JP5934310B2 - 遺伝子サイレンシングに有用なｈｂｖおよびｈｃｖ保存配列 - Google Patents

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Description

関連出願の相互参照
本出願は、２００４年１２月２２日に出願された、米国仮特許出願第60/638,294号明細書からの優先権を主張し、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。
発明の分野
本発明は、転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）および転写遺伝子サイレンシング（ＴＧＳ）を含む二本鎖ＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングにより、哺乳動物細胞中のＨＢＶおよび／またはＨＣＶの発現を調節するために、既知のＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）株および既知のＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）株の保存遺伝子配列を利用する方法および組成物に関する。
発明の背景
ヒトＣ型肝炎（ＨＣＶ）は、世界で推定２億人が感染している主要な公衆衛生問題である。米国内の年間新感染数は、２００１年に約２万５千件であると推定される。この数は、供血者スクリーニングによって１９８０年代の年間新症例推定２４万件からは減少した。それにもかかわらず、推定３９０万人（１．８％）のアメリカ人がＨＣＶに感染したことがあり、そのうち２７０万人は慢性感染している。Ｃ型肝炎は世界規模の集団間において有意な遺伝的変異を示し、これはその頻繁な突然変異割合および急速な進化の証拠である。ＨＣＶには１５種の記録された亜型を伴う６種の基本遺伝子型があり、世界の様々な地域ごとに広く有病率が異なる。これら主要な遺伝子型の各々は、その生物学的効果において―複製、突然変異割合、肝障害の型および重症度、および検出ならびに処置選択の点で―有意に異なり得るものの、それらの差異はいまだ明確には理解されていない。
現在、ＨＣＶに対するワクチンはなく、かつ利用可能な薬物療法は、リバビリンおよびインターフェロンを含め、部分的にのみ有効である。感染者の７５〜８５％が慢性感染を発症するであろうと推定されており、慢性感染者の７０％は肝細胞癌を含む慢性肝疾患を発症すると想定される。慢性ＨＣＶ関連肝疾患は肝移植の主な適応症である。
ヒトＢ型肝炎ワクチンが１９８２年以降利用可能となったものの、世界で３億５千万人がＨＢＶに慢性感染していると推定される。米国内の年間新感染数は１９８０年代の平均２６万件から２００１年には約７万８千件に減少したが、６ヶ月超にわたるＢ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）陽性者として定義されるＢ型肝炎キャリアは推定１２５万人いる。かかるＨＢＶキャリアは、硬変、肝代償不全、および肝細胞癌を発症するリスクが高まる。大部分のキャリアは慢性Ｂ型肝炎から肝合併症を発症することはないが、１５％〜４０％は生存期間中に重篤な続発症を発症するであろうとともに、慢性感染者の１５〜２５％は慢性肝疾患により死亡に至る。
併せて世界中の全肝疾患症例の７５％を占めると推定されるＨＢＶおよび／またはＨＣＶ感染症、特に慢性感染症に罹患した患者に有効な改良された治療薬の必要がある。また、ＨＣＶに対し有効な予防法および薬剤の必要性も極めて高い。
核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ハイブリッド、ヘテロ二重鎖、および修飾核酸）は、人間および動物における疾患状態の予防および／または処置上の治療成分としての使用を含め、有意かつ多様な生物活性を備える極めて有益な薬剤として認められるようになってきた。例えば、アンチセンス機序を介して作用するオリゴヌクレオチドは標的ｍＲＮＡとハイブリダイズするよう設計され、それによりｍＲＮＡの活性を調節する。治療上の核酸利用への別のアプローチは三重または三本鎖構造の利点を生かすよう設計され、ここでは一本鎖オリゴマー（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）が二本鎖ＤＮＡ標的に結合するよう設計されることで所望の結果、例えばＤＮＡ標的からの転写阻害が生じる。治療上の核酸利用へのさらに別のアプローチはリボザイムの利点を生かすよう設計され、ここでは構造化されたＲＮＡまたは修飾オリゴマーがＲＮＡまたは二本鎖ＤＮＡ標的に結合するよう設計されることで所望の結果、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ標的の標的切断を生じさせ、ひいてはその発現を阻害する。核酸はまた、例えば免疫応答の誘発能を有するタンパク質を発現する生物体の組織または細胞にＤＮＡ分子を導入することにより、免疫剤としても使用され得る。核酸はまた、アンチセンス、リボザイム、または三重活性のＲＮＡをコードするように、もしくは生物学的機能を有するタンパク質を産生するよう翻訳されるＲＮＡを産生するように操作もされ得る。
最近になって、細胞または生物体中の標的遺伝子の領域に相補的なｄｓＲＮＡが該標的遺伝子の発現を阻害する、ＲＮＡｉまたは二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）介在性遺伝子サイレンシングの現象が認められてきた（例えば、国際公開第99/32619号パンフレット、１９９９年７月１日公表、Fire et al.、および米国特許第6,506,559号明細書：「Genetic Inhibition by Double-Stranded RNA」、国際公開第00/63364号パンフレット：「Methods and Compositions for Inhibiting the Function of Polynucleotide Sequences」,PachukおよびSatishchandran、および米国仮特許出願第60/419,532号明細書、２００２年１０月１８日出願を参照)。ｄｓＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングは、少なくとも部分的な二本鎖ｄｓＲＮＡを提供する組成物を利用し、極めて困難な問題である慢性ＨＢＶおよび／またはＨＣＶ感染症を含め、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶを含むウイルス感染症に対し極めて有益な治療薬および／または予防薬を提供することが期待される。
発明の概要
哺乳動物体内細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する方法であって、前記細胞に少なくとも１個の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、好ましくは２、３、４、５、６個、またはそれ以上の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を投与するステップを含んでなり、各二本鎖ＲＮＡエフェクター分子が、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号４９からなる群より選択される配列を含んでなる、方法。好ましい方法においては、各々が、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２３、および配列番号４９からなる群より選択される配列を含んでなる、３または４個のｄｓＲＮＡエフェクター分子が哺乳動物体内細胞に投与される。二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は外因的に調製されるとともに哺乳動物細胞に投与されてもよく、もしくは二本鎖ＲＮＡ発現ベクター、すなわち哺乳動物細胞中でｄｓＲＮＡエフェクター分子を発現するよう操作された発現ベクターから哺乳動物細胞中で細胞内発現されてもよい。好ましい方法においては、各々が、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２３、および配列番号４９からなる群より選択される配列を含んでなる、少なくとも３または４個のｄｓＲＮＡエフェクター分子が、哺乳動物体内細胞に投与されるｄｓＲＮＡ発現ベクターにコードされる。
哺乳動物体内細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する組成物であって、少なくとも１個の、好ましくは２、３、４、５、６個またはそれ以上の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含んでなり、各二本鎖ＲＮＡエフェクター分子が、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号４９からなる群より選択される配列を含んでなる、組成物。好ましい組成物においては、少なくとも３または４個のｄｓＲＮＡエフェクター分子が含まれ、各々が、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２３、および配列番号４９からなる群より選択される配列を含んでなる。二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は外因的に調製されるとともに２、３、４、５、６個、またはそれ以上のｄｓＲＮＡエフェクター分子を含んでなる組成物が哺乳動物細胞に投与されてもよく、もしくは組成物が哺乳動物細胞中での２、３、４、５、６個またはそれ以上の前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現能を有する１個またはそれ以上のｄｓＲＮＡ発現コンストラクトを含んでいてもよい。好ましい組成物においては、３または４個のｄｓＲＮＡエフェクター分子であって、各々が、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２３、および配列番号４９からなる群より選択される配列を含んでなるｄｓＲＮＡエフェクター分子が、ｄｓＲＮＡ発現ベクターにコードされる。
哺乳動物体内細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する方法であって、前記細胞に少なくとも２個、好ましくは３、４、５、６個またはそれ以上の、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を投与するステップを含んでなり、各二本鎖ＲＮＡエフェクター分子が、Ｔに対しＵが置換される、（ａ）配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、および配列番号６２からなる群より選択される配列、（ｂ）前記選択された配列の逆相補体、および（ｃ）場合により、配列（ａ）および（ｂ）を連結する配列、を含んでなる、方法。好ましい方法においては、前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子は、Ｔに対しＵが置換される、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５９、および配列番号６２からなる群より選択される３または４の配列を含んでなるであろう。二本鎖ＲＮＡエフェクター分子はステム−ループまたはヘアピン構造および／またはデュプレックス二本鎖ＲＮＡ分子であり得る。二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は外因的に調製されるとともに２、３、４、５、６個、またはそれ以上のｄｓＲＮＡエフェクター分子が哺乳動物細胞に投与されてもよく、もしくは哺乳動物細胞中での２、３、４、５、６個またはそれ以上の前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現能を有する１個またはそれ以上のｄｓＲＮＡ発現コンストラクトが投与されてもよい。
哺乳動物体内細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する組成物であって、少なくとも２個の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含んでなり、各二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、Ｔに対しＵが置換される、（ａ）配列番号５４、配列番号５５、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、および配列番号６２からなる群より選択される配列、（ｂ）前記選択された配列の逆相補体、および（ｃ）場合により、配列（ａ）および（ｂ）を連結する配列、を含んでなる、組成物。好ましい組成物においては、Ｔに対しＵが置換される、配列番号５４、配列番号５５、配列番号５９、および配列番号６２からなる群より選択される配列を含んでなる、３または４個の前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子が含まれるか、もしくは発現ベクターにコードされるであろう。二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は外因的に調製されるとともに組成物は哺乳動物体内細胞への投与のための２、３、４、５、６個、またはそれ以上の前記ｄｓＲＮＡを含んでなるであろう、もしくは組成物が哺乳動物細胞中での２、３、４、５、６個またはそれ以上の前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現能を有する１個またはそれ以上のｄｓＲＮＡ発現コンストラクトを含んでいてもよい。
別の態様において、本発明は哺乳動物体内細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する方法および組成物であって、前記細胞に少なくとも２個、好ましくは３、４、５、６個またはそれ以上の、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を投与するステップを含んでなり、各二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、Ｔに対しＵが置換される、（ａ）配列番号５０；配列番号５１；配列番号５２；配列番号５３；配列番号５４、配列番号５５、配列番号５６；配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６０；配列番号６１；および配列番号６２からなる群より選択される配列、（ｂ）前記選択された配列の逆相補体、および（ｃ）場合により、配列（ａ）および（ｂ）を連結する配列、を含んでなる、方法および組成物に関する。
配列番号４９を含んでなるポリヌクレオチド配列。
哺乳動物体内細胞中のＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する方法であって、前記細胞に、（ａ）配列位置９５１０〜９５３１、９５１０〜９５３３、９５１０〜９５３４、９５１０〜９５３５、９５１０〜９５３６、９５１４〜９５３４、９５１４〜９５３５、９５１４〜９５３６、９５１４〜９５３９、９５１４〜９５４０、９５１４〜９５４２、９５１７〜９５３９、９５１７〜９５４０、９５１７〜９５４２、９５１７〜９５４４、９５１８〜９５３９、９５１８〜９５４０、９５１８〜９５４２、９５１８〜９５４４、９５２０〜９５４０、９５２０〜９５４２、９５２０〜９５４４、９５２０〜９５４８、９５２１〜９５４２、９５２１〜９５４４、９５２１〜９５４８、９５２１〜９５４９、９５２２〜９５４２、９５２２〜９５４４、９５２２〜９５４８、９５２２〜９５４９、９５２７〜９５４８、９５２７〜９５４９、９５２７〜９５５１、９５２７〜９５５２、９５２７〜９５５３、９５２７〜９５５５、９５２８〜９５４８、９５２８〜９５４９、９５２８〜９５５１、９５２８〜９５５２、９５２８〜９５５３、９５２８〜９５５５、９５３０〜９５５１、９５３０〜９５５２、９５３０〜９５５３、９５３０〜９５５５、９５３０〜９５５７、９５３０〜９５５８、９５３２〜９５５２、９５３２〜９５５３、９５３２〜９５５５、９５３２〜９５５７、９５３２〜９５５８、９５３２〜９５５９、９５３２〜９５６０、９５３７〜９５５７、９５３７〜９５５８、９５３７〜９５５９、９５３７〜９５６０、９５３７〜９５６１、９５３７〜９５６４、９５３８〜９５５８、９５３８〜９５５９、９５３８〜９５６０、９５３８〜９５６１、９５３８〜９５６４、９５３８〜９５６６、９５４１〜９５６１、９５４１〜９５６４、９５４１〜９５６６、９５４１〜９５６８、９５４１〜９５６９、９５４３〜９５６４、９５４３〜９５６６、９５４３〜９５６８、９５４３〜９５６９、９５４３〜９５７１、９５４５〜９５６６、９５４５〜９５６８、９５４５〜９５６９、９５４５〜９５７１、９５４５〜９５７３、９５４６〜９５６４、９５４６〜９５６６、９５４６〜９５６９、９５４６〜９５７１、９５４６〜９５７３、９５４７〜９５６８、９５４７〜９５６９、９５４７〜９５７１、９５４７〜９５７３、９５４７〜９５７５、９５５０〜９５７１、９５５０〜９５７３、９５５０〜９５７５、９５５０〜９５７７、９５５０〜９５７８、９５５４〜９５７５、９５５４〜９５７７、９５５４〜９５７８、９５５４〜９５８０、９５５６〜９５７７、９５５６〜９５７８、９５５６〜９５８０、９５５６〜９５８４、９５６２〜９５８４、９５６２〜９５８６、９５６２〜９５８７、９５６２〜９５８８、９５６２〜９５８９、９５６３〜９５８４、９５６３〜９５８６、９５６３〜９５８７、９５６３〜９５８８、９５６３〜９５８９、９５６３〜９５９１、９５６５〜９５８６、９５６５〜９５８７、９５６５〜９５８８、９５６５〜９５８９、９５６５〜９５９１、９５６５〜９５９３、９５６７〜９５８７、９５６７〜９５８８、９５６７〜９５８９、９５６７〜９５９１、９５６７〜９５９３、９５６７〜９５９５、９５７０〜９５９１、９５７０〜９５９３、９５７０〜９５９５、９５７０〜９５９６、９５７０〜９５９８、９５７２〜９５９３、９５７２〜９５９５、９５７２〜９５９６、９５７２〜９５９８、９５７４〜９５９５、９５７４〜９５９６、９５７４〜９５９８、９５７４〜９６０１、９５７６〜９５９６、９５７６〜９５９８、９５７６〜９６０１、９５７６〜９６０４、９５７９〜９６０１、９５７９〜９６０４、９５８１〜９６０１、９５８１〜９６０４、および９５８３〜９６０４位からなる群より選択されるＣ型肝炎ウイルスＤＮＡコード鎖配列と等しいＲＮＡ配列、および（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスＤＮＡコード鎖配列と等しい選択された配列の逆相補体であるＲＮＡ配列を含んでなる、少なくとも１個の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、好ましくは２、３、４、５、６個、またはそれ以上の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を投与するステップを含んでなる、方法。ある実施形態において、前記ＲＮＡ配列（ａ）および（ｂ）はループ配列により連結されるとともに二本鎖ＲＮＡエフェクター分子はステム−ループまたはヘアピンｄｓＲＮＡ構造を形成する。ある態様において、前記二本鎖ＲＮＡエフェクター分子は、２本の別個のＲＮＡ鎖から形成される、デュプレックスｄｓＲＮＡである。ある態様において、本方法は哺乳動物細胞に１、２、３、４、５個またはそれ以上の前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子をコードする発現コンストラクトを投与するステップを含む。ＨＣＶマイナス鎖を標的とするよう設計されるある実施形態において、ｄｓＲＮＡエフェクター分子は、（ａ）上記に特定されるとおりのＣ型肝炎ウイルスＤＮＡコード鎖配列と一致するＲＮＡ配列、および（ｂ）場合によりループ配列により連結される前記ＲＮＡ配列の逆相補体、を含んでなるであろう。ある実施形態において、ｄｓＲＮＡエフェクター分子は発現コンストラクトによりコードされる。
ある態様において、本発明は哺乳動物体内細胞中のＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する組成物であって、少なくとも１個の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、好ましくは２、３、４、５、６個またはそれ以上の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、または哺乳動物体内細胞中での１、２、３、４、５、６個またはそれ以上の前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の転写能を有するｄｓＲＮＡ発現コンストラクトを含んでなり、前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の各々が、（ａ）配列位置９５１０〜９５３１、９５１０〜９５３３、９５１０〜９５３４、９５１０〜９５３５、９５１０〜９５３６、９５１４〜９５３４、９５１４〜９５３５、９５１４〜９５３６、９５１４〜９５３９、９５１４〜９５４０、９５１４〜９５４２、９５１７〜９５３９、９５１７〜９５４０、９５１７〜９５４２、９５１７〜９５４４、９５１８〜９５３９、９５１８〜９５４０、９５１８〜９５４２、９５１８〜９５４４、９５２０〜９５４０、９５２０〜９５４２、９５２０〜９５４４、９５２０〜９５４８、９５２１〜９５４２、９５２１〜９５４４、９５２１〜９５４８、９５２１〜９５４９、９５２２〜９５４２、９５２２〜９５４４、９５２２〜９５４８、９５２２〜９５４９、９５２７〜９５４８、９５２７〜９５４９、９５２７〜９５５１、９５２７〜９５５２、９５２７〜９５５３、９５２７〜９５５５、９５２８〜９５４８、９５２８〜９５４９、９５２８〜９５５１、９５２８〜９５５２、９５２８〜９５５３、９５２８〜９５５５、９５３０〜９５５１、９５３０〜９５５２、９５３０〜９５５３、９５３０〜９５５５、９５３０〜９５５７、９５３０〜９５５８、９５３２〜９５５２、９５３２〜９５５３、９５３２〜９５５５、９５３２〜９５５７、９５３２〜９５５８、９５３２〜９５５９、９５３２〜９５６０、９５３７〜９５５７、９５３７〜９５５８、９５３７〜９５５９、９５３７〜９５６０、９５３７〜９５６１、９５３７〜９５６４、９５３８〜９５５８、９５３８〜９５５９、９５３８〜９５６０、９５３８〜９５６１、９５３８〜９５６４、９５３８〜９５６６、９５４１〜９５６１、９５４１〜９５６４、９５４１〜９５６６、９５４１〜９５６８、９５４１〜９５６９、９５４３〜９５６４、９５４３〜９５６６、９５４３〜９５６８、９５４３〜９５６９、９５４３〜９５７１、９５４５〜９５６６、９５４５〜９５６８、９５４５〜９５６９、９５４５〜９５７１、９５４５〜９５７３、９５４６〜９５６４、９５４６〜９５６６、９５４６〜９５６９、９５４６〜９５７１、９５４６〜９５７３、９５４７〜９５６８、９５４７〜９５６９、９５４７〜９５７１、９５４７〜９５７３、９５４７〜９５７５、９５５０〜９５７１、９５５０〜９５７３、９５５０〜９５７５、９５５０〜９５７７、９５５０〜９５７８、９５５４〜９５７５、９５５４〜９５７７、９５５４〜９５７８、９５５４〜９５８０、９５５６〜９５７７、９５５６〜９５７８、９５５６〜９５８０、９５５６〜９５８４、９５６２〜９５８４、９５６２〜９５８６、９５６２〜９５８７、９５６２〜９５８８、９５６２〜９５８９、９５６３〜９５８４、９５６３〜９５８６、９５６３〜９５８７、９５６３〜９５８８、９５６３〜９５８９、９５６３〜９５９１、９５６５〜９５８６、９５６５〜９５８７、９５６５〜９５８８、９５６５〜９５８９、９５６５〜９５９１、９５６５〜９５９３、９５６７〜９５８７、９５６７〜９５８８、９５６７〜９５８９、９５６７〜９５９１、９５６７〜９５９３、９５６７〜９５９５、９５７０〜９５９１、９５７０〜９５９３、９５７０〜９５９５、９５７０〜９５９６、９５７０〜９５９８、９５７２〜９５９３、９５７２〜９５９５、９５７２〜９５９６、９５７２〜９５９８、９５７４〜９５９５、９５７４〜９５９６、９５７４〜９５９８、９５７４〜９６０１、９５７６〜９５９６、９５７６〜９５９８、９５７６〜９６０１、９５７６〜９６０４、９５７９〜９６０１、９５７９〜９６０４、９５８１〜９６０１、９５８１〜９６０４、および９５８３〜９６０４位からなる群より選択されるＣ型肝炎ウイルスＤＮＡコード鎖配列と等しいＲＮＡ配列、および（ｂ）Ｃ型肝炎ウイルスＤＮＡコード鎖配列と等しい前記選択されたＲＮＡ配列の逆相補体を含んでなる、組成物に関する。ある実施形態において、前記ＲＮＡ配列（ａ）および（ｂ）はループ配列により連結されるとともに、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子はステム−ループまたはヘアピンｄｓＲＮＡ構造を形成する単一ＲＮＡ鎖である。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡエフェクター分子は２本の別個のＲＮＡ鎖から形成されるデュプレックスｄｓＲＮＡ分子である。
別の態様において、本発明は哺乳動物体内細胞中のＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する組成物であって、少なくとも１個の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、好ましくは２、３、４、５、６個またはそれ以上の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、または哺乳動物体内細胞中での１、２、３、４、５、６個またはそれ以上の前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現能を有するｄｓＲＮＡ発現コンストラクトを含んでなり、前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の各々が、Ｔに対しＵが置換される、（ａ）配列番号６３；配列番号６４；配列番号６５；配列番号６６；配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９；配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３；配列番号７４；配列番号７５；および配列番号７６からなる群より選択される配列、（ｂ）前記選択された配列の逆相補体、および（ｃ）場合により、配列（ａ）および（ｂ）を連結する配列を含んでなる、組成物に関する。特定の好ましい実施形態において、配列は、配列番号７２；配列番号７３；配列番号７４；配列番号７５；および配列番号７６からなる群より選択される。
別の態様において、本発明は哺乳動物体内細胞中のＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する方法であって、少なくとも１個の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、好ましくは２、３、４、５、６個またはそれ以上の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、または哺乳動物体内細胞中での１、２、３、４、５、６個またはそれ以上の前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の発現能を有するｄｓＲＮＡ発現コンストラクトを投与するステップを含んでなり、前記ｄｓＲＮＡエフェクター分子の各々が、Ｔに対しＵが置換される、（ａ）配列番号６３；配列番号６４；配列番号６５；配列番号６６；配列番号６７、配列番号６８、配列番号６９；配列番号７０、配列番号７１、配列番号７２、配列番号７３；配列番号７４；配列番号７５；および配列番号７６からなる群より選択される配列、（ｂ）前記選択された配列の逆相補体、および（ｃ）場合により、配列（ａ）および（ｂ）を連結する配列を含んでなる、方法に関する。特定の好ましい実施形態において、配列は、配列番号７２；配列番号７３；配列番号７４；配列番号７５；および配列番号７６からなる群より選択される。
別の態様において、本発明は、配列位置９５１０〜９５３１、９５１０〜９５３３、９５１０〜９５３４、９５１０〜９５３５、９５１０〜９５３６、９５１４〜９５３４、９５１４〜９５３５、９５１４〜９５３６、９５１４〜９５３９、９５１４〜９５４０、９５１４〜９５４２、９５１７〜９５３９、９５１７〜９５４０、９５１７〜９５４２、９５１７〜９５４４、９５１８〜９５３９、９５１８〜９５４０、９５１８〜９５４２、９５１８〜９５４４、９５２０〜９５４０、９５２０〜９５４２、９５２０〜９５４４、９５２０〜９５４８、９５２１〜９５４２、９５２１〜９５４４、９５２１〜９５４８、９５２１〜９５４９、９５２２〜９５４２、９５２２〜９５４４、９５２２〜９５４８、９５２２〜９５４９、９５２７〜９５４８、９５２７〜９５４９、９５２７〜９５５１、９５２７〜９５５２、９５２７〜９５５３、９５２７〜９５５５、９５２８〜９５４８、９５２８〜９５４９、９５２８〜９５５１、９５２８〜９５５２、９５２８〜９５５３、９５２８〜９５５５、９５３０〜９５５１、９５３０〜９５５２、９５３０〜９５５３、９５３０〜９５５５、９５３０〜９５５７、９５３０〜９５５８、９５３２〜９５５２、９５３２〜９５５３、９５３２〜９５５５、９５３２〜９５５７、９５３２〜９５５８、９５３２〜９５５９、９５３２〜９５６０、９５３７〜９５５７、９５３７〜９５５８、９５３７〜９５５９、９５３７〜９５６０、９５３７〜９５６１、９５３７〜９５６４、９５３８〜９５５８、９５３８〜９５５９、９５３８〜９５６０、９５３８〜９５６１、９５３８〜９５６４、９５３８〜９５６６、９５４１〜９５６１、９５４１〜９５６４、９５４１〜９５６６、９５４１〜９５６８、９５４１〜９５６９、９５４３〜９５６４、９５４３〜９５６６、９５４３〜９５６８、９５４３〜９５６９、９５４３〜９５７１、９５４５〜９５６６、９５４５〜９５６８、９５４５〜９５６９、９５４５〜９５７１、９５４５〜９５７３、９５４６〜９５６４、９５４６〜９５６６、９５４６〜９５６９、９５４６〜９５７１、９５４６〜９５７３、９５４７〜９５６８、９５４７〜９５６９、９５４７〜９５７１、９５４７〜９５７３、９５４７〜９５７５、９５５０〜９５７１、９５５０〜９５７３、９５５０〜９５７５、９５５０〜９５７７、９５５０〜９５７８、９５５４〜９５７５、９５５４〜９５７７、９５５４〜９５７８、９５５４〜９５８０、９５５６〜９５７７、９５５６〜９５７８、９５５６〜９５８０、９５５６〜９５８４、９５６２〜９５８４、９５６２〜９５８６、９５６２〜９５８７、９５６２〜９５８８、９５６２〜９５８９、９５６３〜９５８４、９５６３〜９５８６、９５６３〜９５８７、９５６３〜９５８８、９５６３〜９５８９、９５６３〜９５９１、９５６５〜９５８６、９５６５〜９５８７、９５６５〜９５８８、９５６５〜９５８９、９５６５〜９５９１、９５６５〜９５９３、９５６７〜９５８７、９５６７〜９５８８、９５６７〜９５８９、９５６７〜９５９１、９５６７〜９５９３、９５６７〜９５９５、９５７０〜９５９１、９５７０〜９５９３、９５７０〜９５９５、９５７０〜９５９６、９５７０〜９５９８、９５７２〜９５９３、９５７２〜９５９５、９５７２〜９５９６、９５７２〜９５９８、９５７４〜９５９５、９５７４〜９５９６、９５７４〜９５９８、９５７４〜９６０１、９５７６〜９５９６、９５７６〜９５９８、９５７６〜９６０１、９５７６〜９６０４、９５７９〜９６０１、９５７９〜９６０４、９５８１〜９６０１、９５８１〜９６０４、および９５８３〜９６０４位からなる群より選択されるＣ型肝炎ウイルスＤＮＡコード鎖配列と等しいおよび／または相補的なＲＮＡ配列を含んでなるポリヌクレオチド配列に関する。
出願人はさらに、哺乳動物体内細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する方法であって、前記細胞に、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群より選択される配列内由来の少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を投与するステップを含んでなる、方法を提供する。方法の好ましい実施形態において、２本以上の配列ＩＤ配列由来のエフェクター配列が同一細胞に投与されてもよく、および／または同一配列ＩＤ配列内由来の２本以上のエフェクター配列が同一細胞に投与されてもよい。
出願人はさらに、哺乳動物体内細胞中のＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する方法であって、前記細胞に、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号２７からなる群より選択される配列内由来の少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を投与するステップを含んでなる、方法を提供する。方法の本態様の好ましい実施形態において、配列番号１１および配列番号１２の双方に由来するエフェクター分子が同一細胞に投与されてもよく、もしくは配列番号１１および配列番号２７の双方、または配列番号１２および配列番号２７の双方、または配列番号１１、配列番号１２、および配列番号２７の各々に由来して同一細胞に投与される、および／または同一配列番号内由来の２個以上のエフェクター分子が同一細胞に投与されてもよい。
出願人はさらに、同一哺乳動物体内細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列およびＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の双方の発現を阻害する方法であって、前記細胞に、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群より選択される配列内由来の第１の少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、および、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１１、配列番号１２、および配列番号２７からなる群より選択される配列内由来の第２の少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を投与するステップを含んでなる、方法を提供する。本発明の本態様の好ましい実施形態において、配列番号１〜配列番号１０のうちの２本以上に由来するエフェクター分子が同一細胞に投与されてもよく、および／または配列番号１１および配列番号１２の双方、または配列番号１１および配列番号２７の双方、または配列番号１２および配列番号２７の双方、または配列番号１１、配列番号１２および配列番号２７に由来するエフェクター分子が同一細胞に投与されてもよく、および／または同一配列番号内由来の２個以上のエフェクター分子が同一細胞に投与されてもよい。
出願人はさらに、哺乳動物体内細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する組成物であって、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群より選択される配列内由来の少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含んでなる組成物を提供する。組成物の好ましい実施形態としては、配列番号１〜配列番号１０のうちの２本以上の配列内に由来するエフェクター分子が組成物中に存在する場合、および／または同一配列番号内由来の２個以上のエフェクター分子が組成物中に存在する場合が挙げられる。
出願人はさらに、哺乳動物体内細胞中のＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する組成物であって、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１１および配列番号１２および配列番号２７からなる群より選択される配列内由来の少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含んでなる組成物を提供する。組成物の好ましい実施形態としては、配列番号１１および配列番号１２の双方に由来するエフェクター分子が組成物中に存在する、もしくは配列番号１１および配列番号２７の双方、または配列番号１２および配列番号２７の双方、または配列番号１１、配列番号１２、および配列番号２７の各々に由来して同一組成物中に存在する場合、および／または同一配列番号内由来の２個以上のエフェクター分子が組成物中に存在し得る場合が挙げられる。
出願人はさらに、単一哺乳動物体内細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列およびＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の双方の発現を阻害する組成物であって、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０からなる群より選択される配列内由来の第１の少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、および、Ｔに対しＵが置換される、配列番号１１および配列番号１２および配列番号２７からなる群より選択される配列内由来の第２の少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含んでなる、組成物を提供する。組成物の好ましい実施形態としては、配列番号１〜配列番号１０のうちの２本以上に由来するエフェクター分子が組成物中に存在する場合、および／または配列番号１１および配列番号１２の双方、または配列番号１１および配列番号２７の双方、または配列番号１２および配列番号２７の双方、または配列番号１１、配列番号１２、および配列番号２７の各々に由来するエフェクター分子が組成物中に存在する場合、および／または同一配列番号内由来の２本以上のエフェクター配列が組成物中に存在し得る場合が挙げられる。
上記の本発明の方法および組成物の特に好ましい実施形態において、ポリヌクレオチド配列はＲＮＡの二本鎖領域内に存在するとともに、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
さらに提供されるのは、哺乳動物細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列および／またはＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する組成物であり、ここで前記組成物は配列番号１〜配列番号１２、および配列番号２７、前記配列番号１〜配列番号１２、および配列番号２７の配列の相補配列、およびそれら配列の混合配列内から選択される少なくとも１９連続ヌクレオチドの配列を含んでなる。本発明の本実施形態において、「少なくとも１９連続ヌクレオチドの配列」は好ましくはＤＮＡであるとともに、哺乳動物細胞は好ましくはヒトである。また任意の前述の組成物を含んでなる発現コンストラクトおよび前記発現コンストラクトを含んでなる哺乳動物細胞も提供される。
別の態様は、配列番号１４〜配列番号２６より選択される配列を含んでなるポリヌクレオチド配列を提供する。本発明の別の態様は、配列番号１４〜配列番号２６より選択される配列のヌクレオチド１〜１９、１〜２０、１〜２１、２〜２０、２〜２１、または３〜２１を含んでなるポリヌクレオチド配列を提供する。本発明の別の態様は、配列番号２７〜配列番号４４より選択される配列内由来の少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列を含んでなるポリヌクレオチド配列を提供する。
別の態様は、哺乳動物細胞中のＣ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する組成物であって、Ｔに対しＵが置換される、配列番号２７内由来の少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列を含んでなる二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含んでなる組成物を提供する。
前述の方法および組成物の様々な態様において、哺乳動物体内細胞はヒト体内細胞である。
図面の簡単な説明
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターの配置を図示するベクターおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを描き、ヘアピンｅｉＲＮＡ配列の包接を示す。 表２に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。 表３に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。 表４に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。 表５に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。 表６に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。 表７に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。 表８に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。 有効なＨＢＶ−ＡＹＷｓｈＲＮＡインサートを描く図である。 表９に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。 ノーザンブロット分析によるＨＢＶ−ＲＮＡの下方制御を示す棒グラフである。 表１２に見られるデータに対応するＨＢｓＡｇ阻害を示すグラフである。 実施例２の実験１でさらに詳細に記載されるとおり、（左から右に）０、９、および２０ピコモルの同定されたｓｉＲＮＡでのＨＣＶＮＳ５Ａタンパク質レベルを示すウエスタンブロットである。 実施例２の実験２でさらに詳細に記載されるとおり、（左から右に）０、９、および２０ピコモルの同定されたｓｉＲＮＡ、および０、３、および９ピコモルの「コア」陽性対照ｓｉＲＮＡでのＨＣＶＮＳ５Ａタンパク質レベルを示すウエスタンブロットである。 遺伝子サイレンシング用発現ｓｈＲＮＡを含む、Ｃ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害するｄｓＲＮＡエフェクター分子の生成に好適な追加的ＨＣＶ保存ゲノム配列セグメントの表である。各配列は、二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、例えばＨＣＶ−ＲＮＡのマイナス鎖を分解することを標的とするｓｈＲＮＡまたはデュプレックスｄｓＲＮＡ分子を転写または設計するため（その逆相補体と共に）利用され得る標準的な５’から３’の極性のＤＮＡコード鎖配列を表す。例えば、後にループ配列（例えば、本明細書中で別記されるとおりの９塩基ループ配列）が続き、表に与えられる配列の逆相補体が続くＤＮＡ配列は、然るべきプロモーターの制御下で発現コンストラクトに組み込まれてもよい。かかる発現コンストラクトから転写されるｓｈＲＮＡ分子は、ＨＣＶポリヌクレオチド配列の発現を阻害する、および／またはＨＣＶのｄｓＲＮＡサイレンシングを介在することが期待される。例えば、位置９５４５〜９５６６位に示される２２塩基の配列の場合、コンストラクトは、５３ｂｐインサートを含むよう作製され、９５４５〜９５６６位の２２塩基の配列、リンカーまたはループ配列、および９５４５〜９５６６位の配列の逆相補体を含んでなり、好ましくはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下であるとともにＲＮＡポリメラーゼＩＩＩターミネーター、例えば４、５個、またはそれ以上のＴ残基の一続きで終わる。Ｔの代わりにＵを有する、この配列と同等なＲＮＡは、
Figure 0005934310
（ここでＸは５３ｂｐのｓｈＲＮＡ配列の任意の他の部分と安定的な塩基対を形成することができないループの塩基を表す）を読み取るであろう（５’から３’の方向に）。しかしながら、ループは長さおよびヌクレオチド配列の双方に関してかなり異なってもよいが、ヘアピンの二本鎖「ステム」領域の形成が不利な影響を受けない限りにおいてである。このように、本発明の主題である発現コンストラクトにおいて、５’ＡＡＡＧＧＴを読み取る末端から始まる上記配列エレメントが、プロモーターより下流のかつそれと操作可能に連結される然るべきベクターにクローニングされる。本明細書中で別記されるとおり、好ましい実施形態において、場合により本明細書に記載される他の抗ＨＣＶ、および／またはＨＢＶ配列と共に、これらの配列によりコードされる２、３、４、５、６、７個、またはそれ以上のｓｈＲＮＡが、単一ｄｓＲＮＡ発現ベクターにコードされるとともにそれにより発現される。一態様において、前記複数のステム−ループまたはｓｈＲＮＡ分子の各々は異なる発現カセット内の単一発現ベクターにコードされ、各々はプロモーターおよびターミネーターと、好ましくはポリメラーゼＩＩＩプロモーターと、これは同じでも異なってもよいが、操作可能に連結される。別の態様において、２個またはそれ以上のヘアピンｄｓＲＮＡ分子は、例えば単一転写ＲＮＡ鎖が無関係なリンカー配列により隔てられる２本のかかるｓｈＲＮＡ配列を含んでなる２フィンガー分子のような、単一プロモーターから発現されてもよい。かかるコンストラクトは、単一発現ベクターが哺乳動物細胞にＨＣＶおよび／またはＨＢＶ標的ポリヌクレオチドに対する２、３、４、５個またはそれ以上の非依存性ｄｓＲＮＡエフェクター分子を提供し、特に医薬応用に望ましい。ＨＣＶおよび／またはＨＢＶポリヌクレオチド配列の阻害を実現するため、ｄｓＲＮＡ介在性サイレンシングの代替手段が、同定された配列に対応するｓｈＲＮＡまたはデュプレックスｄｓＲＮＡを化学合成または生体内発現により調製することおよびそれらを細胞内へ送達することにより達成されてもよい。
発明の詳細な説明
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、配列特異的な、動物および植物における転写後遺伝子サイレンシングまたは転写遺伝子サイレンシングの、サイレンシングされる遺伝子と配列上相同である二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）により開始される方法である。ＲＮＡ干渉が配列特異的な様式で作用することから、薬物として使用されるＲＮＡｉ分子はその標的に特異的であるに違いない。ウイルスゲノムは環境における変化に抵抗性を適応させるべく変異できる。ＨＢＶおよびＨＣＶはＲＮＡｉにとって非常に望ましいウイルス標的であるが、ウイルスの可変性ならびに変異性およびウイルスの高転写率により、ＨＢＶおよびＨＣＶはいずれの治療的および／または予防的アプローチにおいても非常に課題の多い標的となる。ＲＮＡｉを使用してウイルスゲノム複製をノックダウンするためには、ウイルスゲノム中の保存されたかつ固有の領域を同定する必要がある。同時に、毒性を回避するため、遺伝子サイレンシング用に選択される任意の配列がヒトゲノムには存在しないことが非常に重要である。
ヒトＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ） Ｂ型肝炎ウイルスはヘパドナウイルス科に属する。ＨＢＶゲノムは緩やかな環状で、部分的におよそ３，２００塩基対の二本鎖ＤＮＡである。エンベロープ（プレＳ／Ｓ）、コア（プレコア／コア）、ポリメラーゼ、およびＸタンパク質をコードする４個の部分的に重複するオープンリーディングフレームがある。プレＳ／Ｓオープンリーディングフレームはラージ（Ｌ）、ミドル（Ｍ）、スモール（Ｓ）表面糖タンパク質をコードする。プレコア／コアオープンリーディングフレームはプレコアポリペプチドに翻訳され、これが可溶性タンパク質のＢ型肝炎ｅ抗原（ＨＢｅＡｇ）およびヌクレオカプシドタンパク質のＢ型肝炎コア抗原に改変される。コアプロモーターおよびプレコア領域での突然変異はＨＢｅＡｇ産生を減少させる、または消失させることが明らかにされている。ポリメラーゼタンパク質はＤＮＡポリメラーゼと同様に逆転写酵素として機能する。Ｘタンパク質は強力なトランスアクチベーターであるとともに肝臓癌形成において役割を果たし得る。
ＨＢＶの複製サイクルはビリオンの肝実質細胞への付着から始まる。肝実質細胞核の内部では、ＨＢＶプラス鎖ＤＮＡの合成が完了されるとともにウイルスゲノムが共有結合閉環状ＤＮＡ（ｃｃｃＤＮＡ）に変換される。これまでに調べられた最も抗ウイルス性の薬剤は、ｃｃｃＤＮＡに対しほとんどまたは全く効果がなく、これは抗ウイルス療法の中断後のＨＢＶ血清ＤＮＡの急速な再出現を説明する。慢性Ｂ型肝炎の処置目的はＨＢＶ複製および／またはＨＢＶ抗原の発現の持続的抑制および肝疾患の寛解を実現することである。
ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）バージョン１３２．０には、４５００を超えるＨＢＶ配列および３４０のＨＢＶ完全ゲノム配列（３１７個のヒト分離株、２２個の他の霊長類由来分離株および１個のウッドチャックＨＢＶ分離株）がある。この可変性は、ＲＮＡｉなどの配列特異的な医薬的アプローチにとって重大な課題である。ＲＮＡｉ応用に好適な保存配列を同定するため、全ての完全ゲノム間の比較がＣｌｕｓｔａｌＷの修正バージョンを使用して行われた。２つの多重アラインメント計画が生成された：第１は３３９本全てのＨＢＶ完全ゲノム配列を含み、かつ第２は全てのヒトＨＢＶ分離株に限定された。多重アラインメント結果が解析され、かつＨＢＶゲノム中の各位置での配列保存スコアを含むテーブルが生成された。１９ｎｔ長より長い配列保存の最長領域を同定するスライディングウィンドウ検索が作成された。３個の主要な保存領域が同定され、かつＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＦ０９０８４０のヒトＨＢＶ分離株にマッピングされた。ＨＢＶ保存配列がヒトゲノムおよびｃＤＮＡライブラリ（ヒト染色体データベース）の双方のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列に対しスクリーニングされた。置換「ウィンドウ」として保存領域内から選択された２１ヌクレオチドおよびそれより長いセグメントがＨＢＶに固有である、すなわち、任意の２１ｎｔまたはそれより長いＨＢＶ保存セグメントとヒト染色体およびＲＮＡ配列の利用可能な配列データベースとの間には完全な配列一致が存在しないことが分かった。ヒト治療目的では、相同ヒト配列が過失でサイレンシングされることはないという保証が、ＲＮＡｉ用ウイルス保存配列の選択と同じく重要である。
ヒトＣ型肝炎ウイルス ＨＣＶは小さく（直径４０から６０ナノメートル）、外被を有し、フラビウイルス科ヘパシウイルス属の一本鎖ＲＮＡウイルスである。ゲノムはおよそ１０，０００ヌクレオチドであるとともに、約３，０００個のアミノ酸の単一ポリタンパク質をコードし、これは転写後に、３個の主要な構造的（Ｃ、Ｅ１、およびＥ２）および複数の非構造的タンパク質（［ＮＳ］ＮＳ２〜ＮＳ５）を含む、１０個のポリペプチドに切断される。ＮＳタンパク質はタンパク質プロセシング（プロテアーゼ）およびウイルス複製（ＲＮＡポリメラーゼ）に必要な酵素を含む。ウイルスは急速に突然変異するため、エンベロープタンパク質中の変化はウイルスが免疫系を回避することを助長し得る。ＨＣＶには少なくとも６種の主要な遺伝子型および９０種を超える亜型がある。異なる遺伝子型は異なる地理的分布を有する。米国内では遺伝子型１ａおよび１ｂが最も一般的である（症例の約７５％）。遺伝子型２ａおよび２ｂ（およそ１５％）および３（およそ７％）はそれほど一般的でない。
異なる遺伝子型に感染した患者の疾患の重症度または予後にほとんど差異はない。しかしながら、遺伝子型２および３の患者はインターフェロン処置に対しより反応し易い。ウイルスは肝内で高複製率であるとともに顕著な配列異質性を有する。慢性Ｃ型肝炎の処置の主目標は血中からの検出可能なウイルスＲＮＡを除去することである。治療完了後６ヶ月での血中からの検出可能な慢性Ｃ型肝炎ウイルスＲＮＡの欠如が持続性反応として知られている。研究では、持続性反応は非常に好ましい予後と同等に扱われるとともにそれが治癒に等しいといえることを示唆している。持続性反応を実現しない患者における肝瘢痕（線維症）の進行を緩徐するなど、他のより微細な処置の利点があり得る。
ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）バージョン１３４．０には、２０，０００を超えるＨＣＶ配列および９３のＨＣＶ完全ゲノム配列がある。全ての完全ゲノム間の比較がＣｌｕｓｔａｌＷの修正バージョンを使用して行われた。多重アラインメント結果が解析され、かつＨＣＶゲノム中の各位置での配列保存スコアを含むテーブルが生成された。１９ｎｔ長より長い配列保存の最長領域を同定するスライディングウィンドウ検索が作成された。３個の主要な保存領域が同定され、かつＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）ＲｅｆＳｅｑ（参照配列）受託番号ＮＣ＿００４１０２（これはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）によりアノテートされたＨＣＶ完全ゲノムである）にマッピングされた。３個の主要な保存領域はウイルスの３’非翻訳領域の一部を含み、ウイルス分離株のなかで高保存されていることが既に文献に記載されている。例えば、米国特許第5,874,565号明細書、「Nucleic Acids Comprising a Highly Conserved Novel 3' Terminal Sequence Element of the Hepatitis C Virus」を参照されたい。しかしながら、本開示は、これらの保存領域の包括的かつ詳細な分析を、多様な患者集団のなかのＨＣＶをサイレンシングする治療として単独および組み合わせでの使用に好適な複数の短鎖セグメントの発見および評価が可能であった範囲で提示する。保存配列はヒトゲノムおよびｃＤＮＡライブラリ（ヒト染色体データベース）の双方のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）配列に対してスクリーニングされ、かつ２０塩基長より長いヒト配列データベースと非相同性の一連の置換ＨＣＶセグメントが同定された。
ヒト配列との非相同性
本発明に従いサイレンシングの標的とされるウイルス保存配列が、天然由来で、正常に機能し、かつ必須の任意のヒトポリヌクレオチド配列と確実に実質上非相同であることが、ｄｓＲＮＡ分子が本発明の方法に使用される時、任意の天然由来哺乳動物必須ポリヌクレオチド配列の機能に悪影響を及ぼさないために、等しく重要である。かかる天然由来機能性哺乳動物ポリヌクレオチド配列は、所望のタンパク質をコードする哺乳動物配列、ならびに非コードながら健常哺乳動物中の必須制御配列を提供する哺乳動物配列を含む。本質的に、本発明に有用なＲＮＡ分子は、本発明の任意の方法の実施後にもその機能が妨害されないよう意図される任意の哺乳動物ポリヌクレオチド配列と配列上十分に違うものでなければならない。ＲＮＡ分子ポリヌクレオチド配列と正常哺乳動物配列との間の相同性の本質的な欠如を明確にするため、コンピュータアルゴリズムが使用され得る。
ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）との会合能およびその活性化能を有する連続ｄｓＲＮＡ配列の長さは一般に１９〜２７塩基対であると考えられることから、同定されたＨＢＶおよびＨＣＶ保存配列が双方のヒトゲノムライブラリと、および、おそらくさらにより重要なことには、上記に記載されるとおりヒトｃＤＮＡライブラリと比較された。ヒトｃＤＮＡライブラリはｍＲＮＡ中に出現する発現配列を表すことから、かかるｍＲＮＡ配列は特に、細胞に提供される相同ｄｓＲＮＡ配列によりサイレンシングを受けやすいであろう。
以上により、ＨＢＶおよびＨＣＶ保存配列がヒトゲノムおよびｃＤＮＡ配列と比較された。ヒトｃＤＮＡライブラリのＨＢＶまたはＨＣＶ保存配列との一致は同定されなかった（一部の一致はあったが、最終的にはｃＤＮＡライブラリ内でのＨＢＶ汚染と確認された）。ヒトゲノムライブラリ配列との比較により、２１ｎｔまたはそれ以上のどの配列の一致もなく、１の２０ヌクレオチドの一致、１の１９ヌクレオチドの一致が明らかとなった。これらの一致は非コード領域内であるとともに、同種体がｃＤＮＡライブラリに現れなかったことからｍＲＮＡにおいてはおそらく出現しない。従って、これらは安全上のリスクであるとは考えにくいが、所望であれば取り除かれ得る。
ＨＢＶおよびＨＣＶ由来の保存配列
ＨＢＶ保存領域１
Figure 0005934310
ＨＢＶ保存領域２
Figure 0005934310
ＨＢＶ保存領域３
Figure 0005934310
ＨＢＶ保存領域４
Figure 0005934310
ＨＢＶ保存領域５
Figure 0005934310
ＨＢＶ保存領域６
Figure 0005934310
ＨＢＶ保存領域７
Figure 0005934310
ＨＣＶ保存領域１
Figure 0005934310
ＨＣＶ保存領域２
Figure 0005934310
配列ＩＤフォーマットで表される保存コンセンサス配列
以下の配列はＷＩＰＯスタンダード（Ｓｔａｎｄａｒｄ）ＳＴ．２５（１９９８年）に
より要求されるフォーマットで表され、３７ＣＦＲ１．８２１の下で提供されるコードを
使用する。配列番号１〜配列番号１０はＨＢＶゲノムに由来する。配列番号１１および配
列番号１２はＨＣＶゲノムに由来する。
配列番号１ ＨＢＶ
Figure 0005934310
配列番号２ ＨＢＶ
Figure 0005934310
配列番号３ ＨＢＶ
Figure 0005934310
配列番号４ ＨＢＶ
Figure 0005934310
配列番号５ ＨＢＶ
Figure 0005934310
配列番号６ ＨＢＶ
Figure 0005934310
配列番号７ ＨＢＶ
Figure 0005934310
配列番号８ ＨＢＶ
Figure 0005934310
配列番号９ ＨＢＶ
Figure 0005934310
配列番号１０ ＨＢＶ
Figure 0005934310
配列番号１１ ＨＣＶ
Figure 0005934310
配列番号１２ ＨＣＶ
Figure 0005934310
二本鎖ＲＮＡ遺伝子サイレンシング／ＲＮＡｉ
「核酸組成物」または「ヌクレオチド」組成物により、１個またはそれ以上のリン酸分子が糖（例えば、五炭糖または六炭糖）と結合され、その糖がさらにプリン由来塩基（例えば、アデニン）およびピリミジン由来塩基（例えば、チミン）と結合される、任意の１個またはそれ以上の化合物が意味される。特定の天然由来核酸分子は、ゲノムデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）および宿主リボ核酸（ＲＮＡ）、ならびに数種の形態のリボ核酸、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、およびリボソーマルＲＮＡ（ｒＲＮＡ）を含む。また、種々のＲＮＡ分子に相補的である種々のＤＮＡ（ｃＤＮＡ）も含まれる。合成ＤＮＡまたは天然由来ＤＮＡとのそのハイブリッド、ならびにＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）分子（Gambari，Curr Pharm Des 2001 Nov;7(17):1839-62）もまた使用され得る。
所望の核酸分子がＲＮＡである場合に、本明細書において提供される配列中のＴ（チミン）はＵ（ウラシル）と置換されると考えられる。例えば、配列番号１〜配列番号４４は本明細書においてＤＮＡ配列として開示される。当業者には、上述の任意の配列番号由来の配列を含んでなるＲＮＡエフェクター分子はＴがＵで置換されるであろうことは明らかだろう。
核酸は典型的には、２個またはそれ以上の共有結合された天然由来または修飾されたデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドの配列を有する。修飾核酸としては、例えば、ペプチド核酸および非天然塩基を備えるヌクレオチドが挙げられる。
「ｄｓＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡエフェクター分子」とは、二本鎖構造をなす２個またはそれ以上のヌクレオチドの領域を含む核酸を意味する。本発明のウイルス保存配列は、例えば、自己相補配列を備える単一ＲＮＡ鎖が二本鎖構造を呈する能力を有する「ヘアピン」またはステム−ループ二本鎖ＲＮＡエフェクター分子、または２本の別個のＲＮＡ鎖を含んでなるデュプレックスｄｓＲＮＡエフェクター分子を含む、ｄｓＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡｉ機序を通じて作用する当該技術分野において既知の、または後に開発される「ｄｓＲＮＡエフェクター分子」の多くの組成物のなかの任意のもので利用され得ることが想定される。様々な実施形態において、ｄｓＲＮＡは全体がリボヌクレオチドからなるか、もしくは、例えば２０００年４月１９日出願の国際公開第00/63364号パンフレット、または１９９９年４月２１日出願の米国仮特許出願第60/130,377号明細書により開示されるＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドなどの、リボヌクレオチドおよびデオキシヌクレオチドの混合物からなる。ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡエフェクター分子は、分子の一セグメント内のヌクレオチドが分子の他のセグメント内のヌクレオチドと塩基対合するような自己相補領域を備える単一分子であり得る。様々な実施形態において、単一分子からなるｄｓＲＮＡは全体がリボヌクレオチドからなるか、もしくはデオキシリボヌクレオチド領域と相補的であるリボヌクレオチド領域を含む。あるいは、ｄｓＲＮＡは相互相補領域を有する２本の異種鎖を含んでもよい。様々な実施形態において、両鎖は全体がリボヌクレオチドからなる、１本の鎖は全体がリボヌクレオチドからなるとともに１本の鎖は全体がデオキシリボヌクレオチドからなる、もしくは、１本または両方の鎖はリボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドの混合物を含む。望ましくは、相補領域は、互いに対し、および標的核酸配列に対し、少なくとも７０、８０、９０、９５、９８、または１００％相補的である。望ましくは、二本鎖構造で存在するｄｓＲＮＡ領域は、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、５０、７５、１００、２００、５００、１０００、２０００または５０００個のヌクレオチドを含むか、もしくはｃＤＮＡまたはｄｓＲＮＡに呈示されている他の標的核酸配列中の全てのヌクレオチドを含む。ある実施形態において、ｄｓＲＮＡは、一本鎖末端などの一本鎖領域はどれも含まないか、もしくはｄｓＲＮＡはヘアピンである。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは１個またはそれ以上の一本鎖領域またはオーバーハングを有する。望ましいＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、アンチセンス鎖または領域である（例えば、標的核酸に対し少なくとも７０、８０、９０、９５、９８、または１００％の相補性を有する）ＤＮＡ鎖または領域およびセンス鎖または領域である（例えば、標的核酸に対し少なくとも７０、８０、９０、９５、９８、または１００％の同一性を有する）ＲＮＡ鎖または領域を含み、逆もまた同様である。様々な実施形態において、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドはインビトロで、本明細書に記載されるもの、または２０００年４月１９日出願の国際公開第00/63364号パンフレット、または１９９９年４月２１日出願の米国仮特許出願第60/130,377号明細書に記載されるものなどの酵素的または化学的合成方法を使用して作製される。他の実施形態において、インビトロで合成されたＤＮＡ鎖は、インビボまたはインビトロで、ＤＮＡ鎖の細胞への形質転換の前、後、またはそれと同時に作製されるＲＮＡ鎖と複合体を形成する。さらに他の実施形態において、ｄｓＲＮＡはセンスおよびアンチセンス領域を含む単一環状核酸であるか、もしくはｄｓＲＮＡは環状核酸および第２の環状核酸または直鎖状核酸のいずれかを含む（例えば、２０００年４月１９日出願の国際公開第00/63364号パンフレット、または１９９９年４月２１日出願の米国仮特許出願第60/130,377号明細書を参照）。例示的な環状核酸は、ヌクレオチドの遊離５’ホスホリル基が別のヌクレオチドの２’ヒドロキシル基にループバックをなす様式で連結されるようになるラリアット構造を含む。
他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、対応する２’位が水素またはヒドロキシル基を含む対応するｄｓＲＮＡと比較してインビトロまたはインビボでのｄｓＲＮＡの半減期を増加させる、糖の２’位がハロゲン（フッ素基など）を含むかもしくはアルコキシル基（メトキシ基など）を含む１個またはそれ以上の修飾ヌクレオチドを含む。さらに他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、連続するヌクレオチド間に天然由来のリン酸ジエステル結合以外の１個またはそれ以上の結合を含む。かかる結合の例として、ホスホラミド、ホスホロチオエート、およびホスホロジチオエート結合が挙げられる。ｄｓＲＮＡはまた、米国特許第6,673,661号明細書に教示されるとおりの化学修飾核酸であってもよい。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、例えば、２０００年４月１９日出願の国際公開第00/63364号パンフレット、または１９９９年４月２１日出願の米国仮特許出願第60/130,377号明細書に開示されるとおりの、１本または２本のキャッピングされた鎖を含む。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡは、コード配列または非コード配列、例えば、制御配列（例えば、転写因子結合部位、プロモーター、またはｍＲＮＡの５’または３’非翻訳領域（ＵＴＲ））を含む。加えて、ｄｓＲＮＡは、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、２０００年４月１９日出願の国際公開第00/63364号パンフレットに開示される任意の少なくとも部分的なｄｓＲＮＡ分子（例えば、８〜２２頁を参照）、ならびに２００２年７月３１日出願の米国仮特許出願第60/399,998号明細書、および２００３年７月３１日出願のPCT/US第2003/024028号明細書、および２００２年１０月１８日出願の米国仮特許出願第60/419,532号明細書および２００３年１０月２０日出願のPCT/US第2003/033466号明細書に開示される任意のｄｓＲＮＡ分子であってもよい。任意のｄｓＲＮＡはインビトロまたはインビボで、本明細書に記載される方法または、２０００年４月１９日出願の国際公開第00/63364号パンフレットに記載されるもの（例えば、１６〜２２頁を参照）などの標準方法を使用して発現されてもよい。ある好ましい実施形態において、本発明の複数の抗ＨＢＶおよび／または抗ＨＣＶｄｓＲＮＡエフェクター分子は哺乳動物細胞中で、その教示が参照により組み込まれる２００５年８月２３日出願の米国仮特許出願第60/603622号明細書、米国仮特許出願第60/629942号明細書；およびPCT/US第05/29976号明細書、「Multiple Polymerase III Promoter Expression Constructs」にさらに詳細に記載されるとおりの、各々が複数のポリメラーゼＩＩＩプロモーター発現カセットを含んでなる１個またはそれ以上の発現コンストラクトから転写される。
ｄｓＲＮＡ「ヘアピン」コンストラクトまたはｄｓＲＮＡ「ヘアピン」発現ベクター：逆方向反復配列を伴う一本鎖ＲＮＡはより効率的にｄｓＲＮＡヘアピン構造を形成するため、単分子ヘアピンｄｓＲＮＡをコードするコンストラクトはある適用においてデュプレックスｄｓＲＮＡ（すなわち、センス領域を伴う１個のＲＮＡ分子およびアンチセンス領域を伴う別個のＲＮＡ分子から構成されるｄｓＲＮＡ）をコードするコンストラクトより望ましい。このより高い効率性はある部分、デュプレックスｄｓＲＮＡを生成する集中型プロモーターを含むベクター中で生じる転写干渉の発生に依拠する。転写干渉の結果、各ＲＮＡ鎖の不完全合成が生じることにより、互いと塩基対合するとともにデュプレックスを形成することのできる完全なセンス鎖およびアンチセンス鎖の数が減少する。転写干渉は、所望であれば、（ｉ）１個のベクターがセンスＲＮＡをコードするとともに第２のベクターがアンチセンスＲＮＡをコードする２個のベクター系、（ｉｉ）個々の鎖が同一プラスミドによるが別個のシストロンの使用を通じてコードされるバイシストロン性ベクター、または（ｉｉｉ）ヘアピンｄｓＲＮＡ、すなわち、センスおよびアンチセンス配列が同一ＲＮＡ分子内でコードされるＲＮＡをコードする単一プロモーターベクター、の使用を通じて克服され得る。ヘアピン発現ベクターはデュプレックスベクターと比べある利点を有する。例えば、デュプレックスＲＮＡをコードするベクターにおいては、ＲＮＡ鎖は転写直後にその相補的な対応鎖を探すとともにそれと塩基対合する必要がある。このハイブリダイゼーションが起こらない場合、個々のＲＮＡ鎖は転写鋳型から放散するとともにセンス鎖のアンチセンス鎖に対する局在濃度が低減する。この影響は、細胞ごとの鋳型レベルが低いため、インビトロで転写されるＲＮＡと比較して細胞内転写されるＲＮＡにおいてより大きい。その上、ＲＮＡは最近傍則によりフォールドする結果、同時転写的にフォールドされる（すなわち、それらが転写されるとフォールドされる）ＲＮＡ分子となる。それゆえ完了したＲＮＡ転写のある割合は、これらの分子中の分子内塩基対合のため、相補的な第２のＲＮＡとの塩基対合に利用できない。かかる利用不可能な分子の割合は、それらの転写後の経過時間に伴い増加する。これらの分子は、既に安定的な折り畳み構造にあるため、デュプレックスを形成することはないといってもよい。ヘアピンＲＮＡにおいて、ＲＮＡ配列はその相補ＲＮＡに対し常に物理的に近接している。ＲＮＡ構造は静的ではないことから、ＲＮＡが過渡的にアンフォールドされると、その相補配列は直ちに利用可能であるとともに、非常に近いため塩基対合に関与することができる。形成されると、ヘアピン構造は元の非ヘアピン構造より安定になると予想される。特に望ましいのは、例えば、２００２年７月３１日出願の米国仮特許出願第60/399,998P号明細書、および２００３年７月３１日出願のPCT/US第2003/024028号明細書、「Double Stranded RNA Structures and Constructs and Methods for Generating and Using the Same」に教示されるとおりの、ｄｓＲＮＡヘアピンを形成するべくＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより伸長される能力を有する部分的なヘアピンである「折れ曲がり（ｆｏｒｃｅｄ）」ヘアピンコンストラクト、ならびにミスマッチ領域を伴うヘアピンである「アダリー（ｕｄｄｅｒｌｙ）」構造ヘアピン、および２００２年１０月１８日出願の米国仮特許出願第60/419,532号明細書、および２００３年１０月２０日出願のPCT/US第2003/033466号明細書、「Double-Stranded RNA Structures and Constructs, and Methods for Generating and Using the Same」に教示されるとおりのマルチエピトープコンストラクトである。
「短鎖ｄｓＲＮＡ」とは、二本鎖構造にある約２００、１００、７５、５０、４５、４０、３５、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０または１９連続ヌクレオチド長を有するｄｓＲＮＡを意味する。望ましくは、短鎖ｄｓＲＮＡは、阻害されるべき標的配列と同一の／相補的な少なくとも１９連続塩基対長の二本鎖領域を含んでなる。望ましい実施形態において、二本鎖領域は、延べ１９〜５０、１９〜４０、１９〜３０、１９〜２５、２０〜２５、２１〜２３、２５〜３０、または３０〜４０連続塩基対長の間である。ある実施形態において、短鎖ｄｓＲＮＡは、延べ３０〜５０、５０〜１００、１００〜２００、２００〜３００、４００〜５００、５００〜７００、７００〜１０００、１０００〜２０００、または２０００〜５０００ヌクレオチド長の間であるとともに、延べ３８〜６０連続塩基対長の間である二本鎖領域を有する。一実施形態において、短鎖ｄｓＲＮＡは完全な二本鎖である。ある実施形態において、短鎖ｄｓＲＮＡは１１〜３０ヌクレオチド長の間であるとともに、ｄｓＲＮＡ全体が二本鎖である。他の実施形態において、短鎖ｄｓＲＮＡは１個または２個の一本鎖領域を有する。ある実施形態において、短鎖ｄｓＲＮＡは「ｓｈＲＮＡ」または「短鎖ヘアピンＲＮＡ」または「ｓｈＲＮＡエフェクター分子」または「ｄｓＲＮＡヘアピン」であり、およそ４００〜５００ヌクレオチド（ｎｔ）長未満、好ましくは１００〜２００ｎｔ長未満であるＲＮＡ分子を意味し、そのうち少なくとも約１５〜１００ヌクレオチド（好ましくは、１７〜５０ｎｔ、より好ましくは１９〜２９ｎｔ）の少なくとも１伸長が同一ＲＮＡ分子上に位置する相補配列と塩基対合されるとともに、ここで前記配列および相補配列は、塩基相補性の２領域により作られるステム構造上に一本鎖ループを形成する少なくとも約４〜７ヌクレオチド（好ましくは約９〜約１５ヌクレオチド）の非対合領域により隔てられる。ｓｈＲＮＡ分子は阻害されるべき標的配列と相同的および相補的な約１７〜約１００ｂｐ、約１７〜約５０ｂｐ、約４０〜約１００ｂｐ、約１８〜約４０ｂｐ、または約１９〜約２９ｂｐの二本鎖ステム領域を含んでなる少なくとも１個のステム−ループ構造、および、塩基相補性の２領域により作られるステム構造上の一本鎖ループを形成する、少なくとも約４〜７ヌクレオチド、好ましくは約９〜約１５ヌクレオチドの非対合ループ領域を含んでなる。ｓｈＲＮＡとして挙げられるのは、二重または２フィンガー（すなわち、２個のステム−ループ構造を有する）およびマルチフィンガーヘアピンｄｓＲＮＡ（複数のステム−ループ構造を有する）であり、ここでＲＮＡ分子は一本鎖スペーサー領域により隔てられる２個またはそれ以上のかかるステム−ループ構造を含んでなる。ある実施形態において、発現コンストラクトが使用され、同種の複数のコピーを含む哺乳動物細胞中の１個またはそれ以上のかかるｓｈＲＮＡ分子、および／または複数の異種を含む１個またはそれ以上の短鎖ヘアピンＲＮＡ分子を発現する。互いに「同一」であると考えられる短鎖ヘアピンＲＮＡ分子は、同一の二本鎖配列のみを含んでなるものであるとともに、互いに「異なる」と考えられる短鎖ヘアピンＲＮＡ分子は、各異なる二本鎖配列により標的とされるべき配列が同一遺伝子内かまたは異なる遺伝子か、例えば、同一遺伝子のプロモーター領域および転写領域（ｍＲＮＡ）の配列かまたは２個の異なる遺伝子の配列かなどに関わらず、異なる二本鎖配列を含んでなるであろう。
特定の実施形態において、短鎖ｄｓＲＮＡはｄｓＲＮＡ介在性ストレス応答経路中でＰＫＲまたは別のタンパク質を結合する。望ましくは、かかる短鎖ｄｓＲＮＡはＰＫＲの二量化および活性を少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、または１００％阻害する。ある望ましい実施形態において、短鎖ｄｓＲＮＡは長鎖ｄｓＲＮＡのＰＫＲまたはｄｓＲＮＡ介在性ストレス応答経路の別の構成成分との結合を少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、または１００％阻害する。ｄｓＲＮＡ介在毒性を回避するため他のｄｓＲＮＡと併用する短鎖ｄｓＲＮＡの利用に関して、２００３年４月２８日出願の米国特許出願公開第10/425,006号明細書、「Methods of Silencing Genes Without Inducing Toxicity」、Pachukの教示もまた参照されたい。しかしながら出願人は、ｄｓＲＮＡ分子が、長鎖ｄｓＲＮＡ分子でさえ、ＲＮＡｉ効果が望まれる哺乳動物（または他の脊椎動物）細胞中で細胞内発現される場合、ＰＫＲまたはインターフェロンまたは「パニック」応答を含め、一般に有意なｄｓＲＮＡ介在性ストレス応答を誘起するとは考えにくいことを実証している。例えば、米国特許出願第2002/0132257号明細書、「Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell」を参照されたい。従って、かかる「発現干渉ＲＮＡ分子」または「ｅｉＲＮＡ」分子および「ｅｉＲＮＡ発現コンストラクト」、すなわち、ｄｓＲＮＡ遺伝子サイレンシングまたはＲＮＡｉが誘発される哺乳動物細胞のインビボでの細胞内または内因性発現ｄｓＲＮＡ分子（または対応するｄｓＲＮＡ発現コンストラクト）が、本発明のある態様においては好ましい。
「少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列」とは、ヌクレオチド配列は、始まりの部位が少なくとも１９連続塩基対のポリヌクレオチドの産生能を有する限り、開示されたうち１本の配列内の任意のヌクレオチドから始まり得ることを意味する。例えば、少なくとも１９連続塩基対のヌクレオチド配列はヌクレオチド１〜ヌクレオチド１９、ヌクレオチド２〜ヌクレオチド２０、ヌクレオチド３〜ヌクレオチド２１、および１９ｍｅｒを産生できるその他を含んでなることができる。このように、２０ｍｅｒはヌクレオチド１〜ヌクレオチド２０、ヌクレオチド２〜ヌクレオチド２１、ヌクレオチド３〜ヌクレオチド２２、およびその他を含んでなることができる。保存配列内より選択される、例えば２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７連続等の、２０連続ヌクレオチドを上回る同様の配列が想定される。少なくとも１９連続ヌクレオチドのかかる配列（その相補体とともに二本鎖構造）は「少なくとも１９連続塩基対の配列」であるとともに、ｄｓＲＮＡヘアピン内でデュプレックスｄｓＲＮＡとして存在してもよく、もしくはｄｓＲＮＡ発現コンストラクトにコードされてもよい。
「発現ベクター」とは、ＲＮＡを転写するよう設計される任意の二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ、例えば、下流遺伝子または目的のコード領域に操作可能に連結される少なくとも１個のプロモーターを含むコンストラクトを意味する（例えば、タンパク質をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片、または任意の目的のＲＮＡであって、場合により、例えば、コード領域外にある配列、アンチセンスＲＮＡコード領域、ｄｓＲＮＡコード領域、またはコード領域外にあるＲＮＡ配列に操作的に連結される）。発現ベクターのレシピエント細胞へのトランスフェクションまたは形質転換により細胞は、発現ベクターによってコードされるＲＮＡまたはタンパク質を発現することが可能となる。発現ベクターは、例えばバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルス由来の、遺伝子操作されたプラスミド、ウイルス、または人工染色体であってもよい。
「発現コンストラクト」とは、ＲＮＡを転写するよう設計される任意の二本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＲＮＡ、例えば、下流遺伝子または目的のコード領域に操作可能に連結される少なくとも１個のプロモーターを含むコンストラクトを意味する（例えば、タンパク質をコードするｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ断片、または任意の目的のＲＮＡ）。発現コンストラクトのレシピエント細胞へのトランスフェクションまたは形質転換により細胞は、発現コンストラクトによってコードされるＲＮＡまたはタンパク質を発現することが可能となる。発現コンストラクトは、例えばバクテリオファージ、アデノウイルス、レトロウイルス、ポックスウイルス、またはヘルペスウイルス由来の、遺伝子操作されたプラスミド、ウイルス、または人工染色体であってもよい。発現コンストラクトは生細胞中で複製可能である必要はなく、合成的に作製してもよい。二本鎖ＲＮＡエフェクター分子またはｄｓＲＮＡ分子を発現するよう操作される発現コンストラクトまたは発現ベクターは「ｄｓＲＮＡ発現コンストラクト」または「ｄｓＲＮＡ発現ベクター」である。
本発明の一実施形態において、組換え発現ベクターまたは発現コンストラクトは操作されることで、複数の、例えば、３、４、５個またはそれ以上の短鎖ヘアピンｄｓＲＮＡエフェクター分子を発現し、ポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含んでなる異なる発現カセットから発現される各々は、１個またはそれ以上が、その全ても含め、他と異なり得る。本発明の一態様において、３、４、５個またはそれ以上の異なるｓｈＲＮＡ分子を転写する組換え発現ベクター（各々、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶ保存配列に由来する／と相補的な少なくとも１９連続塩基対を含んでなる二本鎖「ステム」領域を含んでなる）が、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）および／またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の複製を阻害するため使用される。一実施形態において、各ｓｈＲＮＡ分子はポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えば、７ＳＫ、Ｈ１、およびＵ６（これは異種の同プロモーターであり得る）の制御下で発現される。複数のポリメラーゼＩＩＩ発現カセットを含んでなるかかるｄｓＲＮＡ発現コンストラクトは、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、PCT/US第05/29976号明細書、「Multiple Polymerase III Promoter Expression Constructs」にさらに詳細に記載される。一態様において、本発明の組換え発現ベクターまたは発現コンストラクトは、１個またはそれ以上のポリメラーゼＩＩＩプロモーター駆動転写ユニットからの１個またはそれ以上の２フィンガーまたはマルチフィンガーｄｓＲＮＡヘアピン分子、ならびに１個またはそれ以上のポリメラーゼＩＩＩプロモーター駆動転写ユニットからの１個またはそれ以上の単一ヘアピンｄｓＲＮＡ分子を発現し得る。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターからヘアピンｄｓＲＮＡを転写する任意の前記発現コンストラクトにおいては、ヘアピンｄｓＲＮＡは、単一ヘアピンｄｓＲＮＡもしくは２フィンガー、またはその教示が参照により本明細書に組み込まれる、２００４年４月２９日発行の国際公開第2004/035765号パンフレットに記載されるとおりのマルチフィンガーｄｓＲＮＡヘアピン、または２００４年２月５日発行の国際公開第2004/011624号パンフレットに記載されるとおりの部分的または折れ曲がりヘアピン構造であってもよいことは理解されるであろう。
「操作可能に連結される」とは、核酸配列または分子および１本またはそれ以上の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、リプレッサー、ターミネーター）が、ＲＮＡ分子、例えば、センス、アンチセンス、ｄｓＲＮＡヘアピン、またはｍＲＮＡなどの一本鎖ＲＮＡ分子の転写を可能にする、もしくは、然るべき分子が制御配列に結合される時、核酸分子の産物（すなわち、ポリペプチド）の発現および翻訳および／または分泌を可能にするような方法で結び付けられることを意味する。
「プロモーター」とは、共有結合された核酸分子の転写を進めるのに十分な核酸配列を意味する。また、細胞型特異的な、組織特異的な、または時間特異的な様式で制御可能なプロモーター依存性遺伝子発現を供するのに十分な、または外部シグナルまたは薬剤により誘導可能なそれらの転写制御エレメント（例えば、エンハンサー）もこの定義に含まれ、かかるエレメントは、当業者に周知であり、遺伝子の５’または３’領域またはイントロン内に見出し得る。例えば、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、ポリメラーゼＩＩエンハンサーエレメントを利用する修飾ポリメラーゼＩＩＩプロモーターについて指南する米国特許出願公開第2005/0130184 A1号明細書、２００５年６月１６日、Xu et al.、ならびに調節可能なポリメラーゼＩＩＩおよびポリメラーゼＩＩプロモーターについて指南する米国特許出願公開第2005/0130919 A1号明細書、２００５年６月１６日、Xu et al.を参照されたい。望ましくは、プロモーターは核酸配列、例えば、ｃＤＮＡまたは遺伝子配列に、またはｄｓＲＮＡ、例えばｓｈＲＮＡをコードする配列に、核酸配列の発現を可能にするような方法で操作可能に連結される。
本発明に従うＲＮＡ分子は、哺乳動物細胞または哺乳動物細胞中に存在する細胞外病原体に、ｄｓＲＮＡエフェクター分子または部分的二本鎖ＲＮＡ配列、もしくは、Promega Protocols and Applications Guide，(3rd ed. 1996)，eds. Doyle，ISBN No. 1 57などのテキストに記載される従来方法に従い例えばバクテリオファージＴ７、Ｔ３またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを使用する従来の酵素的合成方法によりインビトロで作製されたＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドのような組成物で送達されてもよい。あるいは、これらの分子はインビトロでの化学的合成方法により作製されてもよい［例えば、Q. Xu et al.，Nucleic Acids Res.，24(18):3643-4 (Sept. 1996)；N. Naryshkin et al.，Bioorg. Khim.，22(9):691-8 (Sept. 1996)；J. A. Grasby et al.，Nucleic Acids Res.，21(19):4444-50 (Sept 1993)；C. Chaix et al.，Nucleic Acids Res. 17:7381-93 (1989)；S. H. Chou et al.，Biochem.，28(6):2422-35 (Mar. 1989)；0. Odal el al.，Nucleic Acids Symp. Ser.，21:105-6 (1989)；N.A. Naryshkin et al.，Bioorg. Khim，22(9):691-8 (Sept. 1996)；S. Sun et al.，RNA，3(11):1352-1363 (Nov. 1997)；X. Zhang et al.，Nucleic Acids Res.，25(20):3980-3 (Oct. 1997)；S. M. Grvaznov el al.，Nucleic Acids Res.，2-6 (18):4160-7 (Sept. 1998)；M. Kadokura et al.，Nucleic Acids Symp. Ser.，37:77-8 (1997)；A. Davison et al.，Biorned. Pept. Proteins. Nucleic Acids，2(l):1-6 (1996)；およびA. V. Mudrakovskaia et al.，Bioorg. Khirn.，17(6):819-22 (Jun. 1991)を参照］。
あるいはさらに、本発明のＲＮＡ分子は組換え微生物、例えば細菌および酵母中で、または組換え宿主細胞、例えば哺乳動物細胞中で作製され得るとともに、従来技術によりその培養物から単離され得る。例えば、これらの技術を詳述する実験マニュアルの手本であるSambrook et al，MOLECULAR CLONING，A LABORATORY MANUAL，2nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York，1989に記載される技術、および参照により本明細書に組み込まれる米国特許第5,824,538号明細書、同第5,877,159号明細書、および同第5,643,771号明細書に記載される技術を参照されたい。
インビトロで調製または合成されるかかるＲＮＡ分子は、哺乳動物細胞に、またはそれらがインビトロで作製されるときには哺乳動物に、直接送達されてもよい。上記の参考文献は当業者に任意の以下の特定の実施形態を実現するために必要な技術を、本明細書に提供される教示を所与として、提供する。それゆえ、一実施形態において、組成物の「薬剤」はデュプレックス（すなわち、それは２本の鎖で作られている）、完全または部分的いずれかの二本鎖ＲＮＡである。
別の実施形態において、薬剤は一本鎖ＲＮＡセンス鎖である。別の実施形態において、組成物の薬剤は一本鎖ＲＮＡアンチセンス鎖である。
好ましくは、一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖は片方または双方の末端でヘアピンを形成する。望ましくは、一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖は末端間のある中間部でヘアピンを形成する。かかる一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖はまた、インビトロまたはインビボでそれ自身の上に折り畳まれて部分的に二本鎖となるように設計されてもよい。組成物において使用される有効な薬剤としての既存ＲＮＡ分子のいまだ別の実施形態は、場合により非塩基対合ポリヌクレオチド配列により隔てられる、センスポリヌクレオチド配列およびアンチセンスポリヌクレオチド配列の双方を含んでなる一本鎖ＲＮＡ配列である。好ましくは、この一本鎖ＲＮＡ配列は、細胞中におかれると、またはその合成中にインビトロで、二本鎖となる能力を有する。望ましい実施形態において、少なくとも約１９〜２９個の連続する塩基対の配列には二本鎖構造が想定されるであろう。望ましい実施形態において、二本鎖領域は、下方制御または阻害されるべき標的ヌクレオチド配列と同一の／相補的な少なくとも約１９連続塩基対の配列を含むであろう。
本発明のさらに別の実施形態は、上記に記載されるとおりのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドである。
合成ＲＮＡ分子のさらに別の実施形態は、場合によりロッド構造を形成する環状ＲＮＡ分子である［例えば、K-S. Wang et al.，Nature 323:508-514 (1986)を参照］か、もしくは部分的に二本鎖であるとともに、全て参照により本明細書に組み込まれる、S. Wang et al.，Nucleic Acids Res.，22(12):2326-33 (June 1994)；Y. Matsumoto et al.，Proc. Natl. Acad. Sci, USA，87(19):7628-32 (Oct. 1990)；E. Ford & M. Ares，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (8):3117-21 (Apr. 1994)；M. Tsagris et al.，Nucleic Acids Res.，19 7):1605-12 (Apr. 1991)；S. Braun et al.，Nucleic Acids Res. 24(21):4152-7 (Nov. 1996)；Z. Pasman et al.，RNA，2(6):603-10 (Jun. 1996)；P. G. Zaphiropoulos，Proc. Natl. Acad. Sci.，USA，93(13):6536-41 (Jun. 1996)；D. Beaudry et al.，Nucleic Acids Res.，23(15):3064-6 (Aug. 1995)に記載される技術に従い調製され得る。さらに別の薬剤は、別個の鎖上に存在するか、もしくは同一鎖上に散在するＲＮＡおよびＤＮＡを含んでなる二本鎖分子である。
あるいは、ＲＮＡ分子はインビボで形成されることで、哺乳動物細胞または哺乳動物への薬剤の送達後インビボでかかる部分的二本鎖ＲＮＡ分子を生成する「送達剤」により送達されてもよい。このように、本発明の組成物を形成する薬剤は、一実施形態において、上述のＲＮＡ分子の１つを「コードする」二本鎖ＤＮＡ分子、例えば、ｄｓＲＮＡ発現ベクターまたは発現コンストラクトである。ＤＮＡ薬剤は、細胞内で転写されて二本鎖ＲＮＡとなるヌクレオチド配列を提供する。別の実施形態において、ＤＮＡ配列は、細胞内で上述の一本鎖ＲＮＡセンスまたはアンチセンス鎖に転写され、場合により片方または双方の末端でヘアピンを形成するかまたはそれ自身の上に折り畳まれて部分的に二本鎖となるデオキシリボヌクレオチド配列を提供する。組成物の送達剤であるＤＮＡ分子は、場合により非塩基対合ポリヌクレオチド配列により隔てられる、センスポリヌクレオチド配列およびアンチセンスポリヌクレオチド配列の双方を含んでなる一本鎖ＲＮＡを提供できるとともに、ここで一本鎖ＲＮＡ配列は二本鎖となる能力を有する。あるいは、送達剤であるＤＮＡ分子は、場合によりインビボでロッド構造または部分二本鎖を形成する上述の環状ＲＮＡ分子の転写を提供する。ＤＮＡ分子はまた、上記に記載されるとおりのＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、または１本のＲＮＡ鎖および１本のＤＮＡ鎖を含むデュプレックスの生体内産生も提供し得る。これらの様々なＤＮＡ分子は、上記に引用されるSambrookまたは上記に引用されるPromega文献に記載されるものなどの従来技術を用いることにより設計されてもよい。
本発明の最新の送達剤は、哺乳動物細胞中での任意の上述のＲＮＡ分子の形成が可能であり、ＤＮＡ一本鎖または二本鎖プラスミドまたはベクターであり得る。インビトロまたはインビボで本明細書に記載されるとおりＲＮＡを産生するよう設計される発現ベクターは、ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡｐｏｌＩ、ＲＮＡｐｏｌＩＩ、およびＲＮＡｐｏｌＩＩＩを含む任意のＲＮＡポリメラーゼ、およびウイルスポリメラーゼ、およびＴ７およびＳｐ６などのバクテリオファージポリメラーゼの制御下の配列を含み得る。望ましくは、哺乳動物細胞内でのｄｓＲＮＡエフェクター分子の生体内発現用に設計される発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ、および／またはミトコンドリアポリメラーゼなどの内因性哺乳動物ポリメラーゼを利用するよう設計されてもよい。同種のプロモーター、例えば、Ｕ６、Ｈ１、または７ＳＫなどのポリメラーゼＩＩＩプロモーターを利用する発現ベクターは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによる転写をもたらすべく容易に設計され得る。約４００〜５００ヌクレオチド長未満の短鎖ＲＮＡ分子の発現に好ましくあるのは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターである。ある態様において、「ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター」または「ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーター」または「ポリメラーゼＩＩＩプロモーター」または「ｐｏｌＩＩＩプロモーター」が好ましく、例えばヒト、マウス、ブタ、ウシ、霊長類、サル等の、任意の無脊椎動物、脊椎動物、または哺乳動物プロモーターが、細胞中のその自然状況において、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと結合または相互作用して、選択された宿主細胞中でＲＮＡポリメラーゼＩＩＩと相互作用して操作可能に連結された核酸配列を転写するであろう、天然のまたは操作された、その操作可能に連結された遺伝子、またはその任意の変異体を転写することを意味する。ある適用において好ましくあるのは、５’フランキング領域に存在し、ＴＡＴＡボックスを含み、かつ内部プロモーター配列を欠く、Ｕ６、Ｈ１、７ＳＫおよびＭＲＰを含むＩＩＩ型ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターである。ＲＮＡＰｏｌＩＩＩプロモーターが操作された短鎖のＲＮＡ転写の発現に特に望ましい１つの理由は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ終結と異なり、ＲＮＡＰｏｌＩＩＩ終結が、ＤＮＡコード鎖のチミン残基の短い一続きで、酵母および哺乳動物中で最短のＰｏｌＩＩＩ終結シグナルであるＴ４およびＴ５といった他のタンパク質因子なしに、Ｔ５より長く哺乳動物中では非常に稀少なオリゴ（ｄＴ）ターミネーターを伴い、効率的かつ正確に生じることである。従って、本発明の複数のポリメラーゼＩＩＩプロモーター発現コンストラクトは、然るべきオリゴ（ｄＴ）終結シグナル、すなわち、３’がＤＮＡコード鎖の各ＲＮＡＰｏｌＩＩＩプロモーターに操作可能に連結される、４、５、６個またはそれ以上のＴの配列を含むであろう。
これらのベクターは本発明に従い細胞中の所望のＲＮＡ分子を転写するため使用されてもよい。ベクターは望ましくは、内因性ミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ヒトミトコンドリアＲＮＡポリメラーゼで、この場合かかるベクターは対応するヒトミトコンドリアプロモーターを利用してもよい）を利用するよう設計されてもよい。ミトコンドリアポリメラーゼは、インビボでキャッピングされた（キャッピング酵素の発現を通じて）、またはキャップのないメッセージを生成するため使用され得る。ＲＮＡｐｏｌＩ、ＲＮＡｐｏｌＩＩ、およびＲＮＡｐｏｌＩＩＩ転写物はまた、インビボで生成されてもよい。かかるＲＮＡはキャッピングされていてもされていなくてもよく、および所望であれば、細胞質キャッピングがワクシニアキャッピング酵素またはアルファウイルスキャッピング酵素などのキャッピング酵素の使用を含む様々な手段により達成され得る。しかしながら、全てのｐｏｌＩＩ転写物はキャッピングされる。ＤＮＡベクターはプロモーターの１つを、または複数のプロモーターを組み合わせで（ミトコンドリア、ＲＮＡｐｏｌＩ、ｐｏｌＩＩ、またはｐｏｌＩＩＩ、またはウイルス、細菌またはバクテリオファージプロモーターを同種のポリメラーゼと共に）含むよう設計される。好ましくは、プロモーターがＲＮＡｐｏｌＩＩの場合、ＲＮＡ分子をコードする配列は３００ｎｔより長いオープンリーディングフレームを有するとともに核中のナンセンス変異依存性分解を阻止するための設計ルールに従わなければならない。かかるプラスミドまたはベクターは細菌、ウイルスまたはファージ由来のプラスミド配列を含むことができる。
かかるベクターは、例えば、細菌プラスミド、バクテリオファージ、酵母エピソーム、酵母染色体エレメント、およびウイルスに由来するベクターといった、染色体、エピソーム、およびウイルス由来ベクター、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝因子、コスミドおよびファージミドに由来するものなど、それらの組み合わせに由来するベクターを含む。
このように、一例示的ベクターは、一本または二本鎖ファージベクターである。別の例示的ベクターは、一本または二本鎖ＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベクターである。かかるベクターは、ポリヌクレオチド、好ましくはＤＮＡとして、ＤＮＡおよびＲＮＡを細胞に導入するための周知の技術により細胞に導入されてもよい。ファージおよびウイルスベクターの場合、ベクターは、パッケージングまたはキャプシド形成されたウイルスとして感染および形質導入用の周知の技術により細胞に導入されてもよく、かつ好ましくは導入される。ウイルスベクターは複製コンピテントまたは複製欠損であってもよい。後者の場合、ウイルス増殖は一般的に、相補的な宿主細胞中でのみ生じる。
別の実施形態において、送達剤は１種より多いＤＮＡまたはＲＮＡプラスミドまたはベクターを含んでなる。一例として、第１のＤＮＡプラスミドが上記に記載されるとおりの一本鎖ＲＮＡセンスポリヌクレオチド配列を提供できるとともに、第２のＤＮＡプラスミドが上記に記載されるとおりの一本鎖ＲＮＡアンチセンスポリヌクレオチド配列を提供でき、ここでセンスおよびアンチセンスＲＮＡ配列は塩基対合するとともに二本鎖となる能力を有する。かかるプラスミドは、他の従来のプラスミド配列、例えばタンパク質の組換え発現用のプラスミドおよびベクターを構築するために使用される周知の配列などの細菌配列を含んでなることができる。しかしながら、タンパク質発現が可能な配列、例えばコザック領域等はこれらのプラスミド構造に含まれないことが望ましい。
本発明のｄｓＲＮＡを産生するよう設計されるベクターは望ましくは、標的配列と相同かつ相補的な多くの異なるものを含め２個またはそれ以上のｄｓＲＮＡを生成するよう設計されてもよい。このアプローチは、単一ベクターが多くの、非依存的に操作可能なｄｓＲＮＡを産生し得るという点で、単一転写ユニットからのおよび多数の異なるｄｓＲＮＡの産生による単一ｄｓＲＮＡ分子より望ましく、最適な有効性のために自己選択することが可能である。これを実現するため、自己触媒配列ならびにランダムなおよび／または既定のスプライス部位を作成するための切断用配列を含め、様々な手段が用いられ得る。
哺乳動物細胞中の上述の所望のＲＮＡ分子の形成に必要な情報を提供する他の送達剤としては、本発明の所要のＲＮＡ分子に必要な配列を含むよう設計される、生きている、弱毒のまたは死菌の、不活性化された組換え細菌が挙げられる。かかる組換え細菌細胞、真菌細胞などは、参照により本発明に組み込まれる米国特許第5,824,538号明細書、第5,877,159号明細書、および第5,643,771号明細書に記載されるような従来技術を使用して調製されることができる。これらの送達剤を調製するのに有用な微生物は、大腸菌、枯草菌、ネズミチフス菌、およびシュードモナス属、ストレプトマイセス属、およびブドウ球菌属の様々な種を限定なしに含め、上記に引用される文献中に列挙されるものが挙げられる。
哺乳動物細胞中の所望の上述のＲＮＡ分子の形成に必要な情報を提供するさらに他の送達剤としては、生きている、弱毒のまたは死菌の、不活性化されたウイルス、および特に上記で考察される所要のＲＮＡポリヌクレオチド配列を保有する組換えウイルスが挙げられる。かかるウイルスは、現在遺伝子治療のための遺伝子を細胞に送達するため使用される組換えウイルスと同様に設計されてもよいが、好ましくはタンパク質またはタンパク質の機能性断片を発現する能力を有しない。所要のＲＮＡ分子を哺乳動物細胞にインビボで提供するよう操作され得る有用なウイルスまたはウイルス配列のなかには、限定なしに、アルファウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルス、デルタウイルス、ポックスウイルス、肝炎ウイルス、ヘルペスウイルス、パポバウイルス（ＳＶ４０など）、ポリオウイルス、仮性狂犬病ウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルス、陽性および陰性鎖ＲＮＡウイルス、ウイロイド、およびウイルソイド、またはその部分がある。これらの様々なウイルス送達剤は、本発明の教示を伴い、他のなかでもとりわけ、M. Di Nocola et al.，Cancer Gene Ther.，5(6):350-6 (1998)に記載されるような従来技術を適用することにより、設計されてもよい。
用語「インビボで」は、細胞のＤＮＡまたはＲＮＡ複製機構がインタクトな、好ましくは、組織培養系、組織外植体を含む無傷生細胞内、および単細胞または多細胞生物内の、任意の系を含むことが意図される。
「多重セキトープｄｓＲＮＡ」または「マルチセキトープｄｓＲＮＡ」または「多重エピトープｄｓＲＮＡ」とは、複数の標的核酸由来のセグメントを有するか、もしくは同じ標的核酸由来の非連続セグメントを有するＲＮＡ分子を意味する。例えば、多重セキトープｄｓＲＮＡは（ｉ）単一生物体の複数の遺伝子を呈示する配列、（ｉｉ）様々な異なる生物体由来の１個またはそれ以上の遺伝子を呈示する配列、および／または（ｉｉｉ）特定の遺伝子の異なる領域を呈示する配列（例えば、プロモーター由来の１本またはそれ以上の配列またはｍＲＮＡ由来の１本またはそれ以上の配列）由来のセグメントを有してもよい。望ましくは、各セグメントは標的核酸の対応する領域との実質的な配列同一性を有する。様々な望ましい実施形態において、標的核酸の対応する領域との実質的な配列同一性を有するセグメントは、少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、３０、４０、５０、１００、２００、５００、７５０、またはそれ以上の塩基長である。望ましい実施形態において、多重エピトープｄｓＲＮＡは、少なくとも２、４、６、８、１０、１５、２０個またはそれ以上の標的遺伝子の発現を、少なくとも２０、４０、６０、８０、９０、９５、または１００％阻害する。ある実施形態において、多重エピトープｄｓＲＮＡは、天然由来の５’から３’の順序のセグメントにあってもなくてもよい同一標的遺伝子由来または同一標的ポリヌクレオチド由来の非連続セグメントを有するとともに、ｄｓＲＮＡは標的核酸の発現をセグメントのうち１個のみを備えるｄｓＲＮＡより少なくとも５０、１００、２００、５００、または１０００％多く阻害する。
「セキトープ」とは、ＲＩＳＣ（ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体）と結合できるとともにそれを活性化できる二本鎖ポリリボヌクレオチドの連続配列、通常は延べ１９〜２７塩基対の間の連続配列を意味する。ここで同定される１個またはそれ以上のＨＢＶおよび／またはＨＣＶ保存ヌクレオチド配列内由来の少なくとも１個のセキトープを含んでなる配列が、本明細書で教示されるとおりｄｓＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシングに利用されてもよい。
多重エピトープ／多重セキトープｄｓＲＮＡ ２００２年１０月１８日出願の米国仮特許出願第60/419,532号明細書および２００３年１０月２０日出願のPCT/US第2003/033466号明細書に教示されるとおりの多重エピトープまたはマルチセキトープ二本鎖ＲＮＡアプローチの利点が、本発明のＨＢＶおよび／またはＨＣＶ保存配列の利用に適用可能である。ｄｓＲＮＡの単一種は同時に多くの標的遺伝子（例えば、単一の病原体、または複数の疾患に付随する遺伝子由来の複数の病原体、複数の遺伝子または配列）をサイレンシングできるため、多重エピトープｄｓＲＮＡは同一被験体中の多くの異なる指標に使用されてもよく、もしくは一被験体中の指標のサブセットおよび別の被験体中の別の指標のサブセットに使用されてもよい。かかる適用において、ｄｓＲＮＡストレス応答を惹起することなしに長鎖ｄｓＲＮＡ分子（例えば、複数の遺伝子由来の配列を伴うｄｓＲＮＡ分子）を発現する能力は極めて望ましい。例えば、各々が例えば１９〜２１ヌクレオチドと同程度に短く、望ましくは１００〜６００ヌクレオチド、またはかかる配列の全長が選択されたプラスミドの最大容量内（例えば、２０キロベース長）であるべく容易に１、２，３、４、５キロベース、またはそれ以上までの、一連の配列を使用することにより、単一のかかる医薬組成物が、比較的低価格かつ低毒性で、数多くの病原体および／または毒素、例えばＨＢＶ、ＨＣＶ、ＨＩＶ等に対する保護を提供できる。
ＨＢＶおよび／またはＨＣＶなどの高度に変異可能または急速に突然変異する病原体の複数の株および／または変異体由来の同一ポリヌクレオチドまたは遺伝子の１個またはそれ以上の遺伝子および／または異なる重複および／または非連続配列に由来する多重エピトープまたはセキトープの使用もまた、非常に有利であり得る。例えば、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶの複数の株および／または変異体を認識するとともに標的とする単一のｄｓＲＮＡ種は、ＨＢＶおよび／またはＨＣＶの様々な株／変異体用ワクチンまたは汎用的処置として使用され得る。
ＨＢＶおよび／またはＨＣＶなどの特定の病原体の複数の遺伝子をサイレンシングする能力は、この場合ＨＢＶおよび／またはＨＣＶ「逃避変異体」の選択を阻止する。対照的に、１個の遺伝子またはタンパク質を標的とするのみの典型的な小分子処置またはワクチン治療は結果として標的遺伝子またはタンパク質中での持続性突然変異を有する病原体の選択を招くとともに、こうして病原体は治療に対し抵抗性となる。本発明の多重エピトープアプローチを使用して病原体および／または病原体の広範な領域の多くの遺伝子または配列を同時に標的とすることにより、かかる「逃避変異体」の出現は有効に妨げられる。
例えば、ＨＣＶ配列番号１１および配列番号１２の双方および配列番号２７由来の配列の混合物、すなわち、ＨＣＶ配列番号１１由来の１本またはそれ以上の配列（例えば、各々少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７〜２９連続ヌクレオチド）をＨＣＶ配列番号１２由来および配列番号２７由来の１本またはそれ以上の配列（例えば、各々少なくとも１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７〜２９連続ヌクレオチド）と共に、単一ｄｓＲＮＡ分子、ｄｓＲＮＡ分子の混合物、または患者へのかかる分子の同時投与を通じて（または細胞内にかかるｄｓＲＮＡ分子を産生する１個またはそれ以上のｄｓＲＮＡ発現コンストラクトの投与により）のいずれかで含むことは、生存可能な逃避変異体を生成するウイルスの能力を低減するために、特に有利であると考えられる。同様に、多くのＨＢＶ保存配列を含んでなるｄｓＲＮＡ分子の混合物を、ある場合には１本またはそれ以上の本発明のＨＣＶ保存配列との組み合わせで、提供することが有利であろう。
同様に、２本またはそれ以上のＨＢＶ配列番号１、配列番号２、および配列番号３を、単一ｄｓＲＮＡコンストラクト、コンストラクトの混合物、または患者へのかかるコンストラクト（またはかかるｄｓＲＮＡ分子を産生するｄｓＲＮＡ発現コンストラクト）の同時投与を通じて、使用することが望ましくあり得る。配列番号１、配列番号２、および配列番号３はＨＢＶ表面抗原遺伝子に位置する。ＨＢＶｍＲＮＡの重複する性質により、次のｍＲＮＡ：表面Ａｇ（ｓＡｇ）ｍＲＮＡ、プレコア、コアおよびポリメラーゼｍＲＮＡは１本またはそれ以上のこれらの配列により標的とされるであろう。しかしながら、ｓＡｇｍＲＮＡは最も多量であることから、遺伝子サイレンシング機構が可飽和性である場合、これらのｍＲＮＡが標的とされるであろう可能性が高い。しかしながら、列挙された全てのｍＲＮＡが標的とされるであろう可能性もある。表面Ａｇの減少は幾つかの理由から望ましい：ａ）表面Ａｇは感染性ウイルスの組織化に必要とされる、ｂ）感染中の表面Ａｇの過剰発現は慢性ＨＢＶ感染中に生じる免疫アネルギーに寄与すると考えられる、およびｃ）感染した個体（ウイルス不在において、すなわち宿主ゲノムへ組み込まれたｓＡｇ配列由来でさえ）の肝中でのＨＢＶｓＡｇの発現は肝炎を誘発する。それゆえ、ｓＡｇの減少はウイルス力価を低減し、免疫アネルギーを克服し、かつ肝炎を低減／阻止する可能性がある。
ＨＢＶ配列番号４はプレコアおよびコアの固有領域に位置するとともに特にこれらのｍＲＮＡを標的とするであろう。コアタンパク質は機能性ビリオンを作製するのに必要とされるとともに、そこからこのｍＲＮＡの下方制御はウイルス力価を低減すると予想される。表面、ポリメラーゼまたはＸｍＲＮＡに対するこれらのエフェクターＲＮＡの競合があってはならない。
ＨＢＶ配列番号５〜配列番号８はポリメラーゼ遺伝子に位置する。エフェクターＲＮＡはプレコア／コアおよびポリメラーゼ転写のみを標的とすると予想される。ｓＡｇまたはＸｍＲＮＡとの競合があってはならない。ポリメラーゼはウイルスゲノムの合成に必要とされるとともに、それゆえポリメラーゼが低減されると、ウイルス粒子力価は低減すると期待される。
ＨＢＶ配列番号９はＸ遺伝子に位置する。全てのＨＢＶｍＲＮＡの末端重複性により、これらのエフェクターＲＮＡは、全てのＨＢＶウイルスｍＲＮＡを標的とする可能性を有する。Ｘタンパク質は多くの帰すべき（証明されていない）機能を有する。しかしながら、Ｘ遺伝子発現は肝細胞発癌と関連し、部分的に原発腫瘍部位外の細胞の剥離および移動の促進に関係するという証拠が現れている。Ｘ遺伝子は活性肝炎を伴うおよび伴わない個体中に組み込まれたＨＢＶ配列中に多く見られることから、Ｘ遺伝子発現の下方制御は、肝細胞癌の発生を含め、疾患を寛解すると予想される。
一般に、使用される同定された異なる配列由来の配列またはセキトープ（例えば、配列番号１、配列番号２、および／または配列番号３、加えて配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０由来の配列）が多くなるほど、ウイルスが生存可能な逃避変異体を生成することができる可能性は低くなる。また、標的とされ得るｍＲＮＡが異なるほど、ウイルス力価の低下および疾患寛解はより有意となるであろう。
マルチエピトープまたはマルチセキトープｄｓＲＮＡ発現コンストラクトまたはｄｓＲＮＡエフェクター分子、ｄｓＲＮＡ発現コンストラクトまたはｄｓＲＮＡエフェクター分子の混合物、または異なるｄｓＲＮＡ発現コンストラクトまたはｄｓＲＮＡエフェクター分子の同時投与のための望ましい組み合わせとしては、次が挙げられる：配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号４由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号５由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号６由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号７由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号８由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号４および配列番号５由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号４および配列番号６由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号４および配列番号７由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号４および配列番号８由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号４および配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号４および配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号５および配列番号６由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号５および配列番号７由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号５および配列番号８由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号５および配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号５および配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号６および配列番号７由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号６および配列番号８由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号６および配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号６および配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号７および配列番号８由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号７および配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号７および配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号８および配列番号９由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号８および配列番号１０由来の配列；配列番号１、配列番号２、または配列番号３由来の配列に加えて配列番号９および配列番号１０由来の配列；配列番号４および配列番号５由来の配列；配列番号４および配列番号６由来の配列；配列番号４および配列番号７由来の配列；配列番号４および配列番号８由来の配列；配列番号４および配列番号９由来の配列；配列番号４および配列番号１０由来の配列；配列番号５および配列番号６由来の配列；配列番号５および配列番号７由来の配列；配列番号５および配列番号８由来の配列；配列番号５および配列番号９由来の配列；配列番号５および配列番号１０由来の配列；配列番号６および配列番号７由来の配列；配列番号６および配列番号８由来の配列；配列番号６および配列番号９由来の配列；配列番号６および配列番号１０由来の配列；配列番号７および配列番号８由来の配列；配列番号７および配列番号９由来の配列；配列番号７および配列番号１０由来の配列；配列番号８および配列番号９由来の配列；配列番号８および配列番号１０由来の配列；配列番号９および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５；および配列番号６由来の配列；
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配列番号５、配列番号８；および配列番号９由来の配列;
配列番号５、配列番号８；および配列番号１０由来の配列;
配列番号５、配列番号９；および配列番号１０由来の配列;
配列番号６、配列番号７；および配列番号８由来の配列;
配列番号６、配列番号７；および配列番号９由来の配列;
配列番号６、配列番号７；および配列番号１０由来の配列;
配列番号６、配列番号８；および配列番号９由来の配列;
配列番号６、配列番号８；および配列番号１０由来の配列;
配列番号６、配列番号９；および配列番号１０由来の配列;
配列番号７、配列番号８；および配列番号９由来の配列;
配列番号７、配列番号８；および配列番号１０由来の配列;
配列番号７、配列番号９；および配列番号１０由来の配列;
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配列番号４、配列番号５；配列番号６；および配列番号７由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、および配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号６；および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号７；および配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号７；および配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号７；および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号８；および配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号８；および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５；配列番号９；および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号６；配列番号７；および配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号６；配列番号７；および配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号６；配列番号７；および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号７；配列番号８；および配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号７；配列番号８；および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号７；配列番号９；および配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６；配列番号８；および配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号６；配列番号８；および配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６；配列番号９；および配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号７；配列番号８；および配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号７；配列番号８；および配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号７；配列番号９；および配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９由来の配列；配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号７、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、および配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、および配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号９由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０由来の配列；および配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、および配列番号１０由来の配列。ある態様において好ましくあるのは、配列番号６を加える、配列番号７を加える、配列番号８を加える、配列番号５由来のセキトープの組み合わせを含む、配列番号５、配列番号６、配列番号７、および配列番号８由来の配列である。
別の実施形態において、少なくとも１９連続塩基対長のセキトープの組み合わせおよび任意の上述の配列（例えば、配列番号１〜配列番号１２）内由来のより長い配列は、単一のｄｓＲＮＡ発現コンストラクトまたはｄｓＲＮＡエフェクター分子、ｄｓＲＮＡ発現コンストラクトまたはｄｓＲＮＡエフェクター分子の混合物で、または患者へのかかるｄｓＲＮＡ発現コンストラクトまたはｄｓＲＮＡエフェクター分子の同時投与を通じてのいずれかにおいて利用され得る。「少なくとも１９連続塩基対長」の配列により、１９連続塩基長の配列またはセキトープが、二本鎖構造で、または二本鎖ＲＮＡエフェクター分子内に存在することが意味される。
本明細書の別の箇所で考察されるとおり、本発明の特に好ましい実施形態は、ｄｓＲＮＡ発現コンストラクトまたはベクターを利用して、本発明のｄｓＲＮＡ、特に上記に記載される複数の異なる配列の内因的送達を実現する。これらのｄｓＲＮＡは、例えば、プラスミドなどの発現コンストラクトの同一シストロン上、発現コンストラクトの異なるシストロン上、または異なる発現コンストラクトまたはプラスミド上、例えば、１個またはそれ以上のプラスミドおよび／またはウイルスベクターを含む１個またはそれ以上のベクター上に提供されてもよい。ｓｈＲＮＡエフェクター分子など異なるｄｓＲＮＡエフェクター分子の組み合わせが、異なるプロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよび／またはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、例えばＵ６、Ｈ１、７ＳＫ、またはＭＲＰなどの３型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターにより駆動される異なる発現カセットから転写される各ｄｓＲＮＡエフェクター分子を伴い、プラスミドなどの単一発現コンストラクトからの生体内発現により哺乳動物細胞に提供されてもよい。ある実施形態において、かかる異なる各発現カセットは、異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、これは同じでも異なってもよいが、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ終結配列を含んでもよい。別の実施形態において、ｓｈＲＮＡエフェクター分子などの異なるｄｓＲＮＡエフェクター分子の組み合わせが、複数の異なるプロモーター、例えばＲＮＡポリメラーゼＩプロモーターおよび／または、例えばＵ６、Ｈ１、７ＳＫ、またはＭＲＰなどの３型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターといった、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（ここでかかるプロモーターの各々は異なるｄｓＲＮＡエフェクター分子を転写する）を含んでなる発現カセットを含んでなるプラスミドまたはウイルスベクターなどの単一の発現コンストラクトからの生体内発現により哺乳動物細胞に提供されてもよい。かかる複数の異なるｄｓＲＮＡエフェクター配列はまた、１個またはそれ以上のｄｓＲＮＡ構造、デュプレックスおよび／またはヘアピンの任意の異なる混合物で、および／または１個またはそれ以上の内因的に発現されたｄｓＲＮＡ構造との組み合わせで、哺乳動物体内細胞へ外因的に提供されてもよい。
望ましい核酸投与の方法 本発明のＤＮＡおよび／またはＲＮＡコンストラクト、例えばｄｓＲＮＡエフェクター分子は、いかなるトランスフェクション促進剤も伴わない医薬賦形剤で調合される、「裸の」ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡ／ＲＮＡとして宿主細胞／組織／生物体に投与されてもよい。より効率的な送達が、ＤＮＡおよびＲＮＡ送達の当業者に既知のとおり、例えば、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ送達の当業者に既知のかかるポリヌクレオチドトランスフェクション促進剤を使用して実現されてもよい。以下は例示的薬剤である：ブピバカインなどの局所麻酔薬を含むカチオン両親媒性物質、カチオン脂質、リポソームまたは脂質粒子、ポリリジンなどのポリカチオン、デンドリマーなどの分枝三次元ポリカチオン、糖、デタージェント、または塩化ベンザルコニウムなどのベンジルアンモニウム化合物界面活性剤を含む界面活性剤。本発明に有用なかかる促進剤または共薬剤の非排他的な例は、その教示が本明細書によって参照により組み込まれる、米国特許第5,593,972号明細書、第5,703,055号明細書、第5,739,118号明細書、第5,837,533号明細書、第5,962,482号明細書、第6,127,170号明細書、第6,379,965号明細書、および第6,482,804号明細書、および国際特許出願PCT/US第98/22841号明細書に記載される。米国特許第5,824,538号明細書、第5,643,771号明細書、および第5,877,159号明細書（参照により本明細書に組み込まれる）は、ポリヌクレオチド組成物以外の組成物、例えば本発明のｄｓＲＮＡコード化組成物を含むトランスフェクトされたドナー細胞または細菌の送達を教示する。
ある実施形態において、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現ベクターは、米国特許第4,897,355号明細書（Eppstein et al.、１９８７年１０月２９日出願）、米国特許第5,264,618号明細書（Felgner et al.、１９９１年４月１６日出願）または米国特許第5,459,127号明細書（Felgner et al.、１９９３年９月１６日出願）に開示される組成物のように１個またはそれ以上のカチオン脂質またはカチオン両親媒性物質と複合体形成される。他の実施形態において、ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現ベクターはカチオン脂質を含むリポソーム／リポソーム組成物と複合体形成されるとともに、場合により中性脂質など別の組成物を含む（例えば、米国特許第5,279,833号明細書(Rose)、米国特許第5,283,185号明細書(Epand)、および米国特許第5,932,241号明細書を参照）。
肝実質細胞への標的送達のためを含め、医薬応用のための本発明のオリゴヌクレオチド組成物の送達に特に望ましい方法および組成物が、その教示が参照により本明細書に組み込まれる２００３年５月６日出願のPCT/US第03/14288号明細書に記載される。
研究および他の非治療目的のための細胞の形質転換／トランスフェクションは、リポフェクション、ＤＥＡＥデキストラン介在性トランスフェクション、微量注入、リン酸カルシウム沈澱、ウイルスまたはレトロウイルス送達、電気穿孔、または微粒子銃形質転換を含むが限定はされない様々な手段を通じて起こり得る。ＲＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター（ＤＮＡ）は裸のＲＮＡまたはＤＮＡまたは局所麻酔性複合型ＲＮＡまたはＤＮＡであってもよい（上記の米国特許第6,217,900号明細書および第6,383,512号明細書、「Vesicular Complexes and Methods of Making and Using the Same，Pachuk et al.を参照）
医薬応用のための本発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現コンストラクト用の別の望ましい送達技術は、シクロデキストリン含有ポリカチオンに基づく自己組織化シクロサート（Ｃｙｃｌｏｓｅｒｔ）（商標）２構成成分核酸送達系であり、これはインサート・セラピュティクス（Ｉｎｓｅｒｔ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、カリフォルニア州パサディナ（Ｐａｓａｄｅｎａ，ＣＡ）から入手可能である（Bioconjug Chem 2003 May-Jun; 14 (3): 672-8; Popielarski et al.；「Structural effects of carbohydrate-containing polycations on gene delivery. 3. Cyclodextrin type and functionalization」、ならびにBioconjug Chem 2003 Jan-Feb;14 (1):247-54および255-61を参照）。第１の構成成分は、直線状の、シクロデキストリン含有ポリカチオンポリマーであり、ＤＮＡと混合されると、核酸の「骨格」リン酸に結合して、ＤＮＡを縮合するとともに血清中においてＤＮＡをヌクレアーゼ分解から保護する均一なコロイドナノ粒子に組織化する。第２の構成成分は末端アダマンタンＰＥＧ分子を伴う表面修飾剤であり、シクロデキストリンポリマーと結合されると表面シクロデキストリンと包接複合体を形成するとともに凝集を阻止し、安定性を亢進するとともに全身投与を可能にする。加えて、細胞表面受容体の標的リガンドは、目的の標的細胞へのＤＮＡの直接的な標的送達を提供する修飾因子に付着され得る。肝実質細胞はＨＢＶおよびＨＣＶ感染を起こしやすいことから、本発明のｄｓＲＮＡ発現コンストラクトの肝細胞への標的送達にこの方法を利用することは特に有利と考えられる。例えば、哺乳動物肝実質細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）は、ガラクトシル化ポリマーなどのガラクトシル化またはラクトシル化残基を伴う合成リガンドの使用により標的とされ得る。
一般に、本発明のｄｓＲＮＡコンストラクトの選択的送達は肝実質細胞を標的とすることが好ましい。肝実質細胞を標的とすることは、肝実質細胞特異的受容体のリガンドと共役することにより実現されてもよい。例えば、アシアロ−オロソムコイド、（ポリ）Ｌ−リジン−アシアロ−オロソムコイド、または他の任意の肝アシアロ糖タンパク質受容体のリガンド（Spiess, Biochemistry 29(43):10009-10018, 1990; Wu et al., J. Biol. Chem. 267(18): 12436-12439, 1992; Wu et al., Biotherapy 3:87-95, 1991）。同様に、オリゴヌクレオチドは、肝実質細胞特異的受容体に特異的に結合するモノクローナル抗体に共役させることにより肝実質細胞を標的としてもよい。オリゴヌクレオチドはまた、以下に記載されるとおり、特異的ベクターを使用して肝実質細胞を標的としてもよい。
本発明のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現コンストラクトの送達に特に好ましい組成物は、2003年5月6日出願のPCT/US第03/14288号明細書に記載されるとおりの多機能性組成物であり、これは肝実質細胞のＡＳＧ受容体を標的とするためのリガンドとしてトリラクトシルスペルミンを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドを伴うトリラクトシルコレステリルスペルミン共複合体はインビボで肝実質細胞をトランスフェクトするため記載されるとおり調製および使用されてもよい。
本発明のｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドは、例えば細胞外で調製されるとともに哺乳動物肝実質細胞へと送達されるなど、外因的に標的肝実質細胞に提供されてもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡは、ｄｓＲＮＡをコードする配列に操作可能に連結されるプロモーター配列を含んでなる核酸分子の転写により標的細胞内で産生されてもよい。この方法において、核酸分子は、非複製直鎖状または環状ＤＮＡまたはＲＮＡ分子内に含まれるか、もしくは自己複製プラスミドまたはウイルスベクター内に含まれるか、もしくは宿主ゲノムへと組み込まれる。肝実質細胞をトランスフェクトできる任意のベクターが本発明の方法に使用されてもよい。好ましいベクターは、複製欠損肝炎ウイルス（例えば、ＨＢＶおよびＨＣＶ）、レトロウイルス（例えば、国際公開第89/07136号パンフレット; Rosenberg et al., N. Eng. J. Med. 323(9):570-578, 1990を参照）、アデノウイルス（例えば、Morsey et al., J. Cell. Biochem., Supp. 17E, 1993; Graham et al., in Murray, ed., Methods in Molecular Biology: Gene Transfer and Expression Protocols. Vol. 7, Clifton, N.J.: the Human Press 1991: 109-128を参照）、アデノ随伴ウイルス（Kotin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2211-2215, 1990）、複製欠損ヘルペスシンプレックスウイルス（ＨＳＶ；Lu et al., Abstract, 66頁, Abstracts of the Meeting on Gene Therapy, Sep. 22-26, 1992, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y.）、およびこれらのベクターの任意の修飾型由来のものを含む、ウイルスベクターである。発現ベクターを構築する方法は当該技術分野において周知である（例えば、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照）。
然るべき制御配列が、当業者に周知の方法、例えば相同組換え（Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59-72, 1977）、または他の然るべき方法（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory, 2nd Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989）を使用して、本発明のベクターに挿入され得る。
本発明における組換えＤＮＡプラスミドｄｓＲＮＡ発現ベクターの組織化において、細菌は大量の最終ベクターを産生する「工場」として使用される。細菌の大腸菌はプラスミド発酵に頻用されるとともに、例えば、その教示が参照により本明細書に組み込まれる、Blattner et al.、米国特許出願公開第2005/0032225号明細書に記載されるとおりの減少させたゲノムを有する大腸菌株をこの目的に用いることは有利であり得る。この方法で製造され、当該技術分野において周知の方法に従い単離および精製されるベクターは、上記に記載される方法および組成物を含め、総じて「トランスフェクション」として知られる、様々な方法で生細胞中に導入され得る。細胞中に入ると、プロモーターエレメントは遺伝子転写に利用可能な細胞機構により認識されるとともにＲＮＡエフェクター分子、例えばｓｈＲＮＡが産生されるであろう。
本発明のプラスミド発現ベクターを増殖するために有利であり得る他の細菌株としては、インビボジェン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）、カリフォルニア州サン・ディエゴ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）から市販されている大腸菌ＧＴ１１６コンピテント細胞が挙げられる。ＧＴ１１６は、ヘアピンＲＮＡである１個またはそれ以上のｄｓＲＮＡエフェクター分子を発現するよう操作される本発明のプラスミドなどの、ヘアピン構造を保有するプラスミドＤＮＡの成長を補助するよう特異的に操作されるｓｂｃＣＤ欠失株である。ヘアピン構造は、ヘアピンを認識するとともに切断するＳｂｃＣＤと称されるタンパク質複合体によるそれらの排除により、大腸菌中で不安定であることが知られている（Connelly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:7969-74 (1998)）。ｓｂｃＣＤおよびｓｂｃＤ遺伝子は大腸菌ＧＴ１１６中で除去され、これはヘアピンまたは他の回文含有構造のプラスミドをクローニングするためのその有用性を改善する。
プロモーター プロモーターは、それらが、ｄｓＲＮＡオリゴヌクレオチドをコードする核酸配列に、典型的だが常にというわけではなく、操作可能に連結される５’であるようベクターに挿入される。真核細胞中での転写開始を主導する能力を有する任意のプロモーターが本発明に使用されてもよい。例えば、サイトメガロウイルス（DeBemardi et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:9257-9261，1991、およびそのなかの参考文献）、マウスメタロチオニンＩ遺伝子（Hammer, et al.，J. MoI. Appl. Gen. 1:273-288，1982）、ＨＳＶチミジンキナーゼ（McKnight，Cell 31:355-365 1982）、および初期ＳＶ４０（Benoist et al., Nature 290:304-310, 1981）プロモーターなどの非組織特異的プロモーターが使用されてもよい。非組織特異的プロモーターは、ウイルス配列用の本発明のＨＢＶおよびＨＣＶｄｓＲＮＡの特異性から、非組織特異的プロモーターにより主導される非肝細胞中のＨＢＶおよび／またはＨＣＶｄｓＲＮＡの発現は非肝細胞に対し無害であるはずなので、本発明に使用されてもよい。しかしながら、本発明における使用に好ましいプロモーターは肝実質細胞特異的プロモーターであり、その使用により確実にＲＮＡは肝実質細胞中で一次的に発現される。好ましい肝実質細胞特異的プロモーターとしては、アルブミン、アルファ−フェトプロテイン、アルファ−１−アンチトリプシン、レチノール結合タンパク質、およびアシアロ糖タンパク質受容体プロモーターが挙げられるが、限定はされない。サイトメガロウイルス、ヘルペスシンプレックスウイルス（Ｉ型およびＩＩ型）、肝炎ウイルス（Ａ、Ｂ、およびＣ）、およびラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ；Fang et al.，Hepatology 10:781-787，1989）由来のものなどのウイルスプロモーターおよびエンハンサーもまた本発明に使用されてもよい。
ｄｓＲＮＡ発現ベクターとしては、ＨＣＭＶ、ＳＣＭＶ、ＭＣＭＶ、ＲＳＶ、ＥＦ２ａ、ＴＫを含むが限定はされないＲＮＡポリメラーゼＩ、ＲＮＡポリメラーゼＩＩ用プロモーターおよび他のＩＣＰ６、ＩＣＰ４およびＩＣＰ０プロモーターなどのＨＳＶプロモーター、ＨＢＶプレゲノムプロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーター、特に７ＳＫ、Ｕ６、およびＨ１を含むが限定はされない３型ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター、ならびにミトコンドリア軽鎖および重鎖プロモーターが挙げられ得る。望ましくは、ｄｓＲＮＡ発現ベクターは、少なくとも１個のＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーター、例えばヒトＣＭＶ最初期プロモーター（ＨＣＭＶ−ＩＥ）またはサルＣＭＶ（ＳＣＭＶ）プロモーター、少なくとも１個のＲＮＡポリメラーゼＩプロモーター、または少なくとも１個のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含んでなる。プロモーターはまた、Ｔ７プロモーターであってもよく、この場合、細胞はさらにＴ７ＲＮＡポリメラーゼを含んでなる。あるいは、プロモーターはＳＰ６プロモーターであってもよく、この場合、細胞はさらにＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを含んでなる。プロモーターはまた、１個の集中型Ｔ７プロモーターおよび１個の集中型ＳＰ６ＲＮＡプロモーターであってもよい。細胞は、該細胞をＴ７ポリメラーゼまたはＳＰ６ポリメラーゼ発現プラスミドで形質転換することにより、それぞれＴ７またはＳＰ６ポリメラーゼを含むよう作製され得る。ある実施形態において、Ｔ７プロモーターまたはＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターは短鎖ｄｓＲＮＡ（例えば、２００、１５０、１００、７５、５０、または２５塩基長未満であるｄｓＲＮＡ）をコードする核酸に操作可能に連結される。他の実施形態において、プロモーターは、ベクター中の核酸の細胞質転写を可能にするミトコンドリアプロモーターである（例えば、２０００年４月１９日出願の国際公開第00/63364号パンフレット、および２００１年１月９日出願の国際公開/米国特許出願公開第2002/00543号明細書に記載されるミトコンドリアプロモーターを参照）。あるいは、プロモーターは、ｌａｃ（Cronin et al．Genes & Development 15:1506-1517，2001）、ａｒａ（Khlebnikov et al.，J Bacteriol．2000 Dec;182(24):7029-34）、エクジソン（Rheogeneのウェブサイト）、ＲＵ４８（ミフェプリストン（ｍｅｆｅｐｒｉｓｔｏｎｅ））（副腎皮質ステロイドアンタゴニスト）（Wang XJ，Liefer KM，Tsai S，O'Malley BW，Roop DR，Proc Natl Acad Sci U S A．1999 Jul 20;96(15):8483-8）、またはｔｅｔプロモーター（Rendal et al.，Hum Gene Ther. 2002;13(2):335-42およびLarnartina et al.，Hum Gene Ther. 2002; 13(2):199-210）などの誘導プロモーターまたは２０００年４月１９日出願の国際公開第00/63364号パンフレットに記載されるプロモーターである。また、本発明の方法および組成物に有用であるのは、２００３年４月２２日出願の米国仮特許出願第60/464,434号明細書に教示される構造的およびキメラのプロモーターである。本発明の方法および組成物に特に望ましいと考えられる、Pachuk, C.、およびSatishchandran, C，「Multiple-Compartment Eurkaryotic Expression Systems」、米国仮特許出願第60/497,304号明細書、２００３年８月２２日出願に教示されるプロモーター系もまた参照されたい。
本発明のｄｓＲＮＡ発現コンストラクトに有用な肝特異的プロモーターとしては、アルブミンプロモーター、アルファ−フェトプロテインプロモーター（特に肝癌細胞中で）、アルファ−１−アンチトリプシンプロモーター、例えば、コア、ｅ抗原、ポリメラーゼおよびＸタンパク質を含む抗原遺伝子用プロモーターを含むＢ型肝炎プロモーターといったＢ型肝炎プロモーターが挙げられる。
Ｔ７プロモーター／Ｔ７ポリメラーゼ発現系 本発明の望ましい方法は、Ｔ７ｄｓＲＮＡ発現系を利用して脊椎動物細胞（例えば、哺乳動物細胞）中でのｄｓＲＮＡ（例えば、長鎖または短鎖ｄｓＲＮＡ分子）の細胞質発現を実現する。Ｔ７発現系は、Ｔ７プロモーターを利用して所望のｄｓＲＮＡを発現する。転写はＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより駆動され、第２のプラスミドまたは同一プラスミド上に提供され得る。バクテリオファージＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７Ｐｏｌ）はＴ７遺伝子１の産物であり、その応答プロモーター配列を特異的に認識できるとともに高い転写酵素活性を示すことができる。Ｔ７ゲノムの完全配列は、バクテリオファージの異なる領域についての詳細情報とともに、プロモーター配列を含め、Dunn & Studier，1983，J. Mol. Biol. 166(4)，477-535に開示される（ＮＣＢＩ「ゲノム（Ｇｅｎｏｍｅ）」データベース、受託番号ＮＣ ００ １ ６０４もまた参照されたい）。Ｔ７プロモーターは、バクテリオファージＴ７のポリメラーゼ以外の他のいかなるＲＮＡポリメラーゼによっても利用され得ず、これはプロモーターのストリンジェントな特異性を示している（Chamberlin et al.，1970，Nature 228:227-231）。ｄｓＲＮＡの発現にＴ７発現系を利用する時、例えば、集中型Ｔ７プロモーターの制御下でセンスおよびアンチセンス鎖の双方を発現する第１のプラスミドコンストラクトおよびＲＳＶプロモーターの制御下でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを発現する第２のプラスミドコンストラクトが使用され得る。特にｄｓＲＮＡが、鎖において少なくとも部分的な二本鎖領域を伴うステム−ループまたはヘアピン構造の想定を可能にする逆方向反復または自己相補的領域を伴う単一ＲＮＡ鎖から形成される時、単一のバイシストロン性プラスミドコンストラクトからｄｓＲＮＡおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの双方が有利に発現され得るであろう。ｄｓＲＮＡを形成するため自己組織化する個々のセンスおよびアンチセンス鎖は、例えば選択された転写されるべき配列の相補鎖の５’および３’末端のそれぞれに配置されるバクテリオファージＴ７プロモーターなどの集中型プロモーターを使用して単一のプラスミドコンストラクトにより合成され得る。例えば、Ｔ７ｄｓＲＮＡ発現系に関する国際公開第0063364号パンフレットの教示、ならびに２００２年７月３１日出願の米国仮特許出願第60/399,998P号明細書および２００２年１０月１８日出願の米国仮特許出願第60/419,532号明細書もまた参照されたい。
本発明の治療組成物 本発明のｄｓＲＮＡ、およびそれらをコードする核酸配列を含む組換えベクターは、ＨＣＶおよび／またはＨＢＶ感染の予防または処置用治療組成物に使用されてもよい。本発明の治療組成物は単独または混合物で、または他の抗ウイルス剤を含む１個またはそれ以上の物質との化学的併用で、使用されてもよい。現在、ラミブジン、アデホビルジピボキシル、およびインターフェロンアルファがＨＢＶの処置に認可されているとともに、本発明の組成物がこれらの、およびエムトリシタビン（ＦＴＣ）およびエンテカビルを含むＨＢＶに対し活性を有する他の薬物との組み合わせで使用され得ることが予測される。ＨＢＶおよび／またはＨＣＶに対するｄｓＲＮＡは新規の機序（ｄｓＲＮＡ介在性遺伝子サイレンシング／ＲＮＡｉ）を通じて作用することから、本発明の薬剤および他の抗ウイルス剤の併用治療が、薬物耐性の発生、例えば長期ラミブジン治療の主要な懸案問題であるラミブジン耐性の発生を実質的に低減しながら治療の有効性を有意に増加させると期待される。現在、ＨＢＶ同様に、インターフェロンおよびリバビリンがＨＣＶの処置に許可されているとともに、本発明の組成物がこれらの、およびＨＣＶに対し活性を有する他の薬物との併用で使用され得ることが予測される。かかる複数の薬剤に伴う治療に関する特異的投薬レジメンは臨床医学の当業者により所定の実験を通じて決定され得る。
製剤は望ましくは、オリゴヌクレオチドまたは組換えベクターの生物学的安定性を増加させる物質、または肝実質細胞に選択的に侵入する治療組成物の能力を増加させる物質を含むであろう。本発明の治療組成物は製薬上許容できる担体（例えば、生理食塩水）で投与されてもよいが、これは投与の様式および経路、および標準的な薬務に基づいて選択される。当業者はオリゴヌクレオチドまたは遺伝子コンストラクトを含んでなる医薬組成物を容易に調合できる。ある場合、等張製剤が使用される。一般的に、等張性のための添加剤としては、塩化ナトリウム、ブドウ糖、マンニトール、ソルビトールおよびラクトースを挙げることができる。ある場合、リン酸緩衝食塩水などの等張液が好ましい。安定剤としては、ゼラチンおよびアルブミンが挙げられる。ある実施形態において、血管収縮剤が製剤に添加される。本発明に従う薬剤調製は無菌およびパイロジェンフリーで提供される。好適な医薬担体、ならびに医薬製剤での使用における医薬必需品は、当該分野において標準的な参考テキストであるRemington: The Science and Practice of Pharmacy（旧Remington's Pharmaceutical Sciences）,Mack Publishing Co.およびUSP/NFに記載される。
投与経路としては、筋肉内、腹腔内、皮内、皮下、静脈内、動脈内、眼内および経口ならびに経皮的にまたは吸入または坐薬によるものが挙げられるが、限定はされない。好ましい投与経路としては、静脈内、筋肉内、経口、腹腔内、皮内、動脈内および皮下注射が挙げられる。
ＨＢＶおよび／またはＨＣＶに対するｄｓＲＮＡの送達のためのインビボでの肝実質細胞の標的とされるトランスフェクションは、ラクトシルスペルミン（モノまたはトリラクトシル化）およびコレステリルスペルミン（対ＤＮＡ電荷比０．８のスペルミンを含有する）の混合物（例えば、３５％／６５％の比率）と複合体形成される本明細書に記載されるとおりのＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクターを含んでなる組成物を伴うＩＶ注射を通じて達成されてもよい。かかる組成物は特に、医薬応用に有用であるとともに、好適な無菌の、非パイロジェン賦形剤、例えば注入用、例えばＩＶ（ＩＶ輸液を含む）、ＩＭ、ＳＣといった非経口投与用、および腹腔内投与用、ならびに吸入を介する肺送達用エアロゾル製剤用緩衝食塩水に容易に調合され得る。特定の製剤において、本発明のＤＮＡ発現コンストラクトは、標的スペルミンのない、コレステリルスペルミン単独のようなエンドソームスペルミンと複合体形成されてもよく、腹腔内注入または点滴などのある投与経路は、有効な肝送達および本発明のＤＮＡコンストラクトのトランスフェクション、および、ＲＮＡエフェクター分子、例えばＨＢＶおよび／またはＨＣＶに対し有効な複数のｄｓＲＮＡヘアピンの発現を実現し得る。
特別に調合された送達賦形剤中のＨＢＶおよび／またはＨＣＶに対するｄｓＲＮＡエフェクター分子を提供するｄｓＲＮＡエフェクター分子および／またはｄｓＲＮＡ発現コンストラクトを含んでなる無菌医薬組成物の腹腔内投与（例えば、超音波誘導腹腔内注入）は、肝実質細胞肝を含む肝細胞による取込を促進するために有利な送達経路であり得る。ある組成物においてｄｓＲＮＡ発現コンストラクトは、然るべきトランスフェクション促進剤、例えば、ラクトシルスペルミン（モノまたはトリラクトシル化）およびコレステリルスペルミンと複合体形成されてもよく、もしくは、標的スペルミンのない、コレステリルスペルミン単独などのエンドソームスペルミンを伴う他の組成物中にあってもよい。医薬組成物の容量、濃度、および製剤ならびに投薬レジメンは、炎症反応などの毒性を最小化しながら細胞送達を最大化するよう特異的に個別化されてもよい。例えば、低い活性成分濃度に対応する比較的大きな容量（５、１０、２０、５０ｍｌまたはそれ以上）、ならびに副腎皮質ステロイドなどの抗炎症化合物の包接が、所望であれば利用されてもよい。薬剤学の当業者に周知の製剤もまた、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子および／またはｄｓＲＮＡ発現コンストラクトの徐放を提供するため利用されてもよい。
ｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡ発現コンストラクトは、従来式シリンジ、無針注入デバイス、または「微粒子衝撃遺伝子銃」を含むが、限定はされない手段により投与されてもよい。腹腔内注入は、例えば、従来式シリンジ、超音波に有利に誘導される針の穿刺または同様の技術で達成されてもよい。あるいは、ｄｓＲＮＡおよび／またはｄｓＲＮＡ発現コンストラクトは、様々な手段で個体から除去される細胞中に導入されてもよい。かかる手段としては、例えば、生体外トランスフェクション、電気穿孔、微量注入および微粒子衝撃が挙げられる。遺伝子コンストラクトが細胞により摂取された後、それらは個体中へ再移植される。宿主細胞が元来別の個体から採取された場合においても、そこに組み込まれる遺伝子コンストラクトを有する他の非免疫原性細胞が個体中に移植され得ると考えられる。
ＨＢＶ感染した個体において、本発明のｄｓＲＮＡ組成物が、ウイルスに対する追加免疫をするよう設計される治療ワクチン接種プロトコルと併用する前処置として有用であり得ることが予測される。本発明のｄｓＲＮＡ組成物が、職業上または他の被曝可能性によりＨＢＶおよび／またはＨＣＶへの曝露の危険性が高いと考えられる個体、例えば消防、救急、および医療職員への定期的投与レジメンにおける予防に有用であり得ることも予測される。かかる有効な予防的レジメンとしては、例えば毎週、隔週、毎月、隔月、毎３ヶ月、毎４ヶ月、毎半年、または毎年など、臨床医学の当業者により所定の実験を通じて決定され得るとおりの、本発明のＨＢＶおよび／またはＨＣＶｄｓＲＮＡを提供する組成物投与が挙げられ得る。数週間から数ヶ月の範囲であると期待される、比較的長期間にわたり本発明のｄｓＲＮＡを発現するためのプラスミドまたはウイルスベクターなどのｄｓＲＮＡ発現ベクターの能力は、本適用および他の適用に有利であると考えられる。
ｄｓＲＮＡの投薬量 ｄｓＲＮＡ（例えば、毒性を阻害する短鎖ｄｓＲＮＡまたは遺伝子をサイレンシングする短鎖または長鎖ｄｓＲＮＡ）の動物への投与としては、典型的には１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、５００μｇ〜１ｍｇ、または５μｇ〜５００μｇの間のｄｓＲＮＡが９０〜１５０ポンドの人間／動物に対し投与される（優先度の増加する順）。ｄｓＲＮＡ（例えば、毒性を阻害する短鎖ｄｓＲＮＡまたは遺伝子をサイレンシングする短鎖または長鎖ｄｓＲＮＡ）をコードするベクターの動物への投与としては、典型的には１００ｍｇ〜３００ｍｇ、１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１０ｍｇ、５００μｇ〜１ｍｇ、または５０μｇ〜５００μｇの間のｄｓＲＮＡ発現ベクターまたはコンストラクトが９０〜１５０ポンドの人間／動物に対し投与される（優先度の増加する順）。投薬量は動物の体重に基づき調整されてもよい。ある実施形態において、約１〜１０ｍｇ／ｋｇまたは約２〜２．５ｍｇ／ｋｇが投与される。臨床医学の当業者により所定の実験を通じて決定されるとき、他の投薬量が使用されてもよい。
無傷動物、例えばＨＢＶおよび／またはＨＣＶに感染したヒト被験者における投与としては、１ｍｇ〜１００ｍｇの間、典型的には１ｍｇ〜１０ｍｇの間、１０ｎｇ〜５０μｇの間、５０ｎｇ〜１００ｎｇの間、または１００ｎｇ〜５μｇの間の１個またはそれ以上のｄｓＲＮＡまたはｄｓＲＮＡエフェクター分子をコードするＤＮＡが使用される。望ましい実施形態において、およそ１０μｇのＤＮＡまたは５μｇのｄｓＲＮＡが動物に投与される。望ましい実施形態において、非経口投与用医薬組成物は、本発明のプラスミドｄｓＲＮＡ発現コンストラクト１０ｍｇ（ある製剤においてはコレステリルスペルミンなどの然るべきトランスフェクション促進剤またはコレステリルスペルミン／トリラクトシルスペルミンの混合物と複合体形成される）を標準食塩注射、Ｄ５Ｗ、Ｄ５％／０．４５％ＮａＣｌ、Ｄ５％／０．２％ＮａＣｌ等の注入用の好適な無菌賦形剤２５ｍｌ中に含むよう調製されるとともに、超音波により誘導される針穿刺または同様の技術をもって５〜１０分にわたり腹腔内注入される。投与は周期的に、必要に応じて例えば毎週または毎月、反復されてもよい。本発明の方法に関して、細胞または動物へのｄｓＲＮＡをコードするｄｓＲＮＡまたはＤＮＡの投与が、特定の投与様式、投薬量、または投薬頻度に限定されることは意図されない。本発明は、遺伝子発現を阻害するのに適した用量を提供し、疾患を予防し、または疾患を処置するのに十分な全ての投薬様式を考慮する。
所望であれば、短鎖ｄｓＲＮＡは、さもなければ細胞毒性を誘発すると予期され得るｄｓＲＮＡ（例えばさらに長鎖のｄｓＲＮＡ）の外因的送達の前、最中、または後に送達される。２００３年４月２８日出願の米国特許出願公開第10/425,006号明細書、「Methods of Silencing Genes Without Inducing Toxicity」,Pachukの教示を参照されたい。
世界的疾患発生およびウイルス変異性に関する本発明の治療利点
Ｃ型肝炎ウイルスゲノム、およびより少ないが有意な程度のＢ型肝炎ウイルスゲノムの突然変異性は、これらのウイルス媒介物に対する核酸ベース治療の設計への課題の提示として上記されている。本発明者らは、元来世界中に幅広く散在する地理的地域からの何千ものヒトウイルス分離株に由来する、何千もの個体のＨＣＶおよびＨＢＶ配列を綿密にアラインメントしてきた。そうすることで本発明は、単独で、およびＨＣＶおよび／またはＨＢＶのゲノムの最小変異可能領域を標的とするｄｓＲＮＡエフェクター分子中の組合せで利用される好ましい配列を同定および特定した。
これに対する二重の理論的根拠、第一には患者のＨＢＶまたはＨＣＶへの感染の経過中に、疾患の経過中所与の患者中でウイルスが変異したときでさえ、確実に本発明の治療がウイルスに対し強力であり続けるであろう点が上記で考察されてきた。しかしながら、ｄｓＲＮＡベースの治療応用の設計用の高度保存配列を送達および使用するためのこの理論的根拠の第二点目は、これもまた本発明の治療用ｄｓＲＮＡエフェクター分子、特にＨＢＶおよび／またはＨＣＶに対するｄｓＲＮＡエフェクター分子において高度保存配列の組合せを利用する本発明の方法および組成物が、かかる因子に基づくウイルス変異体群の顕在化として知られる世界中様々な異なる祖先、遺伝子構成、および地理的分布に由来する個体中に存在するウイルス感染を処置できるであろう確実性を増加させることである。このように、本発明の治療有用性および新規性の重要な特徴は、好ましい配列および実施形態の導出の方法にあり、単純に、任意の特定のＨＣＶまたはＨＢＶｄｓＲＮＡ配列が研究室実験において、すなわち、世界中のＨＢＶおよび／またはＨＣＶウイルスの幅広い多様性を必ずしも反映しない細胞系または動物モデルにおいて、さらには感染経過にわたり特別に感染した個体中において、１個または数個の選ばれたウイルス分離株（またはそれらと同種のレプリコン）のウイルス複製を阻害できるという実証にあるのではない。
例えば、Ｂ型肝炎ウイルスは４種の表面抗原の亜型、すなわちａｄｗ、ａｙｗ、ａｄｒおよびａｙｒを有する。ラミブジンが慢性Ｂ型肝炎の有効な治療と考えられる一方、ＨＢＶ耐性の最近の研究は、亜型ａｙｗと比較して、亜型ａｄｗにおける２０倍の耐性増加を実証した。B Zollner et al. 「20-fold Increase in Risk of Lamivudine [Epivir HBV] Resistance in Hepatitis B Virus Subtype adw」；The Lancet，2001; 357: 934-935。かかる従来の抗ウイルス剤と対照的に、かかる地理的遺伝的変異体にわたって高度に保存されるＨＢＶおよび／またはＨＣＶ配列を利用する本発明のｄｓＲＮＡ薬剤（例えば、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子および発現コンストラクト、特に本明細書に教示されるとおりの組合せで使用される時）は、極めて有利な抗ウイルス活性を示すと期待される。
同様に、ＨＣＶもまた、広い範囲の地理的に散在するウイルス遺伝子型、亜型、擬似種を、以下の現在一般的な遺伝子型および亜型の大域的パターンを伴い有することで知られる：
１ａ−北米および南米で最も見られる：オーストラリアでも一般的
１ｂ−ヨーロッパおよびアジアで最も見られる。
２ａ−日本および中国で最も一般的な遺伝子型２である。
２ｂ−米国および北欧で最も一般的な遺伝子型２である。
２ｃ−西欧および南欧で最も一般的な遺伝子型２。
３ａ−ここオーストラリア（症例の４０％）および南アジアで極めて蔓延。
４ａ−エジプトで極めて蔓延
４ｃ−中央アフリカで極めて蔓延
５ａ−南アフリカのみで極めて蔓延
６ａ−香港、マカオおよびベトナムに限定されている
７ａおよび７ｂ−タイで一般的
８ａ、８ｂおよび９ａ−ベトナムで蔓延
１０ａおよび１１ａ−インドネシアで見られる
従って、本発明の高度保存配列は、１ａ、１ｂ、２ａ、２ｂ、および２ｃを含め、これらの世界中に散在するＨＣＶ遺伝子型および亜型の全てではないがほとんどの間で保存されると期待され、例えばｄｓＲＮＡエフェクター分子、特にその組合せ、およびかかるｄｓＲＮＡの発現能を有するｄｓＲＮＡ発現ベクターとして利用される時、極めて有効な治療薬と考えられる。
出願人は具体的に、全ての引用文献の内容全体を本開示中に組み込む。さらに、量、濃度、または他の値またはパラメータが、範囲、好ましい範囲、または好ましい上限値および好ましい下限値のリストのいずれかとして与えられる時、これは、範囲が個別に開示されるか否かに関わらず、任意の範囲上限または好ましい上限値と任意の範囲下限または好ましい下限値との任意の対から形成される具体的に開示する全ての範囲として理解されるべきである。数値の範囲が本明細書に列挙される場合、別段に述べない限り、範囲はその端点、および範囲内の全ての整数および分数を含むことが意図される。本発明のスコープが範囲を定義する時に列挙される特定の値に限定されることは意図されない。
実施例
以下の実施例は実例としてのみ提供される。本開示内で説明される全ての参考文献は参照によりその全体が具体的に本明細書に組み込まれる。
実施例１
複製コンピテント細胞培養モデルにおけるＨＢＶ複製および発現のサイレンシング
細胞培養モデルの簡単な説明：Ｈｕｈ７細胞系などのヒト肝由来細胞系は、全てのウイルスＲＮＡの転写能および感染性ウイルスの産生能を有する末端重複ウイルスゲノムからなるＨＢＶの感染性分子クローンをトランスフェクトされる［１〜３］。これらの研究に使用されるレプリコンはＧｅｎＢａｎｋ受託Ｖ０１４６０に求められるウイルス配列に由来する。肝実質細胞への内部移行および核局在化に続き、数個のウイルスプロモーター由来の感染性ＨＢＶプラスミドの転写がＨＢＶ複製を反映する事象のカスケードを開始することが示されている。これらの事象としては、転写されたウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写されたプレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンおよびＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）粒子のトランスフェクト細胞の培地への組織化および分泌が挙げられる。このトランスフェクションモデルは感染した肝細胞内でのＨＢＶ複製のほとんどの態様を再現するとともに、それゆえＨＢＶ発現および複製のサイレンシングを調べるための優れた細胞培養モデルである。
このモデルを使用して、細胞がＨＢＶの感染性分子クローンおよび様々なｅｉＲＮＡコンストラクト（ｄｓＲＮＡ発現コンストラクト）をコトランスフェクトされた。次に細胞は、下記に記載されるとおりＨＢＶ発現および複製の欠損についてモニタされた。本実験において使用されるベクターおよびコードされたＲＮＡについての詳細は本実施例の末尾に提供される。
実験１：
以下は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｖ０１４６０由来の配列をコードするｅｉＲＮＡベクター（ｄｓＲＮＡ発現ベクター）を使用して実施された実験の例である。これらの記載されたｅｉＲＮＡベクター中のＨＢＶ配列は本明細書中で別記されるとおり同定される高度保存配列であったが、ｓｉＲＮＡとしての活性もまた示した（Pachuk, C.，「Methods and Constructs for Evaluation of RNAi targets and Effector Molecules」，PCT/US第2004/005065号明細書、２００４年２月２５日出願を参照）。本実験用に用いられた特定のｅｉＲＮＡバックボーンベクターは、コードされたＲＮＡの発現を駆動するためのＵ６プロモーターを含む専用ベクターであった。各ベクターは１個の短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）のみをコードした。ｓｈＲＮＡコード配列にはＲＮＡｐｏｌＩＩＩ終結配列が続いた。Ｕ６プロモーター、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩ終結シグナル、およびコードされたｓｈＲＮＡの配列は全て実施例の末尾に示される。Ｕ６プロモーターおよびＲＮＡｐｏｌＩＩＩ終結シグナルを含む同様のベクターは、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）のプロメガ社（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｉｎｃ．）製の「ｓｉＬｅｎｔＧｅｎｅ−２ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ」ベクターのように市販されている。当業者はまた本明細書に提供される情報に従いそれらを作成することもできる。他の発現およびプロモーター系、特に、Ｕ６ではなく、例えばＨ１プロモーターまたは７ＳＫプロモーターであるＲＮＡｐｏｌＩＩＩプロモーターを伴うこれらのベクターを使用しても同様の結果がまた得られるであろうことが期待される。
実験手順：トランスフェクション
ＲＰＭＩ−１６４０培地中で培養されたＨｕｈ７細胞が密度３×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種された。全てのトランスフェクションは細胞播種の翌日に、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）（インビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌ．））を使用して製造者の指示に従い実施された。本実験において、細胞は５００ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミドａｙｗ亜型（「ｐＨＢＶ２」）（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｖ０１４６０）および５００ｎｇ、３００ｎｇ、２５０ｎｇ、１２０ｎｇ、１００ｎｇ、５０ｎｇ、または１０ｎｇのｅｉＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトされた。ＤＮＡは不活性プラスミドＤＮＡのｐＧＬ３−ベーシック（Ｂａｓｉｃ）（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．））をトランスフェクションにおけるＤＮＡ総量が２．５μｇとなる量で含むことにより２．５μｇで一定／トランスフェクションが保たれた。例えば、５００ｎｇのＨＢＶ−ＤＮＡおよび５００ｎｇのｅｉＲＮＡコンストラクトを受け取るトランスフェクションにおいて、１．５μｇのｐＧＬ３がトランスフェクションに添加された。トランスフェクションに先立って、培地が細胞から除去され、かつ該細胞はＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌ．））で洗浄された。次に８００μｇのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）が細胞の各ウェルに添加され、トランスフェクション混合物の添加が続いた。トランスフェクション後１７〜１９時間で、トランスフェクション混合物およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）が細胞から除去され、かつ２ｍＬの培地／培養ウェルと交換された。トランスフェクションから３、６、および１０日後、培地は細胞から除去され、かつ−７０℃で貯蔵された。培地は、３および６日目に２ｍＬの新鮮培地と交換された。全てのトランスフェクションは重複して行われた。２組の対照トランスフェクションもまた実施された：ＨＢＶ−ＤＮＡ単独（５００ｎｇのＨＢＶ−ＤＮＡに加えて２μｇのｐＧＬ３）およびｅｉＲＮＡコンストラクトを伴うＨＢＶ−ＤＮＡ（５００ｎｇのＨＢＶ−ＤＮＡ、１μｇの対照ｅｉＲＮＡコンストラクト、および１．０μｇのｐＧＬ３ＤＮＡ）。
ＨＢＶ発現の欠損に関する細胞のモニタリング
トランスフェクションに続き、細胞がＨＢＶ発現および複製の欠損または低下についてＨＢｓＡｇ分泌を測定することによりモニタされた。細胞はトランスフェクト細胞の培地（および培地対照）を、トランスフェクション後３、６、１０日でアッセイすることによりモニタされた。アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（イリノイ州アボット・パーク（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ．））から市販されているＡｕｓｚｙｍｅ（登録商標）ＥＬＩＳＡが表面Ａｇ（ｓＡｇ）を検出するため製造者の指示事項に従い使用された。表面Ａｇは、ウイルス複製だけでなく、トランスフェクトされた感染性ＨＢＶクローン中およびインビボでの感染中に産生されるＨＢＶｃｃｃＤＮＡからのＲＮＡポリメラーゼＩＩにより開始される表面Ａｇシストロンの転写にも関連することから、ｓＡｇが測定された。表面Ａｇ合成はＨＢＶ複製の不在下においても有害な影響が続くことから、ウイルス複製だけでなくｓＡｇの複製非依存的合成も下方制御することが重要である。
結果：
本実施例の末尾に記載されるＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトされた細胞は全て、対照に比べｓＡｇレベルの減少を誘発した。阻害レベルは、表２〜８に見られるデータに対応する添付図２〜８に示される。７８８〜８０８および８０７〜８２７と同定される配列のみが、用量５００ｎｇで表面Ａｇレベルをそれぞれ３０％および５０％低下させたことに留意されたい。これらはｓＡｇｍＲＮＡを標的としない唯２つのｅｉＲＮＡである；その代わりにこれらは３．１ＫｂのＨＢＶｍＲＮＡを標的とするとともに、それゆえｓＡｇレベルを間接的に低減する。これらの他のＨＢＶ−ＲＮＡが標的とされる時観測されるｓＡｇの３０％〜５０％の低減は、これらのｅｉＲＮＡコンストラクトが効果的であることを強く示唆するものと考えられる。本実験ではＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡが使用された。
ｅｉＲＮＡベクターは表１に列挙されるＨＢＶ配列をコードする。配列はＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｖ０１４６０上のそれらの地図座標とともに示される。表の最右部分には配列番号があり、これらの配列はその範囲内に位置する。コードされたＲＮＡの配列は５’ＧＧＴＣＧＡＣ（それ自体は重要でないが、使用される特定のベクターのポリリンカー配列に由来する配列）であり、その後に第１のセンスまたはアンチセンスＨＢＶ配列、その後にループ配列（表１の下線箇所）、その後に第１のＨＢＶ配列の相補体である第２のＨＢＶ配列が続く。ループ構造は固定的な配列または長さである必要はないとともに、我々はｅｉＲＮＡコンストラクトの機能に何ら有意な影響を及ぼさない数本のループ配列を使用したことに留意されたい。第２のＨＢＶ配列の後には、ＲＮＡｐｏｌＩＩＩの終結シグナルとして機能するＴ残基の一続き、例えば１、２、３、またはそれ以上のＴが続く。
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転写されたＲＮＡ構造の図が図９に示される。配列番号１３はＵ６プロモーターのヌクレオチド配列である。ＲＮＡｐｏｌＩＩＩターミネーターのヌクレオチド配列：５’−ＴＴＴＴＴ−３’。表１のＨＢＶセキトープ（それらのそれぞれの相補配列なしおよび「ヘアピン」またはステム−ループｄｓＲＮＡエフェクター分子に利用される「ループ」またはリンカー配列なし）が下表１Ａに示される。かかる各ＨＢＶセキトープが、その相補配列と共に、場合により本明細書で教示されるとおりの然るべきループまたはリンカー配列と共に、本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子（例えば、デュプレックスｄｓＲＮＡまたはヘアピンｄｓＲＮＡエフェクター分子、またはｄｓＲＮＡ発現ベクター内にコードされるもの）に利用されてもよい。一態様において、複数の（例えば２、３、４、５、６、またはそれ以上の）かかるｄｓＲＮＡ短鎖ヘアピンエフェクター分子は単一発現ベクター、例えばプラスミド発現ベクター内に、各々異なるプロモーター、例えばポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下で、本明細書中で別記されるとおり、コードされる。
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表およびグラフ．
ＨＢｓＡｇが上記に記載されるとおり測定されるとともに表２〜８のデータに対応する図２〜８にプロットされた。ｅｉＲＮＡコンストラクト量はｅｉＲＮＡコンストラクト名の後に括弧書きで示されるとともにμｇ量である。例えば、２７９１（０．５）は、０．５μｇまたは５００ｎｇのｅｉＲＮＡコンストラクト２７９１〜２８１１（表１を参照）がトランスフェクションに使用されたことを意味する。対照と比べた阻害割合もまた下表に示されるとともに、これは１０日目の測定について特異的である。１２９９が５００ｎｇで評価された本実施例における第４番目のデータセットは、１０日目に評価が行われなかったため、３および６日目の２時点のみを有することに留意されたい。本実験の阻害割合は６日目のデータについて示された。データは、ｓＡｇを測定するため使用されるオーザイム（Ａｕｓｚｙｍｅ）ＥＬＩＳＡアッセイキットの製造者により記載されるとおり収集された未加工ＯＤデータとして示される。２７９１〜２８１１についての５０ｎｇのデータおよび１９０７〜１９２７についての１０ｎｇのデータは示されていない。これらの用量の各々は、ＨＢｓＡｇ発現を対照と比べ約５０％阻害した。
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実験２：
背景：２個のｅｉＲＮＡコンストラクトの添加の相加効果を評価するため、同一の細胞培養モデルが使用された。本実験においては２７９１〜２８１１および２９１９〜２９３９が評価された。これらは２種の用量で個別に、すなわち１０ｎｇおよび２５ｎｇで、および１０ｎｇ（５ｎｇの２７９１〜２８１１に加え５ｎｇの２９１９〜２９３９）と２５ｎｇ（１２．５ｎｇの２７９１〜２８１１および１２．５ｎｇの２９１９〜２９３９）との組合せで評価された。相加効果が、例えば、２５ｎｇの２７９１〜２８１１で認められる阻害の半分に加え２５ｎｇの２９１９〜２９３９で認められる阻害の半分が、２５ｎｇの組合せ用量に認められる阻害とほぼ等しくなる時、観測される。これは、２５ｎｇ用量の単一ｅｉＲＮＡコンストラクトの使用では阻害が得られないかもしれないとき、２個またはそれ以上のｅｉＲＮＡ配列の使用がウイルス逃避変異体の生成を予防するにおいて非常に重要であることから、重要である。
実験手順：トランスフェクション
Ｈｕｈ７細胞が密度３×１０５細胞／ウェルで６ウェルプレートに播種された。全てのトランスフェクションは細胞播種の翌日に、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）（インビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して製造者の指示に従い実施された。本実験において、細胞は５００ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミドａｙｗ亜型（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｖ０１４６０）および２５ｎｇまたは１０ｎｇの２種の別個のｅｉＲＮＡコンストラクトまたは総量２５ｎｇまたは１０ｎｇのこれら２種のｅｉＲＮＡコンストラクトの組合せをトランスフェクトされた。ＤＮＡは不活性プラスミドＤＮＡのｐＧＬ３をトランスフェクションにおけるＤＮＡ総量が２．５μｇとなる量で含むことにより２．５μｇで一定／トランスフェクションが保たれた。例えば、５００ｎｇのＨＢＶ−ＤＮＡおよび１０ｎｇのｅｉＲＮＡコンストラクトを受け取るトランスフェクションにおいて、次に１．９９μｇのｐＬＵＣがトランスフェクションに添加された。トランスフェクションに先立って、培地が細胞から除去され、かつ該細胞はＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）（インビトロジェン・ライフ・テクノロジーズ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））で洗浄された。次に８００μｇのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）が細胞の各ウェルに添加され、トランスフェクション混合物の添加が続いた。トランスフェクション後１７〜１９時間で、トランスフェクション混合物およびＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）が細胞から除去され、かつ２ｍＬの培地／培養ウェルと交換された。トランスフェクションから４、８、および１１日後、培地は細胞から除去され、かつ−７０℃で貯蔵された。培地は、４および８日目に２ｍＬの新鮮培地と交換された。全てのトランスフェクションは重複して行われた。２組の対照トランスフェクションもまた実施された：ＨＢＶ−ＤＮＡ単独（５００ｎｇのＨＢＶ−ＤＮＡに加え２μｇのｐＧＬ３）、および対照ｅｉＲＮＡコンストラクトを伴うＨＢＶ−ＤＮＡ（５００ｎｇのＨＢＶ−ＤＮＡ、５００ｎｇの対照ｅｉＲＮＡコンストラクトおよび１．５μｇのｐＧＬ３．ＤＮＡ）。
結果：
結果が表９に示されるとともに、対応するグラフが図１０に見られる。２７９１〜２８１１および２９１９〜２９３９の組合せは、２７９１〜２８１１または２９１９〜２９３９単独の投与と少なくとも等しい効果を示した。同一のおよび／または異なるＨＢＶ遺伝子由来の異なるＨＢＶ配列を照準とする２個またはそれ以上のｄｓＲＮＡを組み合わせることにより同様の利点が見られるであろうことが期待される。
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実験３および４
マウスモデルにおけるＨＢＶのサイレンシング
要約：確認実験１に記載される２個のｅｉＲＮＡベクターが、マウスモデル中のＨＢＶレプリコンをサイレンシングするその能力について評価された。これらのベクターは２７９１〜２８１１および１９０７〜１９２７ベクターであった。双方のベクターが、細胞培養モデル中でそれらがサイレンシングしたのと同程度までマウスモデル中のＨＢＶをサイレンシングすることが認められた。他の治療法によるマウス中の本ＨＢＶレプリコンをサイレンシングする能力はヒト有効性の予測因子であることが実証されている［４］。
動物モデルの背景：
チンパンジーはヒトＨＢＶ感染力を研究する唯一の動物モデルを表す。しかしながら、ＨＢＶ発現および複製が生じるマウスモデルは利用可能である。本モデルは、標的とされるウイルス複製に対するだけでなく抗原のＲＴ非依存性発現に対する抗ＨＢＶ治療剤の評価にも貴重とされてきた。本モデルでは、複製コンピテントＨＢＶはエピソームＨＢＶ−ＤＮＡから一時的に発現される。このモデルは、流体力学的送達により複製コンピテントＨＢＶ−ＤＮＡをマウス肝に導入することにより作成される［１］。
以下の実験の目的は、細胞培養物とマウスモデルとの間にＨＢＶ配列に関連する有効性の差異があるとは予測されていなかったものの、実験１でマウスモデル中での有効性について評価されたＨＢＶ特異的配列をコードするベクターのうち２個を試験することであった。本実験は、複製コンピテントＨＢＶａｙｗプラスミド（実施例１、確認実験１）をエフェクターＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡ発現ベクターとともに同時送達する方法として流体力学的送達を利用した。流体力学的送達は、結果として核酸の肝への有効な送達となるため、これらの一次研究に理想的である［５］。
実験
流体力学的送達の研究：実験３．
全ての動物は流体力学的に７．５μｇの感染性ＨＢＶａｙｗプラスミド（確認実験１に記載される）を注入された。肝実質細胞への内部移行および核局在化に続き、数個のウイルスプロモーター由来ＨＢＶａｙｗプラスミドの転写がＨＢＶ複製を反映する事象のカスケードを開始することが示された［１］。これらの事象としては、転写されたウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写されたプレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンおよびＨＢｓＡｇ粒子の注入された動物の血清への組織化および分泌が挙げられる。実験動物は１０μｇの２７９１〜２８１１を同時注入された。対照動物の第２群が無関係なｅｉＲＮＡコンストラクト１０μｇを注入された。全ての動物はまた、２．５μｇのＧＦＰレポータープラスミド（クロンテック（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、カリフォルニア州パロ・アルト（Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌ．））も同時注入された。正規化するための対照として供される注入されたマウスの肝中でのＧＦＰｍＲＮＡの発現は、マウスモデルトランスフェクション有効性に反する結果となる。動物に注入された全ＤＮＡは、不活性フィラーＤＮＡのｐＧＬ３（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．））を含むことにより２０μｇで一定に保たれた。全てのＤＮＡが、Yang et al.［１］に記載される方法に従い調合および注入された。各群５動物であった。ＤＮＡおよび各動物に注入されるＤＮＡ量が表１０に示される。
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流体力学的送達後のマウス中でのＨＢＶａｙｗプラスミド複製の動態を詳述する、チザリ（Ｃｈｉｓａｒｉ）博士研究室の公表結果［１］に基づき、分析時点が選択された。血清が注入後１、２、３、および４日目にＨＢｓＡｇの存在についてアッセイされた。アッセイはＨＢＶ複製の細胞培養モデルについて記載されたとおり実施された。肝試料中のＨＢＶ−ＲＮＡの存在がチザリ（Ｃｈｉｓａｒｉ）博士研究室で開発された手順［１］を使用して注入後２日目にノーザンブロット分析により確認され、かつ従来技術または標準技術を使用するｓＡｇコード配列を含むＨＢＶ−ＲＮＡについての定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイを使用して内因性ＧＡＰＤＨ−ＲＮＡレベルおよびＧＦＰｍＲＮＡレベルに対し正規化された。ＲＴ−ＰＣＲはノーザンブロット分析より定量的であるとともにノーザンブロット分析の有するより大きなダイナミックウィンドウを有する。
ノーザンブロット分析によるＨＢＶ−ＲＮＡおよびＨＢｓＡｇの双方の下方制御が２７９１〜２８１１を注入されたマウスに認められた。図１１を参照されたい。また、図示されないが、定量ＲＴ−ＰＣＲは対照マウスの肝中に８６７個のＨＢＶ−ＲＮＡ分子および２７９１〜２８１１処置マウス中に１５倍の下方制御となるＨＢＶ−ＲＮＡの５７個の分子の存在を実証した。
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流体力学的送達の研究：実験４
本実験は、２個のｅｉＲＮＡコンストラクト、２７９１〜２８１１および１９０７〜１９２７が評価されたことを除き、実施例１の実験３と同様であった。本実験において、ＨＢｓＡｇが本明細書に既述されたアッセイを使用して１および４日目に測定された。
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Ｂ型肝炎ＲＮＡ産生および複製を低減するｓｈＲＮＡの産生用４−プロモーターＲＮＡポ
リメラーゼＩＩＩベース発現コンストラクト
２００５年８月２３日出願のPCT/US第05/29976号明細書にさらに詳細に記載されるとおり、４個のポリメラーゼＩＩＩプロモーター短鎖ヘアピンｄｓＲＮＡ発現カセットを含むプラスミド発現ベクターのｐＨＢ４が構築された。各発現カセットは、短鎖ヘアピンｄｓＲＮＡをコードする配列に操作可能に連結されるポリメラーゼＩＩＩプロモーター、およびポリメラーゼＩＩＩ終結配列を含んだ。ポリメラーゼＩＩＩプロモーターはＵ６、７ＳＫ、および７ＳＫ−４Ａと命名される２個の７ＳＫ配列変異プロモーターの複製物であった。各短鎖ヘアピンｄｓＲＮＡ配列は、本明細書に教示されるとおりのＨＢＶ高度保存配列と相同および相補的な二本鎖ステム領域を含んでなった。４個のｄｓＲＮＡエフェクター分子は、それぞれ配列番号６２、配列番号５９、配列番号５５、および配列番号５４を含んでなる、配列番号４９、配列番号２３、配列番号１９、および配列番号１８の配列を含んでなった。しかしながら、PCT/US第05/29976号明細書の実施例１にさらに詳細に記載されるとおり、ｄｓＲＮＡヘアピンエフェクター分子をコードする配列は制限部位でプラスミド発現ベクターの発現カセットに挿入され、結果的に事実上最終転写の５’末端に付加される数個の追加的なヌクレオチドとなった。予想されたｄｓＲＮＡヘアピンを含む転写は、実際には追加的な５’および３’配列を含む：６塩基からなる５’リーダー（例えば、ＳａｌＩまたはＨｉｎｄＩＩＩまたは他の選ばれた認識配列）の後にｄｓＲＮＡヘアピン配列が、その後に転写終結中に組み込まれる通常２個（１、２、３、または４個）のＵ残基である短い３’末端Ｕトラクトが続く。これらのｄｓＲＮＡヘアピンに隣接する５’および３’転写配列の長さおよび構成の差異が、ｄｓＲＮＡ介在性サイレンシングをもたらすためのｄｓＲＮＡヘアピンの能力に不利に影響したようには思われなかったが、これは、合成ｄｓＲＮＡデュプレックスとは異なり、内因的に発現されたｄｓＲＮＡヘアピンコンストラクトが、例えば約１９〜２９ｂｐの間のｄｓＲＮＡ「ステム」の長さ、一本鎖ループの長さおよび構成、追加的な短い５’および／または３’配列の存在または不在といった数々の点で変化するにも関わらず、有効であることを示唆する。
PCT/US第05/29976号明細書の実施例１および２００４年９月１０日公表の国際公開第04/076629号パンフレット，「Methods and Constructs for Evaluation of RNAi Targets a
nd Effector Molecules」に教示されるとおりのルシフェラーゼアッセイは、４個全てのプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットがベクターおよびアッセイ可能な基質を供給された細胞中でそれらの標的配列をサイレンシングする活性を有したことを示した。ＩＣ５０値は、１個のプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットベクターから４個のプロモーター／ｓｈＲＮＡカセットを含むｐＨＢ４発現ベクターに増加させた時、実質的に減少した。ＩＣ５０値はまた、各ｓｈＲＮＡ分子の相対力価および転写レベルによっても影響され得たであろうとともにベクターのみの濃度との単純な関係は反映しなかったが、これは細胞に入り４個のコードされたｄｓＲＮＡ分子を発現した後は事実上４個の薬物として振る舞った。言い換えれば、増加した力価は、ベクターにより生成されたより多量のｓｈＲＮＡ転写総量だけでなく、各ｓｈＲＮＡが標的ウイルスＲＮＡ分子の分解を介してｓＡｇまたはｅＡｇ産生の低減に効果を及ぼす必要がある個々の力価もまた反映した。ｓｈＲＮＡカセットの連続的添加は、明らかに定量的様式でベクターの力価を増加させ、さらにはＨＢＶ標的の４箇所の異なる部位を阻害することによりＨＢＶ標的に対する薬理学的活性を増加させた。しかしながら、複数の個々の抗ウイルスｄｓＲＮＡヘアピン分子を発現する複数のポリメラーゼＩＩＩ発現コンストラクトの能力は、「力価」の関連する増加のためだけでなく、それ自体有意な値であることを認識することは重要である。抗ウイルス有効性レベルが高い場合、各追加的ｄｓＲＮＡ分子に伴い認められるウイルス阻害における増加性定量的増加は、ウイルス耐性の発達に対し高い耐性であるという固有の利点から、事実上多剤レジメンであるものを送達するコンストラクトの能力よりもそれ自体は重要性が低くなり得る。
ＨＢＶおよび／またはＨＣＶ高度保存ポリヌクレオチド配列を標的とする複数のｄｓＲＮＡエフェクター分子を送達するよう設計される発現ベクターは、ウイルス感染細胞に送達される時、ウイルス核酸産物を直接破壊する固有の能力を有する。さらに、これらの複数のプロモーターベクター（これはウイルスゲノムの異なる部分を標的とする複数の異なる阻害性短鎖ヘアピンｄｓＲＮＡを発現する）の設計および企図に固有のおよび不可欠であるのは、複数の異なるウイルスアンタゴニストを同時に生成する特性である。アンタゴニスト（短鎖ヘアピンｄｓＲＮＡエフェクター分子）はウイルスゲノム中の異なるゲノム配列を標的とする。ウイルスを無能力化するにはこれらのアンタゴニストのうち１個でおそらく十分であろう。しかしながら、重複性は、ウイルス配列が１個のアンタゴニストを不活性にするべく突然変異した場合に、２、３、４個、またはそれ以上の追加的なアンタゴニストが利用可能であるような「バックアップ」機序として役立つ。加えて、ウイルスゲノム中の複数部位を標的とすることにより、疾患病態において異なる役割を果たすウイルスの異なるＤＮＡまたはＲＮＡ産物が同時に攻撃され得る。
例えばＢ型肝炎の場合、一実施形態において、本発明は次の配列より選択される４、５個、またはそれ以上のｓｈＲＮＡ分子および本明細書に教示されるとおりの他のＨＢＶ高度保存配列を使用する：例えば、「７９９」（配列番号４９）；「１９０７」（配列番号１９）；「２７９１」（配列番号２３）；「１７３７」（配列番号１８）、「１９９１」（配列番号２２）、「１９４３」（配列番号２１）。本明細書に開示される他のＨＢＶ保存配列は、例えば「７９９」、「１９０７」、「２７９１」、「１７３７」、「１９９１」、または「１９４３」の全てまたは一部を含んでなる１９〜２９ヌクレオチドの配列を含め、複数のポリメラーゼＩＩＩ発現ベクターを含む複数のプロモーターを含んでなる発現ベクターにより発現されるべきｄｓＲＮＡヘアピンエフェクター分子への包接のため選択されてもよい。ＨＢＶ遺伝子発現の性質および重複転写産物により、複数のＲＮＡ転写を標的とすること、ならびに１個より多いウイルスタンパク質の複製および発現を妨げるであろう複製可能なウイルスの鋳型が可能となる。ｓｈＲＮＡ分子の１つ「１７３７」（配列番号１８）は、Ｘタンパク質（ＨｂＸ）として知られる産物をコードするＲＮＡを独自に無能力化できる。Ｘタンパク質が肝癌の定着および／または維持に役割を果たすという強力な証拠が生物医学文献に存在する。ある程度ウイルス複製を阻害できる既存の薬物は、ウイルスゲノムの組み込まれたまたは他の残存するコピーまたは部分の細胞を排除できないため、感染性ＨＢＶの「治癒した」患者であっても、これらの薬物はＨｂＸの産生を止められず、それゆえ休眠ＨｂＸにより媒介されるいかなる癌の発生率も直接低減できない。本発明の複数の抗ＨＢＶｄｓＲＮＡヘアピン発現コンストラクトは、ウイルスの複製と、炎症性傷害を引き起こし、結果として特徴的だが完全には解明されていない機序を介して肝細胞癌を促進すると考えられている肝炎および他のＨｂＸなどをもたらすものもある全てのウイルスタンパク質の発現との双方を攻撃できる。本明細書に教示される原理は、Ｈｂｘおよび任意の他の残存ＨＢＶ抗原に対するｄｓＲＮＡを発現する、特にかかる「感染後」患者を処置するべく調整された本発明のコンストラクトを設計するために使用され得ることが認められている。
本発明のＨＢＶ標的配列が、多数の異なるＨＢＶの分離株（株）のなかからそれらの高度な保存性または同一性を呈示するべく明示的に選ばれたが、参照目的のため、同定された配列、例えばｓｈＲＮＡ配列がＨＢＶ分離株ＡＹＷに再マッピングされ得る。それゆえ、本発明のｄｓＲＮＡおよびｄｓＲＮＡ発現コンストラクトは、ＨＢＶ−ＡＹＷおよび関連ウイルス株に対してのみならず、広く分散した地理的地域における感染ヒト集団中で遭遇するＨＢＶ株の全てとはいえないがほぼ全てに対しても有効であると期待されることが認識されるべきである。
実施例２
Ｃ型肝炎−ＲＮＡｉ治療展開のための配列
実験１
簡単な紹介：
Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）は非Ａ、非Ｂ型輸血後肝炎の第一原因であるとともに、世界の２億を超える肝炎症例を占める。ＨＣＶゲノムは高度の配列変異性を有する。５０種を超える亜型を含んでなる６種の主要遺伝子型があるとともに擬似種により特徴付けられる有意な異種性が患者に見出されてきた。組換えポリメラーゼまたは細胞ベースサブゲノムレプリコン系を使用することにより、ＨＣＶ複製の理解には大きな進展がなされてきた。レプリコン細胞系を使用することにより、ＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡはＨＣＶタンパク質発現およびＲＮＡ複製を抑制できることが実証されている。５’ＮＴＲおよび構造的と非構造的との双方の遺伝子の配列が成功裏に標的とされている。３’ＮＴＲ配列はその高度に保存された性質によりｓｉＲＮＡベース治療にとって極めて魅力的な標的となる。しかしながら、３’ＮＴＲ使用の実現可能性を調査する研究は何ら行われていない。我々はここに、サブゲノムレプリコン系においてＨＣＶタンパク質発現を阻害できる数個のｓｉＲＮＡの設計および試験を報告する。外因的に合成されたＨＣＶ特異的ｓｉＲＮＡが下記に記載されるとおりＨＣＶレプリコン細胞系にトランスフェクトされた。
細胞培養および培地：
肝細胞腫Ｈｕｈ７細胞中のＨＣＶレプリコンが、１０％ウシ胎仔血清（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））、１％ペニシリン−ストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸および０．５ｍｇ／ｍＬジェネティシン含有ダルベッコ変法イーグル培地（「ＤＭＥＭ」）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中で培養された。細胞は開裂に先立ち７５％培養密度まで成長させた。
ウエスタンブロット分析：
レプリコン細胞由来の全細胞ライセートが１×ＬＤＳ緩衝液（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中のレプリコン細胞から回収された。ライセートは、１０％トリスグリシンポリアクリルアミドゲル（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））での電気泳動前に、ベータメルカプトエタノールの存在下において９０℃で５分間加熱された。タンパク質はＰＶＤＦ（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））膜に移された。移した後、膜は０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０含有ＰＢＳ（ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ）で１回リンスされ、かつ５％脱脂乳含有ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中に１時間固定された。ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎでの洗浄後、膜は１：１５００希釈のα−ＮＳ５Ａ一次抗体（チェン・リュウ（Ｃｈｅｎ Ｌｉｕ）博士よりの供与）とともに１時間、室温にてインキュベートされた。１：５０００希釈のＨＲＰ結合αマウスＩｇＧ二次抗体（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））を伴うインキュベーションに先立ち、ブロットがＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ２０中で洗浄された。二次抗体のインキュベーションに続き、ブロットは再洗浄され、かつＥＣＬ（アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））で製造者のプロトコルに従い処置された。
ノーザンブロット：
全細胞ＲＮＡがＲｎｅａｓｙ（登録商標）キット（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ））を使用することにより抽出された。ノーザンブロット分析がグオ（Ｇｕｏ）らのプロトコルに従い行われた。簡潔には、５μｇの全ＲＮＡが２．２Ｍホルムアルデヒド含有１．０％アガロースゲルを介して電気泳動され、ナイロン膜に移され、かつＵＶ架橋（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））により固定化された。５０％脱イオンホルムアミド、５×ＳＳＣ（７５０ｍＭ塩化ナトリウム、７５０ｍＭクエン酸ナトリウム）、デンハート液、０．０２Ｍリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．２％ドデシル硫酸ナトリウム（「ＳＤＳ」）、１００μｇの変性剪断サケ精子ＤＮＡ／ｍｌ、および１００μｇの酵母ＲＮＡ／ｍｌ含有溶液中において５８℃で１６時間、α−［３２Ｐ］ＣＴＰ標識ネオマイシンＲＮＡを使用してハイブリダイゼーションが実行された。膜は、２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において室温で３０分間、１回洗浄され、かつ０．１×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳ中において６８℃で３０分間、２回洗浄された。膜はＸ線フィルムに曝露された。
ｓｉＲＮＡのレプリコン細胞へのトランスフェクション：
ｓｉＲＮＡのレプリコン細胞へのトランスフェクションのため、リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）２０００試薬（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））がユーザーマニュアルに従い使用された。簡潔には、トランスフェクション前日に０．５ｍＬのＤＭＥＭ中の２×１０４個の細胞が２４ウェルプレートに播種された。指示されたｓｉＲＮＡ量が５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中に希釈され、かつ希釈リポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（登録商標）２０００試薬（Ｏｐｔｉｍｅｍ５０μＬ中１μＬ）と混合された。混合物は細胞単層上に加えられる前に、室温で２０分間インキュベートされた。トランスフェクション後４８〜７２時間で、細胞はＰＢＳ中で洗浄され、かつ１００μＬのＳＤＳ試料緩衝液中に溶解された。
Figure 0005934310
３’ＵＴＲを標的とする上記で表１４に同定されるＨＣＶ配列（各場合において、最初の２１塩基が本発明のＨＣＶ保存配列を構成し、続く８塩基の「アダプター」配列「ＣＣＴＧＴＣＴＣ」は合成に使用されるアンビオン（Ａｍｂｉｏｎ）キットから付加されるが、これはｄｓＲＮＡエフェクター分子中には現れない）を含んでなる数個の短鎖デュプレックスｄｓＲＮＡ、ＨＣＶ−ＮＳ５Ｂ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ＃１２（陽性対照）、同定されたＨＣＶコアｓｉＲＮＡ（陽性対照）、および同定されたラミンｓｉＲＮＡ（陰性対照）が、カタログ番号１６２０のサイレンサーｓｉＲＮＡ作成キット（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）、テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．））を使用して合成された。ＤＮＡオリゴヌクレオチドがＩＤＴ（アイオワ州コーラルヴィル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ））により合成された。
Figure 0005934310
３’ＵＴＲを標的とする上記で表１４に同定されるＨＣＶ配列を含んでなる数個のｓｉＲＮＡ、ＨＣＶ−ＮＳ５Ｂ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ＃１２（陽性対照）、同定されたＨＣＶコアｓｉＲＮＡ（陽性対照）、および同定されたラミンｓｉＲＮＡ（陰性対照）が、カタログ番号１６２０のサイレンサーｓｉＲＮＡ作成キット（アンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．）、テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，Ｔｅｘ．））を使用して合成された。ＤＮＡオリゴヌクレオチドがＩＤＴ（アイオワ州コーラルヴィル（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，Ｉｏｗａ））により合成された。
対照ｓｉＲＮＡ
１．ＨＣＶコア（陽性対照）：配列番号４５
２．＃１２、表１４に示され、ＨＣＶ−ＮＳ５Ｂ遺伝子を標的とする、これも陽性対照
３．ラミン配列（陰性対照）：配列番号４６
３種のｓｉＲＮＡが対照として使用された：陰性対照用に細胞遺伝子ラミンを標的とするｓｉＲＮＡ、陽性対照としてＨＣＶのコア配列を標的とするｓｉＲＮＡ、陽性対照としてＨＣＶ−ＮＳ５Ｂ遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ。２種の各ｓｉＲＮＡ濃度（９および２０ピコモル）が使用され、かつ結果がｓｉＲＮＡ無しのトランスフェクションと比較された。従って、図１３のウエスタンブロットは、０、９、および２０ピコモルの同定されたｓｉＲＮＡを表す。ｓｉＲＮＡ＃２２、３２、４２、６２、および７２が、ＨＣＶ−ＮＳ５Ａタンパク質発現の抑制において著しく活性であった。おそらくは、コアの陽性対照ｓｉＲＮＡに伴い以前得られた結果に基づけば、ＨＣＶＲＮＡレベルもまた減少している。試験された濃度では数個のｓｉＲＮＡが最小限の影響を有したが、より高い濃度で評価されるべきである。これらとしては、＃１２（標的ＮＳ５Ｂ）、＃１０２、＃５２、および＃８２が挙げられる。
実験２
実験２が、下表１５に記載される配列（およびそれらの相補体）を含んでなるｓｉＲＮＡのＲ１〜Ｒ８がトランスフェクションに使用されたことを除き、ＲＮＡｉ治療展開のためのＣ型肝炎配列の実験１に記載されるとおり実施された。ここで実施されたウエスタンブロットアッセイは、実施例２の実験１に記載されるとおりであった。陽性対照として使用される対照ＨＣＶコアｓｉＲＮＡは前出のＨＣＶ実験１に記載されるｓｉＲＮＡである。０、３および９ピコモルのレベルでトランスフェクトされた対照「コア」ｓｉＲＮＡを除く全てのｓｉＲＮＡが０、９および２０ピコモルの濃度でトランスフェクトされた。Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３、Ｒ５、Ｒ７、およびＲ８全てが、図１４のウエスタンブロットに見られるとおりＨＣＶの有意な阻害を示した。
Figure 0005934310
評価される全てのｓｉＲＮＡはＨＣＶゲノムの３’ＵＴＲに位置するとともにＨＣＶ遺伝子型および擬似種の中に保存されている。配列番号２７は、時に「Ｘ」領域と称される、この１０１ｎｔのＨＣＶ３’ＵＴＲ配列を表す。
実施例３
複製コンピテント細胞培養モデルにおけるＨＢＶ複製および発現のサイレンシング
細胞培養モデルの簡単な説明：
Ｈｕｈ７細胞系などのヒト肝由来の細胞系が、全てのウイルスＲＮＡの転写能および感染性ウイルスの産生能を有する末端重複ウイルスゲノムで構成されるＨＢＶの感染分子クローンをトランスフェクトされる［１〜３］。これらの研究で使用されるレプリコンはＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３に認められるウイルス配列に由来する。肝実質細胞への内部移行および核局在化に続き、数個のウイルスプロモーター由来感染性ＨＢＶプラスミドの転写がＨＢＶ複製を反映する事象のカスケードを開始することが示されている。これらの事象としては、転写されたウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写されたプレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンおよびＨＢｓＡｇ（Ｂ型肝炎表面抗原）粒子のトランスフェクト細胞の培地への組織化および分泌が挙げられる。このトランスフェクションモデルは感染した肝細胞内のＨＢＶ複製のほとんどの態様を再現するとともに、それゆえＨＢＶ発現および複製のサイレンシングを調べるための優れた細胞培養モデルである。
本モデルにおいて、細胞はＨＢＶの感染性分子クローンおよび評価されるべき個々のエフェクターＲＮＡコンストラクトをコトランスフェクトされる。次に細胞はＨＢＶ発現および複製の欠損について下記に記載されるとおりモニタされる。
以下は配列番号１および配列番号５に由来する配列をコードするｅｉＲＮＡベクターを使用する実験例である。本実験用の特定のｅｉＲＮＡベクターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼベースであり（例えば、Ｔ７ｄｓＲＮＡ発現系に関して国際公開第0063364号パンフレット、ならびに２００２年７月３１日出願の米国仮特許出願第60/399,998P号明細書および２００２年１０月１８日出願の米国仮特許出願第60/419,532号明細書の教示を参照）、かつヘアピンＲＮＡ構造（特に望ましいのは、例えば、２００２年７月３１日出願の米国仮特許出願第60/399,998P号明細書および２００３年７月３１日出願のPCT/US第2003/024028号明細書に教示されるとおりの、ｄｓＲＮＡヘアピンを形成するべくＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより伸長される能力を有する部分ヘアピンである「折れ曲がり」ヘアピンコンストラクト、ならびに、ミスマッチ領域を伴うヘアピンである「アダリー」構造ヘアピン（例えば、マルチヘアピン長鎖ｄｓＲＮＡベクターおよびマルチ短鎖ヘアピン構造）、および２００２年１０月１８日出願の米国仮特許出願第60/419,532号明細書および２００３年１０月２０日出願のPCT/US第2003/033466号明細書に教示されるとおりのマルチエピトープコンストラクトである）をコードする。他の発現およびプロモーター系、例えば、上記に記載されるとおりの、および／または代替のｄｓＲＮＡ構造（すなわち、デュプレックス）をコードするベクターを使用して、同様の結果が得られるであろうことが期待される。
実験手順：トランスフェクション．
Ｈｕｈ７細胞が、トランスフェクションの時点で８０〜９０％の間の培養密度であるよう６ウェルプレートに播種される。全てのトランスフェクションはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して製造者の指示に従い実施される。本実験において、細胞は、５０ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミド、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド（下記プラスミドの説明）、６００ｎｇの配列番号１由来の配列からなるヘアピンＲＮＡをコードするｅｉＲＮＡベクター（下述）および６００ｎｇの配列番号５由来の配列からなるヘアピンＲＮＡをコードするｅｉＲＮＡベクター（下述）をトランスフェクトされる。対照細胞は、５０ｎｇのＨＢＶプラスミドおよび１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドをトランスフェクトされる。不活性フィラーＤＮＡであるｐＧＬ３ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．））が、ＤＮＡ総量／トランスフェクションが２．５μｇＤＮＡとなるよう全てのトランスフェクションに添加される。
ＨＢＶ発現の欠損についての細胞モニタリング
トランスフェクションに続き、細胞は、ＨＢｓＡｇ分泌およびＤＮＡ含有ウイルス粒子分泌を測定することにより、ＨＢＶの発現および複製における欠損または低減についてモニタされる。細胞は、ｄｓＲＮＡ投与後２日目に始めるとともにその後隔日で３週間の期間、トランスフェクト細胞の培地をアッセイすることによりモニタされる。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出するため、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（イリノイ州アボット・パーク（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，Ｉｌｌ））から市販されているオーザイム（Ａｕｓｚｙｍｅ）ＥＬＩＳＡが使用される。ＨＢｓＡｇはウイルス複製のみならずトランスフェクトされた感染性ＨＢＶクローン中のＲＮＡポリメラーゼＩＩにより開始される表面Ａｇシストロンの転写にも関係することから、ＨＢｓＡｇが測定される。ＨＢｓＡｇ合成はＨＢＶ複製の不在下においても続行できることから、ウイルス複製のみならずＨＢｓＡｇの複製非依存的合成も下方制御することが重要である。キャプシド形成されたＨＢＶゲノムＤＮＡを含むビリオン粒子の分泌もまた測定される。キャプシド形成されたＤＮＡを含むビリオン粒子の欠損はＨＢＶ複製の欠損の指標である。ビリオン分泌の分析は、裸と未成熟コア粒子と外被感染性ＨＢＶビリオンとの間を識別する技術に関わる［６］。簡潔には、培養細胞の培地由来のペレット状ウイルス粒子が、プロテイナーゼＫ消化に供されコアタンパク質を分解する。プロテイナーゼＫの不活性化後、試料はＲＱ１ＤＮアーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ Ｗｉｓ．））とともにインキュベートされコア粒子から遊離されるＤＮＡを分解する。試料はＳＤＳの存在下でプロテイナーゼＫにより再び消化されＤＮアーゼを不活性化するとともに感染性外被ビリオン粒子を破壊および分解する。次にＤＮＡはフェノール／クロロホルム抽出およびエタノール沈殿により精製される。ＨＢＶ特異的ＤＮＡがゲル電気泳動により検出され、サザンブロット分析が続く。
結果は望ましくは、ＨＢＶプラスミドおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドのみをトランスフェクトされる細胞に比べ、ＨＢＶプラスミド、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドおよびｅｉＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトされる細胞の培地中では、ＨＢｓＡｇおよびウイルス粒子分泌の双方において７０〜９５％の減少を示すであろう。
実験に使用されるベクター
Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の配列
配列番号４７は、ｐＣＥＰ４（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、カリフォルニア州カールズバッド（Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌ．））などの哺乳動物発現ベクターにクローニングされるＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を表す。クローニングは当業者により容易に行われ得る。当業者はまた、コザック配列を伴うリーダー配列がＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子から上流に直接クローニングされる必要があることも承知しているであろう。
配列番号１由来のＲＮＡヘアピンをコードするｅｉＲＮＡベクター
ベクターは上記に記載されるとおりＴ７ベースである。インサートは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の座標３００４〜２９５０（約５５ｂｐ）から位置付けられる配列からなる単分子ヘアピンをコードする。ヘアピンの一領域は配列のセンスバージョンをコードするとともにヘアピンの第２の領域は該配列のアンチセンスバージョンをコードする。ヘアピンは当業者により容易に設計および作製され得る。
配列番号５由来のＲＮＡヘアピンをコードするｅｉＲＮＡベクター
ベクターは上記に記載されるとおりＴ７ベースである。インサートは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の座標７３０〜７８６から位置付けられる配列からなる単分子ヘアピンをコードする。ヘアピンは配列番号１由来配列をコードするヘアピンについて記載されるとおり設計される。
実験１
マウスモデルの理論的根拠：
チンパンジーはヒトＨＢＶ感染力を研究するための唯一の動物モデルを表す。しかしながら、ヒトＨＢＶ発現および複製が生じるマウスモデルは利用可能である。本モデルは、抗ＨＢＶ治療剤の評価に貴重とされてきたとともにヒトにおけるこれらの薬剤の有効性についての予測因子であることが示されてきた［４］。これらのモデルの第１はトランスジェニックマウスモデルであり，ＨＢＶゲノムまたは選択されたＨＢＶ遺伝子が発現される［７、８］。ＨＢＶはマウスゲノムに組み込まれるため，これらの動物はウイルス複製用のみならず抗原のＲＴ非依存性発現用としても役立つ。複製コンピテントＨＢＶがエピソームＨＢＶ−ＤＮＡから一時的に発現される同様のモデルが存在する。本モデルは複製コンピテントＨＢＶ−ＤＮＡをマウス肝に流体力学的送達により導入することにより作成される［１］。トランスジェニック動物と異なり、これらのマウスはＨＢＶ抗原に対し免疫寛容性ではないとともにＨＢＶトランスフェクト肝実質細胞の免疫介在性クリアランスが研究され得る。
ウッドチャック肝炎（ＷＨＢＶ）およびアヒル肝炎（ＤＨＢＶ）の研究用にはそれぞれウッドチャックおよびアヒルモデルが存在するものの、我々は幾つかの理由からこれらのモデルを使用しないことを選んだ。１）ヒトＨＢＶはこれらのモデルでは研究できない。我々は究極的にはヒトＨＢＶの発現を下方制御することに関心があるため，これらのモデルの使用はある時点でヒトＨＢＶに特異的なベクターおよび／またはＲＮＡの再設計および評価が必要になるであろう。２）マウスはアイソジェニックであるとともに、それゆえ系内での遺伝子的変動によるノイズが生じない。３）ヒトＨＢＶと異なり、これらそれぞれの動物モデルと平行して研究され得る検証済みのＷＨＢＶ／ＤＨＢＶ細胞培養モデルがない。
下記に記載される実験は、複製コンピテントＨＢＶａｙｗプラスミドを様々なエフェクターｄｓＲＮＡ（ｅｉＲＮＡ）発現ベクターで同時送達する方法として流体力学的送達を利用する。流体力学的送達は、結果として核酸の肝への有効な送達となるため、本実験に理想的である［５］。同一製剤中でのｄｓＲＮＡエフェクタープラスミドと複製コンピテントＨＢＶプラスミドとの組合せは、双方のプラスミドが同一細胞により摂取される可能性が増加する。発現エフェクターｄｓＲＮＡは複製のＨＢＶプラスミドを有する細胞の大多数に存在するため、観測結果は、送達効率の差異よりもむしろエフェクタープラスミドの能力に起因し得る。本実験は特定のｅｉＲＮＡが感染肝中で有効であることのみを実証する。製剤および送達は本実施例によっては対応されない。ｅｉＲＮＡベクターの製剤、投薬および送達は、トランスジェニックマウスが使用される例において可能である。
実験手順：
対照Ｂ１０．Ｄ２マウスが、全てのウイルスＲＮＡ転写能および感染性ウイルス産生能を有する末端重複ウイルスゲノムからなるＨＢＶ（ａｙｗ亜型）の感染性分子クローンを流体力学的に注入される［１、２、３］。肝実質細胞への内部移行および核局在化に続き、数個のウイルスプロモーター由来ＨＢＶａｙｗプラスミドの転写がＨＢＶ複製を反映する事象のカスケードを開始することが示されている［１］。これらの事象としては、転写されたウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写されたプレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンおよびＨＢｓＡｇ粒子の注入された動物の血清への組織化および分泌が挙げられる。動物はＨＢＶレプリコンプラスミドの４種の用量（１μｇ、３μｇ、５μｇ、および１０μｇ）を注入される。これらの用量は、流体力学的送達後のレポータープラスミドの検出可能な発現を取り除く能力を有する非飽和用量を表すため、選ばれる。動物は、各群の動物が１０〜１９μｇ用量の特定のエフェクターコンストラクトを総ＤＮＡ用量が２０μｇとなるよう受け取るように、エフェクターｄｓＲＮＡ発現ベクター（ｅｉＲＮＡ）を同時注入される。例えば、３μｇ用量のＨＢＶレプリコンを受け取るマウスにおいては、全２０μｇの注入ＤＮＡのために、選ばれたｅｉＲＮＡベクター１７μｇが注入される。それゆえこの用量は、使用されるＨＢＶプラスミドの用量に依存する。対照動物は、ｅｉＲＮＡベクターではなくＨＢＶレプリコンを注入される。代わりに対照マウスは、製剤中ＤＮＡ総量が２０μｇとなるよう不活性フィラーＤＮＡであるｐＧＬ３ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ．））を同時注入される。本研究のｅｉＲＮＡベクターは、例えばアンビオン社（Ａｍｂｉｏｎ，Ｉｎｃ．）、米国テキサス州オースティン（Ａｕｓｔｉｎ，ＴＸ，ＵＳＡ．）の、Ｕ６ベース発現プラスミドである。これらのベクターは、配列番号１および配列番号４由来の短鎖ヘアピンＲＮＡをコードする。これらのベクターによりコードされる正確な配列は下記に記載される。ベクターは等量（重量による）で同時注入される。本明細書中で別記されるとおりの他の発現およびプロモーター系および／または代替の構造（すなわち、デュプレックス）をコードするベクターを使用して同様の結果が得られるであろうことが期待される。
配列番号１由来の配列をコードするＵ６ベースｅｉＲＮＡベクターの説明：ベクターは受託番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の座標２９０５〜２９２９に位置する配列を含むヘアピンをコードする（すなわち、ヘアピンは、ループ構造ＴＴＣＡＡＡＡＧＡにより隔てられる、この配列のセンスおよびアンチセンスバージョンを含む）。Ｕ６ベースベクター配列の説明は、Lee et al.［９］に見出され得る。本実験において使用される第２のｅｉＲＮＡベクターは、配列番号４由来のヘアピンをコードするとともに受託番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の座標１２１５〜１２３９に位置する配列をコードする。
肝試料は注入後１日目に注入された動物から採取されるとともにＨＢＶ−ＲＮＡの存在について分析される。この時点は、流体力学的送達後のマウス中のＨＢＶａｙｗプラスミド複製の動態を詳述するとともに流体力学的送達後１日目に肝中にピークＲＮＡ発現が生じることを実証するチザリ（Ｃｈｉｓａｒｉ）博士研究室の公表結果に基づき選択された［１］。肝試料中のＨＢＶ−ＲＮＡの存在はノーザンブロット分析により確認される。肝組織は、ＨＢＶ−ＲＮＡ発現の下方制御について評価されるであろう。加えて，ＨＢＶｓＡｇおよびＤＮＡ含有ウイルス粒子の測定用に４日目マウスから血清が収集されるであろう。アッセイは細胞培養レプリコン実験（実施例３）について、およびYang et al.［１］に記載されるとおりであろう。各ベクターおよび対照群は、各組が収集時点に対応する２組の動物からなるであろう。各群５動物である。
結果：
ＨＢＶレプリコンおよびｅｉＲＮＡコンストラクトを注入されるマウスは、対照動物と比較したとき、ＨＢＶ特異的ＲＮＡ、およびＨＢｓＡｇならびにＨＢＶウイルス粒子が減少しているであろう。個々の動物において、減少は約７０％から１００％近くまでの幅をとるであろう。
実験２
トランスジェニックマウス研究：背景
我々はチザリ（Ｃｈｉｓａｒｉ）博士研究室で開発されるＨＢＶトランスジェニックマウスモデルを使用しているであろう［８］。これらのマウスは多量のＨＢＶＤＮＡを複製するとともにヒト有効性の予測因子である抗ウイルス選別としてのそれらの有用性が実証されてきた［４］。これらの動物はまた、抗原のＨＢＶ組込み体介在性発現用モデルである点においても理想的であるとともに、それゆえウイルス複製用のみならず抗原のＲＴ非依存性発現用モデルとしても役立ち得る。我々はウイルス複製のみならず組込み体介在性抗原発現も同様に標的とすることに関心があるため、これは重要である。
これらの実験は、臨床的に関連性のある核酸送達方法を使用して動物にエフェクタープラスミドが投与される点において、流体力学的送達実験とは異なる。本モデルにおける有効性は、マウス肝実質細胞へのエフェクタープラスミドの有効な送達を実証する。
実験
参考文献［８］に記載されるマウスは、流体力学的送達の例に記載されるｅｉＲＮＡベクターを含む製剤を静脈内注入されるであろう。これらは、配列番号１および配列番号４由来の配列を含むヘアピンをコードするＵ６ベースｅｉＲＮＡベクターである。
注入されるＤＮＡの製剤
ＤＮＡは、PCT/US第03/14288号明細書、「Methods for Delivery of Nucleic Acids」，Satishchandran，２００３年５月６日出願に記載されるとおりトリラクトシルスペルミンおよびコレステリルスペルミンで調合される。簡潔には、３種の製剤が作製され、全て電荷比１．２（負電荷に対する正電荷）を使用する。しかしながら、電荷比０．８〜１．２の間の製剤は全て有効性を示すと期待されることは留意されるべきである。各プラスミド用ＤＮＡ出発原液は４ｍｇ／ｍｌである。２種のプラスミド原液が、各プラスミドが２ｍｇ／ｍｌとなるよう共に等量で混合される。このプラスミド混合液は最終製剤に使用される。製剤はPCT/US第03/14288号明細書（上記）に記載のとおりである：製剤Ａ）３５％トリラクトシルスペルミン、６５％コレステリルスペルミン、製剤Ｂ）５０％トリラクトシルスペルミン、５０％コレステリルスペルミンおよび製剤Ｃ）８０％トリラクトシルスペルミン、２０％コレステリルスペルミン。以上で結果として生じる全製剤は各プラスミドを１ｍｇ／ｍｌで含む。
マウスは１００μｌの調合ＤＮＡを静脈内注入された。マウスのある群は製剤Ａを受け、第２群は製剤Ｂを受け、および第３群は製剤Ｃを受ける。対照マウスの３群が同様に、対照ＤＮＡであるｐＧＬ３ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））を含む製剤の、製剤Ｄ、ＥおよびＦを注入される。注入は４日間連続して１日１回実行される。１〜３日目の注入は効果的であるが、４日目の注入プロトコルに伴いより強い有効性が見られる。
投与に続き、ＨＢＶ−ＲＮＡおよびＨＢｓＡｇの血清レベルおよびウイルス粒子を含むＤＮＡが、最初の注入後５および９日目に定量化されるであろう。全ての分析は流体力学的送達についての記載のとおりであろう。
結果：
ＨＢＶ特異的ＲＮＡレベル、ＨＢｓＡｇおよびウイルス含有ＤＮＡ粒子は製剤Ａ、ＢおよびＣ群における対照に比べ減少しているであろう。
実施例＃４
複製コンピテント細胞培養モデルにおけるＨＢＶ複製および発現サイレンシング
細胞培養モデルの簡単な説明：
Ｈｕｈ７細胞系などのヒト肝由来の細胞系が、全てのウイルスＲＮＡの転写能および感染性ウイルスの産生能を有する末端重複ウイルスゲノムからなるＨＢＶの感染性分子クローンをトランスフェクトされる［１〜３］。これらの研究に使用されるレプリコンはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＦ０９０８４０に認められるウイルス配列に由来する。肝実質細胞への内部移行および核局在化に続き、数個のウイルスプロモーター由来感染性ＨＢＶプラスミドの転写がＨＢＶ複製を反映する事象のカスケードを開始することが示されている。これらの事象としては、転写されたウイルスｍＲＮＡの翻訳、転写されたプレゲノムＲＮＡのコア粒子へのパッケージング、プレゲノムＲＮＡの逆転写、およびビリオンおよびＨＢｓＡｇ粒子のトランスフェクト細胞の培地への組織化および分泌が挙げられる。このトランスフェクションモデルは感染した肝細胞内でのＨＢＶ複製のほとんどの態様を再現するとともに、それゆえＨＢＶ発現および複製のサイレンシングを調べるための優れた細胞培養モデルである。
本モデルにおいて、細胞はＨＢＶの感染性分子クローンおよびｅｉＲＮＡコンストラクトをコトランスフェクトされた。次に細胞はＨＢＶ発現および複製の欠損について下記に記載されるとおりモニタされた。
以下は配列番号１および配列番号２の双方に由来する配列をコードするｅｉＲＮＡベクターを使用して実施された実験例である。本実験に使用される特定のｅｉＲＮＡベクターは、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼベースであるとともに約６５０ｂｐのデュプレックスＲＮＡをコードする（例えば、２０００年４月１９日出願の国際公開第00/63364号パンフレットを参照）。本明細書中で別記されるとおりの他の発現およびプロモーター系、および／または代替の構造（すなわち、デュプレックス）をコードするベクターを使用して、同様の結果が得られるであろうことが期待される。
実験手順：トランスフェクション
Ｈｕｈ７細胞が、トランスフェクションの時点で８０〜９０％の間の培養密度であるよう６ウェルプレートに播種された。全てのトランスフェクションはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）（インビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して製造者の指示に従い実施された。本実験において、細胞は、Ａ）５０ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミドａｄｗ亜型、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド（実施例３におけるプラスミドの説明）、および１．５μｇのＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡベクター（下記に記載される）、Ｂ）５０ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミド、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドおよび１．５μｇの無関係なｄｓＲＮＡ発現ベクター、Ｃ）１２５ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミド、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドおよび１．４μｇのＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡベクター、およびＤ）１２５ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミド、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドおよび１．４μｇの無関係なｄｓＲＮＡ発現ベクター、をトランスフェクトされた。全てのトランスフェクションは重複して行われた。本実験のトランスフェクションＢおよびＤは対照として機能する。トランスフェクション後４日目、培地がトランスフェクト細胞から取り除かれ、かつＨＢｓＡｇの存在についてアッセイされた（下記参照）。非トランスフェクト細胞からの培地もまた背景対照としてアッセイされた。
ＨＢＶ発現の欠損に関する細胞のモニタリング．
トランスフェクションに続き、細胞はＨＢＶ発現および複製の欠損または低下について、ＨＢｓＡｇ分泌を測定することによりモニタされた。細胞はトランスフェクト細胞の培地（および培地対照）を、ｄｓＲＮＡ投与後４日目にアッセイすることによりモニタされた。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出するため、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（イリノイ州アボット・パーク（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ））から市販されているオーザイム（Ａｕｓｚｙｍｅ）ＥＬＩＳＡが使用された。ＨＢｓＡｇはウイルス複製だけでなく、トランスフェクトされた感染性ＨＢＶクローン中のＲＮＡポリメラーゼＩＩにより開始される表面Ａｇシストロンの転写にも関連することから、ＨＢｓＡｇが測定された。ＨＢｓＡｇ合成はＨＢＶ複製の不在下でも続行できることから、ウイルス複製だけでなくＨＢｓＡｇの複製非依存的合成も下方制御することが重要である。
結果：
ＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡコンストラクトをトランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクションに比べ４日目の時点でＨＢｓＡｇに８２〜９３％の減少を示した。
本実験に使用されるＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡ
ｅｉＲＮＡベクターはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＦ０９０８４０の座標２０２７〜２６７４に位置するｄｓＲＮＡをコードする。それゆえ配列は配列番号１および配列番号２の双方に由来する配列を含む。より具体的には、配列は配列番号２の全ておよび配列番号１由来の１３４ｂｐを含む。
実施例５
細胞培養レプリコンモデルにおけるＨＣＶの下方制御
簡単な説明
本実験において、機能性ＨＣＶレプリコンを発現する細胞系が作成される。細胞系の作成はLohmann et al.［１０］に詳述されるとおりである。本実験において、親細胞系としてＨｕｈ７細胞が使用されるが、理論上は任意のヒト肝実質細胞由来細胞系が使用され得る。次に細胞はＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡベクターをトランスフェクトされる。ＨＣＶ特異的ＲＮＡの存在は、Lohmann et al.［１０］に記載されるとおりｅｉＲＮＡのトランスフェクション後３〜７日目でノーザンブロット分析により確認される。
実験プロトコル：トランスフェクション
ＨＣＶレプリコンを発現するＨｕｈ７細胞が、トランスフェクションの時点で８０〜９０％の間の培養密度であるよう６ウェルプレートに播種される。全てのトランスフェクションはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）（インビトロジェン（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して製造者の指示に従い実施される。本実験において、細胞は１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド（実施例３に記載されるプラスミド）および配列番号１１由来の配列を含んでなるヘアピンＲＮＡをコードする１．５μｇのＴ７ベースｅｉＲＮＡベクター（実施例の末尾に記載されるベクター）をトランスフェクトされる。対照細胞は、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドおよび実施例３に記載される１．５μｇのＨＢＶ特異的（配列番号１に特異的）Ｔ７ベースｅｉＲＮＡベクターをトランスフェクトされる。非トランスフェクトレプリコン発現ＨｕｈＨ７細胞は第２の対照として含まれる。各トランスフェクション混合は、１０個のトランスフェクションが実施／混合される結果として全２０個のトランスフェクション（各混合につき１０個）となり得るように行われる。３、４、５、６、および７日目に、２個の細胞／各トランスフェクションのウェルが溶解されるとともに標準技術を使用してＲＮＡが抽出される。試料はLohmann et al.［１０］に記載されるとおりＨＣＶ特異的ＲＮＡの存在についてノーザンブロット分析により同時に分析される。
結果：
ＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡベクターをトランスフェクトされる細胞は、分析される毎時点において対照細胞に比べ減少したＨＣＶ特異的ＲＮＡを示すであろう。
ＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡベクター
ｅｉＲＮＡベクターはＴ７ベースであるとともにヘアピンＲＮＡをコードする。ヘアピンの片側は配列番号４８を含んでなる。
この配列は後に９個のＴのループ構造が続く。ヘアピンの第２の側はヘアピンの第１の側に相補的である配列を含む。当業者はヘアピンコンストラクトを容易に設計および作成し得る。注意：他のプロモーターにより駆動されるとともに他のタイプのＲＮＡ構造をコードする他のタイプのｅｉＲＮＡベクターは同様の効果を有するであろうことが予想される。
実施例＃６
ＨＢＶ／ＨＣＶ同時注入処置
簡単な説明
本実施例において、ＨＢＶおよびＨＣＶレプリコンの双方を複製している細胞が、ＨＢＶおよびＨＣＶの双方に特異的なｅｉＲＮＡをコードするｅｉＲＮＡベクターを注入される。
実験プロトコル：
ＨＢＶおよびＨＣＶレプリコンの双方を含む細胞系の作成
初めにＨｕＨ７細胞が機能性ＨＣＶレプリコンを発現するよう操作される。細胞系の作成はLohmann et al.［１０］に記載されるとおりである。細胞系が樹立された後、細胞は、実施例３および下記「細胞のトランスフェクション」項に記載されるとおり、感染性ＨＢＶレプリコンプラスミドをトランスフェクトされる。本実施例において、レプリコンはＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３に求められるウイルス配列に由来する。理論的には、初めにＨＢＶレプリコンを安定的に発現する細胞系を作成するとともに、次に該細胞系を使用して同様にＨＣＶレプリコンを発現する細胞系を作成することもまた可能である。ＨＢＶおよびＨＣＶの双方を細胞に同時にトランスフェクトするとともにＨＢＶおよびＨＣＶレプリコンの双方を複製している細胞を選択および拡張することもまた可能である。
細胞のトランスフェクション
本実施例において、ＨＢＶおよびＨＣＶｅｉＲＮＡは同一ベクター内の別個のシストロンによりコードされる。しかしながら、ｅｉＲＮＡが同一シストロン内でコードされるかまたは別個のベクターにより提供される場合には、同様の結果が期待される。本実施例において、各シストロンからの転写はＴ７ＲＮＡポリメラーゼプロモーターおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼにより駆動される。各プロモーターは後にヘアピンｅｉＲＮＡが続き、その後に今度はＴ７ターミネーターが続く（図１）。本実施例におけるシストロンは集中しているが、分散しているシストロンも使用できよう。これらのＲＮＡを産生するため他の発現系（ウイルス性を含む）を使用できるであろうとともに、有効性に有意に影響を及ぼすことなしにこれらのＲＮＡの発現を駆動するため、例えば本明細書中で別記されるとおりの、他のプロモーターもまた使用できるであろうことにも留意されるべきである。然るべき発現系およびプロモーターの選択は当該分野の技術の範囲内である。また、例えば本明細書中で別記されるとおり、他のｅｉＲＮＡ構造ならびに当該領域の文献に記載されるその他のものを発現できるであろう。本実施例において、ＨＢＶｅｉＲＮＡベクターは配列番号１由来の配列をコードするとともにＨＣＶｅｉＲＮＡベクターは配列番号１１由来の配列をコードする。ベクターインサートの説明は本実施例の末尾に位置する。
Ｈｕｈ７細胞が、トランスフェクションの時点で８０〜９０％の間の培養密度であるよう６ウェルプレートに播種される。全てのトランスフェクションはリポフェクタミン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ）（商標）（インビトロジェン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））を使用して製造者の指示に従い実施される。本実験において、細胞は、５０ｎｇの感染性ＨＢＶプラスミド、１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミド（プラスミドの説明は実施例３にある）、６００ｎｇの配列番号１由来の配列からなるヘアピンＲＮＡをコードするｅｉＲＮＡベクター（下記および実施例３に記載される）、および６００ｎｇの配列番号１１由来の配列からなるヘアピンＲＮＡをコードするｅｉＲＮＡベクター（下記に記載される）をトランスフェクトされる。対照細胞は、５０ｎｇのＨＢＶプラスミドおよび１μｇのＴ７ＲＮＡポリメラーゼ発現プラスミドをトランスフェクトされる。不活性フィラーＤＮＡであるｐＧＬ３ベーシック（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ）が、ＤＮＡ総量／トランスフェクションが２．５μｇＤＮＡになるよう全てのトランスフェクションに添加される。各トランスフェクション混合は、１０個のトランスフェクションが実施／混合される結果として結果として全２０個のトランスフェクション（各混合につき１０個）となり得るように行われる。
分析
トランスフェクションに続き、細胞はＨＢＶ発現および複製の欠損または低下について、ＨＢｓＡｇ分泌およびＤＮＡ含有ウイルス粒子分泌を測定することによりモニタされる。細胞はトランスフェクト細胞の培地を、ｄｓＲＮＡ投与後２日目から始めるとともにその後隔日で３週間の期間、アッセイすることによりモニタされる。Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を検出するため、アボット・ラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｓ）（イリノイ州アボット・パーク（Ａｂｂｏｔｔ Ｐａｒｋ，ＩＬ））から市販されているオーザイム（Ａｕｓｚｙｍｅ）ＥＬＩＳＡが使用される。ＨＢｓＡｇはウイルス複製だけでなく、トランスフェクトされた感染性ＨＢＶクローン中のＲＮＡポリメラーゼＩＩにより開始される表面Ａｇシストロンの転写にも関連することから、ＨＢｓＡｇが測定された。ＨＢｓＡｇ合成はＨＢＶ複製の不在下で続行できることから、ウイルス複製だけでなくＨＢｓＡｇの複製非依存的合成も下方制御することが重要である。キャプシド形成されたＨＢＶゲノムＤＮＡを含むビリオン粒子の分泌もまた測定される。キャプシド形成されたＤＮＡを含むビリオン粒子の欠損はＨＢＶ複製の欠損の指標である。ビリオン分泌の分析は、裸と未成熟コア粒子と外被感染性ＨＢＶビリオンとの間を識別する技術に関わる［６］。簡潔には、培養細胞の培地由来のペレット状ウイルス粒子が、プロテイナーゼＫ消化に供されコアタンパク質を分解する。プロテイナーゼＫの不活性化後、試料はＲＱ１ＤＮアーゼ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ウィスコンシン州マディソン（Ｍａｄｉｓｏｎ ＷＩ））とともにインキュベートされコア粒子から遊離されたＤＮＡを分解する。試料はＳＤＳの存在下でプロテイナーゼＫにより再び消化されＤＮアーゼを不活性化するとともに感染性外被ビリオン粒子を破壊および分解する。次にＤＮＡはフェノール／クロロホルム抽出により精製されるとともに沈殿される。ＨＢＶ特異的ＤＮＡがゲル電気泳動により検出され、サザンブロット分析が続く。
３、４、５、６および７日目に、２個の細胞／各トランスフェクションのウェル（実験用および対照用）が溶解されるとともに標準技術を使用してＲＮＡが抽出される。試料はまた、Lohmann et al.［１０］に記載されるとおりＨＣＶ特異的ＲＮＡの存在についてノーザンブロット分析により分析もされる。
結果
ＨＢＶ−ＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡベクターをトランスフェクトされた細胞は、分析される毎時点において対照細胞に比べ減少したＨＣＶ特異的ＲＮＡレベルを示すであろう。加えて、ＨＢｓＡｇおよびＨＢＶウイルス粒子のレベルもまた、対照トランスフェクションに比べ減少するであろう。
ＨＣＶ特異的ｅｉＲＮＡ配列
ｅｉＲＮＡベクターはＴ７ベースであるとともにヘアピンＲＮＡをコードする。ヘアピンの片側は配列番号４８を含んでなる。
この配列は後に９個のＴのループ構造が続く。ヘアピンの第２の側はヘアピンの第１の側に相補的である配列を含む。当業者はヘアピンコンストラクトを容易に設計および作成し得る。注意：ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを含む他のプロモーターにより主導されるとともに、様々なヘアピン構造を含む他のタイプのＲＮＡ構造をコードする他のタイプのｅｉＲＮＡベクターは同様の効果を有するであろうことが予想される。特に望ましいのは、例えば、２００２年７月３１日出願の米国仮特許出願第60/399,998P号明細書および２００３年７月３１日出願のPCT/US第2003/024028号明細書に教示されるとおりの、ｄｓＲＮＡヘアピンを形成するべくＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼにより伸長される能力を有する部分ヘアピンである「折れ曲がり」ヘアピンコンストラクト、ミスマッチ領域を伴うヘアピンである「アダリー」構造ヘアピン（例えば、マルチヘアピン長鎖ｄｓＲＮＡベクターおよびマルチ短鎖ヘアピン構造）、および２００２年１０月１８日出願の米国仮特許出願第60/419,532号明細書および２００３年１０月２０日出願のPCT/US第2003/033466号明細書に教示されるとおりのマルチエピトープコンストラクト、ならびに当業者に周知の他の多様なｄｓＲＮＡ構造である。
ＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡ−配列番号１
ベクターは上記に記載されるとおりＴ７ベースである。インサートは、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｖ０１４６０およびＪ０２２０３の座標３００４−２９５０（約５５ｂｐ）から位置付けられる配列からなる単分子ヘアピンをコードする。ヘアピンの一領域は配列のセンスバージョンをコードするとともにヘアピンの第２の領域は配列のアンチセンスバージョンをコードする。ヘアピンは当業者により容易に設計および作製され得る。
実施例＃７
複数のプロモーターベクター中のＨＢＶ特異的ｅｉＲＮＡの組合せを使用する複製コンピテント細胞培養モデル（実施例１を参照）におけるＨＢＶ複製および発現サイレンシング
その教示が参照により本明細書に組み込まれる、２００５年８月２３日出願のPCT/US第05/29976号明細書および「Multiple RNA Pol III Promoter Expression Constructs」と題する米国仮特許出願（２００４年８月２３日出願の米国仮特許出願第60/603622号明細書、および２００４年１１月２２日出願の同第60/629942号明細書）に開示されるとおり、表１に示される２本またはそれ以上の（好ましくは３、４、５、６本またはそれ以上の）ｓｈＲＮＡ配列および配列番号４９が、個別の各ｓｈＲＮＡ用プロモーターの制御下において個別のシストロン内の同一プラスミドベクターにコードされ得る。配列番号４９は：
Figure 0005934310
配列番号４９はＨＢＶ保存領域を標的とするｓｈＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のコード鎖を表す。上記配列の最初の２１塩基は、ＨＢＶゲノムの位置７９９〜７７９位由来のＨＢＶｍＲＮＡのセンス配列と同一の、ＡＹＷ株である（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号Ｖ０１４６０に与えられる相補鎖に従い番号付けされる）。この配列は後に、ｓｈＲＮＡのループ部分を表す９塩基（すなわち、ＡＧＡＧＡＡＣＴＴ）が続き、その後に最初の２１塩基と逆相補配列の２１塩基が続く。（ループ配列は二本鎖「ステム」を形成する相補配列に結合することのみに供されるとともに、それゆえ長さおよびヌクレオチド配列におけるかなりの変動がループ領域内で許容されることは理解されるであろう）。好ましい実施形態において、このＤＮＡ配列は、好ましくは７ＳＫ、Ｕ６等のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターといったプロモーターの制御下において操作可能に然るべき発現ベクター中に配置されるであろう。結果として生じるＲＮＡ転写：
Figure 0005934310
は二本鎖構造の２１塩基対を有するヘアピンまたはステム−ループ構造であることが想定されるであろう。
分子生物学の当業者により一般的に用いられる方法を使用して、２個またはそれ以上の、好ましくは３個またはそれ以上の、より好ましくは４個またはそれ以上の、５個またはそれ以上の、または配列番号４９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３の全てをコードする単一ベクターが構築される。ＨＢＶ標的のｄｓＲＮＡ介在性サイレンシングの医薬応用に特に好ましい実施形態は、個別のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下に、少なくとも配列番号１９、配列番号２３、および配列番号１８、および場合により、配列番号４９および／または配列番号２１に対応するｓｈＲＮＡをコードする単一発現コンストラクトを含んでなる。かかるｓｈＲＮＡ発現ベクターが有利には、幾つかの代替的適応および組合せにおいて、Ｕ６、７ＳＫ、およびＨ１プロモーターを含む、１個またはそれ以上のＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターを利用してもよい。特に好ましいコンストラクトは、米国仮特許出願第60/603622号明細書および同第60/629942号明細書に教示されるとおりの１個またはそれ以上の７ＳＫプロモーターを利用するであろう。本実施例はこのように、１個のベクターを１個のｓｈＲＮＡとともに同時に導入する代わりに出願人が複数のｓｈＲＮＡを発現する単一プラスミドコンストラクトを送達することを除き、実施例１の実験１と類似している。
ｄｓＲＮＡサイレンシングの治療応用への本アプローチの利点は主に、経済性、単純性および各々がＨＢＶゲノムの異なる部位を標的とする複数の異なるｓｈＲＮＡを含んでなる単一薬物体の協調された送達にある。ウイルスゲノムの複数の部位を同時に標的とする能力は、薬物耐性（ウイルス突然変異による）の広範な現象を臨床的に阻止する点において極めて有利であるとともに、単一送達剤中（本発明のプラスミドベクター）にこれらの異なる標的部位に対するｄｓＲＮＡ薬物体を組み合わせる能力によりこの概念的アプローチは独自に実行可能なものとなる。例えば化学合成または生体内発現を通じ、ｓｈＲＮＡ、例えば配列番号４９、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３に対応するＲＮＡが産生されてもよく、および単独および組合せで動物細胞中に送達されてもよいが、ある適用においては、動物細胞内で単一発現ベクター由来の複数のｓｈＲＮＡを発現することに有意な利点がある。本実施例において、複数のｓｈＲＮＡ発現ベクターの効力は、同様のアッセイにより測定されたとき、実験１で使用された単一ベクターの任意の１個を有意に上回った。
実施例＃８
ｄｓＲＮＡエフェクター分子によるＨＣＶの感染性ビリオンの阻害
ＨＣＶ標的ｄｓＲＮＡのさらなる例として、表１６に与えられる配列は、ＨＣＶの５’および３’非翻訳領域由来の高度保存コード領域セキトープを表す。各配列はコード鎖として記載されるとともに、本明細書中で別記されるとおりのループまたはリンカー配列によりその逆相補体に連結される表１６に示されるとおりのコード配列を含んでなる短鎖ヘアピンｄｓＲＮＡエフェクター分子の設計を具体化するため使用される。示される配列は、新規に利用可能な感染性ビリオン全体の産生能を有するＨＣＶ複製系においてインビトロで試験されたため（Wakita T，Pietschmann T，Kato T，Date T，Miyamoto M，Zhao Z，Murthy K，Habermann A，Krausslich HG，Mizokami M，Bartenschlager R，Liang TJ.，"Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome"，Nat Med 2005 Jul;11(7):791-6；およびZhong J，Gastaminza P，Cheng G，Kapadia S，Kato T，Burton DR，Wieland SF，Uprichard SL，Wakita T，Chisari FV.，"Robust hepatitis C virus infection in vitro"，Proc Natl Acad Sci USA 2005 Jun 28;102(26):9294-9に開示される）、抗ウイルス治療剤として特に効果的であると予想される。この系においては、自然感染と同じく、全てのウイルスタンパク質およびウイルス核酸配列が細胞中に存在する。完全性の低いレプリコン系においては、ｄｓＲＮＡサイレンシング分子は新規系におけるほど厳密には試験され得ない。１個またはそれ以上の（２、３、４、５個、またはそれ以上の）ＨＣＶセキトープおよびそれらの相補体が、デュプレックスｄｓＲＮＡエフェクター分子、短鎖ヘアピンｄｓＲＮＡエフェクター分子として利用され得る、および／またはヒト細胞または生物体を含む哺乳動物細胞のインビボでの発現能を有するｄｓＲＮＡ発現ベクターにコードされ得るであろうことが期待される。
Figure 0005934310
表１７中の配列は、追加的な好ましい、ウイルス（配列番号１１）の５’ＵＴＲ由来の高度に保存された少なくとも１９連続塩基対のＨＣＶ配列を表す。本発明のｄｓＲＮＡエフェクター分子を生成するため、これらの配列が、それらの逆相補体および、場合により、ヘアピンｄｓＲＮＡエフェクター分子を形成することが望ましい時には、配列をその逆相補体に結合するループまたはリンカー配列と併用される。前記５’ＵＴＲ保存配列（配列番号１１由来）を含んでなる１個またはそれ以上の二本鎖ＲＮＡ分子は、例えば３’ＵＴＲ（配列番号２７由来）由来の１本またはそれ以上の高度保存配列および／または配列番号１２由来の少なくとも１９連続塩基対の配列を含む、１個またはそれ以上の本発明の他のｄｓＲＮＡエフェクター分子との組合せで有利に使用されてもよい。
Figure 0005934310
参考文献
１．Yang, P. L, et al., Hydrodynamic injection of viral DNA: a mouse model of acute hepatitis B virus infection. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002. 99(21): p. 13825-30.
２．Guidotti, L.G., et al., Viral clearance without destruction of infected cells during acute HBV infection. Science, 1999. 284(5415): p. 825-9.
３．Thimme, R., et al., CD8(+) T cells mediate viral clearance and disease pathogenesis during acute hepatitis B virus infection. J Virol, 2003. 77(1): p. 68-76.
４．Morrey, J. D., et al., Transgenic mice as a chemotherapeutic model for Hepatitis B infection" In "Therapies for Viral Hepatitis" Eds. Schinazi, R. F., Somma
dossi, J-P. and Thomas, H. C, International medical Press, Holborn, London WC 1V 6QA, UK, 1998.
５．Liu, F., Y. Song, and D. Liu, Hydrodynamics-based transfection in animals by systemic administration of plasmid DNA. Gene Ther, 1999. 6(7): p. 1258-66.
６．Delaney, W.E.t. and H. C. Isom, Hepatitis B virus replication in human HepG2 cells mediated by hepatitis B virus recombinant baculovirus. Hepatology, 1998.
28(4): p. 1134-46.
７．Chisari, F.V., et al., A transgenic mouse model of the chronic hepatitis B surface antigen carrier state. Science, 1985. 230(4730): p. 1157-60.
８．Guidotti, L.G., et al., High-level hepatitis B virus replication in transgenic mice. J Virol, 1995. 69(10): p. 6158-69.
９．Lee, NS, Dohjima, T., Bauer G., Li, H. Li, M.J., Ehsani, A., Salvaterra, P. and Rossi, J.
Expression of small interfering RNAs targeted against HIV-1 rev transcripts in human cells. Nature Biotechnology, 2002, p.500-505.
１０．Lohmann, V., Korner, F., Koch, J.-O., Herian, U., Theilmann, L. and Bartenschlager. R. Replication of Subgenomic Hepatits C Virus RNAs in a Hepatoma Cell Line. Science. 1999. 285: 110-113.
配列の簡単な説明
配列番号１〜配列番号１０はＢ型肝炎ゲノムの保存領域を表す。
配列番号１１および配列番号１２はＣ型肝炎ゲノムの保存領域を表す。
配列番号１３はヒトＵ６プロモーターのヌクレオチド配列を表す。
配列番号１４および配列番号１５は配列番号５内に位置するＨＢＶ配列を有するｅｉＲＮＡを表す。
配列番号１６および配列番号１７は配列番号４内に位置するＨＢＶ配列を有するｅｉＲＮＡを表す。
配列番号１８は配列番号１０内に位置するＨＢＶ配列を有するｅｉＲＮＡを表す。
配列番号１９〜配列番号２２は配列番号３内に位置するＨＢＶ配列を有するｅｉＲＮＡを表す。
配列番号２３および配列番号２４は配列番号２内に位置するＨＢＶ配列を有するｅｉＲＮＡを表す。
配列番号２５および配列番号２６は配列番号１内に位置するＨＢＶ配列を有するｅｉＲＮＡを表す。
配列番号２７はＨＣＶ３’ＵＴＲの「Ｘ」領域を表す。
配列番号２８〜配列番号３６はＨＣＶ３’ＵＴＲに位置するｓｉＲＮＡを表す。
配列番号３７〜配列番号４４はＨＣＶ３’ＵＴＲの「Ｘ」領域に位置するｓｉＲＮＡを表す。
配列番号４５はＨＣＶコアに位置するｓｉＲＮＡを表す。
配列番号４６はラミンに位置するｓｉＲＮＡを表す。
配列番号４７はＴ７ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を表す。
配列番号４８はＣ型肝炎ウイルス配列の５’セグメントを表す（ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＪ２３８７９９の位置３６〜３５８位に一致し、ＡＪ２３８７９９の２０４位でのＣからＧへの、およびＡＪ２３８７９９の３５７位でのＧからＡへの、２塩基変異を伴う）。
配列番号４９はＨＢＶ保存配列に対するｅｉＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）分子を表す。
配列番号５０〜配列番号６２は配列番号１４〜２３、２５〜２６、および４９の最初の２１ヌクレオチドを表す。
配列番号６３〜配列番号７１は配列番号２８〜３６の最初の２１ヌクレオチドを表す。
配列番号７２〜配列番号７６はＨＣＶの５’および３’非翻訳領域由来の高度保存コード領域セキトープを表す。
配列番号７７〜配列番号１０９はＨＣＶ（配列番号１１）の５’ＵＴＲ由来のＨＣＶ高度保存配列を表す。

Claims (10)

  1. 配列番号１９のヌクレオチド配列を含み、Ｔに対しＵが置換される二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含有する、哺乳動物細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する剤。
  2. 配列番号１９の配列を含み、Ｔに対しＵが置換される二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含有する、哺乳動物細胞中のＢ型肝炎ウイルスのポリヌクレオチド配列の発現を阻害する組成物。
  3. 少なくとも２個の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子を含有し、各二本鎖ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３からなる群より選択される配列を含み、Ｔに対しＵが置換される、請求項２に記載の組成物。
  4. 配列番号１９の配列を含み、Ｔに対しＵが置換される二本鎖ＲＮＡエフェクター分子の発現能を有する少なくとも１個の発現ベクターを含有する、請求項２に記載の組成物。
  5. 哺乳動物細胞中での、少なくとも２個の二本鎖ＲＮＡエフェクター分子の発現能を有する少なくとも１個の発現ベクターを含有し、各二本鎖ＲＮＡエフェクター分子が、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、および配列番号２３からなる群より選択される配列を含み、Ｔに対しＵが置換される、請求項４に記載の組成物。
  6. 前記少なくとも１個の発現ベクターが、ポリメラーゼＩプロモーター、ポリメラーゼＩＩＩプロモーター、Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター、７ＳＫプロモーター、およびミトコンドリアプロモーターからなる群より選択される少なくとも１個のプロモーターを含み、前記プロモーターが前記二本鎖ＲＮＡエフェクター分子をコードする配列に操作可能に連結される、請求項４に記載の組成物。
  7. 請求項４に記載の発現ベクターを含有する哺乳動物細胞。
  8. 配列番号１９の配列のヌクレオチド１〜１９、１〜２０、１〜２１、２〜２０、２〜２１、または３〜２１に相当する配列からなるポリヌクレオチド。
  9. 配列番号１９の配列からなるポリヌクレオチド。
  10. 配列番号５５の配列内由来の１９連続塩基対のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド。
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DE (1) DE602005027747D1 (ja)
WO (1) WO2006069064A2 (ja)

Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8575327B2 (en) * 2003-06-12 2013-11-05 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Conserved HBV and HCV sequences useful for gene silencing
JP2008514202A (ja) 2004-09-24 2008-05-08 ニュークレオニクス・インコーポレイテッド Ｒｎａｉによる一本鎖ウイルスの逆鎖複製中間体のターゲティング
WO2012024170A2 (en) 2010-08-17 2012-02-23 Merck Sharp & Dohme Corp. RNA INTERFERENCE MEDIATED INHIBITION OF HEPATITIS B VIRUS (HBV) GENE EXPRESSION USING SHORT INTERFERING NUCLEIC ACID (siNA)
CN111172162A (zh) 2011-04-21 2020-05-19 葛兰素史克公司 乙型肝炎病毒(hbv)表达的调节
WO2013119793A1 (en) * 2012-02-07 2013-08-15 University Of Kansas Chemiluminescent nanoparticles and uses thereof
WO2013159109A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hepatitis b virus (hbv) expression
KR102531576B1 (ko) * 2012-12-06 2023-05-11 시그마-알드리치 컴퍼니., 엘엘씨 Crispr-기초된 유전체 변형과 조절
WO2015078856A1 (en) * 2013-11-28 2015-06-04 Bavarian Nordic A/S Compositions and methods vectors for inducing an enhanced immune response using poxvirus vectors
JOP20200092A1 (ar) 2014-11-10 2017-06-16 Alnylam Pharmaceuticals Inc تركيبات iRNA لفيروس الكبد B (HBV) وطرق لاستخدامها
CA2984512A1 (en) * 2015-05-06 2016-11-10 Benitec Biopharma Limited Reagents for treatment of hepatitis b virus (hbv) infection and use thereof
RU2021113126A (ru) 2016-05-05 2021-08-20 Бенитек Байофарма Лимитед Средства для лечения инфекции вируса гепатита в (hbv) и их применение
CA3043637A1 (en) * 2016-11-11 2018-05-17 Janssen Biopharma, Inc. Oligonucleotide targeting strategy for hbv cccdna
CA3043768A1 (en) 2016-11-29 2018-06-07 PureTech Health LLC Exosomes for delivery of therapeutic agents
US11324820B2 (en) 2017-04-18 2022-05-10 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods for the treatment of subjects having a hepatitis b virus (HBV) infection
JP2021533767A (ja) 2018-08-13 2021-12-09 アルナイラム ファーマシューティカルズ, インコーポレイテッドAlnylam Pharmaceuticals, Inc. Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）ｄｓＲＮＡ物質組成物およびその使用方法

Family Cites Families (44)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5643771A (en) 1980-05-19 1997-07-01 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Non-reverting live bacterial vaccines
US4897355A (en) 1985-01-07 1990-01-30 Syntex (U.S.A.) Inc. N[ω,(ω-1)-dialkyloxy]- and N-[ω,(ω-1)-dialkenyloxy]-alk-1-yl-N,N,N-tetrasubstituted ammonium lipids and uses therefor
WO1989007136A2 (en) 1988-02-05 1989-08-10 Whitehead Institute For Biomedical Research Modified hepatocytes and uses therefor
US5703055A (en) 1989-03-21 1997-12-30 Wisconsin Alumni Research Foundation Generation of antibodies through lipid mediated DNA delivery
US5279833A (en) 1990-04-04 1994-01-18 Yale University Liposomal transfection of nucleic acids into animal cells
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
US5283185A (en) 1991-08-28 1994-02-01 University Of Tennessee Research Corporation Method for delivering nucleic acids into cells
US5593972A (en) 1993-01-26 1997-01-14 The Wistar Institute Genetic immunization
US5739118A (en) 1994-04-01 1998-04-14 Apollon, Inc. Compositions and methods for delivery of genetic material
WO1995027788A1 (fr) * 1994-04-11 1995-10-19 Dainabot Co., Ltd. Polypeptide derive d'une variante du virus de l'hepatite b, gene le codant et adn associe
US5837533A (en) 1994-09-28 1998-11-17 American Home Products Corporation Complexes comprising a nucleic acid bound to a cationic polyamine having an endosome disruption agent
US5877159A (en) 1995-05-03 1999-03-02 University Of Maryland At Baltimore Method for introducing and expressing genes in animal cells and live invasive bacterial vectors for use in the same
US5932241A (en) 1995-06-07 1999-08-03 Valentis, Incorporated Cationic lipid DNA complexes for gene targeting
US5874565A (en) 1995-08-29 1999-02-23 Washington University Nucleic acids comprising a highly conserved novel 3 terminal sequence element of the hepatitis C virus
US5824538A (en) 1995-09-06 1998-10-20 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army Shigella vector for delivering DNA to a mammalian cell
US5843770A (en) * 1996-03-11 1998-12-01 The Immune Response Corporation Antisense constructs directed against viral post-transcriptional regulatory sequences
US6217900B1 (en) 1997-04-30 2001-04-17 American Home Products Corporation Vesicular complexes and methods of making and using the same
EP1027074A1 (en) 1997-10-28 2000-08-16 American Home Products Corporation Compositions and methods for delivery of genetic material
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
EP1063963A1 (en) 1998-03-16 2001-01-03 The Procter & Gamble Company Method of reducing cellulite in mammalian skin
EP2363478B1 (en) 1999-04-21 2019-07-24 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Methods and compositions for inhibiting the function of polynucleotide sequences
EP1238061A2 (en) * 1999-11-24 2002-09-11 Pharmasset, Ltd. A new genotype of hepatitis b virus
AU2358201A (en) * 1999-12-03 2001-06-12 Innogenetics N.V. New hbv sequences
EP1229134A3 (en) 2001-01-31 2004-01-28 Nucleonics, Inc Use of post-transcriptional gene silencing for identifying nucleic acid sequences that modulate the function of a cell
WO2002072763A2 (en) * 2001-03-09 2002-09-19 Human Genome Sciences, Inc. Nucleic acids, proteins, and antibodies
DE10163098B4 (de) * 2001-10-12 2005-06-02 Alnylam Europe Ag Verfahren zur Hemmung der Replikation von Viren
EP1432724A4 (en) * 2002-02-20 2006-02-01 Sirna Therapeutics Inc RNA inhibition mediated inhibition of MAP KINASE GENES
EP1585947B1 (en) 2002-05-03 2020-01-01 Harman International Industries, Incorporated Sound detection and localization system
AU2003274906A1 (en) 2002-07-31 2004-02-16 Nucleonics, Inc. Double stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
US7303906B2 (en) 2002-09-06 2007-12-04 Wisconsin Alumni Research Foundation Competent bacteria
CA2502649A1 (en) 2002-10-18 2004-04-29 Nucleonics Inc. Double-stranded rna structures and constructs, and methods for generating and using the same
JP2006507841A (ja) * 2002-11-14 2006-03-09 ダーマコン， インコーポレイテッド 機能的ｓｉＲＮＡおよび超機能的ｓｉＲＮＡ
JP3839453B2 (ja) * 2002-11-22 2006-11-01 株式会社バイオシンクタンク Ｒｎａ干渉の標的塩基配列検索方法、ｒｎａ干渉を生じさせるポリヌクレオチドの塩基配列設計方法、２本鎖ポリヌクレオチドの作製方法、遺伝子の発現抑制方法、塩基配列処理装置、塩基配列処理方法をコンピュータに実行させるプログラム、記録媒体、および、塩基配列処理システム
US6673661B1 (en) 2002-12-20 2004-01-06 Taiwan Semiconductor Manufacturing Co., Ltd. Self-aligned method for forming dual gate thin film transistor (TFT) device
WO2004063375A1 (en) * 2003-01-15 2004-07-29 Hans Prydz OPTIMIZING siRNA BY RNAi ANTISENSE
US20060128617A1 (en) * 2003-01-24 2006-06-15 Tokyo Metropolitan Organization For Medical Research Oligoribonucleotide or peptidic nucleic acid inhibiting function of hepatitis c virus
EP1597351B1 (en) 2003-02-27 2012-04-18 Alnylam Pharmaceuticals Inc. METHODS AND CONSTRUCTS FOR EVALUATION OF RNAi TARGETS AND EFFECTOR MOLECULES
CN1257284C (zh) * 2003-03-05 2006-05-24 北京博奥生物芯片有限责任公司 一种体外阻断乙肝病毒表达的方法
SI2270162T1 (sl) * 2003-06-12 2019-03-29 Alnylam Pharmaceuticals Inc. Konzervirana HBV in HCV zaporedja uporabna za utišanje genov
WO2005007877A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 University Of Massachusetts Regulatable promoters for synthesis of small hairpin rna
WO2005007875A2 (en) 2003-07-18 2005-01-27 University Of Massachusetts Enhanced promoters for synthesis of small hairpin rna
DE602005024015D1 (de) * 2004-08-23 2010-11-18 Alnylam Pharmaceuticals Inc Expressionskonstrukte mit mehreren rna-polymerase-iii-promotoren
JP5671371B2 (ja) * 2011-03-01 2015-02-18 株式会社山本鉄工所 連続プレス装置
JP2015086965A (ja) 2013-10-31 2015-05-07 株式会社エクセディ フライホイール組立体

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