→文库稀释；应用赛默飞公司Ion Plus FragmentLibrary Kit提供的标准方案进行，为实现上述技术方案，按以下操作步骤进行：
1、根据下一代半导体314芯片大小为100M，选择5例实施例3中的纯化产物进行建库和测序，首选进行末端修复，根据下表所示体系，每个样本分别在1.5mL的EP管中混合体系，吹打混匀，避免气泡产生，室温放置20min；
试剂组分 每个反应管用量
样本DNA 100ng
5×末端修复缓冲液 20uL
末端修复酶(End Repair Enzyme) 1μL
ddH<sub>2</sub>O XuL(补足总量)
总剂量 100uL
2、对修复后的产物进行纯化，用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)进行磁珠纯化，加入25μL的Low TE进行洗脱；
3、连接adapters和barcode序列标签
按照下表所示体系在PCR管中配制体系：
试剂成分 体积(μL)
DNA(上一步纯化产物) 25
连接酶缓冲液10×Ligase Buffer 10
接头Ion P1 Adapter 2
Ion Xpress Barcode X(X＝接头编号) 2
dNTP预混液dNTP Mix 2
ddH<sub>2</sub>O 49
DNA连接酶DNA Ligase 2
Nick Repair Polymerase 8
总量 100
注：X＝接头编号；Ion P1 Adapter处于接头试剂盒中，区别于建库试剂盒中的Adapters。
混合好体系后，吹打混匀瞬时离心，置于PCR仪中，反应条件为25℃反应15min，72℃5min，4℃至多保存1h；程序运行结束后，将PCR管中溶液转移至干净的EP管中。
4、添加接头后的纯化
对连接后的产物进行纯化，用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)进行磁珠纯化，加入20μL的Low TE进行洗脱；
5、文库扩增
将上一步洗脱后的PCR文库进行扩增，配制扩增反应体系如下表所示：
Figure BDA0002572544440000111
文库扩增的反应液混匀后将体系分为两管，每管65μL进行文库的扩增，PCR扩增反应程序为：95℃预变性5min；8个循环中包括95℃变性15s、58℃退火15s和70℃延伸1min，4℃可保存1h。反应结束后，将两个PCR管中的液体全部转移到一个干净的EP管中。
6、扩增结束后，用Agencourt AMPure XP Reagent磁珠(Invitrogen公司)进行磁珠纯化，加入20μL的Low TE进行洗脱。
7、文库定量
将纯化产物用Life Technologies公司的Qubit 2.0定量仪对其进行定量，定量后，将每个样品的文库稀释至100pM，计算公式如下：
Figure BDA0002572544440000112
其中c为样品浓度(ng/μL)；n为文库片段大小(bp)；m为1μL原始文库稀释倍数；将构建好的文库稀释后，每个文库样品取5μL放置于同一个1.5mL的EP管中，混合均匀后，置于4℃待用。
实施例5：油包水PCR与模板富集(OT2与ES)
1、油包水PCR反应
首先，将试剂从-20℃取出后置于于冰上融解，融解后震荡5s，瞬离后重置冰上，开始配制体系，所需试剂与配制比例如下表所示：
试剂 体积
ddH<sub>2</sub>O 48μL
Ion PGM Hi-Q View Enzyme Mix 50μL
实施例4所得待用文库 2μL
Ion PGM Hi-Q View ISPs 100μL
Ion PGM Hi-Q View Reagent Mix 800μL
总量 1000μL
将扩增反应液配制完成后，震荡5s混合均匀，瞬离2s后，缓慢加入到反应器中，再缓慢向反应器中加入1.7mL的Ion OneTouch Reaction Oil，然后放置到进行油包水PCR反应的OT2上进行反应，约6.5h后反应结束，在OT2仪器上按下启动键，将硅胶珠进行离心，吸走上清，每管留约100μL，放置4℃备用。
2、模板富集
首先进行用来富集所用试剂的准备，包括Melt-Off Solution、Dynabeads MyOneStreptavidin C1 Beads的配制，然后将上一步油包水PCR反应产物与配制的试剂加入相应的八连排管中，用ES仪器对含有DNA模板的硅胶珠进行富集，大约35min后结束反应，放置4℃准备上机测序。
实施例6：上机测序
当OT2程序结束之后，要准备Ion PGMTM System测序；首先对PGM仪器进行水洗与氯洗，再进行初始化，然后进行314芯片的检查与加样，最后进行上机测序；测序过程中所应用的试剂来自于Life Technologies公司，测序所有步骤参照Life Technologies公司的测序流程，具体步骤如下：
1、测序Plan的创建
将电脑用网线连接到PGM服务器上，在服务器中上传参考序列文件和靶向文件，在Ion Torrent Server的Plan中选择Templates后继续选择AmpliSeq DNA，点击Create Plan后按照提示、所使用试剂和测序目的来创建Plan，全部设置完成后点击Plan Run将Plan上传至服务器中以供使用。
2、Ion PGMTM System的开机前准备及测序用清洗瓶的预处理
先打开氮气总阀门再调节压力阀，使指针处于10每小时空气变化；按机器正面的开机按钮等待仪器开机；将测序程序运行时用的瓶W1、W2和W3使用18MΩ水涮洗三遍，并将W2中添加18MΩ水直至瓶子最上方的刻度线；按照相同方法涮洗2个1L的玻璃瓶，并添加18MΩ水至瓶子最上方的刻度线，将测序前清洗用瓶W2、W3、水洗瓶和氯洗瓶用18MΩ水涮洗三遍。(注：第一次使用W2测序用瓶时，需要进行预处理才能使用，预处理步骤如下：将装有2L18MΩ水的新测序用瓶W2中加入整瓶的Wash 2Bottle Conditioning Solution，混匀后室温放置至少8h后丢弃溶液才可正常使用。)
3、Ion PGMTMSystem的水洗
①点击主界面上“Clean”，勾选“18MΩ water cleaning”后点击“Next”；
②清空清洗用瓶W2、W3和废液缸中的残余液体，将W2、W3和装有250mL 18MΩ水的水洗瓶安装至对应位置；确保dNTP接口处吸管下面放置有收集废液的废液缸；确保有一张水洗芯片在PGM仪器上；
③继续点击“Next”，根据提示进行检查，检查无误后进行水洗程序，待水洗结束后点击“Next”返回主界面；
4、Ion PGMTMSystem的氯洗
①将装有1L 18MΩ水的氯洗用玻璃瓶中加入一整片Ion Cleaning Tablet，待其完全溶解后加入1mL 1M的NaOH溶液，上下颠倒混匀后用0.22或0.45μm的滤膜过滤出250mL的氯液至氯洗瓶中待用；
②点击主界面上“Clean”选项后勾选“Chlorite cleaning”，点击“Next”；
③清空清洗用瓶W2、W3和废液缸中的残余液体，将W2、W3和装有250mL氯水的氯洗瓶安装至对应位置；确保dNTP接口处吸管下面放置有收集废液的废液缸；确保有一张氯洗芯片在机器上；
④继续点击“Next”，根据提示进行检查，检查无误后进行氯洗程序；
⑤氯洗结束后，清空清洗用瓶W2、W3和废液缸中的残余液体，将W2、W3和装有250mL18MΩ水的水洗瓶安装至对应；确保dNTP接口处吸管下面放置有收集废液的废液缸；确保有一张水洗芯片在机器上；
⑥点击“Next”进行水洗，水洗结束后点击“Next”返回主界面。
5、Ion PGMTMSystem的初始化
①初始化试剂的配制
W1的配制：清空润洗后的残留液体，添加350μL新配的100mM的NaOH；W2的配制：在已经添加2L的18MΩ水的W2中，加入一整瓶的Ion PGMTMHi-QTMView Sequencing W2Solution和70μL新配的100mM的NaOH，立即拧紧盖子，上下颠倒5次混匀；W3的配制：清空润洗后的残留液体，添加50mL的Ion PGMTMHi-QTMView Sequencing W3 Solution。
②初始化
确保Ion PGMTMSystem中有一张水洗芯片，注意不要移除dNTP接口处吸管并保证下方有废液缸。主界面上点击“Initialize”后，下拉选择“Ion PGMTMHi-QTMView SequencingKit”；点击“Enter barcode”后扫描Ion PGMTMHi-QTMView Sequencing W2 Solutionbottle上的条形码或输入编号；点击“Next”仪器会检查气压，检查显示气压充足后，换上干净的手套，更换W1、W2和W3处吸管，同时将配制好的W1、W2和W3安装在对应位置。点击“Next”，按照提示进行检查，检查无误后，进行pH的调节。
将四种dNTP取出置于冰上溶解，溶解后涡旋混匀瞬时离心置于冰上备用；取出4个新的Reagent Bottles并分别贴上标签：dGTP、dCTP、dATP和dTTP，按照Reagent Bottles管上标记，分别加入20μL的dNTP，冰上放置待用；
待初始化完成后，按照屏幕提示将dNTP接口处的旧吸管移除，更换新手套后安装新的吸管，同时将标记有dGTP、dCTP、dATP和dTTP的Reagent Bottles按照Ion PGMTMSystem上标记的顺序依次进行安装。点击“Next”，按照提示检查是否完成所述操作，如果各项指标均通过，屏幕会显示绿色的“PASS”，点击“Next”后返回主界面。
6、测序步骤
①添加Control ISPs：涡旋Control Ion SphereTMParticles至少30s后瞬离，吸取5μL加入到2.4.9中制备的阳性ISPs中；
②测序引物的添加：将上一步ISPs吹打混匀后15500g离心2min；环吸留15μL，加入12μL的Sequencing Primer使总体积达到27μL，吹打混匀瞬离后置于PCR仪上运行程序：95℃2min，37℃2min，程序运行结束后置于常温备用；
③芯片检查：点击主界面的“Run”，根据提示清除废液缸中的废液后点击“Next”，确保有一张干净的水洗芯片在仪器中后点击“Next”，仪器将进行清洗管路的操作；清洗完成后，选择OT2程序所用的试剂盒，点击“Next”；脱去手套去静电后拆开一张新的314芯片标记后放入仪器中，点击“Next”；扫描芯片外包装上的条形码，检查外包装上条形码与屏幕中显示的条形码是否一致，确认一致后点击“Chip Check”；当芯片检查成功后点击“Next”，取下芯片放入Ion centrifuge adapter/rotor篮中，同时将水洗芯片再次放入PGM仪器中；
④向步骤②中常温备用的的ISPs中加入3μL的Ion PGMTMHi-QTMView SequencingPolymerase使总体积达到30μL，吹打混匀后室温放置5min备用；
⑤芯片加样：使芯片与桌面呈45°并保持加样孔在下方，将枪头垂直于芯片表面插入加样孔后尽量吸干净芯片中的液体，随后将芯片倒置标签朝里置于Ion centrifugeadapter/rotor篮中离心5s以除净芯片中的液体。将芯片水平放置，吸取10μL上一步备用的ISPs，不锁枪，将枪头垂直于芯片表面插入加样孔，通过旋转移液枪旋钮进行加样，保持每秒1μL的速率加样，为了避免气泡的进入，剩余0.5μL不打入芯片中；将芯片正置标签朝里放置在Ion centrifuge adapter/rotor篮，离心30s，再将芯片正置标签朝外，离心30s，从Ioncentrifuge adapter/rotor篮中取下；
使芯片与桌面呈45°并保持加样孔在下方，将枪调至5μL后，枪头垂直于芯片表面插入加样孔后慢慢吹吸1次，避免产生气泡，随后尽量吸除残余的液体。将芯片倒置标签朝里离心5s以除去残留液体。最后将添加好样品的芯片放入Ion PGMTMSystem中点击“Next”；
⑥测序计划的选择及运行：点击“Browse”选择第一步中创建的程序，点击“Next”后会出现所创建程序的相关信息，检查是否有误，确认无误后，按照提示进行选择，开始进行测序；
⑦测序结束后返回主界面，进行水洗，水洗结束后关闭Ion PGMTMSystem(依次点击“Tool”、“shutdown”，出现水洗界面后，点掉18MΩ水洗前的“√”，点“Next”关机结束)。
7、测序数据的处理
测序结束后，在Ion Torrent Server服务器中查看ISP热图报告、统计分析报告、读长直方图报告以及fast QC等报告，确定结果的可取性。若测序结果可用，下载所需处理的数据，主要包括BAM/BAI/VCF等文件。将BAM文件用IGV可视化软件打开，查找全基因组序列上的突变情况，结合VCF文件进行突变位点情况的统计，通过一次应用314芯片的半导体测序反应，测序结果如图4-8所示，5个样品共获得76.1M的数据量，共计396449条序列，序列平均长度192bp，1×覆盖度的碱基读取准确率为99％，平均测序深度为1651.8×。
图3为半导体芯片测序的ISP热图报告，由图3可知，314半导体芯片在进行芯片加样时的覆盖率达55％，测序关键信号为73％，一共获得76.1M的数据量；
图4为半导体芯片测序的ISP统计分析报告，由图4可知芯片表面微孔的数据统计分析，76.1M的数据量中，可用的reads数约为61％。芯片表面含有模板的微孔为55％，其中有99％含有阳性模板，在这些含有阳性模板的珠子中，75％含有单一模板。在75％含有单一阳性模板的珠子上，有78％为测序质量较好的微孔。最后经过滤可得到396,449条可用的reads数；
图5为半导体芯片测序的读长直方图报告，由图5可知reads长度的密度分布图，该图的reads为过滤后的分布密度图，从图中可以看出大部分的reads主要集中于150-300bp，测序质量较高，平均长度为192bp；
图6为半导体芯片测序结果与参考靶基因比对分析报告，由图6可知测序后的碱基序列与导入的SARS-CoV-2参考序列NC_045512.2基因组比对的结果，96％的碱基序列能和SARS-CoV-2参考序列NC_045512.2基因组比对上，其中4％不能比对上；这4％分为两种碱基序列，一种是测序深度较低而导致测序不准确的序列，另外一种是发生变异的序列；
图7为半导体芯片测序准确率统计分析报告，即测序深度为1×时，不同长度reads的测序准确率，由图7可知，本发明方法的平均测序准确率为99％；
图8为半导体芯片测序IGV全长拼接情况，表明本发明方法可以覆盖SARA-CoV-2全基因组。
测试例1
将实施例6得到的测序数据以NC_045512.2为参考序列，分析5个样本的突变位点情况，并与Sanger测序结果进行比对；通过下一代半导体测序技术，检测出Sanger测序未检出的突变位点，并且将下一代半导体测序与Sanger测序突变检测结果进行对比，结果如下表所示；
检测样本 Sanger测序结果 下一代半导体测序结果(％)
1 None None
2 82-86DEL(GHVMV) 82-86DELGHVMV(91)、R357K(19)
3 None R357K(24)
4 None R357K(27)
5 None R357K(45)
由上表可知，通过本发明设计的逆转录和全长扩增引物组配合下一代半导体测序技术，可以检测出Sanger测序检测不到的低频率突变位点，也可以对Sanger测序的结果起到纠正作用，其中以82-86(GHVMV)缺失为例的下一代半导体测序结果分析如图9所示。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
序列表
<110> 云南科耀生物科技有限公司
<120> 一种用于检测SARS-CoV-2全基因组的引物组合及应用方法
<160> 152
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211>18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial）
<400> 1
cttcccaggt aacaaacc 18
<210>2
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 2
ttccgtgtac caagcaat 18
<210>3
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 3
cggtcgtagt ggtgagacac 20
<210>4
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 4
aaagcacttg tggaagcaga 20
<210>5
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 5
ttttgtggca ctgagaat 18
<210>6
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 6
ttagaggcat gagtaggc 18
<210>7
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 7
tcgcagtggc taactaac 18
<210>8
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 8
tgaagagcag cagaagtg 18
<210>9
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 9
aagtgctctg cctatacagt 20
<210>10
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 10
taaatggctt aacttcctct 20
<210>11
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 11
ttttaatcag cacgaagttc 20
<210>12
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 12
taacagcatc aggtgaagaa 20
<210>13
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 13
gcagaagaaa cacgcaaatt 20
<210>14
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 14
aagggttgtc tgctgttgtc 20
<210>15
<211>23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 15
caactgatcc tagttttctg ggt 23
<210>16
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 16
ttcaactggt tttgtgctcc 20
<210>17
<211>23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 17
gtacagaaat tgaccctaag ttg 23
<210>18
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 18
tagtagagtt caaatagcct tctc 24
<210>19
<211>23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 19
actaacatag ttacacggtg ttt 23
<210>20
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 20
tgaaccttta gtgttattag c 21
<210>21
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 21
taatggaggt aaaggctttt g 21
<210>22
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 22
tctgtagatg ctatgtcacg a 21
<210>23
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 23
gaccttggtg cttgtattga c 21
<210>24
<211>23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 24
caaaagctct tctaaacctc ata 23
<210>25
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 25
tatgaaagtt tacgccctga c 21
<210>26
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 26
aaccctgagt tgaacattac c 21
<210>27
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 27
attttagtgg agcaatggat a 21
<210>28
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 28
actttggaaa gtaacacctg a 21
<210>29
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 29
gctggcacag acttagaagg t 21
<210>30
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 30
atgctattct tgggtgggag t 21
<210>31
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 31
gtgtatgatg atggtgctag g 21
<210>32
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 32
agaggtatta tgttcaaggg a 21
<210>33
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 33
ctcagagttt agttcccttc c 21
<210>34
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 34
caattagtga ttggttgtcc c 21
<210>35
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 35
acagaactgg aaccaccttg t 21
<210>36
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 36
cgttcaccta agttggcgta t 21
<210>37
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 37
agctgttgct aaacatgact 20
<210>38
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 38
atcctgagca aagaagaagt 20
<210>39
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 39
gtttcaactg gataccactt c 21
<210>40
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 40
tgtaaattgc ggacatactt a 21
<210>41
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>41
gttgggatta tcctaaatgt g 21
<210>42
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 42
actaatgggt ggtttatgtg a 21
<210>43
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400> 43
tatgattgaa cggttcgtgt c 21
<210>44
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>44
gcgagcagaa gggtagtaga g 21
<210>45
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>45
tctttcatgg gaagttggta 20
<210>46
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>46
agagtgagct gtttcagtgg 20
<210>47
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>47
aaagcacata aagacaaatc ag 22
<210>48
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>48
gaacatcaat cataaacgga 20
<210>49
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>49
ccttggaatg tagtgcgtat 20
<210>50
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>50
ccatcaaagt gtcccttatt 20
<210>51
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>51
catgtgagtc tcatggaaaa 20
<210>52
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>52
agaaactaca gataaatctt gg 22
<210>53
<211>23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>53
attacctgaa acttacttta ctc 23
<210>54
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>54
tgtattcctc caaaatatgt a 21
<210>55
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>55
gattggtgat tgtgcaactg t 21
<210>56
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>56
ttcaaggtcc ataagaaaag g 21
<210>57
<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>57
gtttgataac cctgtcctac c 21
<210>58
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>58
aagctataac gcagcctgta 20
<210>59
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>59
ttatgcttgg aacaggaaga 20
<210>60
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>60
tgtgggtatg gcaatagagt 20
<210>61
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>61
tcctacttgg cgtgtttatt 20
<210>62
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>62
ctttgaagtc tgcctgtgat 20
<210>63
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>63
actgttagcg ggtacaatca ct 22
<210>64
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>64
ctggctcaga gtcgtcttca 20
<210>65
<211>23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>65
cattcaagga ggagttagat aaa 23
<210>66
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>66
ctagtagtcg tcgtcggttc 20
<210>67
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>67
ggcacaacaa gtcctatttc 20
<210>68
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>68
aacctgagtc acctgctaca 20
<210>69
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>69
cagaataaat tggatcaccg 20
<210>70
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>70
aacaaggaat agcagaaagg 20
<210>71
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>71
aagagcaacc aatggagatt 20
<210>72
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>72
ggtgaaccaa gacgcagtat 20
<210>73
<211> 28
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>73
gtcctattca cttctattct aaatggta 28
<210>74
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>74
acattccgaa gaacgctgaa 20
<210>75
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>75
ctgcttgaca gattgaacca 20
<210>76
<211>22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>76
tttttgtcat tctcctaaga ag 22
<210>77
<211>18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>77
tcccaggtaa caaaccaa 18
<210>78
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>78
catcagggcc acagaagt 18
<210>79
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>79
tttgacttag gcgacgag 18
<210>80
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>80
agaccttcgg aaccttct 18
<210>81
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>81
gccgaatacc ataatgaa 18
<210>82
<211> 18
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>82
aagtttagct ccaccaat 18
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<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>83
aaaactcaaa cccgtcctt 19
<210>84
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>84
atggctcaaa ctcttcttct tc 22
<210>85
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>85
accactgggc attgatttag 20
<210>86
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>86
aggaatctca gcgatctttt 20
<210>87
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>87
cttgcaccat tattatcagc 20
<210>88
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>88
gtggcattgt aacaagagtt 20
<210>89
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>89
gtattaaaat acaagagggt gtg 23
<210>90
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>90
tattacagta ggctaagata agtg 24
<210>91
<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>91
tggaaatacc cacaagttaa 20
<210>92
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>92
atcaatagcc accacatcac 20
<210>93
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>93
attgatcttg taccaaacca 20
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<211>20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>94
gaacctaggc aaacacttaa 20
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<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
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attaaagcat ctatgccgac ta 22
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<211>21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>96
tcaacgatgt aagaagactg g 21
<210>97
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<212> DNA
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<213>人工序列（Artificial）
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aacaactacg aaaacaaata cg 22
<210>100
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>100
tttacagcat ctacaccaca g 21
<210>101
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>101
ttgaaggttc tgttagagtg g 21
<210>102
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>102
ccaaagaccg ttaagtgtag t 21
<210>103
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>103
gttctttacc aaccaccaca a 21
<210>104
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>104
gtacgtccat tcataccatt tt 22
<210>105
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>105
tataaatgga gacaggtggt t 21
<210>106
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>106
gtcagtctaa agtagcggtt g 21
<210>107
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>107
atttccatgt gggctcttat a 21
<210>108
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>108
gtgcatcatt atccaacttt cta 23
<210>109
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>109
aagtctttga atgtggctaa atctg 25
<210>110
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>110
gaattggcag gcacttctgt t 21
<210>111
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>111
cctaaaggtc ctaaagtgaa gtat 24
<210>112
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>112
caacaattgt atgtgacaag tatt 24
<210>113
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>113
ttagaataga cggtgacatg g 21
<210>114
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>114
tccttaaaga aacccttaga c 21
<210>115
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>115
tatgctgctg accctgctat 20
<210>116
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>116
tctcctgatg aggttccacc 20
<210>117
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>117
tgctcgcaaa catacaacgt g 21
<210>118
<211> 25
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>118
atggtcgtaa cagcatttac aacat 25
<210>119
<211> 24
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>119
cataagaaag ctacatgatg agtt 24
<210>120
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>120
ctgagatatt gagtgttggg tat 23
<210>121
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>121
accgaaatta tgtctttact gg 22
<210>122
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>122
agtcatattc tgagccctgt g 21
<210>123
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>123
attaacaggc cacaaatagg 20
<210>124
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>124
aatagaatga tgccaacagg 20
<210>125
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>125
acagagtcgt atttgtctta tg 22
<210>126
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>126
aagtcttgta aaagtgttcc a 21
<210>127
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>127
ttaggtggtg ctgtctgtag 20
<210>128
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>128
ttagctagtc caatcagtag atg 23
<210>129
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>129
gaacggtata aattagaagg c 21
<210>130
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>130
cacattagta acaaaggctg tc 22
<210>131
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>131
tgtacgaccc taagactaaa a 21
<210>132
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>132
actctgaact cactttccat c 21
<210>133
<211>24
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>133
gtctaacata ataagaggct ggat 24
<210>134
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>134
tggagcgatt tgtctgactt 20
<210>135
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>135
gcatcatttt ccacttttaa 20
<210>136
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>136
ccaagtgaca tagtgtaggc 20
<210>137
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>137
ctgtttaata ggggctgaac 20
<210>138
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>138
accaaaattg gagctaagtt 20
<210>139
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>139
taggtttaat ggtattggag tt 22
<210>140
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>140
ggtcatacag caaagcataa t 21
<210>141
<211> 19
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>141
caatgaggtt gccaagaat 19
<210>142
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>142
tcttcaggct catcaacaat 20
<210>143
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>143
aatgggaatc tggagtaaaa 20
<210>144
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>144
tccgattacg agttcacttt 20
<210>145
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>145
gcaatggctt gtcttgtagg 20
<210>146
<211>19
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>146
gtgaaactga tctggcacg 19
<210>147
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>147
tggcactgat aacactcgct ac 22
<210>148
<211> 20
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>148
atctgagggt ccaccaaacg 20
<210>149
<211> 23
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>149
agtcttgtag tgcgttgttc gtt 23
<210>150
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>150
cggccaatgt ttgtaatcag tt 22
<210>151
<211> 21
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>151
gagcaaaatg tctggtaaag g 21
<210>152
<211> 22
<212> DNA
<213>人工序列（Artificial）
<400>152
catggggata gcactactaa aa 22

Claims (7)

1.一种用于检测SARS-CoV-2全基因组的引物组合，其特征在于：包括用于SARS-CoV-2RNA逆转录的特异性引物、扩增全基因组的引物组。
2.根据权利要求1所述的用于检测SARS-CoV-2全基因组的引物组，其特征在于：用于SARS-CoV-2RNA逆转录的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:30、SEQ IDNO:40、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76所示。
3.根据权利要求2所述的用于检测SARS-CoV-2全基因组的引物组，其特征在于：扩增全基因组的引物组的核苷酸序列如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:152所示。
4.利用权利要求3所述用于检测SARS-CoV-2全基因组的引物组合检测SARS-CoV-2全基因组的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)样品RNA提取；
(2)以步骤(1)所得RNA为模板，采用SARS-CoV-2RNA逆转录的特异性引物，逆转录出cDNA；
(3)采用Nested-PCR方法扩增靶基因；
(4)靶基因文库构建，对所得文库进行下一代半导体测序，通过下一代半导体测序技术进行突变位点筛查。
5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于：步骤(2)所述的SARS-CoV-2RNA逆转录的特异性引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:76所示；
步骤(2)逆转录反应分两步进行：
A、第一步20μL反应体系为：2μL OligodT、2μL SEQ ID NO:20、2μL SEQ ID NO:30、2μLSEQ ID NO:40、2μL SEQ ID NO:60、2μL SEQ ID NO:76、2μL dNTP、1μL H2O、5μL RNA；反应条件为65℃，5min；
B、第二步40μL反应体系为：8μL 5×Primer ScriptⅡ、1μL RNase Inhibitor、2μLPrimer ScriptⅡRTase、9μL H2O、20μL步骤A产物；反应条件为47℃，80min；70℃，15min。
6.根据权利要求5所述的检测方法，其特征在于：步骤(3)所述Nested-PCR的反应体系包括Premix Taq、如SEQ ID NO.1-SEQ ID NO:152所示的扩增全基因组的引物组、模板cDNA；
所述巢式PCR分两步进行：
(1)外围PCR
外围PCR扩增的引物如SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:76所示；
外围PCR的20μL反应体系为：10μL Premix Taq、6μL ddH2O、1μL上游引物、1μL下游引物、2μL cDNA；
外围PCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共40个循环；72℃延伸7min；
(2)内围PCR
内围PCR扩增的引物核苷酸序列如SEQ ID NO:77-SEQ ID NO:152所示；
内围PCR的20μL反应体系为：10μL Premix Taq、6μL dd H2O、1μL上游引物、1μL下游引物、2μL cDNA；
内围PCR的反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸3min，共40个循环；72℃延伸7min；
(3)每个样品包含38个PCR产物，对每个PCR产物进行柱纯化，去除反应液和杂质，再将此DNA溶液经磁珠纯化后进行定量检测，每个样品等比混合38个纯化产物，然后将每个样品统一到相同浓度进行下一步操作。
7.根据权利要求6所述的检测方法，其特征在于，步骤(4)靶基因文库构建的步骤如下：
A、将相同浓度的每个样品进行DNA的末端修复，补为平末端；
B、每个样品加上特异性的barcode序列标签接头和通用的测序接头；
C、将加了接头的DNA片段应用通用引物进行8-10个循环的PCR扩增反应；
D、对步骤C所得文库纯化定量后，进行下一代半导体测序，以SARS-CoV-2参考株NC_045512.2全长基因组的碱基序列为参考序列，筛选产生突变的位点。
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