BR112020007157A2 - métodos e composições para a atenuação de respostas de igm antivetor de transferência viral - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere aqui, neste requerimento de patente, a métodos e composições relacionadas ou kits para a administração de vetores de transferência viral em combinação com nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor e um agente anti-igm.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTO-

DOS E COMPOSIÇÕES PARA A ATENUAÇÃO DE RESPOSTAS DE IGM ANTIVETOR DE TRANSFERÊNCIA VIRAL". CAMPO DA INVENÇÃO

[001] A invenção se refere a métodos e composições relaciona- das para a administração de vetores de transferência viral com nano- carreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor e um agente anti-IgM a um sujeito. De maneira preferencial, os métodos e composições são para a redução ou prevenção de respostas de IgM contra o vetor de transferência viral.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

[002] Em um aspecto, é proporcionado um método compreen- dendo o estabelecimento de uma resposta atenuada antivetor de transferência viral em um sujeito por administração concomitante de um vetor de transferência viral, nanocarreadores sintéticos compreen- dendo um imunossupressor, e um agente anti-IgM, ao sujeito.

[003] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos propor- cionados aqui, neste requerimento de patente, a resposta atenuada antivetor de transferência viral é uma resposta de IgM contra o vetor de transferência viral.

[004] Em outro aspecto, é proporcionado um método compreen- dendo a intensificação da expressão transgênica de um vetor de trans- ferência viral em um sujeito por administração repetidamente, conco- mitantemente ao sujeito de um vetor de transferência viral, de nano- carreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor e de um agente anti-IgM.

[005] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos propor- cionados aqui, neste requerimento de patente, a administração con- comitante do vetor de transferência viral, de nanocarreadores sintéti- cos compreendendo um imunossupressor e/ou do agente anti-IgM é repetida.

[006] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o vetor de transferência viral é qualquer um dos vetores de transferência viral proporcionados aqui, neste re- querimento de patente, tal como qualquer um dos referidos vetores definidos em qualquer uma das reivindicações.

[007] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, os nanocarreadores sintéticos são qualquer um dos nanocarreadores sintéticos proporcionados aqui, nes- te requerimento de patente, tal como qualquer um dos referidos nano- carreadores sintéticos definidos em qualquer uma das reivindicações.

[008] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o agente anti-IgM é um anticorpo anta- gonista de IgM. Anticorpos antagonistas de IgM ou fragmentos de li- gação ao antígeno dos mesmos especificamente se ligam a CD10, CD19, CD20, CD22, CD27, CD34, CD40, CD79a, CD79b, CD123, CD179b, FLT-3, ROR1, BR3, BAFF, ou B7RP-1. Em uma modalidade, o anticorpo antagonista de IgM ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é qualquer um dos anticorpos contra CD10, CD19, CD20, CD22, CD27, CD34, CD40, CD79a, CD79b, CD123, CD179b, FLT-3, ROR1, BR3, BAFF, ou B7RP-1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, tais como qualquer um dos referidos anticorpos contra CD10, CD19, CD20, CD22, CD27, CD34, CD40, CD79a, CD79b, CD123, CD179b, FLT-3, ROR1, BR3, BAFF, ou B7RP-1 ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos definidos em qualquer uma das reivindicações.

[009] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o anticorpo antagonista de IgM é um anticorpo anti-BAFF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. Em uma modalidade, o anticorpo anti-BAFF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo é qualquer um dos anticorpos anti-BAFF ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, tal como qualquer um dos referidos anticorpos anti-BAFF ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mes- mos definidos em qualquer uma das reivindicações.

[0010] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o agente anti IgM é um agente anti- BAFF. Em uma modalidade, o agente anti-BAFF é qualquer um dos agentes anti-BAFF proporcionados aqui, neste requerimento de paten- te, tal como qualquer um dos referidos agentes anti-BAFF definidos em qualquer uma das reivindicações.

[0011] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o agente anti IgM é um agente modula- dor de IL-21, por exemplo, um antagonista de IL-21 ou antagonista de receptor de IL-21. Em uma modalidade, o agente modulador de IL-21 é qualquer um dos agentes moduladores de IL-21 proporcionados aqui, neste requerimento de patente, tal como qualquer um dos referi- dos agentes moduladores de IL-21 definidos em qualquer uma das rei- vindicações.

[0012] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o agente anti IgM é um inibidor da tiro- sina quinase, por exemplo, um inibidor da Syk, um inibidor da BTK, ou um inibidor da tirosina quinase da proteína SRC. Em uma modalidade, o inibidor da tirosina quinase é qualquer um dos inibidores da tirosina quinase proporcionados aqui, neste requerimento de patente, tal como qualquer um dos referidos inibidores da tirosina quinase definidos em qualquer uma das reivindicações. Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, composições ou kits proporcionados, o inibidor da tirosina quinase é um inibidor da Syk. Em uma modalidade, o inibidor da quinase Syk é qualquer um dos inibidores da Syk proporcionados aqui, neste requerimento de patente, tal como qualquer um dos referi- dos inibidores da Syk definidos em qualquer uma das reivindicações. Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, composições ou kits proporcionados, o inibidor da tirosina quinase é um inibidor da BTK. Em uma modalidade, o inibidor da quinase BTK é qualquer um dos inibidores da BTK proporcionados aqui, neste requerimento de pa- tente, tal como qualquer um dos referidos inibidores da BTK definidos em qualquer uma das reivindicações. Em uma modalidade de qual- quer um dos métodos, composições ou kits proporcionados, o inibidor da tirosina quinase é um inibidor da tirosina quinase da proteína SRC. Em uma modalidade, o inibidor da tirosina quinase da proteína SRC é qualquer um dos inibidores da tirosina quinase da proteína SRC pro- porcionados aqui, neste requerimento de patente, tal como qualquer um dos referidos inibidores da tirosina quinase da proteína SRC defi- nidos em qualquer uma das reivindicações.

[0013] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o agente anti IgM é um inibidor da PI3K. Em uma modalidade, o inibidor da PI3K é qualquer um dos inibidores da PI3K proporcionados aqui, neste requerimento de patente, tal como qualquer um dos referidos inibidores da PI3K definidos em qualquer uma das reivindicações.

[0014] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o agente anti IgM é um inibidor da PKC. Em uma modalidade, o inibidor da PKC é qualquer um dos inibidores da PKC proporcionados aqui, neste requerimento de patente, tal como qualquer um dos referidos inibidores da PKC definidos em qualquer uma das reivindicações.

[0015] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o agente anti IgM é um antagonista de APRIL. Em uma modalidade, o antagonista de APRIL é qualquer um dos antagonistas de APRIL proporcionados aqui, neste requerimento de patente, tal como qualquer um dos referidos antagonistas de APRIL definidos em qualquer uma das reivindicações.

[0016] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o agente anti IgM é uma tetraciclina. Em uma modalidade, a tetraciclina é qualquer uma das tetraciclinas proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, tal como qual- quer uma das referidas tetraciclinas definidas em qualquer uma das reivindicações.

[0017] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits proporcionados, o agente anti IgM é mizoribina ou tofa- citinib.

[0018] Em outro aspecto, são proporcionadas composições, tais como kits, compreendendo qualquer um dos vetores de transferência viral proporcionados aqui, neste requerimento de patente, qualquer um dos nanocarreadores sintéticos proporcionados aqui, neste requeri- mento de patente, e qualquer um dos agentes anti-IgM proporcionados aqui, neste requerimento de patente.

[0019] Em outro aspecto, é proporcionado um kit compreendendo qualquer uma das composições ou combinações de composições pro- porcionadas aqui, neste requerimento de patente. Em uma modalida- de de qualquer um dos kits proporcionados, o kit adicionalmente com- preende instruções para uso. Em uma modalidade de qualquer um dos kits proporcionados, as instruções para uso compreendem instru- ções para a realização de qualquer um dos métodos proporcionados aqui, neste requerimento de patente.

[0020] Em outro aspecto, é proporcionado um método ou compo- sição conforme descrito em qualquer um dos Exemplos.

[0021] Em outro aspecto, qualquer uma das composições é para uso em qualquer um dos métodos proporcionados.

[0022] Em outro aspecto, qualquer um dos métodos ou composi- ções é para uso no tratamento de qualquer uma das doenças ou con- dições descritas aqui, neste requerimento de patente. Em outro as- pecto, qualquer um dos métodos ou composições é para uso na ate- nuação de uma resposta antivetor de transferência viral (por exemplo, uma resposta de IgM), no estabelecimento de uma resposta antivetor de transferência viral atenuada (por exemplo, uma resposta de IgM), na intensificação da expressão transgênica e/ou para administração repetida de um vetor de transferência viral.

[0023] Em outro aspecto, é proporcionado um método de adminis- tração de qualquer combinação dos agentes dos Exemplos. Em outro aspecto, também é proporcionada uma composição ou kit compreen- dendo qualquer uma destas combinações de agentes.

[0024] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits, o método, composição ou kit é para a atenuação de uma resposta de IgM além de outra resposta imune, tal como uma resposta de IgG, uma resposta imune humoral ou celular.

[0025] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits, o método, composição ou kit é para a atenuação de uma resposta de IgM além de aumentar a expressão transgênica.

[0026] Em uma modalidade de qualquer um dos métodos, compo- sições ou kits, o método, composição ou kit é para a atenuação de uma resposta de IgM além de outra resposta imune, tal como uma resposta de IgG, uma resposta imune humoral ou celular, bem como para aumentar a expressão transgênica.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS

[0027] A Fig. 1 mostra os níveis séricos de IgM anti-AAV em ca- mundongos 5, 9, 12, 16, e 21 dias depois da administração do trata- mento indicado (vetor viral adenoassociado codificando fosfatase alca- lina secretada (AAV-SEAP) isolado, em combinação com nanocarrea-

dores sintéticos compreendendo rapamicina (AAV-SEAP + SVP[RAPA]), ou em combinação com anti-BAFF (AAV-SEAP + SVP[RAPA] + anti-BAFF)). Cada grupo de tratamento continha seis camundongos.

[0028] A Fig. 2 mostra o nível de expressão de SEAP, medido usando quimiluminescência, 5, 9, 12, e 16 dias depois da administra- ção de tratamento dos mesmos camundongos conforme descrito na Fig. 1.

[0029] A Fig. 3 mostra que tanto BAFF quanto APRIL suportam a sobrevida e a diferenciação de células B. Foram usados anticorpo para BAFF ou um duplo inibidor de BAFF / APRIL TACI-Fc (fusão Fc intera- gente com ativador transmembrana e ligante modulador de cálcio). O layout deste estudo se refere aos dados apresentados nas Figuras 1, 2, 4 a 10, e 15 a 17.

[0030] As Figuras 4A a 4B mostram os níveis típicos de IgG e sua supressão completa por SVP[Rapa] (Fig. 4B); a inibição de BAFF pa- rece ter um efeito adicional de diminuição da resposta de IgM (Fig. 4A).

[0031] A Fig. 5 mostra os níveis de IgG e sua supressão precoce completa por SVP[Rapa] seguida por 1/6 de avanço pós reforço. Não houve avanços em grupos tratados com aBAFF ou TACI-Fc 18 dias pós reforço (mostrado por setas).

[0032] As Figuras 6A a 6D mostram a inibição de IgM em grupos tratados com [Rapa] e com [Rapa]+TACI-Fc; mais pronunciada em camundongos tratados com [Rapa]+BAFF.

[0033] A Fig. 7 mostra a dinâmica da IgM pós reforço no grupo não tratado (vista elevação pós-reforço) e no grupo tratado com SVP[Rapa] (altos níveis pós reforço em um camundongo de 1/6 avan- ço); a inicição de BAFF parece ter um efeito adicional na diminuição da resposta de IgM; Fc-TACI não acrescenta muito ao tratamento com

SVP[Rapa] no auge, mas proporciona benefício pós reforço adicional.

[0034] A Fig. 8 mostra a elevação de SEAP por [Rapa]; adicional- mente reforçada na presença de anti-BAFF.

[0035] As Figuras 9A a 9D mostram efeitos significativos e consis- tentes de um combo de [Rapa] e anti-BAFF para elevação da expres- são transgênica (SEAP).

[0036] A Fig. 10 proporciona dados a partir de d21/28 pré reforço e em seguida por até 14 dias depois de reforço em d37. Um combo de [Rapa] e anti-BAFF proporciona um efeito significativo e consistente para elevação da expressão transgênica.

[0037] A Fig. 11 mostra o layout para outro experimento. O layout deste estudo se refere aos dados apresentados nas Figuras 12 a 14 e 18 a 20.

[0038] As Figs. 12A a 12B mostram a dinâmica precoce da IgM e da IgG para a supressão de IgM.

[0039] A Fig. 13 demonstra a sinergia com anti-BAFF e [Rapa] pa- ra a supressão de IgM.

[0040] A Fig. 14 mostra os níveis de SEAP e o reforço por [Rapa].

[0041] A Fig. 15 mostra os níveis de IgM contra AAV em camun- dongos tratados com AAV-SEAP isolado, com AAV-SEAP + SVP[RAPA], ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA] + anti-BAFF nos dias 0, 37 e 155.

[0042] A Fig. 16 mostra os níveis de IgG contra AAV em camun- dongos tratados com AAV-SEAP isolado, com AAV-SEAP + SVP[RAPA], ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA] + anti-BAFF nos dias 0, 37 e 155.

[0043] A Fig. 17 mostra os níveis de SEAP em camundongos tra- tados com AAV-SEAP isolado, com AAV-SEAP + SVP[RAPA], ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA] + anti-BAFF nos dias 0, 37 e 155.

[0044] As Figuras 18A a 18C mostram os níveis de SEAP, de

IgM, e de IgG em camundongos tratados com AAV-SEAP isolado, com AAV-SEAP + SVP[RAPA], com AAV-SEAP + anti-BAFF, ou com AAV- SEAP + SVP[RAPA] + anti-BAFF nos dias 0, 32 e 98. A Fig. 18A mostra os níveis de SEAP. Fig. 18B mostra os níveis de IgM. A Fig. 18C mostra os níveis de IgG.

[0045] As Figuras 19A a 19F mostram os níveis de SEAP, de IgM, e de IgG em camundongos tratados com AAV-SEAP isolado, com AAV-SEAP + SVP[RAPA] (50 ou 150 µg), ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA] nos dias 0, 32, 98, e 160 com ou sem anti-BAFF quer so- mente no dia de injeção ou também administrado em 14 dias depois da 1ª, da 3ª e da 4ª administrações de AAV. As Figuras 19A e 19B mostram os níveis de SEAP a 50 µg (Fig. 19A) ou a 150 µg (Fig. 19B) de rapamicina. As Figuras 19C e 19E mostram os níveis de IgM. As Figuras 19D e 19F mostram os níveis de IgG.

[0046] As Figuras 20A e 20B mostram a correlação entre os ní- veis de SEAP e de IgM iniciais em d11 em camundongos tratados com AAV-SEAP + SVP[RAPA], ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA] + anti- BAFF nos dias 0, 32, 98, e 160.

[0047] As Figuras 21A a 21F mostram a proporção de diferentes populações de células B em camundongos tratados ou com AAV- SEAP isolado, ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA], ou com AAV-SEAP + anti-BAFF, ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA] + anti-BAFF (B, D, F), ou os tratamentos sem AAV, isto é, com SVP[RAPA], com anti-BAFF, ou com SVP[RAPA] + anti-BAFF (A, C, E).

[0048] As Figuras 22A a 22F mostram os níveis de IgM em ca- mundongos tratados com AAV-SEAP isolado, com AAV-SEAP + SVP[RAPA], ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA] + ibritinub.

[0049] As Figuras 23A a 23B mostram SEAP e sua correlação com os níveis de IgM em camundongos tratados com AAV-SEAP iso- lado, com AAV-SEAP + SVP[RAPA], ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA]

+ ibritinub. Os níveis de SEAP são mostrados na Fig. 23A. A correla- ção dos níveis de IgM iniciais do dia 6 e os níveis de tardios de SEAP (d104/111) é mostrada na Fig. 23B.

[0050] As Figuras 24A a 24B mostram os níveis de IgM e de IgG em camundongos tratados com AAV-SEAP isolado, com AAV-SEAP + SVP[RAPA], com AAV-SEAP + ibritinub, ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA] + ibritinub. Os níveis de IgM são mostrados na Fig. 24A. Os níveis de IgG são mostrados na Fig. 24B.

[0051] A Fig. 25 mostra os níveis de SEAP em camundongos tra- tados com AAV-SEAP isolado, com AAV-SEAP + SVP[RAPA], com AAV-SEAP + ibritinub, ou com AAV-SEAP + SVP[RAPA] + ibritinub.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[0052] Antes de descrever a presente invenção em detalhes, deve ser entendido que esta invenção não é limitada a materiais ou parâme- tros do processo particularmente exemplificados uma vez que este, logicamente, podem variar. Também deve ser entendido que a termi- nologia usada aqui, neste requerimento de patente, é para o fim de descrever modalidades particulares da invenção somente, e não se destina a ser limitante do uso de terminologia alternativa para descre- ver a presente invenção.

[0053] Todas as publicações, patentes e os requerimentos de pa- tente citados aqui, neste requerimento de patente, seja acima ou abai- xo, são por este incorporados por meio de referência em sua totalida- de para todos os tins. A referida incorporação por meio de referência não se destina a ser uma admissão de que quaisquer das publicações, patentes e requerimentos de patente incorporados citados aqui, neste requerimento de patente, constituem técnica anterior.

[0054] Conforme usado nesta especificação e nas reivindicações anexadas, as formas do singular "um," "uma" e "o", "a" incluem refe- rentes no plural a menos que o conteúdo claramente dite de modo di-

verso. Por exemplo, referência a "um polímero" inclui uma mistura de duas ou mais das referidas moléculas ou uma mistura de pesos mole- culares diferentes de uma única espécie de polímero, referência a "um nanocarreador sintético" inclui uma mistura de dois ou mais dos referi- dos nanocarreadores sintéticos ou uma pluralidade de semelhantes nanocarreadores sintéticos, referência a "uma molécula de DNA" inclui uma mistura de duas ou mais das referidas moléculas de DNA ou uma pluralidade de semelhantes moléculas de DNA, referência a "um imu- nossupressor" inclui uma mistura de duas ou mais das referidas molé- culas de imunossupressores ou uma pluralidade de semelhantes mo- léculas de imunossupressores, e semelhantes.

[0055] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "compreendem" ou variações do mesmo tais como "compreen- de" ou "compreendendo" devem ser lidos para indicar a inclusão de qualquer inteiro mencionado (por exemplo, um aspecto, elemento, ca- racterística, propriedade, etapa do método / processo ou limitação) ou grupo de inteiros (por exemplo, aspectos, elementos, características, propriedades, etapas do método / processo ou limitações) mas não a exclusão de qualquer outro inteiro ou grupo de inteiros. Portanto, con- forme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "compreen- dendo" é inclusivo e não exclui inteiros ou etapas do método / proces- so adicionais não mencionados.

[0056] Em modalidades de quaisquer das composições e métodos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, "compreenden- do" pode ser substituído com "consistindo essencialmente em" ou "consistindo em". A expressão "consistindo essencialmente em" é usado aqui, neste requerimento de patente, para requerer o um ou mais inteiros ou etapas especificadas bem como aqueles os quais não afetam materialmente o caráter ou a função da invenção reivindicada. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, o termo "consis-

tindo" é usado para indicar a presença do inteiro mencionado (por exemplo, um aspecto, elemento, característica, propriedade, etapas do método / processo ou limitação) ou grupo de inteiros (por exemplo, as- pectos, elementos, características, propriedades, etapas do método / processo ou limitações) isolado. A. INTRODUÇÃO

[0057] Vetores de transferência viral são terapêuticos promissores para uma variedade de aplicações, tais como terapia genética, edição genética, modulação da expressão genética e salto de éxon (exon skipping). Os vetores de transferência viral, portanto, podem compre- ender transgenes que codifiquem proteínas ou ácidos nucleicos tera- pêuticos. Infelizmente, a promessa destes terapêuticos ainda não foi totalmente realizada em uma grande parte devido a respostas imunes contra o vetor de transferência viral. Estas respostas imunes incluem respostas de anticorpos, de células B e de células T e podem ser es- pecíficas para antígenos virais do vetor de transferência viral, tais co- mo as proteínas ou peptídeos do capsídeo viral ou do revestimento viral dos mesmos.

[0058] Surpreendentemente, foi visto que o AAV induz uma produ- ção de anticorpos extremamente forte e rápida tanto de IgM quanto de IgG, das quais a última é significativamene bloqueada e a primeira é retardadaa por nanocarreadores sintéticos compreendendo rapamici- na. Além disso, surpreendentemente, o tratamento com um vetor de transferência viral em combinação com nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor e um agente que suprime a res- posta de IgM, por exemplo, um agente anti-IgM, tal como um anticorpo monoclonal anti-BAFF, pode ter um efeito sinérgico sobre as respostas imunes, tais como respostas de IgM, e também resulta em um aumen- to substancial na expressão transgênica depois da primeira adminis- tração de um vetor de transferência viral.

[0059] São proporcionados métodos e composições que oferecem soluções para obstáculos para o uso eficaz de vetores de transferência viral para tratamento. Em particular, inesperadamente foi descoberto que respostas imunes de IgM antivetor de transferência viral isoladas ou em combinação com outras respostas imunes podem ser atenua- das com os métodos e composições relacionadas proporcionados aqui, neste requerimento de patente. Os métodos e composições po- dem aumentar a eficácia do tratamento com vetores de transferência viral e proporcionar atenuação imune, mesmo se a administração do vetor de transferência viral precisar ser repetida.

[0060] A invenção agora será descrita abaixo em mais detalhes. B. DEFINIÇÕES

[0061] "Administrando" ou "administração" ou "administrar" signifi- ca dar ou dispensar um material a um sujeito em uma maneira que se- ja farmacologicamente útil. O termo se destina a incluir "fazer com que seja administrado". "Fazer com que seja administrado" significa moti- var, instar, encorajar, auxiliar, induzir ou orientar, diretamente ou indi- retamente, outra parte a administrar o material. Qualquer um dos mé- todos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, pode com- preender ou compreender adicionalmente uma etapa de administração concomitantemente de um vetor de transferência viral, nanocarreado- res sintéticos compreendendo um imunossupressor e um agente anti- IgM. Em algumas modalidades, a administração concomitante é reali- zada repetidamente. Em ainda modalidades adicionais, a administra- ção concomitante é administração simultânea.

[0062] "Quantidade eficaz" no contexto de uma composição ou forma de dosagem para administração a um sujeito conforme propor- cionado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma quanti- dade da composição ou forma de dosagem que produz um ou mais resultados desejados no sujeito, por exemplo, a redução ou eliminação de uma resposta imune, tal como uma resposta de IgM, contra um ve- tor de transferência viral ou a produção de uma resposta atenuada an- tivetor de transferência viral. A quantidade eficaz pode ser para fins in vitro ou in vivo. Para fins in vivo, a quantidade pode ser uma quanti- dade que um clínico acreditaria ter um benefício clínico para um sujeito que possa experimenta respostas imunes indesejadas em consequên- cia da administração de um vetor de transferência viral. Em qualquer um dos métodos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, a uma ou mais composições administradas podem estar em qualquer uma das quantidades eficazes conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente.

[0063] Quantidades eficazes podem envolver a redução do nível de uma resposta imune indesejada, embora, em algumas modalida- des, envolva a prevenção de uma resposta imune indesejada de modo geral. Quantidades eficazes também podem envolver retardar a ocor- rência de uma resposta imune indesejada. Uma quantidade eficaz também pode ser uma quantidade que resulte em um desfecho tera- pêutico desejado ou em um resultado terapêutico desejado. Quanti- dades eficazes, de maneira preferencial, resultam em uma resposta imune tolerogênica em um sujeito para um antígeno, tal como um antí- geno de vetor de transferência viral. Quantidades eficazes também podem resultar de maneira preferencial em aumento da expressão transgênica (um transgene sendo liberado pelo vetor de transferência viral). Isto pode ser determinado medindo a expressão transgênica em vários tecidos ou sistemas de interesse no sujeito. Esta expressão aumentada pode ser medida localmente ou sistemicamente. A reali- zação de qualquer um dos precedentes pode ser monitorada por mé- todos de rotina.

[0064] Em algumas modalidades de qualquer uma das composi- ções e métodos proporcionados, a quantidade eficaz é uma quantida-

de na qual a resposta imune desejada, tal como a redução ou elimina- ção de uma resposta imune contra um vetor de transferência viral ou a produção de uma resposta atenuada antivetor de transferência viral, persiste no sujeito por no mínimo 1 semana, no mínimo 2 semanas ou no mínimo 1 mês. Em outras modalidades de qualquer uma das com- posições e métodos proporcionados, a quantidade eficaz é uma quan- tidade a qual produz uma resposta imune desejada mensurável, tal como a redução ou eliminação de uma resposta imune contra um vetor de transferência viral ou a produção de uma resposta atenuada antive- tor de transferência viral. Em algumas modalidades, a quantidade efi- caz é uma quantidade que produz uma resposta imune desejada men- surável (por exemplo, para um antígeno de vetor de transferência viral específico), por no mínimo 1 semana, no mínimo 2 semanas ou no mí- nimo 1 mês.

[0065] As quantidades eficazes vão depender, logicamente, do sujeito em particular que estiver sendo tratado; da gravidade de uma condição, doença ou distúrbio; dos parâmetros do paciente individual incluindo a idade, a condição física, o tamanho e o peso; da duração do tratamento; da natureza da terapia concomitante (se houver); da via de administração específica e de fatores semelhantes dentro do co- nhecimento e da perícia do profissional de saúde. Estes fatores são de conhecimento geral das pessoas com conhecimento regular na técnica e podem ser abordados com não mais do que experimentação de rotina.

[0066] "Agente anti-BAFF" se refere a qualquer agente, moléculas pequenas, anticorpos, peptídeos, ou ácidos nucleicos, que se saiba que reduz a produção, ou os níveis, ou a atividade de BAFF. Em al- gumas modalidades, um agente anti-BAFF é um anticorpo anti-BAFF. Exemplos de agentes anti-BAFF incluem, mas não estão limitados a, TACI-Ig e receptor de BAFF solúvel.

[0067] "Anticorpo anti-BAFF" se refere a qualquer anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo BAFF. Por exemplo, o anticor- po anti-BAFF pode ser um anticorpo monoclonal, tal como Belimumab (Benlysta). Em alguns casos, o anticorpo anti-BAFF pode suprimir a bioatividade de BAFF. Alternativamente, ou além disso, um anticorpo anti-BAFF pode bloquear a interação entre BAFF e seus receptores, tal como BAFF-R e BCMA (antígeno de maturação de céluals B). Em algumas modalidades, é usado um anticorpo intacto inteiro. Em algu- mas modalidades, ao invés disso é usado um fragmento de ligação ao antígeno do anticorpo anti-BAFF.

[0068] "Agente anti-IgM" se refere a qualquer agente, incluindo, mas não limitadas a, moléculas pequenas, anticorpos, peptídeos, ou ácidos nucleicos, que se saiba que reduz a produção, ou os níveis de, IgM, por exemplo, anticorpos contra IgM. Será reconhecido pelos es- pecialistas na técnica que as células B geram anticorpos. Portanto, em algumas modalidades, um agente anti-IgM é qualquer agente que se saiba que modula ou suprime os níveis de células B. Em algumas modalidades, um agente anti-IgM é qualquer agente que se saiba que modula ou suprime a maturação de células B. Em algumas modali- dades, um agente anti-IgM é qualquer agente que se saiba que modu- la ou suprime a ativação de células B. Em algumas modalidades, um agente anti-IgM é qualquer agente que se saiba que modula ou supri- me a ativação de células B independente de células T.

[0069] Agentes anti-IgM incluem, mas não estão limitados a, anti- corpos antagonistas de IgM ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a CD10, CD19, CD20, CD22, CD27, CD34, CD40, CD79a, CD79b, CD123, CD179b, FLT-3, ROR1, BR3, BAFF, ou B7RP-1; agentes de modulação de IL21, por exemplo, IL-21 e antagonistas de IL-21; inibidores da tirosina quinase, por exemplo, inibidores da Syk, inibidores da BTK, inibidores da tirosina quinase da proteína SRC; inibidores da PI3K; inibidores da PKC; anta- gonistas do APRIL, por exemplo, TACI-Ig; mizoribina; tofacitinib; e te- traciclinas.

[0070] "Anticorpos antagonistas de IgM" incluem, mas não estão limitados a, anticorpos que se sabe que reduzem a produção, ou os níveis de, IgM, por exemplo, anticorpos contra IgM. Em algumas mo- dalidades, um anticorpo antagonista de IgM se liga a e inibe a ativida- de de uma proteína ou de um peptídeo envolvido na produção de, IgM, por exemplo, anticorpos contra IgM, ou na modulação ou na via de es- timulação imune que leva à produção de , IgM, por exemplo, anticor- pos contra IgM.

[0071] Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista de IgM é qualquer anticorpo que se sabe que modula os níveis de células B. Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista de IgM é qual- quer anticorpo que se sabe que modula a maturação de células B. Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista de IgM é qual- quer anticorpo que se sabe que modula a ativação de células B. Em algumas modalidades, um anticorpo antagonista de IgM é qualquer anticorpo que se sabe que modula ou suprime a ativação de células B independente de de células T.

[0072] Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, composições ou kits proporcionados aqui, neste requerimento de pa- tente, um fragmento do anticorpo de ligação ao antígeno pode ser usado ao invés do anticorpo.

[0073] Anticorpos antagonistas de IgM ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a CD10, CD19, CD20, CD22, CD27, CD34, CD40, CD79a, CD79b, CD123, CD179b, FLT-3, ROR1, BR3, BAFF, ou B7RP-1 são exemplos de agentes anti-IgM que podem ser usados em qualquer um dos méto- dos, composições ou kits proporcionados aqui, neste requerimento de patente. Deste modo, os agentes referidos também podem ser anti- corpos ou agentes de ligação ao antígeno para marcadores de células B ou outras moléculas que se ligam especificamente a semelhantes marcadores.

[0074] "Antagciclina" incluem, mas não estão limitados a, qualquer molécula que reduz ou inibe a função ou a produção do APRIL. Um ligante indutor de proliferação (APRIL), também conhecido como membro 13 da superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral (TNFSF13), é uma proteína da superfamília TNF reconhecida pelo re- ceptor da superfície celular TACI. APRIL é um ligante para TNFRSF17/BCMA, um membro da família de receptores de TNF. Esta proteína e seu receptor são ambos considerados importantes para o desenvolvimento de células B. Antagonistas do APRIL incluem inibi- dores de molécula pequena do APRIL, anticorpos para APRIL, e oli- gômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da APRIL. Exemplos de inibidores do APRIL incluem, mas não estão limi- tados a, BION-1301 (Aduro Biotech, Inc.). Em algumas modalidades, um antagonista do APRIL é TACI-Ig. TACI-Ig é uma proteína de fusão recombinante que combina os sítios de ligação de BLyS e APRIL com a região constante da imunoglobina.

[0075] "Inibidores da tirosina quinase de Bruton (BTK)" incluem, mas não estão limitados a, qualquer molécula que reduz ou inibe a função ou a produção de um membro da família de tirosina quinases BTK. Um inibidor da BTK funciona inibindo a enzima tirosina-proteína quinase BTK, a qual tem um papel importante no desenvolvimento de células B. Os inibidores da BTK incluem inibidor de molécula pequena da BTK, anticorpos para BTK, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da BTK. Exemplos de inibidores da BTK incluem, mas não estão limitados a, AVL-292, CC-292, ONO- 4059, ACP-196, PCI-32765, Acalabrutinib, GS-4059, spebrutinib, BGB-

3111, e HM71224.

[0076] "Agentes moduladores de IL-21" incluem, mas não estão limitados a, qualquer molécula que reduz ou inibe a função ou a pro- dução de IL-21 ou do receptor de IL-21. A interleucina-21 é uma cito- kina que tem potentes efeitos reguladores sobres as células dos sis- temas imune, incluindo células natural assassinas (NK) e celulas T ci- totóxicas que podem destruir células cancerosas ou infectadas por ví- rus. Foi reportado que IL-21 contribui para o mecanismo pelo qual cé- lulas T helper CD4+ orquestram a resposta do sistema imune a infec- ções virais. Em algumas modalidades, um agente modulador de IL21 é um antagonista de IL-21. Antagonistas de IL-21 incluem inibidores de molécula pequena da IL-21, anticorpos para IL-21, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da IL-21. Exemplos de inibidores de IL-21 incluem, mas não estão limitados a, NNC0114 (NovoNordisk). Em algumas modalidades, e agente modu- lador de IL-21 é um antagonista de receptor de IL-21. Antagonistas de IL-21 incluem inibidores de molécula pequena do receptor de IL-21, anticorpos para o receptor de IL-21, e oligômeros antisense e inibido- res de RNAi que reduzem a expressão do receptor de IL-21. Exem- plos de inibidores do receptor de IL-21 incluem, mas não estão limita- dos a, ATR-107(Pfizer).

[0077] "Inibidores da PI3K" incluem, mas não estão limitados a, qualquer molécula que reduz ou inibe a função ou a produção de um membro da família de quinases PI3K. PI3 quinases incluem, mas não estão limitadas a, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CG, PIK3CD, PIK3R1, PIK3R2, PIK3R3, PIK3R4, PIK3R5, PIK3R6, PIK3C2A, PIK3C2B, PIK3C2G, e PIK3C3. Os inibidores da PI3K incluem inibidores de mo- lécula pequena da PI3K, anticorpos para PI3K, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da PI3K. Exemplos de inibidores da PI3K incluem, mas não estão limitados a, GS-1101, idela-

lisib, duvelisib, TGR-1202, AMG-319, copanlisib, vortmanina, LY294002, IC486068 e IC87114 (ICOS Corporation), e GDC-0941.

[0078] "Inibidores da PKC" incluem, mas não estão limitados a, qualquer molécula que reduz ou inibe a função ou a produção de um membro da família de quinases PKC. A Proteína Quinase C é uma família de enzimas proteína quinases que estão envolvidas no controle da função de outras proteínas através da fosforilação de grupos de oxidrila dos resíduos de aminoácidos serina e treonina sobre estas proteínas, ou um membro desta família. Enzimas PKC incluem, mas não estão limitadas a, PKC-α (PRKCA), PKC-β1 (PRKCB), PKC-β2 (PRKCB), PKC-γ (PRKCG), PKC-δ (PRKCD), PKC-ε (PRKCE), PKC-η (PRKCH), PKC-θ (PRKCQ), e PKC-ι (PRKCI), PKC-ζ (PRKCZ). Inibi- dores da PKC incluem inibidores de molécula pequena da PKC, anti- corpos para PKC, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da PKC. Exemplos de inibidores da PKC inclu- em, mas não estão limitados a, enzastaurina, ruboxistaurina, celeritri- na, miyabenol C, miricitrina, gossipol, verbascosídeo, BIM-1, e briosta- tina 1.

[0079] "Inibidores da tirosina quinase da proteína SRC" incluem, mas não estão limitados a, qualquer molécula que reduz ou inibe a função ou a produção de um membro da família de quinases SRC. Os inibidores da SRC incluem inibidores de molécula pequena da SRC, anticorpos para SRC, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da SRC. Exemplos de inibidores da Syk inclu- em, mas não estão limitados a, dasatinib.

[0080] "Inibidores da Syk" incluem, mas não estão limitados a, qualquer molécula que reduz ou inibe a função ou a produção de um membro da família de tirosina quinases Syk. Syk está envolvida na transmissão de sinais do receptor de células B e do receptor de célu- las T. Os inibidores da Syk incluem inibidores de molécula pequena da Syk, anticorpos para Syk, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da Syk. Exemplos de inibidores da Syk incluem, mas não estão limitados a, fostamatinib (R788), entosple- tinib (GS-9973), cerdulatinib (PRT062070), e TAK-659, entospletinib, e nilvadipina.

[0081] "Tetraciclinas" são um grupo de compostos antibióticos de amplo espectro que têm uma estrutura básica comum e podem ser isoladas diretamente a partir de várias espécies de bactérias Strep- tomyces ou produzidos no mínimo de maneira semi-sintética. Exem- plos de tetraciclinas incluem, mas não estão limitados a, clortetracicli- na, oxitetraciclina, demetilclortetraciclina, rolitetraciclina, limeciclina, clomociclina, metaciclina, doxiciclina, minociclina, e terc- butilglicilamidominociclina.

[0082] "Inibidores da tirosina quinase" incluem, mas não estão limitados a, qualquer molécula que reduz ou inibe a função ou a pro- dução de uma ou mais tirosina quinases. Inibidores da tirosina qui- nase include inibidores de molécula pequena da tirosina quinases, an- ticorpos para tirosina quinases, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da tirosina quinases. Exemplos de inibidores da tirosina quinase incluem inibidores da Syk, inibidores da BTK, e inibidores da tirosina quinase da proteína SRC. "Resposta imu- ne antivetor de transferência viral" ou "resposta imune contra um vetor de transferência viral" ou semelhantes se refere a qualquer resposta imune indesejada, tal como uma resposta de IgM, contra um vetor de transferência viral. Em algumas modalidades, a resposta imune inde- sejada é uma resposta imune antígeno-específica contra o vetor de transferência viral ou um antígeno do mesmo. Em algumas modalida- des, a resposta imune é específica para um antígeno viral do vetor de transferência viral.

[0083] Diz-se que uma resposta imune antivetor de transferência viral é uma "resposta atenuada antivetor de transferência viral" quando é em alguma maneira reduzida ou eliminada no sujeito ou em compa- ração com uma resposta esperada ou medida no sujeito ou em outro sujeito. Em algumas modalidades, a resposta atenuada antivetor de transferência viral em um sujeito compreende uma resposta imune an- tivetor de transferência viral reduzida (tal como uma resposta de anti- corpo IgM) medida usando uma amostra biológica obtida do sujeito depois de uma administração concomitante conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, em comparação com uma res- posta imune antivetor de transferência viral medida usando uma amos- tra biológica obtida de outro sujeito, tal como um sujeito de teste, de- pois da administração a este outro sujeito do vetor de transferência viral sem administração concomitante dos nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor e 1um agente anti-IgM. Em al- gumas modalidades, a resposta atenuada antivetor de transferência viral é uma resposta imune antivetor de transferência viral reduzida (tal como uma resposta de anticorpo IgM) em uma amostra biológica obti- da do sujeito depois de uma administração concomitante conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, depois de um es- tímulo in vitro com vetor de transferência viral subsequente realizado sobre a amostra biológica do sujeito comparada com a resposta imune antivetor de transferência viral detectada depois de estímulo in vitro com vetor de transferência viral realizado sobre uma amostra biológica obtida de outro sujeito, tal como um sujeito de teste, depois da admi- nistração a este sujeito do vetor de transferência viral sem administra- ção concomitante de nanocarreadores sintéticos compreendendo imu- nossupressor e um agente anti-IgM.

[0084] "Antígeno" significa um antígeno de célula B ou um antíge- no de célula T. "Tipo(s) de antígenos" significa moléculas que parti- lham as mesmas, ou substancialmente as mesmas, características an-

tigênicas. Em algumas modalidades, antígenos podem ser proteínas, polipeptídeos, peptídeos, lipoproteínas, glicolipídeos, polinucleotídeos, polissacarídeos, etc.

[0085] "Anexar" ou "Anexada" ou "Acoplar" ou "Acoplada" (e se- melhantes) significa associar quimicamente uma entidade (por exem- plo, uma porção) com outra. Em algumas modalidades, a anexação é covalente, significando que a anexação ocorre no contexto da presen- ça de uma ligação covalente entre as duas entidades. Em modalida- des não covalentes, a anexação não covalente é mediada por intera- ções não covalentes incluindo, mas não limitadas a, interações de car- gas, interações por afinidade, coordenação de metais, adsorção física, interações parasita-hospedeiro, interações hidrofóbicas, Interações de empilhamento TT, interações de ligação de hidrogênio, interações de van der Waals, interações magnéticas, interações eletrostáticas, inte- rações dipolo-dipolo, e/ou combinações das mesmas. Em modalida- des, encapsulação é uma forma de anexação.

[0086] "Média", conforme usado aqui, neste requerimento de pa- tente, se refere à média aritmética a menos que mencionado de modo diverso.

[0087] "Concomitantemente" significa administrar dois ou mais ma- teriais / agentes a um sujeito em uma maneira que seja correlacionada no tempo, de maneira preferencial suficientemente correlacionada no tempo de modo a proporcionar uma modulação em uma resposta imu- ne, e de maneira ainda mais preferencial os dois ou mais materiais / agentes são administrados em combinação. Em modalidades, admi- nistração concomitante pode englobar a administração de dois ou mais materiais / agentes dentro de um período de tempo especificado, de maneira preferencial dentro de 1 mês, de maneira mais preferencial dentro de 1 semana, de maneira ainda mais preferencial dentro de 1 dia, e de maneira ainda mais preferencial dentro de 1 hora. Em moda-

lidades, os materiais / agentes podem ser administrados repetidamen- te concomitantemente; isto é, administração concomitante em mais de uma ocasião.

[0088] "Forma de dosagem" significa um material farmacologica- mente e/ou imunologicamente ativo em um meio, carregador, veículo, ou dispositivo adequado para administração a um sujeito. Qualquer uma das composições ou doses proporcionadas aqui, neste requeri- mento de patente, pode estar em uma forma de dosagem.

[0089] "Encapsular" significa encerrar no mínimo uma porção de uma substância dentro de um nanocarreador sintético. Em algumas modalidades, uma substância é encerrada completamente dentro de um nanocarreador sintético. Em outras modalidades, a maior parte ou toda uma substância que é encapsulada não é exposta ao ambiente local externo ao nanocarreador sintético. Em outras modalidades, não mais de 50%, 40%, 30%, 20%, 10% ou 5% (em peso / peso) é exposto ao ambiente local. Encapsulação é distinta de absorção, a qual coloca a maior parte ou toda de uma substância sobre uma superfície de um nanocarreador sintético, e deixa a substância exposta ao ambiente lo- cal externo ao nanocarreador sintético.

[0090] "Intensificação da expressão transgênica" se refere a au- mentar o nível de um produto de expressão transgênica de um vetor de transferência viral em um sujeito, o transgene sendo liberado pelo vetor de transferência viral. Em algumas modalidades, o nível do pro- duto de expressão transgênica pode ser determinado medindo a ex- pressão transgênica em vários tecidos ou sistemas de interesse no sujeito. Em algumas modalidades, o produto de expressão transgêni- ca é uma proteína. Em outras modalidades, o produto de expressão transgênica é um ácido nucléico. A intensificação da expressão trans- gênica pode ser determinada, por exemplo, medindo a quantidade do produto de expressão transgênica em uma amostra obtida de um su-

jeito e comparando a mesma com uma amostra anterior. A amostra pode ser uma amostra de tecido. Em algumas modalidades, o produto de expressão transgênica pode ser medido usando citometria de fluxo.

[0091] "Transgene de salto de éxon" significa qualquer ácido nu- cleico que codifique um oligonucleotídeo antisense ou outro agente que possa gerar salto de éxon. "Salto de éxon" se refere a um éxon que é pulado e removido no nível pré-mRNA durante a produção de proteínas. Oligonucleotídeos antisenses podem interferir com sítios de emenda ou elementos reguladores dentro de um éxon. Isto pode levar a proteína truncada e parcialmente funcional, apesar da presença de uma mutação genética. De modo geral, os oligonucleotídeos antisen- ses podem ser mutação-específicos e se ligar a um sítio de mutação no RNA pré-mensageiro de modo a induzir salto de éxon.

[0092] O sujeito pode ser um sujeito que tenha uma doença ou um distúrbio no qual o pulo de éxon seria um benefício. O sujeito pode ter qualquer uma das doenças ou distúrbios proporcionados aqui, neste requerimento de patente, nos quais a geração de salto de éxon seria um benefício, tal como uma distrofia. Além disso, o transgene de salto de éxon pode codificar um agente que possar gerar salto de éxon du- rante a expressão de qualquer proteína endógena para a qual o resul- tado do salto de éxon iria conferir um benefício. Exemplos de seme- lhantes proteínas são as proteínas associadas com as doenças ou os distúrbios proporcionados aqui, neste requerimento de patente, tais como quaisquer das distrofias proporcionadas aqui, neste requerimen- to de patente. As proteínas também podem ser a versão endógena de qualquer uma das proteínas terapêuticas proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, em algumas modalidades.

[0093] "Transgene de edição genética" significa qualquer ácido nucleico que codifique um agente ou componente que seja envolvido em um processo de edição genética. "Edição genética" de modo geral se refere a modificações de longa duração ou permanentes para DNA genômico, tal como inserção, substituição, mutagênese ou remoção de DNA direcionada. A edição genética pode visar sequências de DNA que codifiquem parte ou toda de uma proteína expressa ou sequências de DNA alvo não codificantes que afetam a expressão de um ou mais genes alvo. Edição genética pode incluir a liberação de ácidos nuclei- cos codificando uma sequência de DNA de interesse e a inserção da sequência de interesse em um sítio visado em DNA genômico usando endonucleases. As endonucleases podem criar quebras em DNA de cadeia dupla em localizações desejadas no genoma e usar os meca- nismos das células hospedeiras para reparar a quebra usando recom- binação homóloga, junção de extremidades não homólogas, etc. Classes de endonucleases que podem ser usadas para edição genéti- ca incluem, mas não estão limitadas a, meganucleases, nucleases de dedo de zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativador de transcrição (TALENs), uma ou mais repetições palindrômicas curtas aglomeradas regularmente interespaçadas (CRISPR) e endonucleases homing.

[0094] O sujeito, conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, pode ser um sujeito com qualquer uma das doenças ou distúrbios conforme proporcionados aqui, neste requerimento de pa- tente, e o transgene é um transgene que codifique um agente de edi- ção genética que possa ser usado para corrigir um defeito em qual- quer uma das proteínas conforme proporcionado aqui, neste requeri- mento de patente, ou uma versão endógena das mesmas. Alternati- vamente, em algumas modalidades, um vetor de transferência viral de edição genética também pode incluir um transgene que codifique uma proteína terapêutica ou porção da mesma ou ácido nucleico conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente. Em algumas mo- dalidades, um vetor de transferência viral de edição genética pode ser administrado a um sujeito junto com um vetor de transferência viral com um transgene que codifique uma proteína terapêutica ou porção da mesma ou ácido nucleico proporcionado aqui, neste requerimento de patente.

[0095] "Transgene de modulação da expressão genética" se refere a qualquer ácido nucleico que codifique um modulador da expressão genética. "Modulador da expressão genética" se refere a uma molécu- la que pode reforçar, inibir ou modular a expressão de um ou mais ge- nes endógenos. Moduladores da expressão genética, portanto, inclu- em proteínas de ligação ao DNA (por exemplo, fatores de transcrição artificial) bem como moléculas que mediam a interferência do RNA. Moduladores da expressão genética incluem moléculas de RNAi (por exemplo, dsRNAs ou ssRNAs), miRNA, e oligonucleotídeos formado- res de triplex (TFOs). Moduladores da expressão genética também podem incluir RNAs modificados, incluindo versões modificadas de qualquer uma das moléculas de RNA precedentes.

[0096] O sujeito conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, pode ser um sujeito com qualquer uma das doenças ou distúrbios conforme proporcionados aqui, neste requerimento de pa- tente, e o transgene é um transgene que codifique um modulador da expressão genética que possa ser usado para controlar a expressão de qualquer uma das proteínas proporcionadas aqui, neste requeri- mento de patente. Em algumas modalidades, o sujeito tem uma doen- ça ou um distúrbio por meio do qual a versão endógena da proteína do sujeito é defeituosa ou produzida em quantidades limitadas ou não é produzida de modo algum, e o modulador da expressão genética pode controlar a expressão de uma proteína semelhante. Portanto, o modu- lador da expressão genética, em algumas modalidades, pode controlar a expressão de qualquer uma das proteínas conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, ou uma versão endógena da mesma (tal como uma versão endógena de uma proteína terapêutica conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente).

[0097] "Transgene de terapia genética" se refere a um ácido nu- cleico que codifique um produto de expressão tal como uma proteína ou um ácido nucleico e que, quando introduzido dentro de uma célula pode orientar a expressão da proteína ou do ácido nucleico. Quando uma proteína, a proteína pode ser uma proteína terapêutica. Em al- gumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, o sujeito ao qual o transgene de terapia genética é administrado op meio de um vetor de transferência viral tem uma doença ou um distúrbio por meio do qual a versão endógena da proteína do sujeito é defeituosa ou produ- zida em quantidades limitadas ou não é produzida de modo algum. Em algumas modalidades, a proteína codificada não tem nenhuma contraparte humana, mas é previsto que proporcione efeitos terapeuti- camente benéficos no tratamento de uma doença ou de um distúrbio.

[0098] "Imunossupressor" significa um composto que causa um efeito tolerogênico, de maneira preferencial através de seus efeitos sobre APCs. Um efeito tolerogênico de modo geral se refere à modu- lação pela APC ou outras células imunes sistemicamente e/ou local- mente, que reduz, inibe ou previne uma resposta imune indesejada para um antígeno em um modo durável. Em uma modalidade, o imu- nossupressor é um imunossupressor que faz com que uma APC esti- mule um fenótipo regulador em uma ou mais células efetoras imunes. Por exemplo, o fenótipo regulador pode ser caracterizado pela inibição da produção, indução, estimulação ou recrutamento de células B ou células T CD4+ específicas para o antígeno, a inibição da produção de anticorpos específicos para o antígeno, a produção, indução, estimula- ção ou recrutamento de células Treg (por exemplo, células Treg CD4+CD25highFoxP3+), etc. Isto pode ser o resultado da conversão de células B ou células T CD4+ para um fenótipo regulador. Isto tam- bém pode ser o resultado da indução de FoxP3 em outras células imunes, tais como células T CD8+, macrófagos e células iNKT. Em uma modalidade, o imunossupressor é um imunossupressor que afeta a resposta da APC depois de processar um antígeno. Em outra moda- lidade, o imunossupressor não é um imunossupressor que interfere com o processamento do antígeno. Em uma modalidade adicional, o imunossupressor não é uma molécula de sinalização apoptótica. Em outra modalidade, o imunossupressor não é um fosfolipídeo.

[0099] Em algumas modalidades, o imunossupressor é um ele- mento que está além do material que compõe a estrutura do nanocar- reador sintético. Por exemplo, em uma modalidade, onde o nanocar- reador sintético é composto de um ou mais polímeros, o imunossu- pressor é um composto que está em adição e, em algumas modalida- des, anexado a um ou mais polímeros. Como outro exemplo, em uma modalidade, onde o nanocarreador sintético é composto de um ou mais lipídeos, o imunossupressor está novamente em adição e, em algumas modalidades, anexado ao um ou mais lipídeos. Em outras modalidades, quando o material do nanocarreador sintético também resulta em um efeito tolerogênico, o imunossupressor é um elemento presente além do material do nanocarreador sintético que resulta em um efeito tolerogênico.

[00100] Imunossupressores incluem, mas não estão limitados a, estatinas; inibidores do mTOR, tais como rapamicina ou um análogo da rapamicina (isto é, rapálogo); agentes de sinalização de TGF-; agonistas de receptores de TGF-; inibidores da histona desacetilase, tais como Tricostatina A; corticosteróides; inibidores da função mito- condrial, tais como rotenona; inibidores de P38; inibidores de NF-, tais como 6Bio, Dexametasona, TCPA-1, IKK VII; agonistas de recep- tores da adenosina; agonistas da prostaglandina E2 (PGE2), tais como

Misoprostol; inibidores da fosfodiesterase, tais como o inibidor da fos- fodiesterase 4 (PDE4), tal como Rolipram; inibidores do proteassoma; inibidores de quinases; agonistas de receptores acoplados à proteína G; antagonistas de receptores acoplados à proteína G; glicocorticói- des; retinóides; inibidores de citocinas; inibidores de receptores de ci- tocinas; ativadores de receptores de citocinas; antagonistas de recep- tores ativados por proliferadores do peroxissoma; agonistas de recep- tores ativados por proliferadores do peroxissoma; inibidores da histona desacetilase; inibidores da calcineurina; inibidores da fosfatase; inibi- dores da PI3KB, tais como TGX-221; inibidores de autofagia, tais co- mo 3-Metiladenina; inibidores de receptores de hidrocarbonetos arilo; inibidor do proteassoma I (PSI); e ATPs oxidados, tais como bloquea- dores de receptores de P2X.

Os imunossupressores também incluem IDO, vitamina D3, ácido retinoico, ciclosporinas, tais como ciclosporina A, inibidores de receptores de hidrocarbonetos arilo, resveratrol, azati- opurina (Aza), 6-mercaptopurina (6-MP), 6-tioguanina (6-TG), FK506, sangliferina A, salmeterol, mofetil micofenolato (MMF), aspirina e ou- tros inibidores da COX, ácido niflúmico, estriol e triptolida.

Outros exemplos de imunossupressores incluem, mas não estão limitados a, fármacos de molécula pequena, produtos naturais, anticorpos (por exemplo, anticorpos contra CD20, CD3, CD4), fármacos à base de produtos biológicos, fármacos à base de carboidrato, RNAi, ácidos nu- cleicos antisense, aptâmeros, metotrexato, NSAIDs; fingolimod; nata- lizumab; alemtuzumab; anti-CD3; tacrolimo (FK506), abatacept, bela- tacept, etc. "Rapálogo" se refere a uma molécula que é estruturalmen- te relacionada a (um análogo) de rapamicina (sirolimo). Exemplos de rapálogos incluem, sem limitação, tensirolimo (CCI-779), everolimo (RAD001), ridaforolimo (AP-23573), e zotarolimo (ABT-578). Exem- plos de rapálogos adicionais podem ser encontrados, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional No.

WO 1998/002441 e na Paten-

te U.S. No. 8.455.510, cujos rapálogos são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade.

[00101] Imunossupressores adicionais são de conhecimento dos peritos na técnica, e a invenção não está limitada neste aspecto. Em modalidades, o imunossupressor pode compreender qualquer um dos agentes proporcionados aqui, neste requerimento de patente.

[00102] "Carga", quando acoplada a um nanocarreador sintético, é a quantidade do imunossupressor acoplada ao nanocarreador sintético com base no peso total da receita a seco de materiais em um nanocar- reador sintético inteiro (em peso / peso). De modo geral, uma carga semelhante é calculada como uma média através de uma população de nanocarreadores sintéticos. Em uma modalidade, a carga em mé- dia através dos nanocarreadores sintéticos é entre 0,1% e 50%. Em outra modalidade, a carga é entre 0,1% e 20%. Em uma modalidade adicional, a carga é entre 0,1% e 10%. Em ainda uma modalidade adicional, a carga é entre 1% e 10%. Em ainda uma modalidade adi- cional, a carga é entre 7% e 20%. Em ainda outra modalidade, a car- ga é de no mínimo 0,1%, no mínimo 0,2%, no mínimo 0,3%, no míni- mo 0,4%, no mínimo 0,5%, no mínimo 0,6%, no mínimo 0,7%, no mí- nimo 0,8%, no mínimo 0,9%, no mínimo 1%, no mínimo 2%, no míni- mo 3%, no mínimo 4%, no mínimo 5%, no mínimo 6%, no mínimo 7%, no mínimo 8%, no mínimo 9%, no mínimo 10%, no mínimo 11%, no mínimo 12%, no mínimo 13%, no mínimo 14%, no mínimo 15%, no mínimo 16%, no mínimo 17%, no mínimo 18%, no mínimo 19%, no mínimo 20% ou no mínimo 25% em média através da população de nanocarreadores sintéticos. Em ainda uma modalidade adicional, a carga é de 0,1%, 0,2%, 0,3%, 0,4%, 0,5%, 0,6%, 0,7%, 0,8%, 0,9%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19% ou 20% em média através da população de nanocarreadores sintéticos. Em uma modalidade de qualquer uma das modalidades acima, a carga é de não mais de 25% em média através de uma população de nanocarreadores sintéticos. Em modali- dades, a carga é calculada usando qualquer método conhecido na técnica. A carga de um imunossupressor compreendida em nanocar- readores sintéticos pode ser qualquer uma das cargas proporcionadas aqui, neste requerimento de patente.

[00103] "Dimensão máxima de um nanocarreador sintético" signifi- ca a maior dimensão de um nanocarreador medida ao longo de qual- quer eixo do nanocarreador sintético. "Dimensão mínima de um nano- carreador sintético" significa a menor dimensão de um nanocarreador sintético medida ao longo de qualquer eixo do nanocarreador sintético. Por exemplo, para um nanocarreador sintético esferoidal, as dimen- sões máxima e mínima de um nanocarreador sintético seriam subs- tancialmente idênticas, e seriam o tamanho de seu diâmetro. De mo- do similar, para um nanocarreador sintético cuboidal, a dimensão mí- nima de um nanocarreador sintético seria a menor de sua altura, largu- ra ou comprimento, ao passo que a dimensão máxima de um nanocar- reador sintético seria a maior de sua altura, largura ou comprimento. Em uma modalidade, uma dimensão mínima de no mínimo 75%, de maneira preferencial no mínimo 80%, de maneira mais preferencial no mínimo 90%, dos nanocarreadores sintéticos em uma amostra, com base no número total de nanocarreadores sintéticos na amostra, é igual ou superior a 100 nm. Em uma modalidade, uma dimensão má- xima de no mínimo 75%, de maneira preferencial no mínimo 80%, de maneira mais preferencial no mínimo 90%, dos nanocarreadores sinté- ticos em uma amostra, com base no número total de nanocarreadores sintéticos na amostra, é igual ou inferior a 5 µm. De maneira preferen- cial, uma dimensão mínima de no mínimo 75%, de maneira preferen- cial no mínimo 80%, de maneira mais preferencial no mínimo 90%, dos nanocarreadores sintéticos em uma amostra, com base no número total de nanocarreadores sintéticos na amostra, é maior do que 110 nm, de maneira mais preferencial maior do que 120 nm, de maneira mais preferencial maior do que 130 nm, e de maneira ainda mais pre- ferencial maior do que 150 nm. As razões de aspectos das dimensões máxima e mínima de nanocarreadores sintéticos podem variar depen- dendo da modalidade. Por exemplo, as razões de aspecto das dimen- sões máxima para mínima dos nanocarreadores sintéticos podem va- riar a partir de 1:1 a 1.000.000:1, de maneira preferencial a partir de 1:1 a 100.000:1, de maneira mais preferencial a partir de 1:1 a

10.000:1, de maneira mais preferencial a partir de 1:1 a 1000:1, de maneira ainda mais preferencial a partir de 1:1 a 100:1, e de maneira ainda mais preferencial a partir de 1:1 a 10:1. De maneira preferenci- al, uma dimensão máxima de no mínimo 75%, de maneira preferencial no mínimo 80%, de maneira mais preferencial no mínimo 90%, dos nanocarreadores sintéticos em uma amostra, com base no número total de nanocarreadores sintéticos na amostra é igual ou inferior a 3 µm, de maneira mais preferencial igual ou inferior a 2 µm, de maneira mais preferencial igual ou inferior a 1 µm, de maneira mais preferencial igual ou inferior a 800 nm, de maneira mais preferencial igual ou inferi- or a 600 nm, e de maneira ainda mais preferencial igual ou inferior a 500 nm. Em modalidades preferenciais, uma dimensão mínima de no mínimo 75%, de maneira preferencial no mínimo 80%, de maneira mais preferencial no mínimo 90%, dos nanocarreadores sintéticos em uma amostra, com base no número total de nanocarreadores sintéti- cos na amostra, é igual ou superior a 100 nm, de maneira mais prefe- rencial igual ou superior a 120 nm, de maneira mais preferencial igual ou superior a 130 nm, de maneira mais preferencial igual ou superior a 140 nm, e de maneira ainda mais preferencial igual ou superior a 150 nm. A medição das dimensões dos nanocarreadores sintéticos (por exemplo, diâmetro efetivo) pode ser obtida, em algumas modalidades,

por suspensão os nanocarreadores sintéticos em um meio líquido (ge- ralmente aquoso) e usando espalhamento dinâmico da luz (DLS) (por exemplo, usando um instrumento Brookhaven ZetaPALS). Por exem- plo, uma suspensão de nanocarreadores sintéticos pode ser diluída a partir de um tampão aquoso em água purificada de modo a obter uma concentração da suspensão de nanocarreadores sintéticos final de aproximadamente 0,01 a 0,1 mg/mL. A suspensão diluída pode ser preparada diretamente no interior de, ou transferida para, uma cuveta adequada para análise por DLS. A cuveta pode ser então colocada na DLS, deixada para equilibrar até a temperatura controlada, e em se- guida escaneada por tempo suficiente para adquirir uma distribuição estável e reprodutível com base em inputs apropriados para a viscosi- dade do meio e os índices refrativos da amostra. O diâmetro efetivo, ou média de distribuição, é em seguida reportado. A determinação dos tamanhos efetivos de nanocarreadores sintéticos de alta razão de aspecto, ou não esferoidais, pode requerer técnica aumentativas, tais como microscopia eletrônica, de modo a obter medições mais preci- sas. "Dimensão" ou "tamanho" ou "diâmetro" de nanocarreadores sin- téticos significa a média de uma distribuição de tamanho de partículas, por exemplo, obtida usando espalhamento dinâmico da luz.

[00104] "Polímero não terminado com metóxi" significa um políme- ro que tenha no mínimo um término que termina com uma porção dife- rente de metóxi. Em algumas modalidades, o polímero tem no mínimo dois términos que terminam com uma porção diferente de metóxi. Em outras modalidades, o polímero não tem términos que terminem com metóxi. "Polímero plurônico não terminado com metóxi" significa um polímero diferente de um polímero plurônico linear com metóxi em ambos os términos. Nanopartículas poliméricas conforme proporcio- nado aqui, neste requerimento de patente, podem compreender polí- meros não terminados com metóxi ou polímeros plurônicos não termi-

nados com metóxi, em algumas modalidades. Em outras modalida- des, nanopartículas poliméricas não compreendem os polímeros refe- ridos.

[00105] "Excipiente farmaceuticamente aceitável" ou "carreador farmaceuticamente aceitável" significa um material farmacologiamente inativo usado junto com um material farmacologiamente ativo para formular as composições. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis compreendem uma variedade de materiais conhecidos na técnica, in- cluindo, mas não limitados a, sacarídeos (tais como glicose, lactose, e semelhantes), conservantes tais como agentes antimicrobianos, auxili- ares de reconstituição, colorantes, salina (tal como salina tamponada com fosfato), e tampões.

[00106] "Protocolo" significa um padrão de administração a um su- jeito e inclui qualquer regime de dosagem de uma ou mais substâncias para um sujeito. Protocolos são compostos de elementos (ou variá- veis); portanto, um protocolo compreende um ou mais elementos. Os elementos referidos do protocolo podem compreender quantidades da dosagem (doses), frequência da dosagem, vias de administração, du- ração da dosagem, taxas de dosagem, intervalo entre a dosagem, combinações de qualquer um dos precedentes, e semelhantes. Em algumas modalidades, pode ser usado um protocolo para administrar uma ou mais composições da invenção a um ou mais sujeitos de teste. Em seguidas as respostas imunes nestes sujeitos de teste podem ser avaliadas para determinar se ou não o protocolo foi eficaz para gerar um nível desejado ou desejado de uma resposta imune ou de um efei- to terapêutico. Pode ser avaliado qualquer efeito terapêutico e/ou imunológico. Um ou mais dos elementos de um protocolo podem ter sido previamente demonstrados em sujeitos de teste, tais como sujei- tos não humanos, e em seguida traduzidos em protocolos humanos. Por exemplo, as quantidades das dosagens demonstradas em sujeitos não humanos podem ser escaladas como um elemento de um proto- colo humano usando técnicas estabelecidas tais como escalonamento alométrico ou outros métodos de escalonamento.

Pode ser determi- nado se ou não um protocolo teve um efeito desejado, usando quais- quer dos métodos proporcionados aqui, neste requerimento de paten- te, ou conhecido de modo diverso na técnica.

Por exemplo, uma amostra pode ser obtida de um sujeito ao qual uma composição pro- porcionada aqui, neste requerimento de patente, tenha sido adminis- trada de acordo com um protocolo específico de modo a determinar se ou não células imunes específicas, citocinas, anticorpos, etc. foram reduzida, geradas, ativadas, etc.

Um exemplo de protocolo é um pro- tocolo o qual foi previamente demonstrado que resulta em uma res- posta imune tolerogênica contra um antígeno de vetor de transferência viral ou atinge qualquer um dos resultados benéficos descritos aqui, neste requerimento de patente.

Métodos úteis para a detecção da presença e/ou do número de células imunes incluem, mas não estão limitados a, métodos de citometria de fluxo (por exemplo, FACS), ELISpot, respostas de proliferação, produção de citocinas, e métodos de imunohistoquímica.

Anticorpos e outros agentes de ligação para coloração específica de marcadores de células imunes, estão disponí- veis comercialmente.

Os kits referidos tipicamente incluem reagentes de coloração para antígenos que possibliitam detecção baseada em FACS, separação e/ou quantificação de uma população celular dese- jada de uma população heterogênea de células.

Em modalidades, uma composição conforme proporcionada aqui, neste requerimento de patente, é administrada a um sujeito usando um ou mais ou todos ou substancialmente todos os elementos dos quais é compreendido um protocolo, contanto que o um ou mais elementos selecionados se es- pere que obtenham o resultado desejado no sujeito.

A expectativa re- ferida pode ser baseada em protocolos determinados em sujeitos de teste e escalonamento caso necessário. Qualquer um dos métodos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, pode compreen- der ou compreender adicionalmente uma etapa de administração de uma dose de um vetor de transferência viral em combinação com na- nocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor e um agente anti-IgM conforme descrito aqui, neste requerimento de paten- te, de acordo com um protocolo que tenha sido demonstrado que ate- nue uma resposta imune antivetor de transferência viral, tal como uma resposta de IgM, e/ou possibilite a administração repetida de um vetor de transferência viral e/ou resulte na atenuação d euma ou mais outras respostas imunes contra o vetor de transferência viral e/ou resulte em aumento da expressão transgênica. Qualquer um dos métodos pro- porcionados aqui, neste requerimento de patente, pode compreender ou compreender adicionalmente determinar se um protocolo seme- lhante que obtém um ou mais dos resultados benéficos descritos aqui, neste requerimento de patente. Qualquer um dos métodos proporcio- nados aqui, neste requerimento de patente, pode compreender ou compreender adicionalmente uma etapa de administração de acordo com um protocolo que obtém qualquer um ou mais dos resultados be- néficos descritos aqui, neste requerimento de patente.

[00107] "Dose de repetição" ou "dosagem de repetição" ou seme- lhantes significa no mínimo uma dose ou dosagem adicional que seja administrada a um sujeito subsequente a uma dose ou dosagem ante- rior do mesmo material. Por exemplo, uma dose repetida de um vetor de transferência viral é no mínimo uma dose adicional do vetor de transferência viral depois de uma dose anterior do mesmo material. Apesar do material poder ser a mesma, a quantidade do material na dose repetida pode ser diferente da dose inicial. Uma dose de repeti- ção pode ser administrada conforme proporcionado aqui, neste reque- rimento de patente, tal como nos intervalos dos Exemplos. A dosagem de repetição é considerada como sendo eficaz se resultar em um efei- to benéfico para o sujeito. De maneira preferencial, dosagem de repe- tição eficaz resulta em um efeito benéfico, tal como um efeito terapêu- tico, em conjunto com uma resposta antivetor de transferência viral atenuada.

[00108] "Simultânea" significa administração ao mesmo tempo ou substancialmente ao mesmo tempo onde um clínico consideraria qual- quer tempo entre as administrações virtualmente nada ou desprezível quanto ao impacto sobre o resultado terapêutico desejado. Em algu- mas modalidades, simultânea significa que as administrações ocorrem com 5, 4, 3, 2, 1 ou menos minutos.

[00109] "Sujeito" significa animais, incluindo mamíferos de sangue quente tais como seres humanos e primatas; aves; animais domésti- cos ou de criação tais como gatos, cães, carneiros, cabras, gado bovi- no, cavalos e porcos; animais de laboratório tais como camundongos, ratos e porquinhos da índia; peixe; répteis; animais de zoológico e sel- vagens; e semelhantes. Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, um sujeito pode ser um sujeito que necessite de qualquer um dos métodos ou composições proporcionadas aqui, neste requerimen- to de patente.

[00110] "Nanocarreador(es) sintético(s)" significa um objeto distinto que não é encontrado na natureza, e que possui no mínimo uma di- mensão que é menor do que ou igual a 5 micra de tamanho. Nanopar- tículas de albumina, de modo geral, são incluídas como nanocarreado- res sintéticos, no entanto, em determinadas modalidades, os nanocar- readores sintéticos não compreendem nanopartículas de albumina. Em modalidades, os nanocarreadores sintéticos não compreendem quitosana. Em outras modalidades, nanocarreadores sintéticos não são nanopartículas à base de lipídeos. Em modalidades adicionais, os nanocarreadores sintéticos não compreendem um fosfolipídeo.

[00111] Um nanocarreador sintético pode ser, mas não está limita- do a, uma ou uma pluralidade de nanopartículas à base de lipídeos (também referidas aqui, neste requerimento de patente, como nano- partículas lipídicas, isto é, nanopartículas onde a maior parte do mate- rial que compõe sua estrutura são lipídeos), nanopartículas poliméri- cas, nanopartículas metálicas, emulsões à base de tensoativos, den- drímeros, buckyballs, nanofios, partículas semelhantes a vírus (isto é, partículas que são essencialmente composta de proteínas estruturais virais mas que não são infecciosas ou têm baixa infectividade), partí- culas à base de peptídeos ou de proteínas (também referidas aqui, neste requerimento de patente, como partículas de proteínas, isto é, partículas onde a maior parte do material que compõe sua estrutura são peptídeos ou proteínas) (tais como nanopartículas de albumina) e/ou nanopartículas que são desenvolvidas usando uma combinação de nanomateriais tais como nanopartículas de lipídeos-polímeros. Na- nocarreadores sintéticos podem ser uma variedade de diferentes for- matos, incluindo, mas não limitados a, formato esferoidal, cuboidal, piramidal, oblongo, cilíndrico, toróide, e semelhantes. Nanocarreado- res sintéticos de acordo com a invenção compreendem uma ou mais superfícies. Exemplos de nanocarreadores sintéticos que podem ser adaptados para uso na prática da presente invenção compreendem: (1) as nanopartículas biodegradáveis reveladas na Patente US No.

5.543.158 para Gref et al., (2) as nanopartículas poliméricas do Re- querimento de Patente US Publicado No. 20060002852 para Saltzman et al., (3) as nanopartículas construídas litográficamente do Requeri- mento de Patente US Publicado No. 20090028910 para DeSimone et al., (4) a revelação da Patente Internacional No. WO 2009/051837 pa- ra von Andrian et al., (5) as nanopartículas reveladas no Requerimento de Patente US Publicado No. 2008/0145441 para Penades et al., (6) as nanopartículas de proteínas reveladas no Requerimento de Patente

US Publicado No. 20090226525 para de los Rios et al., (7) as partícu- las semelhantes a vírus reveladas no Requerimento de Patente US Publicado No. 20060222652 para Sebbel et al., (8) as partículas ane- xadas a ácido nucleio semelhantes a vírus reveladas no Requerimento de Patente US Publicado No. 20060251677 para Bachmann et al., (9) as partículas semelhantes a vírus reveladas no Requerimento de Pa- tente Internacional No. WO2010047839A1 ou WO2009106999A2, (10) as nanopartículas nanoprecipitadas reveladas em P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanoparticles that can Efficiently As- sociate and Deliver Virus-like Particles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010), (11) células apoptóticas, corpos apoptóticos ou os mímicos sin- téticos ou semi- sintéticos revelados na Publicação de Patente U.S. No. 2002/0086049, ou (12) as de Look et al., Nanogel-based delivery of mycophenolic acid ameliorates systemic lupus erythematosus in mi- ce" J. Clinical Investigation 123(4):1741-1749(2013).

[00112] Nanocarreadores sintéticos de acordo com a invenção que têm uma dimensão mínima de igual ou inferior a cerca de 100 nm, de maneira preferencial igual ou inferior a 100 nm, não compreendem uma superfície com grupos de oxidrila que ativam o complemento ou alternativamente compreendem uma superfície que consiste essenci- almente em porções que não são grupos de oxidrila que ativam o complemento. Em uma modalidade preferencial, nanocarreadores sin- téticos de acordo com a invenção que têm uma dimensão mínima de igual a ou inferior a cerca de 100 nm, de maneira preferencial igual ou inferior a 100 nm, não compreendem uma superfície que ativa subs- tancialmente o complemento ou alternativamente compreendem uma superfície que consiste essencialmente em porções que não ativam substancialmente o complemento. Em uma modalidade mais prefe- rencial, nanocarreadores sintéticos de acordo com a invenção que têm uma dimensão mínima de igual a ou inferior a cerca de 100 nm, de maneira preferencial igual ou inferior a 100 nm, não compreendem uma superfície que ativa o complemento ou alternativamente compre- endem uma superfície que consiste essencialmente em porções que não ativam o complemento. Em modalidades, nanocarreadores sinté- ticos excluem partículas semelhantes a vírus. Em modalidades, nano- carreadores sintéticos podem possuir uma razão de aspecto maior do que 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7, ou maior do que 1:10.

[00113] "Proteína terapêutica" significa qualquer proteína que possa ser expressa a partir de um transgene de terapia genética conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente. A proteína tera- pêutica pode ser uma proteína terapêutica usada para substituição de proteína ou suplementação de proteína. Proteínas terapêuticas inclu- em, mas não estão limitadas a, enzimas, cofatores enzimáticos, hor- mônios, fatores de coagulação sanguínea, citocinas, fatores de cres- cimento, etc. Exemplos de outras proteínas terapêuticas são proporci- onados em outra parte aqui, neste requerimento de patente. Um sujei- to pode ser um sujeito que necessite de tratamento com qualquer uma das proteínas terapêuticas proporcionadas aqui, neste requerimento de patente.

[00114] "Transgene do vetor de transferência viral" se refere ao ma- terial de ácido nucleico o vetor de transferência viral é usado para transportar para dentro de uma célula e, uma vez na célula, pode ser expresso para produzir uma molécula de ácido nucleico ou proteína, tal como para uma aplicação terapêutica conforme descrito aqui, neste requerimento de patente. O transgene pode ser um transgene de te- rapia genética, um transgene de edição genética, um transgene de modulação da expressão genética ou um transgene de salto de éxon. "Expresso" ou "expressão" ou semelhantes se refere à síntese de um produto genético funcional (isto é, fisiologicamente ativo para o propó- sito desejado) depois do transgene ser transduzido para dentro de uma célula e processado pela célula transduzida. Um produto genéti- co semelhante também é referido aqui, neste requerimento de patente, como um "produto de expressão transgênica". Os produtos expressos incluem, portanto, a proteína ou ácido nucleico resultante, tal como um oligonucleotídeo antisense ou um RNA terapêutico, codificado pelo transgene.

[00115] "Vetor de transferência viral" significa um vetor viral que te- nha sido adaptado para liberar um ácido nucleico, tla como um trans- gene, conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, e inclui o referido ácido nucleico. "Vetor viral" se refere a todos os com- ponentes virais de um vetor de transferência viral. Por conseguinte, "antígeno viral" se refere a um antígeno dos componentes virais do vetor de transferência viral, tal como uma proteína do capsídeo ou do revestimento, mas não ao ácido nucleico, tal como um transgene, que ele libera, ou qualquer produto que ele codifica. "Antígeno do vetor de transferência viral" se refere a qualquer antígeno do vetor de transfe- rência viral incluindo seus componentes virais bem como ácido nucléi- co liberado, tal como um transgene, ou qualquer produto de expressão do mesmo. O transgene pode ser um transgene de terapia genética, um transgene de edição genética, um transgene de modulação da ex- pressão genética ou um transgene de salto de éxon. Em algumas modalidades, o transgene é um transgene que codifique uma proteína proporcionada aqui, neste requerimento de patente, tal como uma pro- teína terapêutica, uma proteína de ligação ao DNA ou uma endonu- clease. Em outras modalidades, o transgene é um transgene que co- difique RNA guia, um ácido nucleico antisense, snRNA, uma molécula de RNAi (por exemplo, dsRNAs ou ssRNAs), miRNA, ou oligonucleotí- deos formadores de triplex (TFOs), etc. Vetores virais podem ser ba- seados, sem limitação, em retrovírus (por exemplo, o retrovírus muri- no, o retrovírus aviário, o vírus da leucemia murina de Moloney (Mo-

MuLV), o vírus do sarcoma murino de Harvey (HaMuSV), o vírus do tumor mamário murino (MuMTV), o vírus da leucemia do macaco gi- bão (GaLV) e o vírus do Sarcoma de Rous (RSV)), lentivírus, herpes vírus, adenovírus, vírus adenoassociados, alfavírus, etc. Outros exemplos são proporcionados em outras partes aqui, neste requeri- mento de patente, ou são conhecidos na técnica. Os vetores virais podem ser baseados em variantes naturais, cepas, ou sorotipos de vírus, tais como qualquer um dos proporcionados aqui, neste requeri- mento de patente. Os vetores virais também podem ser baseados em vírus selecionados através de evolução molecular. Os vetores virais também podem ser vetores manipulados, vetores recombinantes, veto- res mutantes, ou vetores híbridos. Em algumas modalidades, o vetor viral é um "vetor viral quimérico". Em semelhantes modalidades, isto significa que o vetor viral é composto de componentes virais que são derivados de mais de um vírus ou vetor viral. C. COMPOSIÇÕES PARA USO NOS MÉTODOS DA INVENÇÃO

[00116] De maneira importante, foi visto que os métodos e compo- sições proporcionados aqui, neste requerimento de patente, atenuam as respostas imunes, tais como as respostas de IgM, contra vetores de transferência viral. Adicionalmente, foi visto que os métodos e compo- sições proporcionados aqui, neste requerimento de patente, permitem um aumento substancial na expressão transgênica. Os métodos e composições proporcionados aqui, neste requerimento de patente, são úteis para o tratamento de sujeitos com um vetor de transferência viral. Vetores de transferência viral podem ser usados para liberar ácidos nucleicos, tais como transgenes, para uma variedade de propósitos, inclusive para terapia genética, edição genética, modulação da ex- pressão genética e salto de éxon, os métodos e composições propor- cionados aqui, neste requerimento de patente, também são aplicáveis deste modo.

Transgenes

[00117] O transgene dos vetores de transferência viral proporciona- dos aqui, neste requerimento de patente, pode ser um transgene de terapia genética e pode codificar qualquer proteína ou porção da mesma benéfica para um sujeito, tal como uma com uma doença ou distúrbio. A proteína pode ser uma proteína extracelular, intracelular ou ligada à membrana. A proteína pode ser uma proteína terapêutica, e o sujeito ao qual o transgene de terapia genética é administrado por meio de um vetor de transferência viral pode ter uma doença ou dis- túrbio por meio do qual a versão endógena da proteína do sujeito é defeituosa ou produzida em quantidades limitadas ou não é de todo produzida. Portanto, o sujeito pode ser um sujeito com qualquer uma das doenças ou distúrbios conforme proporcionados aqui, neste reque- rimento de patente, e o transgene pode ser um transgene que codifi- que qualquer uma das proteínas terapêuticas ou porção da mesma conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente.

[00118] Exemplos de proteínas terapêuticas incluem, mas não es- tão limitados a, proteínas terapêuticas infundíveis ou injetáveis, enzi- mas, cofatores enzimáticos, hormônios, fatores sanguíneos ou de co- agulação sanguínea, ciocinas e interferons, fatores de crescimento, adipocinas, etc.

[00119] Exemplos de proteínas terapêuticas infundíveis ou injetá- veis incluem, por exemplo, Tocilizumab (Roche/Actemra®), alfa-1 anti- tripsina (Kamada/AAT), Hematide® (Affymax e Takeda, peptídeo sin- tético), alfa-2b albinterferon (Novartis/Zalbin™), Rhucin® (Pharming Group, terapia de substituição de inibidor C1), tesamorelina (Thera- technologies/Egrifta, fator de liberação de hormônio do crescimento sintético), ocrelizumab (Genentech, Roche e Biogen), belimumab (Gla- xoSmithKline/Benlysta®), pegloticase (Savient Pharmaceuti- cals/Krystexxa™), alfa taliglucerase (Protalix/Uplyso), alfa agalsidase

(Shire/Replagal®), e alfa velaglucerase (Shire).

[00120] Exemplos de enzimas incluem lisozims, oxidorredutases, transferases, hidrolases, liases, isomerases, asparaginases, uricases, glicosidases, proteases, nucleases, colagenases, hialuronidases, he- parinases, heparanases, quinases, fosfatases, lisinas e ligases. Ou- tros exemplos de enzimas incluem as que são usadas para terapia de substituição enzimática incluindo, mas não limitadas a, imiglucerase (por exemplo, CEREZYMETM), a-galactosidase A (a-gal A) (por exem- plo, agalsidase beta, FABRYZYMETM), ácido a-glucosidase (GAA) (por exemplo, alfa alglucosidase, LUMIZYMETM, MYOZYMETM), e arilsulfa- tase B (por exemplo, laronidase, ALDURAZYMETM, idursulfase, ELA- PRASETM, arilsulfatase B, NAGLAZYMETM).

[00121] Exemplos de hormônios incluem, mas não estão limitados a, gonadotropinas, hormônio estimulador da tiróide, melanocortinas, hormônios pituitários, vasopressina, oxitocina, hormônios do cresci- mento, prolactina, orexins, hormônios natriuréticos, hormônio paratiroi- deadno, calcitoninas, eritropoietina, e hormônios pancreáticos.

[00122] Exemplos de fatores sanguíneos ou de coagulação sanguí- nea incluem o Fator I (fibrinogênio), Fator II (protrombina), fator tecidu- al, Fator V (proacelerina, fator lábil), Fator VII (fator estável, proconver- tina), Fator VIII (globulina antihemofílica), Fator IX (fator Christmas ou componente da tromboplastina plasmática), Fator X (fator de Stuart- Prower), Fator Xa, Fator XI, Fator XII (fator de Hageman), Fator XIII (fator estabilizante de fibrina), fator de von Willebrand, Fator de von Heldebrant, precallicreína (fator de Fletcher), quininogênio de alto peso molecular (HMWK) (fator de Fitzgerald), fibronectina, fibrina, trombina, antitrombina, tal como antitrombina III, cofator de heparina II, proteína C, proteína S, proteína Z, inibitor da protease relacionado com proteí- na Z (ZPI), plasminogênio, alfa 2-antiplasmina, ativador do plasmino- gênio tecidual (tPA), uroquinase, inibidor do ativador do plasminogênio

1 (PAI1), inibidor do ativador do plasminogênio 2 (PAI2), procoagulan- te cancerígeno, e alfa epoetina (Epogen, Procrit).

[00123] Exemplos de citocinas incluem linfocinas, interleucinas, e quimiocinas, citocinas tipo 1, tais como IFN-γ, TGF-β, e citocinas tipo 2, tais como IL-4, IL-10, e IL-13.

[00124] Exemplos de fatores de crescimento incluem Adrenomedu- lina (AM), Angiopoietina (Ang), fator motilidade Autócrino, proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), fator de crescimento epidermal (EGF), Eritropoietina (EPO), fator de crescimento de fibroblastos (FGF), fator neurotrófico derivado da linhagem de células gliais (GDNF), fator estimulante da colônia de granulócitos (G-CSF), fator estimulante da colônia de macrófagos gra- nulócitos (GM-CSF), fator de diferenciação do crescimento 9 (GDF9), fator de crescimento de hepatócitos (HGF), fator de crescimento deri- vado de hepatoma (HDGF), fator de crescimento semelhante a insuli- na (IGF), fator estimulante de migração, Miostatina (GDF-8), fator de crescimento nervoso (NGF) e outras neurotrofinas, fator de crescimen- to derivado de plaquetas (PDGF), Trombopoietina (TPO), fator de crescimento transformante alfa (TGF-α), fator de crescimento trans- formante beta(TGF-β), fator de necrose tumoral alfa(TNF-α), fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), Via de sinalização Wnt, fator de crescimento placentário (PlGF), [(Somatotrofina Bovina Fetal)] (FBS), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, e IL-7.

[00125] Exemplos de adipocinas, incluem leptina e adiponectina.

[00126] Exemplos adicionais de proteínas terapêuticas incluem, mas não estão limitados a, receptores, proteínas de sinalização, prote- ínas citoesqueléticas, proteínas de scaffold, fatores de transcrição, proteínas estruturais, proteínas de membrana, proteínas citosólicas, proteínas de ligação, proteínas nucleares, proteínas secretadas, prote- ínas de golgi, proteínas do retículo endoplasmático, proteínas mito-

condriais e proteínas vesiculares, etc.

[00127] O transgene dos vetores de transferência viral da terapia genética proporcionada aqui, neste requerimento de patente, pode co- dificar uma versão funcional de qualquer proteína que através de al- gum defeito na versão endógena da qual em um sujeito (incluindo um defeito na expressão da versão endógena) resulta em uma doença ou distúrbio no sujeito. Exemplos de semelhantes doenças ou distúrbios incluem, mas não estão limitados a, armazenamento lisossômico do- enças/distúrbios, tais como a doença de Santavuori-Haltia (Lipofusci- nose Ceróide Neuronal Infantil Tipo 1), Doença de Jansky- Bielschowsky (lipofuscinose ceróide neuronal infantil tardia, Tipo 2), doença de Batten (lipofuscinose ceróide neuronal juvenil, Tipo 3), do- ença de Kufs (lipofuscinose ceróide neuronal, Tipo 4), doença de Von Gierke (doença do armazenamento de glicogênio, Tipo Ia), doença do armazenamento de glicogênio, Tipo Ib, doença de Pompe (doença do armazenamento de glicogênio, Tipo II) , doença de Forbes ou Cori (doença do armazenamento de glicogênio, Tipo III), mucolipidose II (I- Cell doença), mucolipidose III (polidistrofia de Pseudo-Hurler), muco- lipdose IV (sialolipidose), cistinose (tipo não nefropática do adulto), cis- tinose (tipo nefropática infantil), cistinose (nefropática juvenil ou ado- lescente), doença de Salla / distúrbio de armazenamento do ácido siá- lico infantil, e deficiências de saposina; distúrbios da degradação de lipídeos e esfingolipídeos, tais como gangliosidose GM1 (infantil, infan- til tardia / juvenil, e adulta / crônica), doença de Tay-Sachs, doença de Sandhoff, gangliodisose GM2, variante Ab, doença de Fabry, doença de Gaucher, Tipos I, II e III, leucodistrofia metacromática, doença de Krabbe (início precoce e tardio), doença de Neimann-Pick, Tipos A, B, C1, e C2, doença de Farber, e doença de Wolman (doença do arma- zenamento do éster colesterílico); distúrbios da degradação de muco- polissacarídeos, tais como a síndrome de Hurler (MPSI), síndrome de

Scheie (MPS IS), síndrome de Hurler-Scheie (MPS IH/S), síndrome de Hunter (MPS II), síndrome de Sanfillippo A (MPS IIIA), síndrome de Sanfillippo B (MPS IIIB), síndrome de Sanfillippo C (MPS IIIC), sín- drome de Sanfillippo D (MPS IIID), síndrome de Morquio A (MPS IVA), síndrome de Morquio B (MPS IVB), síndrome de Maroteaux-Lamy (MPS VI), e síndrome de Sly (MPS VII); distúrbios da degradação de glicoproteínas, tais como alfa manosidose, beta manosidose, fucosido- se, asparilglucosaminúria, mucolipidose I (sialidose), galactosialidose, doença de Schindler, e doença de Schindler, Tipo II / doença de Kan- zaki; e doenças / distúrbios de leucodistrofia, tais como abetalipopro- teinemia, adrenoleucodistrofia neonatal, doença de Canavan, xantro- matose cerebrotendinosa, doença de Pelizaeus Merzbacher, doença de Tangier, doença de Refum, infantil, e doença de Refum, clássica.

[00128] Exemplos adicionais de semelhantes doenças / distúrbios de um sujeito conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, incluem, mas não estão limitados a, deficiência de maltase ácida (por exemplo, doença de Pompe, glicogenose tipo 2, doença do armazenamento lisossômico); deficiência de carnitina; deficiência de carnitina palmitil transferase; deficiência da enzima debrancher (por exemplo, doença de Cori ou de Forbes, glicogenose tipo 3); deficiência da lactato desidrogenase (por exemplo, glicogenose tipo 11); deficiên- cia da mioadenilato desaminase; deficiência da fosfofructoquinase (por exemplo, doença de Tarui, glicogenose tipo 7); deficiência da fosfogil- cerato quinase (por exemplo, glicogenose tipo 9); deficiência da fosfo- glicerato mutase (por exemplo, glicogenose tipo 10); deficiência da fos- forilase (por exemplo, doença de McArdle, deficiência da miofosforila- se, glicogenose tipo 5); Doença de Gaucher (por exemplo, cromosso- ma 1, enzima glucocerebrosidase afetada); Acondroplasia (por exem- plo, cromossoma 4, receptor do fator de crescimento de fibroblastos 3 afetado); Doença de Huntington (por exemplo, cromossoma 4, hunting-

tina); Hemocromatose (por exemplo, cromossoma 6, proteína HFE); Fibrose Cística (por exemplo, cromossoma 7, CFTR); Ataxia de Frie- dreich (cromossoma 9, frataxina); Doença de Best (cromossoma 11, VMD2); Doença Falciforme (cromossoma 11, hemoglobina); fenilceto- núria (cromossoma 12, fenilalanina hidroxilase); Síndrome de Marfan (cromossoma 15, fibrilina); Distrofia Miotônica (cromossoma 19, prote- ína quinase da distrofia miotônica); Adrenoleucodistrofia (cromossoma x, lignoceroil-CoA ligase em peroxissomas); Distrofia Muscular de Du- chene (cromossoma x, distrofina); Síndrome de Rett (cromossoma x, proteína de ligação a metilCpG 2); Neuropatia Ótica Hereditária de Le- ber (mitochondria, respiratory proteínas); Encefalopatia de Mitocôndri- as, Acidose Láctica e Derrame (MELAS) ( mitocôndrias, RNA de trans- ferência); e deficiências enzimátifcas do Ciclo da Uréia.

[00129] Ainda exemplos adicionais de semelhantes doenças ou dis- túrbios incluem, mas não estão limitados a, Anemia Falciforme, Miopa- tia Miotubular, Hemofilia B, Deficiência de Lipoproteína lipase, Defici- ência de Ornitina Transcarbamilase, Síndrome de Crigler-Najjar, Muco- lipidose IV, Niemann-Pick A, Sanfilippo A, Sanfilippo B, Sanfilippo C, Sanfilippo D, b-talassemia e Distrofia Muscular de Duchenne. Ainda exemplos adicionais de doenças ou distúrbios incluem os que são a conseqüência de defeitos na degradação de lipídeos e esfingolipídeos, degradação de mucopolissacarídeos, degradação de glicoproteínas, leucodistrofias, etc.

[00130] As versões funcionais das proteínas defeituosas de qual- quer uma das doenças ou distúrbios proporcionados aqui, neste re- querimento de patente, podem ser codificadas pelo transgene de um vetor de transferência viral da terapia genética e também são conside- radas proteínas terapêuticas. Segue-se que as proteínas terapêuticas também incluem Miofosforilase, glucocerebrosidase, receptor do fator de crescimento de fibroblastos 3, huntingtina, proteína HFE, CFTR,

frataxina, VMD2, hemoglobina, fenilalanina hidroxilase, fibrilina, proteí- na quinase da distrofia miotônica, lignoceroil-CoA ligase, distrofina, proteína de ligação a metilCpG 2, Beta hemoglobina, Miotubularina, Catepsina A, Fator IX, Lipoproteína lipase, Beta galactosidase, Orniti- na Transcarbamilase, Iduronato-2-Sulfatase, Ácido -Alfa Glucosidase, UDP-glucuronosiltransferase 1-1, GlcNAc-1-fosfotransferase, GlcNAc- 1-fosfotransferase, Mucolipina-1, proteína de transferência de triglice- rídeos microssômicos, Esfingomielinase, ceramidase ácida, ácido li- pase lisossômica, Alfa-L-iduronidase, Heparano N-sulfatase, alfa-N- acetilglucosaminidase, acetil-CoA alfa-glucosaminida acetiltransferase, N-acetilglucosamina 6-sulfatase, N-acetilgalactosamina-6 sulfatase, Alfa-manosidase, Alfa-galactosidase A, regulador transmembrana da condutância da fibrose cística, e proteínas respiratórias.

[00131] Como exemplos adicionais, proteínas terapêuticas também incluem versões funcionais de proteínas associadas com distúrbios da degradação de lipídeos e esfingolipídeos (por exemplo, - Galactosidase-1, -Hexosaminidase A, -Hexosaminidases A e B, Pro- teína Ativadora de GM2, 8-Galactosidase A, Glucocerebrosidase, Glu- cocerebrosidase, Glucocerebrosidase, Arilsulfatase A, Galactosilcera- midase, Esfingomielinase, Esfingomielinase, NPC1, HE1 proteína (De- feito de Tráfico do Colesterol), Ceramidase Ácida, Lipase Ácida Lisos- sômica); distúrbios da degradação de mucopolissacarídeos (por exemplo, L-Iduronidase, L-Iduronidase, L-Iduronidase, Iduronato Sulfa- tase, Heparano N--Sulfatase, N-Acetilglucosaminidase, Acetil-CoA- Glucosaminidase, Acetiltransferase, Acetilglucosamina-6-Sulfatase, Galactosamina-6-Sulfatase, Arilsulfatase B, Glucuronidase); distúrbios da degradação de glicoproteínas (por exemplo, Manosidase, manosi- dase, l-fucosidase, Aspartilglicosaminidase, Neuraminidase, proteína protetora lisossômica, 8-N-acetilgalactosaminidase lisossômica, 8-N- acetilgalactosaminidase lisossômica); distúrbios do lisossômico arma-

zenamento (por exemplo, Palmitoil-proteína tioesterase, no mínimo 4 subtipos, proteína da membrana lisossômica, Desconhecida, Glicose- 6-fosfatase, Glicose-6-fosfato translocase, maltase ácida, enzima De- brancher amilo-1,6 glucosidase, N-acetilglucosamina-1- fosfotransfera- se, N-acetilglucosamina-1- fosfotransferase, Gangliosídeo sialidase (neuraminidase), proteína de transporte de cistina lisossômica, proteí- na de transporte de cistina lisossômica, proteína de transporte de cisti- na lisossômica, proteína de transporte de ácido siálico Saposinas, A, B, C, D) e leucodistrofias (por exemplo, proteína de transferência de triglicerídeos microssômicos / apolipoproteína B, proteína de transfe- rência de membrana peroxissômica, Peroxinas, Aspartoacilase, Este- rol-27-hidroxlase, proteína proteolipídica, transportador ABC1, proteína de membrana do peroxissoma 3 ou fator de biogênese do peroxisso- ma 1, ácido fitânico oxidase).

[00132] Os vetores de transferência viral proporcionados aqui, nes- te requerimento de patente, podem ser usados para edição genética. Em semelhantes modalidades, o transgene do vetor de transferência viral é um transgene de edição genética. Um transgene semelhante codifica um agente ou componente que está envolvido em um proces- so de edição genética. De modo geral, um processo semelhante re- sulta em modificações de longa duração ou permanentes para o DNA genômico, tais como inserção, substituição, mutagênese ou remoção de DNA direcionada. Edição genética pode incluir a liberação de áci- dos nucleicos codificando uma sequência de DNA de interesse e in- serção da seqüência de interesse em um sítio direcionado em DNA genômico usando endonucleases. Portanto, transgenes de edição ge- nética podem compreender estes ácidos nucleicos codificando uma sequência de DNA de interesse para inserção. Em algumas modali- dades, a sequência de DNA para inserção é uma sequência de DNA codificando qualquer uma das proteínas terapêuticas proporcionadas aqui, neste requerimento de patente. Alternativamente, ou além disso, o the transgene de edição genética pode compreender ácidos nuclei- cos que codificam um ou mais componentes que, isolados ou em combinação com outros componentes, podem realizar o processo de edição genética. Os transgenes de edição genética proporconados aqui, neste requerimento de patente, podem codificar uma endonu- clease e/ou um RNA guia, etc.

[00133] Endonucleases podem criar quebras em DNA de cadeia dupla em localizações desejadas em um genoma e usar os mecanis- mos das células hospedeiras para reparar a quebra usando recombi- nação homóloga, junção de extremidades não homólogas, etc. Clas- ses de endonucleases que podem ser usadas para edição genética incluem, mas não estão limitadas a, meganucleases, nucleases de de- do de zinco (ZFNs), nucleases efetoras semelhantes a ativador de transcrição (TALENs), uma ou mais repetições palindrômicas curtas aglomeradas regularmente interespaçadas (CRISPR) e endonucleases homing. O transgene de edição genética dos vetores de transferência viral proporcionados aqui, neste requerimento de patente, pode codifi- car qualquer uma das endonucleases proporcionadas aqui, neste re- querimento de patente.

[00134] Meganucleases são caracterizadas de modo geral por sua capacidade para reconhecer e cortar sequências de DNA (~14 a 40 pares de bases). Além disso, técnicas conhecidas, tais como mutagê- nese e triabem de alta produtividade e montagem combinatorial, po- dem ser usadas para criar meganucleases habituais, onde subunida- des protéicas podem ser associadas ou fundidas. Exemplos de me- ganucleases podem ser encontrados nas Patentes U.S. Nos.

8.802.437, 8.445.251 e 8.338.157; e na Publicação de Patente U.S. Nos. 20130224863, 20110113509 e 20110033935, cujas meganuclea- ses são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00135] Uma nuclease de dedo de zinco tipicamente compreende um domínio de dedo de zinco que se ligam a um sítio alvo específico dentro de uma molécula de ácido nucleico, e um domínio ide clivagem de ácido nucleico que corta a molécula de ácido nucleico dentro de ou em proximidade ao sítio alvo ligado pelo domínio de ligação. Nuclea- ses de dedo de zinco manipuladas típicas compreendem um domínio de ligação tendo entre 3 e 6 motivos de dedo de zinco individuais e sítios alvo de ligação variando a partir de 9 pares de bases até 18 pa- res de bases de comprimento. As nucleases de dedo de zinco podem ser desenhadas para visar virtualmente qualquer seqüência desejada em uma dada molécula de ácido nucleico para clivagem. Por exem- plo, domínios de ligação de dedo de zinco com uma especificidade de- sejada podem ser desenhados combinando motivos de de dedo de zinco individuais de especificidade conhecida. A estrutura da proteína de dedo de zinco Zif268 ligada ao DNA tem informado muito do traba- lho neste campo e o conceito de obter dedos de zinco para cada um dos 64 tripletos de pares de bases possíveis e em seguida misturando e correspondendo estes dedos de zinco modulares para desenhar pro- teínas com qualquer especificidade de seqüência desejada foi descrita (Pavletich NP, Pabo CO (May 1991). "Zinc finger-DNA recognition: crystal structure of a Zif268-DNA complex at 2.1 A". Science 252 (5007): 809–17, cujo conteúdo integral é incorporado aqui, a este re- querimento de patente). Em algumas modalidades, é empregado dis- play bacteriano ou de fago para desenvolver um domínio de dedo de zinco que reconhece uma seqüência de ácido nucleico desejada, por exemplo, um sítio alvo de endonuclease desejado. Nucleases de dedo de zinco, em algumas modalidades, compreendem um domínio de li- gação de dedo de zinco e um domínio de clivagem fundido ou conju- gado de modo diverso um ao outro através de um ligante, por exem-

plo, um ligante polipeptídico. O comprimento do ligante pode determi- nar a distância do corte da seqüência de ácido nucleico ligada pelo domínio de dedo de zinco. Exemplos de nucleases de dedo de zinco podem ser enconatradas nas Patentes U.S. Nos. 8.956.828;

8.921.112; 8.846.578; 8.569.253, cujaas nucleases de dedo de zinco são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00136] Nucleases efetoras semelhantes a ativador de transcrição (TALENs) são enzimas de restrição artificiais produzidas por fusão es- pecífica de domínios de ligação ao DNA a domínios de clivagem de DNA genéricos. Os domínios de ligação ao DNA, os quais podem ser desenhados para se ligarem a qualquer sequência de DNA desejada, se originam de efetores semelhantes a ativador de transcrição (TAL), proteínas de ligação ao DNA excretadas por certas bactérias que in- fectam plantas. Efetores semelhantes a ativador de transcrição (TA- LEs) podem ser manipulados para se ligarem praticamente a qualquer sequência de DNA ou unidos juntos em arrays em combinação com um domínio de clivagem de DNA. TALENs podem ser usadas de modo similar para desenhar nucleases de dedo de zinco. Exemplos de TA- LENS podem ser encontradas na Patente U.S. No. 8.697.853; bem como na Publicação de Patente U.S. Nos. 20150118216, 20150079064, e 20140087426, cujas TALENS são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00137] O sistema CRISPR (repetições palindrômicas curtas aglo- meradas regularmente interespaçadas) / Cas também pode ser usado para edição genética. Em um sistema CRISPR / Cas, RNA guia (gRNA) é codificado genomicamente ou epissomicamente (por exem- plo, sobre um plasmídeo). O gRNA forma um complexo com uma en- donuclease, tal como a endonuclease Cas9, depois de transcrição. O complexo é em seguida guiado pela seqüência determinante de espe-

cificidade (SDS) do gRNA para uma sequência alvo de DNA, tipica- mente localizada no genoma de uma célula. Cas9 ou endonuclease Cas9 se refere a uma endonuclease guiada por RNA compreendendo uma proteína Cas9, ou um fragmento da mesma (por exemplo, uma proteína compreendendo um domínio de clivagem de DNA de Cas9 ativo ou inativo ou um domínio de clivagem de DNA parcialmente inati- vo (por exemplo, uma nicase Cas9), e/ou o domínio de ligação ao gRNA de Cas9). Cas9 reconhece um motivo curto nas sequências de repetição CRISPR (o PAM ou motivo adjacente protoespaçador) para ajudar a distinguir auto versus não-auto (self versus non-self). Se- quências e estruturas de endonuclease Cas9 são de conhecimento geral dos peritos na técnica (vide, por exemplo, "Complete genome sequence of an M1 strain of Streptococcus pyogenes." Ferretti J.J., McShan W.M., Ajdic D.J., Savic D.J., Savic G., Lyon K., Primeaux C., Sezate S., Suvorov A.N., Kenton S., Lai H.S., Lin S.P., Qian Y., Jia H.G., Najar F.Z., Ren Q., Zhu H., Song L. expand/collapse author list McLaughlin R.E., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98:4658-4663(2001); "CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III". Deltcheva E., Chylinski K., Sharma C.M., Gonzales K., Chao Y., Pirzada Z.A., Eckert M.R., Vogel J., Charpentier E., Nature 471:602-607(2011); e "A programmable dual-RNA-guided DNA endo- nuclease in adaptive bacterial immunity." Jinek M., Chylinski K., Fonfa- ra I., Hauer M., Doudna J.A., Charpentier E. Science 337:816- 821(2012)). RNAs guias únicos ("sgRNA", ou simplesmente "gNRA") podem manipulados de modo a incorporar aspectos tanto do crRNA quanto do tracrRNA em uma única espécie de RNA. Vide, por exem- plo, Jinek M., Chylinski K., Fonfara I., Hauer M., Doudna J.A., Char- pentier E. Science 337:816-821(2012).

[00138] Ortólogos de Cas9 foram descritos em várias espécies, in- cluindo, mas não limitadas a, S. pyogenes e S. thermophilus. Sequên-

cias e endonucleases Cas9 adicionais adequadas será evidentes para os versados na técnica, e as referidas sequências e endonucleases Cas9 incluem sequências Cas9 dos organismos e loci revelados em Chylinski, Rhun, and Charpentier, "The tracrRNA and Cas9 families of type II CRISPR-Cas immunity systems" (2013) RNA Biology 10:5, 726-

737. Em algumas modalidades, um transgene de edição genética co- difica um Cas9 selvagem, fragmento ou uma variante de Cas9. Uma "variante de Cas9" é qualquer proteína com uma função de Cas9 que não seja idêntica a uma endonuclease Cas9 selvagem conforme ocor- re na natureza. Em algumas modalidades, uma variante de Cas9 par- tilha homologia com uma Cas9 selvagem, ou com um fragmento da mesma. Uma variante de Cas9 em algumas modalidades tem no mí- nimo 40% de identidade de sequência com a proteína Cas9 de Strep- tococcus pyogenes ou de S. thermophilus e conserva a funcionalidade de Cas9. De maneira preferencial, a identidade de sequência é de no mínimo 90%, 95%, ou mais. De maneira mais preferencial, a identida- de de sequência é de no mínimo 98% ou 99% de identidade de se- quência. Em algumas modalidades de qualquer uma das variantes de Cas9 para uso em qualquer um dos métodos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, a identidade de sequência é identidade de seqüência de aminoácidos. As variantes de Cas9 também incluem dímeros de Cas9, proteínas de fusão de Cas9, fragmentos de Cas9, proteínas Cas9 minimizadas, variantes de Cas9 sem um domínio de clivagem, variantes de Cas9 sem um domínio de gRNA, fusões de Cas9-recombinase, fCas9, FokI-dCas9, etc. Exemplos de semelhan- tes variantes de Cas9 podem ser encontradas, por exemplo, na Publi- cação de Patente U.S. Nos. 20150071898 e 20150071899, cuja des- crição de proteínas Cas9 e variantes de Cas9 é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. As variantes de Cas9 também incluem nicases Cas9, as quais compreendem uma ou mais mutações, as quais inativam um único domínio de endonuclease em Cas9. As nicases referidas podem induzir uma única qurbra de cadeia em um ácido nucleico alvo ao contrário de uma quebra de ca- deia dupla. As variantes de Cas9 também incluem nucleases nulas Cas9, uma variante de Cas9 na qual um domínio nuclease é inativado por uma mutação. Exemplos de variantes de Cas9 adicionais e/ou métodos de identificação de variantes de Cas9 adicionais podem ser encontrados na Publicação de Patente U.S. Nos. 20140357523, 20150165054 e 20150166980, cujo conteúdo pertinente a proteínas Cas9, variantes de Cas9 e métodos de sua identificação é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00139] Ainda outros exemplos de variantes de Cas9 incluem uma forma mutante, conhecida como Cas9D10A, com somente atividade de nicase. Cas9D10A é atraente em termos de especificidade alvo quando os loci são visados por complexos de Cas9 pareados dese- nhados para gerar cortes de DNA adjacentes. Outro exemplo de uma variante de Cas9 é uma Cas9 deficiente de nuclease (dCas9). Muta- ções H840A no domínio HNH e D10A no domínio RuvC inativam a ati- vidade de clivagem, mas não impedem a ligação do DNA. Portanto, esta variante pode ser usada para visar especificamente sequências em qualquer região do genoma sem clivagem. Ao invés, por fusão com vários domínios efetores, dCas9 pode ser usada ou como uma ferra- menta de silenciamento ou de ativação genética. O transgene de edi- ção genética, em algumas modalidades, pode codificar qualquer uma das variantes de Cas9 proporcionadas aqui, neste requerimento de patente.

[00140] Métodos de uso de endonucleases programáveis por RNA, tais como Cas9, para clivagem específica do sítijo (por exemplo, para modificar um genoma) são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas sys-

tems. Science 339, 819-823 (2013); Mali, P. et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science 339, 823-826 (2013); Hwang, W.Y. et al. Efficient genome editing in zebrafish using a CRISPR-Cas system. Nature biotechnology 31, 227-229 (2013); Jinek, M. et al. RNA-programmed genome editing in human cells. eLife 2, e00471 (2013); Dicarlo, J.E. et al. Genome engineering in Saccharomyces ce- revisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic acids research (2013); Jiang, W. et al. RNA-guided editing of bacterial genomes usiong CRISPR-Cas systems. Nature biotechnology 31, 233-239 (2013)).

[00141] Endonucleases homing podem catalisar, em poucas locali- zações ou em localizações singulares, a hidrólise do DNA genômico usado para sintetizar as mesmas, deste modo transmitindo seus genes horizontalmente dentro de um hospedeiro, aumentando sua frequência de alelos. As endonucleases homing de modo geral têm longas se- quências de reconhecimento, deste modo têm baixa probabilidade de clivagem aleatória. Um alelo carrega o gene (gene de endonucleases homing +, HEG+), antes da transmissão, enquanto o outro não (HEG−), e é suscetível a clivagem enzimática. A enzima, uma vez sin- tetizada, quebra o cromossoma no alelo HEG−, iniciando uma respos- ta do sistema de reparo do DNA celular, a qual toma o padrão do oposto, usando recombinação, alelo de DNA não danificado, HEG+, que contém o gene para a endonuclease. Deste modo, o gene é copi- ado para outro alelo que inicialmente não o tinha, e é propagado direto sucessivamente. Exemplos de endonucleases homing podem ser en- contradas, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. No. 20150166969; e na Patente U.S. No. 9.005.973, cujas endonucleases homing são incorporadas aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00142] Os vetores de transferência viral proporcionados aqui, nes- te requerimento de patente, podem ser usados para modulação da ex-

pressão genética. Em semelhantes modalidades, o transgene do vetor de transferência viral é um transgene de modulação da expressão ge- nética. Um transgene semelhante codifica um modulador da expres- são genética que pode reforçar, inibir ou modular a expressão de um ou mais genes endógenos. O gene endógeno pode codificar qualquer uma das proteínas conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, contanto que a proteína seja uma proteína endógena do sujeito. Por conseguinte, o sujeito pode ser um sujeito com qualquer uma das doenças ou distúrbios proporcionados aqui, neste requeri- mento de patente, onde haveria um benefício proporcionado por mo- dulação da expressão genética.

[00143] Moduladores da expressão genética incluem proteínas de ligação ao DNA (por exemplo, fatores de transcrição artificial, tais co- mo os fatores de transcrição artificial na Publicação de Patente U.S. No. 20140296129, cujos fatores de transcrição artificial são incorpora- dos aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência; e proteína silenciadora transcricional NRF da Publicação de Patente U.S. No. 20030125286, cuja proteína silenciadora transcricional NRF é incorporada aqui, a este requerimento de patente, por meio de refe- rência) bem como RNAs terapêuticos. RNAs terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, inibidores da translação de mRNA (anti- sense), agentes de Interferência do RNA (RNAi), moléculas de RNA cataliticamente ativas (riboziymas), RNA de transferência (tRNA) e RNAs que ligam proteínas e outros ligantes moleculares (aptâmeros). Moduladores da expressão genética incluem quaisquer agentes dos precedentes e incluem ácidos nucleicos antisense, moléculas de RNAi (por exemplo, RNAs de cadeia dupla (dsRNAs), RNAs de cadeia única (ssRNAs), micro RNAs (miRNAs), RNAs interferentes curtos (siRNAs), RNAs hairpin curtos (shRNAs)) e oligonucleotídeos formadores de tri- plex (TFOs). Moduladores da expressão genética também podem in-

cluir versões modificadas de quaisquer das moléculas de RNA prece- dentes e, portanto, incluem mRNAs modificados, tais como RNAs mo- dificados quimicamente sintéticos.

[00144] O modulador da expressão genética pode ser um ácido nu- cleico antisense. Ácidos nucleicos antisense podem proporcionar a inibição direcionada da expressão genética (por exemplo, a expressão de proteína mutante, um produto genético dominantemente ativo, uma proteína associada com toxicidade ou produtos genéticos que sejam introduzidos dentro de uma célula por um agente infeccioso, tal como um vírus). Deste modo, vetores de transferência viral de modulação da expressão genética podem ser usados para o tratamento de doen- ças ou distúrbios associados com mecanismos patogenéticos domi- nante-negativos ou de ganho de função, câncer, ou infecção. O sujei- to de qualquer um dos métodos proporcionados aqui, neste requeri- mento de patente, pode ser um sujeito que tenha uma infecção viral, um distúrbio inflamatório, uma doença cardiovascular, um câncer, um distúrbio genético ou uma doença autoimune. Ácidos nucleicos anti- sense também podem interferir com o mecanismo de emenda de mRNA e interromper o processamento de mRNA celular normal. Por conseguinte, o transgene de modulação da expressão genética pode codificar elementos que interagem com proteínas do spliceossoma. Exemplos de ácidos nucleicos antisense (e constructos relacionados) podem ser encontrados, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. Nos. 20050020529 e 20050271733, cujos ácidos nucleicos antisense e constructos são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00145] O modulador da expressão genética também pode ser uma ribozima (isto é, uma molécula de RNA que pode clivar outros RNAs, tais como RNA de cadeia única). As moléculas referidas podem ser manipuladas para reconhecerem sequências de nucleotídeos especÍfi-

cas em uma molécula de RNA e a clivagem (Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1988). Por exemplo, ribozimas podem ser manipula- das de modo a que somente mRNAs com sequências complementares a um constructo contendo a ribozima sejam inativados. Tipos de ribo- zimas e como preparar constructos relacionados são conhecidos na técnica (Hasselhoff, et al., Nature, 334:585, 1988; e na Publicação de Patente U.S. No. 20050020529, cujos ensinamentos pertinentes a se- melhantes Ribozimas e métodos são incorporados aqui, a este reque- rimento de patente, por meio de referência).

[00146] O modulador da expressão genética pode ser um RNA in- terferente (RNAi). Interferência do RNA se refere ao processo de si- lenciamento genético pós-transcricional sequência-específico mediado por RNAs interferentes. De modo geral, a presença de dsRNA pode acionar uma resposta de RNAi. O RNAi tem sido estudado em uma variedade de sistemas. Fire et al., 1998, Nature, 391, 806, RNAi in C. elegans; Bahramian and Zarbl, 1999, Molecular and Cellular Biology, 19, 274-283 e Wianny and Goetz, 1999, Nature Cell Biol., 2, 70, RNAi mediated by dsRNA in mammalian systems; Hammond et al., 2000, Nature, 404, 293, RNAi in Drosophila cells; Elbashir et al., 2001, Natu- re, 411, 494, RNAi induced by introduction of duplexes of synthetic 21- nucleotide RNAs in cultured mammalian cells. O trabalho referido, jun- to com outros, proporcionou orientação quanto ao comprimento, a es- trutura, a composição química, e a sequência que são úteis na cons- trução de moléculas de RNAi de modo a mediar a atividade do RNAi. Várias publicações proporcionam exemplos de moléculas de RNAi que podem ser usadas como moduladores da expressão genética. As pu- blicações referidas incluem a Patente U.S. Nos. 8.993.530, 8.877.917,

8.293.719, 7.947.659, 7.919.473, 7.790.878, 7.737.265, 7.592.322; e a Publicação de Patente U.S. Nos. 20150197746, 20140350071, 20140315835, 20130156845 e 20100267805, cujos ensinamentos re-

lacionados aos tipos de moléculas de RNAi bem como sua produção são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência.

[00147] Aptâmeros podem ligar vários alvos de proteína e romper as interações daquelas proteínas com outras proteínas. Por conse- guinte, o modulador da expressão genética pode ser um apâmero, e o transgene de modulação da expressão genética pode codificar um apâmero semelhante. Aptâmeros podem ser selecionados por sua capacidade para prevenir a transcrição de um gene por ligação especi- ficamente aos sítios de ligação ao DNA de proteínas reguladoras. A Publicação de Patente Internacional PCT Nos. WO 98/29430 e WO 00/20040 proporciona exemplos de apâmeros que foram usados para modular a expressão genética; e a Publicação de Patente U.S. No. 20060128649 também proporciona exemplos de semelhantes apâme- ro, cujos apâmero são incorporados aqui, a este requerimento de pa- tente, por meio de referência.

[00148] Como um exemplo adicional, o modulador da expressão genética pode ser um oligômero triplex. Uma molécula semelhante pode parar a transcrição. De modo geral, isto é conhecido como a es- tratégia de triplex uma vez que o oligômero gira em torno do DNA heli- coidal duplo, formando uma hélice de três cadeias. As moléculas refe- ridas podem ser desenhadas para reconhecerem um único sítio sobre um gene escolhido (Maher, et al., Antisense Res. And Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991).

[00149] Os vetores de transferência viral proporcionados aqui, nes- te requerimento de patente, também podem ser usados para salto de éxon. Em semelhantes modalidades, o transgene do vetor de transfe- rência viral é um transgene de salto de éxon. Um transgene seme- lhante codifica um oligonucleotídeo antisense ou outro agente que po- de gerar salto de éxon. Oligonucleotídeos antisenses podem interferir com sítios de emenda ou elementos reguladores dentro de um éxon de modo a levar a proteína truncada, parcialmente funcional, apesar da presença de uma mutação genética. Adicionalmente, os oligonu- cleotídeos antisenses podem ser específicos da mutação e se ligarem a um sítio de mutação no RNA pré-mensageiro de modo a induzir salto de éxon. Oligonucleotídeos antisenses para salto de éxon são conhe- cidos na técnica e são referidos de modo geral como AONs. Os AONs incluem snRNA. Exemplos de oligonucleotídeos antisenses, métodos para desenhar os mesmos e métodos de produção relacionados po- dem ser encontrados, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. Nos. 20150225718, 20150152415, 20150140639, 20150057330, 20150045415, 20140350076, 20140350067, e 20140329762, cujos AONs bem como os métodos relacionados descritos, tais como méto- dos de desenhar e produzir os AONs, são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade.

[00150] Pode ser usado qualquer um dos métodos proporcionados aqui, neste requerimento de patente, para resultar em salto de éxon em células de um sujeito que necessite do mesmo. O sujeito pode ter qualquer doença ou distúrbio no qual salto de éxon iria proporcionar um benefício, e um oligonucleotídeo antisense pode ser desenhado com base em uma proteína apopriada (onde salto de éxon durante sua expressão seria um benefício) relacionada com uma doença ou distúr- bio semelhante. Exemplos de doença e distúrbios e proteínas relacio- nadas são proporcionados aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, o sujeito tem qualquer uma das distrofias descritas aqui, neste requerimento de pa- tente, tal como distrofia muscular (por exemplo, distrofia muscular de Duchenne). Por conseguinte, em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou composições proporcionadas aqui, neste requeri-

mento de patente, o transgene de salto de éxon codifica um oligonu- cleotídeo antisense ou outro agente que pode resultar em salto de éxon em qualquer uma das proteínas proporcionadas aqui, neste re- querimento de patente, que são associadas com qualquer uma das distrofias também proporcionadas aqui, neste requerimento de paten- te. Em algumas modalidades de qualquer um dos métodos ou compo- sições proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, o oligonu- cleotídeo antisense ou outro agente pode resultar em salto de éxon em distrofina.

[00151] A sequência de um transgene também pode incluir uma se- qüência de controle de expressão. Sequências de DNA de controle de expressão incluem promotores, reforçadores, e operadores, e de modo geral são selecionadas com base no sistema de expressão no qual o constructo de expressão deve ser utilizado. Em algumas modalidades, sequências de promotores e reforçadores são selecionadas pela ca- pacidade para aumentar a expressão genética, ao passo que sequên- cias de operadores podem ser selecionadas pela capacidade para re- gular a expressão genética. O transgene também pode incluir se- quências que facilitem, e de maneira preferencial estimuilem, a recom- binação homóloga em uma célula hospedeira. O transgene também pode incluir sequências que sejam necessárias para a replicação em uma célula hospedeira.

[00152] Exemplos de sequências de controle de expressão incluem sequências de promotores, por exemplo, o promotor do citomegaloví- rus; o promotor do vírus do sarcoma de Rous; e o promotor do do vírus símio 40; bem como quaisquer outros tipos de promotores que são re- velados em outra parte aqui, neste requerimento de patente, ou são conhecidos de modo diverso na técnica. De modo geral, promotor são ligados operativamente a montante (isto é, 5') da sequência codificante para um produto de expressão desejado. O transgene também pode incluir uma sequência de poliadenilação adequada (por exemplo, a se- quência de poliadenilação genética do hormônio do crescimento hu- mano ou SV40) ligada operacionalmente a jusante (isto é, 3') da se- quência codificante. Vetores Virais

[00153] Os vírus desenvolveram mecanismos especializadis oara transportar seus genomas para dentro das células que eles infectam; vetores virais baseados em semelhantes vírus podem ser ajustados para transduzir as células para aplicações específicas. Exemplos de vetores virais que podem ser usados conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, são conhecidos na técnica ou são descritos aqui, neste requerimento de patente. Vetores virais adequa- dos incluem, por exemplo, vetores retrovirais, vetores lentivirais, veto- res à base do vírus herpes simplex (HSV), vetores à base de adenoví- rus, vetores à base de vírus adenoassociado (AAV), e vetores quiméri- cos de AAV-adenovirais.

[00154] Os vetores de transferência viral proporcionados aqui, nes- te requerimento de patente, podem ser baseados em um retrovírus. Retrovírus é um vírus de RNA de sentido positive de cadeia única ca- paz de infectar uma ampla variedade de células hospedeiras. Depois da infecção, o genoma retroviral se integra dentro do genoma de sua célula hospedeira, usando sua própria enzima transcriptase reversa para produzir DNA a partir do genoma de seu RNA. O DNA viral é en- tão replicado junto com o DNA da célula hospedeira, o qual traduz e transcreve os genes virais e do hospedeiro. Um vetor retroviral pode ser manipulado para tornar o vírus incompetente para replicação. Deste modo, vetores retrovirais são considerados como sendo particu- larmente úteis para transferência genética estável in vivo. Exemplos de vetores retrovirais podem ser encontrados, por exemplo, na Publi- cação de Patente U.S. Nos. 20120009161, 20090118212, e

20090017543, cujos vetores virais e métodos de sua produção são incorporados por meio de referência aqui, a este requerimento de pa- tente, em sua totalidade.

[00155] Vetores lentivirais são exemplos de vetores retrovirais que podem ser usados para a produção de um vetor de transferência viral conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente. Os len- tivírus têm a capacidade de infectar células não em divisão, uma pro- priedade que constitui um método mais eficiente de um vetor de libe- ração genética (vide, por exemplo, Durand et al., Viruses. 2011 Feb; 3(2): 132–159). Exemplos de lentivírus incluem o HIV (seres huma- nos), o vírus da imunodeficiência dos símios (SIV), o vírus da imuno- deficiência felina (FIV), o vírus da anemia infecciosa equina (EIAV) e o visna vírus (lentivírus ovino). Diferentemente de outros retrovírus, os vetores à base do HIV são conhecidos por incorporarem seus genes passageiros dentro de células não em divisão. Exemplos de vetores lentivirais podem ser encontrados, por exemplo, na Publicação de Pa- tente U.S. Nos. 20150224209, 20150203870, 20140335607, 20140248306, 20090148936, e 20080254008, cujos vetores virais e métodos de sua fabricação são incorporados por meio de referência aqui, a este requerimento de patente, em sua totalidade.

[00156] Vetores virais à base do vírus do herpes simplex (HSV) também são adequados para uso conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente. Muitos vetores do HSV deficientes para re- plicação contêm uma deleção para remover um ou mais genes preco- ces intermediários para prevenir replicação. As vantagens do vetor do herpes são sua capacidade para penetrar em um estágio latente que pode resultar em expressão de DNA de longo termo, e seu grande ge- noma de DNA viral que pode acommodar DNA exógeno até 25 kb. Para uma descrição de vetores à base de HSV, vide, por exemplo, a Pat. U.S. Nos. 5.837.532, 5.846.782, 5.849.572, e 5.804.413, e os Re-

querimentos de Patente International No. WO 91/02788, WO 96/04394, WO 98/15637, e WO 99/06583, cuja descrição dos vetores virais e métodos de sua fabricação são incorporados por meio de refe- rência em sua totalidade.

[00157] Adenovírus (Ads) são vírus não envelopados que podem transferir DNA in vivo para uma variedade de diferentes tipos de célu- las alvo. O vírus pode ser tornado deficiente para replicação por dele- ção de genes selecionados requeridos para a replicação viral. A região E3 descartável e não essencial para replicação também é freqüente- mente deletada para permitir espaço adicional para um inserto de DNA maior. Vetores de transferência viral podem ser baseados em adenoví- rus. Vetores de transferência adenoviral podem ser produzidos em altos títulos e podem transferir de maneira eficaz o DNA para células em replicação e não em replicação. Diferentemente do lentivírus, o DNA adenoviral não se integra dentro do genoma e, portanto, não é replicado durante a divisão celular, ao invés, eles se replicam no nú- cleo da célula hospedeira usando o mecanismo de replicação do hos- pedeiro.

[00158] O adenovírus sobre o qual um vetor de transferência viral pode ser baseado pode ser de qualquer origem, de qualquer subgru- po, de qualquer subtipo, de mistura de subtipos, ou de qualquer soroti- po. Por exemplo, um adenovírus pode ser do subgrupo A (por exem- plo, sorotipos 12, 18, e 31), do subgrupo B (por exemplo, sorotipos 3, 7, 11, 14, 16, 21, 34, 35, e 50), do subgrupo C (por exemplo, sorotipos 1, 2, 5, e 6), do subgrupo D (por exemplo, sorotipos 8, 9, 10, 13, 15, 17, 19, 20, 22-30, 32, 33, 36-39, e 42-48), subgrupo E (por exemplo, sorotipo 4), do subgrupo F (por exemplo, sorotipos 40 e 41), de um sorogrupo não classificado (por exemplo, sorotipos 49 e 51), ou de qualquer outro sorotipo adenoviral. Os sorotipos adenovirais 1 a 51 estão disponíveis na American Type Culture Collection (ATCC, Ma-

nassas, Va.). Os adenovírus não do grupo C, e mesmo adenovírus não humanos, podem ser usados para preparar vetores adenovirais deficientes para replicação. Vetores adenovirais não do grupo C, mé- todos de produção de vetores adenovirais não do grupo C, e métodos de uso de vetores adenovirais não do grupo C são revelados, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 5.801.030, 5.837.511, e 5.849.561, e nos Requerimentos de Patente Internacional Nos. WO 97/12986 e WO 98/53087. Qualquer adenovírus, mesmo um adenovírus quimérico, pode ser usado como a fonte do genoma viral para um vetor adenovi- ral. Por exemplo, um adenovírus humano pode ser usado como a fon- te do genoma viral para um vetor adenoviral deficiente para replicação. Exemplos adicionais de vetores adenovirais podem ser encontrados na Publicação de Patente U.S. Nos. 20150093831, 20140248305, 20120283318, 20100008889, 20090175897 e 20090088398, cuja des- crição de vetores virais e métodos de sua fabricação são incorporados por meio de referência em sua totalidade.

[00159] Os vetores de transferência viral proporcionados aqui, nes- te requerimento de patente, também podem ser baseados em vírus adenoassociados (AAVs). Os vetores de AAV têm sido de particular interesse para uso em aplicações terapêuticas tais como as descritas aqui, neste requerimento de patente. AAV é um vírus de DNA, o qual não se sabe que cause doença humana. De modo geral, o AAV ne- cessita de co-infecção com um vírus auxiliar (por exemplo, um adeno- vírus ou um herpes vírus), ou expressão de genes auxiliares, para re- plicação eficiente. Os AAVs têm a capacidade de infectar de maneira estável os genomas das células hospedeiras em sítios específicos, tornando os mesmos mais previsíveis do que os retrovírus; no entanto, de modo geral, a capacidade de clonagem do vetor é de 4.9 kb. Os vetores de AAV que têm sido usados em aplicações de terapia genéti- ca de modo geral têm tido aproximadamente 96% do genoma parental deletado, de tal modo que somente as repetições terminais (ITRs), as quais contêm sinais de reconhecimento para replicação de e empaco- tamento DNA, permanecem. Para uma descrição de vetores à base de AAV, vide, por exemplo, as Pat. U.S. Nos. 8.679.837, 8.637.255,

8.409.842, 7.803.622, e 7.790.449, e a Publicação de Patente U.S. Nos. 20150065562, 20140155469, 20140037585, 20130096182, 20120100606, e 20070036757, cujos vetores virais e métodos de sua fabricação são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. Os vetores de AAV podem ser vetores de AAV recombinantes. Os vetores de AAV também podem ser vetores de AAV auto-complementares (sc), os quais são descritos, por exemplo, nas Publicações de Patente U.S. Nos. 2007/01110724 e 2004/0029106, e nas Pat. U.S. Nos. 7.465.583 e 7.186.699, cujos ve- tores e métodos de produção são aqui, a este requerimento de paten- te, incorporados por meio de referência.

[00160] O vírus adenoassociado no qual um vetor de transferência viral pode ser de qualquer sorotipo ou uma mistura de sorotipos. Soro- tipos de AAV incluem AAV1, AAV 2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, e AAV11. Por exemplo, quando o vetor de transferência viral é baseado em uma mistura de sorotipos, o vetor de transferência viral pode conter as sequências de sinal de capsídeo to- madas de um sorotipo de AAV (por exemplo, selecionado entre qual- quer um dos sorotipos de AAV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e 11) e se- quências de empacotamento de um sorotipo diferente (por exemplo, selecionado entre qualquer um dos sorotipos de AAV 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, e 11). Em algumas modalidades de qualquer um dos méto- dos ou composições proporcionadas aqui, neste requerimento de pa- tente, portanto, o vetor de AAV é um vetor de AAV 2/8. Em outras modalidades de qualquer um dos métodos ou composições proporcio- nadas aqui, neste requerimento de patente, o vetor de AAV é um vetor de AAV 2/5.

[00161] Os vetores de transferência viral proporcionados aqui, nes- te requerimento de patente, também podem ser baseados em um alfa- vírus. Alfavírus incluem o Sindbis (e VEEV) vírus, o Aura vírus, o vírus Babanki, o vírus da Floresta de Barmah, o vírus Bebaru, o vírus Ca- bassou, o vírus Chikungunya, o vírus da encefalite eqüina oriental, o vírus Everglades, o vírus Fort Morgan, o vírus Getah, o vírus Highlands J, o vírus Kyzylagach, o vírus Mayaro, o vírus Me Tri, o vírus Middel- burg, o vírus Mosso das Pedras, o vírus Mucambo, o vírus Ndumu, o vírus O'nyong-nyong, o vírus Pixuna, o vírus Rio Negro, o vírus Ross River, o vírus da doença do pâncreas do salmão, o vírus da Floresta de Semliki, o vírus do elefante marinho do Sul, o vírus Tonate, o vírus Trocara, o vírus Una, o vírus encefalite equina venezuelana, o vírus da encefalite equina ocidental, e o vírus Whataroa. De modo geral, o ge- noma de seemelhantes vírus codificam proteínas não estruturais (por exemplo, replicon) e proteínas estruturais (por exemplo, capsídeo e envelope) que podem ser traduzidas no citoplasma da célula hospe- deira. O vírus Ross River, o Sindbis vírus, o vírus da Floresta de Semliki (SFV), e o vírus da encefalie equina venezuelana (VEEV) to- dos têm sido usados para desenvolver vetores de transferência viral para liberação de transgene. Vírus pseudotipados podem ser forma- dos combinando glicoproteínas de envelope alfaviral e capsídeos re- trovirais. Exemplos de vetores alfavirais podem ser encontrados na Publicação de Patente U.S. Nos. 20150050243, 20090305344, e 20060177819; cujos vetores e métodos de sua fabricação são incorpo- rados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. Agentes Anti-IgM

[00162] Agentes anti-IgM são qualquer agente que reduz a produ- ção de IgM, por exemplo, anticorpos anti IgM. Os anticorpos anti IgM são produzidos por células B. Enquanto os anticorpos anti IgG são essencialmente produzidos em resposta a ativação de células B de- pendente de células T, os anticorpos anti IgM são essencialmente pro- duzidos em resposta a ativação de células B independente de células T, tal como ocorre em resposta a infecção com vetores virais.

[00163] Agentes anti-IgM incluem, mas não estão limitados a, anti- corpos antagonistas de IgM ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos que se ligam especificamente a CD10, CD19, CD20, CD22, CD27, CD34, CD40, CD79a, CD79b, CD123, CD179b, FLT-3, ROR1, BR3, BAFF, ou B7RP-1; agentes moduladores de IL21, por exemplo, IL-21 e antagonistas de IL-21; inibidores da tirosina quinase, por exemplo, inibidores da Syk, inibidores da BTK, inibidores da tirosina quinase da proteína SRC; inibidores da PI3K; inibidores da PKC; anta- gonistas do APRIL, por exemplo, TACI-Ig; mizoribina; tofacitinib; e te- traciclinas. Anticorpos Antagonistas de IgM

[00164] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um anticor- po antagonista de IgM ou fragmento de ligação ao antígeno do mes- mo. Em algumas modalidades, o anticorpo visa uma molécula da su- perfície celular sobre uma célula B e a ligação do anticorpo recruta o sistema imune do sujeito para atacar e destruir a célula B. Em algu- mas modalidades, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo se liga especificamente a CD10, CD19, CD20, CD22, CD27, CD34, CD40, CD79a, CD79b, CD123, CD179b, FLT-3, ROR1, BR3, BAFF, ou B7RP-1.

[00165] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti- CD10, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a CD10. Exemplos de anticorpos anti-CD10 incluem, mas não estão limitados a, J5. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti- CD27, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a CD27.

CD27 é um membro da superfamília de receptores de TNF. Em al- gumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-CD34, por exem- plo, um anticorpo que se liga especificamente a CD34. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-CD79a, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a CD79a. Em algumas modali- dades, o anticorpo é um anticorpo anti-CD79b, por exemplo, um anti- corpo que se liga especificamente a CD79b. Exemplos de anticorpos anti-CD79b incluem, mas não estão limitados a, polatuzumab vedotina. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-CD123, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a CD123. Exem- plos de anticorpos anti-CD123 incluem, mas não estão limitados a, KHK2823 e CSL362. Em algumas modalidades, o anticorpo é um an- ticorpo anti-CD179b, por exemplo, um anticorpo que se liga especifi- camente a CD179b. Em algumas modalidades, o anticorpo é um an- ticorpo anti-FLT-3, por exemplo, um anticorpo que se liga especifica- mente a FLT-3. Exemplos de anticorpos anti-FLT-3 incluem, mas não estão limitados a, sorafenib e quizartinib. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-ROR1, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a ROR1. Exemplos de anticorpos anti-ROR1 incluem, mas não estão limitados a, cirmtuzumab. Em algumas moda- lidades, o anticorpo é um anticorpo anti-BR3, por exemplo, um anticor- po que se liga especificamente a BR3. Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-B7RP-1, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a B7RP-1. Exemplos de anticorpos anti- B7RP-1 incluem, mas não estão limitados a, prezalumab.

[00166] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti- CD19, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a CD19. Exemplos de anticorpos anti-CD19 incluem, mas não estão limitados a, MOR00208 (MorphoSysAG).

[00167] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti-

CD20, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a CD20. Exemplos de anticorpos anti-CD20 incluem, mas não estão limitados a, rituximab, obinutuzumab, ocrelizumab, ofatumumab, iodo 131 tosi- tumomab (Bexxar), ibritumomab, hialuronidase/rituximab, e ibritu- momab.

[00168] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti- CD22, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a CD22. Exemplos de anticorpos anti-CD22 incluem, mas não estão limitados a, epratuzumab e moxetumomab.

[00169] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti- CD40, por exemplo, um anticorpo que se liga especificamente a CD40. Exemplos de anticorpos anti-CD40 incluem, mas não estão limitados a, ABBV-927 (Abbvie) e APX005M (Apexigen).

[00170] Em algumas modalidades, o anticorpo é um anticorpo anti- BAFF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo. BAFF, o fator de ativação de células B (estimulador de linfócitos B), é uma importan- te citocina para a geração e a manutenção de células B. BAFF tem múltiplos receptores, os quais têm um papel na transmissão de sinais para diferentes classes de células B, tais como BAFF-R, o qual é sele- tivo e importante na homeostase inicial de células B e na função T-reg e antígeno de maturação de células B (BCMA), o qual é restrito a célu- las produtoras de anticorpos e é importante para a longevidade das células do plasma. Anticorpos anti-BAFF, tais como Belimumab, po- dem incluir agentes que se ligam especificamente a BAFF. Anticorpos anti-BAFF podem interferir com a interação entre BAFF e seus recep- tores, tais como BAFF-R e BCMA (antígeno de maturação de células B). Anticorpos anti-BAFF estão disponíveis comercialmente e um peri- to na técnica vai se capaz de discernir se um determinado agente é um anticorpo anti-BAFF. Pode ser usado qualquer um dos anticorpos anti-BAFF descritos aqui, neste requerimento de patente, ou conheci-

do de modo diverso, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mes- mos, em qualquer um dos métodos proporcionados ou pode ser com- preendido em qualquer uma das composições ou kits proporcionados.

[00171] Em algumas modalidades, o anticorpo ou fragmento de li- gação ao antígeno do mesmo conforme descrito aqui, neste requeri- mento de patente, pode ligar e inibir a atividade de seu alvo no mínimo 50% (por exemplo, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% ou mais). A atividade inibitória de quaisquer dos anticorpos ou fragmentos de ligação ao an- tígeno dos mesmos descritos aqui, neste requerimento de patente, po- de ser determinada por métodos de rotina conhecidos na técnica, por exemplo, com um ELISA. Além do mais, a afinidade de ligação (ou especificidade de ligação) pode ser determinada por uma variedade de métodos incluindo diálise de equilíbrio, ligação de equilíbrio, filtração por gel, ELISA, ressonância de plasmon superficial, ou espectroscopia (por exemplo, usando um ensaio de fluorescência).

[00172] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "an- ticorpo" se refere a uma glicoproteína compreendendo no mínimo duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por li- gações de dissulfeto. Cada cadeia pesada consiste em uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui, neste requerimento de pa- tente, como HCVR ou VH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada consiste em três domínios, CH1, CH2 e CH3. Cada cadeia leve consiste em uma região variável de ca- deia leve (abreviada aqui, neste requerimento de patente, como LCVR ou VL) e uma região constante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve consiste em um domínio, CL. As regiões VH e VL podem ser adicionalmente subdivididas em regiões de hipervariabilidade, de- nominadas regiões determinantes de complementaridade (CDRs), in- terscaladas com regiões que são mais conservadas, denominadas re- giões de framework (FRs). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, arranjadas do término amino para o término carbóxi na seguiinte ordem: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. As regi- ões variáveis das cadeias pesada e leve contêm um domínio de liga- ção que interage com um antígeno. As regiões constantes dos anticor- pos podem mediar a ligação da imunoglobulina aos tecidos ou fatores do hospedeiro, incluindo várias células do sistema imune (por exem- plo, células efetoras) e o primeiro componente (C1q) do sistema do complemento clássico.

[00173] Conforme usado aqui, neste requerimento de patente, "fra- gmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo se refere a uma ou mais porções de um anticorpo que conservam a capacidade para se ligar especificamente a um antígeno. A função de ligação ao antígeno de um anticorpo pode ser realizada por fragmentos de um anticorpo de comprimento total. Exemplos de fragmentos de ligação englobados dentro do termo "fragmento de ligação ao antígeno" de um anticorpo incluem (i) um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistino nos domínios VL, VH, CL e CH1; (ii) um fragmento F(ab′)2, um frag- mento bivalente compreendendo dois um fragmentos Fab ligados por uma ponte de dissulfeto na região de articulação; (iii) um fragmento Fd consistindo nos domínios VH e CH1; (iv) um fragmento Fv consistindo nos domínios VL e VH de um único braço de um anticorpo, (v) um fra- gmento dAb (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546), o qual consiste em um domínio VH; e (vi) uma região determinante de complementari- dade isolada (CDR). Além disso, embora os dois domínios do frag- mento Fv, V e VH, sejam codificados por genes separados, podem ser unidos, usando métodos recombinantes, por um ligante sintético que permita que eles sejam produzidos como uma única cadeia de proteí- na na qual as regiões VL e VH pareiam para formar moléculas mono- valentes (conhecidas como Fv de cadeia úhnica (scFv); vide, por exemplo, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; e Huston et al.

(1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883). Os anticorpos de cadeia única referidos também se destinam a serem englobados den- tro do termo "porção de ligação ao antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpos são obtidos usando procedimentos conven- cionais, tais como procedimentos de fragmentação proteolítica, con- forme descrito em J. Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, pp 98-118 (N.Y. Academic Press 1983), o qual é por este in- corporado por meio de referência, bem como por outras técnicas de conhecimento dos versados na técnica. Os fragmentos podem ser tri- ados para utilidade da mesma maneira que são os anticorpos intactos.

[00174] Em modalidades de qualquer um dos métodos ou composi- ções ou kits proporcionados aqui, neste requerimento de patente, o anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo pode ser os produzidos por sequências manipuladas baseadas em um anticorpo ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

[00175] Exemplos de anticorpos descritos aqui, neste requerimento de patente, estão disponíveis comercialmente e uma pessoa versada na técnica vai se capaz de discernir se um determinado agente é um anticorpo CD10, CD19, CD20, CD22, CD27, CD34, CD40, CD79a, CD79b, CD123, CD179b, FLT-3, ROR1, BR3, BAFF, ou B7RP-1. Po- de ser usado qualquer um dos anticorpos descritos aqui, neste reque- rimento de patente, ou conhecido de modo diverso, ou fragmentos de ligação ao antígeno dos mesmos, em qualquer um dos métodos pro- porcionados ou pode ser compreendido em qualquer uma das compo- sições ou dos kits proporcionados. Inibidores da Tirosina Quinase

[00176] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um inibidor da tirosina quinase, por exemplo, um inibidor da syk, um inibidor da BTK, ou um inibidor da tirosina quinase da proteína SRC.

[00177] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um inibidor da syk. Exemplos de inibidores da syk incluem, mas não estão limita- dos a, fostamatinib (R788), entospletinib (GS-9973), cerdulatinib (PRT062070), TAK-659, entospletinib, e nilvadipina.

[00178] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um inibidor da BTK. Os inibidores da BTK incluem inibidor de molécula pequena da BTK, anticorpos para BTK, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da BTK. Exemplos de inibidores da BTK incluem, mas não estão limitados a, ibrutinib, AVL-292, CC-292, ONO-4059, ACP-196, PCI-32765, Acalabrutinib, GS-4059, spebrutinib, BGB-3111, e HM71224.

[00179] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um inibidor da tirosina quinase da proteína SRC. Os inibidores da SRC incluem inibidores de molécula pequena da SRC, anticorpos para SRC, e oli- gômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da SRC. Exemplos de inibidores da tirosina quinase da proteína SRC in- cluem, mas não estão limitados a, dasatinib.

[00180] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um agente anti-BAFF. Um agente anti-BAFF se refere a qualquer agente, molé- culas pequenas, anticorpos, peptídeos, ou ácidos nucleicos, que se saiba que reduz a produção, ou os níveis, ou a atividade de BAFF. Em algumas modalidades, um agente anti-BAFF é um anticorpo anti- BAFF descrito aqui, neste requerimento de patente. Exemplos de agentes anti-BAFF incluem, mas não estão limitados a, TACI-Ig e re- ceptor de BAFF solúvel.

[00181] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um inibidor da PI3K. PI3 quinases incluem, mas não estão limitadas a, PIK3CA, PIK3CB, PIK3CG, PIK3CD, PIK3R1, PIK3R2, PIK3R3, PIK3R4, PIK3R5, PIK3R6, PIK3C2A, PIK3C2B, PIK3C2G, e PIK3C3. Os inibi- dores da PI3K incluem inibidores de molécula pequena da PI3K, anti- corpos para PI3K, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da PI3K. Exemplos de inibidores da PI3K inclu- em, mas não estão limitados a, GS-1101, idelalisib, duvelisib, TGR- 1202, AMG-319, copanlisib, vortmanina, LY294002, IC486068 e IC87114 (ICOS Corporation), e GDC-0941.

[00182] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um inibidor da PKC. Os inibidores da PKC incluem inibidores de molécula peque- na da PKC, anticorpos para PKC, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão da PKC. Exemplos de inibidores da PKC incluem, mas não estão limitados a, enzastaurina.

[00183] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um antago- nista de APRIL. Os antagonistas de APRIL incluem inibidores de mo- lécula pequena de APRIL, anticorpos para APRIL, e oligômeros anti- sense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão de APRIL. Em algumas modalidades, o antagonista de APRIL é um anticorpo. Exemplos de anticorpos anti-APRIL incluem, mas não estão limitados a, BION-1301 (Aduro Biotech, Inc.) Em algumas modalidades, o agen- te anti-IgM é TACI-Ig, Atacicept.

[00184] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um agente modulador de IL-21. Exemplos de inibidores de IL-21 incluem, mas não estão limitados a, NNC0114 (NovoNordisk). Em algumas modali- dades, um agente modulador de IL-21 é um antagonista de receptor de IL-21. Os antagonistas de IL-21 incluem inibidores de molécula pequena do receptor de IL-21, anticorpos para o receptor de IL-21, e oligômeros antisense e inibidores de RNAi que reduzem a expressão do receptor de IL-21. Exemplos de inibidores do receptor de IL-21 in- cluem, mas não estão limitados a, ATR-107(Pfizer). Exemplos de an- tagonistas de IL-21 incluem, mas não estão limitados a, NNC0114 (NovoNordisk). Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é um an- tagonista de receptor de IL-21. Exemplos de antagonistas de IL-21 incluem, mas não estão limitados a ATR-107(Pfizer).

[00185] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é mizoribina.

[00186] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é tofacitinib.

[00187] Em algumas modalidades, o agente anti-IgM é uma tetraci- clina. Exemplos de tetraciclinas incluem, mas não estão limitados a, clortetraciclina, oxitetraciclina, demetilclortetraciclina, rolitetraciclina, limeciclina, clomociclina, metaciclina, doxiciclina, minociclina, e terc- butilglicilamidominociclina. Nanocarreadores Sintéticos Compreendendo um Imunossupressor

[00188] Uma ampla variedade de outros nanocarreadores sintéticos podem ser usados de acordo com a invenção. Em algumas modalida- des, os nanocarreadores sintéticos são esferas ou esferóides. Em al- gumas modalidades, os nanocarreadores sintéticos são planos ou em formato de placa. Em algumas modalidades, os nanocarreadores sin- téticos são cubos ou cúbicos. Em algumas modalidades, os nanocar- readores sintéticos são ovais ou elipses. Em algumas modalidades, os nanocarreadores sintéticos são cilindros, cones, ou pirâmides.

[00189] Em algumas modalidades, é desejável usar uma população de nanocarreadores sintéticos que seja relativamente uniforme em termos de tamanho ou formato de modo que cada nanocarreador sin- tético tenha propriedades similares. Por exemplo, no mínimo 80%, no mínimo 90%, ou no mínimo 95% dos nanocarreadores sintéticos de qualquer uma das composições ou métodos proporcionados, com ba- se no número total de nanocarreadores sintéticos, pode ser uma di- mensão mínima ou uma dimensão máxima que esteja dentro de 5%, 10%, ou 20% do diâmetro médio ou da dimensão média dos nanocar- readores sintéticos.

[00190] Os nanocarreadores sintéticos podem ser sólidos ou ocos e podem compreender uma ou mais camadas. Em algumas modalida- des, cada camada tem uma composição única e propriedades únicas em relação à outra ou outras camadas. Para dar somente um exem-

plo, os nanocarreadores sintéticos podem ter uma estrutura de núcleo / concha, em que o núcleo é uma camada (por exemplo, um núcleo polimérico) e a concha é uma segunda camada (por exemplo, uma bi- camada ou monocamada lipídica). Os nanocarreadores sintéticos po- dem compreender uma pluralidade de diferentes camadas.

[00191] Em algumas modalidades, nanocarreadores sintéticos po- dem compreender opcionalmente um ou mais lipídeos. Em algumas modalidades, um nanocarreador sintético pode compreender um lipos- soma. Em algumas modalidades, um nanocarreador sintético pode compreender uma bicamada lipídica. Em algumas modalidades, um nanocarreador sintético pode compreender uma monocamada lipídica. Em algumas modalidades, um nanocarreador sintético pode compre- ender uma micela. Em algumas modalidades, um nanocarreador sinté- tico pode compreender um núcleo compreendendo uma matriz polimé- rica circundada por uma camada lipídica (por exemplo, bicamada lipí- dica, monocamada lipídica, etc.). Em algumas modalidades, um nano- carreador sintético pode compreender um núcleo não polimérico (por exemplo, partícula de metal, ponto quântico, partícula cerâmica, partí- cula óssea, partícula viral, proteínas, ácidos nucleicos, carboidratos, etc.) circundado por uma camada lipídica (por exemplo, camada bilipí- dica, camada monolipídica, etc.).

[00192] Em outras modalidades, nanocarreadores sintéticos podem compreender partículas de metal, pontos quânticos, partículas cerâmi- cas, etc. Em algumas modalidades, um nanocarreador sintético não polimérico é um agregado de componentes não poliméricos, tal como um agregado de átomos de metal (por exemplo, átomos de ouro).

[00193] Em algumas modalidades, nanocarreadores sintéticos po- dem opcionalmente compreender uma ou mais entidades anfifílicas. Em algumas modalidades, uma entidade anfifílica pode promover a produção de nanocarreadores sintéticos com aumentada estabilidade,

aprimorada uniformidade, ou aumentada viscosidade.

Em algumas modalidades, as entidades anfifílicas podem ser associadas com a su- perfície interior de uma membrana lipídica (por exemplo, bicamada li- pídica, monocamada lipídica, etc.). Muitas entidades anfifílicas conhe- cidas na técnica são adequadas para uso na produção de nanocarrea- dores sintéticos de acordo com a presente invenção.

As entidades an- fifílicas referidas incluem, mas não estão limitadas a, fosfoglicerídeos; fosfatidilcolinas; dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC); dioleil fosfatidil eta- nolamina (DOPE); dioleiloxipropiltrietilamônio (DOTMA); dioleoilfosfati- dilcolina; colesterol; éster de colesterol; diacil glicerol; diacil glicerol succinato; difosfatidil glicerol (DPPG); hexanodecanol; alcoóis graxos tais como polietileno glicol (PEG); polioxietileno-9-lauril éter; um ácido graxo ativo de superfície, tal como ácido palmítico ou ácido oleico; áci- dos graxos; monoglicerídeos de ácidos graxos; diglicerídeos de ácidos graxos; amidas de ácidos graxos; trioleato de sorbitano (Span®85) gli- cocolato; monolaurato de sorbitano (Span®20); polissorbato 20 (Tween®20); polissorbato 60 (Tween®60); polissorbato 65 (Tween®65); polissorbato 80 (Tween®80); polissorbato 85 (Tween®85); monoestearato de polioxietileno; surfactina; um poloxâ- mero; um éster de ácido graxo de sorbitano tal como trioleato de sorbi- tano; lecitina; lisolecitina; fosfatidilserina; fosfatidilinositol; esfingomieli- na; fosfatidiletanolamina (cefalina); cardiolipina; ácido fosfatídico; ce- rebrosídeos; dicetilfosfato; dipalmitoilfosfatidil glicerol; estearilamina; dodecilamina; hexadecil-amina; acetil palmitato; glicerol ricinoleato; hexadecil esterato; isopropil miristato; tiloxapol; poli(etileno glicol)5000- fosfatidiletanolamina; poli(etileno glicol)400-monoestearato; fosfolipí- deos; detergentes sintéticos e/ou naturais tendo altas propriedades tensoativos; desoxicolatos; ciclodextrinas; sais caotrópicos; agentes de pareamento de íons; e combinações dos mesmos.

Um componente de entidade anfifílica pode ser uma mistura de diferentes entidades anfifílicas. Os versados na técnica vão reconhecer que esta é uma lista de substâncias exemplar, não abrangente, com atividade tensoa- tivo. Qualquer entidade anfifílica pode ser usada na produção dos na- nocarreadores sintéticos a serem usados de acordo com a presente invenção.

[00194] Em algumas modalidades, os nanocarreadores sintéticos podem compreender opcionalmente um ou mais carboidratos. Os car- boidratos podem ser naturais ou sintéticos. Um carboidrato pode ser um carboidrato derivatizado natural. Em determinadas modalidades, um carboidrato compreende monossacarídeo ou dissacarídeo, incluin- do, mas não limitados a, glicose, frutose, galactose, ribose, lactose, sacarose, maltose, trealose, celobiose, manose, xilose, arabinose, áci- do glucorônico, ácido galactorônico, ácido manurônico, glucosamina, galatosamina, e ácido neurâmico. Em determinadas modalidades, um carboidrato é um polissacarídeo, incluindo, mas não limitadas a, pulu- lana, celulose, celulose microcristalina, hidroxipropil metilcelulose (HPMC), hidroxicelulose (HC), metilcelulose (MC), dextrano, ciclodex- trano, glicogênio, hidroxietilamido, carrageenana, glicon, amilose, qui- tosana, N,O-carboxilmetilquitosana, algina e ácido algínico, amido, qui- tina, inulina, konjac, glucomanano, pustulano, heparina, ácido hialurô- nico, curdlan, e xantano. Em modalidades, os nanocarreadores sinté- ticos não compreendem (ou especificamente excluem) carboidratos, tais como um polissacarídeo. Em determinadas modalidades, o car- boidrato pode compreender um derivado de carboidrato tal como um álcool de açúcar, incluindo, mas não limitado a, manitol, sorbitol, xilitol, eritritol, maltitol, e lactitol.

[00195] Em algumas modalidades, os nanocarreadores sintéticos podem compreender um ou mais polímeros. Em algumas modalida- des, os nanocarreadores sintéticos compreendem um ou mais políme- ros que são um polímero plurônico não terminado com metóxi. Em algumas modalidades, no mínimo 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% (em peso / peso) dos polímeros que compõem os nanocarreadores sintéticos são polímeros plurônicos não terminados com metóxi. Em algumas modalidades, todos os po- límeros que compõem os nanocarreadores sintéticos são polímeros plurônicos não terminados com metóxi. Em algumas modalidades, os nanocarreadores sintéticos compreendem um ou mais polímeros que são um polímero não terminado com metóxi. Em algumas modalida- des, no mínimo 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% (em peso / peso) dos polímeros que compõem os nanocarreadores sintéticos são polímeros não terminados com metóxi. Em algumas modalidades, todos os polímeros que compõem os nano- carreadores sintéticos são polímeros não terminados com metóxi. Em algumas modalidades, os nanocarreadores sintéticos compreendem um ou mais polímeros que não compreendem polímero plurônico. Em algumas modalidades, no mínimo 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, ou 99% (em peso / peso) dos polímeros que compõem os nanocarreadores sintéticos não compreendem polí- mero plurônico. Em algumas modalidades, todos os polímeros que compõem os nanocarreadores sintéticos não compreendem polímero plurônico. Em algumas modalidades, um polímero semelhante pode ser circundado por uma camada de revestimento (por exemplo, lipos- soma, monocamada lipídica, micela, etc.). Em algumas modalidades, elementos dos nanocarreadores sintéticos podem ser anexados ao polímero.

[00196] Imunossupressores podem ser ligados aos nanocarreado- res sintéticos por qualquer um de uma série de métodos. De modo geral, a anexação pode ser um resultado da ligação entre os imunos- supressores e os nanocarreadores sintéticos. Esta ligação pode resul- tar nos imunossupressores serem anexados à superfície dos nanocar- readores sintéticos e/ou contidos (encapsulados) dentro dos nanocar- readores sintéticos. No entanto, em algumas modalidades, os imu- nossupressores são encapsulados pelos nanocarreadores sintéticos em consequência da estrutura dos nanocarreadores sintéticos ao invé de ligação aos nanocarreadores sintéticos. Em modalidades preferen- ciais, o nanocarreador sintético compreende um polímero conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, e os imunossu- pressores são anexados ao polímero.

[00197] Quando ocorre anexação em consequência da ligação en- tre os imunossupressores e os nanocarreadores sintéticos, a anexa- ção pode ocorrer por meio de uma porção de ligação. Uma porção de ligação pode ser qualquer porção através da qual um imunossupressor é ligado a um nanocarreador sintético. As porções referidas incluem ligações covalentes, tais como uma ligação amida ou uma ligação és- ter, bem como moléculas separadas que ligam (de modo covalente ou não covalente) o imunossupressor ao nanocarreador sintético. As mo- léculas referidas incluem ligantes ou polímeros ou uma unidade dos msmos. Por exemplo, a porção de ligação pode compreender um po- límero carregado ao qual um imunossupressor se liga eletrostatica- mente. Como outro exemplo, a porção de ligação pode compreender um polímero ou unidade do mesmo ao qual é ligada de modo covalen- te.

[00198] Em modalidades preferenciais, os nanocarreadores sintéti- cos compreendem um polímero conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente. Estes nanocarreadores sintéticos podem ser completamente poliméricos ou podem ser uma mistura de polímeros e outros materiais.

[00199] Em algumas modalidades, os polímeros de um nanocarre- ador sintético se associam para formar uma matriz polimérica. Em al- gumas destas modalidades, um componente, tal como um imunossu- pressor, pode ser associado de modo covalente com um ou mais po- límeros da matriz polimérica. Em algumas modalidades, a associação covalente é mediada por um ligante. Em algumas modalidades, um componente pode ser associado de modo não covalente com um ou mais polímeros da matriz polimérica. Por exemplo, em algumas moda- lidades, um componente pode ser encapsulado dentro de, circundado por, e/ou disperso por toda uma matriz polimérica. Alternativamente ou adicionalmente, um componente pode ser associado com um ou mais polímeros de uma matriz polimérica por interações hidrofóbicas, interações de cargas, forças de van der Waals, etc. Uma ampla varie- dade de polímeros e métodos para formar matrizes poliméricas a partir dos mesmos são conhecidos convencionalmente.

[00200] Polímeros podem ser polímeros naturais ou não naturais (sintéticos). Polímeros podem ser homopolímeros ou copolímeros compreendendo dois ou mais monômeros. Em termos de sequência, copolímeros podem ser aleatórios, em bloco, ou compreender uma combinação de sequências aleatórias e em bloco. Tipicamente, os po- límeros de acordo com a presente invenção são polímeros orgânicos.

[00201] Em algumas modalidades, o polímero compreende um poli- éster, policarbonato, poliamida, ou polieter, ou unidade dos mesmos. Em outras modalidades, o polímero compreende poli(etileno glicol) (PEG), polipropileno glicol, poli(láctico ácido), poli(glicólico ácido), po- li(lactic-co-glicólico ácido), ou uma policaprolactona, ou unidade dos mesmos. Em algumas modalidades, é preferencial que o polímero se- ja biodegradável. Portanto, nestas modalidades, é preferencial que se o polímero compreender um polieter, tal como poli(etileno glicol) ou polipropileno glicol ou unidade dos mesmos, o polímero compreende um co-polímero em bloco de um polieter e um polímero biodegradável de tal modo que o polímero é biodegradável. Em outras modalidades, o polímero não somente compreende um polieter ou unidade do mes- mo, tal como poli(etileno glicol) ou polipropileno glicol ou unidade dos mesmos.

[00202] Outros exemplos de polímeros adequados para uso na pre- sente invenção incluem, mas não estão limitados a polietilenos, poli- carbonatos (por exemplo, poli(1,3-dioxan-2ona)), polianidridos (por exemplo, poli(sebácico anidrido)), polipropilfumeratos, poliamidas (por exemplo, policaprolactama), poliacetais, poliéteres, poliésteres (por exemplo, polilactida, poliglicolida, polilactida-co-glicolida, policaprolac- tona, polihidroxiácido (por exemplo, poli(β-hidroxialcanoato))), po- li(ortoésteres), policianoacrilatos, álcoois polivinílicos, poliuretanos, po- lifosfazenos, poliacrilatos, polimetacrilatos, poliuréias, poliestirenos, e poliaminas, polilisina, copolímeros de polilisina-PEG, e po- li(etilenoimina), copolímeros de poli(etileno imina)-PEG.

[00203] Em algumas modalidades, os polímeros de acordo com a presente invenção incluem polímeros os quais tenham sido aprovados para uso em seres humanos pela agência americana de regulamenta- ção de fármacos e alimentos FDA (U.S. Food and Drug Administration) de acordo com a 21 C.F.R. § 177.2600, incluindo, mas não limitados a, poliésteres (por exemplo, ácido poliláctico, poli(láctico-co-glicólico áci- do), policaprolactona, polivalerolactona, poli(1,3-dioxan-2ona)); polia- nidridos (por exemplo, poli(sebácico anidrido)); poliéteres (por exem- plo, polietileno glicol); poliuretanos; polimetacrilatos; poliacrilatos; e policianoacrilatos.

[00204] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser hidrofí- licos. Por exemplo, os polímeros podem compreender grupos aniôni- cos (por exemplo, grupo de fosfato, grupo de sulfato, grupo de carboxi- lato); grupos catiônicos (por exemplo, grupo de amina quaternária); ou grupos polares (por exemplo, grupo de oxidrila, grupo de tiol, grupo de amina). Em algumas modalidades, um nanocarreador sintético com- preendendo uma matriz polimérica hidrofílica gera um ambiente hidro- fílico dentro do nanocarreador sintético. Em algumas modalidades, os polímeros podem ser hidrofóbicos. Em algumas modalidades, um na- nocarreador sintético compreendendo uma matriz polimérica hidrofóbi- ca gera um ambiente hidrofóbico dentro do nanocarreador sintético. A seleção da hidrofilicidade ou da hidrofobicidade do polímero pode ter um impacto sobre a natureza de materiais que são incorporados den- tro do nanocarreador sintético.

[00205] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser modifi- cados com uma ou mais porções e/ou grupos funcionais. Uma varie- dade de porções ou grupos funcionais pode ser usada de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, os polímeros podem ser modificados com polietileno glicol (PEG), com um carboidrato, e/ou com poliacetais acíclicos derivados de polissacarídeos (Papisov, 2001, ACS Symposium Series, 786:301). Determinadas modalidades podem ser produzidas usando os ensinamentos gerais da Patente US No. 5543158 para Gref et al., ou da publicação de Patente Internacional No. WO2009/051837 por Von Andrian et al.

[00206] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser modifi- cados com um lipídeo ou grupo de ácido graxo. Em algumas modali- dades, um grupo de ácido graxo pode ser um ou mais entre ácido butí- rico, caproico, caprílico, cáprico, láurico, mirístico, palmítico, esteárico, araquídico, behênico, ou lignocérico. Em algumas modalidades, um grupo de ácido graxo pode ser um ou mais entre ácido palmitoléico, oléico, vacênico, linoléico, alfa-linoléico, gama-linoléico, araquidônico, gadoléico, araquidônico, eicosapentaenoico, docosahexaenoico, ou erúcico.

[00207] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser poliés-

teres, incluindo copolímeros compreendendo unidades de ácido láctico e de ácido glicólico, tais como poli(láctico ácido-co-glicólico ácido) e poli(lactida-co-glicolida), referidas coletivamente aqui, neste requeri- mento de patente, como "PLGA"; e homopolímeros compreendendo unidades de ácido glicólico, referidas aqui, neste requerimento de pa- tente, como "PGA," e unidades de ácido láctico, tais como ácido poli-L- láctico, ácido poli-D-láctico, ácido poli-D,L-láctico, poli-L-lactida, poli-D- lactida, e poli-D,L-lactida, referidas coletivamente aqui, neste requeri- mento de patente, como "PLA". Em algumas modalidades, exemplos de poliésteres incluem, por exemplo, polidroxiácidos; copolímeros de PEG e copolímeros de lactida e glicolida (por exemplo, copolímeros PLA-PEG, copolímeros PGA-PEG, copolímeros PLGA-PEG, e deriva- dos dos mesmos. Em algumas modalidades, poliésteres incluem, por exemplo, poli(caprolactona), poli(caprolactona)-PEG copolímeros, po- li(L-lactida-co-L-lisina), poli(serina éster), poli(4-hidroxi-L-prolina éster), poli[α-(4-aminobutil)-L-glicólico ácido], e derivados dos mesmos.

[00208] Em algumas modalidades, um polímero pode ser PLGA. PLGA é um co-polímero biocompatível e biodegradável de ácido lácti- co e ácido glicólico, e várias formas de PLGA são caracterizadas pela proporção de ácido láctico : ácido glicólico. Ácido láctico pode ser L- láctico ácido, D-láctico ácido, ou D,L-láctico ácido. A taxa de degrada- ção de PLGA pode ser ajustada alterando a proporção de ácido láctico : ácido glicólico. Em algumas modalidades, o PLGA a ser usado de acordo com a presente invenção é caracterizado por uma proporção de ácido láctico : ácido glicólico de aproximadamente 85:15, aproxi- madamente 75:25, aproximadamente 60:40, aproximadamente 50:50, aproximadamente 40:60, aproximadamente 25:75, ou aproximadamen- te 15:85.

[00209] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser um ou mais polímeros acrílicos. Em determinadas modalidades, polímeros acrílicos incluem, por exemplo, copolímeros de ácido acrílico e ácido metacrílico, copolímeros de metil metacrilato, etoxietil metacrilatos, ci- anoetil metacrilato, copolímero de aminoalquil metacrilato, poli(acrílico ácido), poli(metacrílico ácido), copolímero de ácido metacrílico alqui- lamida, poli(metil metacrilato), poli(metacrílicos ácido anidrido), metil metacrilato, polimetacrilato, copolímero de poli(metil metacrilato), poli- acrilamida, copolímero de aminoalquil metacrilato, copolímero des de glicidil metacrilato, policianoacrilatos, e combinações compreendendo um ou mais dos polímeros precedentes. O polímero acrílico pode compreender copolímeros totalmente polimerizados de éstesres de ácido acrílico e metacrílico com um baixo teor de grupos de amônio quaternário.

[00210] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser políme- ros catiônicos. Em geral, polímeros catiônicos são capazes de con- densar e/ou protege cadeias de ácidos nucleicos carregadas negati- vamente. Polímeros contendo amina tais como poli(lisina) (Zauner et al., 1998, Adv. Drug Del. Rev., 30:97; e Kabanov et al., 1995, Biocon- jugate Chem., 6:7), poli(etileno imina) (PEI; Boussif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 1995, 92:7297), e poli(amidoamina) dendríme- ros (Kukowska-Latallo et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 93:4897; Tang et al., 1996, Bioconjugate Chem., 7:703; e Haensler et al., 1993, Bioconjugate Chem., 4:372) são carregados positivamente em pH fisiológico, formam pares de íons com ácidos nucleicos. Em modalidades, os nanocarreadores sintéticos podem não compreender (ou podem excluir) polímeros catiônicos.

[00211] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser poliés- teres degradáveis portando cadeias laterais catiônicas (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010; Kwon et al., 1989, Macromolecules, 22:3250; Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633; e Zhou et al., 1990, Macromo-

lecules, 23:3399). Exemplos destes poliésteres incluem poli(L-lactida- co-L-lisina) (Barrera et al., 1993, J. Am. Chem. Soc., 115:11010), po- li(serina éster) (Zhou et al., 1990, Macromolecules, 23:3399), poli(4- hidroxi-L-prolina éster) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; e Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633), e poli(4-hidroxi-L- prolina éster) (Putnam et al., 1999, Macromolecules, 32:3658; e Lim et al., 1999, J. Am. Chem. Soc., 121:5633).

[00212] As propriedades destes e de outros polímeros e métodos para a preparação dos mesmos são de conhecimento geral na técnica (vide, por exemplo, as Patentes U.S. Nos. 6.123.727; 5.804.178;

5.770.417; 5.736.372; 5.716.404; 6.095.148; 5.837.752; 5.902.599;

5.696.175; 5.514.378; 5.512.600; 5.399.665; 5.019.379; 5.010.167;

4.806.621; 4.638.045; e 4.946.929; Wang et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:9480; Lim et al., 2001, J. Am. Chem. Soc., 123:2460; Lan- ger, 2000, Acc. Chem. Res., 33:94; Langer, 1999, J. Control. Release, 62:7; e Uhrich et al., 1999, Chem. Rev., 99:3181). De modo mais geral, são descritos uma variedade de métodos para sintetizar alguns polí- meros adequados em Concise Encyclopedia of Polymer Science and Polymeric Amines and Ammonium Salts, Ed. by Goethals, Pergamon Press, 1980; Principles of Polymerization by Odian, John Wiley & Sons, Fourth Edition, 2004; Contemporary Polymer Chemistry by All- cock et al., Prentice-Hall, 1981; Deming et al., 1997, Nature, 390:386; e nas Patentes U.S. Nos. 6.506.577, 6.632.922, 6.686.446, e

6.818.732.

[00213] Em algumas modalidades, os polímeros podem ser políme- ros lineares ou ramificados. Em algumas modalidades, os polímeros podem ser dendrímeros. Em algumas modalidades, os polímeros po- dem ser substancialmente reticulados uns aos outros. Em algumas modalidades, os polímeros podem ser substancialmente livres de reti- culações. Em algumas modalidades, os polímeros podem ser usados de acordo com a presente invenção sem sofrerem uma etapa de reti- culação. Deve ser adicionalmente entendido que os nanocarreadores sintéticos podem compreender copolímeros em bloco, copolímeros de enxerto, combinações, misturas, e/ou adutos de quaisquer dos políme- ros precedentes e de outros polímeros. Os versados na técnica vão reconhecer que os polímeros listados aqui, neste requerimento de pa- tente, representam uma lista de exemplo, mas não extensiva, de polí- meros que podem ser de uso de acordo com a presente invenção.

[00214] Em algumas modalidades, nanocarreadores sintéticos não compreendem um componente polímérico. Em algumas modalidades, nanocarreadores sintéticos podem compreender partículas de metal, pontos quânticos, partículas cerâmicas, etc. Em algumas modalida- des, um nanocarreador sintético não polimérico é um agregado de componentes não poliméricos, tal como um agregado de átomos de metal (por exemplo, átomos de ouro).

[00215] Qualquer imunossupressor conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, pode ser, em algumas modalidades, acoplado a nanocarreadores sintéticos. Imunossupressores incluem, mas não estão limitados a, estatinas; inibidores do mTOR, tais como rapamicina ou um análogo da rapamicina ("rapálogo"); agentes de si- nalização do TGF-; agonistas de receptores do TGF-; inibidores da histona desacetilase (HDAC); corticosteróides; inibidores da função mitocondrial, tais ocmo rotenona; inibidores de P38; inibidores do NF- ; agonistas de receptores da adenosina; agonistes da prostaglandi- na E2; inibidores da fosfodiesterase, tais como inibidor da fosfodieste- rase 4; inibidores do proteassoma; inibidores da quinase; agonistas de receptores acoplados à proteína G; antagonistas de receptores aco- plados à proteína G; glicocorticóides; retinóides; inibidores de citoci- nas; inibidores de receptores de citocinas; ativadores de receptores de citocinas; antagonistas de receptores ativados por proliferadores do peroxissoma; agonistas de receptorers ativados por proliferadores do peroxissoma; inibidores da histona desacetilase; inibidores da calci- neurina; inibidores da fosfatase e ATPs oxidados. Imunossupressores também incluem IDO, vitamina D3, ciclosporina A, inibidores de recep- tores de hidrocarboneto de arila, resveratrol, azatiopurina, 6- mercaptopurina, aspirina, ácido niflúmico, estriol, tripolida, interleuci- nas (por exemplo, IL-1, IL-10), ciclosporina A, siRNAs visando citoci- nas ou receptores de citocinas e semelhantes.

[00216] Exemplos de inibidores do mTOR incluem rapamicina e análogos da mesma (por exemplo, CCL-779, RAD001, AP23573, C20- metalilrapamicina (C20-Marap), C16-(S)-butilsulfonamidorapamicina (C16-BSrap), C16-(S)-3-metilindolerapamicina (C16-iRap) (Bayle et al. Chemistry & Biology 2006, 13:99-107)), AZD8055, BEZ235 (NVP- BEZ235), ácido crisofânico (crisofanol), deforolimo (MK-8669), evero- limo (RAD0001), KU-0063794, PI-103, PP242, tensirolimo, e WYE-354 (disponível na Selleck, Houston, TX, EUA).

[00217] Exemplos de inibidores do NF (por exemplo, NK-) inclu- em IFRD1, 2-(1,8-naftiridin-2-il)-Fenol, ácido 5-aminosalicílico, BAY 11- 7082, BAY 11-7085, CAPE (Éster fenetílico de ácido caféico), dietilma- leato, Inibidor de IKK-2 IV, IMD 0354, lactacistina, MG-132 [Z-Leu-Leu- Leu-CHO], Inibidor da Ativação de NFκB III, Inibidor da Ativação de NF-κB II, JSH-23, partenolida, Fenilarsina Óxido (PAO), PPM-18, sal de amônio do ácido pirrolidinaditiocarbâmico, QNZ, RO 106-9920, ro- caglamida, rocaglamida AL, rocaglamida C, rocaglamida I, rocaglami- da J, rocaglaol, (R)-MG-132, salicilato de sódio, triptolida (PG490), e vedelolactona.

[00218] "Rapálogo", conforme usado aqui, neste requerimento de patente, se refere a uma molécula que é estruturalmente relacionada com (um análogo de) rapamicina (sirolimo). Exemplos de rapálogos incluem, sem limitação, tensirolimo (CCI-779), everolimo (RAD001),

ridaforolimo (AP-23573), e zotarolimo (ABT-578). Exemplos adicionais de rapálogos podem ser encontrados, por exemplo, na Publicação de Patente Internacional No. WO 1998/002441 e na Patente U.S. No.

8.455.510, cujos rapálogos são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade.

[00219] Imunossupressores adicionais são de conhecimento dos versados na técnica, e a invenção não é limitada a este respeito. Em modalidades de qualquer um dos métodos, composições ou kits pro- porcionados, o imunossupressor pode compreender qualquer um dos agentes conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente.

[00220] Composições de acordo com a invenção podem compreen- der excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tais como conservantes, tampões, salina, ou salina tamponada com fosfato. As composições podem ser produzidas usando técnicas de fabricação e composição farmacêuticas convencionais para chegar em formas de dosagem úteis. Em uma modalidade, as composições são postas em suspen- são em solução salina estéril para injeção junto com um conservante. D. MÉTODOS DE UTILIZAÇÃO E DE FABRICAÇÃO DAS COMPOSI-

ÇÕES

[00221] Vetores de transferência viral podem ser produzidos com métodos conhecidos das pessoas com conhecimento regular na técni- ca ou conforme descrito de modo diverso aqui, neste requerimento de patente. Por exemplo, vetores de transferência viral podem ser cons- truídos e/ou purificados usando os métodos estipulados, por exemplo, na Pat. U.S. No. 4.797.368 e em Laughlin et al., Gene, 23, 65-73 (1983).

[00222] Como um exemplo, vetores adenovirais deficientes de re- plicação podem ser produzidos em linhagens celulares complementa- res que proporcionam funções genéticas não presentes nos vetores adenovirais deficientes de replicação, mas requeridas para propaga-

ção viral, em níveis apropriados de modo a gerar estoque de altos títu- los de vetor de transferência viral. A linhagem celular complementar pode complementar para uma deficiência em no mínimo uma função genética essencial para replicação codificada pelas regiões iniciais, pelas regiões tardias, por regiões de embalagem viral, por regiões de RNA associado ao vírus, ou por combinações das mesmas, incluindo todas as funções adenovirais (por exemplo, para permitir a propaga- ção de amplicons adenovirais). A construção de linhagens celulares complementares envolve técnicas de biologia molecular e de cultura celular de rotina, tais como as descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2d edition, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989), e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, New York, N.Y. (1994).

[00223] Linhagens celulares complementares para produzir vetores adenovirais incluem, mas não estão limitadas a, células 293 (descritas em, por exemplo, Graham et al., J. Gen. Virol., 36, 59-72 (1977)), célu- las PER.C6 (descritas, por exemplo, no Requerimento de Patente In- ternacional No. WO 97/00326, e nas Pat. U.S. Nos. 5.994.128 e

6.033.908), e células 293-ORF6 (descritas, por exemplo, no Requeri- mento de Patente Internacional No. WO 95/34671 e Brough et al., J. Virol., 71, 9206-9213 (1997)). Em alguns casos, a célula complemen- tar não vai complementar para todas as funções genéticas adenovirais requeridas. Vírus auxiliar pode ser empregado para proporcionar as funções genéticas em trans que não são codificadas pelos genomas celulares ou adenovirais para permitir a replicação do vetor adenoviral. Vetores adenovirais podem ser construídos, propagados, e/ou purifi- cados usando os materiais e métodos estipulados, por exemplo, nas Pat. U.S. Nos. 5.965.358, 5.994.128, 6.033.908, 6.168.941, 6.329.200,

6.383.795, 6.440.728, 6.447.995, e 6.475.757, na Publicação do Re-

querimento de Patente U.S. No. 2002/0034735 A1, e nos Requerimen- tos de Patente Internacional No. WO 98/53087, WO 98/56937, WO 99/15686, WO 99/54441, WO 00/12765, WO 01/77304, e WO 02/29388, bem como as outras referências identificadas aqui, neste requerimento de patente. Vetores adenovirais não do grupo C, inclu- indo vetores adenovirais do sorotipo 35, podem ser produzidos usando os métodos estipulados em, por exemplo, Pat. U.S. Nos. 5.837.511 e

5.849.561, e nos Requerimentos de Patente Internacional Nos. WO 97/12986 e WO 98/53087.

[00224] Vetores de AAV podem ser produzidos usando métodos recombinantes. Tipicamente, os métodos envolvem a cultura de uma célula hospedeira a qual contém uma seqüência de ácido nucleico co- dificando uma proteína do capsídeo do AAV ou fragmento da mesma; um gene de rep funcional; um vetor de AAV recombinante composto de repetições de terminal invertido (ITRs) do AAV e um transgene; e funções auxiliares suficientes para permitir o empacotamento do vetor de AAV recombinante dentro das proteínas do capsídeo do AAV. Em algumas modalidades, o vetor de transferência viral pode compreender repetições de terminal invertido (ITR) de sorotipos do AAV seleciona- dos entre o grupo que consiste em: AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, AAV11 e variantes dos mesmos.

[00225] Os componentes a serem cultivados na célula hospedeira para empacotar um vetor de rAAV em um capsídeo do AAV podem ser proporcionados para a célula hospedeira em trans. Alternativamente, qualquer um ou mais dos componentes requeridos (por exemplo, vetor de AAV recombinante, sequências rep, sequências cap, e/ou funções auxiliares) podem ser proporcionados por uma célula hospedeira está- vel a qual tenha sido manipulada para conter um ou mais dos compo- nentes requeridos usando métodos de conhecimento dos versados na técnica. Mais convenientemente, uma célula hospedeira estável se-

melhante pode conter o um ou mais componentes requeridos sob o controle de um promotor indutível. No entanto, o um ou mais compo- nentes requeridos podem estar sob o controle de um promotor consti- tutivo. O vetor de AAV recombinante, sequências rep, sequências cap, e funções auxiliares requeridos para a produção do rAAV da in- venção podem ser liberados para a célula hospedeira de empacota- mento usando qualquer elemento genético apropriado. O elemento genético selecionado pode ser liberado por qualquer método adequa- do, incluindo os descritos aqui, neste requerimento de patente. Méto- dos usados para construir qualquer modalidade desta invenção são de conhecimento das pessoas versadas na manipulação de ácido nuclei- co e incluem engenharia genética, engenharia recombinante, e técni- cas sintéticas. Vide, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. De modo similar, métodos de gerar vírions de rAAV são de co- nhecimento geral e a seleção de um método adequado não é uma limi- tação da presente invenção. Vide, por exemplo, K. Fisher et al, J. Vi- rol., 70:520-532 (1993) e a Pat. U.S. No. 5.478.745.

[00226] Em algumas modalidades, vetores de AAV recombinantes podem ser produzidos usando o método de tripla transfecção (por exemplo, conforme descrito em detalhes na Pat. U.S. No. 6.001.650, cujo conteúdo relativo ao método de tripla transfecção é incorporado aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência). Tipi- camente, os AAVs recombinantes são produzidos por transfecção de uma célula hospedeira com um vetor de AAV recombinante (compre- endendo um transgene) a ser empacotado dentro das partículas do AAV, um vetor de função auxiliar do AAV, e um vetor de função aces- sória. De modo geral, um vector de função auxiliar do AAV codifica sequências de função auxiliar do AAV (rep e cap), as quais funcionam em trans para replicação de AAV produtiva e encapsidação. De ma-

neira preferencial, o vetor de função auxiliar do AAV suporta eficiente produção de vetor de AAV sem gerar quaisquer vírions de AAV selva- gens detectáveis (isto é, vírions de AAV contendo genes rep e cap funcionais). O vetor de função acessória pode codificar sequências de nucleotídeos para funções virais e/ou celulares não derivadas de AAV das quais o AAV é dependente para replicação. As funções acessó- rias incluem as funções requeridas para replicação do AAV, incluindo, sem limitação, as porções envolvidas na ativação da transcrição gené- tica do AAV, emenda de mRNA do AAV estágio específica, replicação do DNA do AAV, síntese de produtos de expressão de cap, e monta- gem do capsídeo do AAV. Funções acessórias de base viral podem ser derivadas de qualquer um dos vírus auxiliares conhecidos, tais como adenovírus, herpes vírus (diferentes do herpes simplex vírus tipo 1), e vírus vaccinia.

[00227] Vetores lentivirais podem ser produzidos usando qualquer um de uma série de métodos conhecidos na técnica. Exemplos de vetores lentivirais e/ou métodos de sua produção podem ser encontra- dos, por exemplo, na Publicação de Patente U.S. Nos. 20150224209, 20150203870, 20140335607, 20140248306, 20090148936, e 20080254008, os vetores lentivirais e métodos de produção referidos são incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência. Como um exemplo, quando o vetor lentiviral é incompeten- te para integração, o genoma lentiviral adicionalmente compreende uma origem de replicação (ori), cuja sequência é dependente da natu- reza das células onde o genoma lentiviral deve ser expresso. A origem de replicação referida pode ser de origem eucariótica, de maneira pre- ferencial de origem de mamífero, de maneira mais preferencial de ori- gem humana. Como o genoma lentiviral não se integra dentro do ge- noma da célula hospedeira (devido à integrase defeituosa), o genoma lentiviral pode ser perdido nas células sofrendo frequentes divisões celulares; este é particularmente o caso em células imunes, tais como células B ou T. A presença de uma origem de replicação pode ser be- néfica em alguns casos. Partículas de vetor podem ser produzidas de- pois de transfecção de células apropriadas, tais como células T 293, pelos referidos plasmídeos, ou por outros processos. Nas células usa- das para a expressão das partículas lentivirais, todos ou alguns dos plasmídeos podem ser usados para expressar de maneira estável seus polinucleotídeos codificantes, ou para expressar de maneira tran- sitória ou semi-estável seus polinucleotídeos codificantes.

[00228] Métodos para produção de outros vetores virais conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente, são conhecidos na técnica e podem ser similares aos métodos exemplificados acima. Além disso, vetores virais estão disponíveis comercialmente.

[00229] Em modalidades, ao preparar certos nanocarreadores sin- téticos compreendendo um imunossupressor, podem ser úteis méto- dos para anexação de um imunossupressor a nanocarreadores sintéti- cos.

[00230] Em determinadas modalidades, a anexação pode ser um ligante covalente. Em modalidades, imunossupressores de acordo com a invenção podem ser anexados de modo covalente à superfície externa através de um ligante de 1,2,3-triazol formado pela reação de cicloadição 1,3-dipolar de grupos azido com imunossupressor conten- do um grupo alquina ou pela reação de cicloadição 1,3-dipolar de al- quinas com imunossupressores contendo um grupo azido. As reações de cicloadição referidas são realizadas de maneira preferencial na presença de um catalisador de Cu(I) junto com um ligante de Cu(I) adequado e um agente redutor para reduzir o composto Cu(II) para o composto Cu(I) catalítico ativo. Esta cicloadição de azida-alquina ca- talisada por Cu(I) (CuAAC) também pode ser referida como a reação de click.

[00231] Adicionalmente, ligação covalente pode compreender um ligante covalente que compreenda um ligante de amida, um ligante de dissulfeto, um ligante de tioéter, um ligante de hidrazona, um ligante de hidrazida, um ligante de imina ou oxima, um ligante de uréia ou ti- ouréia, um ligante de amidina, um ligante de amina, e um ligante de sulfonamida.

[00232] Um ligante de amida é formado através de uma ligação de amida entre uma amina sobre um componente tal como um imunossu- pressor com o grupo de ácido carboxílico de um segundo componente tal como o nanocarreador. A ligação de amida no ligante pode ser produzida usando qualquer uma das reações de formação de ligação de amida convencionais com aminoácidos convenientemente protegi- dos e ácido carboxílico ativado tal como éster ativado por N- hidroxissuccinimida.

[00233] Um ligante de dissulfeto é produzido através da formação de uma ligação de dissulfeto (S-S) entre dois átomos de enxofre da forma, por exemplo, de R1-S-S-R2. Uma ligação de dissulfeto pode ser formada por permuta de tiol de um componente contendo grupo de tiol / mercaptano (-SH) com outro grupo de tiol ativado ou um compo- nente contendo grupos tiol / mercaptano com um componente conten- do grupo de tiol ativado.

[00234] Um ligante de triazol, especificamente um 1,2,3-triazol da form a , em que R1 e R2 podem ser quaisquer entidades quími- cas, é produzido pela reação de cicloadição 1,3-dipolar de uma azida anexada a um primeirio componente com uma alquina terminal anexa- da a um segundo componente tal como o imunossupressor. A reação de cicloadição 1,3-dipolar é realizada com ou sem um catalisador, de maneira preferencial com catalisador de Cu(I), o qual liga os dois com-

ponentes através de uma função 1,2,3-triazol. Esta química é descrita em detalhes por Sharpless et al., Angew. Chem. Int. Ed. 41(14), 2596, (2002) e Meldal, et al, Chem. Rev., 2008, 108(8), 2952-3015 e é fre- quentemente referida como uma reação de "click" ou CuAAC.

[00235] Um ligante de tioéter é produzido pela formação de uma ligação de enxofre-carbono (tioéter) sob a forma, por exemplo, de R1- S-R2. Tioéter pode ser produzido ou por alquilação de um grupo de tiol / mercaptano (-SH) sobre um componente com um grupo de alqui- lação tal como haleto ou epóxido sobre um segundo componente. Li- gantes de tioéter também podem ser formados por adição de Michael de um grupo de tiol / mercaptano sobre um componente a um grupo de alqueno deficiente de elétrons sobre um segundo componente con- tendo um grupo de maleimida ou um grupo de vinil sulfona como o aceitador de Michael. De outro modo, ligantes de tioéter podem ser preparados pela reação de radical tiol-eno de um grupo de tiol / mer- captano sobre um componente com um grupo de alqueno sobre um segundo componente.

[00236] Um ligante de hidrazona é produzido pela reação de um grupo de hidrazida sobre um componente com um grupo de aldeído / cetona sobre o segundo componente.

[00237] Um ligante de hidrazida é formado pela reação de um grupo de hidrazina sobre um componente com um grupo de ácido carboxílico sobre o segundo componente. A reação referida é realizada de modo geral usando química similar à formação da ligação de amida onde o ácido carboxílico é ativado com um reagente de ativação.

[00238] Um ligante de imina ou oxima é formado pela reação de um grupo de amina ou N-alcoxiamina (ou aminoóxi) sobre um componente com um grupo de aldeído ou cetona sobre o segundo componente.

[00239] Um ligante de uréia ou tiouréia é preparado pela reação de um grupo de amina sobre um componente com um grupo de isociana-

to ou tioisocianato sobre o segundo componente.

[00240] Um ligante de amidina é preparado pela reação de um gru- po de amina sobre um componente com um grupo de imidoéster sobre o segundo componente.

[00241] Um ligante de amina é produzido pela reação de alquilação de um grupo de amina sobre um componente com um grupo alquilante tal como haleto, epóxido, ou grupo de éster de sulfonato sobre o se- gundo componente. Alternativamente, um ligante de amina também pode ser produzido por aminação redutiva de um grupo de amina so- bre um componente com um grupo de aldeído ou cetona sobre o se- gundo componente com um reagente redutor adequado tal como cia- noboridreto de sódio ou triacetoxiboridreto de sódio.

[00242] Um ligante de sulfonamida é produzido pela reação de um grupo de amina sobre um componente com um grupo de sulfonil hale- to (tal como sulfonil cloreto) sobre o segundo componente.

[00243] Um ligante de sulfona é produzido por adição de Michael de um nucleófilo a uma vinil sulfona. Ou a vinil sulfona ou o nucleófilo pode estar sobre a superfície do nanocarreador ou anexado a um componente.

[00244] O componente também pode ser conjugado através de mé- todos de conjugação não covalente. Por exemplo, um imunossupres- sor de carga negativa pode ser conjugado a um componente de carga positiva através de adsorção eletrostática. Um componente contedo um ligante metálico também pode ser conjugado a um complexo metá- lico através de um complexo de metal-ligante.

[00245] Em modalidades, o componente pode ser anexado a um polímero, por exemplo, ácido poliláctico-bloco-polietileno glicol, antes da montagem de um nanocarreador sintético ou o nanocarreador sin- tético pode ser formado com grupos reativos ou ativáveis sobre sua superfície. No último caso, o componente pode ser preparado com um grupo o qual seja compatível com a química de anexação que seja apresentada pela superfície dos nanocarreadores sintéticos. Em ou- tras modalidades, um componente peptídico pode ser anexado a VLPs ou lipossomas usando um ligante adequado. Um ligante é um compos- to ou reagente que seja capaz de ligar duas moléculas juntas. Em uma modalidade, o ligante pode ser um reagente homobifuncional ou heterobifuncional conforme descrito em Hermanson 2008. Por exem- plo, um nanocarreador sintético de VLP ou de lipossomas contendo um grupo carboxílico sobre a superfície pode ser tratado com um li- gante homo-bifuncional, di-hidrazida adípica (ADH), na presença de EDC para formar o nanocarreador sintético correspondente com o li- gante de ADH. O nanocarreador sintético ligado ADH resultante é em seguida conjugado com um componente peptídico contendo um grupo ácido através da outra extremidade do ligante de ADH sobre o nano- carreador para produzir o conjugado peptídico de VLP ou lipossoma correspondente.

[00246] Em modalidades, é preparado um polímero contendo um grupo de azida ou alquina, terminal à cadeia polimérica. Este polímero é usado em seguida para preparar um nanocarreador sintético em uma maneira tal que uma pluralidade dos grupos de alquina ou azida são posicionados sobre a superfície daquele nanocarreador. Alternati- vamente, o nanocarreador sintético pode ser preparado por outra via, e subsequentemente funcionalizado com grupos de alquina ou azida. O componente é preparado com a presença ou de um grupo de alqui- na (se o polímero contiver uma azida) ou de azida (se o polímero con- tiver uma alquina). O componente é em seguida deixado para reagir com o nanocarreador por meio da reação de cicloadição 1,3-dipolar com ou sem um catalisador o qual anexa de maneira covalente o componente à partícula através do ligante de 1,2,3-triazol 1,4-di- substituído.

[00247] Se o componente for uma molécula pequena, pode ser van- tajoso anexar o componente a um polímero antes da montagem de nanocarreadores sintéticos. Em modalidades, também pode ser vanta- joso preparar os nanocarreadores sintéticos com grupos superficiais que sejam usados para anexar o componente ao nanocarreador sinté- tico através do uso destes grupos superficiais ao invés de anexação do componente a um polímero e em seguida usando este conjugado polimérico na construção de nanocarreadores sintéticos.

[00248] Para descrições detalhadas de métodos de conjugação disponíveis, vide Hermanson G T "Bioconjugate Techniques", 2nd Edi- tion Published by Academic Press, Inc., 2008. Além de anexação co- valente, o componente pode ser anexado por adsorção a um nanocar- reador sintético pré-formado ou pode ser anexado por encapsulação durante a formação do nanocarreador sintético.

[00249] Nanocarreadores sintéticos podem ser preparados usando uma ampla variedade de métodos conhecidos na técnica. Por exem- plo, nanocarreadores sintéticos podem ser formados por métodos tais como nanoprecipitação, focalização de fluxo usando canais fluídicos, secagem por pulverização, evaporação de solvente de emulsão única e dupla, extração de solvente, separação de fases, moagem, procedi- mentos de microemulsão, microfabricação, nanofabricação, camadas sacrificiais, coacervação simples e complexa, e outros métodos de co- nhecimento geral das pessoas com conhecimento regular na técnica. Alternativamente ou adicionalmente, foram descritas sínteses de sol- ventes aquosos e orgânicos para semicondutor monodisperso, condu- tor, magnético, orgânico, e outros nanomateriais (Pellegrino et al., 2005, Small, 1:48; Murray et al., 2000, Ann. Rev. Mat. Sci., 30:545; e Trindade et al., 2001, Chem. Mat., 13:3843). Métodos adicionais fo- ram descritos na literatura (vide, por exemplo, Doubrow, Ed., "Micro- capsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press,

Boca Raton, 1992; Mathiowitz et al., 1987, J. Control. Release, 5:13; Mathiowitz et al., 1987, Reactive Polymers, 6:275; e Mathiowitz et al., 1988, J. Appl. Polymer Sci., 35:755; Patentes US Nos. 5.578.325 e

6.007.845; P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Nanopar- ticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Particles" Na- nomedicine. 5(6):843-853 (2010)).

[00250] Os materiais podem ser encapsulados dentro de nanocar- readores sintéticos conforme desejável usando uma variedade de mé- todos incluindo, mas não limitados a, C. Astete et al., "Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles" J. Biomater. Sci. Polymer Edn, Vol. 17, No. 3, pp. 247–289 (2006); K. Avgoustakis "Pegylated Poly(Lactide) e Poly(Lactide-Co-Glycolide) Nanoparticles: Preparation, Properties e Possible Applications in Drug Delivery" Current Drug Deli- very 1:321-333 (2004); C. Reis et al., "Nanoencapsulation I. Methods for preparation of drug-loaded polymer nanoparticles" Nanomedicine 2:8– 21 (2006); P. Paolicelli et al., "Surface-modified PLGA-based Na- noparticles that can Efficiently Associate and Deliver Virus-like Parti- cles" Nanomedicine. 5(6):843-853 (2010). Podem ser usados outros métodos adequados para a encapsulação de materiais dentro de na- nocarreadores sintéticos, incluindo sem limitação os métodos revela- dos na Patente dos Estados Unidos No. 6.632.671 para Unger emitida em 14 de outubro de 2003.

[00251] Em determinadas modalidades, nanocarreadores sintéticos são preparados por um processo de nanoprecipitação ou secagem por pulverização. As condições usadas na preparação de nanocarreadores sintéticos podem ser alteradas para produzir partículas de um tamanho desejado ou de uma propriedade desejada (por exemplo, hidrofobici- dade, hidrofilicidade, morfologia externa, "viscosidade", formato, etc.). O método de preparação dos nanocarreadores sintéticos e as condi- ções (por exemplo, solvente, temperatura, concentração, taxa de fluxo de ar, etc.) usadas podem depender dos materiais a serem anexados aos nanocarreadores sintéticos e/ou à composição da matriz poliméri- ca.

[00252] Se os nanocarreadores sintéticos preparados por quaisquer dos métodos acima tiverem uma faixa de tamanho fora da faixa dese- jada, nanocarreadores sintéticos podem ser dimensionados, por exemplo, usando uma peneira.

[00253] Elementos dos nanocarreadores sintéticos podem ser ane- xados ao nanocarreador sintético total, por exemplo, por uma ou mais ligações covalentes, ou podem ser anexados por meio de um ou mais ligantes. Métodos adicionais de funcionalização de nanocarreadores sintéticos podem ser adaptados do Requerimento de Patente US Pu- blicado No. 2006/0002852 para Saltzman et al., do Requerimento de Patente US Publicado No. 2009/0028910 para DeSimone et al., ou do Requerimento de Patente Internacional Publicado No. WO/2008/127532 A1 para Murthy et al.

[00254] Alternativamente ou adicionalmente, nanocarreadores sin- téticos podem ser anexados a componentes diretamente ou indireta- mente por meio de interações não covalentes. Em modalidades não covalentes, a anexação não covalente é mediada por interações não covalentes incluindo, mas não limitadas a, interações de carga, intera- ções por afinidade, coordenação de metais, adsorção física, interações parasita-hospedeiro, interações hidrofóbicas, Interações de empilha- mento TT, interações de ligação de hidrogênio, interações de van der Waals, interações magnéticas, interações eletrostáticas, interações dipolo-dipolo, e/ou combinações das mesmas. As anexações referidas podem ser arranjadas para serem sobre uma superfície externa ou so- bre uma superfície interna de um nanocarreador sintético. Em moda- lidades, encapsulação e/ou absorção é uma forma de anexação.

[00255] As composições proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, podem compreender tampões inorgânicos ou orgânicos (por exemplo, sais de sódio ou potássio de fosfato, carbonato, acetato, ou citrato) e agentes de ajuste de pH (por exemplo, ácido clorídrico, hidróxido de sódio ou potássio, sais de citrato ou acetato, aminoácidos e seus sais), antioxidantes (por exemplo, ácido ascórbico, alfa- tocoferol), tensoativos (por exemplo, polissorbato 20, polissorbato 80, polioxietileno 9-10 nonil fenol, dessoxicolato de sódio), solução e/ou crio / lio estabilizantes (por exemplo, sacarose, lactose, manitol, trealo- se), agentes de ajuste osmótico (por exemplo, sais ou açúcares), agentes antibacterianos (por exemplo, ácido benzoico, fenol, gentami- cina), agentes antiespumantes (por exemplo, polidimetilsilozona), con- servantes (por exemplo, timerosal, 2-fenoxietanol, EDTA), estabilizan- tes poliméricos e agentes de ajuste da viscosidade (por exemplo, poli- vinilpirrolidona, poloxâmero 488, carboximetilcelulose) e cossolventes (por exemplo, glicerol, polietileno glicol, etanol).

[00256] As composições de acordo com a invenção podem com- preender excipientes farmaceuticamente aceitáveis. As composições podem ser produzidas usando técnicas convencionais de fabricação farmacêutica e de composição de modo a chegar a formas de dosa- gem úteis. Técnicas adequadas para uso na prática da presente in- venção podem ser encontradas em Handbook of Industrial Mixing: Science and Practice, Edited by Edward L. Paul, Victor A. Atiemo- Obeng, e Suzanne M. Kresta, 2004 John Wiley & Sons, Inc.; e Phar- maceutics: The Science of Dosage Form Design, 2nd Ed. Edited by M. E. Auten, 2001, Churchill Livingstone. Em uma modalidade, as com- posições são suspensas em solução salina estéril para injeção com um conservante.

[00257] Deve ser entendido que as composições da invenção po- dem ser produzidas em qualquer maneira adequada, e a invenção não é de modo alguma limitada a composições que possam ser produzidas usando os métodos descritos aqui, neste requerimento de patente. A seleção de um método apropriado de fabricação pode requerer a aten- ção às propriedades das porções particulares sendo associadas.

[00258] Em algumas modalidades, as composições são fabricadas sob condições estéreis ou são esterilizadas terminalmente. Isto pode assegurar que as composições resultantes são estéreis e não infecci- osas, deste modo melhorando a segurança quando comparadas com composições não estéreis. Isto proporciona uma medida de segurança valiosa, especialmente quando os sujeitos que recebem as composi- ções têm defeitos imunes, estão sofrendo de infecção, e/ou são susce- tíveis a infecção.

[00259] A administração de acordo com a presente invenção pode ser por uma variedade de vias, incluindo, mas não limitadas a, vias intravenosa e intraperitoneal. As composições referidas aqui, neste requerimento de patente, podem ser fabricadas e preparadas para administração, em algumas modalidades administração concomitante, usando métodos convencionais.

[00260] As composições da invenção podem ser administradas em quantidades eficazes, tais como as quantidades eficazes descritas em outras partes aqui, neste requerimento de patente. Em algumas mo- dalidades, os vetores de transferência viral e/ou nanocarreadores sin- téticos compreendendo um imunossupressor e/ou agente anti-IgM es- tão presentes em formas de dosagem em uma quantidade eficaz para atenuar uma resposta imune antivetor de transferência viral, tal como uma resposta de IgM, e/ou permitir a readministração de um vetor de transferência viral a um sujeito e/ou aumentar a expressão transgênica do vetor de transferência viral. Formas de dosagem podem ser admi- nistradas em uma variedade de frequências. Em algumas modalida- des, é empreendida a administração repetida de um vetor de transfe- rência viral com nanocarreadores sintéticos compreendendo um imu-

nossupressor e um agente anti-IgM.

[00261] Aspectos da invenção se referem à determinação de um protocolo para os métodos de administração conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente. Um protocolo pode ser determi- nado variando no mínimo a frequência, a quantidade de dosagem do vetor de transferência viral, dos nanocarreadores sintéticos compreen- dendo um imunossupressor e/ou do agente anti-IgM e subseqüente- mente avaliando uma resposta imune desejada ou indesejada. Um protocolo preferencial para a prática da invenção atenua uma resposta imune contra o vetor de transferência viral, tal como uma resposta de IgM e/ou atenua outra resposta imune indesejada contra o vetor de transferência viral e/ou incrementa a expressão transgênica. O proto- colo pode compreender no mínimo a freqüência da administração e das doses do vetor de transferência viral, nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor e agente anti-IgM em algumas modalidades.

[00262] Outro aspecto da inveção se refere a kits. Em algumas modalidades, o kit compreende qualquer uma ou mais das composi- ções proporcionadas aqui, neste requerimento de patente, ou qualquer uma das combinações das composições proporcionadas aqui, neste requerimento de patente. Em algumas modalidades, o kit compreende uma ou mais composições compreendendo um vetor de transferência viral e/ou uma ou mais composições compreendendo nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor e/ou uma ou mais composições compreendendo um agente anti-IgM. De maneira prefe- rencial, a uma ou mais composições estão em uma quantidade para proporcionar qualquer uma ou mais doses conforme proporcionado aqui, neste requerimento de patente. A uma ou mais composições podem estar em um recipiente ou em mais de um recipiente no kit. Em algumas modalidades de qualquer um dos kits proporcionados, o recipiente é um frasco ou uma ampola. Em algumas modalidades de qualquer um dos kits proporcionados, a uma ou mais composições es- tão em forma liofilizada cada uma dentro de um recipiente separado ou dentro do mesmo recipiente, de tal modo a que possam ser reconstitu- íddas em um momento subsequente. Em algumas modalidades de qualquer um dos kits proporcionados, o kit adicionalmente compreen- de instruções para reconstituição, mistura, administração, etc. Em al- gumas modalidades de qualquer um dos kits proporcionados, as ins- truções incluem uma descrição de qualquer um dos métodos descritos aqui, neste requerimento de patente. As instruções podem estar em qualquer forma adequada, por exemplo, como um suplemento impres- so ou um rótulo. Em algumas modalidades de qualquer um dos kits proporcionados aqui, neste requerimento de patente, o kit adicional- mente compreende uma ou mais seringas ou outro(s) dispositivo(s) que possam liberar a uma ou mais composições in vivo a um sujeito.

EXEMPLOS Exemplo 1: Nanocarreadores Sintéticos Compreendendo um Imu- nossupressor

[00263] Nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossu- pressor, tal como rapamicina, podem ser produzidos usando qualquer método conhecido das pessoas com conhecimento regular na técnica. De maneira preferencial, em algumas modalidades de qualquer um dos métodos, composições ou kits proporcionados aqui, neste reque- rimento de patente, os nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor são produzidos por qualquer um dos métodos da Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 2016/0128986 A1 e da Publicação do Requerimento de Patente dos Estados Unidos No. US 2016/0128987 A1, os métodos descritos de semelhante produção e os nanocarreadores sintéticos resultantes sendo incorporados aqui, a este requerimento de patente, por meio de referência em sua totalidade. Em qualquer um dos métodos, composi- ções ou kits proporcionados aqui, neste requerimento de patente, os nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor são os nanocarreadores sintéticos referidos incorporados. Nanocarreado- res sintéticos compreendendo rapamicina foram produzidos com mé- todos no mínimo similares a estes métodos incorporados e usados no Exemplo que se segue. Exemplo 2: Liberação de Combinação de Vírus Adenoassociado (AAV) com Nanocarreadores Sintéticos Compreendendo um Imu- nossupressor e Anticorpo Anti-BAFF

[00264] Foi examinado o efeito da administração de um vetor de vírus adenoassociado com um nanocarreador sintético compreenden- do um imunossupressor (rapamicina) e um anticorpo anti-BAFF. Fo- ram testados três tratamentos: vetor viral adenoassociado codificando para fosfatase alcalina secretada (AAV-SEAP) isolado, em combina- ção com nanocarreadores sintéticos compreendendo rapamicina (AAV-SEAP + SVP[RAPA]), e em combinação com um anticorpo anti- BAFF (AAV-SEAP + SVP[RAPA] + anti-BAFF]). Três grupos de seis camundongos foram injetados uma vez com quantidades idênticas de um dos três tratamentos descritos acima. As injeções foram adminis- tradas por via intravenosa (i.v.) para AAV-SEAP e SVP[RAPA] e por via intraperitoneal (i.p.) para anti-BAFF. O sangue total foi coletado e processado para isolar o soro de cada sujeito nos dias 5, 9, 12, 16, e 21 pós-injeção. Foi determinada a IgM sérica direcionada para o AAV ligado à placa usando um ELISA. Soro naïve foi usado como o nível basal negativo. Conforme mostrado na Fig. 1, a administração de AAV-SEAP em combinação com nanocarreadores sintéticos compre- endendo rapamicina e o anticorpo anti-BAFF resultou em uma redução dos níveis séricos de IgM anti-AAV em comparação com os outros dois grupos. Nos dias 16 e 21, a imunidade anti-AAV foi quase abolida em uma série de camundongos recebendo a combinação de vetor de AAV e nanocarreadores sintéticos compreendendo rapamicina e o an- ticorpo anti-BAFF.

[00265] O soro dos camundongos descritos acima também foi ana- lisado para determinar o nível de expressão de SEAP. Conforme mos- trado na Fig. 2, nos dias 5, 9, 12, e 16, a administração de AAV-SEAP em combinação com nanocarreadores sintéticos compreendendo ra- pamicina e o anticorpo anti-BAFF produziu maiores níveis de expres- são de SEAP em comparação com os outros dois grupos. Adicional- mente, a magnitude da expressão de SEAP foi reforçada em cada ponto do tempo, indicando que a combinação leva a expressão trans- gênica alvo aprimorada tanto inicialmente quanto ao longo do tempo. Exemplo 3: Uma Diminuição Sinérgica da Resposta Imune de IgM in vivo para AAV por Combinação de Rapamicina Encapsulada Dentro de Nanocarreador Sintético e Anti-BAFF Sistêmico

[00266] Três grupos de camundongos fêmeas C57BL/6 (6 camun- dongos cada) foram injetados (i.v., veia da cauda) três vezes nos dias 0, 37 e 155 com 1×1010 VG de AAV8-SEAP sem quaisquer nanocarre- adores (um grupo) ou com SVP[Rapa] a 150 µg (dois grupos). Dos dois últimos, um grupo foi adicionalmente tratado com anti-BAFF sis- têmico (i.p. 100 µg) (clone Sandy-2 da Adipogen Corp., San Diego, CA, EUA) nos dias 0, 15, 37, 155 e 169, isto é, a cada injeção com AAV8 e também 14 dias depois do prime e do 2º. reforço.

[00267] No momento indicado (dias 5, 9, 12, 16, 21, 42, 47, 51, 55, 162,167,174, 195 e 210) os camundongos foram sangrados, o soro foi separado do sangue total e armazenado a -20 ± 5 °C até ser analisa- do. Em seguida anticorpos IgM para AAV foram medidos em ELISA: placas de 96 cavidades revestidas o/n com o AAV, lavadas e bloquea- das no dia seguinte, em seguida amostras de soro diluído (1:40) foram adicionadas à placa e incubadas; as placas foram lavadas, foi adicio-

nado HRP de asno específico anti-IgM de camundongo e depois de outra incubação e lavagem, a presença de anticorpos IgM para AAV foi detectada adicionando o substrato TMB e medindo em uma absor- vância de 450 nm com um comprimento de onda de referência de 570 nm (a intensidade do sinal apresentada como densidade ótica máxima, OD, é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo IgM na amostra).

[00268] Conforme é mostrado na Fig. 15, SVP[Rapa] co- administrado com AAV suprimiu a indução inicial de IgM de AAV e re- tardou seu aparecimento, especialmente depois do prime. No entanto, isto foi menos notável depois dos reforços (indicados por setas), espe- cialmente depois do primeiro destes em d37, resultando em notável elevação da IgM no grupo tratado somente com SVP[Rapa] durante o intervalo de d42-55. Ao mesmo tempo, a produção de IgM no grupo tratado com SVP[Rapa] e anti-BAFF sistêmico apresentou supressão da resposta de IgM ainda mais forte e estatisticamente mais acentua- da, a qual foi menor do que no grupo tratado somente com SVP[Rapa] depois das duas primeiras injeções (d0 e 37) e não a excedeu estatis- ticamente depois da 3ª. injeção (d155). Exemplo 4: Menores Níveis de Avanços de IgG contra AAV são induzidos por Combinação de Rapamicina Encapsulada Dentro de Nanocarreadores e Anti-BAFF Sistêmico

[00269] As mesmas amostras de soro do Exemplo 3 também foram testadas para IgG contra AAV medido por ELISA ao longo das mes- mas linhagens que IgM com a exceção de ser usado HRP de cabra específico anti-IgG de camundongo. Conforme foi demonstrado anteri- ormente, a Fig. 16 mostra que SVP[Rapa] co-administrado com AAV suprimiu a indução de IgG contra AAV na maioria dos animais experi- mentais, embora uns poucos desses tenham começado a desenvolver IgG posteriormente no experimento (o que se correlaciona com a ciné-

tica de IgM retardada neste grupo). Digno de nota, não houve avanços da IgG no grupo tratado com combinação de SVP[Rapa] e anti-BAFF, o que também se correlacionou com alguns níveis ainda menorse de IgM e retardo mais acentuada em sua produção. Exemplo 5: É visto um Aumento Sinérgico de Longo Termo da Expressão Transgênica Acionada por AAV in vivo por Combina- ção de Rapamicina Encapsulada Dentro de Nanocarreadores e Anti-BAFF Sistêmico Depois de Cada Re-Administração de AAV

[00270] No mesmo estudo que no Exemplos 3 e 4, os níveis de SEAP no soro foram medidos usando um kit de teste da ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, EUA). Amostras de soro e controles positivos foram diluídas em tampão de diluição, incubadas a 65°C por 30 minu- tos, em seguida arrefecidas até a temperatura ambiente, laminadas em formato de 96 cavidades, tampão de teste (5 minutos) e em segui- da substrato (20 minutos) foi adicionado e as placas foram lidas no lu- minômetro (477 nm).

[00271] Conforme é mostrado na Fig. 17, houve um aumento ime- diato na expressão transgênica em grupos tratados com SVP[Rapa]. Destes, a elevação sérica de SEAP no grupo tratado com combinação de SVP[Rapa] e anti-BAFF foi maior e estatisticamente diferente dos níveis gerados por tratamento com SVP[Rapa] somente (os níveis de expressão relativa para cada ponto do tempo são mostrados dentro do gráfico calculados contra os níveis no grupo não tratado, aos quais foi atribuída uma pontuação de uma centena, 100). Além disso, em cada administração de AAV subsequente (d37 e 155, mostradas por setas na Fig. 17), o grupo ao qual foi administrada a combinação de SVP[Rapa] e anti-BAFF apresentou um reforço adicional na expressão de SEAP, o qual nunca foi inferior ao reforço visto no grupo tratado somente com SVP[Rapa] e na maioria das vezes foi maior, especial- mente depois do 2o. reforço (conforme descrito anteriormente, não houve nenhum reforço em camundongos não tratados; os níveis de expressão pós- a pré-reforço são mostrados para todos os pontos do tempo pós-reforço na linha superior dacima os níveis de expressão relativa). Isto resultou em níveis de expressão de SEAP estáveis e nos maiores níveis de expressão de SEAP vistos no estudo. Notar que em múltiplas ocasiões acima de mais da metade de um ano da duração do estudo, a expressão de SEAP no grupo tratado com a combinação de SVP[Rapa] e anti-BAFF excedeu os níveis vistos inicialmente no dia 16, enquanto estes nunca foram excedidos nem no grupo tratado so- mente com SVP[Rapa] ou no grupo deixado não tratado. Coletivamen- te, em múltiplos pontos do tempo, os níveis de expressão de SEAP no grupo tratado com a combinação de SVP[Rapa] e anti-BAFF foram 3 vezes ou maiores do que no grupo que foi tratado com AAV somente. Exemplo 6: Não é Visto Um Aumento Sinérgico da Expressão Transgênica Acionada por AAV e Diminuição da Resposta Imune de IgM e de IgG para AAV por Combinação de Rapamicina Encap- sulada Dentro de Nanocarreadores e Anti-BAFF Sistêmico se An- ti-BAFF for usado Isolado, sem SVP[Rapa]

[00272] Quatro grupos de camundongos fêmeas C57BL/6 (6 ca- mundongos cada) foram injetados (i.v., veia da cauda) três vezes nos dias 0, 32 e 98 com 1×1010 VG de AAV8-SEAP sem quaisquer nano- carreadores (dois grupos) ou com SVP[Rapa] a 150 µg (dois grupos). Em ambos os braços, um grupo foi deixado sem qualquer intervenção adicional (isto é, um grupo foi completamente não tratado e um grupo foi tratado com SVP[Rapa] somente) e o outro grupo foi adicionalmen- te tratado com anti-BAFF sistêmico (i.p. 100 µg) nos dias de adminis- tração de AAV (d0, 32, e 98).

[00273] Em momentos indicados (dias 5, 11, 21, 28, 38, 42, 49, 63, 91, 108, 112, 118, 125, 139 e 153) os camundongos foram sangrados, o soro foi separado do sangue total e usado para determinação dos níveis de SEAP (Fig. 18A) bem como de anticorpos IgM e IgG para AAV conforme descrito acima (Figuras 18B a 18C).

[00274] Conforme é mostrado na Fig. 18A, apesar de SVP[Rapa] isolado ter proporcionado um certo benefício para expressão transgê- nica, houve um aumento muito maior e estatisticamente diferente da atividade de SEAP no grupo tratado com a combinação de SVP[Rapa] e anti-BAFF, especialmente depois do 2o. reforço no dia 98 (os níveis de expressão relativa para cada ponto do tempo são mostrados calcu- lados contra os níveis no grupo não tratado, e foi atribuída uma pontu- ação de ‘100’; os níveis de expressão pós- a pré-reforço mostrados para todos os pontos do tempo pós-reforço abaixo dos níveis de ex- pressão relativa). Isto coletivamente resultou em uma elevação de 3,5 a 4 vezes da expressão de SEAP no grupo tratado com a combinação de SVP[Rapa] e anti-BAFF em comparação com os camundongos não tratados. De maneira importante, não foi vista nenhuma elevação esta- tisticamente significante da expressão transgênica no grupo tratado unicamente com anti-BAFF, especialmente depois do 2o. reforço (a 3a. administração de AAV-SEAP).

[00275] Ao invés, foram vistos os menores níveis de IgM contra AAV (e sem avanços de IgG) no grupo tratado com a combinação de SVP[Rapa] e anti-BAFF em comparação com outros grupos. A respos- ta de IgM neste grupo foi especialmente baixa depois da 1a e da 3a administrações de AAV e em múltiplos pontos do tempo foi estatisti- camente diferente de todos os outros grupos, incluindo os tratados somente com SVP[Rapa] (Fig. 18B).

[00276] Apesar dos níveis de IgM terem sido inicialmente ligeira- mente retardados e diminuídos no grupo tratado somente com anti- BAFF, os níveis foram sempres maiores do que em ambos os grupos tratados com SVP[Rapa], especialmente no grupo tratado com a com- binação de SVP[Rapa] e anti-BAFF (Fig. 18B). De maneira similar, a cinética de IgG foi somente marginalmente retardada neste grupo com a maior parte dos camundongos se tornando soropositivos no dia 21 e todos eles se convertendo no dia 38 (camundongos não tratados com- pletamente convertidos no dia 21), enquanto nenhum camundongo em grupos tratados com SVP[Rapa] foi convertido até o dia 91 e nenhum camundongo no grupo tratado com a combinação de SVP[Rapa] e an- ti-BAFF se tornou positivo para IgG para a duração do estudo (Fig. 18C).

[00277] Coletivamente, apesar de SVP[Rapa] isolado terapresenta- do um benefício para expressão transgênica acionada por AAV e su- pressão de IgM / IgG e anti-BAFF isolado demonstrou uma certa ca- pacidade para retardar a geração de IgM e IgG específicas para AAV, a combinação de ambos os tratamentos foi bastante superior em ele- var a expressão de SEAP bem como na supressão de IgM / IgG espe- cífica para AAV, especialmente depois de administrações repetidas de AAV. Exemplo 7: A Aumento Sinérgico da Expressão Transgênica Aci- onada pelo AAV Acoplada com Supressão Contínua da Resposta Imune de IgM e de IgG para AAV por Combinação de Rapamicina Encapsulada Dentro de Nanocarreadores e Anti-BAFF Sistêmico é visto Depois de Múltiplas Administrações de AAV

[00278] Seis grupos de camundongos fêmeas C57BL/6 (6 camun- dongos cada) foram injetados (i.v., veia da cauda) quatro vezes nos dias 0, 32, 98, e 160 com 1×1010 VG de AAV8-SEAP quer isolado ou combinado com diferentes doses de SVP[Rapa] (50 ou 150 µg) com ou sem tratamento adicional com anti-BAFF sistêmico (i.p., 100 µg), administrado quer somente no dia da injeção, portanto igualando o to- tal de quatro tratamentos e definido como ‘baixa’ ou também adminis- trado em 14 dias depois da 1a., da 3a. e da 4a. administrações de AAV, isto é, nos dias 14, 112 e 174 do estudo, portanto igualando o total de sete tratamentos e definido como ‘média’. Nos momentos indicados (dias 28, 38, 91, 108, 153, 167, 172, 179, 186 e 214) os camundongos foram sangrados, o soro foi separado do sangue total e usado para determinação dos níveis de SEAP (Figuras 19A a 19B) bem como anticorpos IgM e IgG para AAV conforme descrito acima (Figuras 19C a 19F).

[00279] Digno de nota, em ambas as doses de SVP[Rapa], a admi- nistração de anti-BAFF proporcionou um reforço tardio significante na expressão de SEAP, o qual foi bem manifestado depois da última inje- ção com AAV no dia 160 com anti-BAFF e 50 µg da combinação de SVP[Rapa] mostrando considerável elevação para quase três sema- nas pós injeção (Fig. 19A) e a mesma combinação com 150 µg de SVP[Rapa] demonstrou contínua elevação transgênia até 8 semanas pós injeção (Fig. 19B), a qual em ambos os casos foi muito mais acen- tuada e estatisticamente diferente do benefício obtido por SVP[Rapa] usado isolado (os níveis de expressão relativa para cada ponto do tempo são mostrados calculados contra os níveis no grupo não trata- do, e foi atribuída uma pontuação de ‘100’; os níveis de expressão pós- a pré-reforço mostrados para todos os pontos do tempo pós- reforço abaixo dos níveis de expressão relativa). Em cada injeção sub- seqüente, os grupos tratados com SVP[Rapa] e, mais ainda, com a combinação de SVP[Rapa] e anti-BAFF apresentaram um aumento na atividade transgênica, ao passo que os camundongos não tratados não (vide os níveis de atividade de SEAP do dia 28 para cada grupo marcados por linhas pontilhadas na Fig. 19A) e portanto coletivamente em vários pontos do tempo o efeito cumulative de SVP[Rapa] e anti- BAFF foi próximo ou de mais de 7 vezes em comparação com o grupo injetado 4 vezes com AAV-SEAP sem qualquer tratamento adicional (Fig. 19B).

[00280] Tanto IgM quanto IgG para AAV continuaram a ser profun-

damente suprimidos durante a duração do estudo com IgM para AAV e especialmente bem suprimidos no grupo tratado com a combinação de 150 µg de SVP[Rapa] e anti-BAFF médio (Fig. 19C e Fig. 19E). A res- posta de IgM neste grupo ficou na linha basal na maior parte dos ca- mundongos até o dia 214 do estudo (Fig. 19E), se tornando estatisti- camente diferente de todos os outros grupos (número de avanços de IgM e IgG em cada grupo, definido como OD máxima de >0,1 é mos- trado na Fig. 19C e na Fig. 19D). Ambos os grupos tratados com 150 µg de SVP[Rapa] combinado com anti-BAFF não apresentaram avan- ços de IgG até o fim do estudo (Fig. 19D e Fig. 19F) Exemplo 8: Os níveis Iniciais e Tardios de IgM em Camundongos aos Quais foi Administrado SVP[Rapa] com ou sem Anti-BAFF se Correlacionam Inversamente com uma Expressão Transgênica Acionada por AAV de Longo Termo

[00281] Cinco grupos de camundongos fêmeas C57BL/6 (6 camun- dongos cada) foram injetados (i.v., veia da cauda) quatro vezes nos dias 0, 32, 98, e 160 com 1×1010 VG de AAV8-SEAP combinado com diferentes doses de SVP[Rapa] (50 ou 150 µg) com ou sem tratamento adicional com anti-BAFF sistêmico (i.p., 100 µg). Conforme é mostrado na Fig. 20, todos estes camundongos demonstraram um atraso na formação de IgM contra AAV, a qual foi notavelmente suprimida no dia 11 (camundongos não tratados com SVP[Rapa] são uniformemente positivos para IgM no dia 5, vide exemplos anteriores), embora uns poucos camundongos tenhyam soroconvertido por essa ocasião. Quando os valores da IgM do dia 11 foram plotados contra os níveis séricos de SEAP determinados antes e depois de cada um dos três reforços com AAV subsequentes administrados nos dias 32, 98 e 160, todos estes conjuntos de dados apresentaram uma correlação inversa estatisticamente significante, a qul foi reforçada com o tempo (de p = 0,043 no dia 38 a p = 0,0001 no dia 179, vide a Fig. 20A), portanto in-

dicando que uma resposta de IgM precoce pode ser determinativa da transdução de AAV e expressão transgênica de longo termo subse- quente.

[00282] De maneira similar, quando os níveis de IgM em d153 (uma semana antes da 4a. inoculação de AAV = o 3o. reforço) vistos em ca- mundongos tratados com 150 µg de SVP[Rapa] com ou sem anti- BAFF foram plotados contra elevação de SEAP pós-reforço (como a proporção dos níveis de expressão pós- a pré-reforço), de maneira si- milar foi vista forte correlação inversa (Fig. 20B).

[00283] Coletivamente, isto indica que ambas as respostas de IgM para AAV iniciais quanto de longo termo podem ser determinativas dos níveis de expressão transgênica acionada por AAV, especialmente depois de repetidas administrações de AAV e que a supressão de IgM específica para o antígeno conforme obtida pela combinação de SVP[Rapa] e anti-BAFF pode ser benéfica e pode resultar em expres- são transgênica de longo termo e estável in vivo. Exemplo 9: Combinação de SVP[Rapa] com Anti-BAFF Diminui Suprime Populações de Céluals B Esplênicas Gerais e Específi- cas em Camundongos puros e Injetados com AAV

[00284] Sete grupos de camundongos fêmeas C57BL/6 (9 camun- dongos cada, 3 camundongos por cada ponto do tempo) foram ou inje- tados (i.v., veia da cauda) com 1×1010 VG de AAV8-SEAP (quatro gru- pos) ou deixados livres de vírus (três grupos). Dos precedentes, um grupo não recebeu nenhum tratamento adicional, um grupo foi coinje- tado com 150 µg de SVP[Rapa], um grupo foi adicionalmente tratado com anti-BAFF (i.p., 100 µg) e o último grupo foi tratado com combina- ção de SVP[Rapa] e anti-BAFF sistêmico. De maneira similar, três grupos não injetados com AAV, foram tratados com 150 µg de SVP[Rapa], anti-BAFF (i.p., 100 µg) e com sua combinação. Camun- dongos não recebendo nenhuma injeção serviram como controle basal

(dia 0).

[00285] Nos momentos indicados (1,4 e 7 dias depois da injeção) os camundongos foram sacrificados, os baços foram retirados, tritura- dos para suspensões celulares únicas e em seguida corados com an- ticorpos para marcadores superficiais de células B CD19, CD138, e CD127. Conforme é visto nos gráficos Fig. 21A e Fig. 21B, os camun- dongos injetados com AAV, não tratados ou tratados com SVP[Rapa], não experimentaram qualquer diminuição no número total de esplenó- citos de origem de células B (definidos como CD19+). De maneira simi- lar, camundongos naïve para o vírus tratados com SVP[Rapa] apre- sentaram somente uma menor diminuição no número de células CD19+. Ao invés, os camundongos tratados com anti-BAFF (quer inje- tados com AAV ou puros para o vírus) apresentaram uma queda em células esplênicas CD19+ profunda e dependente do tempo (no míni- mo por um fator de 2), a qual foi ainda mais acentuada no caso de também ter sido usado SVP[Rapa] (por um fator de 3 a 4).

[00286] Este efeito foi ainda mais saliente se a fração de células de plasmablastos (definidas como CD19+CD138+), precursores diretos de células plasmáticas de vida longa secretoras de anticorpos tiver sido avaliada (Fig. 21C e Fig. 21D). Nsete caso, o tratamento com SVP[Rapa] levou a diminuição dos plasmablastos esplênicos depen- dente do tempo como no tratamento com anti-BAFF (por um fator de 2 a 3; não houve virtualmente nenhuma alteração nos camundongos in- jetados com AAV não tratados). No entanto, o efeito cumulativo do tra- tamento de combinação com SVP[Rapa] e anti-BAFF foi ainda mais forte resultando em uma diminuição de mais de 7 vezes na fração de plasmablastos, mostrando que esta combinação pode agir especifica- mente contra células produtoras de anticorpos da linhagem das células B.

[00287] Isto foi reflletido reciprocamente em um aumento relativop da fração pré- / pró- células B (isto é, precursores imediatos de células B imaturas, definidos como CD19+CD127+) conforme mostrado nos gráficos das Fig. 21E e Fig. 21F. Neste caso, camundongos não trata- dos e tratados com SVP[Rapa] injetados com AAV não apresentaram alterações na dinâmica pré-/pró- células B e o efeito de SVP[Rapa] sobre camundongos naïve para o vírus foi de menos de 2 vezes e foi visto somente no dia 7. Anti-BAFF apresentaram um efeito mais forte, o qual foi visto tanto em camundongos naïve para o vírus quanto inje- tados com AAV, sendo notavelmente menos profundo no precedente. Digno de nota, o tratamento de combinação com SVP[Rapa] e anti- BAFF novamente apresentou um efeito sinérgico (sendo maior do que a soma aritmética dos efeitos dos tratamentos únicos com SVP[Rapa] e anti-BAFF), elevando a fração de precursores de células B imaturas quase 4 vezes nos camundongos injetados com AAV e ainda maior em camundongos naïve para o vírus. Coletivamente, pareceu que o tratamento de combinação com SVP[Rapa] e anti-BAFF levou a blo- queio específico e precoce na maturação de células B tanto em ca- mundongos naïve para o vírus e, de maneira mais importante, mesmo no caso de infecção por AAV, que se correlaciounou com uma profun- da supressão da produção específica para o vírus de IgM e IgG reali- zada por este tratamento de combinação. Exemplo 10: A Diminuição Sinérgica da Resposta Imune de IgM para AAV in vivo por Combinação de Rapamicina Encapsulada Dentro de Nanocarreadores e Administração Sistêmica do Inibi- dor da Tirosina Quinase de Bruton PCI-32765 (Ibrutinib)

[00288] Cinco grupos de camundongos fêmeas C57BL/6 (6 camun- dongos cada) foram injetados (i.v., veia da cauda) duas vezes nos dias 0 e 93 com 1×1010 VG de AAV8-SEAP sem quaisquer nanocarreado- res (um grupo) ou com SVP[Rapa] a 100 µg (quatro grupos). Dos últi- mos, três grupos foram tratado com ibrutinib sistêmico (i.p. 200 µL) por

17 dias consecutivos diariamente nas seguintes doses: 20, 100 ou 500 µg/ camundongo iniciando com 2 dias antes da injeção de AAV-SEAP e SVP[Rapa] (dias -2 a 14 e dias 91 a 107).

[00289] No momento indicado (dias 6, 9, 14, 21, 28, 49, 63, 91, 97, 100, 104, e 111) os camundongos foram sangrados, o soro foi separa- do do sangue total e armazenado a -20 ± 5 °C até ser analisado. Em seguida anticorpo IgM para AAV foi medido em ELISA: placas de 96 cavidades foram revestidas o/n com o AAV, lavadas e bloqueadas no dia seguinte, em seguida amostras de soro diluído (1:40) foram adicio- nadas à placa e incubadas; as placas foram lavadas, foi adicionado HRP de asno específico anti-IgM de camundongo e depois de outra incubação e lavagem, a presença de anticorpos IgM para AAV foi de- tectada adicionando o substrato TMB e medindo em uma absorvância de 450 nm com um comprimento de onda de referência de 570 nm (a intensidade do sinal apresentada como densidade ótica máxima, OD, é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo IgM na amostra).

[00290] Conforme é mostrado na Fig. 22, SVP[Rapa] co- administrado com AAV suprimiu a indução inicial de IgM contra AAV e retardou seu aparecimento (Fig. 22A). No entanto, no grupo tratado somente com SVP[Rapa], a IgM foi detectável de modo geral e tam- bém demonstrou um certo reforço depois da injeção repetida com AAV em d93 (mostrada por uma seta na Fig. 22A). Ao mesmo tempo, todos os grupos co-tratados com SVP[Rapa] e ibrutinib sistêmico apresenta- ram supressão da resposta de IgM inicial ainda mais forte e estatisti- camente mais acentuada, a qual na alta dose de ibrutinib de 500 µg foi estatisticamente diferente do grupo tratado somente com SVP[Rapa] até o dia 14 (Figs. 22B-22D). Além do mais, todos os grupos tratados com combinação de SVP[Rapa] e ibrutinib sistêmico apresentaram ní- veis de IgM estatisticamente menores em comparação com o grupo tratado somente com SVP[Rapa] logo depois da injeção repetida com

AAV do dia 93 (Figuras 22E a 22F). Exemplo 11: Um Aumento Sinérgico Pós-Reforço da Expressão Transgênica Acionada por AAV in vivo por Combinação de Ra- pamicina Encapsulada Dentro de Nanocarreadores e Ibrutinib Sis- têmico se Correlacionando Inversamente com IgM Inicial contra

AAV

[00291] No mesmo estudo que no Exemplo 10, os níveis de SEAP no soro foram medidos usando um kit de teste da ThermoFisher Scien- tific (Waltham, MA, EUA) conforme descrito acima: amostras diluídas em tampão de diluição, incubadas a 65°C por 30 minutos, em seguida arrefecidas até a temperatura ambiente, laminadas em formato de 96 cavidades, tampão de teste (5 minutos) e em seguida substrato (20 minutos) foi adicionado e as placas foram lidas no luminômetro (477 nm).

[00292] Não houve nenhuma diferença notável nos níveis de ex- pressão iniciais de SEAP entre todfs os grupos tratados com SVP[Rapa] independente da administração de ibrutinib, embora todos estes tenham apresentados maiores níveis de SEAP sérico em com- paração com o grupo não tratado com SVP[Rapa] (vide os dados do dia 14 na Fig. 23A; aos níveis de SEAP em camundongos que recebe- ram AAV-SEAP sem quaisquer outros tratamentos são atribuídoos um número de ‘100’ em todoos s pontos do tempo e a expressão relativa em todos os oututrs grupos foi calculada consequentemente). Quando medidos em um ponto do tempo posterior (dia 91, isto é, dois dias an- tes da administração repetida de AAV; Fig. 23A), todos os grupos de teste apresentaram aproximadamente o mesmo nível de expressão de SEAP.

[00293] Imediatamente depois da da administração repetida de AAV-SEAP no dia 93, todos os grupos tratados com SVP[Rapa] apre- sentaram ma elevação da expressão transgênica (Fig. 23A). Enquanto o grupo de camundongos tratados somente com SVP[Rapa] teve ní- veis de SEAP excedendo os níveis em camundongos não tratados por 63 a 75% (Fig. 23A, dias 97 a 100, isto é, 4 a 7 dias depois do refor- ço), foi vista uma maior elevação em todos os camundongos tratados com a combinação de SVP[Rapa] e ibrutinib livre (mais de 2 vezes em comparação com os camundongos não tratados no dia 100), embora naquele ponto o efeito viso nato fosse dependente da dose de ibruti- nib.

Isto começou a mudar no dia 104 (11 dias depois do reforço com AAV) com os grupos de camundongos tratados com a combinação de SVP[Rapa] e ibrutinib continuando a apresentar níveis elevados de SEAP excedendo 5 vezes de diferença vs. camundongos não tratados (para as maiores doses de ibrutinib de 100 e 500 µg) e sendo mais de duas vezes maiores do que os nos camundongos tratados somente com SVP[Rapa] (Fig. 23A). Pareceu haver uma dependência da dose neste exemplo vista iniciando a partir do dia 104 com os maiores ní- veis de expressão vistos em camundongos tratados com SVP[Rapa] combinado com 100 a 500 µg de ibrutinib em comparação com o gru- po, no qual foi usado 20 µg de ibrutinib.

Digno de nota, os níveis inici- ais de IgM contra AAV (dia 6 pós prime) em camundongos tratados com SVP[Rapa] se correlacionaram inversamente com os níveis séri- cos de SEAP pós-reforço (Fig. 23B), sugerindo que a supressão de IgM inicial (mais acentuada em camundongos tratados com SVP[Rapa] combinado com ibrutinib) pode resultar em menores níveis de memória imune para AAV e, em consequênc, em menores respos- tas anamnésicas depois de administração repetida de AAV e em uma expressão transgênica pós reforço muito mais sustentada e elevada.

Exemplo 12: A Diminuição Sinérgica de Resposta Imune de IgM e de IgG para AAV por Combinação de Rapamicina Encapsulada Dentro de Nanocarreadores e Ibrutinib Sistêmico é Mais Forte do que a Obtida por Rapamicina ou Ibrutinib Usados Isolados

[00294] Quatro grupos de camundongos fêmeas C57BL/6 (8 a 10 camundongos cada) foram injetados (i.v., veia da cauda) três vezes nos dias 0, 51 e 105 com 1×1010 VG de AAV8-SEAP sem quaisquer nanocarreadores (dois grupos) ou com SVP[Rapa] a 100 µg (dois gru- pos). Em ambos os pares de grupos, um grupo foi adicionalmente tra- tado com ibrutinib sistêmico (i.p. 500 µg) diariamente por 17 dias inici- ando em 2 dias antes de concluir no dia 14 depois de cada injeção com AAV8 (dias -2 a 14, dias 49 a 65 e dias 103 a 119 com a data da injeção com AAV-SEAP considerada como dia 0 da linha do tempo experimental).

[00295] No momento indicado (dias 6, 9, 15, 22, 29, 36, 43, 49, 58, 65, 72 e 79) os camundongos foram sangrados, o soro foi separado do sangue total e armazenado a -20 ± 5 °C até ser analisado. Em segui- da, anticorpos IgM para AAV foram medidos em ELISA: placas de 96 cavidades revestidas o/n com o AAV, lavadas e bloqueadas no dia se- guinte, em seguida amostras de soro diluído (1:40) foram adicionadas à placa e incubadas; as placas foram lavadas, foi adicionado HRP de asno específico anti-IgM de camundongo e depois de outra incubação e lavagem, a presença de anticorpos IgM para AAV foi detectada adi- cionando o substrato TMB e medindo em uma absorvância de 450 nm com um comprimento de onda de referência de 570 nm (a intensidade do sinal apresentada como densidade ótica máxima, OD, é diretamen- te proporcional à quantidade de anticorpo IgM na amostra).

[00296] Conforme é mostrado na Fig. 24, SVP[Rapa] co- administrado com AAV suprimiu a indução inicial de IgM contra AAV e retardou seu aparecimento, especialmente depois do prime (Fig. 24A, gr. 2). No entanto, isto foi menos notável depois do reforço do d51 (in- dicados por setas), resultando em notável elevação da IgM no grupo tratado somente com SVP[Rapa] durante o intervalo de d58-79. Ao mesmo tempo, a produção de IgM no grupo tratado com SVP[Rapa] e ibrutinib sistêmico (Fig. 24A, gr. 3) apresentou supressão da resposta de IgM ainda mais forte e estatisticamente mais acentuada, a qual foi menor do que no grupo tratado somente com SVP[Rapa] depois das duas primeiras injeções (d0 e 51). De maneira importante, ibrutinib sis- têmico isolado (Fig. 24A, gr. 4) foi completamente ineficaz na supres- são de IgM mostrando a mesma dinâmica de sua indução que um gru- po não tratado 1 (Fig. 24A).

[00297] Isto pode ser traduzido para dinâmica de IgG também (Fig. 24B) com camundongos não tratados e tratados somente com ibrutinib (grupos 1 e 4, correspondentemente) produzindo resposta robusta e essencialmente similar com todos os animais (8/8 e 10/10) converten- do em d22, ao passo que os camundongos tratados com SVP[Rapa] (grupo 2) apresentaram cinética de IgG retardada e suprimida com 2/10 dos animais convertendo em d22 e somente 4/10 dos animais apresentando níveis detectáveis de IgG antes do reforço (d49). Esta supressão persistiu depois do reforço do d51 com somente 5/10 dos animais se tornando positivos para IgG contra AAV em d79 (28d pós- reforço). Ainda, a combinação de SVP[Rapa] e ibrutinib sistêmico foi superior a SVP[Rapa] usado isolado (e estatisticamente diferente des- te em d79) sem conversões (0/9) imediatamente antes do reforço (d49) e somente 1/9 de conversão pós-reforço em d79. Exemplo 13: Uma Elevação Sinérgica da Expressão Transgênica Depois de Repetidas Imunizações para AAV por Combinação de Rapamicina Encapsulada Dentro de Nanocarreadores e Ibrutinib Sistêmico é Maior do que a Obtida por Rapamicina ou Ibrutinib Usados Isolados

[00298] No mesmo estudo que no Exemplo 12, os níveis de SEAP no soro foram medidos usando um kit de teste da ThermoFisher Scien- tific conforme descrito acima.

[00299] Conforme é mostrado na Fig. 25, houve um aumento ime-

diato, porém menor na expressão transgênica em grupos tratados com SVP[Rapa]. Destes, a elevação sérica de SEAP no grupo tratado com combinação de SVP[Rapa] e ibrutinib foi maior embora não estatisti- camente diferentes dos níveis gerados por tratamento com SVP[Rapa] somente (os níveis de expressão relativa para cada ponto do tempo são mostrados dentro da Fig. 25 calculados contra os níveis no grupo não tratado, aos quais foi atribuída uma pontuação de uma centena, 100), ao passo que ibrutinib usado isolado não apresentou nenhum efeito vs. camundongos não tratados. Além disso, em cada adminis- tração de AAV subsequente (d51 e 105, mostradas por setas), o grupo ao qual foi administrada a combinação de SVP[Rapa] e ibrutinib apre- sentou o maior reforço na expressão de SEAP, o qual nunca foi inferior ao reforço visto no grupo tratado somente com SVP[Rapa] e na maio- ria das vezes foi maior, especialmente depois do reforço inicial (os ní- veis de expressão pós- a pré-reforço são mostrados para todos os pontos do tempo pós-reforço na linha de baixo abaixo dos níveis de expressão relativa). Conforme é mostrado, não houve nenhum reforço em camundongos não tratados de maneira similar ao grupo tratado com ibrutinib isolado. Isto resultou em níveis de expressão de SEAP estáveis e os maiores níveis de expressão de SEAP vistos no estudo apresentaram no grupo 3, tratado com uma combinação de SVP[Rapa] e ibrutinib sistêmico. Coletivamente, em múltiplos pontos do tempo, os níveis de expressão de SEAP no grupo injetado com AAV tratado com a combinação de SVP[Rapa] e ibrutinib foi 2 vezes maior do que em grupos que foram tratados com AAV somente ou com AAV + ibrutinib. Exemplo 14: Imunizações para AAV com Rapamicina Encapsula- da Dentro de Nanocarreadores e Rituximab (Profético)

[00300] Três grupos de camundongos fêmeas C57BL/6 são injeta- dos (i.v., veia da cauda) três vezes nos dias 0, 37 e 155 com AAV8- SEAP sem quaisquer nanocarreadores (um grupo) ou com SVP[Rapa]

a 150 µg (dois grupos). Dos dois últimos, um grupo é adicionalmente tratado com Rituximab nos dias 0, 15, 37, 155 e 169, isto é, em cada injeção com AAV e também 14 dias depois do prime e do 2º. reforço.

[00301] No momento indicado (dias 5, 9, 12, 16, 21, 42, 47, 51, 55, 162,167,174, 195 e 210) os camundongos são sangrados, e o soro é separado do sangue total e armazenado a -20 ± 5 °C até ser analisa- do. Em seguida, anticorpos IgM e IgG para Ad são medidos em ELISA. Os níveis de SEAP no soro são medidos usando um kit de teste da ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, EUA). Exemplo 15: Imunizações para AAV com Nanocarreadores Sinté- ticos Compreendendo GSK1059615 e Anticorpo Anti-BAFF (Profé- tico)

[00302] Três grupos de camundongos fêmeas C57BL/6 são injeta- dos (i.v., veia da cauda) três vezes nos dias 0, 37 e 155 com AAV8- SEAP sem quaisquer nanocarreadores (um grupo) ou com nanocarre- adores sintéticos compreendendo GSK1059615 (dois grupos). Dos dois últimos, um grupo é adicionalmente tratado com anti-BAFF sistê- mico (i.p. 100 µg) nos dias 0, 15, 37, 155 e 169, isto é, a cada injeção com AAV8 e também 14 dias depois do prime e do 2º. reforço.

[00303] No momento indicado (dias 5, 9, 12, 16, 21, 42, 47, 51, 55, 162,167,174, 195 e 210) os camundongos são sangrados, e o soro é separado do sangue total e armazenado a -20 ± 5 °C até ser analisa- do. Em seguida anticorpos IgM e IgG para Ad são medidos em ELISA. Os níveis de SEAP no soro são medidos usando um kit de teste da ThermoFisher Scientific (Waltham, MA, EUA).

Claims (56)

REIVINDICAÇÕES

1. Composição caracterizada pelo fato de que compreende: um vetor de transferência viral, nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor e um agente anti-IgM.

2. Composição de acordo com a reivindicação 1, caracteri- zada pelo fato de que o agente anti-IgM é selecionado entre anticorpos ou fragmentos dos mesmos que se ligam especificamente a CD10, CD19, CD20, CD22, CD27, CD34, CD40, CD79a, CD79b, CD123, CD179b, FLT-3, ROR1, BR3, BAFF, ou B7RP-1; inibidores da tirosina quinase, por exemplo, inibidores da syk, inibidores da BTK, ou inibido- res da tirosina quinase da proteína SRC; inibidores da PI3K; inibidores da PKC; antagonistas de APRIL; mizoribina; tofacitinib; e tetraciclinas.

3. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zada pelo fato de que o agente anti-IgM é um anticorpo anti-BAFF ou fragmento de ligação ao antígeno do mesmo.

4. Composição de acordo com a reivindicação 2, caracteri- zada pelo fato de que o agente anti-IgM é um inibidor da BTK, por exemplo, ibrutinub.

5. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o vetor de transferência viral é um vetor de transferência retroviral, um vetor de transferência adenoviral, um vetor de transferência lentiviral ou um vetor de transfe- rência viral adenoassociado.

6. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zada pelo fato de que o vetor de transferência viral é um vetor de transferência adenoviral, e o vetor de transferência adenoviral é um vetor de transferência adenoviral do subgrupo A, do subgrupo B, do subgrupo C, do subgrupo D, do subgrupo E, ou do subgrupo F.

7. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zada pelo fato de que o vetor de transferência viral é um vetor de transferência lentiviral, e o vetor de transferência lentiviral é um vetor lentiviral de HIV, SIV, FIV, EIAV ou vetor lentiviral ovino.

8. Composição de acordo com a reivindicação 5, caracteri- zada pelo fato de que o vetor de transferência viral é um vetor de transferência viral adenoassociado, e o vetor de transferência viral adenoassociado é um vetor de transferência viral adenoassociado AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10 ou AAV11.

9. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que o vetor de transfe- rência viral é um vetor de transferência viral quimérico.

10. Composição de acordo com a reivindicação 9, caracte- rizada pelo fato de que o vetor de transferência viral quimérico é um vetor de transferência adenoviral de AAV.

11. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que o transgene do vetor de transferência viral compreende um transgene de terapia gené- tica, um transgene de edição genética, um transgene de salto de éxon ou um transgene de modulação da expressão genética.

12. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que os nanocarreado- res sintéticos compreendem nanopartículas lipídicas, nanopartículas poliméricas, nanopartículas metálicas, emulsões à base de tensoati- vos, dendrímeros, buckyballs, nanofios, partículas semelhantes a vírus ou partículas de peptídeos ou proteínas.

13. Composição de acordo com a reivindicação 12, carac- terizada pelo fato de que os nanocarreadores sintéticos compreendem nanopartículas poliméricas.

14. Composição de acordo com a reivindicação 13, carac- terizada pelo fato de que as nanopartículas poliméricas compreendem um polímero que não é um polímero plurônico não terminado com me- tóxi.

15. Composição de acordo com a reivindicação 13 ou 14, caracterizada pelo fato de que as nanopartículas poliméricas compre- endem um poliéster, poliéster anexado a um polieter, poliaminoácido, policarbonato, poliacetal, policetal, polissacarídeo, polietiloxazolina ou polietilenoimina.

16. Composição de acordo com a reivindicação 15, carac- terizada pelo fato de que o poliéster compreende um poli(láctico áci- do), poli(glicólico ácido), poli(láctico-co-glicólico ácido) ou policaprolac- tona.

17. Composição de acordo com a reivindicação 15 ou 16, caracterizada pelo fato de que as nanopartículas poliméricas compre- endem um poliéster e um poliéster anexados a um polieter.

18. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 15 a 17, caracterizada pelo fato de que o polieter compreende polietileno glicol ou polipropileno glicol.

19. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a média de uma distribuição de tamanho de partícula obtida usando espalhamento di- nâmico da luz de uma população dos nanocarreadores sintéticos é um diâmetro maior do que 110 nm.

20. Composição de acordo com a reivindicação 19, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é maior do que 150 nm.

21. Composição de acordo com a reivindicação 20, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é maior do que 200 nm.

22. Composição de acordo com a reivindicação 21, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é maior do que 250 nm.

23. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 19 a 22, caracterizada pelo fato de que o diâmetro é menor do que 5 µm.

24. Composição de acordo com a reivindicação 23, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é menor do que 4 µm.

25. Composição de acordo com a reivindicação 24, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é menor do que 3 µm.

26. Composição de acordo com a reivindicação 25, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é menor do que 2 µm.

27. Composição de acordo com a reivindicação 26, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é menor do que 1 µm.

28. Composição de acordo com a reivindicação 27, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é menor do que 500 nm.

29. Composição de acordo com a reivindicação 28, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é menor do que 450 nm.

30. Composição de acordo com a reivindicação 29, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é menor do que 400 nm.

31. Composição de acordo com a reivindicação 30, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é menor do que 350 nm.

32. Composição de acordo com a reivindicação 31, carac- terizada pelo fato de que o diâmetro é menor do que 300 nm.

33. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que a carga de imu- nossupressor compreendido nos nanocarreadores sintéticos, em mé- dia através dos nanocarreadores sintéticos, é entre 0,1% e 50% (em peso / peso).

34. Composição de acordo com a reivindicação 33, carac- terizada pelo fato de que a carga é entre 0,1% e 25%.

35. Composição de acordo com a reivindicação 34, carac- terizada pelo fato de que a carga é entre 1% e 25%.

36. Composição de acordo com a reivindicação 35, carac- terizada pelo fato de que a carga é entre 2% e 25%.

37. Composição de acordo com a reivindicação 36, carac- terizada pelo fato de que a carga é entre 2% e 20%, entre 2% e 15%, ou entre 2% e 10%.

38. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que o imunossupres- sor é um inibidor da via NF-kB.

39. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que o imunossupressor é um inibidor do mTOR.

40. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 37, caracterizada pelo fato de que o imunossupressor é um rapalog.

41. Composição de acordo com a reivindicação 40, carac- terizada pelo fato de que o imunossupressor é rapamicina.

42. Composição de acordo com qualquer uma das reivindi- cações precedentes, caracterizada pelo fato de que uma razão de as- pecto de uma população dos nanocarreadores sintéticos é maior do que 1:1, 1:1,2, 1:1,5, 1:2, 1:3, 1:5, 1:7 ou 1:10.

43. Kit caracterizado pelo fato de que compreende qualquer uma das composições como definidas nas reivindicações precedentes e instruções para uso.

44. Kit caracterizado pelo fato de que compreende um vetor de transferência viral conforme definido em qualquer uma das reivindi- cações precedentes, nanocarreadores sintéticos conforme definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes, um agente anti-IgM conforme definido em qualquer uma das reivindicações precedentes e instruções para uso.

45. Kit de acordo com a reivindicação 43 ou 44, caracteri- zado pelo fato de que as instruções para uso compreendem instruções para a realização de qualquer um dos métodos proporcionados aqui,

neste requerimento de patente.

46. Método caracterizado pelo fato de que compreende: o estabelecimento de uma resposta atenuada antivetor de transferência viral em um sujeito por administração concomitante de um vetor de transferência viral, nanocarreadores sintéticos compreen- dendo um imunossupressor, e um agente anti-IgM ao sujeito.

47. Método de acordo com a reivindicação 46, caracteriza- do pelo fato de que a resposta atenuada antivetor de transferência vi- ral é uma resposta de IgM contra o vetor de transferência viral.

48. Método de acordo com a reivindicação 47, caracteriza- do pelo fato de que a resposta atenuada antivetor de transferência vi- ral adicionalmente compreende uma resposta de IgG contra o vetor de transferência viral.

49. Método caracterizado pelo fato de que compreende: a intensificação da expressão transgênica de um vetor de transferência viral em um sujeito por administração repetidamente, concomitantemente ao sujeito de um vetor de transferência viral, de nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor, e de um agente anti-IgM.

50. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 49, caracterizado pelo fato de que a administração concomi- tante do vetor de transferência viral, dos nanocarreadores sintéticos compreendendo um imunossupressor, e/ou do agente anti-IgM é repe- tida.

51. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 50, caracterizado pelo fato de que o vetor de transferência viral é conforme definido em qualquer uma das reivindicações prece- dentes.

52. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 51, caracterizado pelo fato de que os nanocarreadores sin-

téticos são conforme definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes.

53. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 51, caracterizado pelo fato de que o agente anti-IgM é con- forme definido em qualquer uma das reivindicações precedentes.

54. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 53, caracterizado pelo fato de que a administração concomi- tante é administração simultânea.

55. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 54, caracterizado pelo fato de que o vetor de transferência viral e/ou nanocarreadores sintéticos são administrados por via intra- venosa.

56. Método de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 46 a 55, caracterizado pelo fato de que o agente anti-IgM é ad- ministrado por via intraperitoneal.