KR101384860B1

KR101384860B1 - 표적 물질 특이적으로 ｓｉＲＮＡ를 방출하는 ＲＮＡ 간섭용 조성물 및 이를 이용한 ＨＣＶ 관련 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101384860B1
Application number: KR1020110050323A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 장병용; 이창호
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2011-05-26
Filing date: 2011-05-26
Publication date: 2014-04-15
Also published as: KR20120131864A

Abstract

본 발명은 표적 물질 특이적으로 siRNA를 방출하는 RNA 간섭용 조성물 및 이를 이용한 HCV 관련 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 RNA 간섭용 조성물은, 앱타머를 통하여 표적 물질과 특이적으로 결합함으로써 상기 표적 물질의 기능을 억제함과 동시에, siRNA를 방출함으로써 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 가지므로, 효과적으로 표적 물질이 존재하는 세포에서만 특이적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 그 결과, siRNA의 센스 가닥이 다른 유전자에 작용하여 표적 비특이적 활성(off-target effect)을 나타내는 부작용을 감소시키고, siRNA가 세포 내에서 독성 스트레스를 유도하여 세포사를 일으키는 등의 부작용을 감소시킬 수 있다. 특히, HCV가 감염된 세포에서만 특이적으로 HCV의 단백질 발현을 억제하는 siRNA를 방출할 수 있으므로, HCV 단백질 발현을 억제함으로써 HCV의 증식을 효과적으로 억제하고, 그에 따라 효과적으로 HCV 관련 질환을 치료할 수 있다.

Description

표적 물질 특이적으로 ｓｉＲＮＡ를 방출하는 ＲＮＡ 간섭용 조성물 및 이를 이용한 ＨＣＶ 관련 질환 치료용 조성물{Composition for RNA interference releasing siRNA target molecule-specifically and composition for treating HCV related diseases using the same}

본 발명은 표적 물질 특이적으로 siRNA를 방출하는 RNA 간섭용 조성물 및 이를 이용한 HCV 관련 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus : HCV)는 Flaviviridae 속에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로, non-A, non-B 간염을 일으키고(Kuo, G., et al., 1989, Science 244, 362-364), 만성으로 진행되면 간경화나 간암으로 발전되어 치사율이 매우 높은 것으로 알려져 있다(Saito, I., et al., 1990, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87, 6547-6549). 전 세계 인구의 1~2%가 이 바이러스에 감염되어 있지만, 바이러스는 매우 낮은 역가(titer)로 생체 내에 존재하고 있기 때문에 진단하기가 매우 힘들고, HCV 바이러스에 대한 효과적인 치료제나 백신이 없는 상태이다.

현재 HCV 증식을 억제함으로써 HCV로 인한 질병에 어느 정도 효과를 보이는 α-인터페론과 리바비린(ribavirin)을 동시에 투여하는 방법이 있지만, 이 방법은 바이러스의 균주마다 그 효과가 다르게 보고되어 있으며, 단지 40%의 HCV 감염 환자에서만 지속적인 효과가 있으며 많은 부작용을 유발하는 것으로 알려져 있다(Bartenschlager R et al., Adv Virus Res 2004, 63, 71-180).

HCV가 감염되면 숙주세포에서 하나의 긴 복합 단백질을 형성한다. 이 복합 단백질은 개개의 기능을 갖는 여러 개의 단백질로 절단되는데, 그 중 비구조 단백질인 NS5B는 RNA 의존적 RNA 합성 활성을 갖는 단백질로써 바이러스 복제에 매우 중요한 역할을 담당한다.

RNA 간섭(RNAi) 현상은 대부분의 생명체에서 잘 보존된 특이적인 유전자 발현 억제 현상이다. 구체적으로, 특정 유전자에 대한 염기서열 상동성을 가지는 RNA에 의하여 유전자 발현이 간섭을 받아 저해되는 현상을 의미하며, 작은 RNA(small RNA)가 mRNA를 방해하거나 안전성을 저하시키거나 경우에 따라서는 mRNA를 절단함으로써 유전정보의 발현을 제어하는 생명현상 조절 기전을 의미한다. 그 후 포유류 세포에서도 합성 이중가닥 RNA가 서열 특이적인 유전자 넉다운(knock-down)을 야기한다는 것이 발견되었고, 2001년에 포유동물 세포시스템에서 처음으로 siRNA에 의한 유전자 억제가 성공한 이후로 전 세계적으로 많은 연구가 수행되고 있다.

그러나 siRNA가 표적 유전자에 대한 높은 간섭효과를 가짐에도 불구하고, siRNA의 센스 가닥이 다른 유전자에 작용하여 표적 비특이적 활성(off-target effect)을 나타내는 부작용이 일어날 수 있고, siRNA가 세포 혹은 생체 내에서 짧은 반감기를 가지고 있어서 유전자 발현 저해를 수행하기 전에 외부의 유전자 분해 효소 (nuclease)들에 의해서 쉽게 분해되어 버릴 수 있다. 또한 siRNA가 생체 내에서 면역 세포에 의해서 제거되거나 독성 스트레스를 유도하여 세포사를 일으키거나 몸 밖으로 배출되지 않고 오랫동안 순환되면서 표적 세포에 도달해야 하는 문제점들이 여전히 존재하고 있다.

본 발명자는 siRNA의 센스 가닥이 다른 유전자에 작용하여 표적 비특이적 활성(off-target effect)을 나타내는 부작용을 감소시키고, siRNA가 세포 내에서 독성 스트레스를 유도하여 세포사를 일으키는 등의 부작용을 감소시킬 수 있는 방법에 대하여 예의 연구한 결과, 표적 물질이 존재하는 세포 특이적으로 siRNA의 센스 및 안티센스를 방출하는 RNA 간섭용 조성물을 개발하고 본 발명을 완성하였다.

또한, HCV 단백질에 특이적으로 결합하는 앱타머, 자가-절단 능력을 가지고 있는 해머헤드 리보자임, 및 HCV 단백질에 대한 siRNA를 포함하는 RNA 간섭용 조성물을 이용하여 HCV 감염된 세포에서만 특이적으로 HCV 단백질의 발현을 억제함으로써 HCV의 증식을 효과적으로 억제하고, 그에 따라 효과적으로 HCV 관련 질환을 치료할 수 있음을 발견하였다.

본 발명의 주된 목적은 제1앱타자임 및 제2앱타자임을 포함하는 RNA 간섭(RNAi)용 조성물로서, 상기 제1앱타자임은 제1앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제1해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제1교류모듈(comminication module), 및 제1해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고, 상기 제2앱타자임은 제2앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제2해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제2교류모듈(comminication module), 및 제2해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고, 상기 앱타머 RNA에 표적 물질이 결합하면 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되며, 상기 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되면 상기 표적 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자에 대한 센스 뉴클레오티드 서열이 앱타자임으로부터 방출되는, RNA 간섭(RNAi)용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 제1앱타자임을 코딩하는 DNA를 포함하는 제1발현 벡터, 및 제2앱타자임을 코딩하는 DNA를 포함하는 제2발현 벡터를 포함하는 RNA 간섭(RNAi)용 조성물로서, 상기 제1앱타자임은 제1앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제1해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제1교류모듈(comminication module), 및 제1해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고, 상기 제2앱타자임은 제2앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제2해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제2교류모듈(comminication module), 및 제2해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고, 상기 앱타머 RNA에 표적 물질이 결합하면 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되며, 상기 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되면 상기 표적 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자에 대한 센스 뉴클레오티드 서열이 앱타자임으로부터 방출되는, RNA 간섭(RNAi)용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또다른 목적은 상기 RNA 간섭(RNAi)용 조성물을 포함하는 HCV 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 표적 물질이 존재하는 세포 특이적으로 siRNA의 센스 및 안티센스를 각각 방출하는 제1앱타자임 및 제2앱타자임을 포함하는 RNA 간섭(RNAi)용 조성물로서, 상기 제1앱타자임은 제1앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제1해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제1교류모듈(comminication module), 및 제1해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고, 상기 제2앱타자임은 제2앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제2해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제2교류모듈(comminication module), 및 제2해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고, 상기 앱타머 RNA에 표적 물질이 결합하면 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되며, 상기 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되면 상기 표적 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자에 대한 센스 뉴클레오티드 서열이 앱타자임으로부터 방출되는, RNA 간섭(RNAi)용 조성물을 제공하는 것이다. 상기 방출된 표적 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자에 대한 센스 뉴클레오티드 서열은 상보적 결합하여 이중가닥 siRNA를 형성한다. 상기 표적 유전자의 일부는 10 내지 20개 뉴클레오티드로 구성되는 것일 수 있다. 본 발명의 개념을 도 1에 도식화하였다.

본 발명은 siRNA의 안티센스 뉴클레오티드 서열을 방출하는 제1앱타자임 및 센스 뉴클레오티드 서열을 방출하는 제2앱타자임을 포함함으로써, 방출된 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 센스 뉴클레오티드 서열이 상보적 결합하여 이중가닥 siRNA를 형성하여 비로소 RNA 간섭 작용을 할 수 있도록 하는 것을 특징으로 한다. 제1앱타자임의 제1앱타머의 표적 물질과 제2앱타자임의 제2앱타머의 표적 물질은 동일 또는 상이할 수 있다. 또한, 표적 물질이 동일하더라도 앱타머가 인식하는 부위에 따라 제1앱타자임의 제1앱타머와 제2앱타자임의 제2앱타머는 동일 또는 상이할 수 있다. 제1앱타자임의 제1앱타머의 표적 물질과 제2앱타자임의 제2앱타머의 표적 물질이 상이한 경우, 제1앱타머의 표적 물질 및 제2앱타머의 표적 물질이 모두 세포에 존재하는 경우에만 본 발명의 RNA 간섭용 조성물이 siRNA를 방출할 수 있다.

본 발명의 해머헤드 리보자임은 하기 RNA 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단 위치에 센스 뉴클레오티드 서열 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열이 직접 연결될 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 하기 서열 중 밑줄 친 부분이 siRNA의 센스 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열로 대체되는 부분을 나타낸다. N은 A, C, G, U 중 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다.

<해머헤드 리보자임의 RNA 서열 (서열번호 1)>

5'-GGGAAUGGUGCUGAUGAGNCNNNNNNGNCGAAUUAUUUGGGAAACCAAACAAACACCAUUGUCACACUCCA-3'

상기 안티센스 뉴클레오티드 서열 또는 센스 뉴클레오티드 서열은 해머헤드 리보자임 RNA의 촉매 코어(상기 해머헤드 리보자임의 RNA 서열의 이탤릭체 부분) 이외의 부위에 포함될 수 있다. 상기 안티센스 뉴클레오티드 서열 또는 센스 뉴클레오티드 서열이 치환되는 위치가 적절하지 않을 경우, 리보자임의 3차원 구조에 영향을 미칠 수 있고, 안티센스 뉴클레오티드 서열 또는 센스 뉴클레오티드 서열이 효율적으로 방출되지 못하는 문제가 발생할 수 있다.

상기 해머헤드 리보자임 RNA는 해머헤드 리보자임 구조의 헬릭스 I, 헬릭스 II 또는 헬릭스 III가 제거된 것일 수 있다. 해머헤드 리보자임 구조의 헬릭스 I, 헬릭스 II 및 헬릭스 III은 도 2에 표시된 구조일 수 있다.

상기 앱타머는 SELEX 방법(Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment, 시험관 내 선별방법)을 이용하여 수득할 수 있다.

상기 교류 모듈은 앱타머에 표적 물질이 결합하면 알로스테릭한 구조 변형에 의해 해머헤드 리보자임의 자가-절단을 활성화시키는 역할을 한다. 본 발명의 알로스테릭 교류 모듈은 시험관내 선별 방법을 통해 선별할 수 있다. 구체적으로는, 교류 모듈을 NNNNN으로 두고 각각의 N에 A, U, C, G가 동수로 포함되는 랜덤 서열을 조합하여, i) 표적 물질에 대한 앱타머, ii) 해머헤드 리보자임 및 iii) 교류 모듈을 포함하는 앱타자임 라이브러리를 제조한 다음, 앱타자임 라이브러리를 표적 물질 이외의 물질 및 표적 물질과 접촉시켜, 표적 물질 존재하에서만 특이적으로 자가-절단을 보이는 RNA 풀을 수득하고, 수득된 RNA 풀의 교류 모듈의 서열을 확인함으로써 확보할 수 있다.

HCV의 게놈인 RNA는 번역(translation)에 의해 약 3000개의 아미노산으로 이루어진 하나의 복합단백질을 생성하고, 이후 숙주와 바이러스의 프로테이즈에 의해 C, E1, E2 등의 구조 단백질과 NS2, NS3, NS4, NS4A, NS4B, NS5, NS5A 및 NS5B와 같은 비구조 단백질로 나누어진다. 상기 HCV 비구조 단백질 중 NS5B는 RNA 의존적인 RNA 중합효소로서, 세포내에서 HCV가 증식하고 있음을 나타내는 HCV 증식의 주요인자이다.

본 발명의 앱타머는 상기 C, E1, E2 등의 구조 단백질과 NS2, NS3, NS4, NS4A, NS4B, NS5 및 NS5A와 같은 비구조 단백질 중 어느 하나의 단백질과 높은 결합력으로 결합하여 그 기능을 저해하는 물질로서, 바람직하게는 본 발명의 제1 및 제2앱타머의 표적 물질은 C형 간염 바이러스의 NS5B 단백질일 수 있다.

상기 NS5B 단백질에 대한 제1 및 제2앱타머는 SELEX 방법(Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment, 시험관 내 선별방법)을 이용하여 본 발명자들이 발굴한 분자로서, 각각 독립적으로 서열번호 2 내지 5 중에서 선택될 수 있다.

서열번호 2 :

GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCACAUUGUGAGGGGCUCAGGUGGAUCGCAUGGCCGUGUCCAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCU

서열번호 3:

GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCUCGAUAAAAGGGGCCUGGGAUUGAAUCGCAUGGCCGUGUCCAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCU

서열번호 4:

GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCUCGGCUAGGGGGUCUGGGCGAAUCGCAUUGCCGUGCAUCAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCU

서열번호 5:

CGCGCAAUAUUGUGAGGGGCGCA

앱타머가 C형 간염 바이러스의 NS5B 단백질에 대한 앱타머일 경우 제1 및 제2교류 모듈은 각각 독립적으로 5' 모듈 서열은 CCUCU(서열번호 6)이고, 3' 모듈 서열은 CACAC(서열번호 7), UCCAC(서열번호 8) 또는 UCACC(서열번호 9)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 센스 뉴클레오티드 또는 안티센스 뉴클레오티드의 표적 유전자는 앱타머의 표적 물질을 코딩하는 유전자의 일부 또는 전부와 동일 또는 상이할 수 있다. 구체적으로는, C형 간염 바이러스 복제 관련 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있고, 바람직하게는 C형 간염 바이러스 NS5B 단백질을 코딩하는 유전자일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. NS5B 단백질을 코딩하는 유전자에 대한 센스 뉴클레오티드 서열 및 안티센스 뉴클레오티드 서열은 서열번호 10 및 서열번호 11일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 구체적 실시예에 의한 RNA 간섭용 조성물은 C형 간염 바이러스 감염된 세포에 존재하는 표적 물질에 결합함으로써 C형 간염 바이러스 감염된 세포에서 특이적으로 RNA 간섭을 일으킨다. 또한, 상기 RNA 간섭용 조성물은 앱타머를 통하여 표적 물질과 특이적으로 결합함으로써 상기 표적 물질의 기능을 억제함과 동시에 siRNA를 방출함으로써 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 가지므로, 효과적으로 표적 물질이 존재하는 세포 특이적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다.

본 발명의 NS5B에 의존적으로 NS5B에 대한 안티센스 뉴클레오티드를 방출하는 제1앱타자임은 서열번호 12일 수 있고, NS5B에 의존적으로 NS5B에 대한 센스 뉴클레오티드를 방출하는 제2앱타자임은 서열번호 13일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 하기 서열에서 밑줄 친 부분이 교류 모듈이고, 이탤릭체로 기재된 서열은 HCV NS5B에 대한 앱타머이며, 굵게 표시된 부분은 센스 또는 안티센스 뉴클레오티드 서열이다.

서열번호 12:

5'GUGACUCACUGAUGAGCCUCU CGCGGCAAUAUUGUGAGGGGCGCA CACACCGAAACAUUUGGGAAACCAAACGUAUGAGUCAUCAGGAUCAUCCUU3'

서열번호 13:

5'GGGAUCAUCCCUGAUGAGCCUCU CGCGGCAAUAUUGUGAGGGGCGCA CACACCGAAACAUUUGGGAAACCAAACGUAGGAUGAUCCUGAUGACUCAUU3'

다른 양태로서, 본 발명은 제1앱타자임을 코딩하는 DNA를 포함하는 제1발현 벡터, 및 제2앱타자임을 코딩하는 DNA를 포함하는 제2발현 벡터를 포함하는 RNA 간섭(RNAi)용 조성물로서, 상기 제1앱타자임은 제1앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제1해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제1교류모듈(comminication module), 및 제1해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고, 상기 제2앱타자임은 제2앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제2해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제2교류모듈(comminication module), 및 제2해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고, 상기 앱타머 RNA에 표적 물질이 결합하면 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되며, 상기 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되면 상기 표적 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자에 대한 센스 뉴클레오티드 서열이 앱타자임으로부터 방출되는, RNA 간섭(RNAi)용 조성물을 제공하는 것이다. 본 발명에서, "발현 벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질 또는 목적 RNA를 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다. 상기 발현 벡터는 바람직하게는 바이러스 벡터일 수 있다. 상기 발현 벡터는 적절한 프로모터를 포함할 수 있고, 바람직하게는 RNA 폴리머라제 III(U6) 프로모터 또는 RNA 폴리머라제 II 프로모터를 포함할 수 있다.

또다른 양태로서, 본 발명은 상기 RNA 간섭용 조성물을 포함하는 HCV 관련 질환 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다. 상기 HCV 관련 질환은 HCV에 의해 발생하는 질환으로서 간염, 간섬유화, 간경화 및 간암을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 상기 HCV 관련 질환 치료용 조성물을 HCV 보균자, HCV에 의한 간염, 간섬유화, 간경화 또는 간암이 발병한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 HCV 관련 질환의 치료방법이 제공된다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 RNA 간섭용 조성물은 앱타머가 HCV NS5B 단백질과 특이적으로 결합함으로써 NS5B의 기능을 억제시킴과 동시에 해머헤드 리보자임의 자가-절단이 유도되어 NS5B를 비롯한 HCV 단백질의 발현을 억제하는 siRNA를 방출함으로써 오로지 HCV 감염 세포에서만 특이적으로 HCV의 증식을 억제하는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 조성물은 HCV 관련 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여에 의해 HCV 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하고, 본 발명에서 용어 "개체"란 HCV 관련 질환이 발병한 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.

상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 간내투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 HCV 관련 질환의 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호로몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 표적 물질이 존재하는 세포 특이적으로 siRNA를 방출하는 본 발명의 RNA 간섭용 조성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

구체적으로, 제1앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제1해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제1교류모듈(comminication module), 및 제1해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 연결하여 제1앱타자임을 제조하는 단계; 및 제2앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제2해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제2교류모듈(comminication module), 및 제2해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 연결하여 제2앱타자임을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 본 발명의 구체적 실시예에서는 PCR 방법을 이용하여 본 발명의 RNA 간섭용 조성물을 제조하였다.

본 발명의 RNA 간섭용 조성물은, 앱타머를 통하여 표적 물질과 특이적으로 결합함으로써 상기 표적 물질의 기능을 억제함과 동시에, siRNA를 방출함으로써 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 가지므로, 효과적으로 표적 물질이 존재하는 세포에서만 특이적으로 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있다. 그 결과, siRNA의 센스 가닥이 다른 유전자에 작용하여 표적 비특이적 활성(off-target effect)을 나타내는 부작용을 감소시키고, siRNA가 세포 내에서 독성 스트레스를 유도하여 세포사를 일으키는 등의 부작용을 감소시킬 수 있다. 특히, HCV가 감염된 세포에서만 특이적으로 HCV의 단백질 발현을 억제하는 siRNA를 방출할 수 있으므로, HCV 단백질 발현을 억제함으로써 HCV의 증식을 효과적으로 억제하고, 그에 따라 효과적으로 HCV 관련 질환을 치료할 수 있다.

도 1은 앱타머에 표적 물질이 결합하면 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되어 표적 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자에 대한 센스 뉴클레오티드 서열이 방출되는 본 발명의 구체적 실시예에 대한 개념을 도식화한 그림이다.
도 2는 앱타머, 앱타머에 특정 리간드 결합시 구조적 변이를 유도하는 교류 모듈, 및 자가-절단 능력을 갖는 해머헤드 리보자임을 결합시킨 앱타자임의 구조적 모식도(위); 다양한 교류 모듈의 염기서열(아래)을 나타낸다.
도 3은 선별된 NS5B 의존적 엡타자임의 서열을 보인 도면이다. 25개의 클론 중 서열이 서로 다른 22개의 클론의 서열을 도시하였다. 괄호안의 숫자는 중복하여 발견된 클론의 수이다.
도 4는 앱타머가 없는 리보자임의 표적단백질 비의존적 절단을 확인한 것이다.
도 5는 NS5B 의존 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 활성 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 비활성 교류 모듈 포함 앱타자임의 NS5B 단백질 의존적인 절단 능력을 확인한 것이다.
도 6은 NS5B 의존 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 활성 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 비활성 교류 모듈 포함 앱타자임의 시간에 따른 절단 능력을 확인한 것이다.
도 7 a 및 b는 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임의 MgCl₂농도 의존적 절단능력을 확인한 것이고, c 및 d는 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임의 10mM MgCl₂농도에서의 시간 의존적 절단 능력을 확인한 것이다.
도 8은 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임과 활성 교류 모듈 포함 앱타자임의 2차 구조와 절단부위(붉은 화살표)를 나타낸 것이다.
도 9는 다양한 세포 내 앱타머와 교류모듈이 없는 해머헤드 리보자임에 의한 유전자 간섭 현상을 나타낸 것이다. S는 센스, A는 안티센스를 의미한다.
도 10은 앱타머와 교류 모듈이 없는 백터기반 해머헤드 리보자임의 세포내 절단 능력을 나타낸 것이다.
도 11은 NS5B 의존 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 활성 교류 모듈 포함 앱타자임의 절단 능력을 나타낸 것이다.
도 12는 NS5B 의존 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 활성 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 비활성 교류 모듈 포함 앱타자임에 의한 NS5B 단백질 의존적 간섭 현상을 나타낸 것이다.
도 13은 NS5B 의존 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 활성 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 비활성 교류 모듈 포함 앱타자임에 의한 NS5B 발현 세포 특이적 유전자 간섭 현상을 나타낸 것이다. A. 리포터 RNA의 구조. B. Huh-7 간암세포주에 NS5B 단백질을 안정적으로 발현하는 세포에서 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임과 활성 교류 모듈 포함 앱타자임에 의한 유전자 간섭 현상을 확인하였다. C. NS5B 단백질을 발현하지 않는 Huh-7 간암세포에서는 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임과 활성 교류 모듈 포함 앱타자임에 의한 유전자 간섭현상을 확인하지 못하였다.
도 14는 U6+1 벡터 기반 siRNA 센스 가닥 방출 앱타자임과 U6+1 벡터 기반 siRNA 안티센스 가닥 방출 앱타자임을 이용한 NS5B 발현세포 특이적 유전자 간섭 현상을 나타낸 것이다. A. Huh-7 간암세포주에 NS5B 단백질을 안정적으로 발현하는 세포 (neo-replicon이 안정적으로 복제되고 있는 세포)에서 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임과 활성 교류 모듈 포함 앱타자임에 의한 유전자 간섭 현상을 확인하였다. B. NS5B 단백질을 발현하지 않는 Huh-7 간암세포에서는 활성 교류 모듈 포함 앱타자임에 의한 유전자 간섭 현상을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. NS5B 의존적 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임의 선별

1-1. NS5B 의존적 앱타자임 라이브러리 제작

도 2에 도시된 NS5B-의존적인 앱타자임을 구성하기 위해, NS5B 앱타머, 해머헤드 리보자임 촉매 코어 부위 및 무작위의 10 mer로 구성된 교류 모듈(communication module)로 구성된 리보자임 라이브러리를 사용하여 시험관내 선별을 수행하였다.

리보자임 라이브러리 RNA는 교류 모듈에 5개의 랜덤서열을 포함하는 하기의 프라이머 세트를 가지고 연속적으로 두 번 증폭시킨 DNA를 주형으로 시험관 내에서 RNA로 전사시켜 만들었다. 이때, N에는 A, C, G, T가 동수로 포함되게 하였다.

제1 프라이머 세트

5' 프라이머 : 5'-TTGGTGTCTGATGAGNNNNNCGCGCCATATTGTGAGGGGCGCG (서열번호 14)

3' 프라이머 : 5'-TACGTTTGGTTTCCCAAACGTTTCGNNNNNCGCGCCCCTCACAAT (서열번호 15)

제2 프라이머 세트

5' 프라이머 : 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG (서열번호 16)

3' 프라이머 : 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA (서열번호 17)

1-2. NS5B 의존적 앱타자임 라이브러리의 선별

NS5B 단백질 결합시 특이적으로 리보자임 활성을 유도할 수 있는 가장 적당한 교류 모듈의 서열을 확인하기 위해서, 하기 방법에 따라 비특이적으로 자가-절단되는 RNA 집단을 제거하였다. 리보자임 라이브러리를 37℃에서 6시간 동안 리보자임 반응 버퍼(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 4 mM DTT, 10 mM MgCl₂) 및 BSA(bovin serum albumin)를 함께 넣고 반응시킨 후에, 반응물을 7 M 우레아-10% 폴리아크릴아미드 젤에서 전기영동하고, EtBr 염색을 통해 절단되지 않은 RNA를 확인하였다.

그 후, 상기 절단되지 않은 RNA 집단을 프라이머5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA (서열번호 17)를 사용하여 역전사 시키고, 역전사된 cDNA는 5' 프라이머 (서열번호 16 : 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG) 및 3' 프라이머 (서열번호 17 : 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA)로 증폭하였다.

그 후, 상기 cDNA를 RNA로 전사시켜 앱타자임 라이브러리를 만들고, 37℃에서 1 시간 동안 리보자임 반응 버퍼에서 HCV NS5B 단백질과 함께 반응시켰다. 그 후, NS5B에 의존적으로 절단되는 앱타자임 집단을 우레아 폴리아크릴아미드 젤로 전기영동 하여 정제하고, 정제하여 얻은 앱타자임을 프라이머5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA (서열번호 17)를 사용하여 역전사 시키고, 역전사된 cDNA는 5' 프라이머 (서열번호 16 : 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG) 및 3' 프라이머 (서열번호 17 : 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA)로 PCR 증폭하고, 다시 RNA로 전사시켜 선별과정을 거칠 앱타자임 집단을 제작하였다.

4번의 선별 과정 후에, 증폭된 DNA를 클로닝 하였고, 25개의 클론을 시퀀싱 하였다. 도 3은 교류 모듈에 피리미딘(pyrimidine)이 풍부하고, 서열이 서로 다른 22개의 선별된 클론을 나타낸다.

실시예 2. 절단조각부위를 siRNA로 치환한 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

NS5B에 대한 앱타머, 해머헤드 리보자임 및 NS5B 단백질에 의해 활성이 조절되거나(알로스테릭) 조절되지 않는 (비활성/활성) 교류모듈을 포함하는 앱타자임으로서 절단조각부위를 siRNA로 치환한 앱타자임을 하기와 같은 방법으로 제작하였다.

2-1. 절단조각부위를 센스 뉴클레오티드로 치환한 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

2-1-1. 알로스테릭 교류 모듈을 포함하는 앱타자임 제작

NS5B에 대한 앱타머(서열번호 5) 및 해머헤드 리보자임(서열번호 1)를 주형으로, 10μM 5'-프라이머 (서열번호 18: CTGATGAGCCTCTCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCAC)와 10μM 3'-프라이머 (서열번호 19: TACGTTTGGTTTCCCAAATGTTTCGGTGTGTGCGCCCCT), 5X PCR 버퍼(HF), 100uM dNTP 혼합물, DNA taq 폴리머라제(Phusion) 2 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하여 앱타머와 해머헤드 리보자임이 알로스테릭 교류 모듈로 연결된 알로스테릭 앱타자임의 일부를 1차 증폭시켰다. PCR 수행 방법은, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 20 사이클을 반복한 후 마지막으로 72℃ 7분 수행하였다. 그 후, 1차 증폭된 알로스테릭 앱타자임의 일부를 주형으로 하여 알로스테릭 앱타자임의 최종 DNA 주형을 제작하기 위하여, 10μM 5'-프라이머(서열번호 20: TAATACGACTCACTATAGGGATCATCCCTGATGAGCCTCTC)와 10μM 3'-프라이머(서열번호 21: AAGGATGATCCTGATGACTCATACGTTTGGTTTC), 5X PCR 버퍼(HF), 100μM dNTP 혼합물, DNA taq 폴리머라제(Phusion) 2 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행 방법은, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 35 사이클을 반복한 후 마지막으로 72℃ 7분 수행하였다.

2-1-2. 절단조각부위를 센스 뉴클레오티드로 치환한 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

그 후, 절단조각부위를 센스 뉴클레오티드 서열로 치환한 앱타자임을 제작하기 위해, 상기 1차 증폭된 알로스테릭 앱타자임의 일부를 주형으로 하여 10μM 5'-프라이머(서열번호 22: TAATACGACTCACTATAGGATCATCCCTGATGAGTCTCTGAAA)와 10μM 3'-프라이머(서열번호 23: TCCTGGCCTCCCAGGATGTTCGTCTCATTTCAGAGA), 5X PCR 버퍼(HF), 100μM dNTP 혼합물, DNA taq 폴리머라제(Phusion) 2 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하여 치환되지 않을 부분을 1차 증폭시켰다. PCR 수행 방법은, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 20 사이클을 반복한 후 마지막으로 72℃ 7분 수행하였다. 그 후, 1차 증폭된 부분을 주형으로, 10μM 5'-프라이머(서열번호 22: TAATACGACTCACTATAGGATCATCCCTGATGAGTCTCTGAAA)와 10μM 3'-프라이머(서열번호 24: GCTCTAGAAATGAGTCATCAGGATCATCCTCATCCTGGCCTCCC), 5X PCR 버퍼(HF), 100μM dNTP 혼합물, DNA taq 폴리머라제(Phusion) 2 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하여 절단조각부위를 센스 뉴클레오티드 서열로 치환한 앱타자임의 최종 DNA 주형을 제작하였다. PCR 수행 방법은, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 20 사이클을 반복한 후 마지막으로 72℃ 7분 수행하였다.

<제작된 DNA 주형 (서열번호 26)>

5'GGGATCATCCCTGATGAGCCTCTCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCACACACCGAAACATTTGGGAAACCAAACGTAGGATGATCCTGATGACTCATT3'

PCR을 통해 제작된 상기 DNA를 주형으로 T7 RNA 폴리머라제(Takara)를 이용하여 시험관내 전사 과정을 거쳐 앱타자임을 제조하였다. 구체적으로, DNA 주형, 10X 전사 버퍼(Takara), 10mM DTT(Takara), 5 mM ATP, GTP, CTP, T7 RNA 폴리머라제(Takara)를 포함시키고 DEPC-dH₂O를 이용하여 100 μl로 맞춘 후 37℃ 에서 3시간 동안 반응시켜 시험관내 전사를 수행하고; 그 후, DNaseI(Roche)을 처리하여 37℃ 에서 30분간 반응시켜 주형으로 사용된 DNA를 제거한 후 7 M 우레아-8% 폴리아크릴아미드 젤에서 RNA를 추출하였다.

2-2. 절단조각부위를 안티센스 뉴클레오티드로 치환한 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

2-2-1. 알로스테릭 교류 모듈을 포함하는 앱타자임 제작

NS5B에 대한 앱타머(서열번호 5) 및 해머헤드 리보자임(서열번호 1)를 주형으로, 10μM 5'-프라이머 (서열번호 18: CTGATGAGCCTCTCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCAC)와 10μM 3'-프라이머(서열번호 19: TACGTTTGGTTTCCCAAATGTTTCGGTGTGTGCGCCCCT), 5X PCR 버퍼(HF), 100μM dNTP 혼합물, DNA taq 폴리머라제(Phusion) 2 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하여 앱타머와 해머헤드 리보자임이 알로스테릭 교류 모듈로 연결된 알로스테릭 앱타자임의 일부를 1차 증폭시켰다. PCR 수행 방법은, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 20 사이클을 반복한 후 마지막으로 72℃ 7분 수행하였다. 그 후, 1차 증폭된 알로스테릭 앱타자임의 일부를 주형으로 하여 알로스테릭 앱타자임의 최종 DNA 주형을 제작하기 위하여, 10μM 5'-프라이머(서열번호 25: TAATACGACTCACTATAacgcgtcgacGTGACTCACTGATGAGCAACC)와 10μM 3'-프라이머(서열번호 21: AAGGATGATCCTGATGACTCATACGTTTGGTTTC) 5X PCR 버퍼(HF), 100μM dNTP 혼합물, DNA taq 폴리머라제(Phusion) 2 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하였다. PCR 수행 방법은, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 35 사이클을 반복한 후 마지막으로 72℃ 7분 수행하였다.

2-2-2. 절단조각부위를 안티센스 뉴클레오티드로 치환한 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

2-1-2의 방법과 유사한 방법으로 PCR을 수행하여 절단조각부위를 안티센스 뉴클레오티드 서열로 치환한 앱타자임의 최종 DNA 주형을 제작하였다.

<제작된 DNA 주형 (서열번호 27)>

5'GTGACTCACTGATGAGCCTCTCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCACACACCGAAACATTTGGGAAACCAAACGTATGAGTCATCAGGATCATCCTT3'

비교실시예 1. 절단조각부위를 siRNA로 치환한 활성(알로스테릭이 아닌) 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

1-1. 절단조각부위를 센스 뉴클레오티드로 치환한 활성 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

실시예 2-1-1과 동일한 조건으로 10μM 5'-프라이머(서열번호 18: CTGATGAGCAACCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCAC)와 10μM 3'-프라이머 (서열번호 19: TACGTTTGGTTTCCCAAATGTTTCATGCTTGTGCGCCCCT)를 이용하여 1차 증폭후 10μM 5'-프라이머(서열번호 28: TAATACGACTCACTATAGGGATCATCCCTGATGAGCAACC)와 10μM 3'-프라이머 (서열번호 21: AAGGATGATCCTGATGACTCATACGTTTGGTTTC)를 이용하여 2차 증폭을 수행하였다. 이후 과정은 실시예 2-1-2와 동일하다.

<제작된 DNA 주형 (서열번호 29)>

5'GGGATCATCCCTGATGAGCAACCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCACAAGCATGAAACATTTGGGAAACCAAACGTAGGATGATCCTGATGACTCATT3'

1-2. 절단조각부위를 안티센스 뉴클레오티드로 치환한 활성 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

실시예 2-2-1과 동일한 조건으로 10μM 5'-프라이머(서열번호 18: CTGATGAGCAACCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCAC)와 10μM 3'-프라이머 (서열번호 19: TACGTTTGGTTTCCCAAATGTTTCATGCTTGTGCGCCCCT)를 이용하여 1차 증폭후 10μM 5'-프라이머(서열번호 25: TAATACGACTCACTATAacgcgtcgacGTGACTCACTGATGAGCAACC)와 10μM 3'-프라이머(서열번호 21: AAGGATGATCCTGATGACTCATACGTTTGGTTTC)를 이용하여 2차 증폭을 수행하였다. 이후 과정은 실시예 2-2-2와 동일하다.

<제작된 DNA 주형 (서열번호 30)>

5'GTGACTCACTGATGAGCAACCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCACAAGCATGAAACATTTGGGAAACCAAACGTATGAGTCATCAGGATCATCCTT3'

비교실시예 2. 절단조각부위를 siRNA로 치환한 비활성(알로스테릭이 아닌) 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

2-1. 절단조각부위를 센스 뉴클레오티드로 치환한 비활성 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

실시예 2-1-1과 동일한 조건으로 10μM 5'-프라이머(서열번호 18: CTGATGAGTACACCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCAC)와 10μM 3'-프라이머 (서열번호 19: TACGTTTGGTTTCCCAAATGTTTCATACTTGTGCGCCCCT)를 이용하여 1차 증폭후 10μM 5'-프라이머(서열번호 31: TAATACGACTCACTATAGGGATCATCCCTGATGAGTACACC)와 10μM 3'-프라이머 (서열번호 21: AAGGATGATCCTGATGACTCATACGTTTGGTTTC)를 이용하여 2차 증폭을 수행하였다. 이후 과정은 실시예 2-1-2와 동일하다.

<제작된 DNA 주형 (서열번호 32)>

5'GGGATCATCCCTGATGAGTACACCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCACAAGTATGAAACATTTGGGAAACCAAACGTAGGATGATCCTGATGACTCATT3'

2-2. 절단조각부위를 안티센스 뉴클레오티드로 치환한 비활성 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

실시예 2-2-1과 동일한 조건으로 10μM 5'-프라이머(서열번호 18: CTGATGAGTACACCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCAC)와 10μM 3'-프라이머 (서열번호 19: TACGTTTGGTTTCCCAAATGTTTCATACTTGTGCGCCCCT)를 이용하여 1차 증폭후 10μM 5'-프라이머(서열번호 33: TAATACGACTCACTATAacgcgtcgacGTGACTCACTGATGAGTACACC)와 10μM 3'-프라이머(서열번호 21: AAGGATGATCCTGATGACTCATACGTTTGGTTTC)를 이용하여 2차 증폭을 수행하였다. 이후 과정은 실시예 2-2-2와 동일하다.

<제작된 DNA 주형 (서열번호 34)>

5'GTGACTCACTGATGAGTACACCGCGGCAATATTGTGAGGGGCGCACAAGTATGAAACATTTGGGAAACCAAACGTATGAGTCATCAGGATCATCCTT3'

비교실시예 3. 절단반응이 일어나지 않도록 단일염기를 치환한 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임 제작

실시예 2-1-1과 동일한 조건으로 수행한 후, 1차 증폭된 알로스테릭 앱타자임의 일부를 주형으로 하여 10μM 5'-프라이머(서열번호 35: TAATACGACTCACTATAGGTGACTCACTGATGGGTCTCTGAAATGAGAC)와 10μM 3'-프라이머(서열번호 23: TCCTGGCCTCCCAGGATGTTCGTCTCATTTCAGAGA), 5X PCR 버퍼(HF), 100μM dNTP 혼합물, DNA taq 폴리머라제(Phusion) 2 유닛을 혼합하여 치환되지 않을 부분을 1차 증폭시켰다. PCR 수행 방법은, 95℃ 30초, 58℃ 30초, 72℃ 30초의 조건으로 20 사이클을 반복한 뒤, 마지막으로 72℃ 7분 수행하였다. 그 후, 1차 증폭된 부분을 주형으로, 10μM 5'-프라이머(서열번호 35: TAATACGACTCACTATAGGTGACTCACTGATGGGTCTCTGAAATGAGAC)와 10μM 3'-프라이머(서열번호 24: GCTCTAGAAATGAGTCATCAGGATCATCCTCATCCTGGCCTCCC), 5X PCR 버퍼(HF), 100μM dNTP 혼합물, DNA taq 폴리머라제 (Phusion) 2 유닛을 혼합하여 PCR을 수행하여 최종 DNA 주형을 제작하였다.

실험예 1. 알로스테릭 앱타자임의 시험관 내 자가-절단 어세이

절단조각부위를 siRNA의 센스 뉴클레오티드로 치환한 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임의 특이성을 확인하기 위해, 실시예 2, 비교실시예 1, 비교실시예 2 및 비교실시예 3에서 제작한 NS5B 의존 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임, 활성 교류 모듈 포함 앱타자임, 비활성 교류 모듈 포함 앱타자임, 절단반응이 일어나지 않도록 단일염기를 치환한 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임, 그리고 앱타머가 없는 해머헤드 리보자임을 이용하여 시험관 내 자가-절단을 수행하였다. 앱타자임(해머헤드 리보자임) RNA : NS5B 단백질의 비율은 1 : 2로 하였다.

우선 30 pmole의 앱타자임을 95℃에서 2분 동안 변성시킨 후 37℃에서 15분간 구조를 재형성시켰다. 2X완충용액(60mM Tris(pH7.5), 300mM NaCl, 20mM MgCl₂, 4mM DTT)에 60 pmole의 NS5B 단백질, 100 U RNase 저해제(Koschem)를 혼합한 후, 상기 앱타자임과 혼합하여 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 반응이 완료된 RNA는 페놀 추출(pH7.0), 에탄올 침전반응을 시켰다. 그 후, RNA 로딩 염료를 섞은 후 95℃에서 2분 동안 구조를 변성시키고, 7M 우레아-9% 폴리아크릴아미드 젤에서 180V로 1시간동안 전기영동시킨 후, EtBr로 염색하여 UV(Alpha image analyzer)로 자가-절단이 일어난 앱타자임을 확인하였다.

우선, 앱타머가 없는 리보자임이 NS5B 단백질 비의존적 절단 능력을 가짐을 확인하였다.(도 4). 구체적으로, 완충용액(PBS), 비특이적 단백질인 BSA, 특이적 단백질인 NS5B를 넣어준 것들 사이에 절단 능력 변화가 없음을 확인하였다.

알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임의 교류 모듈을 통한 리보자임 활성 조절여부를 확인하기 위하여, 실시예 2, 비교실시예 1, 비교실시예 2에서 제작한 NS5B 의존 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 활성 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 비활성 교류 모듈 포함 앱타자임을 NS5B 단백질과 반응시켰다(도 5). 그 결과, 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임은 NS5B 의존적 절단이 일어나며, NS5B 비의존적 활성 교류 모듈 포함 앱타자임은 NS5B 비의존적 절단이 일어나는 것을 확인하였다. 반면에 NS5B 비의존적 비활성 교류 모듈 포함 앱타자임은 NS5B 단백질 유무에 관계없이 절단이 일어나지 않음을 확인하였다. 앱타머의 NS5B 단백질에 대한 특이성을 검증하기 위하여 대조군으로 비특이 단백질인 BSA를 사용하였다. 또한 위와 같은 알로스테릭 절단능력이 리보자임의 구조적 변이에 의한 것임을 확인하기 위해 Mg²⁺ 이온의 존재 여부에 따른 절단 여부를 확인하였다. 또한 이러한 절단이 NS5B 단백질 존재 시에만 매우 빠르게 일어남을 확인하였다(도 6).

한편, 절단조각부위를 siRNA의 센스 뉴클레오티드로 치환한 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임에 대하여 MgCl₂ 농도 의존적 절단능력(도 7a, b) 및 시간 의존적 절단능력(도 7c, d)을 확인하였다. 대조군으로는 절단반응이 일어나지 않도록 활성부위의 단일염기를 치환한 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임(비교 실시예 3)을 사용하였다.

실험예 2. 앱타자임의 절단부위 확인

상기 절단된 앱타자임의 절단부위를 확인하기 위해, 3'-RACE(3'-Rapid Amplification of cDNA ends)를 수행하였다. 구체적으로, 시험관 내 자가-절단 어세이를 수행한 1㎍의 RNA를 T4 RNA 리가아제(NEB)를 이용하여 3'-어댑터 (5'-Pos/rUrUrU AACCGCGAATTCCAG /3InvdT)와 1시간 동안 연결(ligation)시켰으며, 65℃에서 15분 동안 비활성화시켰다. 상기 어댑터를 연결한 RNA를 특이적 프라이머(서열번호 36: 5'-CTGGAATTCGCGGTT-3')를 이용하여 역전사 시킨 후, 알로스테릭 앱타자임의 경우 프라이머 세트 (정방향: ACGCGTCGACGATCATCCCTGATGAGCCTCTC(서열번호 37), 역방향 : AACCGCGAATTCCAG(서열번호 38))를 이용하여, 활성 앱타자입의 경우 프라이머 세트 (정방향: ACGCGTCGACGGATCATCCCTGATGAGCAACC (서열번호 39), 역방향 : AACCGCGAATTCCAG (서열번호 38))를 이용하여 PCR을 수행하여 T-벡터(Promega)에 클로닝한 후 서열분석하였다.

도 8에서 확인할 수 있는 바와 같이, 앱타자임의 절단된 조각이 siRNA의 센스 또는 안티센스 단일가닥으로서 역할을 할 수 있음을 확인하였다.

실험예 3. 세포내 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임의 선택적 절단확인

세포내 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임의 NS5B 단백질 의존적 절단반응을 확인하기 위해 U6+1 벡터에 실시예 2, 비교실시예 1, 비교실시예 2에서 제작한 NS5B 의존 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 활성 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 비활성 교류 모듈 포함 앱타자임, 그리고 앱타머가 없는 해머헤드 리보자임을 클로닝한 발현벡터를 간암세포주인 Huh-7세포(ATCC) 및 NS5B 단백질을 발현하는 neo-replicon 세포에 각각 형질전환하였다. neo-replicon 세포는 Huh-7 세포에 HCV 레플리콘 RNA를 형질전환시킨 것이다. 24시간 후에 총 RNA를 페놀 추출(pH7.0), 에탄올 침전반응을 시켰다. 그 후, RNA 로딩 염료를 섞은 후 95℃에서 2분 동안 구조를 변성시키고, 7M 우레아-9% 폴리아크릴아미드 젤에서 180V로 1시간동안 전기영동 하였다. 전기영동 후 0.25X TBE 완충용액에서 200mA로 4℃에서 1시간동안 아크릴아미드 젤에 있는 RNA들을 니트로셀룰로오스 막으로 옮기고, UV 교차결합으로 RNA를 니트로셀룰로오스 막에 고정하였다. 그 후 5' 말단에 비오틴이 결합되어 있는 3' 프라이머 (서열번호 40)(5'-비오틴-AATGAGTCATCAG TCATCCTCATCCTGG-3')를 이용하여 Brightstar BioDetect^TM detection kit (Ambion)의 실험방법에 따라 RNA를 확인하였다.

루시퍼라제 리포터 어세이를 수행한 결과, 앱타머와 교류모듈이 없는 해머헤드 리보자임을 사용한 경우, 어떠한 표적 특이적 간섭현상을 확인할 수 없었고(도 9), 이는 세포내에서 리보자임의 절단이 일어나지 않음으로 인한 것임을 노던 블로팅을 이용하여 확인하였다(도 10). 반면, NS5B 의존 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임, NS5B 비의존적 활성 교류 모듈 포함 앱타자임의 경우는 세포 내에서 표적 단백질인 NS5B 의존적인 알로스테릭 자가-절단 또는 NS5B 비의존적 자가-절단이 일어남을 RNA 수준에서 노던 블로팅을 이용하여 확인하였다(도 11).

실험예 4. 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임에 의한 세포내 선택적 HCV 단백질 감소 확인

형질전환 전날에 세포를 미리 준비하여 세포가 60% 차도록 준비한 뒤에 절단조각부위를 NS5B 센스 뉴클레오티드로 치환한 앱타자임을 U6+1에 클로닝한 발현벡터 500ng, 절단조각부위를 NS5B 안티센스 뉴클레오티드로 치환한 앱타자임을 U6+1에 클로닝한 발현벡터 500ng, 및 Mirus-LT1 시약을 4㎕ 혼합한 후 튜브를 상온에서 30분 동안 반응시키고 세포에 덮었다. 24시간 후 DEMRI-C 시약 2μl와 반딧불 루시퍼라제-레플리콘 RNA 및 레닐라(Renilla) 루시퍼라제 RNA를 혼합하여 세포에 형질전환시킨 후 4시간 후에 배지를 교체하였다. 그 후 24시간 후에 형질전환시킨 각각의 세포의 배지를 제거하고 1X PBS로 세척하였다. 여기에 1X수동 세포 용해 버퍼(passive lysis buffer)를 200㎕ 넣고 상온에서 15분간 세포 용해시킨 후 세포를 수확하여 13000rpm으로 2분간 원심분리하여 상층액만을 새 튜브에 옮겨 담았다. 튜브에 LARII(Luciferase assay reagent II)를 100㎕ 넣고 여기에 세포 용해물 20㎕를 넣어 혼합한 후 루미노미터(Luminometer)로 읽었다. 다시 여기에 Stop & Glo 시약 혼합물 (Stop&Glo 20㎕+Stop&Glo 버퍼 1㎖)를 100㎕ 넣고 혼합한 후 루미노미터(TD+ 20/20)로 읽었다. 지연시간(Delay time)은 5초, integrate 시간은 10초로 하였다.

그 결과, 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임이 HCV NS5B 단백질을 발현하는 neo-replicon 세포 특이적으로 유전자 간섭현상을 일으킴을 확인하였다(도 12). 활성 교류 모듈 포함 앱타자임을 이용한 경우, HCV NS5B 단백질을 발현하지 않는 간암세포주인 Huh-7 세포 및 HCV NS5B 단백질을 발현하는 neo-replicon 세포에서 유전자 간섭현상의 차이가 관찰되지 않았다(도 12). 도 12의 neo-replicon 세포는 Huh-7 세포에 HCV 레플리콘 RNA를 일시적으로 형질전환시켜 NS5B 양이 한정적으로 발현되게 한 것이다.

도 13은 NS5B를 안정적으로 과량 발현하는 Huh-7 세포 시스템에서의 특이적 유전자 간섭현상 확인 결과를 나타낸다. NS5B 단백질을 안정적으로 발현하는 Huh-7 간암 세포주(B)와 NS5B 단백질을 발현하지 않는 Huh-7 간암세포(C)를 비교하여, 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임이 NS5B 단백질을 안정적으로 발현하는 Huh-7 간암 세포주 특이적으로 유전자 간섭현상을 일으킴을 확인하였다.

도 14는 Huh-7 세포에 HCV replicon RNA를 안정적으로 복제되는 상태로 만들거나 또는 여러 번 주입을 하여 NS5B의 양을 보다 증가시킨 경우, siRNA 센스 가닥 방출 앱타자임과 siRNA 안티센스 가닥 방출 앱타자임을 이용한 NS5B 발현세포 특이적 유전자 간섭 현상을 나타낸 것이다. NS5B 단백질을 안정적으로 발현하는 Huh-7 간암세포주(neo-replicon이 안정적으로 복제되고 있는 세포)(A)에서 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임과 활성 교류 모듈 포함 앱타자임에 의한 유전자 간섭 현상을 확인하였고, NS5B 단백질을 발현하지 않는 Huh-7 간암세포(B)에서는 활성 교류 모듈 포함 앱타자임에 의한 유전자 간섭 현상만을 확인하였다. 리포터 유전자 자체도 NS5B 단백질을 발현하기 때문에 Huh-7 세포(B)에서도 알로스테릭 교류 모듈 포함 앱타자임에 의한 유전자 간섭현상이 약간 발생하였다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 12의 제1앱타자임 및 서열번호 13의 제2앱타자임을 포함하는 RNA 간섭(RNAi)용 조성물로서,
상기 제1앱타자임은 제1앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제1해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제1교류모듈(comminication module), 및 제1해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고,
상기 제2앱타자임은 제2앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제2해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제2교류모듈(comminication module), 및 제2해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고,
상기 앱타머 RNA에 표적 물질이 결합하면 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되며,
상기 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되면 상기 표적 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자에 대한 센스 뉴클레오티드 서열이 앱타자임으로부터 방출되는, RNA 간섭(RNAi)용 조성물.
NS5B에 대한 앱타머와 NS5B에 대한 siRNA와 연결된 해머헤드 리보자임이 교류모듈로 연결된 앱타자임을 코딩하는, 서열번호 26 및 27의 DNA를 포함하는 RNA 간섭용 발현벡터 조성물.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 방출된 표적 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자에 대한 센스 뉴클레오티드 서열은 상보적 결합하여 이중가닥 siRNA를 형성하는 것인, 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 C형 간염 바이러스 감염된 세포에 존재하는 표적 물질에 결합함으로써 C형 간염 바이러스 감염된 세포에서 특이적으로 RNA 간섭을 일으키는 것인, 조성물.
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제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 표적 물질과 특이적으로 결합하여 상기 표적 물질의 기능을 억제함과 동시에 표적 유전자의 발현을 억제하는 활성을 가지는, 조성물.
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서열번호 12의 제1앱타자임을 코딩하는 DNA를 포함하는 제1발현 벡터, 및 서열번호 13의 제2앱타자임을 코딩하는 DNA를 포함하는 제2발현 벡터를 포함하는 RNA 간섭(RNAi)용 조성물로서,
상기 제1앱타자임은 제1앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제1해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제1교류모듈(comminication module), 및 제1해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고,
상기 제2앱타자임은 제2앱타머 RNA, 자가-절단 가능한 제2해머헤드 리보자임 RNA, 상기 앱타머 RNA와 해머헤드 리보자임 RNA를 연결하는 제2교류모듈(comminication module), 및 제2해머헤드 리보자임 RNA의 일 말단에 연결된, 표적 유전자의 일부 또는 전부에 대한 센스 뉴클레오티드 서열 함유 부위를 포함하고,
상기 앱타머 RNA에 표적 물질이 결합하면 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되며,
상기 해머헤드 리보자임 RNA의 자가-절단이 유도되면 상기 표적 유전자에 대한 안티센스 뉴클레오티드 서열 및 표적 유전자에 대한 센스 뉴클레오티드 서열이 앱타자임으로부터 방출되는, RNA 간섭(RNAi)용 조성물.
제1항, 제2항 또는 제22항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는 HCV 관련 질환 치료용 약학적 조성물.
제23항에 있어서, 상기 HCV 관련 질환은 간염, 간섬유화, 간경화 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 질환인, 약학적 조성물.