CN113817729A - 一种抑制新型冠状病毒(CoV19)的siRNA及其组合物和应用 - Google Patents
一种抑制新型冠状病毒(CoV19)的siRNA及其组合物和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种小干扰核酸或核苷酸修饰的小干扰核酸,其中所述核酸能够抑制新型冠状病毒COVID19基因的表达。本发明还提供了一种药物组合物,该药物组合物含有本发明提供的小干扰核酸作为活性成分。本发明还提供了所述小干扰核酸及其药物组合物在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的应用。本发明所述小干扰核酸对新型冠状病毒COVID19基因的表达具有良好的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学或生物制药技术领域,更具体地涉及靶向新型冠状病毒COVID-19的小干扰核酸分子及其组合物和应用。
背景技术
新型冠状病毒(CoV19或COVID-19,SARS-CoV-2,以下简称“新冠病毒”)作为一种正链RNA病毒,病毒通过附着并进入肺上皮细胞,在溶酶体内进行脱壳,释放病毒正链RNA,正链RNA指导结构蛋白的表达,并通过以自身为模板转录成负链RNA,负链RNA作为一些非结构蛋白的模板,翻译成多种非结构蛋白的聚合物,在经过蛋白水解产生包括RdRP等多种非结构蛋白,并依赖RdRP复制形成子代正链RNA,并产生大量的亚基因组RNA。亚基因组RNA翻译结构蛋白,并组装形成新的病毒粒子。
自从新冠病毒发现以后,目前已在全球范围内蔓延,传播迅速,据WHO报道,截止到2020年9月1日,全球已有超过2500万确诊病例,并有超过84万的死亡病例。新冠病毒成为威胁全球人类健康的一个重大威胁。然而,针对新型冠状病毒感染,目前全球尚未有获批的有效生物药品上市。
RNA干扰药物是近年来发展起来的一种新型药物,通过RNA干扰通过靶向降解互补的mRNA,有效的靶向抑制目的基因的表达。小干扰RNA可以降解本身病毒RNA以及形成的负链RNA和亚基因组RNA,从而有效的抑制病毒复制,并抑制病毒包装关键蛋白的表达,从而达到治疗和预防新冠病毒感染的目的。
发明内容
本发明提供一种能够抑制新型冠状病毒COVID19表达的小干扰核酸分子,优选地,所述小干扰核酸是siRNA.
在本发明的一个方面,本发明提供的小干扰核酸能够抑制新型冠状病毒COVID19表达。优选地,所述小干扰核酸靶向新型冠状病毒COVID19 mRNA上对应的以下基因或蛋白表达区:ORF3a,ORF7a,ORF7b,ORF8,NSP4,RDRP,Helicase,endoRNAse,2'-O-ribosemethyltransferase,N-protein,ORF10,E-Protein,ORF6,Leader Sequence,3’-5’exonuclease,M-Protein,NSP7-10。
所述小干扰核酸包含正义链和反义链,其中正义链包含选自以下序列中至少连续16个与新型冠状病毒mRNA相同的核苷酸序列:如SEQ ID NO.2/4/6/8/10/12/14/16/18/20/22/24/26/28/30/32/34/36/38/40/42/44/46/48/50/52/54/56/58/60/62/64/66/68/70/72/74/76/78/80/82/84/86/88/90/92/94/372中任一所示。
优选地,所述小干扰核酸为以下所述序列的任一组:如SEQ ID NO.2所示正义链和SEQ ID NO.3所示反义链;或如SEQ ID NO.4所示正义链和SEQ ID NO.5所示反义链;或如SEQID NO.6所示正义链和SEQ ID NO.7所示反义链;或如SEQ ID NO.8所示正义链和SEQ IDNO.9所示反义链;或如SEQ ID NO.10所示正义链和SEQ ID NO.11所示反义链;或如SEQIDNO.12所示正义链和SEQ ID NO.13所示反义链;或如SEQ ID NO.14所示正义链和SEQ IDNO.15所示反义链;或如SEQ ID NO.16所示正义链和SEQ ID NO.17所示反义链;或如SEQ IDNO.18所示正义链和SEQ ID NO.19所示反义链;或如SEQ ID NO.20所示正义链和SEQ IDNO.21所示反义链;或如SEQ ID NO.22所示正义链和SEQ ID NO.23所示反义链;或如SEQ IDNO.24所示正义链和SEQ ID NO.25所示反义链;或如SEQ ID NO.26所示正义链和SEQ IDNO.27所示反义链;或如SEQ ID NO.28所示正义链和SEQ ID NO.29所示反义链;或如SEQ IDNO.30所示正义链和SEQ ID NO.31所示反义链;或如SEQ ID NO.32所示正义链和SEQ IDNO.33所示反义链;或如SEQ ID NO.34所示正义链和SEQ ID NO.35所示反义链;或如SEQ IDNO.36所示正义链和SEQ ID NO.37所示反义链;或如SEQ ID NO.38所示正义链和SEQ IDNO.39所示反义链;或如SEQ ID NO.40所示正义链和SEQ ID NO.41所示反义链;或如SEQ IDNO.42所示正义链和SEQ ID NO.43所示反义链;或如SEQ ID NO.44所示正义链和SEQ IDNO.45所示反义链;或如SEQ ID NO.46所示正义链和SEQ ID NO.47所示反义链;或如SEQ IDNO.48所示正义链和SEQ ID NO.49所示反义链;或如SEQ ID NO.50所示正义链和SEQ IDNO.51所示反义链;或如SEQ ID NO.52所示正义链和SEQ ID NO.53所示反义链;或如SEQ IDNO.54所示正义链和SEQ ID NO.55所示反义链;或如SEQ ID NO.56所示正义链和SEQ IDNO.57所示反义链;或如SEQ ID NO.58所示正义链和SEQ ID NO.59所示反义链;或如SEQ IDNO.60所示正义链和SEQ ID NO.61所示反义链;或如SEQ ID NO.62所示正义链和SEQ IDNO.63所示反义链;或如SEQ ID NO.64所示正义链和SEQ ID NO.65所示反义链;或如SEQ IDNO.66所示正义链和SEQ ID NO.67所示反义链;或如SEQ ID NO.68所示正义链和SEQ IDNO.69所示反义链;或如SEQ ID NO.70所示正义链和SEQ ID NO.71所示反义链;或如SEQ IDNO.72所示正义链和SEQ ID NO.73所示反义链;或如SEQ ID NO.74所示正义链和SEQ IDNO.75所示反义链;或如SEQ ID NO.76所示正义链和SEQ ID NO.77所示反义链;或如SEQ IDNO.78所示正义链和SEQ ID NO.79所示反义链;或如SEQ ID NO.80所示正义链和SEQ IDNO.81所示反义链;或如SEQ ID NO.82所示正义链和SEQ ID NO.83所示反义链;或如SEQ IDNO.84所示正义链和SEQ ID NO.85所示反义链;或如SEQ ID NO.86所示正义链和SEQ IDNO.87所示反义链;或如SEQ ID NO.88所示正义链和SEQ ID NO.89所示反义链;或如SEQ IDNO.90所示正义链和SEQ ID NO.91所示反义链;或如SEQ ID NO.92所示正义链和SEQ IDNO.93所示反义链;或如SEQ ID NO.94所示正义链和SEQ ID NO.95所示反义链;或如SEQ IDNO.372所示正义链和SEQ ID NO.373所示反义链。
在本发明的一个方面,本发明提供的小干扰核酸包含核苷酸修饰,所述核苷酸修饰包含但是不限于以下修饰的一种或多种:
l)戊糖的2’-OH甲氧基修饰:
正义链和反义链中的胞嘧啶(C)核苷酸和尿嘧啶(U)核苷酸的戊糖的2’-OH位被甲氧基修饰;甲氧基修饰如下:
2)+2碱基悬垂
正义链和反义链向5’端或3’端延伸2个核苷酸达到21碱基+2碱基悬垂;2碱基悬垂具有跟Dicer酶切割dsRNA形成的小干扰RNA相同的结构,这种结构有利于形成RISC诱导沉默复合体,从而提高沉默效率。其序列与其相应的mRNA一致,但是在3’端比互补的RNA链多2个碱基,形成2碱基悬垂。
3)戊糖的2’-OH位被氟修饰
正义链中5’-3’方向的第7、9和11位及其他重要位点的核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰;反义链中5’-3’方向的第2、14和16位及其他重要位点的核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰,氟修饰如下:
4)部分或全部2’-OH位被甲氧基或氟修饰
正义链和反义链中核苷酸的戊糖的大部分或全部2’-OH位被甲氧基或氟修饰。
5)末端二个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰
所述磷酸二酯键的修饰是指对磷酸二酯键中的氧进行修饰,包括硫代磷酸修饰、硼烷化磷酸盐修饰等;优选地,磷酸二酯键的修饰是硫代磷酸修饰,能够使本发明提供的小干扰核酸的稳定性更好,并且基本上不会影响小干扰核酸的活性。硫代磷酸修饰如下:
进一步有选地,本发明提供的包含核苷酸修饰的小干扰核酸选自具有以下修饰核苷酸序列的任一组:如SEQ ID NO.96所示正义链和SEQ ID NO.97所示反义链;或如SEQ IDNO.98所示正义链和SEQ ID NO.99所示反义链;或如SEQ ID NO.100所示正义链和SEQ IDNO.101所示反义链;或如SEQ ID NO.102所示正义链和SEQ ID NO.103所示反义链;或如SEQID NO.104所示正义链和SEQ ID NO.105所示反义链;如SEQ ID NO.106所示正义链和SEQID NO.107所示反义链;或如SEQ ID NO.108所示正义链和SEQ ID NO.109所示反义链;或如SEQ ID NO.110所示正义链和SEQ ID NO.111所示反义链;或如SEQ ID NO.112所示正义链和SEQ ID NO.113所示反义链;或如SEQ ID NO.114所示正义链和SEQ ID NO.115所示反义链;或如SEQ ID NO.116所示正义链和SEQ ID NO.117所示反义链;或如SEQ ID NO.118所示正义链和SEQ ID NO.119所示反义链;或如SEQ ID NO.120所示正义链和SEQ ID NO.121所示反义链;或如SEQ ID NO.122所示正义链和SEQ ID NO.123所示反义链;或如SEQ IDNO.124所示正义链和SEQ ID NO.125所示反义链;或如SEQ ID NO.126所示正义链和SEQ IDNO.127所示反义链;或如SEQ ID NO.128所示正义链和SEQ ID NO.129所示反义链;或如SEQID NO.130所示正义链和SEQ ID NO.131所示反义链;或如SEQ ID NO.132所示正义链和SEQID NO.133所示反义链;或如SEQ ID NO.134所示正义链和SEQ ID NO.135所示反义链;或如SEQ ID NO.136所示正义链和SEQ ID NO.137所示反义链;或如SEQ ID NO.138所示正义链和SEQ ID NO.139所示反义链;或如SEQ ID NO.140所示正义链和SEQ ID NO.141所示反义链;或如SEQ ID NO.142所示正义链和SEQ ID NO.143所示反义链;或如SEQ ID 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NO.344所示正义链和SEQ ID NO.345所示反义链;或如SEQ ID NO.346所示正义链和SEQ ID NO.347所示反义链;或如SEQ ID NO.348所示正义链和SEQ ID NO.349所示反义链;或如SEQ ID NO.350所示正义链和SEQ ID NO.351所示反义链;或如SEQ ID NO.352所示正义链和SEQ ID NO.353所示反义链;或如SEQ ID NO.354所示正义链和SEQ ID NO.355所示反义链;或如SEQ ID NO.356所示正义链和SEQ ID NO.357所示反义链;或如SEQ IDNO.358所示正义链和SEQ ID NO.359所示反义链;或如SEQ ID NO.360所示正义链和SEQ IDNO.361所示反义链;或如SEQ ID NO.362所示正义链和SEQ ID NO.363所示反义链;或如SEQID NO.364所示正义链和SEQ ID NO.365所示反义链;或如SEQ ID NO.366所示正义链和SEQID NO.367所示反义链;或如SEQ ID NO.368所示正义链和SEQ ID NO.369所示反义链;或如SEQ ID NO.370所示正义链和SEQ ID NO.371所示反义链。
此外,在本发明上文所述小干扰核酸的基础上,末端可引入有助于透膜的基团,包括但不限于胆固醇、蛋白、多肽、高分子、适配体(aptamer)、维生素、叶酸、胆酸、或脂类等亲脂性分子;或以脂质体、高分子、脂类分子或纳米粒包裹以利于干扰核酸与细胞内的mRNA发生作用。
小干扰核酸(优选siRNA)的化学合成方法是本领域技术人员所公知的,一般来说,所述化学合成的方法包括:(1)寡聚核糖核苷酸的合成;(2)脱保护;(3)纯化分离;(4)脱盐四个步骤。包括但不限于以下方法:设计并获得目标RNA序列后,可在自动DNA/RNA合成仪(例如,AppliedBiosystems EXPEDITE8909)上设定合成1毫摩尔的RNA,同时设定每个循环的偶联时间为10-15分钟,起始物为固相连接的5’-O-对二甲氧基-胸苷支持物,第一个循环在固相支持物上连接一个碱基,然后在第n次(19≥n≥2)循环中,在第n-1次循环所连接的碱基上连接一个碱基,重复此循环直至完成全部核酸序列的合成。将连接有siRNA的固相支持物加入到试管中,并在此试管中加入1-5毫升的乙醇/乙胺(体积比为1∶3),然后密封,置于55-70℃温箱中,孵育2-30小时,取出连接有siRNA的固相支持物并用双蒸水淋洗2-3次(每次约1毫升),收集洗脱液,并在室温下干燥30-40分钟。然后,加入1-5毫升四丁基氟化铵的四氢呋喃溶液(1M),室温放置4-12小时,再加入2-5毫升乙醇,收集沉淀即得到siRNA的粗产物。将得到的siRNA的粗产物溶解于2-5毫升浓度为1-5摩尔/毫升的乙酸铵水溶液中,然后通过C18高压液相色谱进行分离,得到纯化的siRNA产物。用浓度为75重量%的乙醇水溶液洗涤纯化的siRNA产物2-4次(每次2-5毫升),以除去盐份,并室温下干燥。然后将正义链和反义链的寡聚核糖核酸混合溶解在1-2毫升的缓冲液中(10mM Tris,pH=7.5-8.0,50mMNaCl),将此溶液加热至90-95℃,然后缓缓将此溶液冷却至室温,并维持室温16-22小时,得到含有siRNA的溶液。
本发明还提供了一种药物组合物,其中,该药物组合物含有本发明提供的小干扰核酸中的至少一种作为活性成分,以及药学上可接受的载体或者辅料。所述药学上可接受的载体或者辅料包括但不限于以下中的一种或多种:药学上可接受的溶剂、分散剂、附加剂、塑形剂、药物辅料。通常,这些物质是无毒的、惰性的和药学上可接受的载体介质。
在本发明的一个方面,所述药物组合物还包括其他化学治疗剂中的一种或几种。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括但并不限于:肺部、腹膜内、静脉内、或局部给药。
本发明中,所述药物组合物的剂型可以为制药领域中的任意剂型,优选地,所述药物组合物可以为注射液。
本发明还提供了本发明上文所述小干扰核酸在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的应用。优选地,所述冠状病毒是冠状病毒是新型冠状病毒COVID19;进一步优选地,所述感染是肺部感染。
本发明还提供了治疗/缓解/预防冠状病毒(优选新型冠状病毒COVID19)感染的方法,所述方法包括向有需要的受试者施用上文中本发明所述小干扰核酸或其组合物。
具体实施方式
参照以下实施例可以更好地理解本发明。但是,应理解,以下实施例仅用于举例说明目的,而不应被理解为以任何方式限制本发明的保护范围。
实施例1 siRNA的设计与合成
选取Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,complete genome,(NC_045512.2)为mRNA序列为模板,分别针对新型冠状病毒CoV19不同区,设计siRNA分子。
设计原则:长度选择:本研究通过不同的设计工具,选用多种设计模式,包括但不限于19nt+dTdT,21nt,21nt+dTdT,以及21nt+2nt序列悬垂的方式进行设计,从而对比不同设计的差异;有些文献报道证明dTdT悬垂可以增强siRNA在细胞培养基和转染细胞内的核酸酶耐受性和稳定性。化学优化的说明:
修饰目的和效果:由于小干扰核酸(siRNA)的稳定性较差,在体内容易被核酸酶降解,因此我们对具有较强活性的siRNA进行化学修饰,以增加siRNA的血清稳定性,从而有效地抑制目的基因的表达。并且该小干扰核酸包含但不限于以下1-5所示方式之一或组合的修饰:
l)戊糖的2’-OH甲氧基修饰:
正义链和反义链中的胞嘧啶(C)核苷酸和尿嘧啶(U)核苷酸的戊糖的2’-OH位被甲氧基修饰;甲氧基修饰如下:
2)+2碱基悬垂
正义链和反义链向5’端或3’端延伸2个核苷酸达到21碱基+2碱基悬垂;2碱基悬垂具有跟Dicer酶切割dsRNA形成的小干扰RNA相同的结构,这种结构有利于形成RISC诱导沉默复合体,从而提高沉默效率。其序列与其相应的mRNA一致,但是在3’端比互补的RNA链多2个碱基,形成2碱基悬垂。
3)戊糖的2’-OH位被氟修饰
正义链中5’-3’方向的第7、9和11位及其他重要位点的核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰;反义链中5’-3’方向的第2、14和16位及其他重要位点的核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰,氟修饰如下:
4)大部分或全部2’-OH位被甲氧基或氟修饰
正义链和反义链中核苷酸的戊糖的大部分或全部2’-OH位被甲氧基或氟修饰。
5)末端二个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰
正义链和反义链的5’和3’端二个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰,能够使本发明提供的小干扰核酸的稳定性更好,并且基本上不会影响小干扰核酸的活性。硫代磷酸修饰如下:
化学修饰代码注释
在以下序列代号中,
小写字母m表示该字母m右侧的一个核苷酸的核糖基为2’-羟基被甲氧基取代而成的2’-甲氧基核糖基;
小写字母f表示该字母f右侧的一个核苷酸的核糖基为2’-羟基被氟取代而成的2’-氟代核糖基;
小写字母r表示该字母r右侧的一个核苷酸为核糖核苷酸,大写字母表示核苷酸的碱基组成;
*号表示二个核苷酸之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。
例如,在由正义链5’端第1个大写字母C及其左侧的m组成的“mC”表示所含碱基为胞嘧啶、核糖基的2’-羟基被甲氧基取代的核苷酸;由反义链5’端第2个大写字母U及其左侧的f组成的“fU”表示所含碱基为尿嘧啶、核糖基的2’-羟基被氟取代的核苷酸。
siRNA合成方式:
本实验所使用的siRNA由广州锐博、美国IDT和上海生工进行合成和质量确认;其中化学修饰的RNA均从上海生工采购。siRNA采用通用方法合成。
按照从左至右5’端到3’端顺序,设计siRNA分子如表1所示。
表1.新冠病毒siRNA序列
实施例2 siRNA抑制效应的测定
2.1.慢病毒载体的制备
本实施例使用的慢病毒购自南京金斯瑞生物科技有限公司,该慢病毒中插入一段新型冠状病毒(SARS-CoV-2)基因组序列(来源:Severe acute respiratory syndromecoronavirus 2,complete genome,NC_045512.2),以及一段EGFP绿色荧光蛋白基因序列同时带有puroR嘌呤霉素抗性筛选基因)。
2.2.稳转Vero-E6细胞系培养
取vero-E6细胞(来源:中国科学院细胞库)按1x105个细胞/孔接种于24孔板中,培养在DMEM+10%胎牛血清(FBS)+1%sodium Pyuvate培养基中,37℃,5%CO2培养箱中过夜。
将实施例2.1中制备的含有新型冠状病毒基因组和EGFP绿色荧光蛋白基因序列的慢病毒溶液按MOI为1、10、100的滴度分别加入到上述24孔板细胞中,孵育6h后弃液,并更换DMEM+10%FBS+1%sodium Pyuvate培养;
培养48小时后,加入含7ug/ml嘌呤霉素的生长培养基(DMEM+10%FBS+1%sodiumPyuvate+7ug/ml Puromycin),并每三天更换一次培养基,继续培养14天用于细胞筛选。
2.3.siRNA的转染
取构建的稳转Vero-E6细胞系,按1x105个/孔接种于24孔板,于DMEM+10%FBS+1%sodium Pyuvate的培养基中培养,37℃,5%CO2培养箱中,生长过夜后至细胞融合度约为80%。
取实施例1中制备的siRNA干粉5nmol/tube,加250uL DEPC-H2O稀释,从而获得浓度为20pmol/uL的siRNA溶液。用25uL无血清DMEM稀释siRNA,至终浓度分别为10nM和3nM;用25uL无血清DMEM对1.5ul RNAiMAX转染试剂进行稀释;将上述siRNA溶液与稀释的RNAiMAX转染试剂溶液在室温下混合均匀,室温下静置孵育5min后加入到24孔板细胞中,继续培养48h。
2.4.荧光PCR检测siRNA序列抑制率
通过荧光实时定量PCR分别对实施例2.3中转染siRNA的Vero-E6细胞新型冠状病毒mRNA进行检测。
细胞转染siRNA后培养48h,倾去24孔板中的培养液,用500ul PBS洗涤细胞两次。利用FastCell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2试剂盒提取总RNA,Nanodrop仪器上检测提取的RNA浓度。根据HiscriptⅢRT superMIX for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒说明,按照表2体系,取500ng RNA样品制备cDNA:
表2
将上述方法制备的cDNA用DEPC水稀释20倍,作为Q-PCR的模板。利用TaqmanTM Fastadvanced Master Mix试剂盒,按表3条件配制10ul/孔的qPCR反应体系,加入到384孔板中进行检测。每个样品设三个复孔,以b-actin基因作为内参,以EGFP基因作为报告基因,引物序列见表4,探针序列见表5。
表3.PCR反应体系
表4.引物序列:
表5.探针序列:
实验反应如下:
从荧光定量PCR结果来看,相比阴性对照组,siRNA分子均有效降低了新型冠状病毒mRNA的表达率,且抑制率低于或者相当于阳性对照组(锐博生物,siP0000004-1-5,针对靶基因下游eGFP的阳性参照物),可见siRNA分子对新型分子的新型冠状病毒mRNA的表达具有明显的抑制效果,见表6。举例说明,其中,LYG-C114在10nM的浓度下实现和阴性对照(1.0)/或者100%比将靶标ORF3a mRNA抑制到0.03/或者3%的表达水平。可见,本申请涉及的诸多siRNA均能有效抑制靶基因mRNA的表达。
表6.SiRNA对mRNA相对表达水平的抑制
实施例3 siRNA的核苷酸修饰
由于小干扰核酸(siRNA)的稳定性较差,在体内容易被核酸酶降解,因此对本发明中具有较强活性的siRNA进行化学修饰,以增加siRNA的血清稳定性。
基于本发明实施例1中所列siRNA核酸序列对相应siRNA序列核苷酸进行修饰设计,其中,小写字母m表示该字母m右侧的一个核苷酸的核糖基为2’-羟基被甲氧基取代而成的2’-甲氧基核糖基;小写字母f表示该字母f右侧的一个核苷酸的核糖基为2’-羟基被氟取代而成的2’-氟代核糖基;小写字母r表示该字母r右侧的一个核苷酸为核糖核苷酸,大写字母表示核苷酸的碱基组成;*号表示二个核苷酸之间的磷酸酯基为硫代磷酸酯基。例如,在由正义链5’端第1个大写字母C及其左侧的m组成的“mC”表示所含碱基为胞嘧啶、核糖基的2’-羟基被甲氧基取代的核苷酸;由反义链5’端第2个大写字母U及其左侧的f组成的“fU”表示所含碱基为尿嘧啶、核糖基的2’-羟基被氟取代的核苷酸。
通过化学合成方法合成表7中所列siRNA分子:
表7.修饰的siRNA分子
实施例4修饰的siRNA的抑制效果验证
通过荧光定量PCR对实施例3中修饰的siRNA分子的新型冠状病毒mRNA表达抑制效果进行验证与分析。
取上述构建的稳转Vero-E6细胞系,按1x105个/孔接种于24孔板,于DMEM+10%FBS+1%sodium Pyuvate的培养基中培养,37℃,5%CO2培养箱中生长过夜后至细胞融合度约为80%。
取部分实施例3中制备的修饰siRNA干粉5nmol/tube,加250uL DEPC-H2O稀释,从而获得浓度为20pmol/uL的siRNA溶液。用50uL无血清DMEM稀释siRNA,分别配置成终浓度分别为3nM、1nM和0.3nM;用50uL无血清DMEM对1.5ul RNAiMAX转染试剂进行稀释;将上述siRNA溶液与稀释的RNAiMAX转染试剂溶液在室温下混合均匀,室温下静置孵育5min后加入到24孔板细胞中,继续培养48h。按照实施例2.4所述荧光定量PCR所述方法对本发明中修饰的各siRNA的新型分子的新型冠状病毒mRNA表达抑制效果进行验证与分析,其中,根据HiscriptⅢRT superMIX for qPCR(+gDNA wiper)试剂盒说明,取100ng RNA样品制备cDNA。部分结果见表8。举例说明,其中,LYG-C114在0.3nM的浓度下实现和阴性对照1.0(100%)比将靶标ORF3a mRNA抑制到0.11(11%)的表达水平。
从荧光定量PCR结果来看,相比阴性对照组,修饰的siRNA分子均有效降低了新型冠状病毒mRNA的表达率,且抑制率低于或者相当于阳性对照组(锐博生物,siP0000004-1-5,针对靶基因下游eGFP的阳性参照物),可见修饰后siRNA分子对新型分子的新型冠状病毒mRNA的表达具有明显的抑制效果。
表8.化学修饰siRNA对mRNA相对表达的抑制
实施例5.修饰的siRNA的抑制效果验证
通过荧光定量PCR对修饰的siRNA分子的新型冠状病毒mRNA表达抑制效果进行验证与分析。
取上述构建的稳转Vero-E6细胞系,按1x104个/孔接种于96孔板,于DMEM+10%FBS+1%sodium Pyuvate的培养基中培养,37℃,5%CO2培养箱中生长过夜后至细胞融合度约为80%。
取部分实施例3制备的修饰siRNA干粉5nmol/tube,加250uL DEPC-H2O稀释,从而获得浓度为20pmol/uL的siRNA溶液。用25uL opti-MEM培养基稀释siRNA,配置成终浓度分别为3nM、0.3nM和0.03nM或者1nM、0.1nM和0.01nM;用25uL opti-MEM培养基对1.5ulRNAiMAX转染试剂进行稀释;将上述siRNA溶液与稀释的RNAiMAX转染试剂溶液在室温下等体积混合均匀,室温下静置孵育5min后加入10uL到96孔板细胞中,继续培养48h。按照以下5.1荧光定量PCR方法对本发明中部分的修饰siRNA分子的新型冠状病毒mRNA表达抑制效果进行验证与分析。结果见表13-14。举例说明,其中,LYG-C411在1nM的浓度下实现和阴性对照1.0(100%)比将靶标Helicase mRNA抑制到0.23(23%)的表达水平。
5.1荧光定量PCR检测siRNA序列抑制率
通过荧光实时定量PCR分别对转染siRNA的Vero-E6细胞新型冠状病毒mRNA进行检测。
细胞转染siRNA后培养48h,倾去96孔板中的培养液,用50ul PBS洗涤细胞一次。利用Fast Advanced Cells-to-CTTM Kit试剂盒提取总RNA并逆转录为cDNA,按照表9体系,取22.5ul裂解样本制备cDNA:
表9
将上述方法制备的cDNA用DEPC水稀释10倍,作为Q-PCR的模板。利用TaqmanTM Fastadvanced Master Mix试剂盒,按表10条件配制10ul/孔的qPCR反应体系,加入到384孔板中进行检测。每个样品设三个复孔,以b-actin基因作为内参,以EGFP基因或特异性基因作为报告基因,引物序列见表11,探针序列见表12。
表10.PCR反应体系
表11.引物序列:
表12.探针序列:
实验反应如下:
从荧光定量PCR结果来看,相比阴性对照组,修饰的siRNA分子均有效降低了新型冠状病毒mRNA的表达率,且抑制率低于或者相当于阳性对照组(锐博生物,siP0000004-1-5,针对靶基因下游eGFP的阳性参照物),可见修饰后siRNA分子对新型分子的新型冠状病毒mRNA的表达具有明显的抑制效果。
表13.化学修饰siRNA对mRNA相对表达的抑制
表14.化学修饰siRNA对mRNA相对表达的抑制
实施例6.修饰的siRNA的剂量依赖性抑制效果验证
通过荧光定量PCR对修饰的siRNA分子的新型冠状病毒mRNA表达剂量依赖性抑制效果进行验证与分析。
取上述构建的稳转Vero-E6细胞系,按1x104个/孔接种于96孔板,于DMEM+10%FBS+1%sodium Pyuvate的培养基中培养,37℃,5%CO2培养箱中生长过夜后至细胞融合度约为80%。
取制备的修饰siRNA干粉5nmol/tube,加250uL DEPC-H2O稀释,从而获得浓度为20pmol/uL的siRNA溶液。用25uL opti-MEM培养基稀释siRNA,配置成终浓度分别为3nM、1nM、0.3nM、0.1nM、0.03nM、0.01nM、0.003nM和0.001nM;用25uL opti-MEM培养基对1.5ulRNAiMAX转染试剂进行稀释;将上述siRNA溶液与稀释的RNAiMAX转染试剂溶液在室温下等体积混合均匀,室温下静置孵育5min后加入10uL到96孔板细胞中,继续培养48h。按照上述实施例所述荧光定量PCR所述方法对本发明中修饰的各siRNA的新型分子的新型冠状病毒mRNA表达抑制效果进行验证与分析。部分结果见表15。举例说明,其中,LYG-C538在3nM的浓度下实现和阴性对照1.0(100%)比将靶标ORF3a mRNA抑制到0.26(26%)的表达水平。
表15.化学修饰siRNA对mRNA相对表达的剂量依赖性抑制
Claims (9)
1.一种能够抑制新型冠状病毒COVID19表达的小干扰核酸分子,其特征在于,所述小干扰核酸分子包含正义链和反义链,其中正义链包含选自以下序列中至少连续16个与新型冠状病毒mRNA相同的核苷酸序列:如SEQ ID NO.2/4/6/8/10/12/14/16/18/20/22/24/26/28/30/32/34/36/38/40/42/44/46/48/50/52/54/56/58/60/62/64/66/68/70/72/74/76/78/80/82/84/86/88/90/92/94/372中任一所示。
2.根据权利要求1所述小干扰核酸分子,其中,所述小干扰核酸分子是具有以下所述序列的任一组的分子:
如SEQ ID NO.2所示正义链和SEQ ID NO.3所示反义链;或如SEQ ID NO.4所示正义链和SEQ ID NO.5所示反义链;或如SEQ ID NO.6所示正义链和SEQ ID NO.7所示反义链;或如SEQ ID NO.8所示正义链和SEQ ID NO.9所示反义链;或如SEQ ID NO.10所示正义链和SEQID NO.11所示反义链;或如SEQ ID NO.12所示正义链和SEQ ID NO.13所示反义链;或如SEQID NO.14所示正义链和SEQ ID NO.15所示反义链;或如SEQ ID NO.16所示正义链和SEQ IDNO.17所示反义链;或如SEQ ID NO.18所示正义链和SEQ ID NO.19所示反义链;或如SEQ IDNO.20所示正义链和SEQ ID NO.21所示反义链;或如SEQ ID NO.22所示正义链和SEQ IDNO.23所示反义链;或如SEQ ID NO.24所示正义链和SEQ ID NO.25所示反义链;或如SEQ IDNO.26所示正义链和SEQ ID NO.27所示反义链;或如SEQ ID NO.28所示正义链和SEQ IDNO.29所示反义链;或如SEQ ID NO.30所示正义链和SEQ ID NO.31所示反义链;或如SEQ IDNO.32所示正义链和SEQ ID NO.33所示反义链;或如SEQ ID NO.34所示正义链和SEQ IDNO.35所示反义链;或如SEQ ID NO.36所示正义链和SEQ ID NO.37所示反义链;或如SEQ IDNO.38所示正义链和SEQ ID NO.39所示反义链;或如SEQ ID NO.40所示正义链和SEQ IDNO.41所示反义链;或如SEQ ID NO.42所示正义链和SEQ ID NO.43所示反义链;或如SEQ IDNO.44所示正义链和SEQ ID NO.45所示反义链;或如SEQ ID NO.46所示正义链和SEQ IDNO.47所示反义链;或如SEQ ID NO.48所示正义链和SEQ ID NO.49所示反义链;或如SEQ IDNO.50所示正义链和SEQ ID NO.51所示反义链;或如SEQ ID NO.52所示正义链和SEQ IDNO.53所示反义链;或如SEQ ID NO.54所示正义链和SEQ ID NO.55所示反义链;或如SEQ IDNO.56所示正义链和SEQ ID NO.57所示反义链;或如SEQ ID NO.58所示正义链和SEQ IDNO.59所示反义链;或如SEQ ID NO.60所示正义链和SEQ ID NO.61所示反义链;或如SEQ IDNO.62所示正义链和SEQ ID NO.63所示反义链;或如SEQ ID NO.64所示正义链和SEQ IDNO.65所示反义链;或如SEQ ID NO.66所示正义链和SEQ ID NO.67所示反义链;或如SEQ IDNO.68所示正义链和SEQ ID NO.69所示反义链;或如SEQ ID NO.70所示正义链和SEQ IDNO.71所示反义链;或如SEQ ID NO.72所示正义链和SEQ ID NO.73所示反义链;或如SEQ IDNO.74所示正义链和SEQ ID NO.75所示反义链;或如SEQ ID NO.76所示正义链和SEQ IDNO.77所示反义链;或如SEQ ID NO.78所示正义链和SEQ ID NO.79所示反义链;或如SEQ IDNO.80所示正义链和SEQ ID NO.81所示反义链;或如SEQ ID NO.82所示正义链和SEQ IDNO.83所示反义链;或如SEQ ID NO.84所示正义链和SEQ ID NO.85所示反义链;或如SEQ IDNO.86所示正义链和SEQ ID NO.87所示反义链;或如SEQ ID NO.88所示正义链和SEQ IDNO.89所示反义链;或如SEQ ID NO.90所示正义链和SEQ ID NO.91所示反义链;或如SEQ IDNO.92所示正义链和SEQ ID NO.93所示反义链;或如SEQ ID NO.94所示正义链和SEQ IDNO.95所示反义链;或如SEQ ID NO.372所示正义链和SEQ ID NO.373所示反义链。
3.根据权利要求1或2所述小干扰核酸分子,其中,该小干扰核酸分子的核苷酸包含但并不限于有以下一种或多种核苷酸的修饰:
1)正义链和反义链向5’端或3’端延伸2个核苷酸达到21碱基+2碱基悬垂;
2)正义链中5’-3’方向的第7、9和11位及其他重要位点的核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰;
3)反义链中5’-3’方向的第2、14和16位及其他重要位点的核苷酸的戊糖的2’-OH位被氟修饰;
4)正义链和反义链中核苷酸的戊糖的大部分或全部2’-OH位被甲氧基或氟修饰;
5)正义链和反义链中的胞嘧啶(C)核苷酸和尿嘧啶(U)核苷酸的戊糖的2’-OH位被甲氧基修饰;
6)正义链和反义链的5’和3’端二个磷酸二酯键用硫代磷酸修饰。
4.根据权利要求3所述小干扰核酸分子,其中,该小干扰核酸分子是具有以下所述修饰的核酸序列的任一组的分子:
如SEQ ID NO.96所示正义链和SEQ ID NO.97所示反义链;或如SEQ ID NO.98所示正义链和SEQ ID NO.99所示反义链;或如SEQ ID NO.100所示正义链和SEQ ID NO.101所示反义链;或如SEQ ID NO.102所示正义链和SEQ ID NO.103所示反义链;或如SEQ ID NO.104所示正义链和SEQ ID NO.105所示反义链;如SEQ ID NO.106所示正义链和SEQ ID NO.107所示反义链;或如SEQ ID NO.108所示正义链和SEQ ID NO.109所示反义链;或如SEQ ID NO.110所示正义链和SEQ ID NO.111所示反义链;或如SEQ ID NO.112所示正义链和SEQ IDNO.113所示反义链;或如SEQ ID NO.114所示正义链和SEQ ID NO.115所示反义链;或如SEQID NO.116所示正义链和SEQ ID NO.117所示反义链;或如SEQ ID NO.118所示正义链和SEQID NO.119所示反义链;或如SEQ ID NO.120所示正义链和SEQ ID NO.121所示反义链;或如SEQ ID NO.122所示正义链和SEQ ID NO.123所示反义链;或如SEQ ID NO.124所示正义链和SEQ ID NO.125所示反义链;或如SEQ ID NO.126所示正义链和SEQ IDNO.127所示反义链;或如SEQ ID NO.128所示正义链和SEQ ID NO.129所示反义链;或如SEQ ID NO.130所示正义链和SEQ ID NO.131所示反义链;或如SEQ ID NO.132所示正义链和SEQ ID NO.133所示反义链;或如SEQ ID NO.134所示正义链和SEQ ID NO.135所示反义链;或如SEQ IDNO.136所示正义链和SEQ ID NO.137所示反义链;或如SEQ ID NO.138所示正义链和SEQ IDNO.139所示反义链;或如SEQ ID NO.140所示正义链和SEQ ID NO.141所示反义链;或如SEQID NO.142所示正义链和SEQ ID NO.143所示反义链;或如SEQ ID NO.144所示正义链和SEQID NO.145所示反义链;或如SEQ ID NO.146所示正义链和SEQ ID NO.147所示反义链;或如SEQ ID NO.148所示正义链和SEQ ID NO.149所示反义链;或如SEQ ID NO.150所示正义链和SEQ ID NO.151所示反义链;或如SEQ ID NO.152所示正义链和SEQ ID NO.153所示反义链;或如SEQ ID NO.154所示正义链和SEQ ID NO.155所示反义链;或如SEQ ID NO.156所示正义链和SEQ ID NO.157所示反义链;或如SEQ ID NO.158所示正义链和SEQ ID NO.159所示反义链;或如SEQ ID NO.160所示正义链和SEQ ID NO.161所示反义链;或如SEQ IDNO.162所示正义链和SEQ ID NO.163所示反义链;或如SEQ ID NO.164所示正义链和SEQ IDNO.165所示反义链;或如SEQ ID NO.166所示正义链和SEQ ID NO.167所示反义链;或如SEQID NO.168所示正义链和SEQ ID NO.169所示反义链;或如SEQ ID NO.170所示正义链和SEQID NO.171所示反义链;或如SEQ ID NO.172所示正义链和SEQ ID NO.173所示反义链;或如SEQ ID NO.174所示正义链和SEQ ID NO.175所示反义链;或如SEQ ID NO.176所示正义链和SEQ ID NO.177所示反义链;或如SEQ ID NO.178所示正义链和SEQ ID NO.179所示反义链;或如SEQ ID NO.180所示正义链和SEQ ID NO.181所示反义链;或如SEQ ID NO.182所示正义链和SEQ ID NO.183所示反义链;或如SEQ ID NO.184所示正义链和SEQ ID NO.185所示反义链;或如SEQ ID NO.186所示正义链和SEQ ID NO.187所示反义链;或如SEQ IDNO.188所示正义链和SEQ ID NO.189所示反义链;或如SEQ ID NO.190所示正义链和SEQ IDNO.191所示反义链;或如SEQ IDNO.192所示正义链和SEQ ID NO.193所示反义链;或如SEQID NO.194所示正义链和SEQ ID NO.195所示反义链;或如SEQ ID NO.196所示正义链和SEQID NO.197所示反义链;或如SEQ ID NO.198所示正义链和SEQ ID NO.199所示反义链;或如SEQ ID NO.200所示正义链和SEQ ID NO.201所示反义链;或如SEQ ID NO.202所示正义链和SEQ ID NO.203所示反义链;或如SEQ ID NO.204所示正义链和SEQ ID NO.205所示反义链;或如SEQ ID NO.206所示正义链和SEQ ID NO.207所示反义链;或如SEQ ID NO.208所示正义链和SEQ ID NO.209所示反义链;或如SEQ ID NO.210所示正义链和SEQ ID NO.211所示反义链;或如SEQ ID NO.212所示正义链和SEQ ID NO.213所示反义链;或如SEQ IDNO.214所示正义链和SEQ ID NO.215所示反义链;或如SEQ ID NO.216所示正义链和SEQ IDNO.217所示反义链;或如SEQ ID NO.218所示正义链和SEQ ID NO.219所示反义链;或如SEQID NO.220所示正义链和SEQ ID NO.221所示反义链;或如SEQ ID NO.222所示正义链和SEQID NO.223所示反义链;或如SEQ ID NO.224所示正义链和SEQ ID NO.225所示反义链;或如SEQ ID NO.226所示正义链和SEQ ID NO.227所示反义链;或如SEQ ID NO.228所示正义链和SEQ ID NO.229所示反义链;或如SEQ ID NO.230所示正义链和SEQ ID NO.231所示反义链;或如SEQ ID NO.232所示正义链和SEQ ID NO.233所示反义链;或如SEQ ID NO.234所示正义链和SEQ ID NO.235所示反义链;或如SEQ ID NO.236所示正义链和SEQ ID NO.237所示反义链;或如SEQ ID NO.238所示正义链和SEQ IDNO.239所示反义链;或如SEQ IDNO.240所示正义链和SEQ ID NO.241所示反义链;或如SEQ ID NO.242所示正义链和SEQ IDNO.243所示反义链;或如SEQ ID NO.244所示正义链和SEQ ID NO.245所示反义链;或如SEQID NO.246所示正义链和SEQ ID NO.247所示反义链;或如SEQ ID NO.248所示正义链和SEQID NO.249所示反义链;或如SEQ ID NO.250所示正义链和SEQ ID NO.251所示反义链;或如SEQ ID NO.252所示正义链和SEQ ID NO.253所示反义链;或如SEQ ID NO.254所示正义链和SEQ ID NO.255所示反义链;或如SEQ ID NO.256所示正义链和SEQ ID NO.257所示反义链;或如SEQ ID NO.258所示正义链和SEQ ID NO.259所示反义链;或如SEQ ID NO.260所示正义链和SEQ ID NO.261所示反义链;或如SEQ ID NO.262所示正义链和SEQ ID NO.263所示反义链;或如SEQ ID NO.264所示正义链和SEQ ID NO.265所示反义链;或如SEQ IDNO.266所示正义链和SEQ ID NO.267所示反义链;或如SEQ ID NO.268所示正义链和SEQ IDNO.269所示反义链;或如SEQ ID NO.270所示正义链和SEQ ID NO.271所示反义链;或如SEQID NO.272所示正义链和SEQ ID NO.273所示反义链;或如SEQ ID NO.274所示正义链和SEQID NO.275所示反义链;或如SEQ ID NO.276所示正义链和SEQ ID NO.277所示反义链;或如SEQ ID NO.278所示正义链和SEQ ID NO.279所示反义链;或如SEQ ID NO.280所示正义链和SEQ ID NO.281所示反义链;或如SEQ ID NO.282所示正义链和SEQ ID NO.283所示反义链;或如SEQ ID NO.284所示正义链和SEQ ID NO.285所示反义链;或如SEQ ID NO.286所示正义链和SEQ ID NO.287所示反义链;或如SEQ ID NO.288所示正义链和SEQ ID NO.289所示反义链;或如SEQ ID NO.290所示正义链和SEQ ID NO.291所示反义链;或如SEQ IDNO.292所示正义链和SEQ ID NO.293所示反义链;或如SEQ ID NO.294所示正义链和SEQ IDNO.295所示反义链;或如SEQ ID NO.296所示正义链和SEQ ID NO.297所示反义链;或如SEQID NO.298所示正义链和SEQ ID NO.299所示反义链;或如SEQ ID NO.300所示正义链和SEQID NO.301所示反义链;或如SEQ ID NO.302所示正义链和SEQ ID NO.303所示反义链;或如SEQ ID NO.304所示正义链和SEQ ID NO.305所示反义链;或如SEQ ID NO.306所示正义链和SEQ ID NO.307所示反义链;或如SEQ ID NO.308所示正义链和SEQ ID NO.309所示反义链;或如SEQ ID NO.310所示正义链和SEQ ID NO.311所示反义链;或如SEQ ID NO.312所示正义链和SEQ ID NO.313所示反义链;或如SEQ ID NO.314所示正义链和SEQ ID NO.315所示反义链;或如SEQ ID NO.316所示正义链和SEQ ID NO.317所示反义链;或如SEQ IDNO.318所示正义链和SEQ ID NO.319所示反义链;或如SEQ ID NO.320所示正义链和SEQ IDNO.321所示反义链;或如SEQ ID NO.322所示正义链和SEQ ID NO.323所示反义链;或如SEQID NO.324所示正义链和SEQ ID NO.325所示反义链;或如SEQ ID NO.326所示正义链和SEQID NO.327所示反义链;或如SEQ ID NO.328所示正义链和SEQ ID NO.329所示反义链;或如SEQ ID NO.330所示正义链和SEQ ID NO.331所示反义链;或如SEQ ID NO.332所示正义链和SEQ IDNO.333所示反义链;或如SEQ ID NO.334所示正义链和SEQ ID NO.335所示反义链;或如SEQ ID NO.336所示正义链和SEQ ID NO.337所示反义链;或如SEQ ID NO.338所示正义链和SEQ ID NO.339所示反义链;或如SEQ ID NO.340所示正义链和SEQ ID NO.341所示反义链;或如SEQ ID NO.342所示正义链和SEQ ID NO.343所示反义链;或如SEQ IDNO.344所示正义链和SEQ ID NO.345所示反义链;或如SEQ ID NO.346所示正义链和SEQ IDNO.347所示反义链;或如SEQ ID NO.348所示正义链和SEQ ID NO.349所示反义链;或如SEQID NO.350所示正义链和SEQ ID NO.351所示反义链;或如SEQ ID NO.352所示正义链和SEQID NO.353所示反义链;或如SEQ ID NO.354所示正义链和SEQ ID NO.355所示反义链;或如SEQ ID NO.356所示正义链和SEQ ID NO.357所示反义链;或如SEQ ID NO.358所示正义链和SEQ ID NO.359所示反义链;或如SEQ ID NO.360所示正义链和SEQ ID NO.361所示反义链;或如SEQ ID NO.362所示正义链和SEQ ID NO.363所示反义链;或如SEQ ID NO.364所示正义链和SEQ ID NO.365所示反义链;或如SEQ ID NO.366所示正义链和SEQ ID NO.367所示反义链;或如SEQ ID NO.368所示正义链和SEQ ID NO.369所示反义链;或如SEQ IDNO.370所示正义链和SEQ ID NO.371所示反义链。
5.一种药物组合物,其特征在于,该药物组合物含有权利要求1-4中任一项所述的小干扰核酸分子作为活性成分。
6.根据权利要求5所述药物组合物,其中,该药物组合物还包含药学可接受的载体和/或辅料。
7.权利要求1-4任一项所述小干扰核酸分子在制备用于预防和/或治疗冠状病毒感染药物中的应用。
8.根据权利要求7所述应用,其中冠状病毒是新型冠状病毒COVID19。
9.根据权利要求8所述应用,其中,所述感染是肺部感染。
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