JP2008541754A - Hcv特異的な低分子干渉rnaおよびそれを含むc型肝炎の治療剤 - Google Patents

Hcv特異的な低分子干渉rnaおよびそれを含むc型肝炎の治療剤 Download PDF

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Abstract

本発明は、有効成分としてHCV特異的な低分子干渉RNA(siRNA)を含むC型肝炎の治療剤に関する。本発明のsiRNAは、哺乳類細胞においてウイルスのRNAの分解を誘導し、それによってHCVタンパク質の発現および複製を阻害する、HCVのヌクレオチド配列に特異的な二本鎖RNAである。合成siRNAまたはこのRNAをコードするDNAベクターを投与する段階を含む本発明の方法は、それゆえ、HCV遺伝子の発現および複製を阻害することによりHCVキャリアの治療に有効である。

Description

本発明は、有効成分としてHCV特異的な低分子干渉RNA(siRNA)を含むC型肝炎の治療剤に関する。
世界中で2億7千万人以上の人々がC型肝炎ウイルス(HCV)に慢性的に感染していると考えられている。このウイルス病原にかかっている患者の40から60%は肝硬変または肝細胞がん(HCC)を進行しうる。しかし、その感染を予防するための有効なワクチンが存在していない。主な抗HCV治療の1つは、アルファインターフェロン(IFN−α)単独またはリバビリンとの組み合わせによる治療である。しかし、現在の治療法では効果が限られており、一定のHCV遺伝子型に対して反応が乏しい。それゆえ、HCV感染を治療するための新しい治療の開発が望まれている。
RNA干渉(RNAi)は、全ての真核生物において進化的に保存された過程であり、(内在性および外因性)遺伝子の発現が二本鎖RNA(dsRNA)の誘導によって阻害される。RNAiはダイサーと呼ばれるRNaseIII様エンドヌクレアーゼによって開始される。このダイサーは、長いdsRNAの21〜23ntの低分子干渉RNA(siRNA)への連続的な切断を促進する(Bernsteinら, Nature, 409: 363, 2001)。siRNAは、ATPの存在下でsiRNAを巻き戻す、RNA誘導サイレンシング複合体(RISC)に取り込まれる(Hammondら, Nature, 404: 293, 2000)。RISCに取り込まれたアンチセンスRNAは細胞質領域内で相同RNAを認識し、それらの分解を指示する。
30nt以上の長さのdsRNAは、プロテインキナーゼR(PKR)およびRNase Lを活性化する非特異的なインターフェロン(IFN)反応を誘導する(Balachandranら, Immunity, 13: 129, 2000)。PKRおよびRNase L活性の誘導は、最終的には、特に哺乳類細胞において、非特異的なmRNAの分解を導き、mRNAの翻訳を阻害する。しかし、siRNAはインターフェロン経路を回避するには十分に短く、配列特異性をもって遺伝子のサイレンシングを指示する(Elbashirら, Nature, 411: 494, 2001)。siRNAの作成は、長いdsRNA要素を部分的または全体的に抱えるトランスポゾン、導入遺伝子およびウイルスにより引き起こされる遺伝子の侵入から保護することを期待されている(Plasterk, Science, 296: 1263, 2002; Zamore, Science, 296: 1265, 2002; Hannon, Nature, 418: 244, 2002)。
ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、C型肝炎ウイルス(HCV)、ポリウイルス、等のごとき病原RNAウイルスの複製を阻害するsiRNAを選択するための多くの試みが行われてきた(Novinaら, Nat Med, 8: 681, 2002; Wilsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 2783, 2003; Getlinら, Nature, 418: 430, 2002)。特に、HCVのセンス鎖RNAはアンチセンス鎖RNAの合成だけではなく、翻訳およびウイルス構築に関連することからRNAiの主な候補である。
HCVは外被ウイルスであり、フラビウイルス科に属する。ヌクレオチド配列の構成に基づいて、少なくとも6つの遺伝子型に分けられる。HCVゲノムは、単一の翻訳領域(ORF)からなる〜9.6kbのプラス鎖RNAであり、5’および3’末端に非翻訳領域(UTR)が隣接する。このORFは約3000aa長の単一長ポリタンパク質をコードし、翻訳と同時または翻訳後に少なくとも10個のウイルスタンパク質:コア、E1、E2、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、およびNS5Bに加工される(Bradley, Curr. Top Microbiol. Immunol., 242: 1, 2000; ReedとRice, Curr. Top Microbiol. Immunol., 242: 55, 2000)。ウイルス複製周期において、マイナス鎖RNAが非構造(NS)タンパク質からなる複製酵素複合体によってウイルスゲノムRNAから新規に合成される(Kimら, J. Virol., 76: 6944, 2002)。この中間体マイナス鎖RNAは、単一ORFのポリタンパク質に翻訳されるか、または成熟ウイルス粒子のウイルス構造タンパク質でキャプシド形成される、ウイルスゲノムRNAの増幅のための鋳型としての役割を果たす。
HCV複製の分子および免疫学的な研究は利便的な動物モデルの不足によって妨げられ、インビトロ細胞培養系が利用されてきた。高力価のHCV患者の血清を用いると培養細胞で一次感染が生じるが、HCV複製の詳細な研究のための効率的なウイルス増幅の条件は確立されていなかった。この障壁を回避するため、ヒト肝細胞腫系統Huh−7に感染後、高いレベルで自立的に複製する、選別可能なサブゲノムRNAが開発された(Lohmannら, Science, 285: 110, 1999)。Cからp7またはNS2までの構造領域を欠くサブゲノムHCV RNAのレプリコンは、HCV IRESの下流にネオマイシントランスフェラーゼ(ネオ)をコードする選別マーカー遺伝子を挿入することにより構築され、HCV NSタンパク質の発現は、脳心筋炎ウイルス(EMCV)のIRESにより制御された。HCV複製を理解する上での著しい進歩が、このサブゲノムレプリコン系または適応性変異を抱えるこの遺伝学的改変クローンを用いることにより可能となった。
HCV感染の代替的な治療の開発が早急に必要であることから、HCVレプリコン系は抗ウイルス剤としてのHCV特異的なsiRNAを開発するために広く用いられている(Randallら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100: 235, 2003; Kapadiaら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100: 2014, 2003; Wilsonら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100: 2783, 2003; Yolotaら, EMBO Reports, 4: 602, 2003; Kronkeら, J. Virol, 78: 3436, 2004; Yukiら, 2004, Microbiol. Immunol., 48, 591)。
国際特許公開番号WO/03/070750およびWO2005/012525、ならびに米国特許公開番号US2004/0209831は、HCVに対するsiRNAについて記載する。しかし、これらのsiRNAはHCVゲノムの全領域に対してではない。選択されたsiRNAのRNAi効果を調べるため、構造領域Cからp7までを含まないサブゲノムHCVレプリコンRNAが有用なスクリーンの道具として用いられている。しかしながら、HCV RNAゲノムの全領域に対して有効なsiRNAを体系的に選択することが必要とされている。
本発明では、発明者らは、細胞に基づいたレプリコン系に全長HCV RNAを導入し、ウイルス複製および発現を阻害する効果を測定した。結果として、本発明者らは、特定の配列を有するsiRNAが効果的にHCVタンパク質の発現およびRNAの合成を阻害できることを立証して本発明を完成させた。
本発明の目的は、HCV特異的なsiRNA、siRNAを発現する発現ベクター、ならびに有効成分としてsiRNAまたはsiRNA発現ベクターを含むC型肝炎の治療および予防のための医薬組成物を提供することである。
上記目的を解決するために、本発明は、配列番号1〜36のヌクレオチド配列のうちの1つ、またはその相補物、またはその一部を含む核酸分子を提供する。
本発明はまた、siRNAを発現する発現ベクターを提供する。
本発明はさらに、有効成分としてsiRNAまたはsiRNA発現ベクターを含む、C型肝炎の治療および予防のための医薬組成物を提供する。
本発明はまた、siRNAまたはsiRNA発現ベクターを患者に注入する段階を含むHCV感染に関連した病気の治療方法を提供する。
以下、本発明の詳細を記載する。
本発明は、配列番号1〜36のヌクレオチド配列のうちの1つ、またはその相補物、またはその一部を含む単離された核酸分子を提供する。
好ましい具体例では、siRNAは、2つの相補的な合成RNAのハイブリダイゼーション、または細胞におけるRNAをコードするベクターの送達により得られる。ウイルス複製の有効な阻害に関して、HCV全長RNAにおける断片の標的配列が配列番号1〜36として選択された。
siHCV−55:5’−CUACUGUCUUCACGCAGAA−3’(配列番号1);
siHCV−74:5’−AGCGUCUAGCCAUGGCGUU−3’(配列番号2);
siHCV−207:5’−CCCGCUCAAUGCCUGGAGA−3’(配列番号3);
siHCV−523:5’−GGCGACAACCUAUCCCCAA−3’(配列番号4);
siHCV−704:5’−GGUCAUCGAUACCCUCACG−3’(配列番号5);
siHCV−845:5’−UCUGCCCGGUUGCUCCUUU−3’(配列番号6);
siHCV−929:5’−CGUAUCCGGAGUGUACCAU−3’(配列番号7);
siHCV−968:5’−CGCAAGCAUUGUGUAUGAG−3’(配列番号8);
siHCV−1264:5’−UAUAUCCCGGCCACGUGAC−3’(配列番号9);
siHCV−1631:5’−UGACUCCCUCAACACUGGG−3’(配列番号10);
siHCV−1980:5’−GGCAACUGGUUUGGCUGUA−3’(配列番号11);
siHCV−2486:5’−AUGGGAGUAUGUCCUGUUG−3’(配列番号12);
siHCV−3013:5’−UCUUGCUCGCCAUACUCGG−3’(配列番号13);
siHCV−3061:5’−CCAAAGUGCCGUACUUCGU−3’(配列番号14);
siHCV−3122:5’−GGUUGCUGGGGGUCAUUAU−3’(配列番号15);
siHCV−7284:5’−GGCACAUGGUAUCGACCCU−3’(配列番号16);
siHCV−7796:5’−UGACGGGCUUUACCGGCGA−3’(配列番号17);
siHCV−8373:5’−CGAGGUUACUACCACACAC−3’(配列番号18);
siHCV−8504:5’−CAGGCAGCGUGGUCAUUGU−3’(配列番号19);
siHCV−8546:5’−AGCCGGCCAUCAUUCCCGA−3’(配列番号20);
siHCV−8572:5’−GUCCUUUACCGGGAGUUCG−3’(配列番号21);
siHCV−8672:5’−UCGGGUUGCUGCAAACAGC−3’(配列番号22);
siHCV−8749:5’−GCCUUCUGGGCGAAGCAUA−3’(配列番号23);
siHCV−9117:5’−CCUACUCCCUGCUAUCCUC−3’(配列番号24);
siHCV−9650:5’−CAUUCCCCAUUAACGCGUA−3’(配列番号25);
siHCV−10464:5’−GAGGACGGUUGUCCUGUCA−3’(配列番号26);
siHCV−10486:5’−UCUACCGUGUCUUCUGCCU−3’(配列番号27);
siHCV−10881:5’−GAAGGUCACCUUUGACAGA−3’(配列番号28);
siHCV−11048:5’−AGGACGUCCGGAACCUAUC−3’(配列番号29);
siHCV−11196:5’−GCCAGCUCGCCUUAUCGUA−3’(配列番号30);
siHCV−11476:5’−GCCAGACAGGCCAUAAGGU−3’(配列番号31);
siHCV−11796:5’−ACCAGAAUACGACUUGGAG−3’(配列番号32);
siHCV−11996:5’−GGAUGAUCCUGAUGACUCA−3’(配列番号33);
siHCV−12509:5’−CGGGGAGCUAAACACUCCA−3’(配列番号34);
siHCV−12520:5’−ACACUCCAGGCCAAUAGGC−3’(配列番号35);および
siHCV−12680:5’−AGGUCCGUGAGCCGCUUGA−3’(配列番号36)。
合成siRNAの安定性、またはウイルス標的RNAとsiRNA断片間の特異的な相互作用を増加させるため、siRNAの両鎖の3’末端は化学合成によってdTdTに伸長された。好ましい具体例では、合成siRNAは、その生理的安定性を獲得し、かつ細胞内におけるその分布を追跡するために化学誘導体または標識分子で内部修飾されうる。
本発明はまた、各鎖RNAの3’末端がそれらの安定性のためにdTdTに伸長された合成siRNAで誘導されるRNAi活性を示す。合成RNAはレプリコン細胞系統で〜80%まで遺伝子発現を効果的に阻害する。合成siRNAまたはベクターのそれを必要とする患者への投与による、HCVに感染した肝炎ウイルスキャリアを治療するための新しい治療の試みであろう。
本発明はまた、siRNA発現のための発現ベクターを提供する。
好ましい具体例では、shRNA(低分子ヘアピン型RNA)が独立して単一のプロモーターから転写され、細胞のダイサーにより二本鎖siRNAに加工されうる。代替的には、二本鎖siRNAの各鎖は、2つの別々のプロモーターから反対または平行方向に発現され、ハイブリダイズし、次いで標的RNAの分解を誘導する。siRNAを発現するベクターは転写開始のプロモーターだけではなくエンハンサー、転写終結シグナル、または他の発現調節配列を含む。ベクターは、裸のプラスミドDNA、移入剤もしくは標的送達物質との複合体、または組み換えウイルスベクターの形態として細胞核に送達されうる。ベクターの構成は、移入する細胞の状態もしくは型、siRNA発現の時期およびレベル、ならびにその他のごとき特定の状況により決定される。
本発明は、収束性逆方向プロモーターから転写されるsiRNAを直接発現するベクターpRNAiDuを提供する(図1を参照)。ベクターは、2つの収束性RNAポリメラーゼIIIプロモーター(H1とU6)およびEGFP−FlucをコードするmRNAの転写を誘導するSV40プロモーターを含む。特に、pRNAiDuベクターにおいて、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)とホタルルシフェラーゼ(Fluc)の融合遺伝子、EGFP−FlucがSV40プロモーターの下流に含まれる。実験的に、これは、移入効率を可視化し、定量的にモニターし、蛍光または発光の検出によってRNAi活性を標準化するのに有用である(KaykasとMoon, BMC Cell Biology, 5: 16, 2004; Zhengら, Proc Natl Acad Sci USA, 101: 135, 2004)。
本発明者らは、発現ベクターで形質転換されたE.coliを2005年5月16日付けで韓国生命工学研究院(KRIBB)の生命工学研究院生物支援センター(KCTC)に寄託した(受託番号:KCTC 10800BP)。
合成siRNAの安定性または標的RNAとsiRNA断片間の特異的な相互作用を高めるため、siRNA両鎖の3’末端は化学合成によってdTdTに伸長された。siRNA発現ベクターにおいて、3’末端の2つのヌクレオチドUUは、RNA転写の最終段階でポリメラーゼIII終結配列から作成される。RNA干渉(RNAi)の効果は検出時間および移入したDNA濃度に依存し、タンパク質発現およびウイルスRNA転写のレベル各々の50%および60%未満の阻害を引き起こす。siRNAベクターから発現される高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)の量が、FACS解析によると移入効率50%を示すことから、選択したsiRNAが劇的かつ特異的な抗ウイルス効果を誘導することが考えられうる。特に、5’リン酸化プライマーを用いたPCR増幅法によりベクターから分離したsiRNA発現カセットは、RNAi効果を誘導する必須要素である。
本発明はさらに、有効成分としてsiRNAまたは発現ベクターを含むC型肝炎の治療または予防のための医薬組成物を提供する。
本発明は、Huh−7細胞系統で安定に維持される全長レプリコンRNA、FK/R2ANを基にした、C型肝炎ウイルス(HCV)RNAを標的とする低分子干渉RNA(siRNA)分子の知見に基づく。ウイルス特異的なsiRNAはこの外因性RNAの分解を誘導し、最終的に、哺乳類細胞におけるウイルスタンパク質の発現およびウイルスの複製を阻害する。これは、siRNAまたは発現ベクターが有効成分としてC型肝炎の治療組成物に含まれうることを示唆する。
本発明のsiRNAは化学的または酵素的に合成されうる(Caruthersら, Methods in Enzymology, 211: 3, 1992; Wicottら, Nucleic Acids Res, 23: 2677, 1995; Brennanら, Biotechnol Bioeng, 61: 33, 1998)。
本発明のsiRNAまたはベクターは、リポソーム、ハイドロゲル、生体接着性微粒子およびこれらの類似物のごとき移入物質を用いることにより標的細胞に送達されうる(Akhtarら, Trends Cell Bio, 2: 139, 1992)。
医薬組成物は、HCV感染を治療するための器官標的物質および医薬上許容されるキャリアとともに本発明のsiRNAもしくはベクターを含む。医薬組成物の濃度は、投与経路、製剤の性質、肝臓不全の段階、患者の大きさ、重量、または分布範囲、ならびに患者の年齢と性別のごとき特定の状況により治療上決定されうる。
本発明の治療組成物は、組成物の総重量の0.0001〜50重量%の有効成分を含む。
本発明の組成物はさらに、活性成分と同一または類似の機能を有する1つまたはそれ以上の有効成分を含みうる。
本発明の組成物はまた、上記の有効成分に加えて、1つまたはそれ以上の投与用の医薬上許容されるキャリアを含みうる。医薬上許容されるキャリアは、生理食塩水、蒸留水、リンゲル液、緩衝生理食塩水、ブドウ糖溶液、マルトブドウ糖溶液、グリセロール、エタノールおよびリポソームから成る群から選択される1つ以上の成分を混合することにより選択または製造されうる。抗酸化剤、緩衝水溶液、静菌剤などのごとき他の一般的な添加物が添加されうる。注射用溶液、ピル、カプセル、顆粒もしくはタブレット錠剤を製造するために、希釈剤、噴霧剤、界面活性剤、結合剤および潤滑剤がさらに添加されうる。本発明の組成物はさらに、各病気に適する形態に、あるいはRemington’s Pharmaceutical Science(最新刊)、Mack Publishing Company、Easton PAに表記される方法による成分によって調製されうる。
本発明の組成物は経口または非経口(例えば、静脈内、皮下内、局所または腹膜の注射)で投与されうる。組成物の有効な濃度は、重量、年齢、性別、健康状態、食事、投与の頻度、投与方法、排泄量および病気の重症度によって決定されうる。本発明の組成物の濃度は1日あたり0.1〜100mg/kgであり、好ましくは1日あたり0.5〜10mg/kgである。投与の頻度は1日1回または好ましくは1日数回である。
本発明のsiRNAまたはsiRNA発現ベクターがマウスに静脈内注射されることにより、毒性が調べられた。結果として、その推定されるLD50値がマウスにおいて1000mg/kg以上であることから、安全な物質であると評価された。
本発明はまた、siRNAまたはsiRNA発現ベクターを患者に注入する段階を含む、HCV感染に関連する病気の治療方法を提供する。
本発明は、合成siRNAまたは二本鎖siRNAをコードするベクターの治療上の適用ならびにウイルスキャリア中でHCV複製を阻害するsiRNAを含む組み合わせ治療を示す。
(図面の説明)
本発明の好ましい具体例の適用は添付した図面を参照にすると最も良く理解される。
図1は、pRNAiDuプラスミドの模式図である。
図2は、HCV特異的なsiRNA発現用に構築されたsiRNA発現カセットの模式図である。
図3は、全長HCVレプリコン、FK/R2ANの模式図である。
図4および図5は、FK/R2AN細胞におけるHCV複製に対するRNAiの効果を示す図である。図4は、HCV全長レプリコン、FK/R2ANの細胞が、陽性コントロール、HCV特異的、またはRluc siRNAを発現するsiRNAベクターを移入され、二重ルシフェラーゼアッセイにより試験されたことを表す図である。図5は、HCV全長レプリコン細胞が、PCR増幅法により作成されたsiRNA発現カセットを移入され、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイにより試験されたことを表す図である。
図6は、siRNA発現ベクターを移入された細胞におけるHCVレプリコンRNAのリアルタイムRT−PCR解析の結果を示す図である。
図7および図8は、合成siRNAによるHCVレプリコン、FK/R2ANのRNAi効果を表す。図7は、HCVコアおよびβ−アクチンに特異的なモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を表す写真である。図8は、選択したsiRNA候補のRNAi活性を確認するために、合成siRNAで処理したFK/R2AN細胞において、レポータータンパク質の発現レベルを表すRlucアッセイの結果を表す図である。
図9は、化学的に合成したsiHCV7284を送達したFK/R2AN細胞のウイルスRNAレベルを表す図である。
本発明の実施および現在の好ましい具体例を以下の実施例で示されるように例示する。
しかし、この開示を考慮に入れた上で、当業者は本発明の精神と範囲内で修飾と改良をなし得ると考えられるだろう。
実施例1:siRNAおよびsiRNA発現ベクター
哺乳類細胞において、これまでのsiRNAベクターは、ポリ(A)シグナル配列と一緒にRNAポリメラーゼIIIプロモーター(U6、H1、およびtRNAプロモーターなど)またはRNAポリメラーゼIIプロモーターから低分子ヘアピン型RNA(shRNA)を転写するように設計されていた(Brummelkampら, Cancer Cell, 2: 243, 2002; Tushcl, Nat. Biotechnol., 20: 446, 2002; Xiaら, Nat. Biotechnol., 20: 1006, 2002)。しかし、shRNAベクターは複数の欠点を示す。それらの非天然型二次構造が細菌内でそれらを合成し、配列決定することを困難にしており、それらを作成するためのDNAオリゴマーはハイスループットスクリーンの場合では費用がかかりうる。さらに、多様なsiRNAライブラリーを構築するための付加配列を含まずに、プロモーターから終結シグナルまでを含むsiRNA発現カセットを作成することは容易ではない。shRNA発現ベクターのこれらの限定を回避するために、本発明者らはsiRNAを直接発現するベクターを構築した。siRNAは収束性逆方向プロモーターから転写され、それをpRNAiDuと名付けた(図1)。
本発明者らは、発現ベクターで形質転換されたE.coliを2005年5月16日付けで韓国生命工学研究院(KRIBB)の生命工学研究院生物支援センター(KCTC)に寄託した(受託番号:KCTC 10800BP)。
このベクターは2つの収束性RNAポリメラーゼIIIプロモーター(H1とU6)およびEGFP−FlucをコードするmRNAの転写を誘導するSV40プロモーターを含む。特に、pRNAiDuベクターにおいて、高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)およびホタルルシフェラーゼ(Fluc)の融合遺伝子EGFP−FlucがSV40プロモーターの下流に含まれる。実験的には、これは、移入効率を可視化し、かつ定量的にモニターし、蛍光または発光の検出によってRNAi活性を標準化することに有用である(KaykasとMoon, BMC Cell Biology, 5: 16, 2004; Zhengら, Proc Natl Acad Sci USA, 101: 135, 2004)。
ヒトU6とH1プロモーターの両方を改変することにより、−5から−1までの位置の5つのチミジンヌクレオチドのRNAポリメラーゼIII終結配列、ならびに−12から−6までの位置のBamHIおよびHindIIIのそれぞれの各部位が含まれた。U6プロモーターが効率的に転写開始するためにはプリンヌクレオチドが好ましいことから、siRNAの最初のヌクレオチド配列がピリミジンである場合には、グアニジンがU6プロモーターの+1位置下流に挿入される。この付加ヌクレオチドで誘導される人為的な効果を最小限にし、RNAi工程におけるアンチセンスsiRNAと標的RNA間の逐次的なハイブリダイゼーションを確保するために、U6プロモーターがアンチセンスRNAの転写を担い、該アンチセンスRNAがRISCに指図して相同なmRNAが切断されることを考え出した。siRNA発現プラスミドを作出するために、36塩基対のオリゴヌクレオチドがアニールされ、BamHIとHindIIIで消化したpRNAiDuに結合された(図2)。図2において、siRNA転写の開始部位を矢印で示す。
U6とH1プロモーターからのsiRNA発現カセットの単離をPCR増幅法により行った。U6順方向プライマー(5’−CGGAATTCCCCAGTGGAAAGAC−3’:配列番号37)およびH1順方向プライマー(5’−CGGAATTCATATTTGCATGTCGC−3’:配列番号38)の両方を、リン酸で各オリゴヌクレオチド5’末端を修飾することにより調製した。各々のsiRNA発現カセットをHCV特異的、陰性コントロール、または陽性コントロールsiRNA配列を含む対応pRNAiDuプラスミドから増幅した。全てのPCR反応を以下の通りに行った:94℃で45秒、50℃で1分および72℃で1分を30サイクル。PCR産物をキアクイック(Qiaquick)PCR精製キット(キアゲン(Qiagen)、米国)を用いて精製し、それらの濃度をUV−分光光度計で定量的に測定した。
実施例2:HCV特異的siRNAによるFK/R2ANレプリコンのタンパク質発現の阻害
Huh−7細胞系統および遺伝子型1bのHCV全長レプリコンRNAを安定的に支持するそのレプリコン細胞系統(Huh−7FK/R2AN)をS.K.Jang博士(PanBioNet、韓国)からいただいた。FK/R2ANレプリコンは、Rlucとネオコード領域間に口蹄疫ウイルス(FMDV)2Aプロテアーゼのシグナル配列挿入を有する、HCV全長レプリコンRNA、FK/RNからの改変型(韓国特許公開番号2004−32341)である。HCVレプリコンを有する細胞系統を10%FBS(ギブコ(Gibco)、米国)および600mg/ml G418(Calbiochem、米国)を含むDMEM中で培養し、全実験に使用した。
siRNA発現プラスミドもしくはPCR産物のDNAまたは合成siRNAオリゴヌクレオチドの移入を、製造業者の説明書に従って、リポフェクタミン(Lipofectamine) 2000 Reagent(インビトロゲン(Invitrogen)、米国)を用いて12−ウェルプレートで行った。簡単に説明すると、1.5×10のHun−7 FK/R2AN細胞をプレートに播き、翌日、0.6mgのsiRNA発現DNAまたは80nMのsiRNA二本鎖を送達した。レポータータンパク質としてレプリコンRNAから発現されるウミシイタケルシフェラーゼ(Rluc)活性を、移入したDNAベクターから発現されるホタルルシフェラーゼ(Fluc)活性を用いて調整し、あるいはPCR産物または合成siRNAを移入する場合には総タンパク質量によって補正して移入効率を標準化した。
レプリコン細胞中の全細胞タンパク質を移入後3日間培養し、ルシフェラーゼ活性をDual−Gloルシフェラーゼアッセイ系(プロメガ(Promega)、米国)またはウミシイタケルシフェラーゼアッセイ系(プロメガ、米国)を用いて定量してHCV特異的なsiRNAによるRNAi効果を間接的にモニターした。
細胞質中のHCV複製におけるsiRNAにより媒介されるRNAi効果を測定するために、本発明者らはHCV全長HCVレプリコン系を利用した。このHCVレプリコンRNA、FK/R2ANにおいて、RlucとネオのmRNA配列をHCVのNS2とNS3翻訳領域の間に導入し、ポリオウイルスIRESの制御下でタンパク質を発現させた。この融合タンパク質は、Rlucとネオ翻訳領域間の口蹄疫ウイルス(FMDV)2Aプロテアーゼのシグナル配列の切断によって分離したタンパク質として加工されることになる。これは、安定的にレプリコンRNAおよびその発現を維持する細胞の選択を可能にし、また細胞溶解物のルシフェラーゼ活性をモニターすることによる複製レベルの正確な定量を可能にする(図3)。H−I、HCVの配列内リボソーム進入部位(IRES);コア−NS2、コアからNS2までのHCV翻訳領域;P−I、ポリオウイルスのIRES;Rluc、ウミシイタルシフェラーゼ遺伝子;2A、口蹄疫ウイルス(FMDV)2Aプロテアーゼ切断部位;ネオ、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子;E−I、脳心筋炎ウイルス(EMCV)のIRES;NS3−NS5B、NS3からNS5BまでのHCV翻訳領域;3’UTR、HCVの3’非翻訳領域。
有効な抗ウイルス効果を有するHCV特異的なsiRNAの選択のため、本発明者らは、36個のHCVのsiRNA候補、市販のsiRNA発現ベクター(アンビオン(Ambion)、米国)から単離された1個の陰性コントロールRNA、あるいは本発明者らの研究室で3個の候補から実験的に活性のある配列としてスクリーンしたRluc特異的なsiRNAを設計した。
これら38個のsiRNA、すなわち、陰性コントロールに対して1個で、その他はHCVレプリコンRNAに相当するもののサイレンシング効果をモニターするため、本発明者らは、siRNAが収束性の逆方向のヒトU6とH1プロモーターから転写されるsiRNA発現プラスミドを調製し、PCR増幅法によってsiRNA発現カセットも作出した。各DNAとも、別個独立にFK/R2ANレプリコン細胞に移入し、レプリコンRNAに対する2つの異なるsiRNA発現系によって影響される複製レベルを、Rluc活性を測定することにより比較した(図4および図5)。
図4および図5は、FK/R2AN細胞におけるHCV複製に対するRNAiの効果を示す図である。HCV全長レプリコン、FK/R2ANの細胞に、陽性コントロール、HCV特異的、またはRluc siRNAを発現するsiRNAベクターを移入した。移入3日後に内部ウミシイタケルシフェラーゼ活性を測定し、二重ルシフェラーゼアッセイによって移入したDNAベクターから指示されるホタルルシフェラーゼ活性で標準化した。HCV全長レプリコン細胞に、PCR増幅法で作成したsiRNA発現カセットを移入した。siRNA陰性コントロールの割合として、すなわち平均±標準偏差として値を示す。レプリコンRNAにおけるsiRNA標的の遺伝子位置を模式的に表した。少なくとも3つの別個独立した実験からの代表的なデータを示す。
図4および図5に示すように、FK/R2AN細胞へのプラスミドの移入から生じたこのレポーター遺伝子発現の阻害解析結果は、RNAi効果を指示する遺伝学的に必須な要素を含む同等量のPCR産物の移入から生じたものと厳密に適合する。テストした38個の誘因因子のうち、siHCV−523、1631、7284、8373、8504、8794、11048、11996、および12509のsiRNAが共通して最も高い効果を示した。特に、ベクターに基づいた系において、最も高い能力のHCVsiRNAはタンパク質発現を〜35−50%減少させた(図4)。これらのプラスミドDNAのリポフェクタミン 2000 reagent(インビトロゲン、米国)を用いたFK/R2AN細胞への移入効率がFACS解析によると約50%に達することを考慮に入れると、これらの抑制レベルは、細胞質に分布するウイルスRNAがsiRNAにより誘導されるサイレンシング経路によってすべて根絶されうることを示す。
ベクターに基づいたsiRNAは、PCR産物に基づいたsiRNAが阻害するより高い能力でHCVレプリコンの発現を阻害した(図5)。これは、PCR産物の直鎖状DNAと比較して環状DNAの高い移入効率および細胞生存率の上昇によって引き起こされるのかもしれない。PCR産物と比較したHCV特異的siRNA発現ベクターによるレプリコンの阻害レベルは:siHCV−523では35%であるのに対して33%;siHCV−1631では18%であるのに対して42%;siHCV−7284では44%であるのに対して51%;siHCV−8373では26%であるのに対して48%;siHCV−8504では34%であるのに対して49%;siHCV−8749では36%であるのに対して39%;siHCV−11048では17%であるのに対して44%;siHCV−11996では23%であるのに対して36%;siHCV−12509では18%であるのに対して36%;およびsiRlucでは67%であるのに対して66%であった。siRNA発現ベクターのクローンを、代替的なアプローチによる遺伝子サイレンシング効果のさらなる研究に用いた。
本発明において、本発明者らは、HCVの5’UTR特異的なsiRNAを含む3つの異なるプラスミドを調製した。この領域がsiRNA治療の発展に最も望ましい領域であると考えられていたためである。しかし、本発明者らは、これらのsiRNAによるHCVゲノムレプリコンの有意な抑制を観察できなかった。それは、この二次構造があまりに安定であるため、RISCに取り込まれたsiRNAが、ワトソン−クリック塩基対の巻き戻しと置換によって標的領域に近づけないか、あるいは細胞またはウイルスのタンパク質がこの領域を一緒に阻害してウイルス遺伝子の発現およびキャプシド形成を調節し、siRNAの標的に望ましくないことを起こすからだと予想されうる。
実施例3:ベクター媒介HCV siRNAによるウイルス転写の減少
合計RNAを、陰性コントロールまたはHCVレプリコン特異的siRMA発現ベクターを移入したFK/R2AN細胞から、移入後2日目に、製造業者の説明書に従って、Trizol LS reagent(インビトロゲン、米国)を用いて抽出した。単離した合計RNAをRNase−free DNase(プロメガ、米国)で消化した。最終的に、RNAの絶対量を、UV−分光光度計を用いて260nm/280nmのUV吸光度を測定することにより定量した。
インビトロ抗ウイルス活性を定量的リアルタイムRT−PCR(Sequence Detection System 5700;アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)、米国)を用いて測定した。移入した細胞から単離した500ngの合計RNAを、TaqMan One−step RT−PCR Master Mix Reagents(アプライドバイオシステムズ(Applied Biosystems)、米国)を用いて50μlの反応体積中でリアルタイムRT−PCRを行った。標準RNAを、T7RNAポリメラーゼによる5’UTR RNAのインビトロ転写により調製した。HCV 5’UTR領域に特異的なプライマーおよびプローブ配列は、5’−TCTGCGGAACCGGTGAGTA−3’(順方向プライマー;配列番号39)、5’−ATTGAGCGGGTTGATCCAAGAAA−3’(逆方向プライマー;配列番号40)および5’−(蛍光)CCGGAATTGCCAGGACGACCG(TAMRA)−3’(プローブ;配列番号41)を含む。合計RNA量を、同時に内部コントロールとしてヒトアクチン遺伝子を標的とするリアルタイムRT−PCRを行うことにより精密に調節した。アクチン遺伝子に対するプライマーおよびプローブ配列は、5’−GCGCGGCTACAGCTTCA−3’(順方向プライマー;配列番号42)、5’−TCTCGTTAATGTCACGAT−3’(逆方向プライマー;配列番号43)および5−(蛍光)CACCACGGCCGAGCGGGA(TAMRA)−3’(プローブ;配列番号44)を含む。全ての実験を3回ずつ行った。
選択したsiRNA発現ベクターを移入したFK/R2AN細胞中のHCVのRNAレベルを正確に定量するために、本発明者らは、HCV 5’UTRおよびアクチン遺伝子に特異的なプライマーを用いてリアルタイムRT−PCRを行った(図6)。
図6は、siRNA発現ベクターを移入した細胞におけるHCVレプリコンRNAのリアルタイムRT−PCR解析の結果を表す図である。FK/R2AN細胞に、12ウェルプレートにおいて、陰性コントロール、HCV特異的、またはRluc siRNAを発現する600ngのpRNAiDuプラスミドを送達した。定量解析のために、HCV RNA値をアクチンRNAの値で標準化した。合計RNAのマイクログラムあたりのHCV RNAコピー数を測定した。少なくとも3つの独立した実験から得た代表的なデータ(平均±標準偏差)を示す。
図6に示されるように、定量解析は、HCV転写レベルが、移入後2日にsiHCV−8749または11996を移入した細胞で62%に、およびsiHCV−523を移入した細胞で47%にそれぞれ減少したことを明らかにした。同様の阻害解析結果を、PCR産物に基づいたsiRNAカセットを用いた移入実験においてRNAレベルを測定することにより得た。これらの結果は、タンパク質レベルで最も高い阻害効果を示す選択HCV siRNAが、ウイルスRNAの分解を誘導することによりレプリコンRNAレベルをも著しく減少させることを示す。予想外なことに、siHCV−7284クローンはウイルスRNAレベルの有意な減少を示さなかった。本発明者らは、siRNA発現ベクターから生成される各siRNA量が種々の時間で一定ではなく、細胞における転写効率と生理的な安定性によって影響されうると推測する。
実施例4:合成siRNAによるRNAi効果の検出
本発明者らは、合成センスおよびアンチセンスsiRNAを調製し、それらをアニールさせてコントロールsiRNA、siHCV−7284およびsiHCV−8749各々に相当する二本鎖RNAにした。それらのヌクレオチド配列は以下の通りである:コントロールsiRNAのセンス鎖、5’−ACUACCGUUGUUAUAGGUGTT−3’(配列番号45);コントロールsiRNAのアンチセンス鎖、5’−CACCUAUAACAACGGUAGUTT−3’(配列番号46);siHCV−7284のセンス鎖、5’−GGCACAUGGUAUCGACCCUTT−3’(配列番号47);siHCV−7284のアンチセンス鎖、5’−AGGGUCGAUACCAUGUGCCTT−3’(配列番号48);siHCV−8749のセンス鎖、5’−GCCUUCUGGGCGAAGCAUATT−3’(配列番号49);siHCV−8749のアンチセンス鎖、5’−UAUUCGCCCAGAAGGCTT−3’(配列番号50)。FK/R2AN細胞を同等濃度の80nM siRNAで処理し、2日目にリアルタイムRT−PCRによるRNA転写レベルの定量および移入後3日目にルシフェラーゼ活性アッセイまたはウェスタンブロットアッセイによるレプリコンタンパク質レベルの測定のために回収した。全ての移入濃度をコントロールsiRNAで80nMの最終濃度にした。全ての実験を少なくとも3回ずつ実施した(図7および図8)。
図7および図8は、合成siRNAによるHCVレプリコン、FK/R2ANのRNAiの効果を示す。図8は、HCVコアおよびアクチンに特異的なモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を示す写真の1組である。合成siRNAで処理したFK/R2ANからの細胞溶解物の合計タンパク質30mgにウェスタンブロット解析を行った。15%SDS−PAGEを用いてタンパク質を分離し、Immobilon−P膜(membrane)(ミリポア(Millipore)、米国)に移行させた。ブロット物をHCVコアおよびアクチン(シグマ(Sigma)、米国)に特異的なモノクローナル抗体(Affinity BioReagent(登録商標)、米国)で検出し、セイヨウワサビペルオキシダーゼ抱合ヤギ抗マウス抗体(KPL、米国)と反応させた。ブロット物をSuper Signal Sest Pico Chemiluminescent基質(Pierce、米国)で発色させた。合成siRNAを各々、FK/R2AN細胞に移入し、HCVコアタンパク質レベルを移入後3日目のウェスタンブロット解析により視覚化した(上)。アクチンの発現レベルもまた調べた(下)。タンパク質溶解物をSDS/15%PAGEゲルで電気泳動した。親のHuh−7細胞(列1)およびレプリコン細胞であるFK/R2AN(列2)からのサンプルを示す。80nMのコントロールsiRNA(列3)あるいは10nM(列4)、20nM(列5)、40nM(列6)または80nM(列7)のsiHCV−7284を移入したFK/R2AN細胞を解析した。最終的な濃度をコントロールsiRNA(列4−6)で80nMにした。
ゲノム全域のsiRNA候補から選択したHCV siRNAのRNAi活性を確認するために、本発明者らは、合成siRNAを送達したFK/R2AN細胞におけるレポータータンパク質発現のレベルをRlucアッセイによって調べた。コントロールsiRNA、siHCV−7284およびsiHCV−8749に相当する化学的に合成されたsiRNAの3’突出をUUの代わりにdTdTにすることでそれらの安定性を確保した。
図8に示されるように、合成siRNAもまた、濃度依存的な形でHCVレプリコンを阻害した。コントロールsiRNAの移入によるウミシイタケルシフェラーゼレベルを100%とすると、siHCV−7284による遺伝子発現の阻害効果は75%であった。それは、siRNAのサイレンシング活性が、ベクターまたはPCR産物に基づくsiRNA発現DNAよりも合成siRNAを用いることによって、より急激に飽和したことを示す。
以前、siHCV−7284 siRNAを発現するpRNAiDuが、ウイルスRNA転写レベルではなくウイルスタンパク質レベルを減少させることにより、有意なRNAi効果を示すことが観察された。本発明者らは、このsiRNA量が検出限界点における飽和した遺伝子サイレンシング効果を誘導するのに十分に発現されていないと推測した。この推測を試すために、本発明者らは、同一の移入条件下で細胞質への同様のsiRNA送達効率を発揮する合成siRNAの移入によりレプリコンRNAレベルを測定し、リアルタイムRT−PCRを用いてそれらのRNAi効果を比較した(図9)。
80nMの化学的に合成された陰性コントロールsiRNAあるいは10nM、20nM、40nMまたは80nMのsiHCV−7284を送達したFK/R2AN細胞のウイルスRNAレベルを定量的に解析した。最終濃度をコントロールsiRNAで80nMにした。HCV RNAの値をアクチンRNAの値で標準化した。合計RNAのマイクログラムあたりのHCV RNAコピー数を測定した。誤差のバーは3つの独立した実験の平均の標準偏差を示す。
図9に示されるように、siHCV−7284もまた、siHCV−8749と同様に濃度依存的な形でレプリコンRNAレベルを大幅に減少させた。
これまで説明したように、本発明は、HCV特異的なsiRNA、siRNAを発現するDNAベクター、ならびに有効成分としてsiRNAまたは発現ベクターを含むC型肝炎の治療および予防のための医薬組成物を提供する。合成siRNAまたは本発明のRNAをコードするDNA分子の投与は、HCV遺伝子発現および複製の阻害を起こした。それゆえ、本発明のsiRNAおよびDNAベクターは、C型肝炎ウイルス慢性キャリアの治療に効果的に使用され得る。
(配列表の説明)
配列番号1−36に示される配列は、HCV全長RNAの標的ヌクレオチド配列であり、
配列番号37および38に示される配列は各々、U6順方向プライマーおよびH1順方向プライマーであり、
配列番号39−41に示される配列は、HCV5’UTR特異的なプライマーおよびプローブ配列であり、
配列番号42−44に示される配列は、β−アクチン遺伝子のプライマーおよびプローブ配列であり、
配列番号45−50に示される配列は、コントロールsiRNAのsiHCV−7284およびsiHCV−8749各々に相当する合成センスおよびアンチセンスsiRNA配列である。
当業者は、前記に開示される概念および特定の具体例が、本発明と同一の目的を達成するための他の具体例を改良または設計する基礎として容易に利用されうることを理解するであろう。当業者はまた、かかる同等の具体例が添付の請求項を説明すると同時に本発明の精神および範囲から切り離せないことを理解するだろう。
図1は、pRNAiDuプラスミドの模式図である。 図2は、HCV特異的なsiRNA発現用に構築されたsiRNA発現カセットの模式図である。 図3は、全長HCVレプリコン、FK/R2ANの模式図である。 図4および図5は、FK/R2AN細胞におけるHCV複製のRNAi効果を示す図である。図4は、HCV全長レプリコン、FK/R2ANの細胞が、陽性コントロール、HCV特異的、またはRluc siRNAを発現するsiRNAベクターを移入され、二重ルシフェラーゼアッセイにより試験されたことを表す図である。 図5は、HCV全長レプリコン細胞が、PCR増幅法により作成されたsiRNA発現カセットを移入され、ウミシイタケルシフェラーゼアッセイにより試験されたことを表す図である。 図6は、siRNA発現ベクターを移入された細胞におけるHCVレプリコンRNAのリアルタイムRT−PCR解析の結果を示す図である。 図7および図8は、合成siRNAによるHCVレプリコン、FK/R2ANのRNAi効果を表す。図7は、HCVコアおよびβ−アクチンに特異的なモノクローナル抗体を用いたウェスタンブロット解析の結果を表す写真である。 図8は、選択したsiRNA候補のRNAi活性を確認するために、合成siRNAで処理したFK/R2AN細胞において、レポータータンパク質の発現レベルを表すRlucアッセイの結果を表す図である。 図9は、化学的に合成したsiHCV7284を送達したFK/R2AN細胞のウイルスRNAレベルを表す図である。

Claims (15)

  1. 配列番号1〜36のヌクレオチド配列のうちの1つ、またはその相補物、またはその一部を含む、単離された核酸分子。
  2. 配列番号4、10、16、18、19、23、29、33もしくは34のヌクレオチド配列のうちの1つ、またはその相補物、またはその一部を含む、請求項1に記載の単離された核酸分子。
  3. 請求項1の核酸分子のセンスおよびアンチセンス配列とハイブリダイズした、単離された核酸分子。
  4. 核酸分子が低分子干渉RNA(siRNA)である、請求項3に記載の単離された核酸分子。
  5. センス鎖およびアンチセンス鎖の3’末端がdTdT分子に連結されている、請求項3に記載の単離された核酸分子。
  6. センス鎖およびアンチセンス鎖がリンカー分子を媒介して共有結合している、請求項3に記載の単離された核酸分子。
  7. リンカー分子がポリヌクレオチドリンカーである、請求項5に記載の単離された核酸分子。
  8. リンカー分子が非ヌクレオチドリンカーである、請求項5に記載の単離された核酸分子。
  9. HCV RNAに結合する、請求項1に記載の単離された核酸分子。
  10. 請求項1に記載のヌクレオチド配列を含むDNAベクター。
  11. 請求項2に記載のヌクレオチド配列を含むDNAベクター。
  12. 有効成分として請求項1〜請求項9の核酸分子のうちの1つ、または請求項10もしくは請求項11のDNAベクターを含む、HCV感染に関連した病気の治療のための医薬組成物。
  13. 組成物がさらに医薬上許容されるキャリアを含む、請求項12に記載の医薬組成物。
  14. 請求項1〜請求項9の核酸分子のうちの1つ、または請求項10もしくは請求項11のDNAベクターを標的の患者に注入する段階を含む、HCV感染に関連した病気の治療方法。
  15. 図1で表されるsiRNA発現ベクター、pRNAiDu(受託番号:KCTC 10800BP)。
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