KR101218470B1

KR101218470B1 - Ｈｃｖ 감염 세포에서 특이적으로 마이크로 ｒｎａ에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임 및 이를 이용한 ｈｃｖ 관련 질환 치료용 조성물

Info

Publication number: KR101218470B1
Application number: KR1020100091145A
Authority: KR
Inventors: 이성욱; 이창호
Original assignee: 단국대학교 산학협력단
Priority date: 2010-09-16
Filing date: 2010-09-16
Publication date: 2013-01-04
Also published as: US20130245094A1; WO2012036507A3; US9284555B2; KR20120029197A; WO2012036507A2

Abstract

본 발명은 HCV RNA에 의해 코딩된 물질에 대한 엡타머, 자가-절단에 의해 방출되는 부위에 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 포함하는 해머헤드 리보자임 및 상기 엡타머에 상기 HCV RNA에 코딩된 물질이 결합되면 해머헤드 리보자임의 자가-절단을 유도하는 교류모듈을 포함하는 엡타자임에 관한 것으로서, HCV가 증식하는 세포에서만 특이적으로 마이크로 RNA의 활성을 억제하는 효과를 나타내므로 상기 엡타자임을 포함하는 본 발명에 따른 조성물은 HCV 관련 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

ＨＣＶ 감염 세포에서 특이적으로 마이크로 ＲＮＡ에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임 및 이를 이용한 ＨＣＶ 관련 질환 치료용 조성물{Aptazyme specifically releasing antisense against miRNA in HCV infected cell and Composition for treating HCV related diseases using the same}

본 발명은 HCV 감염 세포에서 특이적으로 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임 및 이를 이용한 HCV 관련 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

C형 간염 바이러스(Hepatitis C virus : HCV)는 Flaviviridae 속에 속하는 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로, non-A, non-B 간염을 일으키고(Kuo, G., et al., 1989, Science 244, 362-364), 만성으로 진행되면 간경화나 간암으로 발전되어 치사율이 매우 높은 것으로 알려져 있다(Saito, I., et al., 1990, Proc. Natl Acad. Sci. USA 87, 6547-6549). 전 세계 인구의 1~2%가 이 바이러스에 감염되어 있지만, 바이러스는 매우 낮은 역가(titer)로 생체 내에 존재하고 있기 때문에 진단하기가 매우 힘들고, HCV 바이러스에 대한 효과적인 치료제나 백신이 없는 상태이다.

현재 HCV 증식을 억제하여 HCV로 인한 질병에 어느 정도 효과를 보이는 α-인터페론을 이용하는 방법과 리바비린(ribavirin)을 동시에 투여하는 방법이 있지만, 이 방법은 바이러스의 균주마다 그 효과가 다르게 보고되어 있으며, 단지 50%의 HCV 감염 환자에서만 지속적인 효과가 있는 것으로 알려져 있다(Bartenschlager R, Frese M, Pietschmann T. Novel insights into hepatitis C virus replication and persistence. Adv Virus Res 2004, 63, 71-180).

특히, 바이러스의 구성분자를 타켓으로 하는 치료의 경우, 회피 돌연변이(escape mutant)가 발생하기 때문에, 최근에는 숙주세포의 구성분자를 타켓으로 하는 치료가 주목받고 있다.

마이크로 RNA는 일반적으로 표적 mRNA의 번역을 저하 또는 억제를 통해서, 서열-특이적 방법으로 세포의 유전자 발현을 억제하는 내인성의 작은 비-코딩 RNA이다(Chekulaeva M, Filipowicz W. Mechanisms of miRNA-mediated post-transaltional regulation in animal cells. Curr Opin Cell Biol 2009, 21, 452-460). 마이크로 RNA 중 마이크로 RNA 122는 간에서 가장 풍부한 마이크로 RNA이며(Chang J,, et al., miR-122, a mammalian liver-specific microRNA, is processed from hcr mRNA and may downregulate the high affinity cationic amino acid transporter. RNA Biol 2004, 1, 106-113), 바이러스 게놈의 5' UTR(untranslate region)과 상호작용함으로써 HCV의 복제를 촉진시키는 것으로 알려져 있다(Jopling CL,, et al., Modulation of hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific microRNA. Science 2005, 309, 1577-1581 ; Henke JI,, et al., microRNA-122 stimulates translation of hepatitis C virus RNA. EMBO J 2008, 27, 3300-3310 등).

최근에, 침팬지를 대상으로 한 실험에서 마이크로 RNA 122에 대한 안티센스 올리고 뉴클리오티드 처리시, HCV 증식을 억제시킬 수 있다는 사실이 발견되었다(Lanford RE,, et al,, Therapeutic silencing of microRNA-122 in primates with chronic hepatitis C virus infection. Science 2010, 327, 198-201).

그러나, 마이크로 RNA는 지질물질대사를 포함하여 세포의 생리적인 기능과 관련되는 많은 수의 유전자 발현을 조절하는데 있어 중요한 역할을 하기 때문에(Krㆌtzfeldt J,, et al,, Silencing of microRNAs in vivo with 'anagomir'. Nature 2005, 438, 685-689), 모든 세포에서 비특이적으로 마이크로 RNA 122를 억제시킨다면 세포의 생리적인 활성에 중요한 역할을 하는 유전자 변형으로 인한 부작용을 초래하게 된다.

따라서, 정상 간세포에서의 마이크로 RNA 122의 활성은 저해하지 않고, HCV가 증식하는 세포에서만 특이적으로 마이크로 RNA 122의 활성을 억제할 수 있는 기술이 요구된다.

이에, 본 발명자들은 HCV가 증식하는 세포에서만 특이적으로 마이크로 RNA의 활성을 억제할 수 있도록 HCV RNA에 의해 코딩된 물질에 특이적으로 유도 되어 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임을 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 HCV 감염 세포에서만 특이적으로 HCV RNA에 의해 코딩된 물질에 결합하여 그 기능을 억제함과 동시에 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출하여 마이크로 RNA의 활성을 억제시키는 엡타자임을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 HCV 감염 세포에서만 특이적으로 HCV RNA에 의해 코딩된 물질에 결합하여 그 기능을 억제함과 동시에 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출하여 마이크로 RNA의 활성을 억제시키는 엡타자임을 포함하는 HCV 관련 질환 치료용 조성물 및 이를 이용한 치료방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 HCV 감염 세포에서만 특이적으로 HCV RNA에 의해 코딩된 물질에 결합하여 그 기능을 억제함과 동시에 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위한 본 발명은 하나의 양태로서, i) HCV RNA에 의해 코딩된 물질에 대한 엡타머 ii) 자가-절단에 의해 방출되는 부위에 마이크로 RNA에 대한 안티센스(antisense)를 포함하는 해머헤드 리보자임 및 iii) 상기 엡타머에 상기 HCV RNA에 의해 코딩된 물질이 결합되면 해머헤드 리보자임의 자가-절단을 유도하는 교류모듈(commun ication module)을 포함하는 HCV 감염 세포에서 특이적으로 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임을 제공한다.

HCV의 게놈인 RNA는 번역(translation)에 의해 약 3000개의 아미노산으로 이루어진 하나의 복합단백질이 생성되고, 이후 숙주와 바이러스의 프로테이즈에 의해 C, E1, E2 등의 구조 단백질과 NS2, NS3, NS4, NS4A, NS4B, NS5, NS5A 및 NS5B와 같은 비구조 단백질로 나누어진다. 상기 HCV 비구조 단백질 중 NS5B는 RNA 의존적인 RNA 중합효소로서, 세포내에서 HCV가 증식하고 있음을 나타내는 HCV 증식의 주요인자이다.

본 발명에서 용어 "HCV RNA에 의해 코딩된 물질"은 상기 HCV의 구조 및 비구조 단백질과 같이, 세포내에서 HCV가 증식하고 있음을 나타내는 단백질, 펩타이드를 의미한다.

또한, 본 발명에서 용어 "엡타자임"은 알로스테릭 리보자임과 혼용하여 사용할 수 있고, 마이크로 RNA는 miRNA, mir와 혼용하여 사용할 수 있으며, 마이크로 RNA에 대한 안티센스는 antimir와 혼용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 HCV RNA에 의해 코딩된 물질에 대한 엡타머는 상기 C, E1, E2 등의 구조 단백질과 NS2, NS3, NS4, NS4A, NS4B, NS5 및 NS5A와 같은 비구조 단백질 중 어느 하나의 단백질과 높은 결합력으로 결합하여 그 기능을 저해하는 물질로서, 바람직하게는 HCV NS5B 단백질에 특이적으로 결합하는 엡타머일 수 있다.

본 발명의 NS5B에 대한 엡타머는 SELEX 방법(Systematic Evolution of Ligands of Exponential enrichment, 시험관 내 선별방법)을 이용하여 본 발명자들이 발굴한 분자로서, 하기 서열을 포함한다.

1. 엡타머 RNA 서열 (서열번호 1)

GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCACAUUGUGAGGGGCUCAGGUGGAUCGCAUGGCCGUGUCCAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCU

2. 엡타머 RNA 서열 (서열번호 2)

GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCUCGAUAAAAGGGGCCUGGGAUUGAAUCGCAUGGCCGUGUCCAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCU

3. 엡타머 RNA 서열 (서열번호 3)

GGGAGAGCGGAAGCGUGCUGGGCCUCGGCUAGGGGGUCUGGGCGAAUCGCAUUGCCGUGCAUCAUAACCCAGAGGUCGAUGGAUCCU

4. 엡타머 RNA 서열 (서열번호 4)

CGCGCAAUAUUGUGAGGGGCGCA

본 발명은 해머헤드 리보자임에 HCV RNA에 의해 코딩된 단백질에 특이적으로 결합하는 엡타머(aptamer)를 알로스테릭한 방식으로 해머헤드 리보자임의 활성을 변화시킬 수 있는 교류모듈을 통해 결합한 엡타자임을 제공함으로써, HCV가 증식하는 세포에서만 특이적으로 해머헤드 리보자임의 자가-절단 활성을 유도할 수 있다. 나아가, HCV가 증식하는 세포에서만 자가-절단된 리보자임이 HCV 증식에 필요한 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출함으로써 HCV 증식을 효과적이며, 특이적으로 억제할 수 있다.

상기 해머헤드 리보자임은 자가-절단되어 방출되는 부분의 서열이 마이크로 RNA에 대한 안티센스로 대체되어 있으며, 마이크로 RNA 122에 대한 안티센스로 대체되는 것이 바람직하다. 따라서, 본 발명의 해머헤드 리보자임은 HCV가 증식하는 세포에서만 자가-절단 되어 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출함으로써 마이크로 RNA의 활성을 억제할 수 있고 궁극적으로 HCV의 증식을 억제시킬 수 있다.

본 발명의 해머헤드 리보자임은 하기 RNA 서열을 포함하지만, 이에 한정되지 않고, 도 1의 서열구조를 가질 수 있다. 도 1은 해머헤드 리보자임의 공통의(consensus) 염기서열 및 구조를 나타내며, 도 1의 ● 표시는 A, U, C 또는 G를 나타내고, R은 퓨린(purine), Y는 피리미딘(pyrimidine), h는 A, U 또는 C를 나타낸다.

하기 서열 중 밑줄 친 부분은 마이크로 RNA 122에 대한 안티센스 서열로 대체된 부분을 나타내고 N은 A, C, G, U 중 임의의 뉴클레오티드를 나타낸다.

한편, 마이크로 RNA에 대한 안티센스 서열은 해머헤드 리보자임의 촉매 코어 부위(서열번호 5 및 6의 이탤릭체 부분) 이외의 부분으로 삽입되는 것이 바람직하다. 또한, 촉매 코어 부위인 도 1의 공통의 염기서열 이외의 부분으로 삽입되는 것이 바람직하다.

1. 해머헤드 리보자임의 RNA 서열 (서열번호 5)

NNNNNNCUGANGARNCNNNNNNGNYGAAACNNNNNNNhhNNNNNN

2. 해머헤드 리보자임의 RNA 서열 (서열번호 6)

GGGAAUGGUGCUGAUGAGNCNNNNNNGNCGAAUUAUUUGGGAAACCAAACAAACACCAUUGUCACACUCCA

본 발명의 해머헤드 리보자임의 자가-절단에 의해 방출되는 마이크로 RNA 122에 대한 안티센스는 하기 서열을 포함한다.

마이크로 RNA 122에 대한 안티센스 (서열번호 7)

ACAAACACCAUUGUCACACUCCA

상기 교류모듈은 엡타머에 단백질이 결합하면 알로스테릭한 구조 변형에 의해 해머헤드 리보자임의 자가-절단을 활성화시키는 역할을 한다.

본 발명의 교류모듈은 시험관내 선별 방법을 통해 선별할 수 있다. 구체적으로는, 교류모듈을 NNNNN으로 두고 각각의 N에 A, T, C, G가 동수로 포함되는 랜덤 서열을 조합하여, i) NS5B 단백질에 대한 엡타머, ii) 해머헤드 리보자임 및 iii) 교류모듈을 포함하는 엡타자임 라이브러리를 제조한 다음, 엡타자임 라이브러리를 NS5B 단백질 이외의 단백질 및 NS5B 단백질과 접촉시켜, NS5B 단백질 존재하에서만 특이적으로 자가-절단을 보이는 RNA 풀을 수득하고, 수득된 RNA 풀의 교류모듈의 서열을 확인함으로써 확보할 수 있다. 이러한 방법으로 수득한 교류모듈은 본 발명에서 수득한 엡타자임에 따라 차이가 있었지만, 바람직하게는 5' 교류모듈 서열은 'CCTCT'이고, 3' 교류모듈 서열은 'CACAC', 'TCCAC' 또는 'TCACC'이다.

따라서, 본 발명의 교류 서열은 5' 교류모듈 서열로 CCUCU(서열번호 8)를 포함하고, 3' 교류모듈 서열로 CACAC(서열번호 9), UCCAC(서열번호 10) 또는 UCACC(서열번호 11)를 포함할 수 있다.

본 발명의 NS5B에 의존적으로 마이크로 RNA 122에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임은 하기의 RNA 서열을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 엡타자임은 도 1의 서열구조를 가지는 리보자임에 있어서, stem Ⅱ의 5'-NCNNNNNNGN-3' 부분이 5' 교류모듈 서열 - 엡타머 서열 - 3' 교류모듈 서열로 치환되는 서열을 가질 수 있다.

하기 서열에서 밑줄 친 부분이 교류모듈이고, 이탤릭체로 기재된 서열은 HCV NS5B에 대한 엡타머이며, 굵게 표시된 부분은 마이크로 RNA 122에 대한 안티센스 서열이다.

1. 엡타자임의 서열 (서열번호 12)

GGGAAUGGUGCUGAUGAGCCUCU CGCGCAAUAUUGUGAGGGGCGCA CACACCGAAUUAUUUGGGAAACCAAACAAACACCAUUGUCACACUCCA

2. 엡타자임의 서열 (서열번호 13)

GGGAAUGGUGCUGAUGAGCCUCU CGCGCAAUAUUGUGAGGGGCGCA CACACCGAAUUGUUUGGGAAACCAAACAAACACCAUUGUCACACUCCA

또 하나의 양태로서, i) HCV RNA에 의해 코딩된 물질에 대한 엡타머; ii) 자가-절단에 의해 방출되는 부위에 마이크로 RNA에 대한 안티센스(antisense)를 포함하는 해머헤드 리보자임; 및 iii) 상기 엡타머에 상기 HCV RNA에 의해 코딩된 물질이 결합되면 해머헤드 리보자임의 자가-절단을 유도하는 교류모듈(commun ication module)을 포함하는 HCV 관련 질환 치료용 조성물을 제공한다.

상기 HCV 관련 질환은 HCV에 의해 발생하는 질환으로서 간염, 간섬유화, 간경화 및 간암을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양상에 따르면, 상기 HCV 치료용 조성물을 HCV 보균자, HCV에 의한 간염, 간섬유화, 간경화 또는 간암이 발병한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 HCV 관련 질환의 치료방법이 제공된다.

본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 본 발명의 엡타자임은 엡타머가 HCV NS5B 단백질과 특이적으로 결합하여 NS5B의 기능을 억제시킴과 동시에 해머헤드 리보자임의 자가-절단이 유도되어 마이크로 RNA 122에 대한 안티센스를 방출함으로써, 오로지 HCV 감염 세포에서만 특이적으로 HCV의 증식을 억제하는 효과가 있다(실시예 4 참조). 따라서 본 발명의 엡타자임을 포함한 조성물은 HCV 관련 질환의 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "치료"란 조성물의 투여에 의해 HCV 관련 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미하고, 본 발명에서 용어 "개체"란 HCV 관련 질환이 발병한 인간을 포함한 모든 동물을 의미한다.

상기 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 간내투여, 직장내 투여될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 본 발명의 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 용어 "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 HCV 관련 질환의 치료를 위하여 단독으로, 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

또 하나의 양태로서, 본 발명은 HCV 감염 세포에서 특이적으로 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임의 제조방법을 제공한다.

상기 방법은 구체적으로, 1) 교류모듈에 5개의 랜덤 서열을 포함하는 서열번호 14 및 15의 프라이머 세트 (5' 프라이머: 5'-TTGGTGTCTGATGAGNN NNNCGCGCCATATTGTGAGGGGCGCG-3' 및 3' 프라이머: 5'-TACGTTTGGT TTCCCAAACGTTTCGNNNNNCGCGCCCCTCACAAT-3', N은 G, A, T, C가 동수로 포함됨) 및 taq polymerase를 첨가하여 PCR을 수행하는 단계, 2) 상기 PCR 산물에, 서열번호 16 및 17의 프라이머 세트(5' 프라이머: 5'-GGTAATACG ACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG-3' 및 3' 프라이머: 5'-TTTTTTTT TTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA-3')와 taq polymerase를 첨가하여 PCR 하는 단계, 3) 상기 PCR 산물을 T7 중합효소를 이용하여 시험관내에서 RNA로 전사하여 엡타자임 라이브러리를 제작하는 단계, 4) 상기 엡타자임 라이브러리를 NS5B 단백질 및 NS5B 단백질 이외의 단백질과 접촉시켜 NS5B 단백질 존재하에서만 특이적으로 자가-절단 되는 RNA 풀을 수득하고, 수득한 엡타자임 RNA 풀 각각을 RT-PCR하여 DNA를 수득하는 단계, 5) 상기 엡타자임 DNA에 서열번호 18 및 19의 프라이머 세트 (5' 프라이머: 5'-ACGCGTCGACGGGAATGGTGCTGATGAG 및 3' 프라이머: 5'-GCTCTAGATGGAGTGTGACAATGGTG)와 taq polymerase를 첨가하여 PCR 하는 단계 및 6) 상기 PCR 산물을 시험관내에서 RNA로 전사하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 방법에 의해 제조되는 엡타자임은 HCV NS5B의 존재시에만 자가-절단됨으로써 마이크로 RNA 122에 대한 안티센스를 방출할 수 있어, HCV 감염세포에 특이적으로 HCV의 증식을 억제할 수 있다.

본 발명에 의하면, 정상세포내의 마이크로 RNA의 활성은 억제하지 않고, 오로지 HCV가 감염된 세포에서만 특이적으로 마이크로 RNA 활성을 억제하는 효과를 나타내므로 HCV 관련 질환의 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 바이러스 단백질에 특이적으로 결합하는 부분을 통해 바이러스 단백질의 기능을 저해할 수 있고, 동시에 마이크로 RNA의 활성을 억제하여 효과적이며, 특이적으로 HCV 관련 질환을 치료할 수 있다.

도 1은 해머헤드 리보자임의 서열 및 구조를 보인 도면이다.
도 2는 pTK-RL-3×miR122T 리포터 구조체를 보인 도면이다.
도 3은 마이크로 RNA 전구체상에서 anti-miRNA의 다양한 표적 부위를 보인 도면이다. 박스 부분은 mature miRNA에 대한 표적 부위를 나타낸다.
도 4는 마이크로 RNA의 서로 다른 부분을 표적하는 anti-miRNA의 마이크로 RNA 활성 억제 양상을 보인 그래프이다. anti-Dicer star(1 lane), anti-miRNA Dicer(2 lane), anti-Drosha star(3 lane), anti-miRNA Drosha(4 lane), anti-mature miRNA(5 lane)
도 5는 NS5B 의존적 엡타자임의 모식도이다.
도 6은 선별된 NS5B 의존적 엡타자임의 서열을 보인 도면이다. 25개의 클론 중 서열이 서로 다른 22개의 클론의 서열을 도시하였다. 괄호안의 숫자는 중복하여 발견된 클론의 수이다.
도 7은 선별된 엡타자임이 NS5B 존재시에만 자가-절단됨을 보인 사진이다.
도 8은 antimir-122 NDAR 및 antimir-17-5p NDAR의 서열 및 예상되는 2차 구조를 보인 도면이다.
도 9는 antimir-122 NDAR 및 antimir-17-5p NDAR이 NS5B 존재시에만 자가-절단 되는 것을 보인 사진이다. 화살표는 잘려진 산물을 나타낸다.
도 10 및 도 11은 antimir-122 NDAR이 오로지 HCV가 증식하는 세포에서만 특이적으로 마이크로 RNA 122의 활성을 억제하는 것을 보인 그래프이다.
도 12는 변형된 antimir-122 NDAR의 모식도와 NS5B 존재시에만 특이적으로 자가-절단됨을 보인 사진이다.
도 13은 antimir-122 NDAR의 NS5B 의존적으로 마이크로 RNA 122에 대한 안티센스를 방출함으로써 마이크로 RNA 122 활성을 억제하는 과정을 보인 모식도이다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 세포배양

HCV 유전자형 1b 아게놈 레플리콘(subgenomic replicon)인 pFK-I389neo/NS3-3'/5.1은 Dr. R. Bartenschlager(Univ. of Heidelberg, Germany)로부터 제공받았다. HCV 레플리콘 RNA는 AseI 및 ScaI로 처리한 레플리콘 플라스미드를 인 비트로상에서 RNA로 전사시켜 합성하였다(Hwang B,, et al,, Isolation of specific and high-affinity RNA aptamers against NS3 helicase domain of hepatitis C virus. RNA, 2004, 10, 1277-1290 등). Huh-7 인간 간암 세포주(hepatoma cell line)는 ATCC로부터 구입했고, 10% FBS의 DMEM(Invitrogen)에서 배양하였다. 950 μF 및 250 V의 상태에서 Gene pulser 시스템(Bio-Rad)을 사용해서 Huh-7 세포에 HCV 레플리콘 RNA를 전기천공법으로 트렌스펙션 시켰으며, HCV 레플리콘 세포주(stable HCV replicon cell line)를 분리하기 위해 G418(Invitrogen, 500 μg/ml)과 함께 배양하였다.

실시예 2. Anti - miRNA 122 발현벡터의 miRNA 122 활성 억제 양상의 평가

2-1. Anti-miRNA 활성을 평가하기 위한 리포터 구조체

miR-122가 발현되는 Huh-7 세포 및 HCV 레플리콘 Huh-7 세포에서 발현이 조절저하(down-regulation) 되는 리포터 구조체(reporter construct)를 하기 방법에 따라, 3 카피의 마이크로 RNA 122(5'-CAAACACCATTGTCACACTCCA)의 표적 서열(target sequence)을 HSVtk 프로모터 아래에 레닐라 루시퍼라제(Renillar luciferase)를 코딩하는 pTK-RL벡터의 3'-UTR로 삽입하여 만들었다(도 2 참조).

먼저, 프라이머(5'-CCGCTCGAGACAAACACCATTGTCACACTCCACCGGACAAACACCATTGTCA CACTC; 5'-CACTAGTTGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTCCGGTGGAGTGTGACAATGGTGTTTG)를 가지고 PCR을 수행하였고, 증폭된 DNA를 pTK-RL벡터의 XhoI 및 SpeI 위치로 클로닝 하였다(이하, pTK-RL-3×miR122T라 한다.).

대조군으로, miRNA(MCS)의 표적 서열이 없는 리포터 구조체 및 miR-17-5p 또는 let-7a의 3 카피의 표적 서열을 가지는 리포터 구조체를 만들었다(각각, pTK-RL-3×miR-17-5p, pTK-RL-3×miRlet-7aT라 한다.). CMV 프로모터-주도의 반딧불이 루시퍼라제 유전자 구조체는 내부적 대조군으로 사용되었다(이하, pCMV-F. luci라 한다.).

2-2. Anti-miRNA를 코딩하는 발현벡터의 구축

miR-122와 miR-17-5p의 다양한 부위를 표적으로 하는 안티센스 서열을 코딩하는 발현 벡터를 구성하기 위해, 하기의 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 합성하고(Bioneer, Korea), 혼성화하여, Dr. D.R. Engelke(Univ. of Michigan)로부터 얻은 U6+1 snRNA 프로모터-주도의 발현 카세트(expression cassettes) 또는 7SL RNA 프로모터-주도의 발현 카세트의 SalI 및 XbaI 위치로 클로닝 하였다. 각 표적 부위는 도 3에 도시하였다.

<Anti-miRNA 122>

(1) anti-Dicer star [다이서 수행 부위(processing site)와 miRNA passenger strand 부분을 표적]

5'-TCGACTGATAATGGCGTTTGATAGTTTAGAT (센스)

5'-CTAGATCTAAACTATCAAACGCCATTATCAG (안티센스)

(2) anti-miRNA Dicer (다이서 수행 부위와 mature miRNA 부분을 표적)

5'-TCGACTTTGATAGTTTAGACACAAACACCATT (센스)

5'-CTAGAATGGTGTTTGTGTCTAAACTATCAAAG (안티센스)

(3) anti-Drosha star (드로샤 수행 부위와 miRNA passenger strand 부분을 표적)

5'-TCGACCCTAGCAGTAGCTATTTAGTGTGAT (센스)

5'-CTAGATCACACTAAATAGCTACTGCTAGGG(안테센스)

(4) anti-miRNA Drosha (드로샤 수행 부위와 mature miRNA 부분을 표적)

5'-TCGACTGTCACACTCCACAGCTCTGCTAT (센스)

5'-CTAGATAGCAGAGCTGTGGAGTGTGACAG (안티센스)

(5) anti-mature miRNA (mature miRNA를 표적)

5'-TCGACACAAACACCATTGTCACACTCCAT (센스)

5'-CTAGATGGAGTGTGACAATGGTGTTTGTG(안티센스)

<Anti-miRNA 17-5p>

(1) anti-miRNA Drosha (드로샤 수행 부위와 mature miRNA 부분을 표적)

5'-TCGACGTAAGCACTTTGACATTATTCTGAT (센스)

5'-CTAGATCAGAATAATGTCAAAGTGCTTACG (안테센스)

(2) anti-mature miRNA (mature miRNA를 표적)

5'-TCGACACTACCTGCACTGTAAGCACTTTGT (센스)

5'-CTAGACAAAGTGCTTACAGTGCAGGTAGTG (안티센스)

2-3. Anti-miRNA 리포터 에세이

anti-miRNA 발현벡터의 anti-miRNA 활성을 평가하기 위해서, pCMV-F.luci 25ng 및 pTK-RL-3×miR122T 100 ng, pCMV-F.luci 25ng 및 pTK-RL-3×miR-17-5pT 100 ng을 각각 7SL 또는 U6+1 기반의 anti-miRNA 발현벡터 400 ng와 함께 Huh-7 세포 및 HCV 레플리콘 Huh-7 세포에 트렌스펙션 시켰다. 트렌스펙션 24시간 후, 세포를 수득하여 용해하였고, luminometer TD-20/20(Turner Designs Instrument) 및 dual-luciferase 리포터 분석 시스템(Promega)을 사용하여 상대적으로 밝은 유닛을 측정함으로써 리포터 유전자 발현 활성을 살펴보았다.

도 4를 참조하면, pTK-RL-3×miR122T 리포터 구조체와 anti-Dicer star(1 lane), anti-miRNA Dicer(2 lane) 또는 anti-Drosha star(3 lane)를 코딩하는 발현 벡터와 함께 트렌스펙션 시켰을 때, pTK-RL-3×miR122T 리포터 구조체의 활성에 어떠한 변화도 관찰되지 않았으나, anti-miRNA Drosha(4 lane), anti-mature miRNA(5 lane) 발현 벡터와 함께 트렌스펙션 시킨 경우에는 Huh-7 세포 및 HCV 레플리콘 Huh-7 세포 모두에서 리포터 활성이 유도되었다. 이는 HCV의 증식과 무관하게 비특이적으로 miRNA 122의 활성을 억제시킴을 나타낸다.

또한, pTK-RL-3×miR-17-5p 리포터 구조체와 각각의 antimiR-122 발현 벡터와 함께 트렌스펙션 시킨 경우에는 리포터 구조체의 활성이 유도되지 않았다. 이는 antimir-122 발현 벡터에 의한 리포터 구조체 활성의 유도가 특이적으로 miR-122를 표적으로 하는 것에 기인하는 것을 나타내며, 이러한 결과는 mature miR-122의 전부 또는 시드(seed) 서열을 표적으로 하는 안티센스 서열의 세포내 발현이 효과적이며 특이적으로 miR-122의 활성을 억제할 수 있다는 것을 나타낸다.

실시예 3. NS5B 의존적 엡타자임의 선별

3-1. NS5B 의존적 엡타자임 라이브러리 제작

도 5에 도시된 NS5B-의존적인 엡타자임을 구성하기 위해, NS5B 엡타머, 리보자임 촉매 코어 부위 및 무작위의 10 mer로 구성된 교류모듈(communication module)로 구성된 리보자임 라이브러리를 사용하여 시험관내 선별을 수행하였다.

리보자임 라이브러리 RNA는 교류모듈에 5개의 랜덤서열을 포함하는 하기의 프라이머 세트를 가지고 연속적으로 두 번 증폭시킨 DNA를 주형으로 인 비트로상에서 RNA로 전사시켜 만들었다. 이때, N에는 A, C, G, T가 동수로 포함되게 하였다.

<첫 번째 프라이머 세트>

5' 프라이머 : 5'-TTGGTGTCTGATGAGNNNNNCGCGCCATATTGTGAGGGGCGCG,

3' 프라이머 : 5'-TACGTTTGGTTTCCCAAACGTTTCGNNNNNCGCGCCCCTCACAAT,

<두 번째 프라이머 세트>

5' 프라이머 : 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG

3' 프라이머 : 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA

3-2. NS5B 의존적 엡타자임 라이브러리의 선별

NS5B 단백질에 특이적으로 리보자임 활성을 유도할 수 있는 가장 적당한 교류모듈의 서열을 확인하기 위해서, 하기 방법에 따라 비특이적으로 자가-절단되는 RNA pool을 제거하였다. 리보자임 라이브러리를 37℃에서 6시간 동안 리보자임 반응 버퍼(20 mM Tris-HCl (pH 7.5), 300 mM NaCl, 4 mM DTT, 10 mM MgCl₂) 및 BSA(bovin serum albumin)를 함께 넣고 반응시킨 후에, 반응물을 7 M 유레아-10% 폴리아크릴아미드 겔에서 전기영동하고, EtBr 염색을 통해 절단되지 않은 RNA를 확인하였다.

그 후, 상기 절단되지 않은 RNA pool을 oligodT 프라이머5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG를 사용하여 역전사 시키고, 역전사된 cDNA는 하기의 프라이머로 증폭하였다.

5' 프라이머 : 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG

3' 프라이머 : 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA

그 후, 상기 cDNA를 RNA로 전사시켜 엡타자임 pool을 만들고, 37℃에서 한 시간 동안 리보자임 반응 버퍼에서 HCV NS5B 단백질과 함께 반응시켰다. 그 후, NS5B에 의존적으로 절단되는 엡타자임 pool을 유레아 폴리아크릴아미드 겔로 전기영동 하여 정제하고, 정제하여 얻은 엡타자임 RNA를 역전사 시킨 후(프라이머 : 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA), PCR (5' 프라이머; 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG, 3' 프라이머 : 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTG TTACGTTTGGTTTCCCAAA)을 수행하고, 다시 RNA로 전사시켜 선별과정을 거칠 엡타자임 RNA pool을 제작하였다.

4번의 선별 과정 후에, 증폭된 DNA를 클로닝 하였고, 25개의 클론을 시퀀싱 하였다. 도 6은 교류모듈에 피리미딘(pyrimidine)이 풍부하고, 서열이 서로 다른 22개의 선별된 클론을 나타낸다.

3-3. NS5B 의존적 엡타자임(aptazyme) 특이성 검증

선별된 각각의 NS5B 의존적인 앱타자임의 특이성을 확인하기 위해, 앱타자임을 방사성 동위원소로 표지한 다음 BSA 또는 NS5B 단백질과 반응시켰다.

먼저, DNA 주형 200 ng을 이용하여 [α-³² P] UTP(hot):cold UTP의 비율을 1:4로 총 20 ㎕ 부피로 진행하였으며, 0.1 mM ATP, CTP, GTP, 10x 전사 완충액, 10 mM DTT, 40 U RNase 저해제, T7 RNA 중합효소를 넣고, 37 ℃에서 3시간 동안 반응시켰다. 여기에, 1.5 U DNaseⅠ(promega)를 넣어 37 ℃에서 30분간 더 처리한 다음 DNA 주형을 완전히 제거하여 엡타자임 RNA를 표지 하였다.

선별된 엡타자임의 특이성을 보기 위해, [α-³²P] UTP로 표지된 20 fmole의 엡타자임 RNA를 3.2 pmole의 BSA 단백질과 NS5B 단백질을 첨가하여 반응시켰다. 20 fmole의 엡타자임을 95 ℃에서 1분 30초 동안 변성시킨 후, 37 ℃에서 15분 동안 구조를 재형성시켰다. 여기에 2x 해머헤드 반응 완충액과 3.2 pmole의 단백질을 넣어 37 ℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 RNA는 RNA 로딩 염료와 혼합하고, 95 ℃에서 변성시켜 7M-10% 폴리아트릴아미드 겔에서 180V로 1시간 동안 전기영동 하였다. 이를 X-선 필름에 3-24시간 노출하여 현상하였다.

도 7은 본 발명에서 수득한 NS5B 의존적인 엡타자임의 NS5B 특이적인 자가-절단 특이성을 나타낸 것으로, 1 lane부터 8 lane은 관찰한 시간은 나타내며, 각각 0, 10, 20 ~ 120분이다. 9 lane은 120분 동안 BSA와 함께 반응시킨 것을 나타낸다. 도 7을 참조하면, 본 발명의 NS5B 의존적인 엡타자임은 NS5B 단백질 존재시에만 특이적으로 자가-절단되었음을 알 수 있다.

실시예 4. NS5B 에 의존적으로 anti - miRNA 를 방출하는 엡타자임의 활성 평가

4-1. NS5B에 의존적으로 anti-miRNA를 방출하는 엡타자임의 제작

NS5B에 의존적으로 miR-17-5p, miR-122에 대한 안티센스를 방출하는 알로스테릭 리보자임(NS5B-dependently anti-miRNA releasing allosteric ribozyme, 각각 antimir-17-5p NDAR, antimir-122 NDAR이라 한다.)을 만들기 위해, 선별된 리보자임으로부터 방출되는 서열를 mature miRNA 122에 대한 안티센스 서열로 대체시켰다. 이를 위해, 선별된 알로스테릭 리보자임 클론 No. 4 cDNA를 주형으로 하기의 프라이머 세트로 PCR을 수행하였다.

<antimir-17-5p NDAR>

5' 프라이머 : 5'-ACGCGTCGACGGGAGTGCAGCTGATGAG

3' 프라이머 : 5'-GCTCTAGACAAAGTGCTTACAGTGCAG

<antimir-122 NDAR>

5' 프라이머 : 5'-ACGCGTCGACGGGAATGGTGCTGATGAG

3' 프라이머 : 5'-GCTCTAGATGGAGTGTGACAATGGTG

각각의 증폭된 DNA를 SalI 및 XbaI로 처리하고, pGEM T-easy 벡터(Promega)에 클로닝 하였다. 각각의 NDAR은 클로닝 된 벡터를 주형으로 하여 인 비트상에서 RNA로 전사시켜 만들었다. 세포에서 각각의 NDAR을 발현하는 발현벡터를 구성하기 위해 NDAR cDNA를 포함하는 각각의 벡터를 SalI 및 XbaI로 처리하고, U6+1 snRNA 프로모터-주도의 발현 카세트(U6+1 snRNA promoter-driven expression cassettes)로 클로닝 하였다. 도 8은 antimir-122 NDAR 및 antimir-17-5p NDAR의 서열 및 예상되는 2차 구조를 나타낸다.

4-2. NDAR의 인 비트로 자가-절단 에세이

인 비트로 상에서 전사된 NDAR RNA를 calf intestine alkaline phosphatase(Ambion)로 탈인산화시키고, 5'-말단을 [γ-³²P]ATP(3000 Ci/mmol, Amersham) 및 T4 폴리뉴클레오타이드 카이네이즈(Ambion)로 표지 하였다. 말단이 표지된 NDAR RNA 20 fmol을 37℃에서 한 시간 동안 반응버퍼(30 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 2 mM dithiothreitol)에 각각 3.2 pmol의 BSA와 HCV NS5B를 넣고 반응시킨 후, 반응산물을 7 M 유레아-12% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동 하여 분리하였다.

리보자임의 자가-절단 위치를 확인하기 위해서, 서열사다리를 만들고, 사이즈 마커로서 겔 상에 로딩하였다. 알칼리성 가수분해는 95℃에서 15분 동안 50 mM NaHCO₃(pH 9.0), 1 mM EDTA, 0.25 mg/ml tRNA, 및 54 fmole의 NDAR RNA가 포함된 20 μl의 반응 부피에서 수행하였다. 잘려진 NDAR RNA 단편은 80℃에서 5분간 변성시킨 후, 변성 폴리아크릴아미드 겔(denaturing polyacrylamide gel)에서 분석하였다.

또한, NDAR RNA 54 fmole을 37℃에서 10분 동안 20 mM NaCitrate(pH 5.0), 7 M 유레아, 1 mM EDTA, 0.25 mg/ml tRNA 및 1 U의 RNase T1을 포함하는 반응 혼합물 20 μl에서 RNase T1(USB)로 처리한 후, 10 μl의 RNA 로딩 염료(10 ml formamide, 10 mM EDTA, 0.01% bromophenol blue, 0.01% xylene cyanol)를 첨가하여 중지하고, 변성 폴리아크릴아미드 겔에서 분석하였다.

리보자임의 정확한 자가-절단 위치를 확인하기 위해 잘려진 산물을 하기의 방법에 따라 3'-RACE(3'-rapid amplification of cDNA ends) PCR을 하였다. 먼저, 자가-절단 RNA 30 pmol을 유레아 폴리아크릴아미드 겔에서 분리한 후, 37℃에서 30분간 poly(A) 폴리머레이즈(NEB, 5 unit)를 이용해서 poly(A) tail을 붙였다. Poly(A) RNA는 3'-RACE 프라이머 5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)₃₀VN를 사용하여 역전사 시켰다(상기 N은 A, T, G, C가 동수로 포함되며, V는 A, G, 또는 C를 나타낸다).

그 후, 생성된 cDNA는 리보자임의 5' 말단에 특이적인 5' 프라이머(antimir-122 NDAR에 대한 프라이머 : 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAATGGTGCTG ; antimir-17-5p NDAR에 대한 프라이머 : 5'-TAATACGACTCACTATAGGGAGTGCAGCTG) 및 nested 3' 프라이머(5'-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT)로 98℃에서 30초 -> 58℃에서 30초 -> 72℃에서 30초의 조건으로 25회 사이클로 PCR 하였다.

도 9를 참조하면, HCV NS5B의 존재하에서 antimir-122 NDAR과 antimir-17-5p NDAR 모두에서 특이적으로 자가-절단 되었으나(4 lane), BSA의 존재하에서는 자가-절단 되지 않았다(3 lane). 이는 NDAR의 활성은 NS5B에 의존적이라는 것을 의미한다. 또한, 시퀀싱 겔 분석에서 잘려진 RNA 산물의 사이즈는 자가-절단 반응이 NDAR의 예상 절단부위 부근에서 일어났음을 나타냈으며(도 8 및 도 9의 화살표), 이는 오로지 mature miRNA를 표적으로 하는 안티센스 서열이 antimir NDAR에 의해서 방출될 수 있다는 것을 나타낸다. 양 NDAR은 대략 3군데의 주요한 위치에서 자가-절단 되었으나, 자가-절단되어 방출된 모든 안티센스는 표적인 mature miRNA의 서열 전부를 커버할 수 있다.

4-3. Anti-miRNA 리포터 에세이

antimir-122 NDAR 발현 벡터의 HCV 증식 세포에서 특이적으로 마이크로 RNA 122의 활성을 억제하는지 확인하기 위해 하기의 실험을 수행하였다.

먼저, pCMV-F.luci 25 ng 및 pTKRL-3×miR122T 100 ng을 antimir-122 NDAR 발현 벡터 400 ng와 함께 Huh-7 및 HCV 레플리콘 Huh-7 1×10⁵세포로 LT 형질도입 시약(transfection agent, Mirus)을 사용해서 트렌스펙션 시켰다. 24시간 후, 세포를 수득하여 용해하였고, luminometer TD-20/20(Turner Designs Instrument) 및 dual-luciferase 리포터 분석 시스템(Promega)을 사용하여 상대적으로 밝은 유닛을 측정함으로써 리포터 유전자 발현 활성을 살펴보았다(도 10 및 도 11의 122 NDAR). antimir-122 NDAR 에 의한 마이크로 RNA 122 활성의 억제는 마이크로 RNA 122 표적 위치를 가진 리포터 유전자의 활성으로 알 수 있다.

또한, 대조군인 U6+1 벡터, antimir-122 발현 벡터, antimir-17-5p NDAR, 변형된 antimir-17-5p NDAR(M-17-5p NDAR), 변형된 antimir-122 NDAR(M-122 NDAR) 발현 벡터 역시 3×miR122T 리포터 구조체와 함께 트렌스펙션 시켰다.

도 10 및 도 11을 참조하면, 122 NDAR의 발현은 오로지 HCV 레플리콘 Huh-7 세포에서 리포터 유전자의 활성이 높게 유도되었으나, Huh-7 세포에서는 리포터 유전자의 활성이 유도되지 않았다. 구체적으로, HCV 레플리콘 Huh-7 세포에서의 리포터 유전자의 활성이 Huh-7 세포에 비해 약 8배 이상 증가하였다.

도 10 및 도 11의 M-122 NDAR은 리보자임의 스템 Ⅲ 부분의 미스 매치된 염기를 변형시켜 완전한 염기쌍 결합(base-pairing)이 형성되도록 한 것으로 M-122 NDAR은 자가-절단되는 부위가 한군데인 것을 알 수 있다. 도 12의 3 lane은 BSA, 4 lane은 NS5B와의 반응 결과를 나타내며, 화살표는 절단된 단편을 나타낸다.

다시 도 10 및 도 11을 참조하면, M-122 NDAR의 발현은 Huh-7 세포와 비교할 때, HCV 레플리콘 Huh-7 세포에서 약 23배 이상 리포터 활성을 증가시켰다. 그러나, 17-5p NDAR 및 M-17-5p NDAR 중 어느 것의 발현에 의해서도 Huh-7 및 HCV 레플리콘 Huh-7 세포에서의 리포터 활성이 변화되지 않았다. 이는 표적 마이크로 RNA에 대하여 anti-miRNA가 특이성 있음을 나타낸다.

이러한 결과는 본 발명의 엡타자임이 HCV NS5B의 존재하에서 특이적으로 자가-절단되는 활성이 유도되고, 이에 따라 mature miRNA에 대한 안티센스를 방출함으로써 오로지 HCV가 감염된 세포에서만 특이적으로 miR-122 활성을 효율적이고 특이적으로 억제한다는 것을 나타낸다(도 13 참조). 아울러 본 발명의 엡타자임은 HCV NS5B 단백질에 엡타머가 특이적으로 결합하여 HCV NS5B 단백질의 기능을 억제시킴으로써 HCV 감염세포에서만 특이적으로 HCV의 증식을 억제시킬 수 있다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 12 또는 서열번호 13인 HCV 감염 세포에서 특이적으로 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임.
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제 1항의 엡타자임을 포함하는 HCV 관련 질환 치료용 조성물.
제 10항에 있어서, HCV RNA에 의해 코딩된 물질과 특이적으로 결합하여 상기 물질의 기능을 억제함과 동시에 마이크로 RNA 활성을 억제하는 활성을 가지는 치료용 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 HCV RNA에 의해 코딩된 물질은 NS5B 단백질인 것인 치료용 조성물.
제 11항에 있어서, 상기 마이크로 RNA는 마이크로 RNA 122인 것인 치료용 조성물.
제 10항에 있어서, 상시 HCV 관련 질환은 간염, 간섬유화, 간경화 및 간암으로 이루어진 군에서 선택된 질환인 치료용 조성물.
(a) 교류모듈에 5개의 랜덤 서열을 포함하는 서열번호 14 및 15의 프라이머 세트 (5' 프라이머: 5'-TTGGTGTCTGATGAGNNNNNCGCGCCATATTGTGAGGGGCGCG-3' 및 3' 프라이머: 5'-TACGTTTGGTTTCCCAAACGTTTCGNNNNNCGCGCCCCTCACAAT-3', N은 G, A, T, C가 동수로 포함됨) 및 taq polymerase를 첨가하여 PCR 하는 단계;
(b) 단계 (a)의 PCR 산물에, 서열번호 16 및 17의 프라이머 세트(5' 프라이머: 5'-GGTAATACGACTCACTATAGGGTTGGTGTCTGATGAG-3' 및 3' 프라이머: 5'-TTTTTTTTTTTTTTTTGGTGTTACGTTTGGTTTCCCAAA-3')와 taq polymerase를 첨가하여 PCR 하는 단계;
(c) 단계 (b)의 PCR 산물을 T7 중합효소를 이용하여 시험관내에서 RNA로 전사시켜 엡타자임 라이브러리를 제작하는 단계;
(d) 상기 엡타자임 라이브러리를 NS5B 단백질 및 NS5B 단백질 이외의 단백질과 접촉시켜 NS5B 단백질 존재하에서만 특이적으로 자가-절단 되는 RNA 풀을 수득하고, 수득한 엡타자임 RNA 풀 각각을 RT-PCR하여 DNA를 수득하는 단계;
(e) 단계 (d)의 엡타자임 DNA에 서열번호 18 및 19의 프라이머 세트 (5' 프라이머: 5'-ACGCGTCGACGGGAATGGTGCTGATGAG 및 3' 프라이머: 5'-GCT CTAGATGGAGTGTGACAATGGTG)와 taq polymerase를 첨가하여 PCR 하는 단계;
(f) 단계 (e)의 PCR 산물을 시험관내에서 RNA로 전사시키는 단계를 포함하는 HCV 감염 세포에서 특이적으로 마이크로 RNA에 대한 안티센스를 방출하는 엡타자임의 제조방법.
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