JP2008514202A - Ｒｎａｉによる一本鎖ウイルスの逆鎖複製中間体のターゲティング - Google Patents

Abstract

本発明は、二本鎖ＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）によってウイルス複製を調節するための方法および組成物に関し、抗ウイルス法および抗ウイルス組成物が一本鎖ＲＮＡウイルスの逆鎖複製中間体を優先的に標的にする。

Description

発明の分野
本発明は、二本鎖ＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシング（ＲＮＡｉ）によってウイルス複製を阻害し、抑制し、またはダウンレギュレートするための方法および組成物に関し、抗ウイルス法および抗ウイルス組成物は、一本鎖ウイルスの逆鎖複製中間体を優先的に標的にする。

発明の背景
アンチセンス組成物、二本鎖ＲＮＡをベースとする組成物、トリプレックスを形成するオリゴヌクレオチド、リボザイムなどを含む抗ウイルスの適用を目的とする核酸をベースとする組成物の開発に対する注目が高まっている。それらの配列特異的な作用機序は、高レベルの安全性および効力を備える治療における展望を提示する。現在、プラス鎖ウイルスのウイルスＲＮＡをダウンレギュレートすることが認められている方法は、主にプラス鎖ＲＮＡのターゲティングに直接関与する。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドはｍＲＮＡにハイブリダイズすることによって働き、それによりｍＲＮＡのタンパク質への翻訳に干渉すると考えられる。したがって、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、通常、標的ｍＲＮＡに相補的であるように設計される。例えば、米国特許第６，００１，９９０号明細書、「Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ ｏｆ ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ ｖｉｒｕｓ」は、ＨＣＶゲノムＲＮＡの配列に実質的に相補的なオリゴヌクレオチド、すなわちＨＣＶゲノムのプラス鎖に相補的でありかつそれを標的にする配列について記載している。同様に、翻訳されないＲＮＡがｓｉＲＮＡ阻害に対して不応性を示す一方で活発に翻訳されるＲＮＡが有効な標的であることから、ＲＮＡｉが翻訳に機構的に関連すると考えられている。ワン（Ｗａｎｇ）およびカーミカエル（Ｃａｒｍｉｃｈａｅ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６８：４３２−４５２頁（２００４年）を参照のこと。例えば、ＨＣＶゲノムＲＮＡの５’ＵＴＲのｓｉＲＮＡターゲティングについて記載した、ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．４：６０２−０８頁（２００３年）も参照のこと。クロンケ（Ｋｒｏｅｎｋｅ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（７）：３４３６−４６頁（２００４年）では、５’ＮＴＲと同様に様々なコード配列の領域を含むＨＣＶゲノムＲＮＡに特異的なｓｉＲＮＡが評価され、ＮＴＲの大部分がＲＮＡｉに耐性を示すことが報告された。しかし、それらによると、５’ＮＴＲに特異的な単一の配列が実際には負鎖の３’末端を標的にし、それがその抗ウイルス活性に寄与する可能性があることが推測された。ＨＣＶのプラス鎖および／または負鎖を標的にするリボザイムについて記載する米国特許第６，１０７，０２８号明細書によると、リボザイムはＨＣＶのプラス鎖のターゲティングに対する例外であるように見られる。

臨床に関連する多数のウイルスは、複製の間にメッセンジャーＲＮＡ分子ではないＲＮＡ分子を生成する。例えば、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）などの正鎖またはプラス鎖ＲＮＡウイルスは、ウイルスによって作られた様々なｍＲＮＡに相補性および反対の極性を示す（５’対３’末端）、いわゆる負鎖またはマイナス鎖ＲＮＡを生成する。ＨＣＶなどのＲＮＡウイルスの極端な配列変動性および高い突然変異率により、ウイルスゲノムＲＮＡの保存領域を標的にする駆動力がもたらされる。しかし、ＨＣＶの保存領域の複雑な二次構造ならびに細胞内環境内でのこれらの保存領域に対する細胞タンパク質とウイルスタンパク質の結合の存在により、核酸をベースとする抗ウイルスアプローチのこれらの本来好ましい標的領域への適用に関しては不確定要素が出てくる。スミス（Ｓｍｉｔｈ）らは、ＨＣＶのプラス鎖とマイナス鎖の両鎖における保存領域をマッピングし、アンチセンスコンストラクトに対する二次構造およびハイブリダイゼーションの接近可能性（ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）について判定した。Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（１９）：９５６３−７４頁（２００２年）、「Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ ３’−Ｔｅｒｍｉｎａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」や、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、Ｊ．Ｖｉｒａｌ Ｈｅｐａｔ．１１（２）：１１５−２３頁（２００４年）も参照のこと。

同様に、有効な抗ウイルス物質の創出を目的とした戦略において、ウイルスによって生成されたｍＲＮＡ分子の選択的破壊を標的にするのにＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）が用いられている。アンチセンスの如く、ｄｓＲＮＡ媒介性のＲＮＡｉは配列特異的な核酸の相互作用に依存するが、多重タンパク質のＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）の関与により、アンチセンスの接近可能性のみがＲＮＡｉ分解における標的の接近可能性と相関するか否かについては不確かなものになる。さらに、ＲＮＡｉの戦略ではウイルス標的に対して同一性と相補性の双方を示す配列を含む二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）が用いられることから、例えばその相補的なウイルスｍＲＮＡよりも優先的にマイナス鎖ＲＮＡを標的にする方法については示されていない。換言すれば、例えば（プラス鎖ＲＮＡウイルスの）ｍＲＮＡまたはタンパク質産物ではなくマイナス鎖を選択的に標的にすることによって働く抗ウイルス物質の効力についてはこれまでに示されていない。本発明は、ＲＮＡｉを用い、例えばプラス鎖ＲＮＡウイルスのマイナス鎖の破壊を優先的に標的にするための方法を提供し、かつＨＣＶなどのＲＮＡウイルスの複製の強力な阻害についてのこの方法に基づいた新規の組成物も提供する。

発明の概要
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）媒介性のＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）に関して現在認められている用途は、主にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）として分類される標的分子に限られている。翻訳されないＲＮＡがｓｉＲＮＡ阻害に対して不応性を示す一方、活発に翻訳されるＲＮＡがより有効な標的であるようにＲＮＡｉが翻訳に機構的に関連すると考えられている。ワン（Ｗａｎｇ）およびカーミカエル（Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ）、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．６８：４３２−４５２頁（２００４年）を参照のこと。多数のウイルス（特にプラス鎖ウイルスとして知られるＲＮＡウイルス）はｍＲＮＡでないＲＮＡ分子も生成するが、ｄｓＲＮＡを用いてウイルスの機能を阻害するための戦略によると、非翻訳領域同様、コード配列を含む、ウイルスによって生成されたｍＲＮＡ（またはゲノムＲＮＡ類似体）が標的にされている。例えば、ヨコタ（Ｙｏｋｏｔａ）ら、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ．４：６０２−０８頁（２００３年）；カパディア（Ｋａｐａｄｉａ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００（４）：２０１４−１８頁（２００３年）；ウィルソン（Ｗｉｌｓｏｎ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９（１１）：７０５０−５８頁（２００５年）；クロンケ（Ｋｒｏｅｎｋｅ）ら、Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７８（７）：３４３６−４６頁（２００４年）を参照のこと。

それに対し、本発明の抗ウイルス法および抗ウイルス組成物は、プラス鎖ウイルスのマイナス鎖ＲＮＡおよびマイナス鎖ウイルスのプラス鎖ＲＮＡを標的にする。マイナス鎖ウイルスに関して、通常、ウイルスｍＲＮＡよりも極めて少ないプラス鎖の非ｍＲＮＡ配列を標的にすることは有利である。出願人らは、意外なことに、これらのウイルスの「逆」鎖複製中間体（抗ゲノムＲＮＡ鎖）を標的にする、すなわちプラス鎖ウイルスのマイナス鎖およびマイナス鎖ウイルスのプラス鎖を標的にすることによってより優れた抗ウイルス活性を得ることが可能であることを見出している。逆鎖を優先的に標的にするように設計されたかかるｄｓＲＮＡ分子は高活性を示すだけでなく、ｄｓＲＮＡ設計の出発点として逆鎖を利用することで活性分子の割合が高まる結果となる。このアプローチは、対応する主鎖のメッセージよりも少ないＲＮＡ集団を破壊するかまたはダウンレギュレートするのに明らかな利点を有する。これは、ウイルスを除去するという望ましい目標を達成するのに必要となるエフェクターの二本鎖ＲＮＡの量がより少なくてすむことを意味する。これらの「逆」鎖はウイルス複製にとって必要な中間体であることから、これらの鎖の破壊またはダウンレギュレーションによってウイルス複製の低下または消去がもたらされることになる。「逆」鎖をＲＮＡｉ攻撃に対する標的として利用することで、潜在的な抗ウイルス標的の範囲拡大、ひいては特定のウイルスに対して活性を示す潜在的な作用物質の範囲拡大も可能になる。ＨＣＶなどのＲＮＡウイルスの高い突然変異率を考慮すると、有効な抗ウイルス治療には多剤レジメン（ｍｕｌｔｉ−ｄｒｕｇ ｒｅｇｉｍｅｎ）の利用が求められる。したがって一態様では、単独で、またはプラス鎖を優先的に標的にする１種もしくは複数種のｄｓＲＮＡと組み合わせて、および／または他の抗ウイルス物質とともに、１つもしくは複数のかかる負鎖を標的にするｄｓＲＮＡを使用することが可能である。

限定されないが、ピコルナウイルス、カリシウイルス、アストロウイルス、トガウイルス、フラビウイルス、コロナウイルスおよびアルテリウイルスなどのプラス鎖ウイルスは、ＲＮＡゲノムがセンスポラリティーに一致する場合の一本鎖ＲＮＡウイルスであり、これはこれらのＲＮＡゲノムがそれらのウイルスタンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡと同じポラリティーにあることを意味する。これらのすべての「プラス鎖」ウイルスは、感染細胞内でプラス鎖のレベルと比較して通常はるかに少ないマイナス鎖中間体を介して複製する。例えば、Ｃ型肝炎（フラビウイルス）感染細胞では、マイナス鎖はプラス鎖ＲＮＡ分子の約１／３０のレベルで存在している。マイナス鎖の数がより少ないこととマイナス鎖がウイルス複製に必要とされるという事実を合わせると、ＲＮＡｉによるマイナス鎖のターゲティングが治療戦略として望ましいものになる。一部の応用では、有効な抗ウイルス戦略は、１つ、２つ、３つもしくはそれより多数の負鎖を標的にするｄｓＲＮＡ分子を含む複数のＲＮＡｉ物質を、単独で、または例えば１つ、２つ、３つもしくはそれより多数の正鎖を標的にするｄｓＲＮＡ分子を含む他の抗ウイルス物質と組み合わせて同時使用することを含むことになる。

本発明の一部の応用では、代わりにマイナス鎖ウイルスのプラス鎖のセグメントを標的にすることが望ましい。パラミクソウイルス、ラブドウイルス、フィロウイルス、オルトミクソウイルス、ブンヤウイルスおよびアレナウイルスなどのマイナス鎖ウイルスは、ゲノムが負のポラリティーを有する場合の一本鎖ＲＮＡウイルスである。これらすべてのウイルスは、ウイルスのｍＲＮＡ産物と異なりかつ細胞内でマイナス鎖ＲＮＡレベルと比較して通常はるかに少ないプラス鎖中間体を介して複製する。プラス鎖の数がより少ないこととプラス鎖がウイルス複製に必要とされるという事実を合わせると、ＲＮＡｉによるこれらウイルスのプラス鎖のターゲティングが新規の治療戦略として有望なものになる。

本発明の一態様は、該一本鎖ウイルスの逆鎖複製中間体に対する反転相補体由来の少なくとも１９個の近接ヌクレオチドのエフェクター配列を含むＲＮＡエフェクター分子を該脊椎動物細胞に投与するステップを含む、一本鎖ＲＮＡウイルスによって脊椎動物細胞の感染を治療する方法を提供することである。

本発明のさらなる態様は、
ａ）一本鎖ＲＮＡウイルスの逆鎖複製中間体に対する反転相補体である少なくとも１９個の近接ヌクレオチドのエフェクター配列と、
ｂ）エフェクター配列の反転相補体であるエフェクター相補体と
を含む二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を細胞に投与するステップを含み、該エフェクター配列がエフェクター相補体と比べてＲＩＳＣと優先的に結合する、標的脊椎動物細胞内で一本鎖ＲＮＡウイルスの複製を調節する方法を提供することである。

別の態様では、一本鎖ＲＮＡウイルスの逆鎖複製中間体に対する反転相補体でありかつエフェクター相補体と比べてＲＩＳＣと優先的に結合する少なくとも１９個の近接ヌクレオチドのエフェクター配列を個々に含む１種、２種、３種もしくはそれより多種の該二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含む複数の抗ウイルス二本鎖ＲＮＡエフェクター分子が、単独で、または例えば、一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノムＲＮＡ鎖の反転相補体である少なくとも１９個の近接ヌクレオチドのエフェクター配列およびエフェクター配列の反転相補体であるエフェクター相補体を個々に含む１種、２種、３種もしくはそれより多種の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含む１種もしくは複数種の他の抗ウイルス物質と組み合わせて、脊椎動物細胞に同時に提供されることになり、ここでエフェクター配列は、エフェクター相補体と比べてＲＩＳＣと優先的に結合する。

本発明の別の態様は、一本鎖ＲＮＡウイルスの逆鎖複製中間体に対する反転相補体である少なくとも１９個の近接ヌクレオチドのエフェクター配列を個々に含む１種もしくは複数種のかかる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を脊椎動物細胞に提供することである。好ましくは、反転相補体は該反転相補体の５’末端の位置１でＡまたはＵを有し、かつ二本鎖ＲＮＡエフェクター分子においてエフェクター配列の５’末端を含む末端での熱安定性（Ｔｍ）がエフェクター配列の３’末端を含む末端に比べてより低い。

本発明の別の態様は、例えば、プラス鎖ＲＮＡウイルスの抗ゲノムマイナス鎖、またはマイナス鎖ウイルスの抗ゲノムプラス鎖もしくは非ｍＲＮＡ配列である、一本鎖ＲＮＡウイルスの逆鎖複製中間体（抗ゲノムＲＮＡ）に対する反転相補体である少なくとも１９個の近接ヌクレオチドのエフェクター配列を個々に含む１種もしくは複数種、好ましくは２種、３種もしくはそれより多種のかかる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を脊椎動物細胞に提供することであり、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は該抗ゲノムマイナス鎖または該抗ゲノムプラス鎖をそれぞれ直接標的にする。好ましい態様では、該二本鎖ＲＮＡエフェクター分子が、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子をコードする発現コンストラクトを脊椎動物細胞に提供することによって提供される。本発明の他の目的および利点は、以下に示す詳細な説明を参照すると当業者にとって明らかになろう。

配列の簡単な説明
配列番号１はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９３８２〜９４０２を示す。
配列番号２はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５０２〜９５２２を示す。
配列番号３はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５１２〜９５３２を示す。
配列番号４はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５１８〜９５３８を示す。
配列番号５はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５２５〜９５４５を示す。
配列番号６はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５２６〜９５４６を示す。
配列番号７はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５５２〜９５７２を示す。
配列番号８はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５７７〜９５９７を示す。
配列番号９はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５７９〜９５９９を示す。
配列番号１０はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５８３〜９６０３を示す。
配列番号１１はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５０９〜９５２９を示す。
配列番号１２はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５２０〜９５４０を示す。
配列番号１３はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５３４〜９５５４を示す。
配列番号１４はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５６０〜９５８０を示す。
配列番号１５はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５８１〜９６０１を示す。
配列番号１６はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５０６〜９５２６を示す。
配列番号１７はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５１４〜９５３４を示す。
配列番号１８はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５２０〜９５４０を示す。
配列番号１９はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５３７〜９５５７を示す。
配列番号２０はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５４４〜９５６３を示す。
配列番号２１はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５５４〜９５７４を示す。
配列番号２２はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５６７〜９５８７を示す。
配列番号２３はＨＣＶ ３’ＮＴＲのヌクレオチド９５８４〜９６０４を示す。
配列番号２４はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のプラス鎖）を示す。
配列番号２５はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のマイナス鎖）を示す。
配列番号２６はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のプラス鎖）を示す。
配列番号２７はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のマイナス鎖）を示す。
配列番号２８はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のプラス鎖）を示す。
配列番号２９はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のマイナス鎖）を示す。
配列番号３０はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のプラス鎖）を示す。
配列番号３１はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のマイナス鎖）を示す。
配列番号３２はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のプラス鎖）を示す。
配列番号３３はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のマイナス鎖）を示す。
配列番号３４はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のプラス鎖）を示す。
配列番号３５はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のマイナス鎖）を示す。
配列番号３６はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のプラス鎖）を示す。
配列番号３７はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域１のマイナス鎖）を示す。
配列番号３８はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域２のプラス鎖）を示す。
配列番号３９はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域２のマイナス鎖）を示す。
配列番号４０はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域２のプラス鎖）を示す。
配列番号４１はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域２のマイナス鎖）を示す。
配列番号４２はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域２のプラス鎖）を示す。
配列番号４３はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域２のマイナス鎖）を示す。
配列番号４４はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域２のプラス鎖）を示す。
配列番号４５はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のプラス鎖）を示す。
配列番号４６はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のマイナス鎖）を示す。
配列番号４７はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のプラス鎖）を示す。
配列番号４８はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のマイナス鎖）を示す。
配列番号４９はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のプラス鎖）を示す。
配列番号５０はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のマイナス鎖）を示す。
配列番号５１はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のプラス鎖）を示す。
配列番号５２はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のマイナス鎖）を示す。
配列番号５３はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のプラス鎖）を示す。
配列番号５４はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のマイナス鎖）を示す。
配列番号５５はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のプラス鎖）を示す。
配列番号５６はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のマイナス鎖）を示す。
配列番号５７はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のマイナス鎖）を示す。
配列番号５８はＨＣＶ ５’ＵＴＲ ｓｉＲＮＡ（領域５のマイナス鎖）を示す。
配列番号５９はＨＣＶ ３’ＵＴＲ保存領域配列を示す。

発明の詳細な説明
出願人らは、特に本開示におけるすべての引用文献の内容全体を援用する。さらに、量、濃度、または他の値もしくはパラメーターが範囲、好ましい範囲、またはより好ましい値およびあまり好ましくない値の一覧のいずれかとして与えられる場合、範囲が別々に開示されるか否かにかかわらず、これは任意の範囲の上限もしくは好ましい値と任意の範囲の下限もしくは好ましい値との任意の対から形成される全範囲を詳細に開示するものとして理解されるべきである。本明細書において数値範囲が列挙される場合、特に明記しない限り、範囲はその端点ならびに範囲内のすべての整数および分数を含むことを意図している。本発明の範囲は、範囲が限定される場合、列挙される特定の値に限定されることを意図していない。

ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、動物および植物において配列特異的な転写後遺伝子サイレンシングまたは転写遺伝子サイレンシングの過程であり、サイレンシングされる（ｓｉｌｅｎｃｅｄ）遺伝子に対して配列において相同性を示す二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）によって開始される。ＲＮＡ干渉は配列特異的な様式で作用することから、薬剤として使用されるＲＮＡｉ分子はその標的に特異的でなければならない。ウイルスゲノム、特にＲＮＡウイルスゲノムは環境における変化への耐性を調節するために変動的であることは当該技術では既知である。したがって、ＲＮＡｉを用いてウイルスゲノム複製をノックダウンするために、ウイルスゲノムにおける固有の保存領域を同定する必要がある。ｄｓＲＮＡ分子が本発明の方法において使用される場合、任意の必須で自然発生的な宿主のポリヌクレオチド配列の機能に有害な作用を示さないように、本発明によるサイレンシングに対する標的とされる保存されたウイルス配列が任意の自然発生的で機能が正常な宿主のポリヌクレオチド配列に対して実質的に非相同であることを保証することも重要である。かかる自然発生的な機能的ポリヌクレオチド配列には、健康な宿主生物における所望のタンパク質をコードする配列、ならびに非コードであるが必須の調節配列である配列が含まれる。したがって、本発明に有用な好ましいＲＮＡエフェクター分子は、本発明の方法のいずれかを実施した後に機能が阻害されないように意図された任意の宿主のポリヌクレオチド配列とは配列的に十分に識別されなければならない。コンピュータアルゴリズムを用いると、ＲＮＡ分子のポリヌクレオチド配列と宿主に必須の正常な配列の間の本質的な相同性の欠如について定義することが可能である。

本開示に関連して、多数の用語を用いる必要がある。「少なくとも１９個の近接ヌクレオチド」とは、開始部位が少なくとも１９個の塩基対のポリヌクレオチドを生成可能である限り、開示された配列のうちの一配列内の任意のヌクレオチドでヌクレオチド配列が開始しうることを意味する。例えば、少なくとも１９個の近接塩基のヌクレオチド配列は、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド１９、ヌクレオチド２〜ヌクレオチド２０、ヌクレオチド３〜ヌクレオチド２１などを含み、１９ｍｅｒを生成することが可能である。したがって、２０ｍｅｒは、ヌクレオチド１〜ヌクレオチド２０、ヌクレオチド２〜ヌクレオチド２１、ヌクレオチド３〜ヌクレオチド２２などを含みうる。２０個を超える近接ヌクレオチドが類似配列として想定される。

「ｄｓＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ分子」または「ｄｓＲＮＡエフェクター分子」または「二本鎖ＲＮＡエフェクター分子」とは、二本鎖の高次構造をなす少なくとも約１９個以上のヌクレオチドの領域を含む少なくとも部分的に二本鎖のリボ核酸分子を含む。二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は２つの別々のＲＮＡ鎖から形成される二本鎖ＲＮＡの二本鎖であるかまたはそれは少なくとも部分的に二本鎖のヘアピン高次構造（すなわちヘアピンｄｓＲＮＡまたはステムループｄｓＲＮＡ）をとることが可能な自己相補性の領域を有する単一のＲＮＡ鎖でありうる。様々な実施形態では、ｄｓＲＮＡは、全体としてリボヌクレオチドからなるか、または例えば２０００年４月１９日に出願された国際公開第００／６３３６４号パンフレットまたは１９９９年４月２１日に出願された米国特許出願第６０／１３０，３７７号明細書で開示されたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドなどのリボヌクレオチドとデオキシヌクレオチドの混合物からなる。ｄｓＲＮＡは、分子の１つのセグメント内のヌクレオチドが分子の別のセグメント内のヌクレオチドと塩基対合するように、自己相補性の領域を有する単一の分子でありうる。一態様では、自己相補性の領域は、少なくとも約３〜４個のヌクレオチド、望ましくは少なくとも約５、６、７、９〜１５個もしくはそれより多数のヌクレオチドの領域によって連結され、分子の別の部分に対する相補性がないことから、一本鎖（すなわち「ループ領域」）が残る。かかる分子は、場合によって短い一本鎖の５’および／または３’末端を有する、部分的に二本鎖のステムループ構造をとることになる。一態様では、ヘアピンｄｓＲＮＡの自己相補性の領域または二本鎖のｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、（望ましくはヘアピンｄｓＲＮＡ内の一本鎖ループ領域によって連結される）エフェクター配列およびエフェクター相補体を含むことになる。エフェクター配列またはエフェクター鎖は、ＲＩＳＣ内に取り込まれるかまたはそれと結合する二本鎖領域または二本鎖における鎖である。一態様では、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、ＨＣＶなどのプラス鎖ＲＮＡウイルスの抗ゲノムマイナス鎖、またはマイナス鎖ウイルスの抗ゲノムプラス鎖もしくは非ｍＲＮＡプラス鎖配列を例とする一本鎖ＲＮＡウイルスの逆鎖複製中間体（抗ゲノムＲＮＡ）に対する反転相補体である、少なくとも１９個の近接ヌクレオチド、好ましくは１９〜２９、１９〜２７、または１９〜２１個のヌクレオチドのエフェクター配列を含むことになり、ここでは二本鎖ＲＮＡエフェクター分子が該抗ゲノムマイナス鎖または該抗ゲノムプラス鎖をそれぞれ直接標的にする。好ましい態様では、該二本鎖ＲＮＡエフェクター分子をコードする発現コンストラクトを脊椎動物細胞に提供することにより、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子が生成される。

様々な実施形態では、単一の分子からなるｄｓＲＮＡは、全体としてリボヌクレオチドからなるかまたはデオキシリボヌクレオチドの領域に対して相補的なリボヌクレオチドの領域を含む。あるいは、ｄｓＲＮＡは相互に相補性の領域を有する２つの異なる鎖を含みうる。様々な実施形態では、両方の鎖が全体としてリボヌクレオチドからなるか、一方の鎖が全体としてリボヌクレオチドからなりかつ一方の鎖が全体としてデオキシリボヌクレオチドからなるか、または一方もしくは両方の鎖がリボヌクレオチドとデオキシリボヌクレオチドの混合物を含む。望ましくは、相補性の領域は少なくとも７０、８０、９０、９５、９８もしくは１００％の相補性を示す。望ましくは、二本鎖の高次構造内に存在するｄｓＲＮＡの領域は、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、７５、１００、２００、５００、１０００、２０００もしくは５０００個のヌクレオチドを含むか、またはｄｓＲＮＡ内に現れている標的ウイルスＲＮＡ内または標的ｃＤＮＡ内の全ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡは一本鎖末端などの任意の一本鎖領域を含まないか、またはｄｓＲＮＡは一本鎖「ループ」領域によって分離された二本鎖「ステム」の高次構造をとる自己相補性の領域を含むヘアピンである。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡ分子内部のおよび／または１、２、３、４、５、８、１０個もしくはそれより多数のヌクレオチドの３’および／または５’のオーバーハングを含む様々な位置に１つもしくは複数の一本鎖領域を有する。望ましいＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、アンチセンス鎖または領域である（例えば標的核酸に対して少なくとも７０、８０、９０、９５、９８もしくは１００％の相補性を有する）ＤＮＡ鎖または領域であり、かつセンス鎖または領域である（例えば標的核酸に対して少なくとも７０、８０、９０、９５、９８もしくは１００％の同一性を有する）ＲＮＡ鎖または領域を含む。様々な実施形態では、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、例えば本明細書に記載または２０００年４月１９日に出願された国際公開第００／６３３６４号パンフレットもしくは１９９９年４月２１日に出願された米国特許出願第６０／１３０，３７７号明細書に記載の酵素法または化学合成法を用いてインビトロで作製される。他の実施形態では、インビトロで合成されたＤＮＡ鎖は、ＤＮＡ鎖の細胞への形質転換の前、後またはそれと同時にインビボもしくはインビトロで作製されたＲＮＡ鎖と複合体を形成する。さらに他の実施形態では、ｄｓＲＮＡはセンスおよびアンチセンス領域を含む単一の環状核酸であるか、またはｄｓＲＮＡは環状核酸と第２の環状核酸もしくは線状核酸とを含む（例えば、２０００年４月１９日に出願された国際公開第００／６３３６４号パンフレットもしくは１９９９年４月２１日に出願された米国特許出願第６０／１３０，３７７号明細書を参照）。例示的な環状核酸には、ヌクレオチドの遊離５’ホスホリル基がループバックの様式で別のヌクレオチドの２’水酸基に連結されるに至る投げ縄構造を含む。

他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、糖における２’位置が、対応する２’位置が水素もしくは水酸基を含有する場合に対応するｄｓＲＮＡと比べてインビトロまたはインビボでｄｓＲＮＡの半減期を増加させるハロゲン（フッ素基など）またはアルコキシ基（メトキシ基など）を含有する、１つもしくは複数の修飾ヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、自然発生的なリン酸ジエステルの連結以外の近接ヌクレオチド間の１つもしくは複数の連結を含む。かかる連結の例として、ホスホラミド、ホスホロチオエートおよびホスホロジチオエート連結が挙げられる。ｄｓＲＮＡは、米国特許第６，６７３，６６１号明細書において教示された化学的に修飾された核酸分子でもありうる。他の実施形態では、例えば２０００年４月１９日に出願された国際公開第００／６３３６４号パンフレットまたは１９９９年４月２１日に出願された米国特許出願第６０／１３０，３７７号明細書によって開示された如く、ｄｓＲＮＡは１つもしくは２つのキャッピングされた鎖（ｃａｐｐｅｄ ｓｔｒａｎｄｓ）を含有する。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡは、例えば、調節配列（例えば、転写因子結合部位、プロモーター、またはｍＲＮＡの５’もしくは３’ＵＴＲ）または本発明などの場合、ウイルスゲノムの非コーディング鎖のＲＮＡ配列といったコード配列または非コード配列を含む。さらに、ｄｓＲＮＡは、２０００年４月１９日に出願された国際公開第００／６３３６４号パンフレット（例えば８−２２頁を参照）において開示された少なくとも部分的にｄｓＲＮＡである分子のいずれか、ならびに２００２年７月３１日に出願された米国仮特許出願第６０／３９９，９９８号明細書および２００３年７月３１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２４０２８号明細書と；２００２年１０月１８日に出願された米国仮特許出願第６０／４１９，５３２号明細書および２００３年１０月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３３４６６号明細書において記載のｄｓＲＮＡ分子のいずれかでありうる。ｄｓＲＮＡのいずれかは、本明細書に記載の方法あるいは例えば２０００年４月１９日に出願された国際公開第００／６３３６４号パンフレット（例えば１６−２２頁を参照）に記載の標準的方法を用い、インビトロまたはインビボで発現されうる。

ｄｓＲＮＡをコードする発現コンストラクトを細胞にトランスフェクトすることによってｄｓＲＮＡが脊椎動物細胞に供給される場合を含む、ｄｓＲＮＡ分子がｄｓＲＮＡをコードする発現コンストラクトから転写される場合に特に、逆位反復配列を有する一本鎖ＲＮＡがｄｓＲＮＡのヘアピン構造をより効率的に形成することから、単分子のヘアピンｄｓＲＮＡをコードするｄｓＲＮＡ「ヘアピン」用コンストラクトは、一部の応用において二本鎖のｄｓＲＮＡ（すなわちセンス領域を有する１個のＲＮＡ分子とアンチセンス領域を有する別のＲＮＡ分子とからなるｄｓＲＮＡ）をコードするコンストラクトよりも望ましい。この効率の向上は、二本鎖のｄｓＲＮＡを生成する収束的プロモーター（ｃｏｎｖｅｒｇｉｎｇ ｐｒｏｍｏｔｏｒ）を含有するベクター内で生じる転写干渉の発生に部分的に起因する。転写干渉が各ＲＮＡ鎖の不完全な合成をもたらすことにより、相互に塩基対合して二本鎖を形成することが可能な完全なセンス鎖およびアンチセンス鎖の数が減少する。転写干渉は、必要があれば、（ｉ）１つのベクターがセンスＲＮＡをコードしかつ第２のベクターがアンチセンスＲＮＡをコードする場合の２種のベクター系、（ｉｉ）同一のプラスミドによるが別々のシストロンの使用を介してコードされる個々の鎖を有するバイシストロニックベクター、または（ｉｉｉ）ヘアピンｄｓＲＮＡ、すなわちセンスおよびアンチセンス配列が同じＲＮＡ分子内でコードされる場合のＲＮＡをコードする単一のプロモーター用ベクターを使用することによって克服可能である。ヘアピン発現ベクターは、二本鎖ベクターと比べていくつかの利点を有する。例えば、二本鎖ＲＮＡをコードするベクターでは、ＲＮＡ鎖は、転写直後にそれらに相補的な相手を見出しかつそれらと塩基対合を形成する必要がある。もしこのハイブリダイゼーションが生じない場合、個々のＲＮＡ鎖は転写鋳型から離散し、アンチセンス鎖に対するセンス鎖の局所濃度が低下する。細胞内で転写されるＲＮＡの場合、細胞当たりの鋳型のレベルの低下に起因し、この効果はインビトロで転写されるＲＮＡと比べて高まる。さらに、ＲＮＡは最近傍則によって折り畳み、同時転写によって折り畳まれた（すなわち、それらが転写される際に折り畳まれた）ＲＮＡ分子を生成する。したがって、完成したＲＮＡ転写産物の数パーセントは、これらの分子で分子内塩基対を形成することから、相補的な第２のＲＮＡと塩基対合することができない。かかる使用不能な分子の百分率は、それらの転写後、経時的に増大する。これらの分子は、既に安定に折り畳まれた構造をなすことから二本鎖を形成する可能性は全くない。ヘアピンＲＮＡでは、ＲＮＡ配列は通常、その相補的なＲＮＡと物理的に極めて接近している。ＲＮＡ構造が静的でないことからＲＮＡが一時的にほどける際、その相補配列は直ちに利用可能であり、それがあまりに近接していることから塩基対形成を担うことが可能である。ヘアピン構造は、一旦形成されると、元の非ヘアピン構造よりも安定であることが予測される。例えば、２００２年７月３１日に出願された米国特許出願第６０／３９９，９９８Ｐ号明細書；および２００３年７月３１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００３／０２４０２８号明細書、「Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」に教示されるが如く、ｄｓＲＮＡヘアピンを形成するためのＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって伸長されうる部分的なヘアピンである「フォースド（ｆｏｒｃｅｄ）」ヘアピンコンストラクト；ならびに２００２年１０月１８日に出願された米国特許出願第６０／４１９，５３２号明細書および２００３年１０月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３３４６６号明細書、「Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ，ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」に教示されるが如く、ミスマッチ領域を有するヘアピンである「アダリー（ｕｄｄｅｒｌｙ）」構成のヘアピンおよび多重エピトープコンストラクトが特に望ましい。後者の出願は、特に、複数の短いヘアピンｄｓＲＮＡ分子を含む１種もしくは複数種を発現するのに特に重要な方法および組成物を提供し、それらの各々は、本明細書で教示される原理および方法を用い、選択されたウイルス鎖、例えば正鎖のＨＣＶのマイナス鎖を標的にするように設計可能である。一部の態様では、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、「ヘアピンｄｓＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡヘアピン」、「短いヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」、すなわち約４００〜５００ヌクレオチド（ｎｔ）未満、好ましくは１００〜２００ｎｔ未満のＲＮＡ分子であり、その中では少なくとも１５〜１００個のヌクレオチド（好ましくは１７〜５０ｎｔ、より好ましくは１９〜２９ｎｔ）からなる少なくとも１つのストレッチと同じＲＮＡ分子（単一のＲＮＡ鎖）上に位置する相補配列とが塩基対を形成し、そこでは該配列および相補配列が、塩基相補性をなす２つの領域によって創出されるステム構造の上部で一本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７個のヌクレオチド（好ましくは約９〜約１５個のヌクレオチド）の不対領域によって分離される。ｓｈＲＮＡ分子は、阻害されるべき標的配列に対して相同性および相補性を示す、約１７〜約１００ｂｐ；約１７〜約５０ｂｐ；約４０〜約１００ｂｐ；約１８〜約４０ｂｐ；または約１９〜約２９ｂｐの二本鎖ステム領域と、塩基相補性をなす２つの領域によって創出されるステム構造の上部で一本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７個のヌクレオチド、好ましくは約９〜約１５個のヌクレオチドの不対ループ領域とを含む少なくとも１つのステムループ構造を含む。しかし、ある配列とその直後にその反転相補体を含むＲＮＡ分子がたとえ不適切な「スタッファー（ｓｔｕｆｆｅｒ）」配列によって分離されない場合であってもステムループ高次構造をとる傾向があることから、「ループ領域」または「ループ配列」を含める必要が厳密にはないことが理解されるであろう。例えば、もし選択されたエフェクター配列およびエフェクター相補体が十分に長い場合、それらは、立体的制約が不対「ループ」を強いることで、３個もしくは４個のヌクレオチドによって分離される少なくとも１９〜２１ｎｔの長さの二本鎖ステム領域を形成することになる。含まれるｓｈＲＮＡは、二重またはバイ・フィンガーおよびマルチフィンガーのヘアピンｄｓＲＮＡであり、ここでＲＮＡ分子は、一本鎖スペーサー領域によって分離された２つ以上のかかるステムループ構造を含む。一態様では、本発明は、ヒト疾患を誘発するウイルス、例えば本明細書に記載の一本鎖ＲＮＡウイルス由来のＲＮＡ配列に相同性を有する複数のｓｈＲＮＡ分子の発現を制御する、複数のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、好ましくはヒトまたは哺乳類のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むベクター組成物を提供する。複数のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、同一または異なっていてもよい。本発明は、ｄｓＲＮＡのストレス応答を引き起こすことなく、２、３、４、５つもしくはそれより多数の独立したウイルス配列要素を使用してウイルス複製を阻害する遺伝的に安定な様式で、治療量および持続量として２、３、４、５つもしくはそれより多数の異なる抗ウイルス性のｄｓＲＮＡヘアピン分子を宿主細胞に送達する手段を提供する。一態様では、各ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター配列は、異なるｄｓＲＮＡヘアピン分子をコードする配列に対して作動可能に連結される。有利には、少なくとも１、２、３つもしくはそれより多数の抗ウイルス逆鎖複製中間体を標的にする（例えば、ＨＣＶマイナス鎖または抗ゲノム鎖を標的にする）ｄｓＲＮＡエフェクター分子を含む、３、４、５、６種もしくはそれよりも多種のｄｓＲＮＡエフェクター分子、例えばヘアピンｄｓＲＮＡが、単独であるいはゲノムＲＮＡ鎖を標的にする（例えば、ＨＣＶのプラス鎖ＲＮＡまたはゲノム鎖ＲＮＡを標的にする）、１、２、３、４、５、６種もしくはそれより多種の抗ウイルス性のｄｓＲＮＡエフェクター分子（例えばｄｓＲＮＡヘアピン）と組み合わされて投与される。

一態様では、１つもしくは複数のポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、一本鎖領域によって分離される本発明の２種以上のｓｈＲＮＡ（各々がステムループ構造を含む）を含むバイ・フィンガーの（ｂｉ−ｆｉｎｇｅｒｅｄ）または二本鎖のｄｓＲＮＡのヘアピン分子を形成するＲＮＡ転写産物を発現する。２種以上のｓｈＲＮＡは、同一ウイルスあるいは異なるウイルスの同一鎖または異なる鎖の同一配列もしくは異なる配列を標的にし得る。

一態様では、ヘアピンｄｓＲＮＡの自己相補性の領域または二本鎖のｄｓＲＮＡの二本鎖領域は、（望ましくはヘアピンｄｓＲＮＡ内の一本鎖ループ領域によって連結される）エフェクター配列およびエフェクター相補体を含むことになる。エフェクター配列またはエフェクター鎖は、ＲＩＳＣ内に取り込まれるかまたはそれと結合する二本鎖領域または二本鎖における鎖である。

「発現ベクター」とは、例えばＲＮＡを転写するのに使用されるプロモーターなどの成分を含む任意のベクター、例えば目的の下流遺伝子またはコードもしくは非コード領域（例えば、タンパク質をコードするｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡ断片、またはウイルスゲノム鎖ＲＮＡもしくは抗ゲノム鎖ＲＮＡをコードする配列を例とする目的の任意のＲＮＡ、場合によって例えばコード領域の外部に位置する配列に作動可能に連結された本明細書に記載のコードおよび／もしくは非コード配列、アンチセンスＲＮＡコード領域、ｄｓＲＮＡコード領域、あるいはコード領域の外部に位置するＲＮＡ配列）に作動可能に連結された少なくとも１種のプロモーターを含むベクターを意味する。本明細書で使用される「発現コンストラクト」は、ｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現において使用される成分、例えばプロモーターに作動可能に連結されたｄｓＲＮＡエフェクター分子をコードする配列を含む任意の発現ベクターを意味する。発現コンストラクトのレシピエント細胞へのトランスフェクションまたは形質転換により、細胞が発現コンストラクトによってコードされるｄｓＲＮＡを発現することが可能である。発現コンストラクトは、例えばバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、もしくはヘルペスウイルス由来の、遺伝子操作されたプラスミド、ウイルス、または人工染色体でありうる。発現コンストラクトは、生体細胞内で複製可能である必要はないが、合成的に作製されうる。ｄｓＲＮＡヘアピン分子を含む二本鎖ＲＮＡの発現にとって好ましい発現ベクターは、米国仮特許出願第６０／４９７，３０４号明細書、２００５年５月６日に公開された国際公開第２００５／０４０３８８号パンフレット、ＵＳ／ＰＣＴ２００４／０２６９９９号明細書「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ」、２００４年８月２３日および２００４年１１月２２日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第６０／３６２２６０号明細書および第６０／６２９９４２号明細書、ならびに２００５年８月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００５／２９９７６号明細書「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ Ｐｒｏｍｏｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」に記載されている。「インビボ」という用語は、組織培養系を含みかつ単細胞、組織、器官もしくは多細胞生物の内部の、細胞ＤＮＡまたはＲＮＡの複製機構が無傷である任意の系を含むことを意図している。

「感染」、「感染された」、「ウイルス感染」、または「ウイルス感染された」とは、ウイルスによる宿主生物、宿主組織、または宿主細胞への侵入を意味する。例えば、感染は動物の身体の内外に常在するウイルスの過剰な成長または動物の内外に常在しないウイルスの成長を含みうる。より一般的には、ウイルス感染はウイルス集団の存在によって宿主生物が傷害されつつある任意の状況でありうる。したがって、過剰量のウイルス集団が生物の内外に存在するか、またはウイルス集団の存在によって生物の細胞もしくは他の組織が傷害されつつある場合、生物はウイルス感染に「かかっている（ｓｕｆｆｅｒｉｎｇ）」。

本発明の方法に関連したウイルス感染は、プラス鎖またはマイナス鎖のクラスの一本鎖ＲＮＡウイルスの集団のメンバーである１種もしくは複数種の以下のウイルスによる感染である。プラス鎖ウイルスには、（重症急性呼吸器症候群（ＳＡＲＳ）を誘発する作用物質によって例示される）ヒトコロナウイルス；ウエストナイル脳炎ウイルス（ＶＮＶ）、日本脳炎（ＪＥ）ウイルス、マーレーバレー脳炎（ＭＶＥ）ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）を含むフラビウイルス；デング熱ウイルス、風疹ウイルス、ノーウォークウイルスなどのカリシウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、コクサッキーウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルスおよび口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）が含まれる。マイナス鎖ウイルスには、インフルエンザウイルス、エボラおよびマールブルグウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、狂犬病ウイルスおよび水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が含まれる。両センスウイルス（ａｍｂｉｓｅｎｓｅ ｖｉｒｕｓｅｓ）として知られる一本鎖ＲＮＡウイルスの別のクラスは、ラッサ熱ウイルスおよびハンタウイルス（出血熱ウイルス）によって例示される。上記ウイルスによる感染は、数種の伝染経路、ある種の好ましい経路またはそれ以外の複数の経路を介して生じる可能性がある。皮膚または粘膜表面（例えば、膣、鼻腔もしくは口）への侵入により、感染した個体の体液（例えば、血液、唾液もしくは粘液）が摂取されるかまたは吸入される、あるいは別の個体に導入される場合に感染は起こりうる。したがって、これらのウイルスの中には、感染した個体との直接的接触またはエアロゾル化されたウイルス粒子の吸入によって伝染可能なものがある。さらにこれらのウイルスの中には、一般の表面、食料などの環境下で構造完全性および感染特性を保持し、間接的接触を通して伝染可能なものがある一方、感染した個体または生物との直接的接触を必要とするものもある。これらのウイルスの中には、蚊または齧歯類などの非ヒト種から直接にヒトへ伝染可能なものがある一方、伝染される可能性がないものもある。

ウイルス複製を停止させるか阻害するために本明細書において開示される方法を用いることで、既にウイルスに感染した被験者を治療することが可能である。さらに、本明細書において開示される方法は、もし本発明の医薬製剤が初期感染に先立って投与される場合、予防的な様式で利用されうる。ＨＣＶなどの慢性感染の治療は、本発明における特に有用な方法である。長期間にわたって１種もしくは複数種、好ましくは極めて多種のｄｓＲＮＡエフェクター分子を細胞に供給し続けるｄｓＲＮＡ発現コンストラクトは、特に予防的適用および慢性感染にとって望ましい。「調節する」とは、増減のいずれかによって変化させることを意味する。本明細書で使用される如く、望ましくはｄｓＲＮＡエフェクター分子は、ウイルス複製用の１つもしくは複数の間接アッセイによる測定によると、細胞内でのウイルス複製を、標的ウイルスの正常な複製レベルと比べて少なくとも２０％、より望ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％もしくは７５％、および最も望ましくは少なくとも９０％低下させる。一本鎖ＲＮＡウイルスの「逆」鎖複製中間体（抗ゲノム鎖）、すなわちＨＣＶを例とするプラス鎖ＲＮＡウイルスのマイナス鎖複製中間体、またはマイナス鎖ＲＮＡウイルスのプラス鎖の極性を有する非ｍＲＮＡセグメントを標的にする本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、望ましくはウイルス複製を、より多数の鎖に特異的なｄｓＲＮＡエフェクター分子の等価物を用いて得られたウイルス複製レベルにおける低下と比べて少なくとも２０％、より望ましくは少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、および最も望ましくは少なくとも９０％、９５％もしくは１００％低下させる。

一部の態様では、逆鎖を標的にするｄｓＲＮＡ分子（例えばＨＣＶマイナス鎖を標的にするｄｓＲＮＡ）は、抗ゲノムＲＮＡ鎖のレベルを直接的に低下させるが、ウイルスのゲノムＲＮＡ鎖（例えばＨＣＶゲノムＲＮＡ鎖）のレベルに対して（抗ゲノム鎖鋳型のレベルの低下が鋳型から作られるゲノムＲＮＡ鎖のレベルの低下を招くことから間接的な効果はありうるが）直接的な作用を全く有しないことになる。本発明の一部の態様では、逆鎖を標的にするｄｓＲＮＡ分子は、抗ゲノムＲＮＡ鎖のレベルを直接的に低下させかつゲノムＲＮＡ鎖のレベルについてもより少ない程度に直接的に低下させうる。有効な逆鎖を標的にするｄｓＲＮＡ分子は、エフェクター相補体と比べてＲＩＳＣと優先的に結合するエフェクター配列を含み、ここで「優先的に」ＲＩＳＣと結合するエフェクター配列とは、他方の鎖と比べて５０％、６０％、７０％、８０％、９０％よりも大きい範囲までＲＩＳＣと結合する核酸配列を意味する。その結果、標的にされたＲＮＡ鎖のレベルが低下することになる。一本鎖ＲＮＡウイルスの「逆」鎖複製中間体（抗ゲノム鎖）のレベルにおけるこの低下は、独立的または直接的なものであり、ＲＩＳＣ上に負荷されている一部のエフェクター相補体配列から生じうるより多数のＲＮＡ鎖またはゲノムＲＮＡ鎖における低下に対する二次的なものではない。ＨＣＶの構造遺伝子（Ｅ２）および非構造遺伝子（ＮＳ３およびＮＳ５Ｂ）を標的対象とするｓｉＲＮＡ分子がＨＣＶのコアおよびＮＳ５Ａタンパク質の発現を低下させるとともに、複製の負鎖のＨＣＶ ＲＮＡの合成を阻害することが報告されている（プラブ（Ｐｒａｂｈｕ）ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｖｉｒｏｌ．７６（４）：５１１−９頁（２００５年））。負鎖または抗ゲノムＲＮＡの合成における鋳型として機能するＨＣＶコーディング鎖（ＨＣＶゲノムＲＮＡ）におけるＲＮＡｉ媒介性の分解があると、負鎖レベルにおける二次的または間接的な低下がもたらされることが予想される点で、これは想定外ではない。それに対し、本発明の逆鎖を標的にするｄｓＲＮＡ分子（例えば、ＨＣＶマイナス鎖を標的にするｄｓＲＮＡ）は、ゲノムまたは多数のＲＮＡ鎖に対する作用に対して二次的な任意の低下とは独立に、ＲＮＡｉを介して抗ゲノムＲＮＡ鎖のレベルを直接的に低下させるであろう。

一部の応用では、ウイルス複製用の１つもしくは複数の間接アッセイによる測定によると、標的ウイルスの正常な複製レベルと比べてウイルス複製における少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７５％、および最も望ましくは少なくとも９０％、９５％もしくは１００％の低下を得ることを目的に、ウイルスの「逆」鎖複製中間体（抗ゲノム鎖）を標的にする本発明の１種、２種、３種、４種もしくはそれより多種のｄｓＲＮＡエフェクター分子が、ウイルスゲノムＲＮＡ鎖を標的にする１種、２種、３種もしくはそれより多種のｄｓＲＮＡエフェクター分子とともに細胞に提供される。これらのアッセイは、典型的には感染細胞内に存在するマイナス鎖および／またはプラス鎖のウイルスＲＮＡのレベルを測定可能なノーザンブロッティングを含みうる。ノーザンブロッティングに加えてまたはそれの代わりにＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）アッセイを用い、高感度および高精度でＲＮＡ鎖を定量することも可能である。ウイルス複製は、典型的には「プラークアッセイ」を用いても測定され、そこではウイルス粒子の採取のために対象の感染細胞が処理され、別の細胞セットを感染させて細胞培養プレート内で形成されたウイルスプラークを計数することにより、回収された機能的ウイルス粒子の数が測定される。その教示内容は本明細書において参照により援用される、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ｆｏｒ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡｉ Ｔａｒｇｅｔｓ ａｎｄ Ｅｆｆｅｃｔｏｒ Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ」、２００４年９月１０日に公開された国際公開第２００４／０７６６２９号パンフレットも参照のこと。組織培養におけるＨＣＶウイルスの複製によって問題が起きていたが、現在ではＨＣＶ複製について研究しかつ抗ＨＣＶ活性を評価するのに適するＨＣＶレプリコン系を利用することが可能である。例えば、ピーチュマン（Ｐｉｅｔｓｃｈｍａｎｎ）ら、２００２年、Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．７６：４００８−４０２１頁；チョン（Ｚｈｏｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１０２（２６）：９２９４−９９頁（２００５年）を参照し、アパス（Ａｐａｔｈ）、ＬＬＣ、ミズーリ州セントルイス（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ）も参照のこと。

「複数のセキトープ（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｓｅｑｕｉｔｏｐｅ）ｄｓＲＮＡ」または「マルチセキトープ（ｍｕｌｔｉｓｅｑｕｉｔｏｐｅ）ｄｓＲＮＡ」とは、複数の標的核酸由来のセグメントを有するかまたは同じ標的核酸由来の非近接セグメントを有するＲＮＡ分子を意味する。例えば、複数のセキトープｄｓＲＮＡは、（ｉ）単一の生物の複数の遺伝子を示す配列、例えば同じ標的病原体由来の複数の遺伝子；（ｉｉ）種々の異なる生物由来の１つもしくは複数の遺伝子を示す配列；および／または（ｉｉｉ）特定の遺伝子の異なる領域を示す配列（例えば、プロモーターおよび／または他の調節領域由来の１つもしくは複数の配列およびｍＲＮＡ由来の１つもしくは複数の配列）を由来とするセグメントを有しうる。望ましくは、各セグメントは標的核酸の対応する領域に対して実質的な配列同一性を有する。様々な望ましい実施形態では、標的核酸に対して実質的な配列同一性を有するセグメントは、長さが少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、１００、２００、５００、７５０個もしくはそれより多数の塩基対であり、望ましくは長さが１９〜３０、１９〜２７、または１９〜２５個の塩基対である。一部の実施形態では、複数のエピトープｄｓＲＮＡは、自然発生的な５’から３’への順序をもつセグメント内に存在するかまたは存在しなくてもよい同じ標的遺伝子由来の非近接セグメントを有し、そのｄｓＲＮＡはセグメントのうちの１つしか有しないｄｓＲＮＡよりも少なくとも２５、５０、１００、２００、５００もしくは１０００％多くの複製を阻害する。

２００２年１０月１８日に出願された米国特許出願第６０／４１９，５３２号明細書および２００３年１０月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００３／０３３４６６号明細書に教示された複数のエピトープまたはマルチセキトープ二重鎖ＲＮＡのアプローチの利点は、本発明の保存配列の利用に適用可能である。ｄｓＲＮＡの唯一の種が多数の標的遺伝子（例えば、複数の病原体由来の遺伝子、単一の病原体由来の複数の遺伝子または配列、あるいは複数の疾患に関連する遺伝子）に対して同時にサイレンシング可能であることから、複数のエピトープｄｓＲＮＡを、同一被験者における多数の異なる徴候のために使用するかまたは一被験者におけるある部分の徴候および別の被験者における別の部分の徴候のために使用することが可能である。かかる応用にとって、ｄｓＲＮＡのストレス応答を誘発することなく長いｄｓＲＮＡ分子（例えば、複数の遺伝子由来の配列を有するｄｓＲＮＡ分子）を発現する能力は極めて望ましい。例えば、かかる配列の全長が選択されたプラスミドの最大容量（例えば長さが２０キロベース）内にある程度の、各々が例えば１９〜２１個程度に短いヌクレオチド、望ましくは１００〜６００個のヌクレオチド、または優に最大で１、２、３、４、５キロベースもしくはそれより多数である一連の配列を使用することにより、単一のかかる医薬組成物は、多数の病原体および／または毒素に対する保護を比較的低コストおよび低毒性で提供することが可能である。

特定の病原体の複数の遺伝子に対するサイレンシング能力により、「エスケープミュータント（ｅｓｃａｐｅ ｍｕｔａｎｔ）」の遺伝的選択が阻止される。それに対し、１つの遺伝子またはタンパク質を標的にするだけの典型的な小分子治療または免疫療法により、標的遺伝子またはタンパク質における突然変異を維持している病原体の選択がもたらされることから、病原体が治療に対して耐性をもつようになる。本発明の複数のエピトープのアプローチを用いて病原体の多数の遺伝子または配列および／または病原体の拡張領域を同時に標的にすることにより、かかる「エスケープミュータント」の出現が有効に防止される。真のＨＣＶの負鎖の抗ゲノムＲＮＡなどの逆鎖ウイルスＲＮＡを標的にするように設計された本発明のｄｓＲＮＡ分子により、新たな一連の標的および新たな一連の抗ウイルス分子を、単独でかつウイルスゲノムＲＮＡを標的にするｄｓＲＮＡと協調して、ならびに他の抗ウイルス物質とともに使用することが可能になる。好ましい実施形態では、ウイルスＲＮＡの保存領域が標的にされることになる。例えば一態様では、ＨＣＶの抗ゲノム負鎖の保存配列を標的にする１種もしくは複数種のｄｓＲＮＡ分子、および一部の実施形態では、コード配列と非コード配列の双方、例えば５’ＵＴＲ（ＩＲＥＳ）、コア、ＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａ、ＮＳ５Ｂおよび３’ＵＴＲを含む、ゲノムのプラス鎖ＲＮＡの保存配列を標的にする１種もしくは複数種の追加的ｄｓＲＮＡ分子を含む極めて多数のｄｓＲＮＡ分子をＨＣＶに感染したヒト細胞または生物に提供することが望ましい場合がある。一態様では、ＨＣＶ ５’ＵＴＲ（−）鎖の１つもしくは複数の保存配列を標的対象とする１種もしくは複数種のｄｓＲＮＡと；５’ＵＴＲ（＋）鎖の１つもしくは複数の保存配列を標的対象とする１種もしくは複数種のｄｓＲＮＡと；３’ＵＴＲ（−）鎖の１つもしくは複数の保存配列を標的対象とする１種もしくは複数種のｄｓＲＮＡと；３’ＵＴＲ（＋）鎖の１つもしくは複数の保存配列を標的対象とする１種もしくは複数種のｄｓＲＮＡと；場合によって、ＨＣＶ（＋）のコア、ＮＳ３、ＮＳ４Ｂ、ＮＳ５Ａおよび／またはＮＳ５Ｂ配列を標的にする１種もしくは複数種のｄｓＲＮＡと；場合によって、例えばインターフェロンアルファ−２ａ＋リバビリン、ペグインターフェロンアルファ−２ｂなどのＨＣＶに対して活性を示す１種もしくは複数種の他の抗ウイルス性分子とからなる群から選択される極めて多数のｄｓＲＮＡ分子が使用される。

かかる極めて多数のｄｓＲＮＡが、外因性に合成され、場合によって化学的に修飾されたｄｓＲＮＡの「カクテル」として送達される場合でも、かかるｄｓＲＮＡ分子をコードする１種もしくは複数種の発現ベクター、例えば１種もしくは複数種の多重ポリメラーゼＩＩＩプロモーターの発現コンストラクトを介して脊椎動物細胞、組織または生物に供給される場合でも、かかる種々の抗ウイルス物質の利用可能性は、ヒト集団内と一時的に突然変異事象の結果としての宿主内の双方でのウイルス変異体の性質に基づく、有効な抗ウイルス治療の設計にとって重要である。例えば、本発明のこの態様は、ウイルス阻害のレベルが増強され、かつウイルスにおいて生じ、ウイルス複製のｄｓＲＮＡ阻害を無効にする複数の独立の突然変異事象があっても極めて少ないように、数種の異なるｄｓＲＮＡウイルス阻害剤分子を含む多剤レジメンを宿主生物の脊椎動物における細胞または組織に送達するための手段を提供する。多数のｄｓＲＮＡ療法を例とする多剤レジメンを提供するこの能力は、極めて高い突然変異率を有するＲＮＡウイルスに対して特に重大である。

「核酸組成物」または「ヌクレオチド」組成物とは、１種もしくは複数種のリン酸分子が炭水化物（例えばペントースもしくはヘキソース）と結合され、次いでプリン（例えばアデニン）およびピリミジン（例えばチミン）由来の塩基と結合される、任意の１種もしくは複数種の化合物を意味する。特定の自然発生的な核酸分子には、ゲノムのデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および宿主のリボ核酸（ＲＮＡ）、ならびにメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を例とする後者の数種類の異なる形態が含まれる。異なるＲＮＡ分子に対して相補的な異なるＤＮＡ分子（ｃＤＮＡ）もまた含まれる。合成されたＤＮＡまたはその自然発生的なＤＮＡとのハイブリッド、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）分子（ガムバリ（Ｇａｍｂａｒｉ）、Ｃｕｒｒ．Ｐｈａｒｍ．Ｄｅｓ．７：１８３９−６２頁（２００１年））についても使用することが可能である。

所望の核酸分子がＲＮＡである場合、本明細書で提供される配列内のＴ（チミン）がＵ（ウラシル）と置き換えられると考えられる。例えば、本明細書では、ＤＮＡ配列として配列番号１〜配列番号５９が開示される。任意の上記配列番号由来の配列を含むＲＮＡエフェクター分子ではＴがＵと置き換えられることが一当業者にとっては明らかであろう。核酸は、典型的には２種以上の共有結合された、自然発生的なもしくは修飾されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を有する。修飾された核酸には、例えば、ペプチド核酸、天然由来でない塩基および化学的に修飾された塩基を有するヌクレオチドが含まれる。

「作動可能に連結される（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）」という用語は、核酸の発現制御配列（プロモーター、シグナル配列、エンハンサーまたは多数の転写因子結合部位など）と第２の核酸配列の間の機能的連結を示し、ここで発現制御配列は、適切な分子（例えば転写アクチベータータンパク質）が発現制御配列に結合される場合、第２の配列に対応する核酸の転写および／または翻訳に作用する。本発明のｄｓＲＮＡ分子をコードする発現コンストラクトは、転写されるべき核酸配列、例えばヘアピンｄｓＲＮＡ分子または二本鎖のｄｓＲＮＡのうちの一本鎖をコードする配列に作動可能に連結されるプロモーターを含むことになる。一態様では、２種、３種、４種もしくはそれより多種のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含むｄｓＲＮＡ発現コンストラクトは、該プロモーターの１種、２種、３種、４種もしくは各々に対して作動可能に連結された、本発明のｓｈＲＮＡまたはｄｓＲＮＡヘアピンをコードする核酸配列を含みうる。

本明細書に用いられる「逆鎖複製中間体」または「抗ゲノムＲＮＡ」は、プラス鎖ウイルスのマイナス鎖ＲＮＡ相補体またはマイナス鎖ウイルスのプラス鎖ＲＮＡ相補体の非ｍＲＮＡ配列を意味する。例えば、ＨＣＶは、複製の間に抗ゲノム負鎖ＲＮＡ（すなわち逆鎖複製中間体）の転写に対する鋳型として機能するプラス鎖（センス）のゲノムＲＮＡを有するプラス鎖ウイルスである。本明細書に開示される如く、ｄｓＲＮＡエフェクター分子は一本鎖ウイルスの逆鎖複製中間体の反転相補体を含む。したがって、例えば核酸配列ＡＴＡＧＣＴを含むプラス鎖ウイルスであれば、（３’から５’の方向、すなわちプラス鎖の相補体において読まれる）核酸配列ＴＡＴＣＧＡを含む逆鎖複製中間体を有する。したがって、逆鎖複製中間体上のこの配列を標的にするｄｓＲＮＡエフェクター分子であれば、逆鎖複製中間体の反転相補体、すなわち（５’から３’方向において読まれる）核酸配列ＡＴＡＧＣＴを含む。所望の複製中間体を標的にするこの反転相補体配列はエフェクター配列であり、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、エフェクター配列（そのエフェクター相補体に対して反対である）がＲＮＡｉを媒介するためのＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と確実に優先的に結合するように設計される。本発明の一部の好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、ＨＣＶを例とするプラス鎖ウイルスのマイナス鎖複製中間体を標的にするように設計される。

「プロモーター」とは、作動可能に連結された核酸分子の転写を誘導するのに十分な核酸配列を意味する。この定義には、細胞種特異的、組織特異的もしくは時間特異的な様式で制御可能なプロモーター依存性の遺伝子発現をもたらすのに十分であるかまたは外部シグナルもしくは外部物質によって誘導性を示すそれら転写制御因子（例えばエンハンサー）も含まれ、当業者に周知のかかる因子は、遺伝子の５’もしくは３’領域またはイントロン内部に認められうる。望ましくは、プロモーターは、核酸配列の発現を可能にするような方法で、ｃＤＮＡまたは遺伝子を例とする核酸配列に対して作動可能に連結される。本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現についての一部の実施形態では、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、２００４年８月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０４／２６９９９号明細書および２００３年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／４９７，３０４号明細書において教示されたプロモーター、複数区画発現系および複数区画プロモーター系、ならびに２００４年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６０３，６２２号明細書；２００４年１１月２２日に出願された第６０／６２９９４２号明細書；および２００５年８月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００５／２９９７６号明細書において教示されたプロモーターおよび複数のポリメラーゼＩＩＩプロモーター用発現コンストラクトが特に望ましい。

本明細書で用いられる「ＲＮＡエフェクター分子」は、一本鎖ＲＮＡウイルスの逆鎖複製中間体の反転相補体に相同性を示す少なくとも１９個の近接ヌクレオチドを含むリボ核酸配列を含む。一本鎖ウイルスの逆鎖複製中間体の反転相補体に相同性を示す該少なくとも１９個の近接ヌクレオチドが二本鎖の高次構造の中に存在することになる。本発明のＲＮＡエフェクター分子は、例えば、２本の別々の鎖を含むｄｓＲＮＡ二本鎖、あるいはステムループまたはヘアピン高次構造をとることが可能な自己相補的領域を含む単一のＲＮＡ鎖でありうる。より詳細には、所望のウイルスの抗ゲノムＲＮＡ鎖（すなわち逆鎖複製中間体）を標的にするために、ウイルス標的の反転相補体配列（すなわち、エフェクター鎖またはエフェクター配列））が、二本鎖の高次構造内に存在する、１９〜２７もしくは１９〜２９個のヌクレオチド（すなわち、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくは２９個のヌクレオチド）、好ましくは１９、２０もしくは２１個のヌクレオチドのｄｓＲＮＡ二本鎖の一部として、（細胞に提供され、細胞内での発現時、または細胞ヌクレアーゼによる切断後）細胞内に存在し、その５’末端の内部安定性が３’末端と比べた場合に低い二本鎖の一部となるように該エフェクター鎖が選択されることになる（コヴォロヴァ（Ｋｈｖｏｒｏｖａ）ら、Ｃｅｌｌ １１５：２０９−１６頁（２００３年））。これにより、ｄｓＲＮＡのエフェクター鎖がＲＮＡｉを媒介するＲＩＳＣ複合体と機能的に結合するという可能性が増大することになる。

「セキトープ」とは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と結合しかつそれを活性化することが可能な二本鎖ポリリボヌクレオチドの近接配列を意味し、これは通常、１９〜２７もしくは２９個の塩基対を含む近接配列である。かかる二本鎖セキトープは、エフェクター配列およびその反転相補体であるエフェクター相補体を含むことになる。ＨＣＶなどのプラス鎖の一本鎖ＲＮＡウイルスのマイナス鎖複製中間体（すなわち抗ゲノムＲＮＡ鎖）を標的にし、かつその逆にマイナス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスのプラス鎖（抗ゲノムＲＮＡ鎖）を標的にするセキトープを選択することが望ましい。エフェクター鎖とＲＩＳＣ複合体との結合をエフェクター相補体と比べて増強する種々の手段のいずれかによってこれを行うことが可能である。

本明細書で使用される「一本鎖ウイルス」または「一本鎖ＲＮＡウイルス」は、プラス鎖ＲＮＡまたはマイナス鎖ＲＮＡのゲノムを有するウイルスを意味する。「プラス鎖」とは、対応するウイルスｍＲＮＡと同じ極性を有するＲＮＡまたはウイルスタンパク質をコードするＲＮＡを意味する。プラス鎖ＲＮＡウイルスの非限定的な例として、ヒトコロナウイルス（ＳＡＲＳ病原体）、ウエストナイル脳炎ウイルス（ＷＮＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、デング熱ウイルス、ノーウォークウイルス、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎およびＥ型肝炎ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス（ＪＥ）、風疹ウイルス、コクサッキーウイルス、ならびに口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）が挙げられる。「マイナス鎖」とは、ウイルスタンパク質をコードする、対応するウイルス性ｍＲＮＡとは逆の極性を有するＲＮＡを意味する。マイナス鎖ＲＮＡウイルスの非限定的な例として、インフルエンザウイルス、エボラウイルス、マールブルグウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、麻疹ウイルス、ムンプスウイルス、狂犬病ウイルス、ならびに水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）が挙げられる。

「実質的な配列相補性」とは、ｄｓＲＮＡまたは他の生物活性を示す核酸と標的核酸分子の発現を阻害するための核酸に対する標的核酸分子との間にある十分な配列相補性を意味する。好ましくは、ｄｓＲＮＡの配列は標的核酸分子のある領域の配列に対して少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは１００％の相補性を示す。本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子を提供するために、望ましくは、標的ウイルス配列に対する相補性が１００％、すなわち標的ウイルス複製中間体ＲＮＡ（抗ゲノムＲＮＡ鎖）の１９〜２７、２８もしくは２９個のヌクレオチド配列に対する相補性、例えばＨＣＶのマイナス鎖複製中間体の配列に対する相補性が１００％である（すなわち反転相補体）、最低で１９もしくは２０個の近接ヌクレオチド（「エフェクター配列」）が与えられることになる。しかし、この「エフェクター配列」に必要とされる１００％の配列相補性に対し、ｄｓＲＮＡエフェクター分子のもう一方の鎖（「エフェクター相補体」）は、エフェクター配列に対して完全に相補性を示しうるかまたは最小数のミスマッチヌクレオチドを含み得、例えば、１個、２個もしくは３個のミスマッチヌクレオチドが、所望の末端自体が二本鎖の高次構造で残る限りにおいて、「エフェクター配列」の５’末端領域とハイブリダイズする「エフェクター相補体」の３’末端領域内に存在しうる。

「実質的な配列同一性」とは、ｄｓＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡと標的核酸分子の発現を阻害するためのｄｓＲＮＡまたはアンチセンス分子に対する標的核酸分子の間の十分な配列同一性を意味する。好ましくは、ｄｓＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡの配列は、標的核酸分子の領域の配列に対して少なくとも４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５もしくは１００％の同一性を示し、ｄｓＲＮＡ分子内に、好ましくは標的に対して完全な配列同一性を示す約１９〜約２５、２６、２７、２８もしくは２９個のヌクレオチド配列を含むことになる。好ましい実施形態では、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子の「エフェクター配列」鎖内に（反転相補体として）この配列同一性が存在することになる。

ヌクレオチド配列が実質的に同一であることの別の指標は、２つの分子がストリンジェントな条件下で相互にハイブリダイズするか否かである。ストリンジェントな条件は配列依存的であり、異なる環境下で異なることになる。一般にストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨでの特異的な配列に対する熱融解点よりも低く、約５℃〜約２０℃、通常は約１０℃〜約１５℃であるように選択される。熱融解点は、標的配列すなわち逆鎖複製中間体の５０％が完全マッチプローブに対してハイブリダイズする（規定のイオン強度およびｐＨ下での）温度である。典型的には、ストリンジェントな条件は、塩の濃度がｐＨ７．０で約０．０２モルでありかつ温度が少なくとも約６０℃である条件ということになる。例えば標準的なサザンハイブリダイゼーション法では、ストリンジェントな条件は、４２℃、６×ＳＳＣでの初期洗浄と、それに続く少なくとも約５５℃、典型的には約６０℃および時には約６５℃の温度、０．２×ＳＳＣでの１回もしくは複数回の追加洗浄を含むことになる。

「ウイルス感染を治療し、安定化し、または予防する」とは、ウイルス感染の初期発生または続発的な発生を予防するかまたは遅延させ、ウイルス感染の消失とその再発の間の疾患のない生存期間を増加させ、ウイルス感染に関連した有害症状を安定化するかまたは低減し、あるいはウイルス感染の進行を阻害するかまたは安定化することを意味する。これは感染物質による感染前の治療が確立される場合の予防的治療を含み、感染の重症度または持続期間について予防または低減する。好ましくは、治療対象の少なくとも２０、４０、６０、８０、９０もしくは９５％が、ウイルス感染のあらゆる証拠が少なくともある期間消失する場合の完全な緩和を経験する。別の態様では、治療の結果、進行するウイルス感染の少なくとも一部の徴候または症状における臨床的に意義のある低下、例えば、ウイルス負荷における顕著な低下、ウイルス性疾患に付随する肝酵素における顕著な低下、または疾患の調節に相関する機能における改善がもたらされることになる。別の実施形態では、患者がウイルス感染であると診断され、本発明の方法を用いて治療された後に生存する期間は、（ｉ）治療を受けていない患者が生存する平均期間、または（ｉｉ）別の治療法で治療された患者が生存する平均期間よりも、少なくとも２０、４０、６０、８０、１００、２００％もしくは５００％までも長い。「非翻訳領域」（「ＮＴＲ」）および「未翻訳領域」（「ＵＴＲ」）という用語は、本明細書では同義的に用いられ、ペプチドを作るために翻訳されることがない、ｍＲＮＡの５’から翻訳開始（ＡＴＧ）部位および３’から翻訳停止部位の配列を例とするコード配列ではない核酸配列を示す。

本発明の任意の態様では、感染細胞または標的細胞は脊椎動物細胞でありうる。望ましくは、脊椎動物細胞は哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞である。細胞はエクスビボまたはインビボでありうる。細胞は、癌細胞、幹細胞、免疫系の細胞、ニューロン細胞、筋肉細胞、または脂肪細胞を例とする生殖細胞または体細胞でありうる。一部の実施形態では、ダイサー（Ｄｉｃｅｒ）またはアルゴノート（Ａｒｇｏｎａｕｔ）などの遺伝子サイレンシングに関与する１種もしくは複数種のタンパク質が細胞または動物において過剰発現されるか活性化されることで、遺伝子発現の阻害量が増大する。好ましくは、細胞は哺乳類細胞、より好ましくはヒト細胞である。「標的細胞」には未感染細胞が含まれる。したがって、標的細胞はウイルス感染の予防が求められる場合の細胞でありうる。かかる標的細胞が本明細書において開示されるｄｓＲＮＡエフェクター分子を含む場合、かかる細胞内のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、これらの細胞が対応する一本鎖ウイルスによる感染状態になる場合、逆鎖複製中間体を標的にしうる。

意外なことに、ＨＣＶなどのプラス鎖ウイルスの逆鎖複製中間体ならびにマイナス鎖ウイルスの抗ゲノムプラス鎖、およびマイナス鎖ウイルスのマイナス鎖同様に、マイナス鎖の抗ゲノムプラス鎖の非ｍＲＮＡ配列を標的にするための核酸をベースとする抗ウイルス分子を設計することが望ましいことが発見されている。ｄｓＲＮＡエフェクター分子を、ＲＮＡｉ過程におけるエフェクター配列の関与を優先的に高める任意の手段により、例えば、かかるｄｓＲＮＡのエフェクター鎖におけるＲＮＡｉのＲＩＳＣメディエーターとのもしくはそれに対する親和性、結合性、または「負荷」を高めることにより、マイナス鎖複製中間体を標的にするように設計することが可能である。一本鎖ウイルスの逆鎖複製中間体を標的にするように設計されるかかる一方法は、レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３２６−３０頁（２００４年）；シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ら、Ｃｅｌｌ １１５：１９９−２０８頁（２００３年）；およびコヴォロヴァ（Ｋｈｖｏｒｏｖａ）ら、Ｃｅｌｌ １１５：２０９−１６頁（２００３年）によって記載の規則および観察結果を単純化したものに基づく。アマルズグイオウイ（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ）およびプリッツ（Ｐｒｙｄｚ）、「Ａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３１６：１０５０−１０５８頁（２００４年）；およびウイ・テイ（Ｕｉ−Ｔｅｉ）ら、Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：９３６−９４８頁（２００４年）もある。Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ Ｂｕｌｌｅｔｉｎ＃５０６、「ｓｉＲＮＡ Ｄｅｓｉｇｎ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ」、アムビオン（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）も参照のこと。しかし、アムビオン（Ａｍｂｉｏｎ）の使用説明書に教示された如く、ｓｉＲＮＡ分子を設計するための標的としてｍＲＮＡ（またはプラス鎖ゲノムＲＮＡ）を選択する代わりに、標的は、プラス鎖自体ではなく、ＨＣＶのようなプラス鎖一本鎖ＲＮＡウイルスの抗ゲノムＲＮＡ鎖（すなわち非コーディングＲＮＡ鎖）である必要がある。同様に、ダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）のｓｉＤＥＳＩＧＮ Ｃｅｎｔｅｒによると、使用者は機能的ｓｉＲＮＡ分子の設計のための出発点として「標的ｍＲＮＡヌクレオチド配列を同定する」ように課されている（ダーマコン（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｉｎｃ．）、コロラド州ラファイエッテ（Ｌａｆａｙｅｔｔｅ））。それに反し、出願人らは、ＨＣＶの負鎖を含む、一本鎖ＲＮＡウイルスの抗ゲノムＲＮＡ鎖のターゲティングにおいてより優れた結果を示している。ｄｓＲＮＡによる鎖に特異的なターゲティングは、ｄｓＲＮＡ分子内に存在するセンス鎖およびアンチセンス鎖が、ｄｓＲＮＡ媒介性の遺伝子サイレンシングの機構と結合し、および／またはそれを活性化するそれらの能力において機能的に等価ではないという発見に基づく。ｄｓＲＮＡ由来の一本鎖がＲＩＳＣとして知られるサイレンシング複合体と結合するかまたはそれの上に「負荷される」と考えられるが、鎖の５’末端で始まっており、ｄｓＲＮＡ内に存在する２本の各鎖が５’および３’末端を有することから、各々がＲＩＳＣ内に同程度に取り込まれるように思われる。しかし実際には、５’末端が熱安定性が低下した二本鎖内に存在する鎖がＲＩＳＣ内に取り込まれる可能性がより高いように見られる。これらの原理を用いることで、ウイルスの選択された鎖、望ましくは一本鎖ウイルスの逆鎖複製中間体、例えばＨＣＶなどのプラス鎖ウイルスの負鎖の抗ゲノムＲＮＡを優先的に標的にするｄｓＲＮＡエフェクター分子を設計することが可能である。

ｄｓＲＮＡエフェクター分子（ｄｓＲＮＡ分子の長さが１９〜２７個または１９〜２９個のヌクレオチド）は２つの末端を有することになる。本願の目的として、「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」、「末端（ｔｅｒｍｉｎｉ）」または「末端（ｅｎｄ）」は、ｄｓＲＮＡの二本鎖部分の両末端での２〜６個の塩基対、好ましくは３〜５個の塩基対を意味する。しかし、２つの末端配列のヌクレオチド組成物が異なることから、２つの末端が同一の熱安定性を有する可能性は低い。熱安定性がより低い末端では、その複合的な３’および５’末端に分かれる傾向が高まるであろう。理論または機構に拘束されることを望むものではないが、５’末端が３’末端と比べて熱安定性が低い二本鎖内に存在するＲＮＡ鎖がその相補鎖よりもＲＩＳＣ複合体に取り込まれる可能性が高いことは理にかなっている。例えば、アマルズグイオウイ（Ａｍａｒｚｇｕｉｏｕｉ）およびプリッツ（Ｐｒｙｄｚ）、「Ａｎ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ｓｉＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ」、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．３１６：１０５０−１０５８頁（２００４年）では、ｓｉＲＮＡの二本鎖の両末端における３、４、５および６個のヌクレオチドにおけるＡ／Ｕ対の数が評価され、二本鎖（ｄｓ）領域の（センス鎖に対する）５’および３’末端での末端の３個のヌクレオチドの間の正（好ましくは＋２もしくは＋３であるが少なくとも負ではない）のＡ／Ｕ含量の違いが、ウイ・テイ（Ｕｉ−Ｔｅｉ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３２：９３６−９４８頁（２００４年）において見出された、末端の７塩基対に対して類似の算出値と比べて機能性のより優れた予測因子であることが結論づけられた。オーバーハングの有無が活性に対する効果がほとんどないか全くないことが見出され、二本鎖領域の２つの末端の相対的安定性のみである。ｍＲＮＡ標的配列に対して分析が開始されるので、これらの原理によるｄｓＲＮＡの設計により、ＨＣＶのプラス鎖ゲノムＲＮＡなどのｍＲＮＡまたはセンス鎖ＲＮＡを標的にするｄｓＲＮＡ分子が得られることになる。それに対し、下記により詳細に記載される如く、出願人らは、プラス鎖のＣ型肝炎ウイルスの負鎖複製中間体（すなわち抗ゲノムＲＮＡ鎖）を標的にすることを目的とした類似の原理および検討事項をうまく適合させかつそれらを利用している。

ＲＮＡｉを促進するために望ましいウイルス鎖のターゲティングを行うためにこれらの観察結果を適合させかつ利用する能力が、ｄｓＲＮＡ配列変異体の実験的な置換において出願人らによって確認されている。本発明において鎖標的ｄｓＲＮＡを設計するのに用いられる特定の基準は、エフェクター鎖の５’末端（およびエフェクター相補体の３’末端）を含む末端の予測される熱安定性がエフェクター鎖の３’末端（およびエフェクター相補体の５’末端）を含む末端の熱安定性よりも低い必要があることを求める点である。これに関連して、５’もしくは３’「末端（ｅｎｄ）」または「末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）」は、３〜５個の塩基対の末端を意味する。当業者に既知の標準的公式の適用、またはｄｓＲＮＡエフェクター分子の２つの末端におけるより強力なＣ−Ｇ結合に対するより弱いＡ−Ｕ結合の相対数および相対位置の評価により、予測されるＴｍを決定することが可能である。例えば、エフェクター鎖の所望の５’末端はＡまたはＵの末端残基を含む一方、次の４残基のうちの少なくとも２残基はＡまたはＵのいずれかである必要がある。エフェクター鎖の３’末端は、望ましくはＧまたはＣの末端を有し、次の４残基のうちの少なくとも２残基はＧまたはＣのいずれかを含む。あるいは、コヴォロヴァ（Ｋｈｖｏｒｏｖａ）ら（Ｃｅｌｌ １１５：２０９−１６頁（２００３年））およびその中の参考文献における方法を用いた自由エネルギーの算出値によって熱安定性を評価することが可能である。

下記の如く発現コンストラクトからの細胞内発現を介する送達に加え、本発明に記載のＲＮＡエフェクター分子は、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ Ｇｕｉｄｅ（第３編 １９９６年）、ドイル（Ｄｏｙｌｅ）編、ＩＳＢＮ Ｎｏ．１５７などのテキストに記載された従来の方法に記載の、バクテリオファージＴ７、Ｔ３、またはＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを用いた従来の酵素合成法によってインビトロで作製されたＲＮＡ分子として、あるいは部分的に二本鎖のＲＮＡ配列またはＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドとして、哺乳類細胞内に存在するウイルス病原体に送達されうる。あるいは、インビトロでの化学合成法によってこれらの分子を作製することが可能である[例えば、Ｑ．クス（Ｑ．Ｘｕ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：３６４３−４４頁（１９９６年）；Ｎ．ナリーシュキン（Ｎ．Ｎａｒｙｓｈｋｉｎ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．２２：６９１−９８頁（１９９６年）；Ｊ．Ａ．グラスビー（Ｊ．Ａ．Ｇｒａｓｂｙ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２１：４４４４−５０頁（１９９３年）；Ｃ．チェクス（Ｃ．Ｃｈａｉｘ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１７：７３８１−９３頁（１９８９年）；Ｓ．Ｈ．チョウ（Ｓ．Ｈ．Ｃｈｏｕ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．２８：２４２２−３５頁（１９８９年）；Ｏ．オダール（Ｏ．Ｏｄａｌ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．２１：１０５−０６頁（１９８９年）；Ｎ．Ａ．ナリーシュキン（Ｎ．Ａ．Ｎａｒｙｓｈｋｉｎ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．２２：６９１−９８頁（１９９６年）；Ｓ．サン（Ｓ．Ｓｕｎ）ら、ＲＮＡ３：１３５２−６３頁（１９９７年）；Ｘ．チャン（Ｘ．Ｚｈａｎｇ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３９８０−８３頁（１９９７年）；Ｓ．Ｍ．グルヴァズノフ（Ｓ．Ｍ．Ｇｒｖａｚｎｏｖ）およびＨ．ウィンター（Ｈ．Ｗｉｎｔｅｒ）、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：４１６０−６７頁（１９９８年）；Ｍ．カドクラ（Ｍ．Ｋａｄｏｋｕｒａ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｓｙｍｐ．Ｓｅｒ．３７：７７−７８頁（１９９７年）；Ａ．ダヴィソン（Ａ．Ｄａｖｉｓｏｎ）ら、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｅｐｔ． Ｐｒｏｔｅｉｎｓ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ２：１−６頁（１９９６年）；ならびにＡ．Ｖ．ムドラコフスカイア（Ａ．Ｖ．Ｍｕｄｒａｋｏｖｓｋａｉａ）ら、Ｂｉｏｏｒｇ．Ｋｈｉｍ．１７：８１９−２２頁（１９９１年）を参照]。

またあるいは、従来の技術によって培養物から単離された、細菌および酵母を例とする組換え微生物内、または哺乳類細胞を例とする組換え宿主細胞内で本発明のＲＮＡ分子を作製し、次いで宿主生物に送達してもよい。例えば、これらの技術を詳述する例示的な実験マニュアルであるサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ， Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、第２編；Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１９８９年に記載の技術、ならびに米国特許第５，８２４，５３８号明細書；第５，８７７，１５９号明細書；および第５，６４３，７７１号明細書に記載の技術を参照のこと。

インビトロで作製される場合、インビトロで調製されるかまたは合成されるかかるＲＮＡ分子は、感染細胞または感染生物に直接送達されうる。上記参考文献は、本明細書にて提供される教示内容を与えることにより、以下の特定の実施形態のいずれかを提供するのに必要な技術を一当業者に提供する。したがって、一実施形態では、組成物の「作用物質」または「ｄｓＲＮＡエフェクター分子」は、完全かまたは部分的な二本鎖ＲＮＡといった二本鎖（すなわちそれは２本の鎖からなる）である。別の実施形態では、組成物の作用物質または「ｄｓＲＮＡエフェクター分子」は、自己相補性領域を有する一本鎖ＲＮＡでありうる。望ましくは、一本鎖ＲＮＡは一末端または両末端にてヘアピンを形成する。望ましくは、一本鎖ＲＮＡ鎖は末端間の任意の中間体部分にてヘアピンを形成する。かかる一本鎖ＲＮＡ鎖をそれ自身上で折り返すように設計することで、インビトロまたはインビボで部分的に二本鎖になりうる。さらに、組成物中で使用される有効な作用物質としての既存のＲＮＡ分子に関する別の実施形態は、場合によって塩基対をもたないポリヌクレオチド配列によって分離された、センスポリヌクレオチド配列およびアンチセンスポリヌクレオチド配列を含む一本鎖ＲＮＡ配列である。好ましくは、この一本鎖ＲＮＡ配列は、一旦細胞内に存在するかまたはその合成の間にインビトロに存在すると、二本鎖になる能力を有する。

本発明のさらに別の実施形態は、上記のＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドである。

合成ＲＮＡ分子のさらに別の実施形態は、場合によってロッド構造を形成する環状ＲＮＡ分子（例えば、Ｋ−Ｓ．ワン（Ｋ−Ｓ．Ｗａｎｇ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ３２３：５０８−５１４頁（１９８６年））または部分的に二本鎖であり、Ｓ．ワン（Ｓ．Ｗａｎｇ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２２：２３２６−３３頁（１９９４年）；Ｙ．マツモト（Ｙ．Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８７：７６２８−３２頁（１９９０年）；Ｅ．フォード（Ｅ．Ｆｏｒｄ）およびＭ．アレス（Ｍ．Ａｒｅｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９１：３１１７−２１頁（１９９４年）；Ｍ．ツァグリス（Ｍ．Ｔｓａｇｒｉｓ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：１６０５−１２頁（１９９１年）；Ｓ．ブラウン（Ｓ．Ｂｒａｕｎ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２４：４１５２−７頁（１９９６年）；Ｚ．パスマン（Ｚ．Ｐａｓｍａｎ）ら、ＲＮＡ２：６０３−１０頁（１９９６年）；Ｐ．Ｇ．ザフィロポーラス（Ｐ．Ｇ．Ｚａｐｈｉｒｏｐｏｕｌｏｓ）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９３：６５３６−４１頁（１９９６年）；Ｄ．ボードリー（Ｄ．Ｂｅａｕｄｒｙ）ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２３：３０６４−６頁（１９９５年）に記載の技術によって調製可能である。さらに別の作用物質は、別々の鎖上に存在するかまたは同一の鎖上に散在するＲＮＡおよびＤＮＡからなる二本鎖分子である。

望ましくは、ＲＮＡエフェクター分子はインビボで形成され、ひいては感染細胞または感染生物への送達後、インビボでかかる部分的に二本鎖のＲＮＡ分子を生成する「送達物質（ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｇｅｎｔ）」によって送達されうる。したがって、本発明の組成物を形成する同物質は、一実施形態では上記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の１つを「コードする」二本鎖ＤＮＡ分子である。ＤＮＡ作用物質は、二本鎖ＲＮＡになるための細胞内部で転写されるヌクレオチド配列をもたらす。別の実施形態では、ＤＮＡ配列は、場合によって一末端もしくは両末端でヘアピンを形成するかまたはそれ自身上で折り返して部分的に二本鎖になる、上記一本鎖ＲＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖に細胞内で転写されるデオキシリボヌクレオチド配列をもたらす。組成物の送達物質であるＤＮＡ分子は、場合によってリンカーまたは「ループ」配列によって分離されたエフェクター配列とエフェクター相補体の双方を含む一本鎖ＲＮＡ配列を提供可能であり、ここで自己相補的なエフェクター配列およびエフェクター相補体は、一本鎖「ループ」すなわち「ヘアピン」ｄｓＲＮＡによって連結された二本鎖「ステム」高次構造をとりうる。あるいは、送達物質であるＤＮＡ分子は、場合によってインビボでロッド構造または部分的な二本鎖構造を形成する、エフェクター配列およびエフェクター相補体配列を含む上記環状ＲＮＡ分子の転写をもたらす。ＤＮＡ分子は、上記の如くＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドまたは１本のＲＮＡ鎖および１本のＤＮＡ鎖を含む二本鎖のインビボでの生成ももたらす。例えば、上記のサムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）または上記のプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の参考文献に記載の従来の技術を利用することにより、これらの様々なＤＮＡ分子を設計することが可能である。

上記ＲＮＡ分子のいずれかの細胞内での形成を可能にする本発明の別の送達物質は、ＤＮＡの一本鎖もしくは二本鎖のプラスミドまたはベクターであってもよい。一部の態様では、アデノウイルスもしくはＡＡＶなどの適切な組換えウイルスベクターを使用し、本発明のコードされたｄｓＲＮＡエフェクター分子を送達することが可能である。インビトロまたはインビボにおいて本明細書に記載のＲＮＡを生成するように設計される発現ベクターは、ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩおよびＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ、およびウイルスポリメラーゼ、ならびにＴ７およびＳｐ６などのバクテリオファージポリメラーゼを含む任意のＲＮＡポリメラーゼの制御下の配列を含みうる。長さが約３００〜４００ｎｔ未満の短いヘアピンｄｓＲＮＡまたは他のｄｓＲＮＡエフェクター分子などのオリゴヌクレオチドの発現については、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが好ましい。これらのベクターを使用することで、本発明に記載の細胞内で所望のＲＮＡ分子を転写することが可能である。ベクターを望ましく設計することで、内因性のミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ（例えば、かかるベクターにて対応するヒトミトコンドリアプロモーターの利用が可能な場合のヒトミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ）を利用することが可能である。ミトコンドリアポリメラーゼを使用することで、インビボで（キャッピング酵素の発現を介して）キャッピングされたまたはキャッピングされていないメッセージが生成されうる。ＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩおよびＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ転写産物についてもインビボで生成可能である。かかるＲＮＡをキャッピングしてもキャッピングしなくてもよく、必要に応じ、ワクシニアのキャッピング酵素もしくはアルファウイルスのキャッピング酵素などのキャッピング酵素の使用を含む様々な手段によって細胞質のキャッピングを行うことが可能である。しかし、すべてのｐｏｌ ＩＩ転写産物がキャッピングされる。ＤＮＡベクターは、それらプロモーターまたは併用される複数のプロモーター（ミトコンドリアのＲＮＡ ｐｏｌ Ｉ、ｐｏｌ ＩＩもしくはｐｏｌ ＩＩＩ、または同系のポリメラーゼと併せたウイルス、細菌もしくはバクテリオファージのプロモーター）のうちの１つを含有するように設計される。好ましくは、プロモーターがＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩである場合、ＲＮＡ分子をコードする配列は、約３００個よりも長いヌクレオチドのオープンリーディングフレームを有し、核内でのノンセンス媒介性の分解を阻止するための設計上の規則に従わなければならない。本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現についての一部の実施形態では、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」、２００４年８月２０日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ０４／２６９９９号明細書および２００３年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／４９７，３０４号明細書において教示された複数区画発現系および複数区画プロモーター系といったプロモーター、ならびに２００４年８月２３日に出願された米国仮特許出願第６０／６０３，６２２号明細書；２００４年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／６２９，９４２号明細書；および２００５年８月２３日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２００５／２９９７６号明細書において教示されたＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターおよび複数のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター用発現コンストラクトが特に望ましい。

望ましくは、一本鎖ＲＮＡウイルスの複製中間体ＲＮＡに相補的でかつそれを標的にするように設計されたエフェクター配列が優先的にＲＩＳＣと結合するように選択される１９〜２９個、好ましくは１９〜２７個の塩基対のｄｓＲＮＡを含む本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子を設計しかつ発現することを目的に、国際公開第０４／０３５７６５号パンフレットおよびＰＣＴ／ＵＳ０３／００３３４６６号明細書、「Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」に教示された方法、ＲＮＡ構造、および発現コンストラクトを利用してもよい。これらの方法およびコンストラクトを望ましく利用することで、本発明の極めて多種を含む１種もしくは複数種のｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡ（短いヘアピンＲＮＡ）を発現することが可能である。これらのｓｉＲＮＡおよび／またはｓｈＲＮＡの各々は、本明細書に記載の原理に従って設計されることになる。国際公開第０４／０１１６２４号パンフレットおよびＰＣＴ／ＵＳ０２／０３９９９９８号明細書、「Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」において教示された方法、ＲＮＡ構造、および発現コンストラクトも参照のこと。

かかるプラスミドまたはベクターは、細菌、ウイルス、またはファージ由来のプラスミド配列を含みうる。かかるベクターには、染色体ベクター、エピソームベクター、およびウイルス由来のベクター、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体因子、およびウイルスを由来とするベクター；これらの組み合わせ由来のベクター、例えばプラスミドおよびバクテリオファージの遺伝因子、コスミドならびにファージミドを由来とするものが含まれる。したがって、１つの例示的なベクターは一本鎖または二本鎖のファージベクターである。別の例示的なベクターは、一本鎖もしくは二本鎖のＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターである。かかるベクターは、ＤＮＡおよびＲＮＡの細胞への導入における周知の技術により、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとして細胞に導入されうる。ファージおよびウイルスベクターの場合におけるベクターは、感染および形質導入についての周知の技術により、パッケージ化またはカプセル化されたウイルスとして細胞に導入可能であり、好ましくは導入される。ウイルスベクターは、複製能力が高いかまたは複製に欠陥がある。後者の場合には、一般に宿主細胞を補完する場合に限ってウイルスの増殖が生じる。

別の実施形態では、送達物質は単一のＤＮＡもしくはＲＮＡのプラスミドまたはベクターだけを含むのではない。一例として、第１のＤＮＡプラスミドは上記のエフェクター配列を含む一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを提供し、かつ第２のＤＮＡプラスミドは上記のエフェクター相補体配列を含む一本鎖ＲＮＡポリヌクレオチドを提供することが可能であり、ここでエフェクター配列を含むＲＮＡおよびエフェクター相補体を含むＲＮＡは塩基対号を形成する能力を有し、二本鎖になる。かかるプラスミドは、他の従来のプラスミド配列、例えば、タンパク質の組換え発現のためにプラスミドおよびベクターを構築するのに使用される周知の配列などの細菌配列を含みうる。しかし、タンパク質の発現を可能にする配列、例えばコザック（Ｋｏｚａｋ）領域などがこれらのプラスミド構造内に含まれないことが望ましい。本発明のｄｓＲＮＡを生成するのに設計されるベクターを望ましく設計することで、標的配列に対して相同性および相補性を示す配列を含む多数を含む２種以上の異なるｄｓＲＮＡエフェクター分子を生成することが可能である。このアプローチは、単一のベクターが単一の転写単位由来の単一のｄｓＲＮＡ分子ではなく多数の独立に作動可能なｄｓＲＮＡ分子を生成しうるという点で望ましく、極めて多種のｄｓＲＮＡを生成することにより、最適な有効性を目的とする自己選択を行うことが可能である。自己触媒的な配列ならびに無作為および／または所定のスプライス部位を創出するための切断用配列を含む様々な手段を用いることで、これを行うことが可能である。

感染細胞内での上記の望ましいＲＮＡ分子の形成にとって必要な情報を提供するための他の送達物質は、本発明の必要とされるＲＮＡ分子にとって必要な配列を含むように設計される生または弱毒化された組換え細菌を含む。かかる組換え細菌細胞、真菌細胞などは、例えば、米国特許第５，８２４，５３８号明細書；第５，８７７，１５９号明細書；および第５，６４３，７７１号明細書に記載の従来の技術を用いることによって調製されうる。これらの送達物質の調製に有用な微生物には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、ならびにシュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、ストレプトマイシス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）およびスタフィロコッカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）の様々な種を含み、これらに限定されず、上記引用文献において列挙されたものを含む。

さらに、哺乳類細胞内で所望の上記ＲＮＡ分子の形成にとって必要な情報を提供するための他の送達物質は、生ウイルス、弱毒化されたウイルス、および特に上で考察した必要なＲＮＡポリヌクレオチド配列を担持する組換えウイルスを含む。かかるウイルスは、遺伝子療法などにおいて遺伝子を細胞に送達するのに現在使用される組換えウイルスと同様に設計可能であるが、好ましくはタンパク質またはタンパク質の機能断片を発現する能力を有しない。インビボで哺乳類細胞に対して必要なＲＮＡ分子を提供するために操作可能である有用なウイルスまたはウイルス配列の中には、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ関連性ウイルス、バキュロウイルス、デルタウイルス、ポックスウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０など）、ポリオウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、正鎖および負鎖のＲＮＡウイルス、ウイロイド、ならびにウイルソイド、またはこれらの一部が含まれるがこれらに限定されない。本発明の教示内容とともに特に、例えばＭ．ジ・ノコラ（Ｍ．Ｄｉ Ｎｏｃｏｌａ）ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．５：３５０−６頁（１９９８年）に記載の従来の技術を適用することにより、これらの様々なウイルスの送達物質を設計することが可能である。

核酸送達
本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子ならびに本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子をコードするＤＮＡおよび／またはＲＮＡコンストラクトを、いずれのトランスフェクション促進剤も添加することなく、医薬賦形剤において調合される「裸（ｎａｋｅｄ）」ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡとして宿主細胞／組織／生物に投与することが可能である。例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ送達に関する当業者に既知のポリヌクレオチドのトランスフェクション促進剤などを使用し、ＤＮＡおよびＲＮＡ送達に関する当業者に既知の如くより効率的な送達を行うことが可能である。ブピバカインなどの局所麻酔薬、カチオン脂質、リポソームまたは脂質粒子を含むカチオン両親媒性物質；ポリリジンなどのポリカチオン；デンドリマーなどの三次元の分岐ポリカチオン；炭水化物；洗剤；あるいは塩化ベンザルコニウムなどのベンジルアンモニウム界面活性剤を含む界面活性剤は、例示的な作用物質である。本発明に有用なかかる促進剤または共剤（ｃｏ−ａｇｅｎｔ）の非排他的な例が、米国特許第５，５９３，９７２号明細書；第５，７０３，０５５号明細書；第５，７３９，１１８号明細書；第５，８３７，５３３号明細書；第５，９６２，４８２号明細書；第６，１２７，１７０号明細書；第６，３７９，９６５号明細書；および第６，４８２，８０４号明細書；ならびに２００３年１１月１３日に公開された国際公開出願第０３／０９３４４９号パンフレット（多機能分子複合体および油／水カチオン両親媒性物質エマルジョン）および１９９９年５月６日に公開された国際公開第９９／２１５９１号パンフレット（「Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｔｅｒｉａｌ」）に記載され、これらの教示内容は参照により本明細書に援用される。米国特許第５，８２４，５３８号明細書；第５，６４３，７７１号明細書；および第５，８７７，１５９号明細書は、ポリヌクレオチド組成物以外の組成物、例えば、本発明のｄｓＲＮＡをコードする組成物を含有するトランスフェクトされたドナー細胞または細菌の送達について教示する。

一部の実施形態では、ｄｓＲＮＡエフェクター分子またはｄｓＲＮＡ発現ベクターは、米国特許第４，８９７，３５５号明細書（エップスタイン（Ｅｐｐｓｔｅｉｎ）ら、１９８７年１０月２９日に出願）；米国特許第５，２６４，６１８号明細書（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、１９９１年４月１６日に出願）；または米国特許第５，４５９，１２７号明細書（フェルグナー（Ｆｅｌｇｎｅｒ）ら、１９９３年９月１６日に出願）において開示された組成物などの１種もしくは複数種のカチオン脂質またはカチオン両親媒性物質と複合体を形成する。他の実施形態では、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現ベクターは、カチオン脂質を含有しかつ場合によって中性脂質（例えば、米国特許第５，２７９，８３３号明細書（ローズ（Ｒｏｓｅ））；米国特許第５，２８３，１８５号明細書（エパンド（Ｅｐａｎｄ））；および米国特許第５，９３２，２４１号明細書を参照）などの別成分を含有するリポソーム／リポソーム組成物（ｌｉｐｏｓｏｍｉｃ ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）と複合体を形成する。

他の実施形態では、ｄｓＲＮＡエフェクター分子またはｄｓＲＮＡ発現コンストラクトは、米国特許第５，８３７，５３３号明細書；第６，１２７，１７０号明細書；および第６，３７９，９６５号明細書（ボーチン（Ｂｏｕｔｉｎ））の多機能分子複合体、あるいは望ましくは２００３年１１月１３日に公開された国際公開第０３／０９３４４９号パンフレット、サティシュチャンドラン（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ）における多機能分子複合体または油／水カチオン両親媒性物質エマルジョンと複合体を形成し、その教示内容は本明細書において参照により援用される。後者の応用として、核酸を含有する組成物、コレステロールまたは脂肪酸を含有するエンドソーム溶解性（ｅｎｄｏｓｏｍｏｌｙｔｉｃ）スペルミンおよび細胞表面分子に対するリガンドを含有するターゲティングスペルミン（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｒｍｉｎｅ）が教示される。組成物の正電荷の負電荷に対する比は０．１〜２．０、好ましくは０．５〜１．５であり、エンドソーム溶解性スペルミンは組成物中のスペルミンを含有する分子の少なくとも２０％を構成し、かつターゲティングスペルミンは組成物中のスペルミンを含有する分子の少なくとも１０％を構成する。望ましくは、正電荷の負電荷に対する比は、０．８〜１．２、例えば０．８〜０．９である。ターゲティングスペルミンは、組成物を目的の特定の細胞または組織に局在化するように設計される。エンドソーム溶解性スペルミンは、エンドサイトーシスの間にエンドソーム小胞を破壊し、組成物をカプセル化することで、核酸のエンドソーム小胞からの放出や細胞の細胞質または核への放出を促進する。かかるターゲティングスペルミン／エンドソーム溶解性スペルミンの混合物を使用することで、トランスフェクションが行われるだけでなく、発現についても促進される。

国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにおいて教示される如く、ｄｓＲＮＡエフェクター分子または本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子をコードするＤＮＡ発現ベクターと、６５％のコレステリルスペルミンに対する３５％のマンノシルスペルミンの混合物とで複合体を形成することで、マウスの静脈内に投与される場合に、マンノース受容体を介して、免疫細胞、例えば、マクロファージの標的化されたトランスフェクションを行うことが可能である。（モノもしくはトリラクトシル化）ラクトシルスペルミンとコレステリルスペルミンの混合物（例えば３５％／６５％の比）と複合体を形成した本明細書に記載のＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターを含有する組成物（電荷比０．８のＤＮＡに対するスペルミンを含有する）の静脈内注射により、ｄｓＲＮＡのＨＣＶなどの肝炎ウイルスに対する送達のために、インビボでの肝細胞の標的化されたトランスフェクションを行うことが可能である。かかる組成物は、特に医薬用途に有用であり、適切な無菌の非発熱性賦形剤、例えばＩＶ（ＩＶ注入を含む）、ＩＭ、ＳＣ、および腹腔内投与を例とする非経口投与における注射用の緩衝化生理食塩水、ならびに吸入を介する肺送達用のエアロゾル化製剤において容易に調合可能である。特定の製剤では、本発明のＤＮＡ発現コンストラクトと、ターゲティングスペルミンを含まない、コレステリルスペルミン単独などのエンドソーム溶解性スペルミンとの複合体を形成することが可能であり、腹膜腔内への注射または注入などの一部の投与経路により、ＤＮＡコンストラクトの有効な肝臓への送達およびトランスフェクションならびにＨＣＶに対して有効な複数のｄｓＲＮＡヘアピンを例とするｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現を行うことが可能である。国際公開第０３／０９３４４９号パンフレットにおいて教示される如く、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子をコードするＤＮＡ発現ベクターを、インビボでの経口または非経口、例えば静脈内送達においてマイクロエマルジョンとして調合することも可能であり、その教示内容は本明細書において参照により援用される。製剤は、望ましくは局所麻酔薬のブピバカイン、コレステリルスペルミン、塩化ベンザルコニウム、またはオクチルスペルミンなどの両親媒性物質を含有する。マウスにおけるインビボでの実験は、経口投与によって肝臓への有効な送達がもたらされることを示唆している。マイクロエマルジョンの静脈内投与により、例えば肺、肝臓、脾臓および腎臓といった大規模な毛細血管床を有する器官におけるトランスフェクションが得られる。

リポフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、ウイルスまたはレトロウイルス送達、エレクトロポレーション、またはバイオリスティック形質転換を含み、しかし、これらに限定されない種々の手段により、研究目的および他の非治療目的における細胞の形質転換／トランスフェクションを行うことが可能である。ＲＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター（ＤＮＡ）は、裸のＲＮＡもしくはＤＮＡまたは局所麻酔薬と複合体を形成したＲＮＡもしくはＤＮＡでありうる（米国特許第６，２１７，９００号明細書および第６，３８３，５１２号明細書、「Ｖｅｓｉｃｕｌａｒ Ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ ａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｍａｋｉｎｇ ａｎｄ Ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ Ｓａｍｅ」、パチュック（Ｐａｃｈｕｋ）らを参照）。医薬用途を対象とした本発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現コンストラクトについての別の望ましい送達技術は、インサート・セラピューティクス（Ｉｎｓｅｒｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、カリフォルニア州パサデナ（Ｐａｓａｄｅｎａ）から入手可能なシクロデキストリンを含有するポリカチオンをベースとする自己組織化するサイクロサート（Ｃｙｃｌｏｓｅｒｔ）（商標）の２成分核酸送達系である（ポピエラースキー（Ｐｏｐｉｅｌａｒｓｋｉ）ら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４：６７２−８頁（２００３年）；ライニキー（Ｒｅｉｎｅｋｅ）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４：２４７−５４頁（２００３年）；ライニキー（Ｒｅｉｎｅｋｅ）およびデイビス（Ｄａｖｉｓ）、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．１４：２５５−６１頁（２００３年）を参照）。第１の成分は、ＤＮＡと混合される場合、ＤＮＡを濃縮し、ＤＮＡを血清中でのヌクレアーゼ分解から保護する均一なコロイド状ナノ粒子に自己組織化する核酸のリン酸塩「骨格（ｂａｃｋｂｏｎｅ）」に結合する、線形のシクロデキストリンを含有するポリカチオン重合体である。第２の成分は、シクロデキストリン重合体と結合する場合、表面のシクロデキストリンと包接複合体を形成し、凝集を防止し、安定性を高め、かつ全身投与を可能にするアダマンティン−ＰＥＧの末端分子を有する表面変性剤である。さらに、細胞表面受容体に対するターゲティングリガンドを、ＤＮＡの目的の標的細胞への標的化された直接送達をもたらす修飾因子に付着させることが可能である。肝細胞がＨＣＶ感染の影響を受けやすいことから、本発明のｄｓＲＮＡ発現コンストラクトの肝臓細胞への送達を標的にするこの方法の利用が特に有利なものと考えられる。例えば、哺乳類肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）を、ガラクトシル化重合体などのガラクトシル化もしくはラクトシル化残基を有する合成リガンドの使用によって標的にすることが可能である。相同組換え（グラハム（Ｇｒａｈａｍ）ら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９−７２頁（１９７７年））、または他の適切な方法（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、サムブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）、１９８９年）を例とする当業者に既知の方法を用い、適切な調節配列を本発明のベクターに挿入してもよい。

プロモーターがｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドをコードする核酸配列に対して作動可能に連結された５’であるようにベクターに挿入される。本発明では、真核細胞において転写の開始を誘導可能な任意のプロモーターを使用可能である。例えば、サイトメガロウイルス（デ・バーナルディ（Ｄｅ Ｂｅｒｎａｒｄｉ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８８：９２５７−９２６１頁（１９９１年）およびその中の参考文献）、マウスメタロチオネイン（ｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｉｎｅ）Ｉ遺伝子（ハマー（Ｈａｍｍｅｒ）ら、Ｊ．ＭｏＩ．Ａｐｐｌ．Ｇｅｎ．１：２７３−２８８頁（１９８２年））、ＨＳＶチミジンキナーゼ（マクナイト（ＭｃＫｎｉｇｈｔ）、Ｃｅｌｌ ３１：３５５−３６５頁（１９８２年））、およびＳＶ４０初期（ベノイスト（Ｂｅｎｏｉｓｔ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０頁（１９８１年））プロモーターなどの非組織特異的プロモーターの使用が可能である。本発明では、例えばサイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルス（Ｉ型およびＩＩ型）、肝炎ウイルス（Ａ、ＢおよびＣ）、ならびにラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ；ファン（Ｆａｎｇ）ら、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ １０：７８１−７８７頁（１９８９年））由来のウイルスプロモーターおよびエンハンサーを使用することも可能である。ｄｓＲＮＡ発現ベクターは、ＩＣＰ６、ＩＣＰ４およびＩＣＰ０プロモーターなどのＨＣＭＶ、ＳＣＭＶ、ＭＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ２ａ、ＴＫならびに他のＨＳＶプロモーターを含むがこれらに限定されないＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩにおけるプロモーター、ＨＢＶプレゲノムプロモーター、Ｕ６およびｔＲＮＡプロモーターを含むがこれらに限定されないＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、ミトコンドリア軽鎖および重鎖プロモーターを含みうる。望ましくは、ｄｓＲＮＡ発現ベクターは、少なくとも１種のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、例えばヒトＣＭＶ−前初期プロモーター（ＨＣＭＶ−ＩＥ）もしくはサルＣＭＶ（ＳＣＭＶ）プロモーター、少なくとも１種のＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、または少なくとも１種のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む。プロモーターはＴ７プロモーターでもありうるが、その場合には細胞はさらにＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを含む。あるいは、プロモーターはＳＰ６プロモーターでありうるが、その場合には細胞はさらにＳＰ６ ＲＮＡポリメラーゼを含む。プロモーターは、１種の収束的（ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｔ）Ｔ７プロモーターおよび１種の収束的ＳＰ６ ＲＮＡプロモーターも含みうる。Ｔ７ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼの発現プラスミドをそれぞれ用いて細胞を形質転換することにより、Ｔ７またはＳＰ６ポリメラーゼを含むように細胞を作製することが可能である。一部の実施形態では、Ｔ７プロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは、短いｄｓＲＮＡをコードする核酸に対して作動可能に連結される。別の実施形態では、プロモーターは、ベクターの核酸の細胞質転写を可能にするミトコンドリアプロモーターである（例えば、２０００年４月１９日に出願された国際公開第００／６３３６４号パンフレットおよび２００１年１月９日に出願されたＷＯ／ＵＳ２００２／００５４３に記載のミトコンドリアプロモーターを参照）。あるいは、プロモーターは、ｌａｃ（クロニン（Ｃｒｏｎｉｎ）ら、Ｇｅｎｅ Ｄｅｖ．１５：１５０６−１５１７頁（２００１年））、ａｒａ（クレブニコフ（Ｋｈｌｅｂｎｉｋｏｖ）ら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１８２：７０２９−３４頁（２０００年））、エクジソン（レオジーン（Ｒｈｅｏｇｅｎｅ）ウェブサイト）、ＲＵ４８（メフェプリストン）（コルチコステロイド拮抗薬）（ワン（Ｗａｎｇ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９６：８４８３−８８頁（１９９９年））、またはｔｅｔプロモーター（レンダル（Ｒｅｎｄａｌ）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：３３５−４２頁（２００２年）；ラーナルティナ（Ｌａｒｎａｒｔｉｎａ）ら、Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３：１９９−２１０頁（２００２年））あるいは２０００年４月１９日に出願された国際公開第００／６３３６４号パンフレットに開示されたプロモーターなどの誘導プロモーターである。本発明の方法および組成物では、２００４年１２月２３日に再公開された国際公開第０３／０３５９１０Ａ１号パンフレットに教示されたフォースドオープンパドロック（ｆｏｒｃｅｄ ｏｐｅｎ ｐａｄｌｏｃｋ）プロモーターを含む、構成およびキメラプロモーターも有用である。本発明の方法および組成物に特に望ましいと考えられる、２００３年８月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／４９７，３０４号明細書、パチュック Ｃ．（Ｐａｃｈｕｋ Ｃ．）およびサティシュチャンドラン Ｃ．（Ｓａｔｉｓｈｃｈａｎｄｒａｎ Ｃ．）、「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ−Ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍｓ」において教示されたプロモーター系も参照のこと。

本発明の望ましい方法では、脊椎動物細胞（例えば哺乳類細胞）内でのｄｓＲＮＡ（例えば長いもしくは短いｄｓＲＮＡ分子）の細胞質発現を得るのに、Ｔ７ ｄｓＲＮＡ発現系が利用される。Ｔ７発現系では、Ｔ７プロモーターを使用することで所望のｄｓＲＮＡが発現される。第２のプラスミドまたは同じプラスミド上に提供されうるＴ７ ＲＮＡポリメラーゼによって転写が駆動される。バクテリオファージＴ７ ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７ Ｐｏｌ）は、その応答プロモーター配列を特異的に認識しかつ高い転写酵素活性を示しうるＴ７遺伝子１の産物である。プロモーター配列を含む、バクテリオファージの異なる領域に関する詳細な情報を有するＴ７ゲノムの完全配列は、ダン（Ｄｕｎｎ）およびストゥディエ（Ｓｔｕｄｉｅｒ）、Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．１６６：４７７−５３５頁（１９８３年）に開示される（ＮＣＢＩ’ゲノム（Ｇｅｎｏｍｅ）’データベース、登録番号ＮＣ００１６０４も参照）。Ｔ７プロモーターを、該プロモーターに対して厳密な特異性を示す、バクテリオファージＴ７のポリメラーゼ以外の任意のＲＮＡポリメラーゼによって利用することはできない（チェンバリン（Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ）ら、Ｎａｔｕｒｅ ２２８：２２７−３１頁（１９７０年））。ｄｓＲＮＡ発現のためにＴ７発現系を利用する場合、例えば、収束的Ｔ７プロモーターの制御下でのセンス鎖とアンチセンス鎖の双方を発現する第１のプラスミドコンストラクトおよびＲＳＶ（ラウス肉腫ウイルス）またはＣＭＶプロモーターの制御下でのＴ７ ＲＮＡポリメラーゼを発現する第２のプラスミドコンストラクトを使用してもよい。特にｄｓＲＮＡが、少なくとも部分的に二本鎖領域を伴ってステムループまたはヘアピン構造をとることを可能にする自己相補性の逆方向反復または領域を有する単一のＲＮＡ鎖から形成される場合、ｄｓＲＮＡとＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの双方が単一のバイシストロニック（ｂｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ）プラスミドコンストラクトから有利に発現可能であると思われる。自己組織化してｄｓＲＮＡを形成する個々のセンス鎖およびアンチセンス鎖は、例えば、転写されるべく選択された配列の相補鎖の５’および３’末端に別々に配置される、バクテリオファージＴ７プロモーターなどの収束的プロモーターを使用した単一のプラスミドコンストラクトによって合成されうる。例えば、Ｔ７ ｄｓＲＮＡ発現系に関連する国際公開第００６３３６４号パンフレット、ならびに２００２年７月３１日に出願された米国特許出願第６０／３９９，９９８号明細書および２００２年１０月１８日に出願された米国特許出願第６０／４１９，５３２号明細書における教示内容も参照のこと。

一本鎖ウイルスによる感染を予防するための治療組成物では、本発明のｄｓＲＮＡおよびそれらをコードする核酸配列を含む組換えベクターを使用することが可能である。本発明の治療組成物は、単独または混合、または化学的組合せにおいて、他の抗ウイルス物質を含む１種もしくは複数種の物質と、使用されうる。本発明の作用物質と他の抗ウイルス物質との併用療法は、治療の効力を顕著に高める一方、実質的に薬剤耐性の発現を低下させることが期待される。かかる複数の作用物質による治療法を含む特定の投与計画は、臨床医学における当業者らによる通常の実験を通じて決定されうる。

製剤は、望ましくは、オリゴヌクレオチドもしくは組換えベクターの生物学的安定性を高める物質、または治療組成物が感染細胞を選択的に通過する能力を高める物質を含むことになる。本発明の治療組成物を、投与の様式および経路に基づいて選択される、医薬的に許容可能な担体中で（例えば生理食塩水）、ならびに標準薬務（ｓｔａｎｄａｒｄ ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ ｐｒａｃｔｉｃｅ）で投与することが可能である。当業者であれば、オリゴヌクレオチドまたは遺伝子コンストラクトを含有する医薬組成物を容易に調合することが可能である。一部の場合、等張製剤が使用される。一般に、等張性を得るための添加剤は、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを含有しうる。一部の場合、リン酸塩緩衝化生理食塩水などの等張溶液が好ましい。安定剤にはゼラチンおよびアルブミンが含まれる。一部の実施形態では、血管収縮剤が製剤に添加される。本発明に記載の医薬製剤は、無菌でかつ発熱物質を含まない状態で提供される。適切な医薬担体、ならびに医薬製剤での使用のための医薬必需品が、この分野およびＵＳＰ／ＮＦにおける標準的な参考書であるレミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ（旧Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）、マック・パブリッシング（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）中に記載されている。

投与経路には、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、関節内、眼内および経口、ならびに経皮または吸入もしくは坐剤によるものが含まれるがこれらに限定されない。好ましい投与経路には、静脈内、筋肉内、経口、腹腔内、経皮、動脈内および皮下注射が含まれる。ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現コンストラクトは、従来の注射器、針なし注射装置、または「マイクロプロジェクタイル・ボンバードメントの遺伝子銃（ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅ ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ ｇｅｎｅ ｇｕｎ）」を含むがこれらに限定されない手段によって投与されうる。あるいは、ｄｓＲＮＡおよび／またはｄｓＲＮＡ発現コンストラクトは、様々な手段によって個体から除去される細胞に導入されうる。かかる手段には、例えば、エクスビボでのトランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよびマイクロプロジェクタイル・ボンバードメントが含まれる。遺伝子コンストラクトが細胞に取り込まれた後、細胞は個体に再移植される。それ以外として細胞に取り込まれた遺伝子コンストラクトを有する非免疫原性細胞は、宿主細胞が最初に別の個体から採取された場合でも個体に移植可能であると考えられる。

本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子（例えば、遺伝子サイレンシングを行うための短いもしくは長いｄｓＲＮＡ分子）の動物への投与の場合、典型的にはｄｓＲＮＡの１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、５００μｇ〜１ｍｇ、または５μｇ〜５００μｇが（優先度が高まる順に）９０−１５０ポンドのヒト／動物に投与される。ｄｓＲＮＡ（例えば、遺伝子サイレンシングを行うための短いまたは長いｄｓＲＮＡ）をコードするベクターの動物への投与の場合、典型的にはｄｓＲＮＡ発現ベクターまたはコンストラクトの１００ｍｇ〜３００ｍｇ、１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、５００μｇ〜１ｍｇもしくは５０μｇ〜５００μｇが（優先度が高まる順に）９０−１５０ポンドのヒト／動物に投与される。動物の重量を基準として用量を調節することが可能である。一部の実施形態では、約１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは約２〜２．５ｍｇ／ｋｇが投与される。臨床医学に関する当業者による通常の実験を介して決定されたものとして、他の用量が使用される場合もある。

無傷の動物への投与の場合、典型的にはｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの１０ｎｇ〜５０μｇ、５０ｎｇ〜１００ｎｇ、または１００ｎｇ〜５μｇが使用される。望ましい実施形態では、約１０μｇのＤＮＡまたは５μｇのｄｓＲＮＡが動物に投与される。本発明の方法に関連して、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡをコードするＤＮＡの細胞または動物への投与について投与、用量、または投与頻度といった特定の様式に限定する意図はなく、本発明では、ウイルス感染を阻害するか、ウイルス感染を予防するか、またはウイルス感染を治療するのに十分な用量を提供するのに十分なすべての投与様式について検討されている。

本来であれば細胞毒性を誘発すると予想されかねないｄｓＲＮＡ（例えば、より長いｄｓＲＮＡ）の外因性の送達の前、その間またはその後に、短いｄｓＲＮＡが必要に応じて送達される。２００３年４月２８日に出願された米国特許出願第１０／４２５，００６号明細書、「Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ Ｇｅｎｅｓ Ｗｉｔｈｏｕｔ Ｉｎｄｕｃｉｎｇ Ｔｏｘｉｃｉｔｙ」、パチュック（Ｐａｃｈｕｋ）の教示内容を参照のこと。

本開示を踏まえて過度の実験を行うことなく、本明細書において開示され、特許請求されるすべての組成物および方法について作製しかつ実行することが可能である。本発明の組成物および方法が好ましい実施形態の観点で説明されている一方、本発明の概念、趣旨および範囲から逸脱することなく、組成物および方法に対しならびに本明細書に記載の方法のステップまたは一連のステップにおいて変更を加えることが可能であることが当業者にとって明らかであろう。より詳細には、化学的にも生理学的にも関連がある特定の作用物質を、同一または類似の結果が得られる一方で、本明細書に記載の作用物質と置き換えることが可能であることは明らかであろう。当業者にとって明らかな、すべてのかかる類似の置き換えおよび変更は、添付の特許請求の範囲によって記載の如く、本発明の趣旨、範囲および概念の範囲内に含まれることになる。

本発明は以下の実施例にさらに記載される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示す一方、図示を通してのみ示されることが理解されるべきである。例えば、本明細書でｄｓＲＮＡ分子のエフェクター配列またはエフェクター相補体として用いられるｓｉＲＮＡ配列は、標的配列に対して同一の２１個のヌクレオチドを含むが、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、特にｄｓＲＮＡ分子が細胞内で発現される場合、例えば、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８もしくはそれより長い、例えば、５０、１００もしくはそれより長い塩基対といった様々な長さのｄｓＲＮＡの二本鎖（エフェクター配列およびエフェクター相補体を含む）である可能性があり、その場合、ｄｓＲＮＡがより長い場合であってもｄｓＲＮＡのストレス応答が誘発されない。同様に、「ヘアピンｄｓＲＮＡ」、「ｄｓＲＮＡヘアピン」、「短いヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡ」、すなわち約４００〜５００ヌクレオチド（ｎｔ）未満、好ましくは１００〜２００ｎｔ未満のＲＮＡ分子を利用することが可能であり、その中では少なくとも１５〜１００個のヌクレオチド（好ましくは１７〜５０ｎｔ、より好ましくは１９〜２９ｎｔ）からなる少なくとも１つのストレッチと同じＲＮＡ分子（単一のＲＮＡ）上に位置する相補配列とが塩基対合を形成し、そこでは該配列（「エフェクター配列」）および相補配列（「エフェクター相補体」）が、塩基相補性をなす２つの領域によって創出されるステム構造の上部で一本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７個のヌクレオチド（好ましくは約９〜約１５個のヌクレオチド）の不対領域によって分離される。これらの様々な実施形態は本発明の範囲内にある。上記の考察およびこれらの実施例から、一当業者であれば本発明の好ましい特徴を確認することができ、かつ本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、それを様々な使用および条件に適合させるのにその様々な変形および変更を行うことができる。

実験の詳細および結果が以下に示される。これらの実験では、ＨＣＶのプラス鎖を標的にするのに設計されたｓｉＲＮＡを用いて得られた結果に対し、ＨＣＶのマイナス鎖を標的にするのに設計されたｓｉＲＮＡを用いて得られた結果が比較される。確証的実験データの後に、プラス鎖およびマイナス鎖に対してｓｉＲＮＡを設計するのに用いられる方法が記載される。

実施例１（プラス鎖のターゲティング）
簡単な紹介：Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は非Ａ、非Ｂの輸血関連肝炎の主な原因であり、世界規模で２億を超える肝炎症例を占める。ＨＣＶゲノムは高度な配列上のばらつきを有する。５０種を超えるサブタイプを含む６種の主な遺伝子型が存在し、かつ患者の中に準種に代表される顕著な不均一性が認められている。組換えポリメラーゼまたは細胞をベースとするサブゲノムレプリコン系を使用することにより、ＨＣＶの複製についての理解がかなり進んでいる。レプリコン細胞系を使用することにより、ｓｉＲＮＡがＨＣＶタンパク質の発現およびＲＮＡの複製を抑制可能であることが示されている。５’ＮＴＲおよび構成遺伝子と非構成遺伝子の双方の配列を標的にすることに成功している。米国特許第５，８７４，５６５号明細書、「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ ａ Ｈｉｇｈｌｙ Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ Ｎｏｖｅｌ ３’ Ｔｅｒｍｉｖａｌ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｅｌｅｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｈｅｐａｔｉｔｉｓ Ｃ Ｖｉｒｕｓ」は、ＨＣＶの複製に重要であると考えられる高度に保存された１０１ｎｔの配列について教示し、それをｄｓＲＮＡ媒介性のサイレンシングにとって潜在的に有望な標的としている。しかし、３’ＮＴＲをＲＮＡｉにおいて有効な抗ウイルス標的として使用することについての実現可能性は明確にされておらず、特別に設計されたｄｓＲＮＡエフェクター分子によるこのプラス鎖配列のマイナス鎖の複製中間体を優先的に標的にすることについての実現可能性と比べると極めて低い。「Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＨＢＶ ａｎｄ ＨＣＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」、２００５年２月１７日に公開された国際公開第２００５／０１４８０６号パンフレットおよび２００４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／６３８，２９４号明細書において教示された、５’ＵＴＲ配列を含む、ＨＣＶのこの配列および他の保存配列は、プラス鎖ＨＣＶのＨＣＶマイナス鎖複製中間体（抗ゲノムＲＮＡ）、および場合によってプラス鎖ゲノムＲＮＡも標的にするのに使用されるべき保存配列プールを提供する。

ｄｓＲＮＡエフェクター分子に関連して本明細書で用いられる「ターゲティング」とは、選択されたウイルス鎖に対し逆の極性を有しかつ相補的なＲＮＡ分子（「エフェクター鎖」）がＲＩＳＣと結合する可能性が高まることを意味する。「ターゲティング」とは、本明細書において提供される原理に従って、このプールから配列を選択することでありうる。例えば、熱安定性がより低いｄｓＲＮＡエフェクター分子の末端がその複合的な鎖（ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ ｓｔｒａｎｄｓ）に分離する傾向が高まることから、特定のウイルス鎖を標的にするのに、例えば１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６もしくは２７の１９〜２７個の塩基対の特定の保存領域が選択されうる。すなわち、５’末端が３’末端に比べて熱安定性が低い二本鎖内に存在する場合の鎖は、その相補鎖よりもＲＩＳＣ内に取り込まれる可能性が高いことになる。既知の保存されたウイルス配列を選択することで、この本明細書に教示される基準を満たすことが可能である。本発明の他の実施形態では、ターゲティングは、本明細書に教示される如く、逆鎖複製中間体を標的にするのに保存配列を修飾可能にするように、ｄｓＲＮＡエフェクター分子の一末端の熱安定性の低下を可能にするのに用いられるいくつかの方法のうちの唯一のものとして、ｄｓＲＮＡエフェクター分子のエフェクター相補鎖の３〜５個の末端ヌクレオチド内の１個もしくは場合により２個のヌクレオチドミスマッチを導入するステップを含みうる。

ここで発明者らは、サブゲノムのレプリコン系におけるＨＣＶタンパク質の発現を阻害可能な数種のｓｉＲＮＡの設計および試験について報告する。合成的に調製したｓｉＲＮＡを便宜上使用したが、本明細書で教示される如く、得られた結果が、ｓｈＲＮＡエフェクター分子を含む発現されたｄｓＲＮＡエフェクター分子ならびにそれらを作製しかつ使用する方法に等しく適用可能であることが分子生物学の当業者によって理解されるであろう。

ｓｉＲＮＡ設計：ｄｓＲＮＡのターゲティング用に選択されるＨＣＶ ３’ＮＴＲ由来の２１ｂｐの各配列を使用して、配列の両相補鎖を示す１対のＤＮＡオリゴヌクレオチドに加え、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼプロモーターに対応する追加的な９ｂｐのテールを設計した。レイノルズ（Ｒｅｙｎｏｌｄｓ）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２２：３２６−３０頁（２００４年）；シュワルツ（Ｓｃｈｗａｒｔｚ）ら、Ｃｅｌｌ １１５：１９９−２０８頁（２００３年）；およびクヴォラヴァ（Ｋｈｖｏｒａｖａ）ら、Ｃｅｌｌ １１５：２０９−１６頁（２００３年）で記載された規則の概略では、必要に応じてマイナス鎖またはプラス鎖のいずれかの配列から開始し、３’末端よりも熱力学的安定性が低い二本鎖内に存在する５’末端を有する（標的に対して相補的な）エフェクター鎖配列を選択することにより、鎖特異的なターゲティングプロセスを実施した（図３を参照）。次いで、テールを付加した各オリゴヌクレオチドを、各反応において鋳型配列に相補的な大量の一本鎖ＲＮＡを生成するインビトロ転写反応における鋳型として使用した（アムビオン（Ａｍｂｉｏｎ）製キットを用いてインビトロ転写を行った）。精製後、相補的ＲＮＡ産物をアニーリングしてｄｓＲＮＡを形成し、それをトランスフェクションにおいて使用した。この実験のための標的配列はライス（Ｒｉｃｅ）、米国特許第５，８７４，５６５号明細書に教示された１０１ｎｔ ３’ＵＴＲであった。

本発明の原理によるｓｉＲＮＡおよびｓｈＲＮＡにおける選択および利用に適する他のＨＣＶの保存配列は、本明細書において参照により援用される、２００５年２月１７日に公開された国際公開第２００５／０１４８０６号パンフレットおよび２００４年１２月２２日に出願された米国仮特許出願第６０／６３８，２９４号明細書「Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ ＨＢＶ ａｎｄ ＨＣＶ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ Ｕｓｅｆｕｌ ｆｏｒ Ｇｅｎｅ Ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ」、特に同明細書において開示されたＨＣＶの保存配列、すなわち配列番号１１、配列番号１２および配列番号２７、ならびにＨＣＶの保存領域１およびＨＣＶの保存領域２において教示される。

細胞培養および培地。１０％のウシ胎仔血清（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、１％のペニシリン−ストレプトマイシン、１％の非必須アミノ酸、および０．５ｍｇ／ｍｌのジェネティシン（Ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ）（登録商標）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を含有するダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））でＨＣＶレプリコンの肝腫瘍細胞系Ｈｕｈ７ ９−１３（ＲａＩｆ Ｂａｒｔｅｎｓｃｈｌａｇｅｒ）を培養した。分配に先立ち７５％の密集度になるまで細胞を成長させた。

ウエスタンブロット解析。レプリコン細胞由来の細胞溶解物を１×ＬＤＳ緩衝液（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中に採取した。１０％のトリス−グリシンポリアクリルアミドゲル（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））上での電気泳動前にβ−メルカプトエタノールの存在下で溶解物を９０℃で５分間加熱した。タンパク質をポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）膜（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））に移した。移した後、０．５％ トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）−２０（ＰＢＳ−トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ））を含有するＰＢＳで膜を１回すすぎ、５％の脱脂乳を含有するＰＢＳ−トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）で１時間ブロッキングした。ＰＢＳ−トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）で洗浄後、膜を１：１５００に希釈した一次α−ＮＳ５Ａ抗体（Ｄｒ．チェン・リウ（Ｄｒ．Ｃｈｅｎ Ｌｉｕ）から提供）とともに室温で１時間インキュベートした。１：５０００に希釈したα−マウスＩｇＧ二次抗体（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））と共役した西洋わさびペルオキシターゼ（ＨＲＰ）とのインキュベーションに先立ち、ブロットをＰＢＳ−トゥイーン（Ｔｗｅｅｎ）２０で洗浄した。二次抗体のインキュベーション後、ブロットを再洗浄し、製造者のプロトコルに従い、ＥＣＬ（電気化学発光）（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））で処理した。

ｓｉＲＮＡのレプリコン細胞へのトランスフェクション。ｓｉＲＮＡのレプリコン細胞へのトランスフェクションのために、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）２０００試薬（インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））をユーザーズマニュアルに従って使用した。つまり、トランスフェクションの１日前に０．５ｍｌのＤＭＥＭ中の２×１０^４個の細胞を２４ウェルプレートに播種した。指定量のｓｉＲＮＡを５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）で希釈し、希釈したリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）２０００試薬（５０μｌのＯｐｔｉＭＥＭ（登録商標）中１μｌ）と混合した。混合物を、細胞単層上に加える前に室温で２０分間インキュベートした。トランスフェクションの４８〜７２時間後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００μｌのＳＤＳ試料緩衝液に溶解した。

図１は、同書に記載の如く送達された、同定されたｓｉＲＮＡの０、９および２０ｐモル（左から右）でのＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットである。ラミンｓｉＲＮＡは負の対照として働き、コアｓｉＲＮＡは正の対照として働く。ラミンｓｉＲＮＡの任意の濃度が使用される場合にＮＳ５Ａの阻害がない一方、正の対照のｓｉＲＮＡを用いると９ｐモルと２０ｐモルの双方で阻害が見られる。ｓｉＲＮＡ７２（配列番号７）を用いると顕著なダウンレギュレーションが見られる。表１に、３’ＮＴＲのプラス鎖を標的にするように設計したｓｉＲＮＡの配列を列挙する。配列はプラス鎖（５’→３’）として発現される。参照配列は、ＨＣＶ株１ｂ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＡＪ２３８７９９）に対応する領域を示す。

実施例２（マイナス鎖のターゲティング）
ｓｉＲＮＡ Ｒ１〜Ｒ８をトランスフェクションにおいて使用することを除き、実施例２を実施例１に記載の如く実施した。ここではウエスタンブロットアッセイを実施例１に記載の如く実施した。正の対照として使用した対照のＨＣＶのコアｓｉＲＮＡは、先のＨＣＶの実施例１に記載のｓｉＲＮＡである。すべての評価されたｓｉＲＮＡはＨＣＶゲノムの３’ＵＴＲにマップされ、ＨＣＶの遺伝子型および準種の中で保存されている。

図２は、同定されたｓｉＲＮＡの０、９および２０ｐモル、ならびに正の対照のコアｓｉＲＮＡの０、３および９ｐモル（左から右）でのＨＣＶのＮＳ５Ａタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットである。ｓｉＲＮＡのＲ１（配列番号２３）、Ｒ２（配列番号２２）、Ｒ３（配列番号２１）、Ｒ５（配列番号１９）およびＲ７（配列番号１７）のすべてがＨＣＶの顕著な阻害を示した。さらに、ｓｉＲＮＡにおける配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５についてもマイナス鎖に対する特異的ターゲティングで有効であった（データを示さず）。表２に、実施例２において使用したｓｉＲＮＡの配列を列挙する。配列はプラス鎖（５’→３’）として発現される。参照配列は、ＨＣＶ株１ｂ（ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）登録番号ＡＪ２３８７９９）に対応する領域を示す。

結論：実施例１および２における上記の結果は、プラス鎖ＲＮＡウイルスのＲＮＡがプラス鎖であってもマイナス鎖であっても、エフェクターｓｉＲＮＡを適切に設計することによって意図的に標的にされうることを示す。ここで示される実施例においては、マイナス鎖のターゲティングは、一般にウイルスタンパク質の発現をダウンレギュレートするのにより有効な方法であった。さらに、負鎖を標的にするのに設計されたｄｓＲＮＡは、より活性を示す可能性が高い。マイナス鎖に対して標的にされた全部で１２種のｓｉＲＮＡのうちの１０種のｓｉＲＮＡがウイルスタンパク質の発現における低下を示した一方、プラス鎖に対してタンパク質の発現を低下させるのに有効であったのは、標的にされた１３種のｓｉＲＮＡ（そのうち９個の結果を図１に示す）のうちの２種のｓｉＲＮＡに過ぎなかった。この結果は、ＲＮＡｉに対してウイルス複製中間体ＲＮＡ（マイナス鎖）がそのより多数のプラス鎖の相手から区別される実行可能な基質であると考慮する、このｓｉＲＮＡの設計アプローチが強力な抗ウイルス物質の選択においてより優れた利点を有することを示す。

実施例３
（ＨＣＶの負鎖を標的にする４種のｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡプラスミドベクター）
この実施例では、図２でＲ１、Ｒ２、Ｒ５およびＲ７として与えられるｓｉＲＮＡ配列を、細胞にトランスフェクトしたプラスミドベクターからの発現によって細胞内で生成し、ｓｉＲＮＡの４つの短いヘアピン（ｓｈＲＮＡ）形態をコードするオリゴヌクレオチドをそれぞれ単一のベクター内での異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下で（すなわち、４つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターのそれぞれを４種のｓｈＲＮＡのうちの１種をコードする配列に作動可能に連結する）クローニングすることによってベクターを作製する。これらのｓｈＲＮＡ転写産物では、エフェクター鎖を「ループ」配列（ＡＧＡＧＡＡＣＵＵ）の９塩基を介してエフェクター相補鎖に連結する。

標準的な組換えＤＮＡ技術を用い、細菌の抗生物質選択マーカーおよび複製起点を含むプラスミドを、下記の特異的プロモーター／ｓｈＲＮＡの組み合わせの挿入のための開始点として選択する。まず幅広く使用可能なｐＵＣ１８ベクター（ヤニッシュ・ペロン（Ｙａｎｉｓｃｈ−Ｐｅｒｒｏｎ）ら、Ｇｅｎｅ、１１４：８１頁（１９８５年））の約１ｋｂの断片（アンピシリン耐性遺伝子と複数のクローニング部位の間に細菌の複製起点を含む）を米国特許第５，８５１，８０４号明細書に開示されたキメラのカナマイシン耐性遺伝子と結合することにより、プラスミドを作製する。例えば、インヴィトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、クローンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）およびその他の供給業者から入手可能な種々の市販のプラスミドベクターを、ベクター成分の代替源として、または下記ベクターの機能的に等価な変異体を生成するための出発原料として使用する場合の出願人らのベクターに対する代用を目的として使用することが可能である。元の配列からベクターを構築するのに使用される方法には、制限酵素消化、ゲル電気泳動、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＤＮＡ配列決定、酵素的ライゲーション、および米国特許第６，１４３，５２７号明細書、「Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ａ ｂｒｉｄｇｉｎｇ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ａｎｄ ＤＮＡ ｌｉｇａｓｅ」、パチュック（Ｐａｃｈｕｋ）らに記載の「連鎖反応クローニング（Ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ ｃｌｏｎｉｎｇ）」、ならびに当業者にとって一般的かつ周知の他の方法が含まれる。

複数のプロモーターコンストラクトの生成に先立ち、単一のＰｏｌ ＩＩＩプロモーター用ベクターコンストラクトを調製することは好都合である。逐次ステップでの、キメラのカナマイシン耐性遺伝子と、その次の所望のＰｏｌ ＩＩＩプロモーター／ｓｈＲＮＡ発現カセットに対する上部の複製起点の制限断片（ｏｒｉ）の酵素連結により、単一の短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）の発現を目的とする基本的な単一のプロモーターＲＮＡ ｐｏｌ ＩＩＩ用ベクターを生成する。販売業者からの特注による合成の二本鎖オリゴヌクレオチドとして作製された、目的のｓｈＲＮＡ配列を含む短い断片（約５０〜６０ｂｐ）とプロモーターを連結することにより、プロモーター／ｓｈＲＮＡ発現カセットを作製する。複数のプロモーター用ベクターに対する前駆体として単一のプロモーター用ベクターを構築する目的においては、いくつかの有利な態様が具現される。第１に、それは、目的のプロモーター／ｓｈＲＮＡ対もしくは成分を検出する手段の実行を困難にする可能性があると思われる他のＰｏｌ ＩＩＩ発現成分またはｓｈＲＮＡの非存在下で、各プロモーター／ｓｈＲＮＡ対に関する機能的な確認を可能にする。第２に、それは、別の場合であれば複数のプロモーター用ベクター内に複数のアニーリング部位を有し、その状況下での配列決定が困難である配列決定プライマーを使用し、各カセットの全部もしくは一部のＤＮＡ配列決定を可能にする。第３に、各プロモーター成分に固有の制限部位対をクローニングするという意図的な設計により、任意の数の複数の初期プロモーター用ベクターへのクローニングに対し、検証された単一のプロモーターカセットを効率的に動員することが可能である。

単一のプロモーター用ベクターの適度な発現レベルおよび遺伝子サイレンシングの効果に関する測定を行った後、単一のプロモーター用ベクターのプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットから、複数のプロモーター用ベクターを、段階的方法で異なるｓｈＲＮＡの発現を駆動する４つのＰｏｌ ＩＩＩプロモーターを含むように構築する。したがって、ｓｈＲＮＡを発現するのに有効な単一のプロモーターコンストラクトを第２のプロモーター−ｓｈＲＮＡカセットを付加して修飾する。（第１および第２のカセットの他方のベクター成分に対する相対位置によって変化し、かつ転写方向に対する各カセットの方向によって変化する）いくつかの選択的な２−プロモーター形態の２−プロモーター用プラスミドを生成することにより、第１のカセットに相対的な第２のカセットの配置を実験的に選択する。単一のベクター内での最適な発現のために２つのカセットの結合を試みる場合、環状ベクター周囲の位置ならびにカセットの「後方」または「前方」の転写方向性が変化することで、あらゆる同一成分を含有する８通りもの異なる変種を生成することが可能であることが、当業者によって理解されるであろう。さらに、このベクター内で２つの異なるプロモーター由来の２つの異なるｓｈＲＮＡ成分の発現を試みる場合、ｓｈＲＮＡ配列と２種の各プロモーターとの組み合わせが異なるのであれば、異なる配置である以外では、同様にあらゆる同一成分を含有する該ベクターの１６通りの異なる変異体が生成される。出願人らは、これらの異なる構成に起因して、各ｓｈＲＮＡの明確な発現レベルが顕著に変化しうることを観察している。それにもかかわらず、本明細書および２００４年８月２３日および２００４年１１月２２日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第６０／３６２２６０号明細書および第６０／６２９９４２号明細書ならびに「Ｍｕｌｔｉｐｌｅ ＲＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ＩＩＩ Ｐｒｏｍｏｔｏｒ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ」という表題の２００５年８月２３日に出願されたＰＣＴ／２００５／２９９７６号明細書に記載の複数のポリメラーゼＩＩＩプロモーターコンストラクトでは、過度な実験を行うことなく遺伝子サイレンシング効果を目的とした複数のエフェクターＲＮＡ（特にｓｈＲＮＡ）を発現するために、これらの成分を相対的に最適化した構成を効率的に選択可能であることが示されることになる。

Ｕ６、Ｈ１および７ＳＫなど（例えば、ヒト、マウス、ウシまたは他の哺乳類形態）を含むＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型−３（Ｕ６−型）プロモーターは、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現にとって好ましい。この実施例では、ベクターの複数のクローニング部位においてＵ６および７ＳＫプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットを互いに近接させて配置する一方、第３および第４のプロモーター配列（第２の複製物としてＵ６プロモーター、７ＳＫプロモーターまたはＨ１プロモーターのいずれか）用に（カナマイシン耐性遺伝子に近接した）遠位のクローニング部位を用いる。各ｓｈＲＮＡ成分の５’末端を、ＳａｌＩまたはＨｉｎｄＩＩＩを例とする好都合な制限部位を用いて各プロモーターの３’末端に連結するが、これはプロモーターの３’末端とｓｈＲＮＡ配列の開始点の間に６ｎｔを導入することによって設計される。各プロモーターカセットは、転写ターミネーターとしての働きをする３’末端に５個のチミジン残基のストレッチを含む。したがって、ｄｓＲＮＡヘアピンを含む予測された転写産物は、実際には追加的な５’および３’配列、すなわち６個の塩基（例えば、ＳａｌＩまたはＨｉｎｄｌｌｌまたは他の選択された認識配列）からなる５’リーダーと、その次のｄｓＲＮＡヘアピン配列と、その次の、転写終止の間に取り込まれた、通常は２個の（１、２、３もしくは４個の）Ｕ残基である短い３’末端のＵトラクトを含む。ＳａｌＩまたはＨｉｎｄｌｌｌ部位は便宜上選択されるものであり、代わりに任意の数の他の制限部位、好ましくは６もしくは８つのカッターであれば使用可能であり、その場合、ｄｓＲＮＡヘアピン転写産物が異なる５’リーダー配列を含むことが理解されるであろう。アムビオン（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）（テキサス州オースチン（Ａｕｓｔｉｎ）、米国）から市販されているクローニングベクターおよび取扱説明書において、単一のプロモーターによる発現においてｓｈＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントをクローニングする原理も十分に説明されている。

次いで、標準的方法に従って大腸菌において完全な発現ベクターを生成し、先行する実施例の場合と同様にＨＣＶレプリコンを含有するｈｕｈ７細胞にトランスフェクトする。ベクターがＨＣＶの負鎖を標的にする４種の全ｓｈＲＮＡを発現することが示され、かつ細胞ＲＮＡに関するノーザンブロッティング、ＰＣＲまたはヌクレアーゼ保護分析を用いると、ウイルスの負鎖がｓｈＲＮＡ配列の高度に変異した置換体を含有する対照ベクターをトランスフェクトした細胞に対して２０％以上低下することが示されうる。

実施例４
ＨＣＶの３’ＵＴＲの負鎖（抗ゲノム鎖）および正鎖（ゲノム鎖）の両鎖の保存配列を標的にするｓｈＲＮＡを含む、複数のｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡプラスミドベクター。

この実施例では、発現ベクター内に負鎖を標的にするｓｈＲＮＡ配列の２つ（例えば、表２からの配列番号２３または２２または１９または１７から選択された任意の２つ）のみを含め（例えばＲ１とＲ２、またはＲ５とＲ７など）、かつ他の２つの発現カセットが、プラス鎖を標的にするセキトープに対応するｓｈＲＮＡ、（この場合、いずれもＨＣＶの３’ＵＴＲの（＋）鎖の保存配列または「Ｘ」領域を標的にする）、例えば配列番号７、およびｓｉＲＮＡの１２２番（配列番号５９）に基づくｓｈＲＮＡを含むように使用されることを除き、実施例３の方法および手順に従う。選択されたｓｈＲＮＡをコードする配列をプラスミド発現ベクターにクローニングし、ここで各々を、同一または異なっていてもよいポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＵ６、７ＳＫ、Ｈ１などに作動可能に連結させる。

実施例５
ＨＣＶの負鎖（抗ゲノム鎖）および正鎖（ゲノム鎖）の両鎖における５’および３’ＵＴＲの双方の保存配列を標的にするｓｈＲＮＡを含む複数のｓｈＲＮＡを発現するＤＮＡプラスミドベクター。

この実施例では、ＨＣＶ（＋）鎖の３’ＵＴＲとＨＣＶ（−）鎖の３’ＵＴＲの両鎖を標的にするｓｈＲＮＡをコードする配列（例えば、配列番号７または配列番号５９、および例えば配列番号２３または２２または１９または１７から選択される配列）を発現ベクターにクローニングすることを除き、実施例３の方法および手順に従い、さらに、ＨＣＶ（＋）鎖の５’ＵＴＲ（例えば、配列番号２４、２６、２８、３０、３２、３４、３８、４０、４２、４５、４７もしくは４９）およびＨＣＶ（−）鎖の５’ＵＴＲ（配列番号２５、２７、２９、３９、４１、４６、４８、５０もしくは５２）の両方を標的にするｓｈＲＮＡをコードする保存配列を選択しかつ発現ベクターにクローニングし、例えば各々を、同一または異なっていてもよいポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＵ６、７ＳＫ、Ｈ１などに作動可能に連結させる。

同定されたｓｉＲＮＡの（左から右へ）０、９および２０ｐモルでのＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットである。 同定されたｓｉＲＮＡの（左から右へ）０、９および２０ｐモル、ならびにコアの正の対照のｓｉＲＮＡの０、３および９ｐモルでのＨＣＶ ＮＳ５Ａタンパク質のレベルを示すウエスタンブロットである。 ｄｓＲＮＡによる鎖特異的なターゲティングの図である。Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）などのプラス鎖ＲＮＡウイルスに感染した細胞に関する概略図が示される。ウイルスは複製過程の間にそのゲノムのマイナス鎖の複製物を生成するが、これらの存在量はプラス鎖に比べて著しく低い。図の中心にてＨＣＶの短いセグメント配列（ジェンバンク（Ｇｅｎｂａｎｋ）登録番号ＡＪ２３８７９９内のヌクレオチド９５０２で開始）が詳細に示される。ウイルスのゲノム（プラス）鎖とウイルスの複製中間体（マイナス）鎖の両鎖が示され、それらの塩基の相補性を示すように整列されている。同定されたｄｓＲＮＡ分子の設計を意図して２１ｂｐの領域が選択される（下線）。「エフェクター」鎖（四角で囲まれ「ａ」と標識されたもの）と「ｂ」と標識されたその相補体の双方が示される。末端の５個の塩基におけるＡおよびＴ残基の割合がより大きいことに起因して「ａ」鎖の５’末端が「ｂ」鎖の５’末端よりも熱力学的な安定性が低いことから、「ａ」鎖だけがｄｓＲＮＡのサイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に取り込まれることになる。ＲＩＳＣ複合体の取り込みにとって好ましいのは「ａ」鎖のみであり、それがウイルスのマイナス鎖ＲＮＡのみに相補的であることから、このｄｓＲＮＡ分子は分解においてウイルスのマイナス鎖を標的にしてもプラス鎖を標的にしないことになる。

Claims (39)

1. 脊椎動物細胞に感染している一本鎖ＲＮＡウイルスの複製を阻害する方法であって、
   前記一本鎖ウイルスの逆鎖複製中間体に対する反転相補体由来の少なくとも１９個の近接ヌクレオチドのエフェクター配列を含む１種もしくは複数種のｄｓＲＮＡエフェクター分子を前記脊椎動物細胞に投与する工程を含み、前記エフェクター配列が前記一本鎖ウイルスの前記逆鎖複製中間体を選択的に標的にする、方法。
2. 一本鎖ＲＮＡウイルスがプラス鎖ウイルスである請求項１に記載の方法。
3. 一本鎖プラス鎖ウイルスが、ヒトコロナウイルスと、ウエストナイル脳炎ウイルス、日本脳炎ウイルス、マーレーバレー脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、黄熱病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルスを含むフラビウイルスと、デング熱ウイルスと、風疹ウイルスと、カリシウイルスと、Ｅ型肝炎ウイルスと、ポリオウイルスと、ライノウイルスと、Ａ型肝炎ウイルスと、コクサッキーウイルスと、ベネズエラウマ脳炎ウイルスと、口蹄疫ウイルスとからなる群から選択される請求項２に記載の方法。
4. プラス鎖ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである請求項３に記載の方法。
5. 脊椎動物細胞がヒト細胞である請求項１に記載の方法。
6. エフェクター配列が約１９から約２７個の長さのヌクレオチドである請求項１に記載の方法。
7. 前記エフェクター配列が、優先的にＲＩＳＣと結合することによって前記逆鎖複製中間体を選択的に標的にする、いずれか先の請求項に記載の方法。
8. １種もしくは複数種のｄｓＲＮＡエフェクター分子のうちの少なくとも１種が、Ｃ型肝炎ウイルスのマイナス鎖複製中間体の保存された５’非翻訳領域に対する反転相補体またはＣ型肝炎ウイルスのマイナス鎖複製中間体の保存された３’非翻訳領域に対する反転相補体から選択される１つもしくは複数の配列を含む、いずれか先の請求項に記載の方法。
9. ｄｓＲＮＡエフェクター分子が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３から選択される配列を含み、ＵがＴと置き換えられている、請求項８に記載の方法。
10. 一本鎖ウイルスがマイナス鎖ウイルスである請求項１に記載の方法。
11. 一本鎖マイナス鎖ウイルスが、インフルエンザウイルスと、エボラウイルスと、マールブルグウイルスと、呼吸器合胞体ウイルスと、パラインフルエンザウイルスと、麻疹ウイルスと、ムンプスウイルスと、狂犬病ウイルスと、水疱性口内炎ウイルスとからなる群から選択される請求項１０に記載の方法。
12. 脊椎動物細胞に送達される１種もしくは複数種の発現コンストラクトからの発現によって１種もしくは複数種のｄｓＲＮＡエフェクター分子が投与される、いずれか先の請求項に記載の方法。
13. 前記１種もしくは複数種の発現コンストラクトがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから選択される１つもしくは複数のプロモーターをさらに含み、前記１つもしくは複数のプロモーターが前記コンストラクト内に配置されることで前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現を駆動する、請求項１２に記載の方法。
14. 発現コンストラクトの少なくとも１種が少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む請求項１２に記載の方法。
15. 発現コンストラクトの少なくとも１種が少なくとも３つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含み、前記少なくとも３つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターが同一または異なっていてもよい、請求項１２に記載の方法。
16. 発現コンストラクトの少なくとも１種が少なくとも２つの異なるｄｓＲＮＡエフェクター分子を含む請求項１２に記載の方法。
17. 異なるｄｓＲＮＡエフェクター分子が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３から選択され、ＵがＴと置き換えられている、請求項１６に記載の方法。
18. １種もしくは複数種のｄｓＲＮＡエフェクター分子の少なくとも１種がｄｓヘアピンコンストラクトである請求項１２に記載の方法。
19. 前記ｄｓヘアピンが単一のステムｄｓヘアピン、バイ・フィンガーｄｓヘアピンとマルチフィンガーｄｓヘアピンから選択される請求項１８に記載の方法。
20. ウイルスに感染された脊椎動物細胞内で一本鎖ＲＮＡウイルスの複製を阻害する方法であって、
    ａ）一本鎖ＲＮＡウイルスの逆鎖複製中間体に対する反転相補体である少なくとも１９個の近接ヌクレオチド配列と、
    ｂ）一本鎖ＲＮＡウイルスのゲノム鎖に対する反転相補体である少なくとも１９個の近接ヌクレオチド配列と
    を含む核酸分子を前記細胞に投与する工程を含む方法。
21. 細胞に投与された核酸分子の少なくとも１種がｄｓＲＮＡ分子を含む請求項２０に記載の方法。
22. 一本鎖ＲＮＡウイルスがＣ型肝炎でありかつ細胞がヒト細胞である請求項２０に記載の方法。
23. ヌクレオチド配列ａおよびヌクレオチド配列ｂが相補配列である請求項２０に記載の方法。
24. ヌクレオチド配列ａおよびヌクレオチド配列ｂが相補配列でない請求項２０に記載の方法。
25. ヌクレオチド配列ａおよびヌクレオチド配列ｂの各々が、Ｃ型肝炎ウイルスのプラス鎖またはＣ型肝炎ウイルスのマイナス鎖の保存された５’非翻訳領域または保存された３’非翻訳領域に対する反転相補体である配列からなる群から選択される少なくとも１９個の近接ヌクレオチド配列を含む請求項２０に記載の方法。
26. 脊椎動物細胞に送達された１種もしくは複数種の発現コンストラクトからの発現によってヌクレオチド配列ａおよびヌクレオチド配列ｂが投与される請求項２０に記載の方法。
27. 前記１種もしくは複数種の発現コンストラクトがＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターおよびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターから選択される１つもしくは複数のプロモーターを含む請求項２６に記載の方法。
28. 少なくとも２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む請求項２７に記載の方法。
29. 少なくとも３つのＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む請求項２７に記載の方法。
30. 一本鎖ＲＮＡウイルスの逆鎖複製中間体に対する反転相補体である少なくとも１９個の近接ヌクレオチドのエフェクター配列を含む二本鎖ＲＮＡエフェクター分子。
31. エフェクター配列の反転相補体である第２の配列をさらに含み、エフェクター配列が第２の配列と比べてＲＩＳＣと優先的に結合する、請求項３０に記載の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子。
32. エフェクター配列の５’末端を含む末端では第２の配列の３’末端を含む末端に比べて熱安定性（Ｔｍ）が低い、請求項３１に記載の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子。
33. 一本鎖ＲＮＡウイルスがプラス鎖ウイルスである請求項３０に記載の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子。
34. 前記エフェクター配列が前記反転相補体の５’末端の位置１でＡまたはＵを有する請求項３０に記載の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子。
35. 前記プラス鎖ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである請求項３０に記載の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子。
36. 二本鎖ＲＮＡエフェクター分子がＣ型肝炎ウイルスのマイナス鎖複製中間体の保存された５’非翻訳領域または保存された３’非翻訳領域の反転相補体であるエフェクター配列を含む請求項３０に記載の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子。
37. 二本鎖ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２および配列番号２３から選択されるエフェクター配列を含み、ＵがＴと置き換えられている請求項３６に記載の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子。
38. 一本鎖ＲＮＡウイルスによって脊椎動物細胞の感染を治療する方法であって、
    前記一本鎖ウイルスの逆鎖複製中間体に対する反転相補体由来の少なくとも１９個の近接ヌクレオチドのエフェクター配列を含む１種もしくは複数種のｄｓＲＮＡエフェクター分子を前記脊椎動物細胞に投与する工程を含み、前記エフェクター配列が前記一本鎖ウイルスの前記逆鎖複製中間体を選択的に標的にする、方法。
39. 前記脊椎動物細胞がヒト細胞であり、かつ前記一本鎖ウイルスがＣ型肝炎ウイルスである請求項３８に記載の方法。

Images