KR20060124454A

KR20060124454A - Ｈｃｖ 유전자에 특이적인 작은 간섭 ｒｎａ 및 그를유효성분으로 포함하는 ｃ형 간염 치료제

Info

Publication number: KR20060124454A
Application number: KR1020050046392A
Authority: KR
Inventors: 김미현; 신덕향; 박만훈
Original assignee: 재단법인 목암생명공학연구소
Priority date: 2005-05-31
Filing date: 2005-05-31
Publication date: 2006-12-05
Also published as: WO2006129961A1; JP2008541754A; US20090318531A1; KR100733186B1

Abstract

본 발명은 HCV 유전자에 특이적인 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA)를 유효 성분으로 포함하는 C형 간염 치료제에 관한 것이다. 본 발명의 siRNA는 HCV 염기서열에 특이적으로 반응하는 이중 가닥 RNA로 포유동물 세포에서 바이러스 RNA의 분해를 유도하여 HCV 바이러스 단백질의 발현 및 바이러스의 복제를 억제하였다. 본 발명은 합성된 siRNA 분자, RNA 분자를 코딩하는 DNA 벡터를 투여함으로써 HCV 유전자 발현 및 바이러스의 복제를 억제하여 C형 간염 바이러스 보균자를 치료하는데 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

C형 간염 바이러스, HCV, siRNA

Description

ＨＣＶ 유전자에 특이적인 작은 간섭 ＲＮＡ 및 그를 유효성분으로 포함하는 Ｃ형 간염 치료제{Small Interfering RNA specific for HCV and Therapeutic Agent for Hepatitis C Comprising the Same}

도 1은 pRNAiDu 플라스미드를 나타낸 개요도이다.

도 2는 HCV에 특이적인 siRNA를 발현하기 위해 제작된 siRNA 발현 카세트를 나타낸 개요도이다.

도 3은 전장(full-length) HCV 레플리콘(replicon), FK/R2AN을 나타낸 개요도이다.

도 4는 FK/R2AN 세포에서 HCV 복제에 대한 RNAi의 효과를 나타낸 결과로 도 4a는 HCV 전장 레플리콘 FK/R2AN 세포를 양성 대조군, HCV 특이적인 또는 Rluc siRNA를 발현하는 벡터로 형질감염 후 듀얼 루시퍼라제 분석(Dual Luciferase Assay)에 의해 나타낸 그래프이고, 도 4b는 HCV 전장 레플리콘 세포에 PCR 증폭으로 제작된 siRNA 발현벡터를 형질감염 후 레닐라 루시퍼라제 분석(Renilla Luciferase Assay)에 의해 나타낸 그래프이다.

도 5는 siRNA 발현 벡터로 형질감염된 세포에서 HCV 레플리콘 RNA를 실시간 RT-PCR 분석으로 나타낸 그래프이다.

도 6은 HCV 레플리콘, FK/R2AN에서 합성 siRNA에 의한 RNAi 효과를 나타낸 결과로 도 6a는 HCV 코어 및 β-액틴에 특이적인 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 사진이고, 도 4b는 게놈에 널리 분포되어 있는 siRNA 후보물로부터 선택된 HCV siRNA의 RNAi 활성을 확인하기 위하여, 합성 siRNA가 처리된 FK/R2AN 세포에서 리포터 단백질 발현의 수준을 Rluc 분석을 나타낸다.

도 7은 화학적으로 합성된 siHCV-7284가 전달된 FK/R2AN 세포의 바이러스 RNA 수준을 정량적으로 분석하였다.

본 발명은 HCV 유전자에 특이적인 작은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA)를 유효 성분으로 포함하는 C형 간염 치료제에 관한 것이다.

세계적으로 2억 7천명 이상의 사람들이 만성적으로 C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus, HCV)에 감염되어 있다고 추정된다. 상기 바이러스 항원을 가지고 있는 환자의 40-60%는 간경변(liver cirrhosis) 또는 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC)으로 발전할 수 있다. 하지만, 상기 바이러스의 감염을 막을 수 있는 백신은 개발되어 있지 않다. 주요 항-HCV 치료법 중의 하나는 알파 인터페론(IFN-α) 또는 리바비린(ribavirin)과 함께 병용하여 치료하는 것 이다. 그러나 현 치료 처방은 제한된 효율 및 낮은 반응율을 가지고 있어, HCV 감염을 치료할 새로운 치료법의 개발이 시급하다.

RNA 간섭(RNA interference, RNAi)은 모든 진핵세포에 이중 가닥 RNA(dsRNA)을 도입함으로써 (내인성과 외인성) 유전자의 발현이 억제되는 진화적으로 보존되어 있는 과정이다. RNAi는 긴 dsRNA를 21-23 nt의 작은 간섭 RNA(short interfering, siRNA)로 연속적으로 절단하는 Dicer라 부르는 RNase III-유사 엔도뉴클라제에 의해 개시된다(Bernstein et al., Nature, 409: 363, 2001). siRNA는 ATP 존재하에서 siRNA를 푸는 RNA-유도된 침묵화 복합체(RNA-induced silencing complex, RISC)에 삽입된다(Hammond et al., Nature, 404: 293, 2000). RISC에 삽입된 안티센스 RNA는 상동 RNA를 인지하고 세포내 세포질에서 그의 분해를 유도한다.

30 nt 이상의 dsRNA는 비특이적인 인터페론 반응을 유도하여 단백질 키나제 K(protein kinase K, PKR) 및 RNase L을 활성화시킨다( Balachandran et al., Immunity, 13: 129, 2000). PKR 및 RNase L 활성의 유도는 궁극적으로 포유동물 세포에서 비특이적으로 mRNA를 분해하고, mRNA의 번역을 억제한다. 그러나 siRNA는 인터페론 경로는 피하고 염기서열 특이적으로 유전자 침묵화를 유도할 수 있을 만큼 충분히 짧다(Elbashir et al., Nature, 411: 494, 2001). siRNA의 생성은 부분적으로 또는 전체적으로 긴 dsRNA를 가지고 있는 전이인자(transposon), 전이유전자(transgene) 및 바이러스에 의한 유전적 침입을 보호하는 것으로 예상된다(Plasterk, Science, 296: 1263, 2002; Zamore, Science, 296: 1265, 2002; Hannon, Nature, 418: 244, 2002).

인간 면역 결핍 바이러스(human immunodeficiency virus, HIV), C형 간염 바이러스, 폴리오바이러스 등과 같은 병원성 RNA 바이러스의 복제를 억제하기 위하여 siRNA를 선택하기 위한 많은 시도들이 시행되어지고 있다(Novina et al., Nat Med, 8: 681, 2002; Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 2783, 2003; Getlin et al., Nature, 418: 430, 2002). 특히, HCV의 센스 가닥 RNA는 안티-센스 가닥 RNA의 합성뿐만 아니라 번역 및 바이러스의 조립(assembly)에 관련되어 있기 때문에 RNAi에 대한 주요 표적 후보이다.

HCV는 Flaviviridae과에 속하는 외피를 가진(enveloped) 바이러스이다. 뉴클레오티드 염기서열 조성에 따라 적어도 6개의 유전자형으로 구분된다. HCV 게놈은 5' 및 3' 말단 측면에 비번역부위(untranslated regions, UTRs)가 위치한 하나의 개방형 판독틀(open reading frame, ORF)로 구성된 ~9.6 kb의 양성-가닥RNA이다. 상기 ORF는 약 3,000개의 아미노산으로 이루어진 하나의 긴 폴리단백질을 암호화하고 상기 단백질은 번역동안 또는 번역 후 코어(Core), E1, E2, p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A, 및 NS5B 등 10개의 바이러스 단백질로 가공된다(Bradley, Curr. Top Microbiol. Immunol., 242: 1, 2000; Reed and Rice, Curr. Top Microbiol. Immunol., 242: 55, 2000). 바이러스 복제하는 동안, 음성-가닥 RNA는 비구조(nonstructural, NS) 단백질로 구성된 복제효소(replicase) 복합체에 의하여 바이러스 게놈으로부터 처음부터(de novo) 합성된다(Kim et al., J. Virol., 76: 6944, 2002). 상기 중간체 음성-가닥 RNA는 바이러스 게놈 RNA의 증폭을 위한 주 형으로 사용되고 증폭된 바이러스 게놈 RNA는 하나의 ORF의 폴리단백질로 번역되거나 또는 성숙한 바이러스 입자를 만들기 위해 바이러스의 구조 단백질로 캡시드를 형성한다.

HCV 복제의 분자생물학적 및 면역학적 연구는 편리한 동물 모델 및 실험실 조건에서 사용 가능한 세포배양 시스템의 결여로 인한 장애가 있다. 고-역가 HCV 환자 혈청으로 배양된 세포에 일차 감염을 시키기도 하지만, HCV의 상세한 연구를 위한 효과적인 바이러스의 증폭 조건은 확립되어 있지 않다. 상기 장애를 극복하기 위하여, 인간 간암 세포주 Huh-7로 형질감염 후, 높은 수준으로 자율적으로 복제하는 선택적인 하부게놈(subgenomic) RNA가 개발되었다(Lohmann et al., Science, 285: 110, 1999). C에서 p7 또는 NS2까지 구조 부위가 결여된 하부게놈 HCV RNA의 레플리콘을 네오마오신 인산전달효소(neo) 선택 마커 유전자 및 뇌심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus, EMCV)의 IRES에 의하여 HCV NS 단백질들이 발현되는 HCV IRES 하부(downstream)를 삽입함으로써 제작되었다. 상기 하부게놈 레플리콘 시스템 또는 그것의 적응된 돌연변이를 가지고 있는 유전적으로 변형된 클론으로 HCV 복제를 연구하는데 상당한 진보가 이루어지게 하고 있다.

HCV 감염을 치료하기 위한 선택적인 치료법의 개발이 시급하기 때문에, HCV 리플리콘 시스템은 항-바이러스 시약으로 HCV-특이적인 siRNA를 개발하기 위하여 광범위하게 적용될 수 있다(Randall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100: 235, 2003; Kapadia et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100: 2014, 2003; Wilson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 100: 2783, 2003; Yolota et al., EMBO Reports, 4: 602, 2003; Kronke et al., J. Virol, 78: 3436, 2004; Yuki et al., 2004, Microbiol. Immunol., 48, 591).

국제 공개 특허 WO/03/070750 및 WO 2005/012525, 및 미국 공개 특허 US 2004/0209831에서도 HCV에 대한 siRNA를 보고하고 있지만, 전장의 HCV 게놈이 아닌 일부의 HCV 게놈을 이용하여 효과를 확인하였다. 선택된 siRNA의 RNAi 효과를 조사하기 위하여, C에서 p7까지 구조부위를 포함하지 않은 하부게놈 HCV 레플리콘 RNA은 유용한 스크리닝 도구로 이용될 수 있다. 그러나 아직까지 자연 상태에서 존재하는 바이러스의 전체 게놈 수준에서 효과적인 RNAi를 유도하는 HCV에 대한 siRNA는 개발된 바 없다. 따라서, HCV RNA 게놈 전체 부위에 대해 조직적으로 효과적인 siRNA를 개발하여야 할 필요성이 끊임없이 대두되었다.

이에, 본 발명자들은 전장 HCV RNA를 이용하여 세포에 기반을 둔 레플리콘 시스템을 도입하였고, 바이러스 복제 및 발현을 억제할 수 있는 siRNA의 효능을 분석한 결과, 특정 서열을 갖는 siRNA가 보다 효율적으로 HCV 바이러스 단백질의 발현 및 RNA 합성을 감소시킬 수 있음을 확인함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 HCV에 특이적인 siRNA, 상기 siRNA를 발현하는 벡터 및 상기 siRNA 또는 siRNA를 발현하는 벡터를 유효성분으로 함유하는 C형 간염 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 36으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 염기 서열 또는 상보적 가닥 또는 그의 일부를 포함하는 핵산 분자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA를 발현하는 발현벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 siRNA 또는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 C형 간염 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, siRNA 또는 발현벡터를 유효성분으로 대상체에 주입하는 단계를 포함하는 HCV 감염으로 인한 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1 내지 36으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 염기 서열 또는 그의 상보적 가닥 또는 그의 일부의 염기 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자를 제공한다.

본 발명의 일실시태양에서, siRNA는 두개의 상보적인 합성 RNA를 혼성화 함으로써 또는 RNA를 코딩하는 벡터를 세포로 전달함으로써 수득된다. 바이러스의 복제를 효율적으로 억제하기 위하여, HCV 전장 RNA에 있는 표적 염기서열을 서열번호 1 내지 36으로 선택하였다.

siHCV-55: 5'-CUACUGUCUUCACGCAGAA-3' (서열번호: 1);

siHCV-74: 5'-AGCGUCUAGCCAUGGCGUU-3' (서열번호: 2);

siHCV-207: 5'-CCCGCUCAAUGCCUGGAGA-3' (서열번호: 3);

siHCV-523: 5'-GGCGACAACCUAUCCCCAA-3' (서열번호: 4);

siHCV-704: 5'-GGUCAUCGAUACCCUCACG-3' (서열번호: 5);

siHCV-845: 5'-UCUGCCCGGUUGCUCCUUU-3' (서열번호: 6);

siHCV-929: 5'-CGUAUCCGGAGUGUACCAU-3' (서열번호: 7);

siHCV-968: 5'-CGCAAGCAUUGUGUAUGAG-3' (서열번호: 8);

siHCV-1264: 5'-UAUAUCCCGGCCACGUGAC-3' (서열번호: 9);

siHCV-1631: 5'-UGACUCCCUCAACACUGGG-3' (서열번호: 10);

siHCV-1980: 5'-GGCAACUGGUUUGGCUGUA-3' (서열번호: 11);

siHCV-2486: 5'-AUGGGAGUAUGUCCUGUUG-3' (서열번호: 12);

siHCV-3013: 5'-UCUUGCUCGCCAUACUCGG-3' (서열번호: 13);

siHCV-3061: 5'-CCAAAGUGCCGUACUUCGU-3' (서열번호: 14);

siHCV-3122: 5'-GGUUGCUGGGGGUCAUUAU-3' (서열번호: 15);

siHCV-7284: 5'-GGCACAUGGUAUCGACCCU-3' (서열번호: 16);

siHCV-7796: 5'-UGACGGGCUUUACCGGCGA-3' (서열번호: 17);

siHCV-8373: 5'-CGAGGUUACUACCACACAC-3' (서열번호: 18);

siHCV-8504: 5'-CAGGCAGCGUGGUCAUUGU-3' (서열번호: 19);

siHCV-8546: 5'-AGCCGGCCAUCAUUCCCGA-3' (서열번호: 20);

siHCV-8572: 5'-GUCCUUUACCGGGAGUUCG-3' (서열번호: 21);

siHCV-8672: 5'-UCGGGUUGCUGCAAACAGC-3' (서열번호: 22);

siHCV-8749: 5'-GCCUUCUGGGCGAAGCAUA-3' (서열번호: 23);

siHCV-9117: 5'-CCUACUCCCUGCUAUCCUC-3' (서열번호: 24);

siHCV-9650: 5'-CAUUCCCCAUUAACGCGUA-3' (서열번호: 25);

siHCV-10464: 5'-GAGGACGGUUGUCCUGUCA-3' (서열번호: 26);

siHCV-10486: 5'-UCUACCGUGUCUUCUGCCU-3' (서열번호: 27);

siHCV-10881: 5'-GAAGGUCACCUUUGACAGA-3' (서열번호: 28);

siHCV-11048: 5'-AGGACGUCCGGAACCUAUC-3' (서열번호: 29);

siHCV-11196: 5'-GCCAGCUCGCCUUAUCGUA-3' (서열번호: 30);

siHCV-11476: 5'-GCCAGACAGGCCAUAAGGU-3' (서열번호: 31);

siHCV-11796: 5'-ACCAGAAUACGACUUGGAG-3' (서열번호: 32);

siHCV-11996: 5'-GGAUGAUCCUGAUGACUCA-3' (서열번호: 33);

siHCV-12509: 5'-CGGGGAGCUAAACACUCCA-3' (서열번호: 34);

siHCV-12520: 5'-ACACUCCAGGCCAAUAGGC-3' (서열번호: 35); 및,

siHCV-12680: 5'-AGGUCCGUGAGCCGCUUGA-3' (서열번호: 36).

합성 siRNA의 안정성을 증가시키기 위하여 또는 표적 RNA 및 siRNA 분절 사이의 특이적인 상호작용을 증가시키기 위하여, 화학적 합성으로 siRNA 두가닥 모두의 3'-말단을 dTdT로 연장하였다. 본 발명의 일실시태양에서, 합성 siRNA는 생리학적 안정성을 획득하고 세포 내의 분포를 추적하기 위하여 화학적 유도체 또는 태그-분자로 변형될 수 있다.

본 발명은 또한 siRNA의 안정성을 위하여 각각의 가닥의 3'-말단에 dTdT로 연장된 합성 siRNA에 의해 유도된 RNAi 활성도를 나타내었다. 합성 RNA는 레플리콘(replicon) 세포주에서 80%까지 유전자의 발현을 효율적으로 억제하였다. 본 발명은 합성 siRNA 또는 벡터를 대상체에 주입함으로써 HCV에 의해 감염된 간염 바이러스 보균자를 치료하기 위한 새로운 치료법상의 접근 방법이 될 것이다.

본 발명의 일실시태양에서, shRNA(short hairpin, shRNA)는 하나의 프로모터로부터 독립적으로 전사되어 질 수 있고, 세포의 다이서(Dicer)에 의하여 이중 가닥 siRNA으로 가공되어 질 수 있다. 선택적으로, 이중 가닥 siRNA의 각각의 가닥을 두개의 별개의 프로모터로부터 반대방향으로 또는 평형하게 발현되어지고 혼성화되어 표적 RNA의 분해를 유도한다. siRNA를 발현하는 벡터는 전사를 시작하는 프로모터뿐만 아니라, 인해서, 전사 종결 신호, 또는 다른 발현 조절 염기서열을 포함한다. 벡터는 순수 플라스미드 DNA 또는 형질감염 시약 또는 표적-전달 물질과 함께 복합체로 또는 재조합 바이러스 벡터의 형태로 세포내 핵으로 전달될 수 있다. 벡터의 컨스트럭트는 형질감염될 형태, 시간, 및 siRNA 발현 수준 등과 같은 특정 환경에 의해 결정된다.

본 발명은 두개의 수렴하는 프로모터로부터 HCV 특이적인 이중 가닥 siRNA를 전사하는 pRNAiDu라 명명되는 DNA 벡터를 제공한다(도 1참조). 상기 벡터는 siRNA 전사를 위한 2개의 이종 RNA 중합효소 III 프로모터(H1 및 U6) 및 EGFP-반딧불 루시퍼라제 융합 단백질(EGFP-Fluc)을 코딩하는 mRNA 전사를 유도하는 SV40 프로모터 를 포함한다. 특히 pRNAiDu 벡터에는 개량 된 녹색 형광 단백질(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)과 반딧불 루시퍼라제(Firefly luciferase, FLuc)의 융합 유전자인, EGFP-FLuc가 SV-40 프로모터 하위에 포함되어 있다. 이는 실험적으로 형질감염 효율의 시각화 및 정량적인 측정에 유용하며, 형광 또는 발광의 탐지를 통하여 RNAi의 활성을 표준화할 수 있다(Kaykas and Moon, BMC Cell Biology, 5: 16, 2004; Zheng et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101: 135, 2004).

본 발명자들은 상기 발현 벡터로 형질전환된 대장균을 2005년 5월 16일자로 한국생명공학연구소 유전자은행에 기탁하였다(수탁번호: KCTC 10800BP).

siRNA의 안정성을 증가시키기 위하여 또는 표적 RNA 및 siRNA 분절 사이의 특이적인 상호작용을 증가시키기 위하여, siRNA 발현 벡터에서 3’-말단의 UU 뉴클레오티드는 RNA 전사의 마지막 단계에서 중합효소 III 종결 염기서열로부터 만들어진다. RNA 간섭(RNA interference, RNAi) 효과는 검출 시간 및 형질감염된 DNA 투여량에 의존적이고, 단백질 발현 및 바이러스 RNA 전사 수준은 각각 50% 및 60% 보다 낮았다. 이는 siRNA 벡터로부터 발현된 EGFP의 발현 양은 FACS 분석에 의하여 형질감염 효율의 50% 임을 고려하면, 선택된 siRNA는 극적이고 특이적인 항-바이러스 효과를 유도하는 것으로 사료된다. 특히, 5‘-인산화된 프라이머로 PCR 증폭하여 벡터에서 분리된 siRNA 발현 카세트는 siRNA 효과를 유도하는 필수적인 요소이다.

본 발명은 간암 Huh-7 세포주에서 일정하게 유지되고 있는 HCV 전장 레플리콘 RNA, FK/R2AN를 기본으로 HCV RNA를 표적으로 하는 짧은 간섭 RNA(short interfering RNA, siRNA)를 이용하여 바이러스에 특이적인 siRNA는 외인성 RNA의 분해를 유도하고, 최종적으로 포유동물 세포에서 바이러스 단백질의 발현 및 바이러스 복제를 억제하였으므로 상기 siRNA 또는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 C 형 간염 치료제로 이용될 수 있음을 시사한다.

본 발명인 siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성 될 수 있다(Caruthers et al., Methods in Enzymology, 211: 3, 1992; Wicott et al., Nucleic Acids Res, 23: 2677, 1995; Brennan et al., Biotechnol Bioeng, 61: 33, 1998).

본 발명의 siRNA 또는 그를 발현할 수 있는 벡터는 리포솜, 하이드로겔, 세포흡착 미소구체 등과 같은 형질감염 운반체를 사용하여 표적 세포로 전달되어 질 수 있다(Akhtar et al., Trends Cell Bio, 2: 139, 1992).

HCV로 감염된 보균자를 치료하기 위해 본 발명의 약학적 조성물은 기관 표적화 물질 및 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 본 발명의 siRNA 또는 그를 발현시킬 수 있는 벡터를 포함한다. 상기 약학적 조성물의 투여량은 주입 경로, 제형의 특성, 간 손상 정도, 대상체의 사이즈, 중량 또는 분포 범위 및 환자의 나이와 성과 같은 특이적 환경에 의해 치료법상으로 결정 될 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 유효성분을 0.0001 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 치료용 조성물은 상기 유효성분에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 함유할 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물은, 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있으며, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 더 나아가 당해 기술분야의 적정한 방법으로 또는 레밍턴의 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물의 투여방법은 특별히 이에 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)하거나 경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여가 바람직하며, 정맥내 주사에 의한 투여가 더욱 바람직하다. 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일 일 투여량은 화합물의 경우 약 0.1 내지 100 ㎎/㎏ 이고, 바람직하게는 0.5 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 일회 내지 수회에 나누어 투여하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명의 siRNA 또는 siRNA 발현벡터를 마우스에 정맥내 주사에 의하여 투여하여 독성 실험을 수행한 결과, 독성시험에 의한 50% 치사량(LD₅₀)은 적어도 1,000 ㎎/㎏ 이상인 안전한 물질로 판단된다.

아울러, siRNA 또는 발현벡터를 유효성분으로 대상체에 주입하는 것을 포함하는 HCV 감염으로 인한 질환을 치료하는 방법을 제공한다.

본 발명은 HCV 보균자에서 HCV 복제를 억제하기 위하여 합성 siRNA 또는 이중 가닥 siRNA를 코딩하는 벡터 및 siRNA를 포함하는 병합 치료의 치료법상의 적용될 수 있음을 제시하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

다만, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> siRNA의 고안 및 siRNA 발현 벡터의 제조

종래의 siRNA 벡터는 포유동물의 세포에서 RNA 중합효소 III 프로모터(U6, H1 및 tRNA 프로모터) 또는 poly(A) 시그날 염기서열을 가지는 중합효소 II 프로모터로부터 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin ,shRNA)로 전사되는 것으로 고안되었다 (Brummelkamp et al., Cancer Cell, 2: 243, 2002; Tushcl, Nat. Biotechnol., 20: 446, 2002; Xia et al., Nat. Botechnol., 20: 1006, 2002). 그러나 shRNA 벡터는 다양한 결점을 가진다. 그들의 가공 된 이차 구조는 세균에서 합성하고 염기서열을 결정하기가 힘들고 그것을 제작하기 위한 DNA 올리고머는 대량 탐색의 경우 비용이 비싸다. 더욱이 다양한 siRNA 라이브러리를 제작하기 위하여 추가적인 태그 서열 없이 프로모터에서 종결 신호까지를 포함하는 siRNA 발현 카세트를 제작하는 것은 어렵다. 이러한 shRNA 발현 벡터의 제한점을 극복하기 위하여 반대 방향으로 수렴하는 프로모터로부터 전사되어지는 siRNA 다이렉트 발현 벡터를 제작하였고 이를 pRNAiDu라 명명되었다(도 1).

상기 벡터는 siRNA 전사를 위한 2개의 이종 RNA 중합효소 III 프로모터(H1 및 U6) 및 EGFP-반딧불 루시퍼라제 융합 단백질(EGFP-Fluc)을 코딩하는 mRNA 전사를 유도하는 SV40 프로모터를 포함한다. 특히 pRNAiDu 벡터에는 개량 된 녹색 형광 단백질(Enhanced green fluorescent protein, EGFP)과 반딧불 루시퍼라제(Firefly luciferase, FLuc)의 융합 유전자인, EGFP-FLuc가 SV-40 프로모터 하위에 포함되어 있다. 이는 실험적으로 형질감염 효율의 시각화 및 정량적인 측정에 유용하며, 형광 또는 발광의 탐지를 통하여 RNAi의 활성을 표준화할 수 있다(Kaykas and Moon, BMC Cell Biology, 5: 16, 2004; Zheng et al., Proc Natl Acad Sci USA, 101: 135, 2004).

인간 U6 및 H1 프로모터 모두에 -5 내지 -1 위치에 5개의 티미딘 뉴클레오티드의 RNA 중합효소 III 종결 서열을 포함하고 각각의 -12 내지 -6 위치에 BamH I 및 Hind III의 제한 부위를 포함하도록 변형하였다. U6 프로모터는 효과적인 전사 개시를 위하여 퓨린 뉴클레오티드를 선호하기 때문에 siRNA의 첫 뉴클레오티드 염기서열이 피리미딘인 경우 구아니딘을 U6 프로모터의 +1 위치에 삽입하였다. 추가된 뉴클레오티드에 의해 유도 될 수 있는 부작용을 최소화하고 RNAi 과정 동안 안티센스 RNA와 표적 RNA 사이의 지속적인 혼성화가 이루어질 수 있도록, U6 프로모터가 안티센스 RNA를 전사하도록 하여 RISC가 상동 mRNA를 절단하도록 고안되어졌다. siRNA 발현 플라스미드를 만들기 위하여 36-염기 합성 센스 및 안티-센스 DNA 올리고누클레오티드 쌍을 어닐링하고 BamH I과 Hind III로 절단 된 pRNAiDu로 연결하였다(도 2). 도 2에서 siRNA 전사의 개시 부위는 화살표로 나타내었다.

PCR 증폭에 의하여 U6 프로모터에서 H1프로모터까지의 siRNA 발현 카세트를 분리하였다. U6 정방향 프라이머(5'-CGGAATTCCCCAGTGGAAAGAC-3': 서열번호 37) 및 H1 정방향 프라이머(5'-CGGAATTCATATTTGCATGTCGC-3': 서열번호 38)의 각각의 올리고뉴클레오티드의 5'-말단을 인산기로 변형시켜 준비하였다. 각각의 siRNA 발현 카세트는 HCV-특이적인, 음성 대조군 또는 양성 대조군 siRNA 염기서열을 포함하는 pRNAiDu 플라스미드로부터 증폭되었다. 모든 PCR 반응은 하기와 같이 수행되었다; 94℃에서 45초, 50℃에서 1분, 72℃에서 1분 동안 30회 반복 수행하였다. PCR 생성물은 Qiaquick PCR 정제 키트(Qiagen, USA)를 이용하여 정제하였고, 그들의 농도는 UV-분광계를 이용하여 정량적으로 측정하였다.

<실시예 2> HCV 특이적인 siRNA에 의한 FK/R2AN 레플리콘의 단백질 발현 억제

Huh-7 세포주 및 유전형 1b의 HCV 전장 레플리콘 RNA가 지속적으로 유지되는 Huh-7 레플리콘 세포주로인 Huh-7FK/R2AN를 장 승기 박사님(PanBioNet, Korea)으로부터 얻었다. 상기 FK/R2AN 레플리콘은 HCV 전장 레플리콘 RNA, FK/RN(대한민국 공개 특허 제 2004-32341호)을 기본으로 Rluc 및 neo 코딩 부위 사이에 구제역바이러스 2A 단백질분해효소의 신호서열이 삽입된 것이다. 상기 HCV 레플리콘을 가지고 있는 세포주를 10% FBS (Gibco, USA) 및 G418(Calbiochem, USA) 600 mg/ml을 포함하는 DMEM에서 키워 모든 실험에 사용하였다.

siRNA 발현 플라스미드 또는 PCR 생성물 또는 합성된 siRNA 올리고뉴클레오티드 DNA의 형질감염은 제조사의 지시에 따라 Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen, USA)을 이용하여 12-웰 플레이트에서 수행하였다. 간단히 서술하면, 1.5x10⁵의 밀도로 Huh-7 FK/R2AN 세포를 접종한 다음 날, siRNA 발현 벡터 0.6 mg 또는 siRNA 중합체(duplex) 80 nM를 전달하였다. 리포터 단백질로써 레플리콘 RNA에서 발현된 레닐라(Renilla) 루시퍼라제(Rluc) 활성은 형질감염된 DNA 벡터에서 발현된 반딧불 루시퍼라제(Fluc) 활성을 이용하여 보정하였고, PCR 생성물 또는 합성 siRNA로 형질감염한 경우에는 총 단백질에 의해 형질감염 효율을 보정하였다.

레플리콘 세포에서 총 세포 단백질은 형질감염 후 3일째 수거하였고, HCV-특이적인 siRNA의 RNAi 효과를 간접적으로 검출하기 위하여 Dual-Glo 루시퍼라제 분 석 시스템(Promega, USA) 또는 레닐라 루시퍼라제 분석 시스템(Promega, USA)을 이용하여 루시퍼라제 활성을 정량하였다.

세포내 세포질에서 siRNA에 의해 매개되는 RNAi 효과를 분석하기 위하여, HCV 전장 레플리콘 시스템을 사용하였다. 상기 HCV 레플리콘 RNA, FK/R2AN에서, Rluc 및 neo의 mRNA 염기서열을 HCV NS2 및 NS3 코딩 부위 사이에 도입하였고 폴리오바이러스 IRES에 의하여 단백질로 발현된다. 상기 합성 단백질은 Rluc 및 neo 코딩 부위 사이에 존재하는 구제역바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV) 2A 단백질분해효소의 신호 서열에서 절단됨으로써 분리된 단백질로 된다. 상기 단백질은 최종적으로 레플리콘 RNA 및 발현을 안정적으로 유지하는 세포를 선택할 수 있고, 세포 용출물의 루시퍼라제 활성을 검출에 의하여 복제 수준을 정확하게 정량할 수 있게 하였다(도 3). 도 3에서, H-I, HCV 내부 리보좀 삽입 부위(internal ribosomal entry site, IRES); Core-NS2, HCV의 코어(core)에서 NS2까지 코딩하는 부위; P-I, 폴리오바이러스(poliovirus) IRES; Rluc, 레닐라 루시퍼라제 유전자(Renilla luciferase gene); 2A, 구제역 바이러스(foot-and-mouth disease virus, FMDV) 2A 단백질분해효소 절단 부위; Neo, 네오마이신 인산전달효소 유전자; E-I, 뇌심근염 바이러스(encephalomyocarditis virus, EMCV) IRES; NS3-NS5B, HCV의 NS3에서 NS5B까지 코딩하는 부위, 3' UTR, HCV 3' 비번역 부위(untranslated region)를 나타낸다.

효과적인 항-바이러스 효과를 가진 HCV-특이적인 siRNA 선택하기 위하여, 36개의 HCV siRNA 후보물, 상품화된 siRNA 발현 벡터(Ambion, USA)에서 분리된 하나 의 음성 대조군 RNA, 또는 본 발명자 실험실에서 세 가지 후보물에서부터의 활성 염기서열로 실험적으로 스크링된 Rluc 특이적인 siRNA를 디자인하였다.

상기 38가지 음성 대조군 및 HCV 레플리콘 RNA에 대한 siRNA의 침묵(silencing) 효과를 측정하기 위하여, 반대 방향으로 수렴하는 인간 U6 및 H1 프로모터로부터 siRNA가 전사되는 siRNA 발현 플라스미드를 준비하고, PCR 증폭에 의하여 siRNA 발현 카세트를 제작하였다. 두 가지 종류의 DNA를 각각의 FK/R2AN 레플리콘 세포에 형질감염시키고, 두 가지 다른 siRNA 발현 시스템에 의해 영향 받는 레플리콘 RNA의 복제 수준을 Rluc 활성을 측정함으로써 비교하였다(도 4).

도 4는 Huh7 FK/R2AN 세포에서 HCV 복제에 대한 RNAi의 효과를 나타낸 그래프이다. 도 4a는 HCV 전장 레플리콘 FK/R2AN 세포를 양성 대조군, HCV 특이적인 또는 Rluc siRNA를 발현하는 벡터로 형질감염시켰다. 내부 레닐라 루시퍼라제 활성을 형질감염 후 3일째 형질감염된 DNA 벡터로부터 반딧불 루시퍼라제 활성을 보정하여, 듀얼 루시퍼라제 분석에 의하여 측정하였다. 도 4b는 HCV 전장 레플리콘 세포에 PCR 증폭으로 제작된 siRNA 발현 카세트를 형질감염시켰다. 수치는 siRNA 음성 대조군에 대한 백분율의 평균값±표준편차(s.d.)로써 제시하였다. 레플리콘 RNA에 위치한 siRNA 표적의 위치를 도식적으로 나타내었다. 적어도 3번 이상의 각각의 실험에서 얻은 데이터를 나타내었다.

도 4에서 보듯이, 플라스미드로 FK/R2AN에 형질감염시겨 얻은 상기 리포터 유전자 발현의 억제 양상은 RNAi 효과를 유도하기 위해 유전적으로 필수적인 요소를 포함하는 PCR 생성물의 동일 양을 형질감염시켜 얻은 결과와 동일 양상을 보였 다. 시험된 38 가지 억제제 중에서 siHCV-523, 1631, 7284, 8373, 8504, 8749, 11048, 11996 및 12509의 siRNA가 공통적으로 가장 강력한 효과를 보였다. 특히, 벡터를 기본으로 한 시스템에서, 가장 강력한 HCV siRNA는 단백질의 발현을 ~35-50 %까지 감소시켰다(도 4a). Lipofectamine 2000 시약 (Invitrogen, USA)을 이용하여 FK/R2AN 세포로의 상기 플라스미드의 형질감염 효율은 FACS 분석에 의하여 약 50%까지 도달한다는 사실을 감안하면, 상기 억제 수준은 세포내 세포질에 분포된 바이러스의 RNA는 siRNA-유도된 침묵 경로에 의해 완전히 제거될 수 있다는 것을 시사한다.

벡터를 기본으로 한 siRNA는 PCR-생성물을 기본으로 한 siRNA 보다 더욱 강력하게 HCV 레플리콘의 발현을 억제하였다(도 4b). 상기 이유는 선형 DNA인 PCR 생성물과 비교해서 환형 DNA인 플라스미드의 높은 형질감염 효율 및 증가된 세포내 생존율 때문이라 사료된다. PCR 생성물과 비교해서 HCV-특이적인 siRNA 발현 벡터에 의한 레플리콘의 억제 수준은 하기와 같다: siHCV-523에 있어서, 플라스미드인 경우 33%임에 비해 PCR 생성물인 경우 35% ; siHCV-1631에 있어서, 42%임에 비해 18%; siHCV-7284에 있어서, 51%임에 비해 44%; siHCV-8373에 있어서, 48%임에 비해 26%; siHCV-8504에 있어서, 49%임에 비해 34%; siHCV-8749에 있어서, 39% 임에 비해 36%; siHCV-11048에 있어서 44%임에 비해 17%; siHCV-11996에 있어서, 36%임에 비해 23%; siHCV-12509에 있어서, 36%임에 있어서 18%; 및, siRluc에 있어서, 66%임에 비해 67%. siRNA 발현 벡터의 클론은 다른 실험 방법에 의한 유전자 침묵 효과를 좀 더 조사하기 위하여 사용되었다.

본 발명에서, HCV 5'UTR은 siRNA 치료제의 개발에 가장 이상적인 부위로 여겨지기 때문에, HCV 5'UTR-특이적인 siRNA를 포함하는 세 가지 다른 플라스미드를 준비하였다. 그러나, 상기 siRNA에 의한 HCV 게놈 레플리콘의 의미있는 억제를 관찰할 수 없었다. 이는 5'UTR의 이차구조가 너무 견고해서 RISC에 통합된 siRNA는 왓슨-클릭 염기쌍의 풀림 및 교체를 통한 표적 부위로의 접근을 하지 못하는 것으로 예상할 수 있거나, 또는 바이러스 유전자 발현 및 인캡시데이션을 조절하기 위하여 세포내 또는 바이러스 단백질이 표적 부위 주위로 뭉쳐서 siRNA-표적이 순조롭지 못하기 때문으로 사료된다.

<실시예 3> 벡터로 매개된 HCV siRNA에 의한 바이러스 전사체의 감소

벡터로 매개된 HCV siRNA에 의한 바이러스 전사체의 감소를 확인하기 위하여, 음성 대조군 또는 HCV 레플리콘-특이적인 siRNA 발현 벡터로 형질감염된 세포에서 형질감염 후 2일째 Trizol LS 시약(Invitrogen, USA)을 이용하여 제조사의 지시에 따라 총RNA를 추출하였다. 분리된 총 RNA에 RNase-프리 DNase(Promega, USA)를 처리하였다. 마지막으로 RNA의 절대적인 양을 UV-분광계를 이용하여 260 nm/280nm에서 UV 흡광도를 측정함으로써 결정하였다.

실험실 조건에서 항바이러스 활성은 실시간 PCR 기기(Sequence Detection System 5700, ABI, USA)를 이용하여 정량적인 실시간 RT-PCR으로 측정하였다. 실시간 RT-PCR는 Taqman One-step RT-PCR Master Mix 시약(ABI, USA)을 이용하여 50 ㎕ 반응 부피에서 형질감염세포로부터 분리 된 총 RNA 500 ng으로 수행하였다. 표준 RNA는 T7 RNA 중합효소로 실험실 내 조건 전사로 준비되었다. HCV 5'UTR 부위에 특이적인 프라이머 및 탐침 염기서열은 5'-TCTGCGGAACCGGTGAGTA-3' (정방향 프라이머: 서열번호 39), 5'- ATTGAGCGGGTTGATCCAAGAAA-3' (역방향 프라이머: 서열번호 40) 및 5'- (플루오르레신) CCGGAATTGCCAGGACGACCG (TAMRA) -3' (프로브: 서열번호 41)을 포함한다. 총 RNA의 양은 내부 대조군으로서 인간 베타-액틴 유전자를 표적으로 하는 실시간 RT-PCR을 수행함으로써 명확히 보정되었다. 베타-액틴 유전자에 대한 프라이머와 탐침 염기서열은 5'-GCGCGGCTACAGCTTCA-3' (정방향 프라이머: 서열번호 42), 5'-TCTCGTTAATGTCACGAT-3' (역방향 프라이머: 서열번호 43) 및 5’-(플루오르레신) CACCACGGCCGAGCGGGA (TAMRA)-3 (프로브: 서열번호 44)을 포함한다. 모든 실험은 세 번 수행하였다.

선택된 siRNA 발현벡터로 형질감염된 FK/R2AN 세포에서 HCV RNA 수준을 정확히 정량하기 위하여, HCV 5' UTR 및 베타-액틴 유전자에 특이적인 프라이머를 이용하여 실시간 RT-PCR로 확인하였다(도 5).

도 5는 siRNA 발현 벡터로 형질감염된 세포에서 HCV 레플리콘 RNA를 실시간 RT-PCR 분석으로 나타낸 그래프이다. 12 웰 플레이트에서 FK/2RAN 세포에 음성 대조군, HCV-특이적인 또는 Rluc siRNA를 발현하는 600 ng pRNAiDu 플라스미드를 전달하였다. 정량 분석을 위하여 HCV RNA 수치를 β-액틴 RNA 수치로 보정하였다. 총 RNA μg 당 HCV RNA 카피(copy) 수를 측정하였다. 적어도 3번 이상의 각각의 실험에서 얻은 데이터(평균값±s.d.)를 나타내었다.

도 5에서 보듯이, 정량적 분석을 통하여 siHCV-8749 또는 11996 및 siHCV- 523으로 형질감염된 세포에서 형질감염 후 2일째 HCV 전사체 수준이 각각 62% 및 47%감소함을 확인하였다. 유사한 억제 양상을 PCR 생성물-기본으로 한 siRNA 카세트로 형질감염시킨 실험에서 RNA를 측정함으로써 확인하였다. 상기 결과는 단백질 수준에서 가장 큰 억제 효과를 보인 선택된 HCV siRNA가 바이러스 RNA 분해를 유도함으로써 레플리콘 RNA 수준에서도 강력히 감소시킨다는 것을 시사한다. 하지만, siHCV-7284 클론은 바이러스 RNA 수준에서 의미 있는 감소를 보이지 않았다. 이는 발현 벡터로부터 생산된 siRNA의 양이 다양한 시간대에서 동일하지 않았을 것이고 벡터의 전사 효율 및 생리적 안정성에 의해 영향을 받았을 것으로 추측한다.

<실시예4> 합성 siRNA에 의한 RNAi 효과의 검출

합성 siRNA에 의한 RNAi 효과의 확인하기 위하여, 대조군 siRNA, siHCV-7284 및 siHCV-8749에 해당하는 각각의 합성 센스 및 안티-센스 siRNA를 준비하고 어닐링하였다. 상기 뉴클레오티드의 염기서열은 하기와 같다: 대조군 siRNA의 센스 가닥(5'-ACUACCGUUGUUAUAGGUGTT-3': 서열번호 45), 대조군 siRNA의 안티-센스 가닥( 5'-CACCUAUAACAACGGUAGUTT-3': 서열번호 46), siHCV-7284의 센스 가닥(5'-GGCACAUGGUAUCGACCCUTT-3': 서열번호 47), siHCV-7284의 안티-센스 가닥(5'-AGGGUCGAUACCAUGUGCCTT-3': 서열번호 48); siHCV-8749의 센스 가닥(5'-GCCUUCUGGGCGAAGCAUATT-3': 서열번호 49), siHCV-8749의 안티-센스 가닥(5'-UAUUCGCCCAGAAGGCTT-3': 서열번호 50). FK/R2AN 세포에 siRNA 80 nM의 동일 농도로 처리하고 2일째 실시간 RT-PCR에 의하여 RNA 전사체 수준을 정량하고 형질감염 후 3일째 루시퍼라제 활성 분석 또는 웨스턴 블롯 분석에 의하여 레플리콘 단백질 수준을 측정하기 위하여 세포를 수거하였다. 모든 siRNA의 농도는 대조군 siRNA로 최종 농도 80 nM로 맞추었다. 모든 실험은 적어도 3번 이상 수행하였다(도 6).

도 6은 HCV 레플리콘, FK/R2An에서 합성 siRNA에 의한 RNAi 효과를 나타낸 결과이다. 도 6a는 HCV 코어 및 β-액틴에 특이적인 단클론 항체를 이용한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸 사진이다. 합성 siRNA로 FK/R2AN 세포에 형질감염시키고, 형질감염 3일 후 합성 siRNA가 처리된 FK/R2AN의 세포 용출물의 총 단백질 30 mg으로 웨스턴 블롯 분석을 수행하기 위하여, 단백질을 15% SDS-PAGE로 분리하고 Immobilon-P 막(Millipore, USA)으로 전달하였다. 블롯은 HCV 코어(Affinity BioReagent^TM, USA) 또는 베타-액틴(Sigma, USA)에 특이적인 단클론 항체로 탐침한 뒤, 호올스래디쉬 퍼옥시다제가 접합된 고트(goat) 항-마우스 항체(KPL, USA)로 배양하였다. 블롯은 Super Signal Test Pico 화학발광기질(Chemiluminescent substrate, Pierce, USA)로 현상하였다. 형질감염 3일 후 HCV 코어 단백질의 수준을 웨스턴 블롯 분석으로 나타내었다(상). β-액틴의 수준 또한 측정하였다(하). 모세포인 Huh-7(레인 1) 및 레플리콘 세포인 FK/R2AN (레인 2)의 샘플을 보이고, 대조군 siRNA 80 nM(레인 3) 또는 siHCV-7284 10 nM (레인 4), 20 nM (레인 5), 40 nM (레인 6) 또는 80 nM (레인 7)으로 형질감염된 FK/R2AN 세포를 분석하였다(레인 4-6).

도 4b는 게놈에 널리 분포되어 있는 siRNA 후보물로 부터 선택된 HCV siRNA 의 RNAi 활성을 확인하기 위하여, 합성 siRNA가 처리된 FK/R2AN 세포에서 리포터 단백질 발현의 수준을 Rluc 분석을 나타낸다. 안정성을 위하여 대조군 siRNA, siHCV-7284 및 siHCV-8749에 해당하는 화학적으로 합성 siRNA의 3' 오버행(overhang)은 UU 대신 dTdT이다.

도 4b에서 보듯이, 합성siRNA는 농도-의존적인 방법으로 HCV 레플리콘을 억제한다는 것을 나타낸다. 대조군 siRNA의 형질감염으로 인한 레닐라 루시퍼라제 수준을 100%로 정하여, siHCV-7284에 의한 유전자 발현의 억제 효과는 75%였다. 상기 결과는 siRNA의 침묵 효과는 벡터를 기본으로 하는 또는 PCR 생성물을 기본으로 하는 siRNA 발현 DNA보다 합성 siRNA를 이용함으로써 더욱 극적으로 포화되었다.

종래에 siHCV-7284 siRNA를 발현하는 pRNAiDu는 바이러스 RNA의 전사체 수준이 아닌 바이러스 단백질의 수준을 감소시킴으로써 상당한 RNAi 효과를 보였다. 상기 siRNA의 양은 검출 시점에서 포화된 유전자 침묵 효과를 유도하기에는 충분하지 않았음을 확인하기 위하여, 실시간 RT-PCR을 이용하여 같은 형질감염 조건에서 세포질로 유사한 siRNA 전달 효율을 보장하는 합성 siRNA로 형질감염시킴으로써 레플리콘 RNA 수준을 측정하고, 그들의 RNAi 효과를 비교하였다(도 7).

도 7은 화학적으로 합성된 siHCV-7284가 전달된 FK/R2AN 세포의 바이러스 RNA 수준을 정량적으로 분석하였다. 화학적으로 합성된 음성 대조군 siRNA 80 nM 또는 siHCV-7284 10 nM, 20 nM, 40 nM 또는 80 nM이 전달된 FK/R2AN 세포의 바이러스 RNA 수준을 정량적으로 분석하였다. 대조군 siRNA를 이용하여 최종 농도 80 nM로 맞추었다. HCV RNA 수치는 β-액틴의 수치로 보정하였다. 총 RNA μg 당 HCV RNA 카피(copy) 수를 측정하였다. 오차 막대는 3번 수행한 실험의 평균값의 표준편차를 나타낸다.

도 7에서 보듯이, siHCV-7284 또한 siHCV-8749처럼 농도 의존적인 방법으로 레플리콘 RNA의 수준이 강력하게 감소되었다.

이상에서 주장하고 입증하였듯이, 본 발명은 HCV RNA에 특이적인siRNA, 상기 siRNA를 발현하는 코딩하는 DNA 벡터 및 상기 siRNA 또는 발현벡터를 유효성분으로 포함하는 C형 간염 치료 및 예방용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명의 합성 siRNA 분자는 물론 본 발명의 RNA 분자를 코딩하는 DNA 분자를 투여함으로써 HCV 유전자 발현 및 복제를 억제하였으므로 C형 간염 바이러스 만성 보균자를 임상적으로 치료하는데 매우 효과적으로 사용될 수 있을 것이다.

-<110> MOGAM BIOTECHNOLOGY INSTITUTE <120> Small Interfering RNA specific for HCV and Therapeutic Agent for Hepatitis C Comprising the Same <130> 5p-03-17 <160> 50 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 1 cuacugucuu cacgcagaa 19 <210> 2 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 2 agcgucuagc cauggcguu 19 <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 3 cccgcucaau gccuggaga 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 4 ggcgacaacc uauccccaa 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 5 ggucaucgau acccucacg 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 6 ucugcccggu ugcuccuuu 19 <210> 7 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 7 cguauccgga guguaccau 19 <210> 8 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 8 cgcaagcauu guguaugag 19 <210> 9 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 9 uauaucccgg ccacgugac 19 <210> 10 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 10 ugacucccuc aacacuggg 19 <210> 11 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 11 ggcaacuggu uuggcugua 19 <210> 12 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 12 augggaguau guccuguug 19 <210> 13 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 13 ucuugcucgc cauacucgg 19 <210> 14 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 14 ccaaagugcc guacuucgu 19 <210> 15 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 15 gguugcuggg ggucauuau 19 <210> 16 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 16 ggcacauggu aucgacccu 19 <210> 17 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 17 ugacgggcuu uaccggcga 19 <210> 18 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 18 cgagguuacu accacacac 19 <210> 19 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 19 caggcagcgu ggucauugu 19 <210> 20 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 20 agccggccau cauucccga 19 <210> 21 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 21 guccuuuacc gggaguucg 19 <210> 22 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 22 ucggguugcu gcaaacagc 19 <210> 23 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 23 gccuucuggg cgaagcaua 19 <210> 24 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 24 ccuacucccu gcuauccuc 19 <210> 25 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 25 cauuccccau uaacgcgua 19 <210> 26 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 26 gaggacgguu guccuguca 19 <210> 27 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 27 ucuaccgugu cuucugccu 19 <210> 28 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 28 gaaggucacc uuugacaga 19 <210> 29 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 29 aggacguccg gaaccuauc 19 <210> 30 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 30 gccagcucgc cuuaucgua 19 <210> 31 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 31 gccagacagg ccauaaggu 19 <210> 32 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 32 accagaauac gacuuggag 19 <210> 33 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 33 ggaugauccu gaugacuca 19 <210> 34 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 34 cggggagcua aacacucca 19 <210> 35 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 35 acacuccagg ccaauaggc 19 <210> 36 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV siRNA <400> 36 agguccguga gccgcuuga 19 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> U6 forward primer <400> 37 cggaattccc cagtggaaag ac 22 <210> 38 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> H1 forward primer <400> 38 cggaattcat atttgcatgt cgc 23 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV forward primer <400> 39 tctgcggaac cggtgagta 19 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV backward priemr <400> 40 attgagcggg ttgatccaag aaa 23 <210> 41 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HCV probe <400> 41 ccggaattgc caggacgacc g 21 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin forward primer <400> 42 gcgcggctac agcttca 17 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin backward primer <400> 43 tctcgttaat gtcacgat 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta-actin probe <400> 44 caccacggcc gagcggga 18 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control siRNA sense <220> <223> synthetic siRNA <400> 45 acuaccguug uuauaggugt t 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> control siRNA anti-sense <220> <223> synthetic siRNA <400> 46 caccuauaac aacgguagut t 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siHCV-7284 sense <220> <223> synthetic siRNA <400> 47 ggcacauggu aucgacccut t 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siHCV-7284 anti-sense <220> <223> synthetic siRNA <400> 48 agggucgaua ccaugugcct t 21 <210> 49 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siHCV-8749 sense <220> <223> synthetic siRNA <400> 49 gccuucuggg cgaagcauat t 21 <210> 50 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> siHCV-8749 anti-sense <220> <223> synthetic siRNA <400> 50 uauucgccca gaaggctt 18

Claims

서열번호 1 내지 36으로 구성되는 그룹으로부터 선택되는 염기 서열 또는 그의 상보적인 가닥 또는 그의 일부의 염기 서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
제 1항에 있어서, 서열 번호 4, 10, 16, 18, 19, 23, 29, 33 및 34로 구성된 그룹으로부터 선택되는 염기 서열 또는 그의 상보적인 가닥 또는 그의 일부의 염기서열을 포함하는 분리된 핵산 분자.
제 1항의 핵산분자로 구성된 센스 가닥 및 그의 안티 센스 가닥이 상보 결합된 분리된 핵산 분자.
제 3항에 있어서, 작은 간섭 RNA(siRNA)인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제 3항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥의 3‘ 말단이 dTdT분자에 의해 연결된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제 3항에 있어서, 센스 가닥 및 안티센스 가닥이 연결 분자에 의해서 공유 결합이 된 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제 5항에 있어서, 상기 연결 분자는 폴리뉴클레오티드 링커(linker)인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제 5항에 있어서, 상기 연결 분자는 비-뉴클레오티드 링커(non-nucleotide linker)인 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제 1항에 있어서, C형 간염 바이러스의 RNA에 결합하는 것을 특징으로 하는 분리된 핵산 분자.
제 1항의 핵산분자의 염기 서열을 포함하는 DNA 벡터.
제 2항의 핵산분자의 염기 서열을 포함하는 DNA 벡터.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제 10항 또는 제 11항의 DNA 벡터를 유효 성분으로 포함하는 HCV 감염으로 인한 질환 치료용 약학적 조성물.
제 12항에 있어서, 약학적으로 허용가능한 담체를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항의 핵산 분자 또는 제 10항 또는 제 11 항의 DNA 벡터를 대상체에 주입하는 것을 포함하는 HCV 감염으로 인한 질환을 치료하는 방법.
도1의 pRNAiDu로 나타내어지는 siRNA 발현벡터(수탁번호: KCTC 10800BP).