JP5632610B2 - 最適化された非正準ジンクフィンガータンパク質 - Google Patents

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Description

関連技術の相互参照
本出願は、どちらもその開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００６年１２月１４日出願の米国特許仮出願第６０／８７４，９１１号及び２００７年５月３０日出願の米国特許仮出願第６０／９３２，４９７号の利益を主張する。
本開示は、ゲノム工学、遺伝子ターゲティング、標的染色体組込み、タンパク質発現及びエピゲノムエディティングの分野に属する。
ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質及び他の分子へのタンパク質の配列特異的結合は、多くの細胞プロセス、例えば転写、複製、染色質構造、組換え、ＤＮＡ修復、ＲＮＡプロセシング及び翻訳に関与する。タンパク質−ＤＮＡ、タンパク質−ＲＮＡ及びタンパク質−タンパク質相互作用に関わる細胞結合タンパク質の結合特異性は、発生、分化及びホメオスタシスに関与する。
ジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）は、配列特異的にＤＮＡに結合することができるタンパク質である。ジンクフィンガーは、アフリカツメガエル（African clawed toad）、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓの卵母細胞からの転写因子ＴＦＩＩＩＡにおいて最初に同定された。このクラスのＺＦＰの単一ジンクフィンガードメインは約３０アミノ酸長であり、いくつかの構造試験は、前記ドメインがβターン（２個の保存されたシステイン残基を含む）とαらせん（２個の保存されたヒスチジン残基を含む）を含み、それらが２個のシステインと２個のヒスチジンによる亜鉛原子の配位を通して特定立体配座に保持されていることを明らかにした。このクラスのＺＦＰはまた、Ｃ２Ｈ２ ＺＦＰとしても公知である。さらなるクラスのＺＦＰも示唆されている。Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓ（Ｃ３Ｈ）ＺＦＰの考察については、例えばJiang et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 : 10723-10730参照。これまでに、１０，０００を超えるジンクフィンガー配列が数千の公知又は推定上の転写因子において同定された。ジンクフィンガードメインは、ＤＮＡ認識だけでなくＲＮＡ結合及びタンパク質−タンパク質結合にも関与する。現在の推定では、このクラスの分子は全ヒト遺伝子の約２％を構成する。
大部分のジンクフィンガータンパク質は、各々のフィンガードメイン中の１個の亜鉛原子に四面体に配位する保存されたシステイン及びヒスチジン残基を有する。特に、大部分のＺＦＰは、一般配列：−Ｃｙｓ−（Ｘ）２−４−Ｃｙｓ−（Ｘ）１２−Ｈｉｓ−（Ｘ）３−５−Ｈｉｓ−（配列番号１）［式中、Ｘはいずれかのアミノ酸を表す］（Ｃ２Ｈ２ ＺＦＰ）のフィンガー成分によって特徴づけられる。この最も広く示されるクラスの亜鉛配位配列は、２個のシステインと２個のヒスチジンを特定の間隔で含む。各々の指の折りたたまれた構造は逆平行βターン、フィンガーチップ領域及び短い両親媒性αらせんを含む。金属に配位する配位子は亜鉛イオンに結合し、ｚｉｆ２６８型ジンクフィンガーの場合は、短い両親媒性αらせんがＤＮＡの主溝に結合している。加えて、ジンクフィンガーの構造は、いくつかの保存された疎水性アミノ酸残基（例えば最初の保存されたＣｙｓの直前の残基及び指のらせんセグメントの＋４位置の残基）によって及び保存されたシステイン及びヒスチジン残基を通しての亜鉛配位によって安定化される。
塩基と直接接触する位置、塩基接触位置に直接隣接する「支持（supporting）」又は「強化（buttressing）」残基、及びＤＮＡのリン酸骨格に接触することができる位置に変化を有する正準（canonical）（Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガータンパク質が記述されている。例えば米国特許第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，１４０，０８１号；同第６，８６６，９９７号；同第６，７４６，８３８号；同第６，１４０，０８１号；同第６，６１０，５１２号；同第７，１０１，９７２号；同第６，４５３，２４２号；同第６，７８５，６１３号；同第７，０１３，２１９号；国際公開公報第ＰＣＴ ＷＯ９８／５３０５９号; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Segal et al. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:34-39参照。
加えて、修飾された亜鉛配位残基を有するジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質も記述されている（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００３０１０８８８０号、同第２００６０２４６５６７号及び同第２００６０２４６５８８号参照）。しかし、これらの非正準（non-canonical）ジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質は、遺伝子転写調節機能を保持する一方で、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）として働く能力は、一部の場合、もっぱら正準Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガーからなるジンクフィンガータンパク質に比べて低下している。
米国特許第６，００７，９８８号 米国特許第６，０１３，４５３号 米国特許第６，１４０，０８１号 米国特許第６，８６６，９９７号 米国特許第６，７４６，８３８号 米国特許第６，１４０，０８１号 米国特許第６，６１０，５１２号 米国特許第７，１０１，９７２号 米国特許第６，４５３，２４２号 米国特許第６，７８５，６１３号 米国特許第７，０１３，２１９号 国際公開公報第ＰＣＴ ＷＯ９８／５３０５９号 米国特許出願第２００３０１０８８８０号 米国特許出願第２００６０２４６５６７号 米国特許出願第２００６０２４６５８８号
Jiang et al. (1996) J. Biol. Chem. 271 : 10723-10730 Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416; Segal et al. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:34-39
そこで、最適化された非正準亜鉛配位領域を有するジンクフィンガーを含む、さらに操作されたジンクフィンガー結合タンパク質に対する必要性が、特にジンクフィンガーヌクレアーゼの構築において、なおも存在する。
本開示は、少なくとも１個の亜鉛配位残基に変化を有するジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを提供する。特に、ＣＣＨＣジンクフィンガーをここで説明する。これらのＣＣＨＣジンクフィンガーは、亜鉛配位残基の近傍に、例えばジンクフィンガーのＣ末端に最も近い（C-terminal-most）亜鉛配位残基の周囲の残基に付加的な変化（置換、挿入及び／又は欠失）を有し得る。１又はそれ以上のこれらのＣＣＨＣジンクフィンガーを含むジンクフィンガーポリペプチド及び融合タンパク質、これらのジンクフィンガー及び融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド及びこれらのジンクフィンガーポリペプチド及び／又は融合タンパク質を使用する方法も開示される。
従って、本開示は、以下の番号を付した実施形態を包含するが、これらに限定されない。
１．非正準（非Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質であって、非正準ジンクフィンガーがＤＮＡ結合に関与するらせん部分を有し、らせん部分の亜鉛配位領域がアミノ酸配列ＨＸ１Ｘ２ＲＣＸＬ（配列番号２）を含み、及びジンクフィンガータンパク質が標的配列に結合するように操作されている、前記ジンクフィンガータンパク質。
２．Ｘ１がＡであり、及びＸ２がＱである、実施形態１のジンクフィンガータンパク質。
３．Ｘ１がＫであり、及びＸ２がＥである、実施形態１のジンクフィンガータンパク質。
４．Ｘ１がＴであり、及びＸ２がＲである、実施形態１のジンクフィンガータンパク質。
５．ＸＬがＧである、実施形態１のジンクフィンガータンパク質。
６．少なくとも１つのジンクフィンガーが、配列Ｃｙｓ−（ＸＡ）２−４−Ｃｙｓ−（ＸＢ）１２−Ｈｉｓ−（ＸＣ）３−５−Ｃｙｓ−（ＸＤ）１−１０（配列番号３）［式中、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ及びＸＤはいずれのアミノ酸でもよい］を含む、２又はそれ以上のジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質。
７．表１、２、３又は４のいずれかに示す配列のいずれかを含む、実施形態１−６のいずれかのジンクフィンガータンパク質。
８．ＸＤが配列ＱＬＶ又はＱＫＰを含む、実施形態６又は７のいずれかのジンクフィンガータンパク質。
９．配列ＱＬＶ又はＱＫＰがジンクフィンガーの３個のＣ末端アミノ酸残基である、実施形態８のジンクフィンガータンパク質。
１０．ＸＤが１、２又は３個のＧｌｙ（Ｇ）残基を含む、実施形態６−９のいずれかのジンクフィンガータンパク質。
１１．ジンクフィンガーの少なくとも１つが、実施形態１−１０のいずれかに従ったＣＣＨＣジンクフィンガーを含む、複数のジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質。
１２．ジンクフィンガータンパク質が３、４、５又は６個のジンクフィンガーを含む、実施形態１１のジンクフィンガータンパク質。
１３．フィンガー２がＣＣＨＣジンクフィンガーを含む、実施形態１１又は１２のジンクフィンガータンパク質。
１４．Ｃ末端ジンクフィンガーがＣＣＨＣフィンガーを含む、実施形態１１−１３のいずれかのジンクフィンガータンパク質。
１５．少なくとも２個のジンクフィンガーがＣＣＨＣジンクフィンガーを含む、実施形態１１−１４のいずれかのジンクフィンガータンパク質。
１６．ジンクフィンガータンパク質が、表８に示す配列のいずれかを含み、ＩＰＰ２−Ｋ遺伝子内の標的配列に結合するように操作されている、実施形態１１−１５のいずれかのジンクフィンガータンパク質。
１７．実施形態１−１６のいずれかのジンクフィンガータンパク質及び１又はそれ以上の機能性ドメインを含む融合タンパク質。
１８．（ａ）切断ハーフドメイン、
（ｂ）実施形態１−１６のいずれかのジンクフィンガータンパク質、及び
（ｃ）切断ハーフドメインとジンクフィンガータンパク質の間に介在するＺＣリンカー
を含む融合タンパク質。
１９．ＺＣリンカーの長さが５アミノ酸である、実施形態１８の融合タンパク質。
２０．ＺＣリンカーのアミノ酸配列がＧＬＲＧＳ（配列番号４）である、実施形態１９の融合タンパク質。
２１．ＺＣリンカーの長さが６アミノ酸である、実施形態１８の融合タンパク質。
２２．ＺＣリンカーのアミノ酸配列がＧＧＬＲＧＳ（配列番号５）である、実施形態２１の融合タンパク質。
２３．実施形態１−１６のいずれかに従ったジンクフィンガータンパク質又は実施形態１７−２２のいずれかに従った融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
２４．細胞において、実施形態１８−２２のいずれかに従った一対の融合タンパク質を発現させることを含む、植物細胞中の細胞クロマチンの標的切断のための方法であって、
（ａ）融合タンパク質の標的配列が互いの１０ヌクレオチド内であり、及び
（ｂ）融合タンパク質が二量体化して、標的配列の間に位置するＤＮＡを切断する、
前記方法。
２５．宿主植物細胞における標的遺伝子組み換えの方法であって、
（ａ）融合タンパク質の標的配列が選択された宿主標的遺伝子座に存在する、宿主細胞において、実施形態１８−２２のいずれかに従った一対の融合タンパク質を発現させること、及び
（ｂ）宿主標的遺伝子座において配列変化を示す組換え宿主細胞を同定すること
を含む前記方法。
２６．配列変化が、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、遺伝物質の置換及びそれらの何らかの組み合わせからなる群より選択される突然変異である、実施形態２４又は２５のいずれかの方法。
２７．外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態２４−２６のいずれかの方法。
２８．外因性ポリヌクレオチドが、宿主標的遺伝子座に相同な配列を含む、実施形態２７の方法。
２９．植物が、単子葉植物、双子葉植物、裸子植物及び真核藻類からなる群より選択される、実施形態２４−２８のいずれかの方法。
３０．植物が、トウモロコシ、イネ、コムギ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アブラナ科の成員及びシロイヌナズナからなる群より選択される、実施形態２９の方法。
３１．植物が樹木である、実施形態２４−２９のいずれかの方法。
３２．標的配列がＩＰＰ２Ｋ遺伝子内に存在する、実施形態２４−３１のいずれかの方法。
３３．実施形態３２に従ったＩＰＰ２−Ｋ遺伝子を不活性化する又は変化させることを含む、種子中のフィチン酸のレベルを低下させるための方法。
３４．実施形態３２に従ったＩＰＰ２−Ｋ遺伝子を不活性化する又は変化させることを含む、種子においてリンをより代謝的に使用可能にするための方法。
３５．実施形態１−１６のいずれかに従ったジンクフィンガータンパク質又は実施形態１７−２２のいずれかに従った融合タンパク質又は実施形態２３に従ったポリヌクレオチドを含む植物細胞。
３６．細胞が種子である、実施形態３５の植物細胞。
３７．種子がトウモロコシ種子である、実施形態３６の植物細胞。
３８．ＩＰＰ２−Ｋが部分的に又は完全に不活性化されている、実施形態３５−３７のいずれかの植物細胞。
３９．種子中のフィチン酸のレベルが低下している、実施形態３８の植物細胞。
４０．細胞中のリンの代謝的に使用可能なレベルが上昇している、実施形態３５−３９の植物細胞。
図１は、米国特許第２００５／００６４４７４号及び以下で述べるようなＧＦＰ細胞レポーターアッセイ系における、ＧＦＰを発現する細胞のパーセンテージによって測定した、遺伝子修復率を示すグラフである。ＺＦＮ変異体は「Ｘ−Ｙ」で表わされ、「Ｘ」は表番号を指し、「Ｙ」は、特定して選択された表の中でジンクフィンガーに与えられた番号を指す。例えば「２−２１」は、表２において２１番の列に示される配列、すなわちＨＡＱＲＣＧＬＲＧＳＱＬＶ（配列番号５３）を含むフィンガーを有するＺＦＮを指す。 図２は、様々な対のＺＦＮ変異体を使用した切断から生じるＣｅｌ−１シグナルのパーセンテージを示すグラフである。２回の実験の結果を、試料番号を参照して各々の対のＺＦＮについて示す。各々の試料について使用した変異体の対を右上の隅の箱に示しており、「ｗｔ ５−８」及び「ｗｔ ５−９」は、米国特許出願第２００５／００６４４７４号の実施例１４（表１７）に開示されている正準ＺＦＮ対を指す。試料３−１２では、正準ＺＦＮ ５−８又は５−９のフィンガー２又はフィンガー４の認識らせんのＣ末端領域が非正準配列で置換されている。試料３−１２において２０、２１、４３、４５、４７及び４８と称される非正準ＺＦＮ変異体の部分配列及び４個のフィンガーのＺＦＮ内のこれらの変異体のフィンガー位置を、グラフの左上の隅に示す。試料８及び９についての実験２からの結果を示すバーの上の星印は、ＺＦＮ効率の過小評価を生じさせる、レーン内のバックグラウンドを指示する。 図３は、米国特許第２００５／００６４４７４号及びここで述べるＧＦＰ細胞レポーターアッセイ系における遺伝子修復率を示すグラフである。各試料において試験したＺＦＮ対を各々のバーの下に示しており、その中でジンクフィンガー番号２０、２１、４３、４５、４７及び４８は実施例３で述べるものであり、ＣＣＨＣジンクフィンガー１ａ−１０ａは表３及び４に示す配列を含む。ジンクフィンガー２０、２１、７ａ、８ａ、９ａ及び１０ａをフィンガー４において使用した；ジンクフィンガー４３、４５、４７、４８、１ａ、２ａ、３ａ、４ａ、５ａ及び６ａをフィンガー２において使用した。 図４は、タバコについての標的ベクターである、プラスミドｐＤＡＢ１５８５の線状の図式的表示である。 図５は、タバコについての標的ベクターである、プラスミドｐＤＡＢ１５８５の図式的表示である。 図６Ａ及び６Ｂは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を示す。図６ＡはＺＦＮ結合の図式的表示である。図６Ｂは標的配列の配列を示す。 図７は、プラスミドｐＤＡＢ１４００の図式的表示である。 図８は、プラスミドｐＤＡＢ７８２の図式的表示である。 図９は、プラスミドｐＤＡＢ１５８２の図式的表示である。 図１０は、プラスミドｐＤＡＢ３５４の図式的表示である。 図１１は、プラスミドｐＤＡＢ１５８３の図式的表示である。 図１２は、プラスミドｐＤＡＢ２４０７の図式的表示である。 図１３は、プラスミドｐＤＡＢ１５８４の図式的表示である。 図１４は、プラスミドｐＤＡＢ２４１８の図式的表示である。 図１５は、プラスミドｐＤＡＢ４０４５の図式的表示である。 図１６は、プラスミドｐＤＡＢ１５７５の図式的表示である。 図１７は、プラスミドｐＤＡＢ１５７７の図式的表示である。 図１８は、プラスミドｐＤＡＢ１５７９の図式的表示である。 図１９は、プラスミドｐＤＡＢ１５８０の図式的表示である。 図２０は、プラスミドｐＤＡＢ３４０１の図式的表示である。 図２１は、プラスミドｐＤＡＢ１５７０の図式的表示である。 図２２は、プラスミドｐＤＡＢ１５７２の図式的表示である。 図２３は、プラスミドｐＤＡＢ４００３の図式的表示である。 図２４は、プラスミドｐＤＡＢ１５７１の図式的表示である。 図２５は、プラスミドｐＤＡＢ７２０４の図式的表示である。 図２６は、プラスミドｐＤＡＢ１５７３の図式的表示である。 図２７は、プラスミドｐＤＡＢ１５７４の図式的表示である。 図２８は、プラスミドｐＤＡＢ１５８１の図式的表示である。 図２９は、プラスミドｐＤＡＢ１５７６の図式的表示である。 図３０は、プラスミドｐＤＡＢ１６００の図式的表示である。 図３１は、プラスミドｐＤＡＢ３７３１の図式的表示である。 図３２は、プラスミドｐＤＡＢ４３２２の図式的表示である。 図３３は、プラスミドｐＤＡＢ４３３１の図式的表示である。 図３４は、プラスミドｐＤＡＢ４３３２の図式的表示である。 図３５は、プラスミドｐＤＡＢ４３３３の図式的表示である。 図３６は、プラスミドｐＤＡＢ４３３４の図式的表示である。 図３７は、プラスミドｐＤＡＢ４３３６の図式的表示である。 図３８は、プラスミドｐＤＡＢ４３３９の図式的表示である。 図３９は、プラスミドｐＤＡＢ４３２１の図式的表示である。 図４０は、プラスミドｐＤＡＢ４３２３の図式的表示である。 図４１は、プラスミドｐＤＡＢ４３４１の図式的表示である。 図４２は、プラスミドｐＤＡＢ４３４２の図式的表示である。 図４３は、プラスミドｐＤＡＢ４３４３の図式的表示である。 図４４は、プラスミドｐＤＡＢ４３４４の図式的表示である。 図４５は、プラスミドｐＤＡＢ４３４６の図式的表示である。 図４６は、プラスミドｐＤＡＢ４３３０の図式的表示である。 図４７は、プラスミドｐＤＡＢ４３５１の図式的表示である。 図４８は、プラスミドｐＤＡＢ４３５６の図式的表示である。 図４９は、プラスミドｐＤＡＢ４３５９の図式的表示である。 図５０は、プラスミドｐＤＡＢ７００２の図式的表示である。 図５１は、プラスミドｐＤＡＢ７０２５の図式的表示である。 図５２は、プラスミドｐＤＡＢ１５９１の図式的表示である。 図５３は、Ｓｃｄ２７ ＺＦＮのＰＣＲ増幅のために使用したＤＮＡ鋳型である、プラスミドｐｃＤＮＡ３．１−ＳＣＤ２７ａ−Ｌ０−Ｆｏｋ１の図式的表示である。 図５４は、プラスミドｐＤＡＢ１５９４の図式的表示である。 図５５は、プラスミドｐＤＡＢ１５９８の図式的表示である。 図５６は、プラスミドｐＤＡＢ１５７７の図式的表示である。 図５７は、プラスミドｐＤＡＢ１５７８の図式的表示である。 図５８は、ＰＡＴ遺伝子制御ベクターである、プラスミドｐＤＡＢ１６０１の図式的表示である。 図５９は、ＩＬ−１−Ｆｏｋ１融合タンパク質によって刺激した予測上の染色体内相同組換えの図式的表示である。 図６０は、陽性ＧＦＰ発現対照である、プラスミドｐＤＡＢ１５９０の図式的表示である。 図６１は、ＩＬ−１ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質によって刺激した予測上の染色体間相同組換えを示す図式である。 図６２は、Ｓｃｄ２７ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質によって刺激した予測上の染色体間相同組換えを示す図式である。 図６３は、組換え体のＰＣＲ分析を示すゲルである。左側の最初の４つのレーンはゲルの上部に表示されている。１−５と表示されるレーンは、Ｃ３Ｈ ＩＬ−１−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子によるＢＹ２−３８０の形質転換からのＨＲ事象を示す。６−７と表示されるレーンは、Ｃ３Ｈ ＳＣＤ２７−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子によるＢＹ２−３８０の形質転換からのＨＲ事象を示す。 図６４は、トウモロコシＩＰＰ２Ｋに標的されるＺＦＮの工作のための設計鋳型として使用した、ＨｉＩＩ細胞培養に由来するトウモロコシＩＰＰ２Ｋ遺伝子配列（配列番号６）を示す。 図６５、パネルＡ−Ｅは、ＺＦＮ発現ベクタークローニングスキームを示す。ＺＦＮ発現構築物を作製するために段階的クローング戦略を使用した。二元（dual）タンパク質カセット（Ｃ）を創製するために個々のＺＦＮコード遺伝子をベクターｐＶＡＸ−Ｎ２Ａ−ＮＬＳｏｐ２−ＥＧＦＰ−ＦｏｋＭｏｎｏ（Ａ）及びｐＶＡＸ−Ｃ２Ａ−ＮＬＳｏｐ２−ＥＧＦＰ−ＦｏｋＭｏｎｏ（Ｂ）にクローニングした。このカセットをｐＤＡＢ３８７２（Ｄ）に連結して、ＺＦＮヘテロ二量体の発現のための最終プラスミド（Ｅ）を作製した。 図６６は、トウモロコシＩＰＰ２Ｋ遺伝子におけるＺＦＮ結合を示す。ＤＮＡの二本鎖切断を実施するためには２個のＺＦＮタンパク質が必要である。切断部位（下向き矢印で指示されている）の周囲の配列を示す（配列番号７）。１個のタンパク質（８７０５）は配列ＣＴＧＴＧＧＧＧＣＣＡＴ（上の鎖）（配列番号８）に結合し、もう１つのタンパク質（８６８４、８６８５又は８６８６）は下流の配列（ＣＴＴＧＡＣＣＡＡＣＴＣＡＧＣＣＡＧ、下の鎖）（配列番号９）に結合する。 図６７は、野生型（上の配列、配列番号１０）及びＺＦＮクローン１２７（下の配列、配列番号１１）の配列を示す。このＺＦＮについての切断標的を灰色の箱でハイライト表示する。 図６８は、４５４配列決定によって検出されるトウモロコシＩＰＰ２Ｋ遺伝子内のＺＦＮを介したｄｓＤＮＡ切断の非相同的末端接合（ＮＨＥＪ）から生じる多数の欠失のアラインメントを示す。このＺＦＮについての切断標的を灰色の箱でハイライト表示する。 図６９は、米国特許第２００５／００６４４７４号及びここで述べるＧＦＰ細胞レポーターアッセイ系における遺伝子修復率を示すグラフである。各試料において試験したＺＦＮ対を各々のバーの下に示す。 図７０は、実施例１８Ｂで述べるように構築した、プラスミドｐＤＡＢ７４７１を示す。 図７１は、実施例１８Ｃで述べるように構築した、プラスミドｐＤＡＢ７４５１を示す。 図７２は、例示的な自律的除草剤耐性遺伝子発現カセットを示す図式である。この構築物は、実施例１８Ｄで述べるようにプロモーター、除草剤耐性遺伝子及びポリアデニル化（ポリＡ）終結配列を含む完全なプロモーター転写ユニット（ＰＴＵ）を含む。 図７３は、実施例１８Ｅで述べるように構築された、プラスミドｐＤＡＢ７４２２を示す。このプラスミドは、ポジション−１のプラスミド骨格に挿入されたプロモーター、除草剤耐性遺伝子及びポリアデニル化（ポリＡ）終結配列を含む完全なプロモーター転写ユニット（ＰＴＵ）を含む。 図７４は、実施例１８Ｅで述べるように構築された、プラスミドｐＤＡＢ７４５２を示す。このプラスミドは、ポジション−２のプラスミド骨格に挿入されたプロモーター、除草剤耐性遺伝子及びポリアデニル化（ポリＡ）終結配列を含む完全なプロモーター転写ユニット（ＰＴＵ）を含む。 図７５は、例示的な非自律的除草剤耐性遺伝子発現カセットを示す図式である。この構築物は、実施例１８Ｆで述べるように除草剤耐性遺伝子及びポリアデニル化（ポリＡ）終結配列を含む不完全なプロモーター転写ユニット（ＰＴＵ）を含む。 図７６は、実施例１８Ｇで述べるように構築された、プラスミドｐＤＡＢ７４２３を示す。このプラスミドは、ポジション−１のプラスミド骨格に挿入された除草剤耐性遺伝子及びポリアデニル化（ポリＡ）終結配列を含む不完全なプロモーター転写ユニット（ＰＴＵ）を含む。 図７７は、実施例１８Ｇで述べるように構築された、プラスミドｐＤＡＢ７４５４を示す。このプラスミドは、実施例１８Ｇで述べるようにポジション−２のプラスミド骨格に挿入された除草剤耐性遺伝子及びポリアデニル化（ポリＡ）終結配列を含む不完全なプロモーター転写ユニット（ＰＴＵ）を含む。 図７８は、実施例１８Ｈで述べるように構築された、プラスミドｐＤＡＢ７４２４（例示的なＧａｔｅｗａｙ（登録商標）対応のポジション−１自律的ドナー）を示す。 図７９は、実施例１８Ｈで述べるように構築された、プラスミドｐＤＡＢ７４２５（例示的なＧａｔｅｗａｙ（登録商標）対応のポジション−１自律的ドナー）を示す。 図８０は、実施例１８Ｈで述べるように構築された、プラスミドｐＤＡＢ７４２６を示す。ｐＤＡＢ７４２６は、ＺＦＮ発現カセットとポジション−１自律的ドナーを含む組み合わせプラスミド（combination plasmid）である。 図８１は、実施例１８Ｈで述べるように構築された、プラスミドｐＤＡＢ７４２７を示す。ｐＤＡＢ７４２７は、ＺＦＮ発現カセットとポジション−１自律的ドナーを含む組み合わせプラスミドである。 図８２は、ゲノムＤＮＡからのドナーＤＮＡ特異的配列の増幅を示す。３１７ｂｐ産物の存在は、実施例２０Ｃに示すようにトウモロコシカルス系統Ｎｏ．６１−７２のゲノムに挿入されたＰＡＴ遺伝子を含むドナーＤＮＡの存在の特徴である。ＨｉＩＩは野生型陰性対照を指示する。 図８３は、ドナーＤＮＡとＩＰＰ２Ｋに特異的なトウモロコシゲノム配列の間の５’境界配列の増幅を示す。ＩＰＰ２Ｋ遺伝子へのドナーの標的組込みに由来する二次的ＰＣＲ産物は、実施例２１Ａで述べるように１．６５ＫｂｐのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。ＨｉＩＩは野生型陰性対照を指示する。 図８４は、ドナーＤＮＡとＩＰＰ２Ｋに特異的なトウモロコシゲノム配列の間の３’境界配列の増幅を示す。ＩＰＰ２Ｋ遺伝子へのドナーの標的組込みに由来する二次的ＰＣＲ産物は、実施例２１Ａで述べるように１．９９ＫｂｐのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。ＨｉＩＩは野生型陰性対照を指示する。 図８５は、ゲノムとドナーの間の上流（５’）境界配列の増幅を示す。ＩＰＰ２Ｋ遺伝子（５’境界配列）へのドナーの標的組込みに由来するＰＣＲ産物は、実施例２１Ｂで述べるように１．３５Ｋｂｐの大きさのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。ＨｉＩＩは野生型陰性対照を指示する。 図８６は、ドナーとゲノムの間の下流（３’）境界配列の増幅を示す。ＩＰＰ２Ｋ遺伝子（３’境界配列）へのドナーの標的組込みに由来するＰＣＲ産物は、実施例２１Ｂで述べるように１．６６Ｋｂｐの大きさのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。ＨｉＩＩは野生型陰性対照を指示する。 図８７は、ポジション−１の５’相同性フランク（5'-homology flank）（配列番号１７１）の配列を示す。 図８８は、ポジション−１の３’相同性フランク（配列番号１７２）の配列を示す。 図８９は、ポジション−２の５’相同性フランク（配列番号１３９）の配列を示す。 図９０は、ポジション−２の３’相同性フランク（配列番号１４０）の配列を示す。 図９１は、ＺＦＮ標的領域の上流（５’）ＩＰＰ２Ｋゲノム配列（配列番号１４１）の配列を示す。 図９２は、ＺＦＮ標的領域の下流（３’）ＩＰＰ２Ｋゲノム配列（配列番号１４２）の配列を示す。
Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓパターンの非正準ジンクフィンガーを含むジンクフィンガー結合ポリペプチド（ＺＦＰ）を含む組成物をここで開示する。亜鉛配位がジンクフィンガーのための主要な折りたたみエネルギーを提供するので、亜鉛配位残基の調節は、ジンクフィンガータンパク質の種々の重要な機能的特徴、例えば細胞半減期、他の細胞因子との相互作用、ＤＮＡ結合特異性及び親和性、及び機能性ドメインの相対的配向に影響を及ぼす、フィンガーの安定性と構造を改変するための容易な手段を提供する。
非正準ジンクフィンガー、例えば米国特許出願第２００３０１０８８８０号；同第２００６０２４６５６７号；及び同第２００６０２４６５８８号に開示されているものを含むジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡに結合して転写を変化させることが示された。しかし、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ、例えば米国特許出願第２００５／００６４４７４号参照）に組み込まれたとき、これらの以前に記述されている非正準ジンクフィンガータンパク質は、時として、標的ＤＮＡを切断するとき最適未満の活性を示し得る。
Ｃ末端対の亜鉛配位残基の周囲の特定配列が変化した、１又はそれ以上のＣＣＨＣジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質をここで述べる。また、そのＺＦＮが、正準（ＣＣＨＨ）ジンクフィンガーを含むＺＦＮを使用して達成される切断に匹敵する割合で標的ＤＮＡを切断する、これらの最適化された非正準ジンクフィンガーを含む融合タンパク質、例えばジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）もここで説明される。
ここで開示するような融合ポリペプチドは、遺伝子の転写を増強又は抑制する及び／又は標的配列を切断することができる。最適化非正準ジンクフィンガーをコードするポリヌクレオチド、及び１又はそれ以上の最適化非正準ジンクフィンガーを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも提供される。加えて、ここで述べるジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド又はその機能性フラグメントのいずれかの治療有効量；又は修飾されたジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド又はその機能性フラグメントのいずれかをコードするヌクレオチド配列の治療有効量を、医薬的に許容される担体と組み合わせて含有する医薬組成物が提供される。さらに、ここで述べるジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド又はその機能性フラグメントのいずれかの農学的有効量；又は修飾されたジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチド又はその機能性フラグメントのいずれかをコードするヌクレオチド配列の農学的有効量を、農学的に許容される担体と組み合わせて含有する農薬組成物が提供される。また、ゲノム配列に結合する修飾されたジンクフィンガーヌクレオチド結合ポリペプチドを得るためのスクリーニング方法も提供される。
ゲノム配列は、染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えばミトコンドリア、葉緑体）、人工染色体及び細胞内に存在する他の何らかの型の核酸、例えば増幅配列、二重微小染色体及び内因性又は感染細菌及びウイルスのゲノム中に存在するものを含む。ゲノム配列は、正常（すなわち野生型）又は突然変異型であり得る；突然変異型配列は、例えば挿入、欠失、置換、転座、再配列及び／又は点突然変異を含み得る。ゲノム配列はまた、多くの異なる対立遺伝子の１つを含み得る。
概要
ここで開示する方法の実施、並びにここで開示する組成物の調製と使用は、異なる指示がない限り、当分野の技術範囲内である、分子生物学、生化学、染色質構造の構造と分析、コンピュータ化学、細胞培養、組換えＤＮＡ及び関連分野における従来の手法を用いる。これらの手法は文献において詳細に説明されている。例えばSambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 and Third edition, 2001; Ausubel et al, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 and periodic updates; the series METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego; Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998; METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, 「Chromatin」 (P.M. Wassarman and A. P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999; and METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, 「Chromatin Protocols」 (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999参照。
定義
「核酸」、「ポリヌクレオチド」及び「オリゴヌクレオチド」という用語は同義的に使用され、線状又は環状立体配座の、一本鎖又は二本鎖形態である、デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示に関して、これらの用語はポリマーの長さに関する限定と解釈されるべきではない。前記用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体、並びに塩基、糖及び／又はリン酸部分（例えばホスホロチオエート骨格）において修飾されているヌクレオチドを包含し得る。一般に、特定ヌクレオチドの類似体は同じ塩基対合特異性を有する、すなわちＡの類似体はＴと塩基対合する。
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために同義的に使用される。これらの用語はまた、１又はそれ以上のアミノ酸が、対応する天然に生じるアミノ酸の化学的類似体又は修飾誘導体であるアミノ酸ポリマーにも適用される。
「結合」は、巨大分子の間の（例えばタンパク質と核酸の間の）配列特異的な非共有結合相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、必ずしも結合相互作用のすべての成分が配列特異的である必要はない（例えばＤＮＡ骨格内のリン酸残基との接触）。そのような相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１又はそれ以下の解離定数（Ｋｄ）によって特徴づけられる。「親和性」は、結合の強度を指す；高い結合親和性はより低いＫｄと相関する。
「結合タンパク質」は、もう１つ別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質である。結合タンパク質は、例えばＤＮＡ分子（ＤＮＡ結合タンパク質）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）及び／又はタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合タンパク質の場合は、それ自体に結合することができ（ホモ二量体、ホモ三量体等を形成する）及び／又は１又は複数の異なるタンパク質の１又はそれ以上の分子に結合することができる。結合タンパク質は２以上の型の結合活性を有し得る。例えばジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合及びタンパク質結合活性を有する。
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（又は結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位を通して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である、１又はそれ以上のジンクフィンガーを通して配列特異的にＤＮＡに結合するタンパク質又はより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、しばしばジンクフィンガータンパク質又はＺＦＰと略される。
ジンクフィンガー結合ドメインは、あらかじめ定められたヌクレオチド配列に結合するように「操作（engineered）」され得る。ジンクフィンガータンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計及び選択である。設計されたジンクフィンガータンパク質は、その設計／組成物が主として合理的基準から生じる、自然界では生じないタンパク質である。設計のための合理的基準は、置換規則の適用及び既存のＺＦＰ設計及び結合データの情報を蓄積するデータベース中の情報を処理するためのコンピュータアルゴリズムを含む。例えば米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；及び同第６，７８５，６１３号参照；また、国際公開公報第ＷＯ９８／５３０５８号；同第ＷＯ９８／５３０５９号；同第ＷＯ９８／５３０６０号；同第ＷＯ０２／０１６５３６号；及び同第ＷＯ０３／０１６４９６号；及び米国特許第６，７４６，８３８号；同第６，８６６，９９７号；及び同第７，０３０，２１５号も参照のこと。
「選択された」ジンクフィンガータンパク質は、その生産が主として経験的工程、例えばファージディスプレイ、相互作用トラップ又はハイブリッド選択から生じる、自然界では認められないタンパク質である。例えば米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；同第６，７３３，９７０号；米国特許第ＲＥ３９，２２９号；及び国際公開公報第ＷＯ９５／１９４３１号；同第ＷＯ９６／０６１６６号；同第ＷＯ９８／５３０５７号；同第ＷＯ９８／５４３１１号；同第ＷＯ００／２７８７８号；同第ＷＯ０１／６０９７０号；同第ＷＯ０１／８８１９７号及び同第ＷＯ０２／０９９０８４号参照。
「非正準」ジンクフィンガータンパク質は、非正準（非Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガーを含むタンパク質である。非正準ジンクフィンガーは、従って、天然に生じるＣ２Ｈ２ジンクフィンガータンパク質と比較して、少なくとも１個のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失を含む。非正準ジンクフィンガーの非限定的な例は、Ｃｙｓ−Ｃｙｓ−Ｈｉｓ−Ｃｙｓの亜鉛配位残基（アミノ末端からカルボキシ末端へ）を含むもの（例えばＣ３Ｈ）である。
「相同配列」は、２番目の配列とある程度の配列同一性を共有し、その配列が２番目の配列の配列と同一であり得る、１番目の配列を指す。「相同な非同一配列」は、２番目の配列とある程度の配列同一性を共有し、その配列が２番目の配列の配列と同一でない１番目の配列を指す。例えば突然変異型遺伝子の野生型配列を含むポリヌクレオチドは、突然変異型遺伝子の配列と相同であり、非同一である。ある実施形態では、２つの配列の間の相同性の程度は、通常の細胞機構を利用して、その間での相同組換えを許容するために十分である。２つの相同な非同一配列はいかなる長さであってもよく、非相同性の程度は、１個のヌクレオチド程度の小ささであってもよく（例えば標的相同組換えによるゲノム点突然変異の修正のため）又は１０キロ塩基又はそれ以上の大きさであってもよい（例えば染色体内のあらかじめ定められた部位での遺伝子の挿入のため）。相同な非同一配列を含む２つのポリヌクレオチドは、同じ長さである必要はない。例えば２０−１０，０００ヌクレオチド又はヌクレオチド対の外因性ポリヌクレオチド（すなわちドナーポリヌクレオチド）が使用できる。
核酸及びアミノ酸配列同一性を決定するための手法は当分野において公知である。典型的には、そのような手法は、遺伝子についてのｍＲＮＡのヌクレオチド配列を決定すること及び／又はそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、及びこれらの配列を２番目のヌクレオチド又はアミノ酸配列と比較することを含む。ゲノム配列も、このようにして決定し、比較することができる。一般に、同一性は、それぞれ２つのポリヌクレオチド又はポリペプチド配列の正確なヌクレオチド対ヌクレオチド又はアミノ酸対アミノ酸の対応性を指す。２又はそれ以上の配列（ポリヌクレオチド又はアミノ酸）を、それらの同一性パーセントを決定することによって比較できる。２つの配列の同一性パーセントは、核酸又はアミノ酸配列に関わらず、２つの整列した配列の間の正確な一致数をより短い配列の長さで除して、１００を乗じた数である。核酸配列についてのおおよそのアラインメントは、Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって提供される。このアルゴリズムは、Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure. M. O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D. C., USAによって開発され、Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)によって正規化されたスコアリングマトリックスを使用することにより、アミノ酸配列に適用できる。配列の同一性パーセントを決定するためのこのアルゴリズムの例示的な実行は、「ＢｅｓｔＦｉｔ」ユーティリティアプリケーションにおいて、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって提供される。この方法のためのデフォルトパラメータは、Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual,Version 8(1995)（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩより入手可能）に記載されている。本開示に関連して、同一性パーセントを確立する例示的な方法は、Ｊｏｈｎ Ｆ．Ｃｏｌｌｉｎｓ及びＳｈａｎｅ Ｓ．Ｓｔｕｒｒｏｋによって開発され、ＩｎｔｅｌｌｉＧｅｎｅｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）によって配給される、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈが版権を所有するプログラムのＭＰＳＲＣＨパッケージを用いることである。
この一式のパッケージから、スコアリング表のためにデフォルトパラメータを使用して（例えば１２のギャップオープンペナルティ、１のギャップ伸長ペナルティ及び６のギャップ）、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムが利用できる。作成したデータから、「一致（Match）」の値は「配列同一性」を反映する。配列間の同一性パーセント又は類似性パーセントを算定するための他の適切なプログラムは一般に当分野で公知であり、例えばもう１つの整列プログラムは、デフォルトパラメータで使用されるＢＬＡＳＴである。例えばＢＬＡＳＴＮ及びＢＬＡＳＴＰは、以下のデフォルトパラメータを用いて使用できる。遺伝暗号＝標準；フィルター＝なし；鎖＝両方；カットオフ＝６０；期待値＝１０；行列＝ＢＬＯＳＵＭ６２；記述（Descriptions）＝５０配列；ソート＝ＨＩＧＨ ＳＣＯＲＥ；データベース＝非重複、ＧｅｎＢａｎｋ＋ＥＭＢＬ＋ＤＤＢＪ＋ＰＤＢ＋ＧｅｎＢａｎｋ ＣＤＳ翻訳＋Ｓｗｉｓｓタンパク質＋Ｓｐｕｐｄａｔｅ＋ＰＩＲ。これらのプログラムの詳細はインターネットで検出される。ここで述べる配列に関して、配列同一性の所望程度範囲は、約３５％−１００％及びその間の整数値である。典型的には、配列間の同一性パーセントは、少なくとも３５％−４０％；４０％−４５％；４５％−５０％；５０％−６０％；６０％−７０％；７０−７５％、好ましくは８０−８２％、より好ましくは８５−９０％、さらに一層好ましくは９２％、なお一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性である。
あるいは、ポリヌクレオチドの間の配列類似性の程度は、相同領域の間で安定な二重鎖の形成を可能にする条件下でのポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション、続いて一本鎖特異的ヌクレアーゼでの消化及び消化されたフラグメントの大きさの決定によって決定され得る。２つの核酸又は２つのポリペプチド配列は、上記の方法を用いて決定したとき、これらの配列が分子の定義された長さにわたって少なくとも約７０％−７５％、好ましくは８０−８２％、より好ましくは８５−９０％、さらに一層好ましくは９２％、なお一層好ましくは９５％、最も好ましくは９８％の配列同一性を示すとき、互いに実質的に相同である。ここで使用されるとき、実質的に相同とはまた、指定されたＤＮＡ又はポリペプチド配列に対して完全な同一性を示す配列を指す。実質的に相同であるＤＮＡ配列は、その特定システムについて定義される、例えばストリンジェント条件下でのサザンハイブリダイゼーション実験において同定され得る。適切なハイブリダイゼーション条件を定義することは当分野の技術範囲内である。例えばSambrook et al., supra; Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press参照。
２つの核酸フラグメントの選択的ハイブリダイゼーションは以下のように判定できる。２つの核酸分子の間の配列同一性の程度は、そのような分子の間でのハイブリダイゼーション事象の効率及び強度に影響を及ぼす。部分的に同一の核酸配列は、完全に同一な配列の標的分子へのハイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する。完全に同一な配列のハイブリダイゼーションの阻害は、当分野で周知のハイブリダイゼーションアッセイ（例えばサザン（ＤＮＡ）ブロット法、ノーザン（ＲＮＡ）ブロット法、溶液ハイブリダイゼーション等、Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.参照)を用いて評価できる。そのようなアッセイは、様々な程度の選択性を用いて、例えば低ストリンジェンシーから高ストリンジェンシーまでにわたる条件を使用して実施できる。低ストリンジェンシーの条件を使用する場合は、非特異的結合事象が存在しなければ二次プローブが標的にハイブリダイズしないように、非特異的結合が存在しないことを、部分的な程度の配列同一性でさえも有さない二次プローブ（例えば標的分子と約３０％未満の配列同一性を有するプローブ）を用いて評価することができる。
ハイブリダイゼーションに基づく検出系を利用するときは、参照核酸配列に相補的な核酸プローブが選択され、次に適切な条件の選択により、プローブと参照配列が選択的にハイブリダイズするか又は互いに結合して二重鎖分子を形成する。中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照配列に選択的にハイブリダイズすることができる核酸分子は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と少なくとも約７０％の配列同一性を有する、少なくとも約１０−１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする条件下でハイブリダイズする。ストリンジェントハイブリダイゼーション条件は、典型的には、選択された核酸プローブの配列と約９０−９５％より高い配列同一性を有する、少なくとも約１０−１４ヌクレオチド長の標的核酸配列の検出を可能にする。プローブと参照配列が特定の程度の配列同一性を有する、プローブ／参照配列のハイブリダイゼーションのために有用なハイブリダイゼーション条件は、当分野で公知のように決定され得る（例えばNucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press参照）。
ハイブリダイゼーションのための条件は当業者に周知である。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーとは、ハイブリダイゼーション条件がミスマッチヌクレオチドを含むハイブリッドの形成に対して不利に働く程度を指し、より高いストリンジェンシーはミスマッチハイブリッドに対するより低い許容性と相関する。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに影響を及ぼす因子は当業者に周知であり、温度、ｐＨ、イオン強度、有機溶媒、例えばホルムアミド及びジメチルスルホキシドの濃度を含むが、これらに限定されない。当業者に公知のように、ハイブリダイゼーションストリンジェンシーは、より高い温度、より低いイオン強度及びより低い溶媒濃度によって上昇する。
ハイブリダイゼーションについてのストリンジェンシー条件に関して、例えば以下の因子を変化させることにより、特定のストリンジェンシーを確立するために数多くの等価条
件が使用できることは当分野において周知である。配列の長さ及び性質、様々な配列の塩基組成、塩及び他のハイブリダイゼーション溶液成分の濃度、ハイブリダイゼーション溶液におけるブロッキング剤の存在又は不在（例えばデキストラン硫酸及びポリエチレングリコール）、ハイブリダイゼーション反応温度及び時間パラメータ、並びに様々な洗浄条件。特定セットのハイブリダイゼーション条件の選択は、当分野における標準的方法に従って選択される（例えばSambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N. Y.参照）。
「組換え」は、２つのポリヌクレオチドの間での遺伝情報の交換の過程を指す。この開示に関して、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば細胞における二本鎖断裂の修復の間に起こるそのような交換の特殊な形態を指す。この過程は、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、「標的」分子（すなわち二本鎖断裂を経験した分子）の修復の鋳型となる「ドナー」分子を使用して、ドナーから標的への遺伝情報の転移を導くので、「非乗換え（non-crossover）遺伝子変換」又は「短路（short tract）遺伝子変換」のように様々に知られる。特定の理論に縛られるのは望むところではないが、そのような転移は、断裂された標的とドナーの間で形成されるヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ修復、及び／又はドナーが、標的の一部となる遺伝情報を再合成するために使用される、「合成依存性鎖アニーリング」、及び／又は関連過程を含み得る。そのような特殊なＨＲはしばしば、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部又は全部が標的ポリヌクレオチドに組み込まれるように、標的分子の配列の変化を生じさせる。
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破壊を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的又は化学的加水分解を含むが、これらに限定されない様々な方法によって開始され得る。一本鎖切断及び二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２つの個別の一本鎖切断事象の結果として起こり得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端又は付着末端のいずれかの生産を生じ得る。ある実施形態では、融合ポリペプチドが標的二本鎖ＤＮＡ切断のために使用される。
「切断ドメイン」は、ＤＮＡ切断のための触媒活性を有する１又はそれ以上のポリペプチド配列を含む。切断ドメインは一本のポリペプチド鎖に含まれ得るか、又は２つの（又はそれ以上の）ポリペプチドの会合から切断活性が生じ得る。
「切断ハーフドメイン」は、２番目のポリペプチド（同一か又は異なる）と共に切断活性（例えば二本鎖切断活性）を有する複合体を形成するポリペプチド配列である。
「切断ドメイン」及び「切断ハーフドメイン」という用語は、野生型ドメイン、及び多量体化（例えば二量体化）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持する、切断ドメイン又は切断ハーフドメインの部分又は突然変異体を包含する。
「クロマチン（染色質）」は、細胞質ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主としてＤＮＡ、及びヒストンと非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含有する。真核細胞クロマチンの大部分はヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３及びＨ４の各々２個を含む八量体と結合した約１５０塩基対のＤＮＡを含み、リンカーＤＮＡ（生物に依存して異なる長さの）がヌクレオソームコアの間に伸びる。ヒストンＨ１の１分子が一般にリンカーＤＮＡと結合する。本開示に関して、「クロマチン」という用語は、原核生物及び真核生物の両方の、すべての型の細胞核タンパク質を包含することが意図されている。細胞クロマチンは、染色体クロマチンとエピソームクロマチンの両方を含む。
「染色体」は、細胞のゲノムの全部又は部分を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムはしばしば、細胞のゲノムを含むすべての染色体のコレクションである、その核型によって特徴づけられる。細胞のゲノムは１又はそれ以上の染色体を含み得る。
「エピソーム」は、複製核酸、核タンパク質複合体又は細胞の染色体核型の部分ではない核酸を含む他の構造である。エピソームの例は、プラスミド及び一部のウイルスゲノムを含む。
「アクセス可能領域（accessible region）」は、核酸内に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞クロマチン内の部位である。特定の理論に縛られるのは望むところではないが、アクセス可能領域はヌクレオソーム構造内にパッケージングされない領域であると考えられる。アクセス可能領域の明確な構造は、しばしば化学的及び酵素的プローブ、例えばヌクレアーゼに対するその感受性によって検出され得る。
「標的部位」又は「標的配列」は、結合のための十分な条件が存在することを条件として、結合分子が結合する核酸の部分を定義する核酸配列である。例えば配列５’−ＧＡＡＴＴＣ−３’は、ＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼについての標的部位である。
「外因性」分子は、通常は細胞中に存在しないが、１又はそれ以上の遺伝的、生化学的又は他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「細胞中の通常の存在」は、細胞の特定発生段階及び環境条件に関して決定される。従って例えば、筋の胚発生の間のみ存在する分子は、成体筋細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックを受けていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば機能不全内因性分子の機能型又は正常機能性の内因性分子の機能不全型を含み得る。
外因性分子は、数ある中でも特に、コンビナトリアル化学工程によって生成される低分子、巨大分子、例えばタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖、上記分子の何らかの修飾誘導体、又は上記分子の１又はそれ以上を含む何らかの複合体であり得る。核酸は、ＤＮＡ及びＲＮＡを含み、一本鎖又は二本鎖であり得、線状、分枝又は環状であり得、いかなる長さでもあり得る。核酸は、二重鎖を形成することができるもの、並びに三重鎖形成核酸を含む。例えば米国特許第５，１７６，９９６号及び同第５，４２２，２５１号参照。タンパク質は、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ジャイレース及びヘリカーゼを含むが、これらに限定されない。
外因性分子は、内因性分子と同じ型の分子、例えば外因性タンパク質又は核酸であり得る。例えば外因性核酸は、感染ウイルスゲノム、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefacians）Ｔ鎖、細胞に導入されたプラスミド又はエピソーム、又は細胞中に通常は存在しない染色体を含み得る。外因性核酸又はポリヌクレオチドは、しかし、内因性配列に相同又は同一である配列を含み得る。特定の内因性ゲノム領域に関して、「外因性配列」は、その領域には存在しないヌクレオチド配列を指す。そのような外因性配列は、別の内因性染色体位置に存在してもよく又はゲノム内に全く存在しなくてもよい。従って、外因性ポリヌクレオチドは、外因性と内因性の両方の配列を含み得る；例えばゲノム領域に相同な配列によって隣接された導入遺伝子を含み得る。そのような外因性核酸は、以下で述べるような標的組込み及び標的組換えのための方法において使用される。外因性分子を細胞に導入するための方法は当業者に公知であり、脂質媒介移入（すなわち中性及びカチオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔法、直接注入、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈法、ＤＥＡＥデキストラン媒介移入及びウイルスベクター媒介移入を含むが、これらに限定されない。
これに対し、「内因性」分子は、特定環境条件下で特定発生段階において特定細胞中に通常存在するものである。例えば内因性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体又は他の細胞小器官のゲノム、又は天然に生じるエピソーム核酸を含み得る。さらなる内因性分子は、タンパク質、例えば転写因子及び酵素を含み得る。
「融合」分子は、２又はそれ以上のサブユニット分子が、例えば共有結合的に、連結されている分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子であり得るか又は異なる化学型の分子であり得る。１番目の型の融合分子の例は、融合タンパク質（例えばＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインとの間の融合）及び融合核酸（例えば上述した融合タンパク質をコードする核酸）を含むが、これらに限定されない。２番目の型の融合分子の例は、三重鎖形成核酸とポリペプチドとの間の融合、及び副溝結合物質と核酸との間の融合を含むが、これらに限定されない。
細胞における融合タンパク質の発現は、融合タンパク質の細胞への送達から又は融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの細胞への送達によって生じ得るが、後者の場合は、ポリヌクレオチドが転写され、転写産物が翻訳されて融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断及びポリペプチド連結も、細胞におけるタンパク質の発現に関与し得る。細胞へのポリヌクレオチド及びポリペプチドの送達のための方法は、本開示中の別の部分に示されている。
本開示に関して、「遺伝子」は、遺伝子産物（以下参照）をコードするＤＮＡ領域、並びに、そのような調節配列がコード配列及び／又は転写配列に隣接するかしないに関わらず、遺伝子産物の生産を調節するすべてのＤＮＡ領域を含む。従って、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えばリボゾーム結合部位及び内部リボゾーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス結合部位及び遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
「遺伝子発現」は、遺伝子中に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子（例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造ＲＮＡ又は他の何らかの型のＲＮＡ）の直接転写産物又はｍＲＮＡの翻訳によって生産されるタンパク質であり得る。遺伝子産物はまた、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化及びエディティングのような工程によって修飾されたＲＮＡ、及び、例えばメチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化及びグリコシル化によって修飾されたタンパク質を包含する。
遺伝子発現の「調節」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現の調節は、遺伝子活性化及び遺伝子抑制を含み得るが、これらに限定されない。
「植物」細胞は、単子葉植物又は双子葉植物の細胞を含むが、これらに限定されない。単子葉植物の非限定的な例は、穀物用植物、例えばトウモロコシ、イネ、オオムギ、カラスムギ、コムギ、モロコシ、ライムギ、サトウキビ、パイナップル、タマネギ、バナナ及びココナツを含む。双子葉植物の非限定的な例は、タバコ、トマト、ヒマワリ、綿、サトウダイコン、ジャガイモ、レタス、メロン、ダイズ、キャノーラ（ナタネ）及びアルファルファを含む。植物細胞は、植物のいかなる部分から及び／又は植物発育のいかなる段階からであってもよい。
「対象領域」は、細胞クロマチンの何らかの領域、例えば遺伝子又は、外因性分子に結合することが望ましい、遺伝子内又は遺伝子に隣接する非コード配列である。結合は、標的ＤＮＡ切断及び／又は標的組換えのためであり得る。対象領域は、例えば染色体、エピソーム、細胞小器官ゲノム（例えばミトコンドリア、葉緑体）、又は感染ウイルスゲノム中に存在し得る。対象領域は、遺伝子のコード領域内、転写された非コード領域内、例えばリーダー配列、トレーラー配列又はイントロン内、又はコード領域の上流又は下流の非転写領域内であり得る。対象領域は、１個のヌクレオチド対の小ささ又は２５，０００ヌクレオチド対までの長さ、又はいかなる整数値のヌクレオチド対であってもよい。
「作動可能連結」及び「作動可能に連結された」という用語は、２又はそれ以上の成分（配列エレメントのような）が、両方の成分が正常に機能し、成分の少なくとも１つがその他の成分の少なくとも１つに対して及ぼされる機能を媒介し得ることを可能にするように配置されている、２又はそれ以上の成分の並置に関して同義的に使用される。例示として、転写調節配列、例えばプロモーターは、転写調節配列が１又はそれ以上の転写調節因子の存在又は不在に応答してコード配列の転写のレベルを制御する場合、コード配列に作動可能に連結されている。転写調節配列は、一般にコード配列とシスで作動可能に連結されているが、必ずしもそれに直接隣接する必要はない。例えばエンハンサーは、コード配列と隣接していない場合でも、コード配列に作動可能に連結された転写調節配列である。
融合ペプチドに関して、「作動可能に連結された」という用語は、成分の各々が、そのように連結されていない場合でも、その他の成分に連結されているのと同じ機能を果たすという事実を指し得る。例えばＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインが切断ドメインに融合している融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチド内で、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメイン部分がその標的部位及び／又はその結合部位に結合することができ、一方切断ドメインが標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと切断ドメインは作動可能に連結されている。
タンパク質、ポリペプチド又は核酸の「機能性フラグメント」は、その配列が完全長タンパク質、ポリペプチド又は核酸と同一ではないが、完全長タンパク質、ポリペプチド又は核酸と同じ機能を保持するタンパク質、ポリペプチド又は核酸である。機能性フラグメントは、対応する天然（native）分子より多い、少ない又は同数の残基を有し得る及び／又は１又はそれ以上のアミノ酸又はヌクレオチド置換を含み得る。核酸の機能（例えばコード機能、もう１つ別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は当分野において周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法も周知である。例えばポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えばフィルター結合アッセイ、電気泳動移動度シフトアッセイ又は免疫沈降アッセイによって決定され得る。ＤＮＡ切断はゲル電気泳動によって検定できる。Ausubel et al., supra参照。タンパク質がもう１つ別のタンパク質と相互作用する能力は、例えば共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイ、又は遺伝的及び生化学的な相補性によって決定され得る。例えばFields et al. (1989) Nature 340:245-246;米国特許第５，５８５，２４５号及び国際公開公報第ＰＣＴ ＷＯ９８／４４３５０号参照。
ジンクフィンガー結合ドメイン
非正準ジンクフィンガー結合ドメイン及びこれらのジンクフィンガー結合ドメインをコードするポリヌクレオチドをここで述べる。ある実施形態では、ここで述べる非正準ジンクフィンガー結合ドメインは、２個の保存された亜鉛に配位するヒスチジン残基の１個がシステインに変換されている、Ｃ３Ｈジンクフィンガーである。付加的な実施形態では、Ｃ末端に最も近いヒスチジン残基がシステイン残基に変換されて、「ＣＣＨＣタンパク質」を生成する。
ジンクフィンガー結合ドメインは、１又はそれ以上のジンクフィンガー（例えば２、３、４、５、６、７、８、９又はそれ以上のジンクフィンガー）を含むことができ、何らかの標的配列（例えばゲノム配列）に結合するように操作することができる。ジンクフィンガー結合ドメインは、ＤＮＡ、ＲＮＡ及び／又はタンパク質に結合し得る。典型的には１つのジンクフィンガードメインは約３０アミノ酸長である。ジンクフィンガーは、正準Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー（すなわち亜鉛イオンが２個のシステインと２個のヒスチジン残基によって配位されているもの）及び、例えばＣ３Ｈジンクフィンガー（亜鉛イオンが３個のシステイン残基と１個のヒスチジン残基によって配位されているもの）を含む、非正準ジンクフィンガーの両方を包含する。その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００３０１０８８８０号、同第２００６０２４６５６７号及び同第２００６０２４６５８８も参照のこと。
構造試験は、正準ジンクフィンガードメイン（モチーフ）が、２つのβシート（２個の不変のシステイン残基を含むβターンに保持される）と１つのαらせん（２個の不変のヒスチジン残基を含む）を含み、それらが２個のシステインと２個のヒスチジンによる亜鉛原子の配位を通して特定立体配座に保持されていることを明らかにした。ここで開示する非正準ジンクフィンガーは、このβ−β−α構造を保持する。
ここで述べる非正準ジンクフィンガーは、天然に生じるジンクフィンガー結合ドメインであり得る。しかし、より典型的には、ここで述べる非正準ジンクフィンガーは、亜鉛に配位するシステイン又はヒスチジン残基の少なくとも１個が１又はそれ以上のアミノ酸で置換された、１又はそれ以上のジンクフィンガー成分を含む。例えばある実施形態では、正準ジンクフィンガー結合分子のＣ末端Ｈｉｓ残基がＣｙｓ残基で置換されている。
ここで述べるＣＣＨＣジンクフィンガーはまた、亜鉛配位残基以外のアミノ酸残基の配列内に１又はそれ以上の変化（天然に生じるＣ２Ｈ２ジンクフィンガーの配列に対して）を含み得る。そのような変化は、置換、欠失及び／又は挿入を含み得る。アミノ酸は、ジンクフィンガー内のどこで変化していてもよい。変化の非限定的な例は以下を含む。（１）変化した亜鉛配位残基の周囲の１個の残基の置換；（２）変化した亜鉛配位残基の前後の余分な残基の付加（例えばＣ末端に最も近いＨｉｓ残基がＣｙｓ残基に変換されている場合、余分なアミノ酸残基の付加は、より短いシステイン側鎖を代償することによって亜鉛配位を促進し得る）；及び／又は（３）天然に生じるＣＣＨＣジンクフィンガーのＨｉｓ及びＣｙｓ残基の間に位置する残基の、非正準ＣＣＨＣジンクフィンガーの対応する領域への置換。
ある実施形態では、ここで述べるジンクフィンガータンパク質は、非正準ジンクフィンガーがＤＮＡ結合に関与するらせん部分を有し、らせん部分の亜鉛配位領域がアミノ酸配列ＨＸ１Ｘ２ＲＣＸＬ（配列番号２）を含み、及びジンクフィンガータンパク質が標的配列に結合するように操作されている、非正準（非Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガーを含む少なくとも１つのジンクフィンガーを含有する。ある実施形態では、Ｘ１はＡ又はＫ又はＴであり、Ｘ２はＱ又はＥ又はＲであり、及びＸＬはＧである。
他の実施形態では、ここで述べる非正準ジンクフィンガーは、一般構造：Ｃｙｓ−（ＸＡ）２−４−Ｃｙｓ−（ＸＢ）１２−Ｈｉｓ−（ＸＣ）３−５−Ｃｙｓ−（ＸＤ）１−１０（配列番号３）［式中、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ及びＸＤはいずれかのアミノ酸を表す］を有する。ＸＣが３個の残基を含む実施形態では、（ｉ）これらの残基の少なくとも１個は正準ＣＣＨＣジンクフィンガーに比べて変化している；及び／又は（ｉｉ）ＸＤは正準ＣＣＨＣジンクフィンガーに比べて少なくとも１つの欠失、置換又は挿入を含む。ある実施形態では、ＸＤは配列ＱＬＶ又はＱＫＰを含む。他の実施形態では、ＸＤは１又はそれ以上の（例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０）Ｇｌｙ（Ｇ）残基を含む。
例示的な非正準ジンクフィンガーの部分アミノ酸配列（３番目の亜鉛配位残基及びそのＣ末端側を含む）を表１、２、３及び４に示す。すべての表において、２個のＣ末端に最も近い（すなわち３番目と４番目の）亜鉛配位残基（Ｈ及びＣ）に下線を付している。「野生型」非正準フィンガーの配列と比較したときの変化（例えば置換、挿入、欠失）（表１及び３の２行目）は、二重の下線で示す。





上述したように、ＺＦＰはどのような数のジンクフィンガー結合ドメインも、例えば少なくとも３個のジンクフィンガーを含み得る。さらに、ジンクフィンガーの１個、２個以上又は全部がここで述べる非正準ジンクフィンガーであり得る。
ある実施形態では、多フィンガーのジンクフィンガータンパク質のＣ末端に最も近いフィンガーは、正準ジンクフィンガーを含む。他の実施形態では、多数の指のジンクフィンガータンパク質のＣ末端に最も近いフィンガーは、ここで述べるＣＣＨＣフィンガー、例えばＣ末端に最も近い亜鉛配位Ｃｙｓ残基のＣ末端側に１又はそれ以上のアミノ酸挿入を含むＣＣＨＣフィンガーを含む。フィンガー２（Ｆ２）及び／又はフィンガー４（Ｆ４）がここで述べる非正準ジンクフィンガーである、４フィンガーのジンクフィンガータンパク質を述べる、実施例１−５参照。
ジンクフィンガー結合ドメインは、選択配列に結合するように操作することができる。例えばBeerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141; Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340; Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656- 660; Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637; Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416参照。操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に生じるジンクフィンガータンパク質と比較して、新規結合特異性を有し得る。操作の方法は、合理的設計及び様々なタイプの選択（例えば複数の異なるジンクフィンガー配列を１つの標的ヌクレオチド配列に対してスクリーニングする方法）を含むが、これらに限定されない。合理的設計は、例えばトリプレット（又はクアドラプレット）ヌクレオチド配列を含むデータベースと個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を使用して、各々のトリプレット又はクアドラプレットヌクレオチド配列を、特定のトリプレット又はクアドラプレットヌクレオチド配列に結合するジンクフィンガーの１又はそれ以上のアミノ酸配列と関連づけることを含む。例えば共有米国特許第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号参照。さらなる設計方法は、例えば米国特許第６，７４６，８３８号；同第６，７８５，６１３号；同第６，８６６，９９７号；及び同第７，０３０，２１５号に開示されている。ジンクフィンガー結合ドメインの結合特異性の増強は、例えば共有米国特許第６，７９４，１３６号に述べられている。
ファージディスプレイ及びツーハイブリッドシステムを含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；及び同第６，２４２，５６８号；並びに国際公開公報第ＷＯ９８／３７１８６号；同第ＷＯ９８／５３０５７号；同第ＷＯ００／２７８７８号；同第ＷＯ０１／８８１９７号及び英国特許第ＧＢ２，３３８，２３７号に開示されている。
個々のジンクフィンガーは３ヌクレオチド（すなわちトリプレット）配列（又は隣接ジンクフィンガーの４ヌクレオチド結合部位と１ヌクレオチドによってオーバーラップし得る４ヌクレオチド配列）に結合するので、ジンクフィンガー結合ドメインが結合するように操作される配列（例えば標的配列）の長さが、操作されたジンクフィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガーの数を決定する。例えばジンクフィンガーモチーフがオーバーラップサブサイトに結合しないＺＦＰに関して、６ヌクレオチドの標的配列は２フィンガー結合ドメインによって結合される；９ヌクレオチド標的配列は３フィンガー結合ドメインによって結合される等。標的配列内の個々のジンクフィンガーについての結合部位（すなわちサブサイト）は隣接している必要はなく、多フィンガー結合ドメイン内のジンクフィンガーの間のアミノ酸配列（すなわちフィンガー間リンカー）の長さと性質に依存して、１又はいくつかのヌクレオチドによって分離され得る。例えばその開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号及び同第７，１５３，９４９号及び米国特許出願第２００３／０１１９０２３号参照。
多フィンガーのジンクフィンガー結合ドメインにおいて、隣接ジンクフィンガーは、約５アミノ酸のアミノ酸リンカー配列（いわゆる「正準」フィンガー間リンカー）によって、あるいは１又はそれ以上の非正準リンカーによって分離され得る。例えば共有米国特許第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号参照。４以上のフィンガーを含む操作されたジンクフィンガー結合ドメインに関して、ジンクフィンガーの一部の間により長い（「非正準」）フィンガー間リンカー配列を挿入することは、結合ドメインによる結合の親和性及び／又は特異性を上昇させ得る。例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４７９，６２６号及び米国特許出願第２００３／０１１９０２３号参照。従って、多フィンガーのジンクフィンガー結合ドメインはまた、非正準フィンガー間リンカーの存在及び位置に関して特性決定され得る。より長いフィンガー間リンカーの使用はまた、非隣接ヌクレオチドを含む標的部位へのジンクフィンガータンパク質の結合を促進し得る。その結果として、ジンクフィンガー結合ドメインについての標的部位内の１又はそれ以上のサブサイトは、１、２、３、４、５又はそれ以上のヌクレオチドによって互いから分離され得る。一例を挙げると、４フィンガー結合ドメインは、配列内に、２つの隣接する３ヌクレオチドサブサイト、介在ヌクレオチド及び２つの隣接するトリプレットサブサイトを含む１３ヌクレオチド標的部位に結合し得る。
標的サブサイトは、単一のジンクフィンガーによって結合されるヌクレオチド配列（一般に３又は４ヌクレオチド）である。しかし、標的部位が３ヌクレオチドの倍数である必要はない。例えば交差鎖相互作用が起こる場合（例えば米国特許第６，４５３，２４２号及び同第６，７９４，１３６号参照）、多フィンガー結合ドメインの個々のジンクフィンガーの１又はそれ以上が、オーバーラップするクアドラプレットサブサイトに結合することができる。米国特許第６，７４６，８３８号及び同第６，８６６，９９７号も参照のこと。一例として、３フィンガー結合ドメインは、３つのオーバーラップする４ヌクレオチドサブサイトを含む１０ヌクレオチド標的部位に結合し得る。
ジンクフィンガードメインによる結合のための細胞クロマチン内の配列（例えば標的部位）の選択は、例えば共有米国特許第６，４５３，２４２号（２００２年９月１７日）に開示されている方法に従って実施でき、前記特許はまた、選択した配列に結合するＺＦＰを設計するための方法も開示する。標的部位の選択のためにヌクレオチド配列の簡単な目視検査も使用できることは当業者に明白である。従って、標的部位選択のためのいかなる手段も、ここで述べる方法において使用できる。
多フィンガージンクフィンガータンパク質は、得られた個々のジンクフィンガーを、例えば設計又は選択によって連結することにより構築できる。あるいは、２個のジンクフィンガーからなる結合分子を、４及び６フィンガータンパク質を生成するために正準又はより長い非正準フィンガー間リンカー（上記参照）のいずれかを使用して、互いに連結することができる。そのような２フィンガーモジュールは、例えば、多フィンガータンパク質（一般に３フィンガー）に関して、特定の６ヌクレオチド標的配列に結合する２つの隣接フィンガーを選択することによって入手できる。例えばその開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開公報第ＷＯ９８／５３０５７号及び米国特許出願公開公報第２００３／０１１９０２３号参照。あるいは、個々のジンクフィンガーのアセンブリによって２フィンガーモジュールを構築することができる。
そこで、ここで述べるジンクフィンガードメインは、何らかの標的部位に結合する多フィンガージンクフィンガータンパク質を構築するために個別に又は様々な組み合わせで使用できる。
配列（例えば標的部位）間の距離とは、互いに最も近い配列の末端から測定したときの、２つの配列の間に介在するヌクレオチド又はヌクレオチド対の数を指す。
例えば切断が、分離した標的部位への２つのジンクフィンガードメイン／切断ハーフドメイン融合分子の結合に依存する、ＺＦＮを使用した実施形態では、２つの標的部位は反対のＤＮＡ鎖上に存在し得る。他の実施形態では、両方の標的部位は同じＤＮＡ鎖上に存在する。例えばその開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開公報第ＷＯ２００５／０８４１９０号参照。
ジンクフィンガー又はジンクフィンガータンパク質をコードするポリヌクレオチドも、本開示の範囲内である。これらのポリヌクレオチドは、標準的な手法を用いて構築し、ベクターに挿入することができ、コードされるタンパク質が細胞において発現されるようにベクターを細胞に導入することができる（ポリヌクレオチドを細胞に導入するためのベクター及び方法に関するさらなる開示については以下を参照のこと）。
融合タンパク質
ここで述べる１又はそれ以上の非正準ジンクフィンガー成分を含む融合タンパク質も提供される。
融合分子は、当業者に周知のクローニング及び生化学的結合の方法によって構築される。融合分子は、ＣＣＨＣ含有ＺＦＰ及び、例えば切断ドメイン、切断ハーフドメイン、転写活性化ドメイン、転写抑制ドメイン、クロマチンリモデリング複合体の成分、インスレータードメイン、これらのドメインのいずれかの機能性フラグメント；及び／又は２又はそれ以上の機能性ドメイン又はそのフラグメントの何らかの組み合わせを含む。
ある実施形態では、融合分子は、修飾された植物ジンクフィンガータンパク質及び少なくとも２つの機能性ドメイン（例えばインスレータードメイン又はメチル結合タンパク質ドメイン及び、さらに、転写活性化又は抑制ドメイン）を含む。
融合分子はまた、場合により核局在化シグナル（例えばＳＶ４０ Ｔ抗原又はトウモロコシＯｐａｑｕｅ−２ ＮＬＳからのもの）及びエピトープタグ（例えばＦＬＡＧ又は赤血球凝集素）を含む。融合タンパク質（及びそれらをコードする核酸）は、翻訳リーディングフレームが融合物の成分の間で保存されるように設計される。
融合タンパク質（及びそれらをコードするポリヌクレオチド）の設計と構築のための方法は当業者に公知である。例えばジンクフィンガータンパク質を含む融合タンパク質（及びこれをコードするポリヌクレオチド）の設計と構築のための方法は、共有米国特許第６，４５３，２４２号及び同第６，５３４，２６１号に述べられている。
そのような融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドも本開示の範囲内である。これらのポリヌクレオチドは、標準的な手法を用いて構築し、ベクターに挿入することができ、そのベクターを細胞に導入することができる（ポリヌクレオチドを細胞に導入するためのベクター及び方法に関するさらなる開示については以下を参照のこと）。
遺伝子発現を抑制するために使用される、ＺＦＰ ＤＮＡ結合ドメインと融合するための例示的な機能性ドメインは、ヒトＫＯＸ−１タンパク質からのＫＲＡＢ抑制ドメインである（例えばThiesen et al., New Biologist 2, 363-374 (1990); Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513 (1994); Pengue et al., Nucl. Acids Res. 22:2908-2914 (1994); Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4514- 4518 (1994)参照）。ＫＯＸドメインはまた、抑制ドメインとしての使用にも適する。もう１つの適切な抑制ドメインは、メチル結合ドメインタンパク質２Ｂ（ＭＢＤ−２Ｂ）である（Hendrich et al. (1999) Mamm Genome 10:906-912 for description of MBD proteinsも参照のこと）。もう１つの有用な抑制ドメインは、ｖ−ＥｒｂＡタンパク質と結合しているものである。例えばDamm, et al. (1989) Nature 339:593-597; Evans (1989) Int. J. Cancer Suppl. 4:26-28; Pain et al. (1990) New Biol. 2:284-294; Sap et al. (1989) Nature 340:242-244; Zenke et al. (1988) Cell 52:107-119; and Zenke et al. (1990) Cell 61:1035-1049参照。さらなる例示的な抑制ドメインは、甲状腺ホルモン受容体（ＴＲ）、ＳＩＤ、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２、ＭＢＤ３、ＭＢＤ４、ＭＢＤ様タンパク質、ＤＮＭＴファミリーの成員（例えばＤＮＭＴ１、ＤＮＭＴ３Ａ、ＤＮＭＴ３Ｂ）、Ｒｂ、ＭｅＣＰ１及びＭｅＣＰ２を含むが、これらに限定されない。例えばZhang et al. (2000) Ann Rev Physiol 62:439-466; Bird et al. (1999) Cell 99:451-454; Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446; Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450; and Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342参照。さらなる例示的な抑制ドメインは、ＲＯＭ２及びＡｔＨＤ２Ａを含むが、これらに限定されない。例えばChern et al. (1996) Plant Cell 8:305-321; and Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27参照。
活性化を達成するための適切なドメインは、ＨＳＶ ＶＰ１６活性化ドメイン（例えばHagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997)参照)、核内ホルモン受容体（例えばTorchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998)参照)；核内因子κＢのｐ６５サブユニット(Bitko & Barik, J. Virol. 72:5610-5618 (1998) and Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)); Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3- 28 (1998))、又はＶＰ６４のような人工的キメラ機能性ドメイン(Seifpal et al., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992))を含む。
さらなる例示的な活性化ドメインは、ｐ３００、ＣＢＰ、ＰＣＡＦ、ＳＲＣ１ ＰｖＡＬＦ及びＥＲＦ−２を含むが、これらに限定されない。例えばRobyr et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347; Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255- 275; Leo et al. (2000) Gene 245:1-11; Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89; McKenna et al. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12; Malik et al. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283; and Lemon et al. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504参照。さらなる例示的な活性化ドメインは、ＯｓＧＡＩ、ＨＡＬＦ−１、Ｃ１、ＡＰ１、ＡＲＦ−５、−６、−７及び−８、ＣＰＲＦ１、ＣＰＲＦ４、ＭＹＣ−ＲＰ／ＧＰ及びＴＲＡＢ１を含むが、これらに限定されない。例えばOgawa et al. (2000) Gene 245:21-29; Okanami et al. (1996) Genes Cells 1:87-99; Goff et al. (1991) Genes Dev. 5:298-309; Cho et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429; Ulmason et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849; Sprenger-Haussels et al. (2000) Plant J. 22:1-8; Gong et al. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44; and Hobo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353参照。
さらなる機能性ドメインは、例えば共有米国特許第６，９３３，１１３号に開示されている。さらに、融合分子における使用に適するインスレータードメイン、クロマチンリモデリングタンパク質、例えばＩＳＷＩ含有ドメイン、及びメチル結合ドメインタンパク質が、例えば共有の国際公開公報第ＷＯ０１／８３７９３号及び同第ＷＯ０２／２６９６０号に記載されている。
他の実施形態では、融合タンパク質は、ここで述べる１又はそれ以上のＣＣＨＣジンクフィンガーと切断ドメイン（又は切断ハーフドメイン）を含むジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）である。ジンクフィンガーは、任意の選択ゲノム領域内の標的配列を認識するように操作することができ、細胞に導入されたとき、融合タンパク質のその結合部位への結合及び前記ゲノム領域内又はその近傍での切断を生じさせる。そのような切断は、非相同末端連結後にゲノム領域のヌクレオチド配列の変化（例えば突然変異）を生じさせ得る。あるいは、ゲノム領域に相同な配列を含む外因性ポリヌクレオチドがそのような細胞内に同時に存在する場合は、ＺＦＮによる標的切断後に、ゲノム領域と外因性ポリヌクレオチドの間で高い比率で相同組換えが起こる。相同組換えは、外因性ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列に依存して、標的配列置換又は外因性配列の標的組込みを生じさせ得る。
ここで述べる非正準ジンクフィンガーは、ＺＦＮに組み込まれたとき改善された切断機能を提供する。実施例で述べるように、ここで述べる少なくとも１つのＣＣＨＣフィンガーを含む４フィンガーＺＦＮは、少なくとももっぱらＣＣＨＨフィンガーだけを含むヌクレアーゼと同程度に切断する。ある実施形態では、Ｃ末端フィンガーが非正準ＣＣＨＣジンクフィンガーを含むとき、３番目と４番目の亜鉛配位残基の間（すなわちＣ末端Ｈｉｓ残基とＣｙｓ残基の間）の残基は正準ＣＣＨＨジンクフィンガー中に存在するものとは異なり、また１又はそれ以上のグリシン残基（例えば１、２、３、４、５又はそれ以上）がＣ末端Ｃｙｓ残基の後に挿入される。
ここで開示するＺＦＮの切断ドメイン部分は、何らかのエンドヌクレアーゼ又はエキソヌクレアーゼから入手できる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼは、制限エンドヌクレアーゼ及びホーミングエンドヌクレアーゼを含むが、これらに限定されない。例えば2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA; and Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388参照。ＤＮＡを切断するさらなる酵素が公知である（例えばＳ１ヌクレアーゼ；マングビーンヌクレアーゼ；膵臓ＤＮアーゼＩ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ;Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993も参照のこと)。これらの酵素（又はその機能性フラグメント）の１又はそれ以上が、切断ドメイン及び切断ハーフドメインのソースとして使用できる。
同様に、切断ハーフドメインは、切断ハーフドメインが切断活性のために二量体化を必要とすることを条件として、上記に示すような何らかのヌクレアーゼ又はその部分に由来し得る。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、ゲノムＤＮＡの標的切断のためには２つの融合タンパク質が必要である。あるいは、２つの切断ハーフドメインを含む単一タンパク質が使用できる。２つの切断ハーフドメインは同じエンドヌクレアーゼに由来し得るか、又は各々の切断ハーフドメインが異なるエンドヌクレアーゼに由来し得る。加えて、２つの融合タンパク質についての標的部位は、２つの融合タンパク質のそれぞれの標的部位への結合が、切断ハーフドメインが例えば二量体化によって機能性切断ドメインを形成することを可能にする互いに対しての空間的方向に切断ハーフドメインを位置付けるように、互いに対して配置される。従ってある実施形態では、標的部位の近位端は５−８ヌクレオチド対又は１５−１８ヌクレオチド対によって分離される。付加的な実施形態では、標的部位は互いの１０ヌクレオチド対内である。しかし、いかなる整数のヌクレオチド又はヌクレオチド対も、２つの標的部位の間に介在し得る（例えば２−５０ヌクレオチド又はそれ以上）。一般に、切断点は標的部位の間に位置する。
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は多くの種において存在し、ＤＮＡ（認識部位の）に配列特異的に結合することができ、結合部位で又は結合部位の近くでＤＮＡを切断することができる。ある種の制限酵素（例えばＩＩＳ型）は、認識部位から離れた部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合ドメインと切断ドメインを有する。例えばＩＩＳ型酵素Ｆｏｋ Ｉは、１本の鎖上のその認識部位から９ヌクレオチド及び他方の鎖上のその認識部位から１３ヌクレオチドの位置でＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号及び同第５，４８７，９９４号;並びにLi et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279; Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768; Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887; Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982参照。そこで、１つの実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１つのＩＩＳ型制限酵素からの切断ドメイン（又は切断ハーフドメイン）及び、操作されていてもよく又は操作されていなくてもよい、１又はそれ以上のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能である、例示的なＩＩＳ型制限酵素はＦｏｋ Ｉである。この特殊な酵素は二量体として活性である。Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575。従って、本開示に関して、開示される融合タンパク質において使用されるＦｏｋ Ｉ酵素の部分は切断ハーフドメインとみなされる。従って、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合物を含むＺＦＮを使用した標的二本鎖切断及び／又は細胞配列の標的置換のために、各々がＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質が、触媒活性切断ドメインを再構成するために使用できる。あるいは、１つのジンクフィンガー結合ドメインと２つのＦｏｋ Ｉ切断ハーフドメインを含む単一ポリペプチド分子も使用できる。ジンクフィンガー−Ｆｏｋ Ｉ融合物を使用した標的切断及び標的配列変化のためのパラメータは、本開示中の別の部分で、及び例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願第２００５／００６４４７４号において提供される。
付加的な実施形態では、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインは、二量体形成に影響を及ぼす何らかのアミノ酸残基において１又はそれ以上の突然変異を含み得る。そのような突然変異は、ＺＦＰ／ＦｏｋＩ融合物の対の１つが、所望しない配列での切断を導き得るホモ二量体化を受けることを防ぐために有用であり得る。例えばＦｏｋＩの４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７及び５３８位のアミノ酸残基はすべて、二量体化に影響を及ぼす二量体形成界面に十分に近い。従って、上記位置の１又はそれ以上におけるアミノ酸配列変化は、切断ハーフドメインの二量体化特性を変化させるために使用できる。そのような変化は、例えばこれらの位置に異なるアミノ酸残基を含む（又はコードする）ライブラリーを構築し、所望特性を有する変異体を選択することによって、又は個々の突然変異体を合理的に設計することによって導入できる。ホモ二量体化を防ぐことに加えて、これらの突然変異の一部は、２つの野生型切断ハーフドメインで得られるものと比較して、切断効率を高めることも可能である。
そこで、一対のＺＦＰ／ＦｏｋＩ融合物を使用した標的切断のために、融合タンパク質の１つ又は両方が、自己二量体化を阻害するが、切断が所望標的部位で起こるように２つの融合タンパク質のヘテロ二量体化を生じさせ得る、１又はそれ以上のアミノ酸変化を含み得る。ある実施形態では、変化は両方の融合タンパク質内に存在し、変化は付加的な作用を及ぼす、すなわち、異常切断を導くいずれかの融合物のホモ二量体化は最小限に抑えられるか又は排除され、一方野生型切断ハーフドメインで得られるものと比較して２つの融合タンパク質のヘテロ二量体形成が促進される。
ある実施形態では、切断ドメインは、両方が結合ドメインを含む単一ポリペプチドの一部である２つの切断ハーフドメイン、１番目の切断ハーフドメインと２番目の切断ハーフドメインを含む。切断ハーフドメインは、それらがＤＮＡを切断するように機能する限り、同じアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列を有し得る。
切断ハーフドメインはまた、別々の分子中で提供され得る。例えば２つの融合ポリペプチドは１つの細胞内で発現され得、各々のポリペプチドは結合ドメインと切断ハーフドメインを含む。切断ハーフドメインは、それらがＤＮＡを切断するように機能する限り、同じアミノ酸配列又は異なるアミノ酸配列を有し得る。さらに、結合ドメインは、典型的には、融合ポリペプチドに結合したとき、２つの切断ハーフドメインが、切断ドメインの再構成を可能にする（例えばハーフドメインの二量体化によって）互いに対しての空間的方向に提示され、それによりハーフドメインが、機能性切断ドメインを形成するように互いに対して位置付けられ、対象領域内で細胞クロマチンの切断を生じさせるような方法で配置された標的配列に結合する。一般に、再構成された切断ドメインによる切断は、２つの標的配列の間に位置する部位で起こる。タンパク質の一方又は両方が、その標的部位に結合するように操作され得る。
細胞内での２つの融合タンパク質の発現は、２個のタンパク質の細胞への送達；１個のタンパク質とタンパク質の１つをコードする１個の核酸の細胞への送達；各々がタンパク質の１つをコードする２個の核酸の細胞への送達；又は両方のタンパク質をコードする単一核酸の細胞への送達から生じ得る。付加的な実施形態では、融合タンパク質は、２つの切断ハーフドメインと１つのジンクフィンガー結合ドメインを含む１本のポリペプチド鎖を含む。この場合、１つの融合タンパク質が細胞において発現され、そして、理論に縛られるのは望むところではないが、切断ハーフドメインの分子内二量体の形成の結果としてＤＮＡを切断すると考えられる。
ある実施形態では、ＺＦＮの成分は、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、切断ハーフドメインがカルボキシ末端に最も近いように配置される。これは、天然に生じる二量体化する切断ドメイン、例えばＤＮＡ結合ドメインがアミノ末端に最も近く、切断ハーフドメインがカルボキシ末端に最も近いＦｏｋ Ｉ酵素に由来するものにおける、切断ドメインの相対的配向を反映する。これらの実施形態では、機能性ヌクレアーゼを形成するための切断ハーフドメインの二量体化は、融合タンパク質が反対のＤＮＡ鎖上の部位に結合し、結合部位の５’末端が互いに近位であることによって引き起こされる。
この配向において、Ｃ末端に最も近いジンクフィンガーはＦｏｋＩ切断ハーフドメインに近位である。ＣＣＨＣ型ジンクフィンガーがＣ末端に最も近いフィンガーとして存在するとき、非正準ジンクフィンガータンパク質は最も効率的にそれらのＤＮＡ標的に結合することが先に判定された。従って、先に述べたＦｏｋＩ切断ハーフドメインに近接するＣＣＨＣ型ジンクフィンガーの存在がその機能を阻害した可能性がある。そうである場合、ここで開示する最適化ＣＣＨＣジンクフィンガーは、見掛け上この仮定阻害活性を示さない。
付加的な実施形態では、融合タンパク質（例えばＺＦＰ−Ｆｏｋ Ｉ融合物）の成分は、切断ハーフドメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、ジンクフィンガードメインがカルボキシ末端に最も近いように配置される。これらの実施形態では、機能性ヌクレアーゼを形成するための切断ハーフドメインの二量体化は、融合タンパク質が反対のＤＮＡ鎖上の部位に結合し、結合部位の３’末端が互いに近位であることによって引き起こされる。
さらなる付加的な実施形態では、１番目の融合タンパク質は、融合タンパク質のアミノ末端に最も近い切断ハーフドメインとカルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含み、２番目の融合タンパク質は、ジンクフィンガードメインが融合タンパク質のアミノ末端に最も近く、切断ハーフドメインがカルボキシ末端に最も近いように配置される。これらの実施形態では、両方の融合タンパク質は同じＤＮＡ鎖に結合し、カルボキシ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含む１番目の融合タンパク質の結合部位は、アミノ末端に最も近いジンクフィンガードメインを含む２番目の融合タンパク質の結合部位の５’側に位置する。その開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開公報第ＷＯ２００５／０８４１９０号も参照のこと。
ジンクフィンガードメインと切断ドメイン（又は切断ハーフドメイン）の間のアミノ酸配列は「ＺＣリンカー」と称される。ＺＣリンカーは、上記で論じたフィンガー間リンカーとは区別されるべきである。切断を最適化するＺＣリンカーを得ることに関する詳細については、例えばその開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第２００５００６４４７４Ａ１号及び同第２００３０２３２４１０号、及び国際公開公報第ＷＯ２００５／０８４１９０号参照。
発現ベクター
１又はそれ以上のＺＦＰ又はＺＦＰ融合タンパク質（例えばＺＦＮ）をコードする核酸は、複製及び／又は発現のために、原核細胞又は真核細胞への形質転換のためのベクターにクローニングされ得る。ベクターは、原核細胞又は真核細胞ベクターであり得、プラスミド、シャトルベクター、昆虫ベクター、バイナリーベクター（例えば米国特許第４，９４０，８３８号; Horsch et al (1984) Science 233:496-498, and Fraley et al (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803参照)等を含むが、これらに限定されない。ＺＦＰをコードする核酸はまた、植物細胞への投与のために発現ベクターにクローニングされ得る。
融合タンパク質を発現するため、ＺＦＰ又はＺＦＰ融合物をコードする配列を、典型的には、転写を指令するプロモーターを含む発現ベクターにサブクローニングする。適切な細菌及び真核生物プロモーターは当分野において周知であり、例えばSambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990); and Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al, supra)に述べられている。ＺＦＰを発現するための細菌発現系は、例えば大腸菌、バチルス種（Bacillus sp.）及びサルモネラ属（Salmonella） (Palva et al, Gene 22:229-235 (1983))において入手可能である。そのような発現系のためのキットは市販されている。哺乳動物細胞、酵母及び昆虫細胞のための真核生物発現系は当業者には周知であり、同じく市販されている。
ＺＦＰをコードする核酸の発現を指令するために使用されるプロモーターは、特定の適用に依存する。例えば宿主細胞に適合する強力な構成的プロモーターが、ＺＦＰの発現及び精製のために典型的に使用される。
これに対し、植物遺伝子調節のためにＺＦＰをインビボで投与するときは（以下の「植物細胞への核酸送達」の章参照)、ＺＦＰの特定使用に依存して、構成的又は誘導的プロモーターが使用される。植物プロモーターの非限定的な例は、シロイヌナズナ（A. thaliana）のユビキチン−３（ｕｂｉ−３） (Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493); A. ツメファシエンスのマンノピンシンターゼ(Δｍａｓ) (Petolino et al.,米国特許第 ６，７３０，８２４号); 及び／又はキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ） (Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129- 1139)に由来するプロモーター配列を含む。実施例も参照のこと。
プロモーターに加えて、発現ベクターは、典型的には、原核又は真核細胞のいずれかの宿主細胞における核酸の発現のために必要な付加的なエレメントすべてを含む転写ユニット又は発現カセットを含む。典型的な発現カセットは、従って、例えばＺＦＰをコードする核酸配列に作動可能に連結されたプロモーター及び、例えば転写産物の効率的なポリアデニル化、転写終結、リボソーム結合部位又は翻訳終結のために必要なシグナルを含む。カセットの付加的なエレメントは、例えばエンハンサー及び異種スプライシングシグナルを含み得る。
遺伝情報を細胞に輸送するために使用される特定発現ベクターは、ＺＦＰの意図される用途、例えば植物、動物、細菌、真菌、原生動物等における発現に関して選択される（以下で述べる発現ベクター参照）。標準的な細菌及び動物発現ベクターは当分野において公知であり、例えばその開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第２００５００６４４７４Ａ１号及び国際公開公報第ＷＯ０５／０８４１９０号、同第ＷＯ０５／０１４７９１号及び同第ＷＯ０３／０８０８０９号に詳細に述べられている。
標準的なトランスフェクション法が、多量のタンパク質を発現する細菌、哺乳動物、酵母又は昆虫細胞系を生産するために使用でき、前記タンパク質はその後標準的な手法を用いて精製できる（例えばColley et al, J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989); Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)参照）。真核及び原核細胞の形質転換は標準的な手法に従って実施される（例えばMorrison, J. Bact. 132:349-351 (1977); Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al, eds., 1983)参照）。
異種ヌクレオチド配列をそのような宿主細胞に導入するための周知の手順のいずれかが使用され得る。これらは、リン酸カルシウムトランスフェクション、ポリブレン、プロトプラスト融合、電気穿孔、超音波法（例えばソノポレーション）、リポソーム、微量注入、裸のＤＮＡ、プラスミドベクター、エピソーム及び組込み型の両方の、ウイルスベクター、及びクローニングされたゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、合成ＤＮＡ又は他の異種遺伝物質を宿主細胞に導入するためのその他の周知の方法のいずれかの使用を含む（例えば Sambrook et al, supra参照)。使用される特定遺伝子操作手順は、選択タンパク質を発現することができる宿主細胞に少なくとも１つの遺伝子を成功裏に導入することができれば十分である。
植物細胞への核酸送達
上述したように、ＤＮＡ構築物は様々な従来の手法によって所望植物宿主に（例えばそのゲノムに）導入し得る。そのような手法の総説については、例えばWeissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N. Y.) Section VIII, pp. 421-463; and Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9参照。
例えばＤＮＡ構築物は、電気穿孔及び植物細胞プロトプラストの微量注入のような手法を用いて植物細胞に導入し得るか、又は微粒子銃法、例えばＤＮＡパーティクルボンバードメントを使用してＤＮＡ構築物を植物組織に直接導入することができる（例えばKlein et al (1987) Nature 327:70-73参照)。あるいは、ＤＮＡ構築物を適切なＴ−ＤＮＡフランキング領域と組み合わせ、従来のアグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主ベクターに導入し得る。ディスアーミング（disarming）及びバイナリーベクターの使用を含む、アグロバクテリウム・ツメファシエンスを介した形質転換手法は、学術文献に詳細に記述されている。例えばHorsch et al (1984) Science 233:496-498, and Fraley et al (1983) Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 80:4803参照。
加えて、遺伝子導入は、非アグロバクテリウム細菌又はウイルス、例えばリゾビウム属ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロッティ（Sinorhizoboium meliloti）、メソリゾビウム・ロティ（Mesorhizobium loti）、ジャガイモＸウイルス、カリフラワーモザイクウイルス及びキャッサバ葉脈モザイクウイルス及び／又はタバコモザイクウイルスを使用して達成され得る。例えばChung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):l-4参照。
アグロバクテリウム・ツメファシエンス宿主のビルレンス機能は、バイナリーＴ ＤＮＡベクター(Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721)又は共培養手順(Horsch et al (1985) Science 227: 1229-1231)を使用して細胞を細菌に感染させたとき、構築物及び隣接マーカーの植物細胞ＤＮＡへの挿入を指令する 。一般に、アグロバクテリウム形質転換系は双子葉植物を操作するために使用される(Bevan et al (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384; Rogers et al (1986) Methods Enzymol. 118:627-641)。アグロバクテリウム形質転換系はまた、単子葉植物及び植物細胞を形質転換するため並びにそれらにＤＮＡを導入するためにも使用され得る。米国特許第５, ５９１，６１６号; Hernalsteen et al (1984) EMBO J 3:3039-3041; Hooykass-Van Slogteren et al (1984) Nature 311 :763-764; Grimsley et al (1987) Nature 325:1677-179; Boulton et al (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40.; and Gould et al (1991) Plant Physiol. 95:426-434参照。
選択的遺伝子導入及び形質転換法は、カルシウム、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）又は電気穿孔を介した裸のＤＮＡの取込みを通してのプロトプラスト形質転換（Paszkowski et al. (1984) EMBOJ 3:2717-2722, Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177; Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828; and Shimamoto (1989) Nature 338:274-276参照)及び植物組織の電気穿孔(D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505)を含むが、これらに限定されない。植物細胞形質転換のためのさらなる方法は、微量注入、シリコンカーバイドを介したＤＮＡ取込み(Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418)、及びマイクロプロジェクタイルボンバードメント（Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309; and Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618参照)を含む。
開示される方法及び組成物は、外因性配列を植物細胞ゲノム内のあらかじめ定められた位置に挿入するために使用され得る。これは、植物ゲノムに導入された導入遺伝子の発現がその組込み部位に決定的に依存するので、有用である。従って、例えば栄養素、抗生物質又は治療分子をコードする遺伝子を、標的組換えによって、それらの発現に有利な植物ゲノムの領域に挿入することができる。
上記形質転換手法のいずれかによって生産される形質転換植物細胞は、形質転換した遺伝子型を有し、従って所望表現型を有する全植物体を再生するために培養できる。そのような再生手法は、組織培養増殖培地中のある種の植物ホルモンの操作に基づき、典型的には所望ヌクレオチド配列と共に導入された殺生物剤及び／又は除草剤マーカーに基づく。培養プロトプラストからの植物再生は、Evans, et al., 「Protoplasts Isolation and Culture」 in Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983; and Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985に述べられている。再生はまた、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚又はその部分から得られ得る。そのような再生手法は、Klee et al (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486において一般的に述べられている。
植物細胞に導入された核酸は、基本的にいかなる植物に対しても所望形質を与えるために使用できる。多種多様な植物及び植物細胞系が、本開示の核酸構築物及び上述した様々な形質転換法を使用して、ここで述べる所望の生理的及び農学的性質のために操作され得る。ある実施形態では、操作のための標的植物及び植物細胞は、単子葉植物及び双子葉植物、例えば穀類（例えばコムギ、トウモロコシ、イネ、アワ、オオムギ）、果実作物（例えばトマト、リンゴ、西洋ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えばアルファルファ）、根菜作物（例えばニンジン、ジャガイモ、サトウダイコン、ヤムイモ）、葉菜作物（例えばレタス、ホウレンソウ）を含む農作物；顕花植物（例えばペチュニア、バラ、キク）、針葉樹及びマツの木（例えばマツ、モミ、トウヒ）；ファイトレメディエーション（植物による環境／土壌浄化）において使用される植物（例えば重金属蓄積植物）；油料作物（例えばヒマワリ、ナタネ）及び実験目的に使用される植物（例えばアラビドプシス）を含むが、これらに限定されない。従って、開示される方法及び組成物は、アスパラガス属（Asparagus）、 アベナ（カラスムギ）属（Avena）、ブラシカ（アブラナ）属（Brassica）、シトラス（ミカン）属（Citrus）、キトルルス（スイカ）属（Citrullus）、カプシクム（トウガラシ）属（Capsicum）、ククルビタ（カボチャ）属（Cucurbita）、ダウクス（ニンジン）属（Daucus）、グリシン（ダイズ）属（Glycine）、ゴシッピウム（ワタ）属（Gossypium）、ホルデウム（オオムギ）属（Hordeum）、ラクチュカ（アキノノゲシ）属（Lactuca）、リコペルシコン（トマト）属（Lycopersicon）、マルス（リンゴ）属（Malus）、マニホット（キャッサバ）属（Manihot）、ニコチアナ（タバコ）属（Nicotiana）、オリザ（イネ）属（Oryza）、ペルセア（アボカド）属（Persea）、ピスム（エンドウ）属（Pisum）、ピルス（ナシ）属（Pyrus）、プルヌス（サクラ）属（Prunus）、ラファヌス（ダイコン）属（Raphanus）、セカレ（ライムギ）属（Secale）、ソラヌム（ナス）属（Solanum）、ソルガム（モロコシ）属（Sorghum）、トリチカム（コムギ）属（Triticum）、ビチス（ブドウ）属（Vitis）、ビグナ（ササゲ）属（Vigna）及びゼア（トウモロコシ）属（Zea）からの種を含むが、これらに限定されない、広範囲の植物にわたる用途を有する。
当業者は、発現カセットがトランスジェニック植物に安定に組み込まれ、作動可能であることが確認された後、それを有性交配によって他の植物に導入できることを認識する。交配する種に依存して、多くの標準的な交配手法のいずれかが使用できる。
形質転換植物細胞、カルス、組織又は植物は、操作された植物材料を形質転換ＤＮＡ上に存在するマーカー遺伝子によってコードされる形質に関して選択又はスクリーニングすることによって同定及び単離され得る。例えば選択は、操作された植物材料を、形質転換遺伝子構築物がそれに対する耐性を付与する抗生物質又は除草剤の阻害量を含む培地で増殖させることによって実施され得る。さらに、形質転換された植物及び植物細胞はまた、組換え核酸構築物上に存在し得る何らかの可視マーカー遺伝子（例えばβ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、Ｂ又はＣ１遺伝子）の活性に関してスクリーニングすることによっても同定され得る。そのような選択及びスクリーニング方法は当業者に周知である。
物理的及び生化学的方法も、挿入された遺伝子構築物を含む植物又は植物細胞形質転換体を同定するために使用され得る。これらの方法は、１）組換えＤＮＡ挿入物の構造を検出し、決定するためのサザン分析又はＰＣＲ増幅；２）遺伝子構築物のＲＮＡ転写産物を検出し、検査するためのノーザンブロット法、Ｓ１ ＲＮアーゼ保護、プライマー伸長又は逆転写酵素ＰＣＲ増幅；３）そのような遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされる場合、酵素又はリボザイム活性を検出するための酵素検定法；４）遺伝子構築物の産物がタンパク質である場合、タンパク質ゲル電気泳動、ウエスタンブロット手法、免疫沈降法又は固相酵素免疫検定法、を含むが、これらに限定されない。付加的な手法、例えばインサイチューハイブリダイゼーション、酵素染色及び免疫染色も、特定植物器官及び組織における組換え構築物の存在又は発現を検出するために使用され得る。これらすべてのアッセイを実施するための方法が当業者に周知である。
ここで開示する方法を使用した遺伝子操作の作用は、例えば対象組織から単離したＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）のノーザンブロット法によって観察され得る。典型的には、ｍＲＮＡの量が増加している場合、対応する内因性遺伝子が以前より高い割合で発現されていると推測できる。遺伝子及び／又はＣＹＰ７４Ｂ活性を測定する他の方法も使用できる。使用される基質及び反応産物又は副産物の増加又は減少を検出するための方法に依存して、種々のタイプの酵素検定法が使用できる。加えて、発現される遺伝子及び／又はＣＹＰ７４Ｂタンパク質のレベルは、免疫化学的に、すなわち当業者に周知のＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＩＡ及び他の抗体に基づくアッセイ、例えば電気泳動検出アッセイ（染色又はウエスタンブロット法と共に）によって測定できる。導入遺伝子は、植物の一部の組織において又は一部の発育段階で選択的に発現され得るか、又は導入遺伝子は、実質的にすべての植物組織において又は実質的にその生活環全体を通じて発現され得る。しかし、いかなるコンビナトリアル発現様式も適用され得る。
本開示はまた、種子が導入遺伝子又は遺伝子構築物を有する上述したトランスジェニック植物の種子を包含する。本開示はさらに、導入遺伝子又は遺伝子構築物を有する、上述したトランスジェニック植物の子孫、クローン、細胞系又は細胞を包含する。
ＺＦＰ及びＺＦＰをコードする発現ベクターは、標的切断及び／又は組換えのために植物に直接投与することができる。
有効量の投与は、ＺＦＰを導入して処理される植物細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のいずれかによる。ＺＦＰは何らかの適切な方法で投与される。そのような組成物を投与する適切な方法は当業者に使用可能であり、周知であるが、特定組成物を投与するために２以上の経路が使用でき、特定経路はしばしば、別の経路よりも迅速でより有効な反応を提供し得る。
担体も使用でき、担体は、一部には、投与される特定組成物によって並びに組成物を投与するために使用される特定方法によって決定され得る。従って、使用可能な医薬組成物の多岐にわたる適切な製剤が存在する（例えばRemington 's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985参照)。
適用
ここで述べる１又はそれ以上の非正準ジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質は、遺伝子活性化；遺伝子抑制；ゲノムエディティング（切断、標的挿入、置換又は欠失）；及びエピゲノムエディティング（ヒストン又はＤＮＡの共有結合修飾のターゲティングによる）を含むがこれらに限定されない、正準Ｃ２Ｈ２ ＺＦＰが現在使用されるすべてのゲノム調節及びエディティング適用のために有用である。
ここで開示する非正準ジンクフィンガーを含むＺＦＮは、細胞クロマチン内の対象領域で（例えばゲノム内の、例えば突然変異型又は野生型の遺伝子内の、所望部位又はあらかじめ定められた部位で）ＤＮＡを切断するために使用できる。そのような標的ＤＮＡ切断のために、ジンクフィンガー結合ドメインを、あらかじめ定められた切断部位で又はその近くで標的部位に結合するように操作し、操作したジンクフィンガー結合ドメインと切断ドメインを含む融合タンパク質を細胞において発現させる。融合タンパク質のジンクフィンガー部分が標的部位に結合した後、ＤＮＡが切断ドメインによって標的部位の近くで切断される。切断の正確な部位はＺＣリンカーの長さに依存する。
あるいは、各々がジンクフィンガー結合ドメインと切断ハーフドメインを含む２つのＺＦＮを細胞において発現させ、機能性切断ドメインが再構成され、ＤＮＡが標的部位近傍で切断されるように並置された標的部位に結合させる。１つの実施形態では、切断は、２つのジンクフィンガー結合ドメインの標的部位の間で起こる。ジンクフィンガー結合ドメインの１つ又は両方が操作され得る。
ジンクフィンガー結合ドメイン−切断ドメイン融合ポリペプチドを用いた標的切断のために、結合部位が切断部位を包含し得るか、又は結合部位の近傍末端が切断部位から１、２、３、４、５、６、１０、２５、５０又はそれ以上のヌクレオチド（又は１〜５０の間の何らかの整数値のヌクレオチド）であり得る。切断部位に対する、結合部位の正確な位置は、特定切断ドメインとＺＣリンカーの長さに依存する。各々がジンクフィンガー結合ドメインと切断ハーフドメインを含む２つの融合ポリペプチドを使用する方法に関しては、結合部位は一般に切断部位をまたいで位置する。従って、１番目の結合部位の近傍末端は、切断部位の一方の側で１、２、３、４、５、６、１０、２５又はそれ以上のヌクレオチド（又は１〜５０の間の何らかの整数値のヌクレオチド）であり得、２番目の結合部位の近傍末端は、切断部位の他方の側で１、２、３、４、５、６、１０、２５又はそれ以上のヌクレオチド（又は１〜５０の間の何らかの整数値のヌクレオチド）であり得る。インビトロ及びインビボで切断部位をマッピングするための方法は当業者に公知である。
ひとたび標的細胞に導入されるか又は標的細胞において発現されれば、融合タンパク質は標的配列に結合し、標的配列で又はその近くで切断する。切断の正確な部位は、切断ドメインの性質及び／又は結合ドメインと切断ドメインの間のリンカー配列の存在及び／又は性質に依存する。各々が切断ハーフドメインを含む２つのＺＦＮを使用する場合、結合部位の近傍末端の間の距離は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２５又はそれ以上のヌクレオチド（又は１〜５０の間の何らかの整数値のヌクレオチド）であり得る。切断の最適レベルはまた、２つのＺＦＮの結合部位の間の距離（例えばSmith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-3369; Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:289-297参照)及び各々のＺＦＮ内のＺＣリンカーの長さの両方に依存し得る。また、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第２００５００６４４７４Ａ１号及び国際公開公報第ＷＯ０５／０８４１９０号、同第ＷＯ０５／０１４７９１号及び同第ＷＯ０３／０８０８０９号も参照のこと。
各々が切断ハーフドメインを含む２つのＺＦＮは、同じか又は反対の極性の対象領域内で結合することができ、それらの結合部位（すなわち標的部位）は、何らかの数のヌクレオチド、例えば０〜５０ヌクレオチド対又はその間の何らかの整数値のヌクレオチド対によって分離され得る。ある実施形態では、各々がジンクフィンガー結合ドメインと切断ハーフドメインを含む２つの融合タンパク質についての結合部位は、他方の結合部位に最も近く各々の結合部位の末端から測定したとき、５〜１８ヌクレオチド対離れた、例えば５〜８ヌクレオチド対離れた、又は１５〜１８ヌクレオチド対離れた、又は６ヌクレオチド対離れた、又は１６ヌクレオチド対離れた間に、又は互いの１０ヌクレオチド対以内に位置することができ、切断は結合部位の間で起こる。
ＤＮＡが切断される部位は、一般に２つの融合タンパク質についての結合部位の間に位置する。ＤＮＡの二本鎖の断裂は、しばしば、１、２、３、４、５、６又はそれ以上のヌクレオチドによって相殺される、２本の一本鎖の断裂、又は「ニック（切れ目）」から生じる（例えば未変性Ｆｏｋ Ｉによる二本鎖ＤＮＡの切断は４ヌクレオチドによって相殺される一本鎖断裂から生じる）。従って、切断は必ずしも各々のＤＮＡ鎖の正確に反対の部位で起こるわけではない。加えて、融合タンパク質の構造及び標的部位の間の距離は、切断が１つのヌクレオチド対に隣接して起こるかどうか、又は切断がいくつかの部位で起こるかどうかに影響を及ぼし得る。しかし、標的組換え及び標的突然変異誘発を含む多くの適用に関して、一続きのヌクレオチド内での切断で一般に十分であり、特定塩基対の間での切断は必要ない。
上述したように、融合タンパク質は、ポリペプチド及び／又はポリヌクレオチドの細胞への導入後に細胞において発現され得る。例えば各々が上記ポリペプチドの１つをコードする配列を含む２つのポリヌクレオチドを細胞に導入することができ、ポリペプチドが発現されて、各々がその標的配列に結合するとき、標的配列で又はその近くで切断が起こる。あるいは、両方の融合ポリペプチドをコードする配列を含む１個のポリヌクレオチドを細胞に導入する。ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ若しくはＤＮＡ及び／又はＲＮＡの何らかの修飾形態又は類似体であり得る。
ある実施形態では、ＺＦＮによるゲノム領域内での標的切断は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による切断事象の修復後、その領域のヌクレオチド配列の変化を生じさせる。
他の実施形態では、ＺＦＮによるゲノム領域内での標的切断はまた、ゲノム配列（例えば細胞クロマチン内の対象領域）が、相同性依存機構（例えばあらかじめ定められたゲノム配列（すなわち標的部位）と同一である又は相同であるが非同一の１又はそれ以上の配列と共に外因性配列を含むドナー配列の挿入）によって相同な非同一配列で置き換えられる（すなわち標的組換えによって）手順の一部であり得る。細胞ＤＮＡ内での二本鎖断裂は、切断部位の近傍で細胞修復機構を数千倍刺激するので、ここで述べるＺＦＮでの標的切断は、ゲノム内の実質的にいかなる部位においても配列の変化又は置換（相同性指令修復による）を可能にする。
選択ゲノム配列の標的置換は、ここで述べるＺＦＮに加えて、外因性（ドナー）ポリヌクレオチドの導入を必要とする。ドナーポリヌクレオチドは、ＺＦＮの発現前に、発現と同時に又は発現後に細胞に導入できる。ドナーポリヌクレオチドは、自らと相同性を担持するゲノム配列との間での相同組換え（又は相同性指令修復）を支持するためにゲノム配列に対する十分な相同性を含む。約２５、５０、１００、２００、５００、７５０、１，０００、１，５００、２，０００ヌクレオチド又はそれ以上の配列相同性（又は１０〜２，０００の間の何らかの整数値のヌクレオチド又はそれ以上）は、相同組換えを支持する。ドナーポリヌクレオチドは、１０〜５，０００ヌクレオチド（又はその間の何らかの整数値のヌクレオチド）又はそれ以上の長さにわたり得る。
ドナーポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、典型的にはそれが置換するゲノム配列のものと同一でないことは容易に明白である。例えばドナーポリヌクレオチドの配列は、染色体配列との十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関する１又はそれ以上の置換、挿入、欠失、逆位又は再配列を含み得る。そのような配列変化はいかなる大きさでもあり得、１個のヌクレオチド対の小ささであり得る。あるいは、ドナーポリヌクレオチドは、相同な２つの領域によって隣接された非相同配列（すなわち外因性ポリヌクレオチドとは区別されるべき、外因性配列）を含み得る。加えて、ドナーポリヌクレオチドは、細胞クロマチン内の対象領域と相同でない配列を含むベクター分子を含み得る。一般に、ドナーポリヌクレオチドの相同領域は、組換えを所望するゲノム配列と少なくとも５０％の配列同一性を有する。ある実施形態では、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％又は９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに依存して、１％〜１００％の間のいかなる値の配列同一性も存在し得る。
ドナー分子は、細胞クロマチンに相同ないくつかの不連続領域を含み得る。例えば対象領域内に通常は存在しない配列の標的挿入のために、前記配列は、ドナー核酸分子内に存在し、対象領域内の配列に相同な領域によって隣接され得る。
ドナーポリヌクレオチドからの配列挿入の成功を判定するアッセイ（例えばハイブリダイゼーション、ＰＣＲ、制限酵素消化）を簡略化するため、ゲノム配列と比較してある種の配列の相違がドナー配列内に存在し得る。好ましくは、コード領域内に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列の相違はアミノ酸配列を変化させないか、又はサイレントアミノ酸変化（すなわちタンパク質の構造又は機能に影響を及ぼさない変化）を生じさせる。ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによって細胞クロマチンに導入されたドナー配列の切断を防ぐために、場合により対象領域内のジンクフィンガードメイン結合部位に対応する配列に変化を含み得る。
ポリヌクレオチドは、付加的な配列、例えば複製起点、プロモーター及び抗生物質耐性をコードする遺伝子を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナーポリヌクレオチドは、裸の核酸として、リポソーム又はポロキサマーのような物質と結合した核酸として導入され得るか、又は細菌又はウイルス（例えばアグロバクテリウム、リゾビウム属ＮＧＲ２３４、シノリゾビウム・メリロッティ、メソリゾビウム・ロティ、タバコモザイクウイルス、ジャガイモＸウイルス、カリフラワーモザイクウイルス及びキャッサバ葉脈モザイクウイルス）によって送達され得る。例えばChung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):l-4参照。
染色体配列の変化のために、所望配列変化を生じさせるために十分なドナー配列がコピーされる限り、染色体にコピーされるドナーの全長配列は必要ない。
相同組換えによるドナー配列の挿入の効率は、細胞ＤＮＡにおいて、二本鎖断裂と組換えを所望する部位の間の距離に逆相関する。言い換えると、二本鎖断裂が組換えを所望する部位により近いとき、より高い相同組換え効率が認められる。組換えの正確な部位があらかじめ定められていない（例えば所望組換え事象がゲノム配列の距離にわたって起こり得る）場合、ドナー核酸の長さ及び配列は、切断部位と共に、所望組換え事象が得られるように選択される。ゲノム配列内の１つのヌクレオチド対の配列を変化させるように所望の事象が設計される場合、細胞クロマチンはそのヌクレオチド対のいずれかの側の１０，０００ヌクレオチド以内で切断される。ある実施形態では、その配列を変化させようとするヌクレオチド対のいずれかの側の、１，０００、５００、２００、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、２０、１０、５又は２ヌクレオチド、又は２〜１，０００の間の何らかの整数値のヌクレオチド内で切断が起こる。
ゲノム領域への外因性配列の標的挿入は、外因性配列を含む外因性（ドナー）ポリヌクレオチドの提供と合わせて、ＺＦＮを使用したゲノム領域内での標的切断によって達成される。ドナーポリヌクレオチドはまた、典型的には、ゲノム配列内の二本鎖断裂の相同性指令修復を支持するためにゲノム領域に対する十分な相同性を含む、外因性配列に隣接する配列を含み、それによってゲノム領域に外因性配列を挿入する。従って、ドナー核酸は、相同性依存型修復機構（例えば相同組換え）による外因性配列の組込みを支持するために十分ないかなる大きさであってもよい。特定の理論に縛られるのは望むところではないが、外因性配列に隣接する相同な領域は、断裂された染色体末端に、二本鎖断裂部位の遺伝情報の再合成のための鋳型を提供すると思われる。
上述したような、外因性配列の標的組込みは、選択された染色体位置にマーカー遺伝子を挿入するために使用できる。マーカー遺伝子は、抗生物質耐性（例えばアンピシリン耐性、ネオマイシン耐性、Ｇ４１８耐性、ピューロマイシン耐性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色又は蛍光又は発光タンパク質（例えば緑色蛍光タンパク質、強化緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）及び細胞増殖増強及び／又は遺伝子増幅増強を媒介するタンパク質（例えばジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列を含むが、これらに限定されない。例示的なマーカー遺伝子は、従って、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）、ホスフィノトリシンＮ−アセチルトランスフェラーゼ（ＰＡＴ、ＢＡＲ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ、β−ラクタマーゼ、カテコールジオキシゲナーゼ、α−アミラーゼ、チロシナーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、エクオリン、ＥＰＳＰシンターゼ、ニトリラーゼ、アセト乳酸シンターゼ（ＡＬＳ）、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）、ダラポンデハロゲナーゼ及びアントラニル酸シンターゼを含むが、これらに限定されない。ある実施形態では、標的組込みは、ＲＮＡ発現構築物、例えばマイクロＲＮＡ又はｓｉＲＮＡの調節された発現の原因となる配列を挿入するために使用される。プロモーター、エンハンサー及び付加的な転写調節配列も、ＲＮＡ発現構築物に組み込むことができる。
ジンクフィンガー／ヌクレアーゼ融合分子及びドナーＤＮＡ分子を含む細胞における、標的組換えの効率のさらなる上昇は、相同性駆動修復工程が最大限に活性である、細胞周期のＧ２期で細胞をブロックすることによって達成される。そのような停止は多くの方法で実現され得る。例えば細胞を、例えばＧ２期で細胞を停止させるように細胞周期進行に影響を及ぼす薬剤、化合物及び／又は低分子で処理することができる。このタイプの例示的な分子は、微小管重合に影響を及ぼす化合物（例えばビンブラスチン、ノコダゾール、タキソール）、ＤＮＡと相互作用する化合物（例えばシス白金（ＩＩ）二塩化ジアミン、シスプラチン、ドキソルビシン）及び／又はＤＮＡ合成に影響を及ぼす化合物（例えばチミジン、ヒドロキシ尿素、Ｌ−ミモシン、エトポシド、５−フルオロウラシル）を含むが、これらに限定されない。組換え効率のさらなる上昇は、ゲノムＤＮＡを細胞組換え機構に対してよりアクセスしやすくするようにクロマチン構造を変化させるヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば酪酸ナトリウム、トリコスタチンＡ）の使用によって達成される。
細胞周期停止のためのさらなる方法は、ＣＤＫ細胞周期キナーゼの活性を阻害するタンパク質の過剰発現、例えば前記タンパク質をコードするｃＤＮＡを細胞に導入することによる又は前記タンパク質をコードする遺伝子の発現を活性化する操作されたＺＦＰを細胞に導入することによる、前記タンパク質の過剰発現を含む。細胞周期停止はまた、例えばＲＮＡｉ法を使用してサイクリン及びＣＤＫの活性を阻害することによって（例えば米国特許第６，５０６，５５９号）、又は細胞周期進行に関与する１又はそれ以上の遺伝子、例えばサイクリン及び／又はＣＤＫ遺伝子の発現を抑制する操作されたＺＦＰを細胞に導入することによっても達成される。遺伝子発現の調節のための操作されたジンクフィンガータンパク質の合成のための方法に関しては、例えば共有米国特許第６，５３４，２６１号参照。
上述したように、標的切断のための開示される方法及び組成物は、ゲノム配列内に突然変異を誘導するために使用できる。標的切断はまた、遺伝子ノックアウト（例えば機能ゲノミクス又は標的の検証（target validation））を創製するため及びゲノム内への配列の標的挿入（すなわち遺伝子ノックイン）を促進するためにも使用できる。挿入は、相同組換えを通しての染色体配列の置換によって、又は染色体内の対象領域に相同な配列によって隣接される新しい配列（すなわち対象領域内には存在しない配列）があらかじめ定められた標的部位に挿入される、標的組込みによってであり得る。同じ方法がまた、野生型配列を突然変異型配列で置換するため、又は１つの対立遺伝子を異なる対立遺伝子に変換するためにも使用できる。
感染した又は組み込まれた植物病原体の標的切断は、例えば病原体のゲノムを、その病原性が低下する又は排除されるように切断することにより、植物宿主における病原体感染を処置するために使用できる。加えて、植物ウイルスについての受容体をコードする遺伝子の標的切断は、そのような受容体の発現をブロックし、それによって植物におけるウイルス感染及び／又はウイルス拡大を予防するために使用できる。
例示的な植物病原体は、植物ウイルス、例えばアルファモウイルス（Alfamoviruses）、アルファクリプトウイルス（Alphacryptoviruses）、バドナウイルス（Badnaviruses）、ベータクリプトウイルス（Betacryptoviruses）、ビジェミニウイルス（Bigeminiviruses）、ブロモウイルス（Bromoviruses）、バイモウイルス（Bymoviruses）、カピロウイルス（Capilloviruses）、カルラウイルス（Carlaviruses）、カルモウイルス（Carmoviruses）、カウリモウイルス（Caulimoviruses）、クロステロウイルス（Closteroviruses）、コモウイルス（Comoviruses）、ククモウイルス（Cucumoviruses）、サイトラブドウイルス（Cytorhabdoviruses）、ダイアントウイルス（Dianthoviruses）、エナモウイルス（Enamoviruses）、ファバウイルス（Fabaviruses）、フィジーウイルス（Fijiviruses）、フロウイルス（Furoviruses）、ホルデイウイルス（Hordeiviruses）、ハイブリジェミニウイルス（Hybrigeminiviruses）、イダエオウイルス（Idaeoviruses）、イラルウイルス（Ilarviruses）、イポモウイルス（Ipomoviruses）、ルテオウイルス（Luteoviruses）、マクロモウイルス（Machlomoviruses）、マクルラウイルス（Macluraviruses）、マラフィウイルス（Marafiviruses）、モノジェミニウイルス（Monogeminiviruses）、ナナウイルス（Nanaviruses）、ネクロウイルス（Necroviruses）、ネポウイルス（Nepoviruses）、ヌクレオラブドウイルス（Nucleorhabdoviruses）、オリザウイルス（Oryzaviruses）、ウルミアウイルス（Ourmiaviruses）、ファイトレオウイルス（Phytoreoviruses）、ポテックスウイルス（Potexviruses）、ポティウイルス（Potyviruses）、ライモウイルス（Rymoviruses）、サテライトＲＮＡ、サテライトウイルス（satelliviruses）、セキウイルス（Sequiviruses）、ソベモウイルス（Sobemoviruses）、テヌイウイルス（Tenuiviruses）、トバモウイルス（Tobamoviruses）、トブラウイルス（Tobraviruses）、トンブスウイルス（Tombusviruses）、トスポウイルス（Tospoviruses）、トリコウイルス（Trichoviruses）、ティモウイルス（Tymoviruses）、アンブラウイルス（Umbraviruses）、バリコサウイルス（Varicosaviruses）及びワイカウイルス（Waikaviruses）;真菌病原体、例えば黒穂病菌（例えばクロボキン類（Ustilaginales)）、サビ病菌(サビキン類（Uredinales)）、麦角菌(クラビセプス・プルプレア（Clavicepts pupurea)）及びうどんこ病菌;糸状菌（卵菌類（Oomycetes)）、例えばフィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）（ジャガイモ疫病菌）;細菌病原体、例えばエルウィニア属（例えばＥ．ハービコラ（E. herbicola)）、シュードモナス属（Pseudomonas）（例えば緑膿菌（P. aeruginosa）、Ｐ．シリンガエ（P. syringae）、Ｐ．フルオレセンス（P. fluorescense）及びＰ．プチダ（P. putida)）、ラルストニア属（Ralstonia）（例えばＲ．ソラナセラム（R. solanacearum)、アグロバクテリウム及びキサントモナス属（Xanthomonas）;回虫（線形動物(Nematoda)）;及びフィトミクサ類（Phytomyxea）（ポリミクサ(Polymyxa)及びプラスモジオフォラ（Plasmodiophora)）を含むが、これらに限定されない。
標的組換えのための開示される方法は、何らかのゲノム配列を相同な非同一配列で置換するために使用できる。例えば突然変異型ゲノム配列をその野生型対応物によって置換することができ、それにより植物病の処置のための方法を提供する；植物病原体に対する抵抗性を与える；作物の収率を上昇させる等が可能である。同様に、遺伝子の１個の対立遺伝子を、ここで開示する標的組換えの方法を用いて異なる対立遺伝子によって置換することができる。
これらの場合の多くにおいて、対象領域は突然変異を含み、ドナーポリヌクレオチドは対応する野生型配列を含む。同様に、野生型ゲノム配列は、それが望ましい場合は、突然変異型配列によって置換され得る。実際に、何らかの方法で特定ゲノム配列に依存する疾病は、ここで開示される方法及び組成物を用いて修復又は緩和され得る。
標的切断及び標的組換えはまた、遺伝子産物の発現のレベルを変化させるために非コード配列（例えば調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、イニシエーター、ターミネーター、スプライス部位）を変化させるために使用できる。そのような方法は、例えば治療目的、細胞生理学及び生化学の変化、機能ゲノミクス及び／又は標的の検証試験のために使用できる。
ここで述べる方法及び組成物はまた、非正準ジンクフィンガー結合ドメインと機能性ドメインの間の融合を使用した遺伝子発現の活性化及び抑制のためにも使用できる。そのような方法は、例えばその開示が参照により本明細書に組み込まれる、共有米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，８２４，９７８号及び同第６，９３３，１１３号に開示されている。付加的な抑制方法は、抑制すべき遺伝子の配列に対して標的されるアンチセンスオリゴヌクレオチド及び／又は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ又はＲＮＡｉ）の使用を含む。
付加的な実施形態では、標的組換えを促進するために、ここで開示するジンクフィンガー切断ドメイン融合物に加えて又はその代わりに、ジンクフィンガー結合ドメインとリコンビナーゼ（又はその機能性フラグメント）の間の１又はそれ以上の融合物が使用できる。例えば共有米国特許第６，５３４，２６１号及びAkopian et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8688-8691参照。
付加的な実施形態では、開示される方法及び組成物は、活性のために二量体化（ホモ二量体化又はヘテロ二量体化）を必要とする転写活性化又は抑制ドメインとＺＦＰ結合ドメインの融合物を提供するために使用される。これらの場合、融合ポリペプチドは、ジンクフィンガー結合ドメインと機能性ドメイン単量体（例えば二量体転写活性化又は抑制ドメインからの単量体）ウイルスを含む。適切に位置する標的部位へのそのような２つの融合ポリペプチドの結合は、機能性転写活性化又は抑制ドメインを再構成するための二量体化を可能にする。
本発明を以下の実施例においてさらに定義し、その中では、異なる規定がない限り、すべての割合及びパーセンテージは重量比であり、温度はセ氏である。これらの実施例は、本発明のある種の実施形態を示すが、説明としてのみ提供されることが了解されるべきである。上記の考察及びこれらの実施例から、当業者は本発明の基本的特徴を確認することができ、その精神と範囲から逸脱することなく、本発明を様々な用途及び条件に適合させるために本発明の様々な変更及び修正を行うことができる。
ＺＦＮ発現ベクター
その開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第２００５／００６４４７４号（この出願の実施例２参照）の実施例２及び１４で述べられている４フィンガーのＺＦＮ（「５〜８」及び「５〜９」と称される）をコードする配列を含む発現ベクターを以下のように改変した。簡単に述べると、５〜８及び５〜９ＺＦＮ（４アミノ酸のＺＣリンカーによってＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569の配列のアミノ酸３８４〜５７９）に融合した４つのジンクフィンガードメインを含む）をＣＣＨＣ構造に改変した。さらなる改変（置換及び挿入）を、Ｃ末端ＨｉｓとＣｙｓ亜鉛配位構造の間の残基及び／又はＣ末端ＣｙｓのＣ末端側でフィンガー２及び／又はフィンガー４に対しても実施した。
レポーター細胞系におけるｅＧＦＰの遺伝子修復
ここで述べるＣＣＨＣジンクフィンガーを含むＺＦＮが相同組換えを促進する能力を、Urnov (2005) Nature 435(7042):646-51及び米国特許公開公報第２００５００６４４７４号（例えば実施例６〜１１）に述べられているＧＦＰ系において試験した。簡単に述べると、各々のＺＦＮ ５０ｎｇとプロモーターのないＧＦＰドナー(Urnov (2005) Nature)５００ｎｇを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎリポフェクタミン２０００プロトコールに従って、試料ごとにリポフェクタミン２０００ ２μＬを使用して５００，０００個のレポーター細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクションの２４時間後にビンブラスチンを０．２μＭの最終濃度で添加し、トランスフェクションの７２時間後に除去した。
細胞を、Ｇｕａｖａ卓上ＦＡＣＳ分析器で各トランスフェクションにつき４０，０００細胞を測定することにより、トランスフェクションの５日後にＧＦＰ発現に関して検定した。
図１に示すように、上記表１及び２に示す変化したＣＣＨＣジンクフィンガーを含む大部分のＺＦＮが、レポーター（ＧＦＰ）遺伝子座での相同組換えを促進し、非改変ＣＣＨＣジンクフィンガーを上回るレベルのＧＦＰ発現を生じさせ、いくつかは、ＣＣＨＨジンクフィンガーを含むＺＦＮと同等の成績であった。フィンガー４（Ｆ４）に位置付けたとき最適性能の変異体は、以下の配列（Ｈｉｓ亜鉛配位残基及びそのＣ末端側を含む）：ＨＡＱＲＣＧＬＲＧＳＱＬＶ（配列番号５３）（表２においてＮｏ．２１と称され、図１では「２〜２１」として示されるジンクフィンガー）を含んだ。フィンガー２（Ｆ２）に位置付けたとき最適性能の変異体は、以下の配列（Ｈｉｓ亜鉛配位残基及びそのＣ末端側を含む）：ＨＩＲＴＣＴＧＳＱＫＰ（配列番号７５）（表２においてＮｏ．４３と称され、図１では「２〜４３」として示されるジンクフィンガー）を含んだ。
標的組換えによる染色体ＩＬ２Ｒγ遺伝子のエディティング
ここで述べるＺＦＮを、Urnov (2005) Nature 435(7042):646-51及び米国特許公開公報第２００５００６４４７４号の実施例２で述べられている内因性ＩＬ２Ｒγアッセイにおいても検定した。簡単に述べると、各々のＺＦＮ発現構築物２．５μｇを、ヌクレオフェクター（Nucleofector）（Ａｍａｘａ）を使用して５００，０００個のＫ５６２細胞にトランスフェクトした。ゲノムＤＮＡを採取し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒエンドヌクレアーゼキットを用いて内因性ＩＬ２Ｒγ遺伝子座で遺伝子破壊を検定した。
ＺＦＮを図２の左上に示す。特に、変化したジンクフィンガー２０は、配列ＨＴＲＲＣＧＬＲＧＳＱＬＶを含むＣＣＨＣジンクフィンガーを指す；ジンクフィンガー２１は配列ＨＡＱＲＣＧＬＲＧＳＱＬＶ（配列番号５３）を含む；ジンクフィンガー４３は配列ＨＩＲＴＣＴＧＳＱＫＰ（配列番号７５）を含む；ジンクフィンガー４５は配列ＨＩＲＴＧＣＴＧＳＱＫＰを含む；ジンクフィンガー４７は配列ＨＩＲＲＣＴＧＳＱＫＰを含む；及びジンクフィンガー４８は配列ＨＩＲＲＧＣＴＧＳＱＫＰを含む。ジンクフィンガー２０及び２１を４フィンガーＺＦＮのフィンガー４において使用し、ジンクフィンガー４３、４５、４７及び４８を４フィンガーＺＦＮのフィンガー２において使用した。
試験したＺＦＮの対を上記図２とグラフの右側及び表５に示す。

突然変異が切断部位で誘導されたかどうかを調べるため、増幅産物を変性して復元し、次にミスマッチ特異的Ｃｅｌ−１ヌクレアーゼで処理する、Ｃｅｌ−１アッセイを用いて増幅産物を分析した。例えばOleykowski et al (1998) Nucleic Acids res. 26:4597- 4602; Qui et al. (2004) BioTechniques 36:702-707; Yeung et al. (2005) BioTechniques 38:749-758参照。
２つの実験の結果を図２において各々の試料に関して示す。試料８及び９についての実験Ｎｏ．２は、レーン内に有意のバックグラウンドノイズを有し、これは、これらのＺＦＮの見掛け上の効果を低下させた。
図２に示すように、一部のＣＣＨＣ変異体は野生型Ｃ２Ｈ２ ＺＦＮと基本的に等価であった。フィンガー４のジンクフィンガー２１（試料５及び９）は、フィンガー４のジンクフィンガー２０（試料４及び８）よりも良好な成績を生じた。フィンガー２において、ジンクフィンガー４３が最良の結果を生じた。
レポーター細胞系におけるｅＧＦＰの遺伝子修復
図１及び２に示す結果に基づき、上記表３及び４に示すＣＣＨＣジンクフィンガー（１ａ〜１０ａと称される）を作製した。これらのジンクフィンガーを５〜８及び５〜９ ＺＦＮに組み込み、上記実施例２で述べたＧＦＰ遺伝子修復アッセイにおいて試験した。各々の試料において試験したＺＦＮ対を各々のバーの下に示しており、ジンクフィンガー番号２０、２１、４３、４５、４７及び４８は実施例３で述べたものであり、ＣＣＨＣジンクフィンガー１ａ〜１０ａは上記表３及び４に示す配列を含む。ジンクフィンガー２０、２１、７ａ、８ａ、９ａ及び１０ａはフィンガー４において使用した；ジンクフィンガー４３、４５、４７、４８、１ａ、２ａ、３ａ、４ａ、５ａ及び６ａはフィンガー２において使用した。
結果を図３に示す。各々のバーの下部の上の列はＺＦＮ ５〜８に組み込まれたジンクフィンガーを表し、各々のバーの下部の下の列はＺＦＮ ５〜９に組み込まれたジンクフィンガーを表す。例えば図３のグラフの左から２番目のバーは、両方のＺＦＮのＦ４がジンクフィンガー２０の配列を含む、５〜８及び５〜９ ＺＦＮでトランスフェクトした試料を表す。図示されているように、ＣＣＨＣジンクフィンガーを含むＺＦＮの多くが野生型（ＣＣＨＨ）ＺＦＮと同等の成績であった。
標的ベクターの設計と作製
Ａ．標的配列の全体構造
タバコ（双子葉植物）についての標的構築物は、図４及び５に示す以下の７つの成分を含んだ。ｉ）Ａ．ツメファシエンスオープンリーディングフレーム２４（ｏｒｆ−２４）３’非翻訳領域（ＵＴＲ）(Gelvin et al., 1987, 欧州特許第ＥＰ２２２４９３号)によって終結される、大腸菌ＨＰＴ遺伝子(Waldron et al., 1985, Plant Mol. Biol. 18:189-200)を駆動するシロイヌナズナのユビキチン−３（ｕｂｉ−３）プロモーター(Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)を含む、ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＨＰＴ）発現カセット;ｉｉ）Ｎ．タバカム（N.Tabacum）ＲＢ７マトリックス結合領域（ＭＡＲ）(Thompson et al., 1997, 国際公開公報第ＷＯ９７２７２０７号)を含む、相同配列−１; ｉｉｉ）修飾されたＡ．ツメファシエンスのマンノピンシンターゼ(Δｍａｓ)プロモーター(Petolino et al.,米国特許第 ６，７３０，８２４号)によって駆動される５’緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）遺伝子フラグメント（Ｅｖｒｏｇｅｎ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）；ｉｖ）Ａ．ツメファシエンスのノパリンシンターゼ（ｎｏｓ）３’ＵＴＲ(DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573)によって終結される、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）遺伝子(Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)を駆動するキャッサバ葉脈モザイクウイルス（ＣｓＶＭＶ）プロモーター(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31 :1129-1139)を含む、ＧＵＳ発現カセット；ｖ）Ａ．ツメファシエンスのｏｒｆ−１ ３’ＵＴＲ(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)によって終結される３’ＧＦＰ遺伝子フラグメント(Evrogen Joint Stock Company, Moscow, Russia)；ｖｉ）シロイヌナズナ４−クマロイル−ＣｏＡシンターゼ（４−ＣｏＡＳ）イントロン−１（遺伝子座Ａｔ３ｇ２１３２０，ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３０７４）を含む相同配列−２及びｖｉｉ）Ａ．ツメファシエンスＯＲＦ−２５／２６ ３’ＵＴＲ(Gelvin et al., 1987, 欧州特許第ＥＰ２２２４９３号)によって終結されるＳ．ビリドクロモゲネス（S. viridochromogenes）ホスフィノトリシンホスホトランスフェラーゼ（ＰＡＴ）(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)３’遺伝子フラグメント。
ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合部位（ＩＬ−１−Ｌ０−Ｆｏｋ１） (Urnov et al., 2005, 米国特許第２００５/００６４４７４号)をＣｓＶＭＶプロモーター(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139)の下流に挿入し、Ｎ末端でＧＵＳコード配列(Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)と融合した。２番目のジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合部位（Ｓｃｄ２７−Ｌ０−Ｆｏｋ１）(Urnov et al., 2005, 米国特許第２００５/００６４４７４号)の２コピーは、５’及び３’ＧＦＰ遺伝子フラグメントに隣接した(Evrogen Joint Stock Company, Moscow, Russia)。各々の結合部位は、特定ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質の認識配列の４つの縦列反復配列を含んだので、各結合部位は〜２００ｂｐの大きさであった（図６Ａ）。これは、認識配列が複雑なクロマチン環境においてジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質にアクセス可能であることを確実にするために設計された。各々の認識配列は、１つのジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質がホモ二量体として結合される逆方向反復配列を含み、二本鎖ＤＮＡを切断した（図６Ｂ）。標的配列からの機能性ＧＦＰ翻訳が起こらないことを確実にするため、標的配列内に相同性を与える、５４０ｂｐだけオーバーラップする５’及び３’ＧＦＰ遺伝子フラグメント及び終結コドンを５’ＧＦＰフラグメントの３’末端において挿入した。
標的配列を含む形質転換ベクターを、以下で述べる多段階クローニング工程を通して作製した。
Ｂ．ＨＰＴバイナリーベクター（ｐＤＡＢ１５８４）の構築
Ａ．ツメファシエンスｏｒｆ−１ ＵＴＲ(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)によって終結される、ＧＵＳ遺伝子(Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)を駆動するシロイヌナズナのｕｂｉ−３プロモーター(Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)を含む、ＧＵＳ発現カセットを含有するベクターｐＤＡＢ１４００を出発ベース構築物として使用した（図７）。
標的構築物内の不必要な反復調節エレメントを回避するため、ｐＤＡＢ１４００内のＡ．ツメファシエンスｏｒｆ−１ ＵＴＲ(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)を、ｐＤＡＢ７８２（図８）からＳａｃＩ／ＸｂａＩフラグメントとして切り出し、ｐＤＡＢ１４００内の同じ部位にクローニングしたＡ．ツメファシエンスｏｒｆ−２４ ＵＴＲ(Gelvin et al., 1987, 欧州特許第ＥＰ２２２４９３号)で置換した。生じた構築物は、Ａ．ツメファシエンスｏｒｆ−２４ ＵＴＲ(Gelvin et al., 1987, 欧州特許第ＥＰ２２２４９３号)によって終結される、ＧＵＳ遺伝子(Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)を駆動するシロイヌナズナｕｂｉ−３プロモーター(Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)を含み、ｐＤＡＢ１５８２（図９）と命名された。
ＨＰＴコード配列(Waldron et al., 1985, Plant Mol. Biol. 18:189-200)を、プライマーＰ１及びＰ２を使用してｐＤＡＢ３５４プラスミド（図１０）からＰＣＲ増幅した。ＢｂｓＩ部位をプライマーＰ１の５’末端に付加し、ＳａｃＩ部位をプライマーＰ２の３’末端に保持した。ＨＰＴＩＩ ＰＣＲフラグメントをＢｂｓＩ／ＳａｃＩで消化し、ＮｃｏＩ−ＳａｃＩで消化したｐＤＡＢ１５８２にクローニングして、ＧＵＳ遺伝子をＰＣＲフラグメントからのＨＰＴ遺伝子で置換した。生じたプラスミドをｐＤＡＢ１５８３（図１１）と命名した。
シロイヌナズナｕｂｉ−３／ＨＰＴ／Ａ．ツメファシエンスｏｒｆ−２４フラグメントを、次に、ＮｏｔＩ消化によってｐＤＡＢ１５８３から切り出し、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで処理して平滑末端を生成した。平滑末端処理したＨＰＴ発現カセットを、ＰｍｅＩ部位でバイナリーベースベクター、ｐＤＡＢ２４０７（図１２）にクローニングして、プラスミドｐＤＡＢ１５８４（図１３）を生成した。
Ｃ．相同配列及びＳｃｄ２７ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合部位を含むベクター（ｐＤＡＢ１５８０）の構築
標的ベクター内の反復調節配列を回避するため、ｐＤＡＢ２４１８（図１４）内のＡ．ツメファシエンスｏｒｆ−１ ＵＴＲ(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)をＡ．ツメファシエンスｏｒｆ２５／２６ＵＴＲ(Gelvin et al., 1987, 欧州特許第ＥＰ２２２４９３号)で置換した。ＵＴＲ交換を行うため、Ａ．ツメファシエンスｏｒｆ２５／２６ＵＴＲ(Gelvin et al., 1987, 欧州特許第ＥＰ２２２４９３号)を、プライマーＰ３及びＰ４を使用してｐＤＡＢ４０４５プラスミド（図１５）からＰＣＲ増幅した。ＳｍａＩ及びＡｇｅＩ部位をＰＣＲフラグメントの３’末端に付加し、ＳａｃＩ部位を５’末端に保持した。Ａ．ツメファシエンスｏｒｆ−１ ＵＴＲ(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)によって終結される、ＰＡＴ遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)を駆動するシロイヌナズナユビキチン−１０（ｕｂｉ−１０）プロモーター(Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)及びＮ．タバカム（N.tabacum）ＲＢ７ ＭＡＲ配列(Thompson et al., 1997, 国際公開公報第ＷＯ９７２７２０７号)を含むＰＡＴ遺伝子発現カセットを含有する、ｐＤＡＢ２４１８プラスミドＤＮＡをＳａｃＩ及びＡｇｅＩで消化し、２つの最も大きなフラグメントを回収した。これらのフラグメントを、ＳａｃＩ及びＡｇｅＩで消化したＡ．ツメファシエンスｏｒｆ２５／２６ＵＴＲ(Gelvin et al., 1987, 欧州特許第ＥＰ２２２４９３号)のＰＣＲ産物と連結した。生じたプラスミドをｐＤＡＢ１５７５（図１６）と命名した。Ｎ．タバカムＲＢ７ ＭＡＲ(Thompson et al., 1997, 国際公開公報第ＷＯ９７２７２０７号)を標的ベクター内の相同配列−１として使用する。
シロイヌナズナ４−ＣｏＡＳ（遺伝子座Ａｔ３ｇ２１３２０，ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３０７４）のイントロン−１を、標的ベクター内の相同配列−２として使用するために選択した。ＰＡＴ遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)コード配列を分析し、開始コドンの２９９／３００ｂｐ下流を、適切な５’及び３’スプライシング部位が形成されるようにイントロンを挿入するための部位として同定した。次に、完全長イントロンをＤＮＡ合成によって(Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ Ｌｔｄ．，ＬＬＰ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ)３’部分ＰＡＴコード配列の２５３ｂｐと融合した。ＮｏｔＩ及びＳａｃＩ部位をそれぞれＤＮＡフラグメントの５’末端と３’末端に付加した。合成したＤＮＡフラグメントを、次に、ＮｏｔＩ／ＳａｃＩで消化し、完全長ＰＡＴコード配列を置換するために同じ部位でｐＤＡＢ１５７５に挿入した。生じた構築物をｐＤＡＢ１５７７（図１７）と命名した。
Ｓｃｄ２７−Ｌ０−Ｆｏｋ１認識部位の４つの縦列反復配列を含む２４１ｂｐのＤＮＡフラグメント（図６）を、フラグメントの５’末端と３’末端の両方にＳｍａＩ部位を付加して合成した（Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ Ｌｔｄ．，ＬＬＰ，Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）。合成したジンクフィンガー−Ｆｏｋ１結合部位含有フラグメントを、次にＳｍａＩで消化し、ＭｓｃＩ部位でｐＤＡＢ１５７７に挿入した。生じたベクターをｐＤＡＢ１５７９（図１８）と命名した。２番目のＳｍａＩ消化したジンクフィンガー−Ｆｏｋ１結合部位含有フラグメントを、次に、ＳｗａＩ部位でｐＤＡＢ１５７９に挿入した。生じた構築物をｐＤＡＢ１５８０（図１９）と命名した。このベクターは、相同配列１及び２（それぞれＮ．タバカムＲＢ７ ＭＡＲ及びシロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１）、及び各々がＳｃｄ２７−Ｌ０−Ｆｏｋ１認識部位の４つの縦列反復配列を含む、２つの合成Ｓｃｄ２７ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１結合部位を含有する。
Ｄ．２つの部分的に重複する非機能性ＧＦＰフラグメントを含むベクター（ｐＤＡＢ１５７２）の構築
ＧＦＰ遺伝子、ＣｏｐＧＦＰをＥｖｒｏｇｅｎ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）より購入し、完全長コード配列を、プライマーＰ５及びＰ６を使用してＰＣＲ増幅した。ＢｂｓＩ及びＳａｃＩ部位をそれぞれＰＣＲ産物の５’末端と３’末端に付加した。ＣｏｐＧＦＰ ＰＣＲ産物を、次に、ＢｂｓＩ／ＳａｃＩで消化し、ＧＵＳ遺伝子を置換するためにＮｃｏＩ／ＳａｃＩ部位で、Ａ．ツメファシエンスｏｒｆ−１ ３’ＵＴＲ(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)によって終結される、ＧＵＳ遺伝子(Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)を駆動する修飾Ａ．ツメファシエンスΔｍａｓプロモーター(Petolino et al.,米国特許第 ６７３０８２４号)を含むｐＤＡＢ３４０１（図２０）にクローニングした。生じたベクターをｐＤＡＢ１５７０（図２１）と命名した。
２つの部分的に重複する非機能性ＧＦＰフラグメントを作製するため、ＣｏｐＧＦＰのコード配列の大部分及び５’末端に４７ｂｐ欠失を含むＤＮＡフラグメントを、プライマーＰ９及びＰ１０を使用してＰＣＲ増幅した。ＡｐａＩ部位を５’末端と３’末端の両方に付加し、追加ＳｔｕＩ部位をＡｐａＩ部位の下流で５’末端に付加した。ＰＣＲ産物を、次に、ＡｐａＩで消化し、ＡｐａＩ部位でｐＤＡＢ１５７０に挿入して、それにより５４０ｂｐの重複配列を有する同じベクター内の２つの非機能性ＧＦＰフラグメントを創製した。生じた構築物をｐＤＡＢ１５７２（図２２）と命名した。
Ｅ．ＩＬ−１ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合部位／ＧＵＳ遺伝子融合物を含むベクター（ｐＤＡＢ１５７３）の構築
ＩＬ−１＿Ｌ０−Ｆｏｋ１認識部位の４つの縦列反復配列を含む２３３ｂｐのＤＮＡフラグメント（図６）は、５’末端と３’末端にそれぞれＮｃｏＩとＡｆｌＩＩＩ部位を付加してＰｉｃｏｓｃｒｉｐｔ Ｌｔｄ．，ＬＬＰ，（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）によって合成された。合成されたフラグメントを、次にＮｃｏＩ／ ＡｆｌＩＩＩで消化し、ＮｃｏＩ部位で、Ａ．ツメファシエンスｏｒｆ−１ ３’ＵＴＲ(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)によって終結され、ＣｓＶＭＶプロモーター(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31 :1129-1139)によって駆動されるＧＵＳ遺伝子(Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)を含む、ｐＤＡＢ４００３（図２３）に挿入した。その後、ＩＬ−１＿Ｌｏ−Ｆｏｋ１結合部位とＧＵＳコード配列の間のＮ末端融合物を作製した。生じたベクターをｐＤＡＢ１５７１（図２４）と命名した。
標的ベクター内の反復３’ＵＴＲエレメントを回避するため、Ａ．ツメファシエンスのｎｏｓ ３’ＵＴＲ(DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573)をｐＤＡＢ７２０４（図２５）からＳａｃＩ／ＰｍｅＩフラグメントとして切り出し、Ａ．ツメファシエンスｏｒｆ−１ ３’ＵＴＲ(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)を置換するために、ＳａｃＩ／ＮａｅＩで消化したｐＤＡＢ１５７１にクローニングした。生じたプラスミドをｐＤＡＢ１５７３（図２６）と命名した。
Ｆ．最終標的ベクター（ｐＤＡＢ１５８５）の構築
最終標的ベクターを作製するため、ＩＬ−１−Ｆｏｋ１融合タンパク質標的部位挿入を有するＧＵＳ発現カセットをＮｏｔＩ消化によってｐＤＡＢ１５７３から切り出し、平滑末端処理して、ＳｔｕＩ部位でｐＤＡＢ１５７２に挿入した。生じた中間ベクターをｐＤＡＢ１５７４（図２７）と命名した。修飾Δｍａｓプロモーター(Petolino et al.,米国特許第６７３０８２４号)、５’部分重複ＧＦＰ配列（Ｅｖｒｏｇｅｎ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）、ＣｓＶＭＶプロモーター(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129- 1139)、ＩＬ−１−Ｆｏｋ１融合タンパク質標的配列、ＧＵＳ遺伝子（Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)コード領域、Ａ．ツメファシエンスのｎｏｓ ３’ＵＴＲ(DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573)、３’部分重複ＧＦＰ（Ｅｖｒｏｇｅｎ Ｊｏｉｎｔ Ｓｔｏｃｋ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｏｓｃｏｗ，Ｒｕｓｓｉａ）及びＡ．ツメファシエンスのｏｒｆ−１ ３’ＵＴＲ(Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822)を含むカセット全体をｐＤＡＢ１５７４から切り出し、ＮｏｔＩ部位でｐＤＡＢ１５８０に挿入した。生じたプラスミドをｐＤＡＢ１５８１（図２８）と命名した。次に、ｐＤＡＢ１５８１のＡｇｅＩフラグメントをＡｇｅＩ部位でｐＤＡＢ１５８４に挿入し、それによって最終標的構築物ｐＤＡＢ１５８５（図４及び５）を創製した。
組み込まれた標的配列を有するトランスジェニック細胞系の作製
実施例５の標的配列がアグロバクテリウム形質転換によって安定に組み込まれた、ＢＹ２と称されるタバコ細胞懸濁培養物を使用した。基礎細胞系、ＢＹ２は、Ｊｕｎ Ｕｅｋｉ ｏｆ Ｊａｐａｎ Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｉｗａｔａ，Ｓｈｉｚｕｏｋａ，Ｊａｐａｎより入手した。この培養物は、約１８時間の倍加時間で１００〜１５０細胞クラスターにおいて直径５〜１０μの細胞として増殖する。ＢＹ２細胞懸濁培養物を、ＬＳ基本塩（ＰｈｙｔｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｌａｂｓ Ｌ６８９）、１７０ｍｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、３０ｇ／Ｌスクロース、０．２ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ及び０．６ｍｇ／Ｌチアミン−ＨＣＬ、ｐＨ６．０を含む培地に維持した。ＰＣＶ ０．２５ｍＬにＬＳ基本培地５０ｍＬを添加することにより、７日ごとにＢＹ２細胞を継代培養した。ＢＹ２細胞懸濁培養物を２５℃、１２５ＲＰＭの回転式振とう機上の２５０ｍＬフラスコ中に維持した。
組み込まれた標的配列を有するトランスジェニックＢＹ２細胞培養物を生成するため、継代培養後４日目のタバコ懸濁液のフラスコを１０〜１２の４ｍＬアリコートに分け、それを１００×２５ｍｍのペトリ皿において、ＯＤ６００〜１．５に一晩増殖させたｐＤＡＢ１５８５を保持するアグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４ １００μＬと共培養した。皿をパラフィルムで包み、振とうせずに２５℃で３日間インキュベートした後、過剰の液体を除去し、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含むＬＳ基本培地１１ｍＬと交換した。
タバコ細胞の再懸濁後、懸濁液１ｍＬを、８ｇ／ＬのＴＣ寒天で凝固させた５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン及び２００ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含む適切な基本培地の１００×２５ｍｍプレートに分注し、ラップで包まずに暗所にて２８℃でインキュベートした。これは、１回の処理につき１２０〜１４４の選択プレートを生じた。接種の１０〜１４日後に個々のハイグロマイシン耐性単離物が出現し、それらを個別の６０×２０ｍｍプレート（１プレートにつき１単離物）に移して、分析及びその後の再形質転換実験のために必要なときまで１４日の継代培養スケジュールでカルスとして維持した。
標的トランスジェニック事象のスクリーニングと特性決定
実施例６で述べた、ＢＹ２タバコ細胞培養物への標的ベクターの形質転換から生じたハイグロマイシン耐性トランスジェニック事象を以下のように分析した。
これらのトランスジェニック事象をスクリーニングするために実施した初期分析は、標的配列のアクセス可能性を示すためのＧＵＳ発現分析、標的ベクターの存在と無傷性を確認するための部分及び完全長標的配列のＰＣＲ分析、及び組み込まれた標的配列のコピー数を測定するためのサザンブロット分析を含んだ。ＧＵＳ発現を示したトランスジェニック事象のサブセットは、完全長標的配列の単一コピーを含んだ；これらを、その後の再形質転換用の標的系統を生成するための懸濁培養物を再樹立するために選択した。これらの再樹立した標的系統をさらなる特性決定に供し、それらの特性決定は、より詳細なサザンブロット分析、標的挿入物全体の配列決定確認及び隣接ゲノム配列分析を含んだ。
トランスジェニックタバコカルス組織又は選択事象から開始された懸濁培養物を、アッセイ緩衝液１５０μＬ中の試料５０ｍｇを３７℃で２４〜４８時間インキュベートすることにより、ＧＵＳ活性に関して分析した。アッセイ緩衝液は、０．２Ｍ リン酸ナトリウムｐＨ８．０、各々０．１ｍＭのフェリシアン化カリウム及びフェロシアン化カリウム、１．０ｍＭナトリウムＥＤＴＡ、０．５ｍｇ／ｍＬ ５−ブロモ−４−クロロ−３−インドイル−β−グルクロニド及び０．６％（ｖ／ｖ）トリトンＸ−１００(Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405)からなった。青色着色領域の出現をＧＵＳ遺伝子発現のインジケータとして使用し、ＧＵＳ遺伝子発現は、標的配列挿入が転写的に活性であり、従って局所ゲノム環境においてアクセス可能であることを指示した。
ＧＵＳを発現するトランスジェニック事象を、標的配列の５’末端のＨＰＴ発現カセットの３’ＵＴＲから標的配列の３’末端の部分ＰＡＴ遺伝子カセットの３’ＵＴＲまでにわたる１０ｋｂ ＤＮＡフラグメントの増幅を導くプライマー対Ｐ１５／Ｐ１６を使用したＰＣＲによって検定した。すべての事象がハイグロマイシン選択下で得られたので、ＨＰＴ発現カセットは標的事象すべてにおいて無傷であると推測された。従って、ＨＰＴ発現カセットの３’ＵＴＲだけを完全長ＰＣＲ分析における対象とした。事象のサブセットも、標的配列の５’末端と３’末端の無傷性を判定するためにそれぞれプライマー対Ｐ１５／Ｐ１７及びＰ１８／Ｐ１９を使用してＰＣＲ検定した。組み込まれた標的配列のコピー数を測定するために、ＰＣＲ分析で確認されたすべての標的事象をサザンブロット分析によってさらに検定した。
ＧＵＳ発現及び完全長ＰＣＲのスクリーニングを通過したすべての標的事象に関してサザンブロット分析を実施した。ゲノムＤＮＡ１０μｇを、標的配列内の唯一のカッター酵素であるＮｓｉＩで消化した。消化したゲノムＤＮＡを０．８％アガロースゲルで分離し、ナイロン膜に移した。架橋後、標的配列の５’末端のコピー数を測定するため、膜に移したＤＮＡをＨＰＴ遺伝子プローブとハイブリダイズした。次に、標的配列の３’末端のコピー数を測定するために同じブロットをストリップし、ＰＡＴ遺伝子プローブと再ハイブリダイズした。
ＧＵＳ発現を示し、完全長標的配列の１コピーを含む多数の事象を、より詳細なサザンブロット分析、標的配列全体の確認及び隣接ゲノム配列分析を含む、さらなる特性決定のために選択した。ＢＹ２−３８０と称される１つの事象を分子特性決定に基づいて選択した。懸濁培養物を、ドナーＤＮＡと非Ｃ２Ｈ２ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子を含むベクターでのその後の再形質転換のためにこの事象から再樹立した。
標的事象ＢＹ２−３８０から樹立された懸濁培養物が予想されたように無傷標的配列を含むことを確実にするため、標的配列の５’末端のＨＰＴ発現カセットの３’ＵＴＲから標的配列の３’末端の部分ＰＡＴ遺伝子カセットの３’ＵＴＲまでの主要標的配列を、プライマー対Ｐ１５／Ｐ１６を使用してＰＣＲ増幅し、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にクローニングした。ＴＯＰＯベクターに挿入されたＰＣＲ産物はＬａｒｋ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）によって配列決定された。配列結果は、ＢＹ２−３８０が予想されたように完全な標的配列を有することを指示した。
ＢＹ２−３８０細胞系を、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて隣接ゲノム配列を得るためにさらに分析した。簡単に述べると、ゲノムＤＮＡ ２．５μｇを、別々の反応において３つの平滑末端制限酵素、ＥｃｏＲＶ、ＤｒａＩ及びＳｔｕＩで消化した。消化したＤＮＡをフェノール／クロロホルム抽出を通して精製し、ＢＤ ＧｅｎｏｍｅＷａｌｋｅｒ Ａｄａｐｔｏｒで連結した。ネステッドＰＣＲ増幅を、連結物を鋳型とし、一次ＰＣＲ反応のためにプライマーＰ２０（標的配列挿入の５’末端の上流歩行）とＰ２１（標的配列挿入の３’末端の下流歩行）、及び二次ネステッドＰＣＲ反応のためにプライマーＰ２２（標的配列挿入の５’末端の上流歩行）とＰ２３（標的配列挿入の３’末端の下流歩行）を用いて実施した。二次ＰＣＲ反応からの増幅フラグメントをｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯ又はｐＣＲ Ｂｌｕｎｔ ＩＩ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にクローニングし、Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）を用いて配列決定した。この工程を通してＢＹ２−３８０標的系統から隣接ゲノム配列を得た。次に隣接ゲノム配列に基づいてプライマーを消化し、標的配列全体を増幅するために使用した。
この標的系統から得た増幅フラグメントは予想された大きさであった。増幅フラグメントの両末端を塩基配列決定によって確認した。
ドナーＤＮＡベクターの設計と作製
ドナーＤＮＡ構築物は、相同配列−１（Ｎ．タバカムＲＢ７ ＭＡＲ）(Thompson et al., 1997, 国際公開公報第ＷＯ９７２７２０７号)、完全長シロイヌナズナｕｂｉ−１０プロモーター(Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)、５’部分ＰＡＴ遺伝子コード配列の２９９ｂｐ(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)及び相同配列−２（シロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１）（遺伝子座Ａｔ３ｇ２１３２０，ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３０７４）を含んだ。ドナーベクター内の２つの相同配列−１及び相同配列−２はどちらも、標的ベクター（ｐＤＡＢ１５８５）内の対応する相同配列−１及び相同配列−２と同一であった。
ドナーベクターを構築するため、５’部分ＰＡＴコード配列の２９９ｂｐを、Ｐｉｃｏｓｃｒｉｐｔ Ｌｔｄ．，ＬＬＰ，（Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｔｅｘａｓ）によるＤＮＡ合成を通して完全長シロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１（遺伝子座Ａｔ３ｇ２１３２０，ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３０７４）と融合した。ＮｃｏＩ及びＸｈｏＩ部位をそれぞれフラグメントの５’末端と３’末端に付加した。この合成したＤＮＡフラグメントを、次に、ＮｃｏＩ／ＸｈｏＩで消化し、完全長ＰＡＴ遺伝子コード配列及びその３’ＵＴＲを置換するために同じ部位でｐＤＡＢ１５７５に挿入した。生じた構築物をｐＤＡＢ１５７６（図２９）と命名した。
次に、ｐＤＡＢ１５７６をＡｇｅＩで消化し、相同配列−１及び相同配列−２によって隣接される５’部分ＰＡＴ発現カセットを含むフラグメント全体を、同じ部位でバイナリー基本ベクター、ｐＤＡＢ２４０７に挿入した。生じた構築物をｐＤＡＢ１６００（図３０）と命名し、これは、植物細胞再形質転換のためのドナーベクターのバイナリー型であった。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ発現ベクターの設計と作製
ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子は、ＣｓＶＭＶプロモーターと５’ＵＴＲによって駆動された(Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31 : 1129-1139)。Ａ．ツメファシエンスオープンリーディングフレーム−２４（ｏｒｆ−２４）３’非翻訳領域（ＵＴＲ）(Gelvin et al., 1987, 欧州特許第ＥＰ２２２４９３号)もカセットに含まれた。
これらのベクターを作製するため、上記実施例１〜４で述べたＩＬ−１−Ｆｏｋ１及びＳｃｄ２７−Ｆｏｋ１コード配列のＣ２Ｈ２対照及びそれらのＣ３Ｈ変異体をそれらの最初の設計からＰＣＲ増幅し、ＢｂｓＩ又はＮｃｏＩ及びＳａｃＩ部位をそれぞれＰＣＲフラグメントの５’末端と３’末端に付加して、ＮｃｏＩ−ＳａｃＩで消化したｐＤＡＢ３７３１（図３１）にクローニングした。生じたプラスミドをｐＤＡＢ４３２２（図３２）、ｐＤＡＢ４３３１（図３３）、ｐＤＡＢ４３３２（図３４）、ｐＤＡＢ４３３３（図３５）、 ｐＤＡＢ４３３４（図３６）、ｐＤＡＢ４３３６（図３７）及びｐＤＡＢ４３３９（図３８）と命名した。これらのベクターはすべて、ＺＦＮ発現カセットに隣接するａｔｔＬ１及びａｔｔＬ２部位を含み、Ｇａｔｅｗａｙ（商標）クローニングシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）と適合性であった。
２セットのバイナリー型ベクターをＩＬ−１−ＦｏｋＩ融合タンパク質のために構築した。一方はＰＡＴ選択マーカー遺伝子を含み、他方はＰＡＴ選択マーカー遺伝子を含まなかった。ＳＣｄ２７−ＦｏｋＩ融合タンパク質については、ＰＡＴ選択マーカー遺伝子を含まないバイナリー型のベクターだけを構築した。ＰＡＴ選択マーカー遺伝子を含むバイナリーベクターを作製するため、ｐＤＡＢ４３２２、ｐＤＡＢ４３３１、ｐＤＡＢ４３３２、ｐＤＡＢ４３３３、ｐＤＡＢ４３３４及びｐＤＡＢ４３３６内のＩＬ−１−ＦｏｋＩ融合タンパク質発現カセットを、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いたＬＲ組換え反応を通してｐＤＡＢ４３２１（図３９）にクローニングした。生じたプラスミドをｐＤＡＢ４３２３（図４０）、ｐＤＡＢ４３４１（図４１）、ｐＤＡＢ４３４２（図４２）、ｐＤＡＢ４３４３（図４３）、ｐＤＡＢ４３４４（図４４）、ｐＤＡＢ４３４６（図４５）と命名した。ＰＡＴ選択マーカー遺伝子を含まないバイナリーベクターを作製するため、それぞれｐＤＡＢ４３３１、ｐＤＡＢ４３３６及びｐＤＡＢ４３３９内のＣ２Ｈ２ ＩＬ−１−ＦｏｋＩ、Ｃ３Ｈ ＩＬ−１−ＦｏｋＩ及びＳｃｄ２７−ＦｏｋＩ発現カセットを、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）Ｅｎｚｙｍｅ Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いたＬＲ組換え反応を通してｐＤＡＢ４３３０（図４６）にクローニングした。生じたプラスミドをそれぞれｐＤＡＢ４３５１（図４７）、ｐＤＡＢ４３５６（図４８）及びｐＤＡＢ４３５９（図４９）と命名した。
ＳＣＤ２７−Ｆｏｋ１のＣ２Ｈ２対照を作製するため、ｐＤＡＢ７００２（図５０）内のＰＡＴを駆動するＣｓＶＭＶプロモーター及び５’ＵＴＲを含むＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩフラグメントを、ｐＤＡＢ７０２５（図５１）からＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｃＩで切り出した、ＧＵＳを駆動するＣｓＶＭＶプロモーター及び５’ＵＴＲ及びＮ．タバカム５’ＵＴＲを含むフラグメントで置換した。生じたプラスミドをｐＤＡＢ１５９１（図５２）と命名した。Ｓｃｄ２７−Ｌ０−ＦｏｋＩコード配列を、プライマー対Ｐ１３／Ｐ１４を使用してそれらのもとのベクターｐＣＤＮＡ３．１−ＳＣＤ２７ａ−Ｌ０−ＦｏｋＩ（図５３）からＰＣＲ増幅した。ＢｂｓＩ及びＳａｃＩ部位をそれぞれＰＣＲフラグメントの５’末端と３’末端に付加した。ｐＤＡＢ１５９１内のＰＡＴ遺伝子を、ＳａｃＩ／ＮｃｏＩクローニングを通してジンクフィンガー融合タンパク質遺伝子のＰＣＲフラグメントで置換した。生じたプラスミドをｐＤＡＢ１５９４（図５４）と命名した。このベクターのバイナリー型を、ジンクフィンガー融合タンパク質遺伝子発現カセットをｐＤＡＢ１５９４からＰｍｅＩ／ＸｈｏＩフラグメントとして切り出し、末端を充填して、ＰｍｅＩ部位で ｐＤＡＢ２４０７にクローニングすることによって構築した。生じたプラスミドをｐＤＡＢ１５９８（図５５）と命名した。植物形質転換のために使用したすべてのバイナリーベクターの詳細を表６に要約する。
陽性対照ベクターの設計と作製
非正統的組換えの頻度を推定し、陽性対照として使用するため、ＰＡＴ遺伝子発現カセットを含むベクターを使用した。最終組換え体と同等であるために、シロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１（遺伝子座Ａｔ３ｇ２１３２０，ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３０７４）をＰＡＴコード配列(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)の２９９／３００ｂｐに挿入した。この構築物を作製するため、ｐＤＡＢ１５７６からの２５５９ｂｐのＳｗａＩ／ＣｌａＩフラグメントを、同じ制限酵素で消化したｐＤＡＢ１５７７（図５６）の骨格フラグメントと連結した。生じたベクターは、ＰＡＴコード配列(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)の中央にシロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１（遺伝子座Ａｔ３ｇ２１３２０，ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３０７４）（遺伝子座Ａｔ３ｇ２１３２０，ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３０７４）の１７４３ｂｐの挿入を有するＰＡＴ遺伝子発現カセットを含んだ。このベクターをｐＤＡＢ１５７８（図５７）と命名した。
ｐＤＡＢ １５７８のバイナリー型を作製するため、シロイヌナズナイントロン−１（遺伝子座Ａｔ３ｇ２１３２０，ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３０７４）を有するＰＡＴ遺伝子発現カセットをｐＤＡＢ１５７８からＰｍｅＩ／ＸｈｏＩで切り出した。フラグメントの３’末端を平滑末端処理した後、ＰｍｅＩ部位でバイナリー基本ベクター、ｐＤＡＢ２４０７に挿入した。シロイヌナズナｕｂｉ１０プロモーター(Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493)によって駆動され、Ａ．ツメファシエンスｏｒｆ２５／２６ ３’ＵＴＲ(Gelvin et al., 1987,欧州特許第ＥＰ２２２４９３号)によって終結されるシロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１（遺伝子座Ａｔ３ｇ２１３２０，ＧｅｎＢａｎｋ ＮＣ ００３０７４）配列を含むＰＡＴ遺伝子(Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37)を含有する、生じたベクターをｐＤＡＢ１６０１（図５８）と命名した。
Ｃ３Ｈジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子での標的細胞培養物の再形質転換による染色体内相同組換えの実証
染色体内相同組換えを刺激する上でのＣ３Ｈジンクフィンガーヌクレアーゼの機能性を確認するため、５４０ｂｐのオーバーラップ配列を有する２つの非機能性ＧＦＰフラグメントを、図５９に示すように標的ベクター内に含めた。これら２つのフラグメントの間にＧＵＳ遺伝子発現カセットが存在した。ＩＬ−１−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合配列をそのＮ末端でＧＵＳコード配列と融合した。１つの理論に縛られるわけではないが、ＩＬ−１−Ｆｏｋ１融合タンパク質の存在下で、ＩＬ−１ ＺＦＮ結合配列が認識され、二本鎖ＤＮＡ断裂が誘導されて、それが内因性ＤＮＡ修復過程を刺激するとの仮説が立てられた。ドナーＤＮＡの存在がなければ、２つの部分的に相同なＧＦＰフラグメントは染色体内相同組換え過程を受け、機能性ＧＦＰ遺伝子が再構成される。
組み込まれた標的配列の単一の完全長コピーを含むＢＹ２−３８０トランスジェニック細胞系を、１００ｍｇ／Ｌハイグロマイシンを含むＬＳ基本培地４０〜５０ｍＬにカルス組織約２５０〜５００ｍｇを入れ、上述したように７日ごとに継代培養することによって懸濁培養を再開するために使用した。再形質転換の前に、懸濁培養物を少なくとも２継代にわたって、ハイグロマイシンを含まない基本培地に移した。
アグロバクテリウムを介した標的細胞培養物の形質転換を上述したように実施した。各々の実験について、８つの共培養プレートを以下のように作製した。１つのプレートは、基本アグロバクテリウム株ＬＢＡ４４０４ ３００μＬと共培養した細胞を含んだ；１つのプレートは、ｐＤＡＢ１５９０（機能性ＧＦＰ構築物）を保有するアグロバクテリウム株３００μＬと共培養した細胞を含んだ；６つのプレートの各々は、それぞれｐＤＡＢ４３２３、ｐＤＡＢ４３４１、ｐＤＡＢ４３４２、ｐＤＡＢ４３４３、ｐＤＡＢ４３４４及びｐＤＡＢ４３４６を保有するアグロバクテリウム株３００μＬと共培養した細胞を含んだ。上述した方法を用いた共培養後、選択試薬を含まない、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを添加したＬＳ基本培地を含む８つのプレートで細胞を平板培養した。構成された機能性ＧＦＰ遺伝子の明らかな発現は、形質転換の約５〜８日後に可視蛍光を生じさせた。各々の実験において各構築物につき８プレート、各プレートにつき５つの「ランダムな」顕微鏡視野を検査することにより、視野当たりの緑色蛍光遺伝子座の数を計数し、６つの独立した実験から平均値を求めた。
表７に要約されるように、２つのＣ３Ｈジンクフィンガーヌクレアーゼ、ｐＤＡＢ４３４６及びｐＤＡＢ４３４３から、それぞれ各視野につき９．５０及び７．５７の緑色蛍光遺伝子座の平均値が認められた。ＩＬ−１−ＦｏｋＩのこれら２つのＣ３Ｈ設計は、それらのＣ２Ｈ２対照、ｐＤＡＢ４３４１（各視野につき６．３７遺伝子座）及びｐＤＡＢ４３２３（各視野につき５．５３遺伝子座）よりも良好な成績であった。一方で、Ｃ２Ｈ２対照と比較して、ＩＬ−１−ＦｏｋＩ融合タンパク質の他の２つのＣ３Ｈ変異体、ｐＤＡＢ４３４４（各視野につき４．３９遺伝子座）及びｐＤＡＢ４３４２（各視野につき０．２５遺伝子座）の機能は、特にＣ３Ｈ変換が単に４番目のフィンガーにおいて２番目のシステインをヒスチジンで置換することによって行われたｐＤＡＢ４３４２では、有意に損なわれていた。基本アグロバクテリウム株、ＬＢＡ４４０４で形質転換した陰性対照では、わずかなバックグラウンドを超える認識し得る蛍光は認められなかった。
Ｃ３Ｈジンクフィンガーヌクレアーゼ遺伝子及びドナーＤＮＡ配列での標的細胞培養物の再形質転換による染色体間相同組換えの実証
例示的タバコ系において染色体間相同組換えを刺激する上でのＣ３Ｈジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質の機能性を確認するため、２つの戦略を開発し、試験した。
戦略１では、ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質（ＩＬ−１−Ｌ０−Ｆｏｋ１）についての結合部位を標的構築物の中央に含めた（図６１）。この戦略では、結合部位は、両側が〜３ｋｂの非相同配列によって隣接され、上流と下流にそれぞれ相同配列−１（Ｎ．タバカムＲＢ７ ＭＡＲ）及び相同配列−２（シロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１）が続いた。以前に明らかにされたように（例えば米国特許公開公報第２００５００６４４７４号）、Ｃ２Ｈ２ ＩＬ−１ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質の存在下で、ＩＬ−１−Ｌ０−Ｆｏｋ１結合配列が認識され、この特定部位で二本鎖ＤＮＡ断裂が誘導されて、それが内因性ＤＮＡ修復過程を刺激した。標的配列内のものと同一の相同配列を含むドナーＤＮＡの存在下で、５’部分ＰＡＴ遺伝子はそのプロモーターと共に、相同組換えを通してその標的内の相同配列の間の〜６ｋｂ ＤＮＡフラグメント全体を置換した。この過程を通して、２つの部分ＰＡＴ遺伝子配列は、その間に介在するシロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１と共に、機能性ＰＡＴ遺伝子を再構成して、ＰＡＴ発現及び除草剤耐性表現型を生じさせた。
戦略２では、２つのジンクフィンガー−Ｆｏｋ１結合部位（Ｓｃｄ２７−Ｌ０−Ｆｏｋ１）を標的ベクターに含めた。一方はＮ．タバカムＲＢ７ ＭＡＲのすぐ下流、及び他方はシロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１のすぐ上流であった（図６２）。２つのジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質結合部位の間には〜６ｋｂの配列が存在し、この配列は、５’ＧＦＰフラグメント、ＧＵＳ発現カセット及び３’ＧＦＰフラグメントを含んだ。以前に明らかにされたように（例えば米国特許公開公報第２００５００６４４７４号）、Ｓｃｄ２７ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質の存在下で、２つの結合配列が認識され、両方の位置で二本鎖ＤＮＡ断裂が誘導されて、これら２つの結合配列の間の〜６ｋｂ ＤＮＡフラグメントが除去され、内因性ＤＮＡ修復過程を刺激した。戦略１と同様に、標的配列内のものと同一の相同配列を含むドナーＤＮＡの存在下で、５’部分ＰＡＴ遺伝子はそのプロモーターと共に、二本鎖ＤＮＡ断裂が誘導された部位での相同組換えを通して標的配列に挿入された。この過程を通して、２つの部分ＰＡＴ遺伝子配列は、その間に介在するシロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１と共に、機能性ＰＡＴ遺伝子を再構成して、ＰＡＴ発現及び除草剤耐性表現型を生じさせた。
アグロバクテリウムを介したＢＹ２−３８０標的細胞培養物の形質転換を上述したように実施した。各々の実験について、１２の共培養プレートを以下のように作製した。１つのプレートは、ｐＤＡＢ１６００（ドナーＤＮＡ）を保有するアグロバクテリウム株５０μＬ及びアグロバクテリウム基本株ＬＢＡ４４０４ ２５０μＬと共培養した細胞を含んだ；１つのプレートは、ｐＤＡＢ１６０１（ＰＡＴ選択マーカー）を保有するアグロバクテリウム株５０μＬ及びアグロバクテリウム基本株ＬＢＡ４４０４ ２５０μＬと共培養した細胞を含んだ；２つのプレートは、ｐＤＡＢ１６００（ドナーＤＮＡ）を保有するアグロバクテリウム株５０μＬ及びｐＤＡＢ４３５１（Ｃ２Ｈ２ ＩＬ−１ ＺＦＰ−Ｆｏｋ１）を保有するアグロバクテリウム株２５０μＬと共培養した細胞を含んだ；３つのプレートは、ｐＤＡＢ１６００（ドナーＤＮＡ）を保有するアグロバクテリウム株５０μＬ及びｐＤＡＢ４３５６（Ｃ３Ｈ ＩＬ−１ ＺＦＰ−Ｆｏｋ１）を保有するアグロバクテリウム株２５０μＬと共培養した細胞を含んだ；２つのプレートは、ｐＤＡＢ１６００（ドナーＤＮＡ）を保有するアグロバクテリウム株５０μＬ及びｐＤＡＢ１５９８（Ｃ２Ｈ２ Ｓｃｄ ２７ａ ＺＦＰ−Ｆｏｋ１）を保有するアグロバクテリウム株２５０μＬと共培養した細胞を含んだ；３つのプレートは、ｐＤＡＢ１６００（ドナーＤＮＡ）を保有するアグロバクテリウム株５０μＬ及びｐＤＡＢ４３５９（Ｃ３Ｈ Ｓｃｄ２７ａ ＺＦＰ−Ｆｏｋ１）を保有するアグロバクテリウム株２５０μＬと共培養した細胞を含んだ。上述した方法を用いた共培養後、細胞を、５００ｍｇ／Ｌカルベニシリン及び１５ｍｇ／Ｌ Ｂｉａｌａｐｈｏｓ（登録商標）を含むＬＳ基本培地で平板培養した。個々のＢｉａｌａｐｈｏｓ（登録商標）耐性単離物が平板培養後２〜４週間で出現し、それらを個別の６０×２０ｍｍプレート（１プレートにつき１単離物）に移して、分析のために必要なときまで１４日ごとの継代培養スケジュールでカルスとして維持した。
多数のＢｉａｌａｐｈｏｓ（登録商標）耐性単離物が、Ｃ３Ｈ ＩＬ−１ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｐＤＡＢ４３５６）及びＣ３Ｈ Ｓｃｄ２７ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ｐＤＡＢ４３５９）の両方から得られた。これらの単離物を、再構成されたＰＡＴ遺伝子全体に及ぶＤＮＡフラグメントを増幅する、プライマー対Ｐ２４／２５を用いたＰＣＲによって分析した。プライマーＰ２４はドナーＤＮＡ内のＰＡＴコード配列の５’末端に相同であり、プライマーＰ２５は標的ＤＮＡ内のＰＡＴコード配列の３’末端に相同であった。２つの部分ＰＡＴコード配列が相同組換えを通して連結された場合、２．３ｋｂのＰＣＲフラグメントが生じる。図６３に示すように、分析した多数の単離物から２．３ｋｂのＰＣＲ産物が得られた。これらの単離物は、Ｃ３Ｈ ＩＬ−１ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子／ドナーＤＮＡ及びＣ３Ｈ Ｓｃｄ２７ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子／ドナーＤＮＡの両方の共形質転換から得られた。Ｃ３Ｈ ＩＬ−１ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１及びＣ３Ｈ Ｓｃｄ２７ジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子形質転換の両方に由来するものを代表する多数の独立した単離物からの２．３ｋｂ ＰＣＲ産物をアガロースゲルから精製し、ｐＣＲ２．１ ＴＯＰＯベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）にクローニングした。２．３ｋｂ ＰＣＲ産物をＴＯＰＯベクターに挿入し、その後Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて配列決定した。配列決定の結果は、ＴＯＰＯベクターにクローニングされたＰＣＲ産物すべてが、予測されたように、５’及び３’部分ＰＡＴ遺伝子配列と介在するシロイヌナズナ４−ＣｏＡＳイントロン−１を含む、組換え配列を含むことを確認した。これらの結果は、試験した両方の戦略について予測された染色体間組換えを確認し、Ｃ３Ｈジンクフィンガー−Ｆｏｋ１融合タンパク質遺伝子の発現による遺伝子ターゲティングを例証した。
トウモロコシ細胞培養物における標的遺伝子配列の同定
Ａ．配列同定
本実施例では、公知の機能を有する内因性トウモロコシ遺伝子についてのＤＮＡ配列を、操作されたジンクフィンガーヌクレアーゼを用いたゲノムエディティングのための標的として選択した。特許保護されているトウモロコシ近交系５ＸＨ７５１に由来する、ＩＰＰ２−Ｋと称されるこの遺伝子のゲノム構造及び配列は、その開示が参照により本明細書に組み込まれる、国際公開公報第ＷＯ２００６／０２９２９６号に記述されている。
特に、ＩＰＰ２−Ｋゲノム配列は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムを使用してＴＩＧＲトウモロコシゲノムデータベース（インターネット上でｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｔｉｇｒ．ｏｒｇ／ｔｄｂ／ｔｇｉ／ｍａｉｚｅ／にて入手可能）の問い合わせを行うために使用した。アクセッション番号ＡＺＭ５１５２１３及びＴＣ３１１５３５を含むが、これらに限定されない、ＩＰＰ２−Ｋに対してオーバーラップする相同性を有するセグメントを含む、いくつかの付加的なゲノムフラグメントが同定された。これらのアクセッション番号の配列並びにＩＰＰ２−Ｋ配列に基づき、多数の短いオリゴヌクレオチドを、Ｐｒｉｍｅｒ３プログラム(Rozen, S. and Skaletsky, H.J. (2000) Primer 3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology Humana Press, Totowa, NJ, pp365-386; インターネットにても入手可能)を用いて、ＰＣＲプライマーとしての使用のために設計した。これらのプライマーは、以下の正方向オリゴヌクレオチド、
１．５’−ＡＴＧＧＡＧＡＴＧＧＡＴＧＧＧＧＴＴＣＴＧＣＡＡＧＣＣＧＣ−３’（配列番号：１０４）
２．５’−ＣＴＴＧＧＣＡＡＧＧＴＡＣＴＧＣＧＧＣＴＣＡＡＧＡＡＧＡＴＴＣ−３’（配列番号：１６１）
３．５’−ＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＡＧＧＡＣ−３’（配列番号：１６２）
４．５’−ＡＴＧＡＡＧＡＡＡＧＡＣＡＧＧＧＡＡＴＧＡＡＧＧＡＣＣＧＣＣＡＣ−３’（配列番号：１６３）
５．５’−ＣＡＴＧＧＡＧＧＧＣＧＡＣＧＡＧＣＣＧＧＴＧＴＡＧＣＴＧ−３’（配列番号：１６４）
６．５’−ＡＴＣＧＡＣＡＴＧＡＴＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：１６５）
を含むが、これらに限定されない。
加えて、プライマーは、以下の逆方向オリゴヌクレオチド、
７．５’−ＴＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＧＡＡＡＣ−３’（配列番号：１６６）
８．５’−ＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＧＡＡＡＣＡＣ−３’（配列番号：１６７）
９．５’−ＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣＣＴＡＧＡＡＡＣＡＣ−３’（配列番号：１６８）
１０．５’−ＴＧＣＴＡＡＧＡＡＣＡＴＴＣＴＴＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＣＣ−３’（配列番号：１６９）
１１．５’−ＧＡＡＣＡＴＴＣＴＴＴＴＣＧＡＣＡＡＧＣＴＣＣＡＧＡＡＡＡＴＣＣ−３’（配列番号：１７０）
を含むが、これらに限定されない。
すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成され、同社から購入された。
Ｂ．Ｈｉ ＩＩトウモロコシ細胞培養
カルス培養開始のための未熟胚を得るため、温室で生育したＨｉ−ＩＩ親ＡとＢの間でのＦ１交配(Armstrong, C., Green, C. and Phillips, R. (1991) Maize Genet. Coop. News Lett. 65: 92-93)を実施した。約１．０〜１．２ｍｍの大きさの胚（受粉後約９〜１０日目）を健康な穂から採取し、Ｌｉｑｕｉ−Ｎｏｘ（登録商標）石けんでこすり洗いすることによって表面を滅菌し、７０％エタノール中に２〜３分間液浸して、次に市販の２０％漂白剤（０．１％次亜塩素酸ナトリウム）中に３０分間液浸した。
穂を滅菌蒸留水で洗浄し、未熟接合胚を無菌的に切除して、１５Ａｇ１０培地（Ｎ６培地(Chu C.C., Wang C.C., Sun C.S., Hsu C., Yin K.C, Chu C.Y., and Bi F. Y. (1975) Sci. Sinica 18:659-668)、１．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２０ｇ／Ｌスクロース、１００ｍｇ／Ｌカゼイン加水分解物（酵素消化物）、２５ｍＭ Ｌ−プロリン、１０ｍｇ／Ｌ ＡｇＮＯ３、２．５ｇ／Ｌゲルライト（Gelrite）、ｐＨ５．８）で、胚盤を培地から離して外に向けて２〜３週間培養した。予想された形態を示す組織(Welter, ME, Clayton, DS, Miller, MA, Petolino, JF. (1995) Plant Cell Rep: 14:725-729)を選択的に、週に２回の間隔で新鮮１５Ａｇ１０培地に約６週間移し、その後週に２回の間隔で約２ヵ月間、４培地（Ｎ６培地、１．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２０ｇ／Ｌ スクロース、１００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物（酵素消化物）、６ｍＭ Ｌ−プロリン、２．５ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ５．８）に移した。
胚形成懸濁培養を開始するため、単一胚を起源とするカルス組織の充填細胞容積（ＰＣＶ）約３ｍｌを、Ｈ９ＣＰ＋液体培地約３０ｍｌ（ＭＳ基本塩混合物（basal salt mixture） (Murashige T., & Skoog F. (1962) Physiol. Plant. 15:473-497)、１０倍低いニコチン酸と５倍高いチアミン−ＨＣｌを含む改変ＭＳビタミン、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、２．０ｍｇ／Ｌ α−ナフタレン酢酸（ＮＡＡ）、３０ｇ／Ｌ スクロース、２００ｍｇ／Ｌ カゼイン加水分解物（酸消化物）、１００ｍｇ／Ｌ ミオイノシトール、６ｍＭ Ｌ−プロリン、５％ｖ／ｖココヤシ水（継代培養の直前に添加）、ｐＨ６．０）に添加した。懸濁培養物を、１２５ｒｐｍ、２８℃の温度制御振とう機セットにおいて１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中、暗条件下に維持した。細胞系統の樹立の間（２〜３か月）、広口ピペットを用いてＰＣＶ ３ｍｌの細胞及び馴化培地７ｍｌを新鮮Ｈ９ＣＰ＋液体培地２０ｍｌに添加することにより、懸濁液を３．５日ごとに継代培養した。成長の倍加によって証明される、成熟到達後、懸濁液をスケールアップし、５００ｍｌフラスコに維持して、それによりＰＣＶ １２ｍｌの細胞及び馴化培地２８ｍｌをＨ９ＣＰ＋培地８０ｍｌに移した。懸濁培養の完全な樹立後、アリコートを後日の使用のために凍結保存した。国際公開公報第ＷＯ２００５／１０７４３７号参照。
Ｃ．ＤＮＡの単離と増幅
上述したトウモロコシＨｉＩＩ細胞培養物を、２５０ｍｌフラスコ中、標準ＧＮ６培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌ スクロース、２．５ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ５．８）で増殖させ、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）Ｐｌａｎｔ ＤＮｅａｓｙ抽出キットを製造者の推奨に従って使用してゲノムＤＮＡを抽出した。上述したプライマーをすべての可能な組み合わせで使用したＰＣＲ増幅反応を以下の条件下で実施した。酵素製造者の緩衝液中に、ｇＤＮＡ鋳型２０ｎｇ、各々のプライマー２０ｐｍｏｌ、１％ ＤＭＳＯ及びＡｃｃｕｐｒｉｍｅ（商標）Ｐｆポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１０単位を含む反応物容量２５μｌ。５００ｂｐ−２ｋｂの範囲の大きさの増幅産物が、９５℃−１分間、（９５℃−３０秒間、５７〜６２℃−３０秒間、７２℃−１分間）×３０、７２℃−５分間、４℃−保持からなる増幅サイクルから生じた。増幅したフラグメントを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＴＡクローニングキットを製造者の推奨に従って使用してベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に直接クローニングした。
Ｄ．配列分析
トウモロコシ近交系５ＸＨ７５１におけるＩＰＰ２−Ｋ遺伝子及びＨｉＩＩ細胞培養物の以前の分析は、小さな遺伝子ファミリーを含む２〜３の異なる遺伝子の存在を指示していた(Sun et al., in press, Plant Physiology；国際公開公報第ＷＯ２００６０２９２９６号）。従って、単離したクローン化フラグメントを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）からのＣＥＱ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔで、製造者の推奨に従って配列決定した。多数のクローンの配列分析は、トウモロコシゲノムの２つの異なる、以前に特性決定された遺伝子座に由来する、２つの異なる遺伝子フラグメントが、ＨｉＩＩ細胞から単離されていたことを明らかにした。
ＨｉＩＩ培養細胞から単離した２つの配列の比較は、予測されたコード領域内で、小さな相違、例えば単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）が２つのパラログの間に存在し、一方イントロン及び非コード領域はヌクレオチドレベルで有意に異なることを指示した。２つのパラログの間のこれらの相違は、それらが配列依存性ＤＮＡ結合タンパク質、例えばジンクフィンガードメインによって識別され得る配列の領域を際立たせるので、注目される。当業者は、１つの遺伝子配列に結合し、もう１つ別の高度に類似する遺伝子配列には結合しないジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインを設計し得る。対象パラログに対応する１．２ｋｂの部分遺伝子配列（図６６）をジンクフィンガーヌクレアーゼタンパク質設計のための鋳型として選択し、その後、上述したジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメイン分析に供した。
ＩＰＰ２−ＫジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインの設計
ＩＰＰ２−Ｋに関して同定された標的部位を使用して、ＩＰＰ２−Ｋジンクフィンガーについての認識らせんを選択した。ジンクフィンガー設計を以下の表８に示す。
ジンクフィンガー設計の標的部位を以下の表９に示す。
ＩＰＰ２−Ｋ設計を、ＣＣＨＣ構造を有するタンパク質をコードするジンクフィンガー発現ベクターに組み込んだ。上記表１〜４参照。非正準ジンクフィンガーコード配列を、次に、ＩＩＳ型制限酵素ＦｏｋＩのヌクレアーゼドメイン（４アミノ酸のＺＣリンカーによるWah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569の配列のアミノ酸３８４〜５７９）に融合して、ＩＰＰ２−Ｋ ＺＦＮを形成した。
ＩＰＰ２−Ｋジンクフィンガーヌクレアーゼを用いた遺伝子修復
ここで述べるＩＰＰ２−Ｋ ＺＦＮが相同組換えを促進する能力を、Urnov (2005) Nature 435(7042):646-51及び米国特許公開公報第２００５００６４４７４号（例えば実施例６〜１１）に述べられているＧＦＰ系において試験した。簡単に述べると、各々のＺＦＮ ５０ｎｇ及びプロモーターのないＧＦＰドナー(Urnov (2005) Nature)５００ｎｇを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎリポフェクタミン２０００プロトコールに従い、各試料につきリポフェクタミン２０００ ２μＬを使用して、５００，０００個のレポーター細胞にトランスフェクトした。
トランスフェクションの２４時間後にビンブラスチンを０．２μＭの最終濃度で添加し、トランスフェクションの７２時間後に除去した。
細胞を、トランスフェクションの５日後に、Ｇｕａｖａ卓上ＦＡＣＳ分析器で各トランスフェクションにつき４０，０００細胞を測定することにより、ＧＦＰ発現に関して検定した。結果を図６９に示す。
トウモロコシＨｉＩＩ細胞におけるＣ３Ｈ１ ＺＦＮの発現
Ａ．ベクターの設計
トウモロコシ細胞におけるＺＦＮタンパク質の発現のためのプラスミドベクターを構築した。機能性ジンクフィンガーヌクレアーゼヘテロ二量体を形成するために必要な２つの異なるタンパク質の発現と相対的化学量論を最適化するため、単一プロモーターによって駆動される、単一ベクターに両方のＺＦＮ単量体のオープンリーディングフレームの挿入を生じさせる発現戦略を採用した。この戦略は、テソア・アシニア（Thesoa assigna）ウイルスに由来する２Ａ配列(Mattion, N.M., Harnish, E.C., Crowley, J. C. & Reilly, P.A. (1996)J. Virol. 70, 8124-8127)、オパック（opaque）−２遺伝子（ｏｐ−２）からのトウモロコシ核局在化シグナル（ＮＬＳ）(Maddaloni, M., Di Fonzo, N., Hartings, H., Lazzaroni, N., Salaminil, F., Thompson, R., & Motto M. (1989) Nucleic Acids Research Vol. 17(18):7532)及びトウモロコシユビキチン−１遺伝子に由来するプロモーター(Christensen A.H., Sharrock R.A., & Quail P.H. (1992) Plant Mol Biol. 18(4):675-89)の機能性を利用する。ライブラリーアーカイブから選択された又は新たに合成されたＺＦＮコード遺伝子の所与の対についてのこれらの発現ベクターを開発するために、段階的モジュラークローニングスキームを考案した。
第一に、ｐＶＡＸベクター（例えばその開示が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開公報第２００５−０２６７０６１号参照）を、図６５、パネルＡ−Ｅに示すようにＮ末端発現ドメインを含むように改変した。この改変プラスミド（ｐＶＡＸ−Ｎ２Ａ−ＮＬＳｏｐ２−ＥＧＦＰ−ＦｏｋＭｏｎｏ）（図６５Ａ）の特徴は、トウモロコシｏｐ−２に由来するＮＬＳをコードする、再設計され、合成されたセグメント（ＲＫＲＫＥＳＮＲＥＳＡＲＲＳＲＹＲＫ、配列番号１３３）、及びトウモロコシコドンバイアスを利用したＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをコードする、再設計され、合成されたセグメントを含む。加えて、クローニングの都合上、ユニークＸｈｏＩ部位の下流の単一ヌクレオチド挿入（Ｃ）が余分なＳａｃＩ部位を創製した。
第二に、ｐＶＡＸベクター（例えば米国特許公開公報第２００５−０２６７０６１号参照）をまた、Ｃ末端発現ドメインを含むように改変した。この改変プラスミド（ｐＶＡＸ−Ｃ２Ａ−ＮＬＳｏｐ２−ＥＧＦＰ−ＦｏｋＭｏｎｏ）（図６５Ｂ）の特徴は、トウモロコシｏｐ−２に由来するＮＬＳをコードする、再設計され、合成されたセグメント（ＲＫＲＫＥＳＮＲＥＳＡＲＲＳＲＹＲＫ、配列番号１３３）、及びトウモロコシコドンバイアスを利用したＦｏｋＩヌクレアーゼドメインをコードする、再設計され、合成されたセグメントを含む。加えて、テソア・アシニアウイルスからの２Ａ配列（ＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤ ＶＥＥＮＰＧＰ、配列番号１３４）を、前記の２つのタンパク質コードドメインのその後の連結のためにＺＦＮ ＯＲＦのＮ末端に導入した。
個々のジンクフィンガータンパク質のＯＲＦをコードする遺伝子カセットを、制限酵素ＫｐｎＩ及びＢａｍＨＩを使用した連結によってＮ２Ａ又はＣ２Ａベクターのいずれかにクローニングして適合性末端を創製した。次に、Ｃ２ＡベクターからのＢｇｌＩＩ／ＸｈｏＩフラグメントを同じ制限部位によってＮ２Ａベクターに挿入し、ＮｃｏＩ及びＳａｃＩ制限部位によって隣接された２つのＺＦＮコードドメインを含むカセットを含有する中間構築物を生成した。
最後に、両方のＺＦＮ遺伝子を含む、この中間構築物（図６５Ｃ）からのＮｃｏＩ／ＳａｃＩカセットを、これらの酵素を用いた制限によって切り出し、プラスミド骨格ｐＤＡＢ３８７２（図６５Ｄ）に連結した。生じたプラスミドは、ＺＦＮ遺伝子プラス関連プロモーター及びターミネーター配列、及びプラスミド維持のための選択マーカーを含む。
その一例を図６５Ｅに示す、最終構築物において、ＺＦＮ発現カセット（プロモーター及びターミネーターエレメントを含む）は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＧａｔｅｗａｙシステムを使用した好都合な操作のためにａｔｔＬ部位によって隣接される。このクローニングスキームを用いて作製されたＺＦＮ構築物の各々を、大腸菌ＤＨ５ａ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、その後適切な選択下で維持した。
Ｂ．ＤＮＡ送達と一過性発現
図６５Ｅに示すように構築されたＺＦＮ発現ベクターのプラスミド試料を、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）からのエンドヌクレアーゼ不含Ｇｉｇａｐｒｅｐキットを製造者の推奨に従って使用して、抗生物質を含むＬＢ培地で増殖させた大腸菌細胞の２Ｌ培養物から作製した。プラスミドＤＮＡを、様々な方法を用いてトウモロコシＨｉＩＩ培養細胞に直接送達した。
一例では、トウモロコシ細胞をＷｈｉｓｋｅｒｓ（商標）（ウィスカー）によるＤＮＡ送達に供した。ＤＮＡ送達の約２４時間前に、ＰＣＶ ３ｍｌのＨｉＩＩトウモロコシ懸濁細胞プラス馴化培地７ｍｌを、１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中のＧＮ６液体培地（ゲルライトを欠くＧＮ６培地）２０ｍｌに継代培養し、１２５ｒｐｍ、２８℃の振とう機上に２４時間置いた。ＰＣＶ ２ｍＬを取り出し、１２５ｍＬエルレンマイヤーフラスコ中のＧＮ６ Ｓ／Ｍ浸透培地１２ｍｌ（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌ スクロース、４５．５ｇ／Ｌ ソルビトール、４５．５ｇ／Ｌ マンニトール、１００ｍｇ／Ｌ ミオイノシトール、ｐＨ６．０）に添加した。フラスコを、穏やかに攪拌しながら（１２５ｒｐｍ）２８℃で３０〜３５分間、暗所でインキュベートした。この期間中に、適切な容量のＧＮ６ Ｓ／Ｍ液体培地をあらかじめ計量した滅菌ウィスカーに添加することにより、シリコンカーバイドウィスカー（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，Ｉｎｃ．，Ｅｕｒｅｋａ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＡＫ）の５０ｍｇ／ｍｌ懸濁液を調製した。ＧＮ６ Ｓ／Ｍ中でのインキュベーション後、各々のフラスコの内容物を１５ｍＬ円錐遠心分離管に注ぎ入れた。
細胞が沈降した後、ＧＮ６ Ｓ／Ｍ液体 １ｍＬを除く全部を取り出し、後日の使用のために１２５ｍＬフラスコに収集した。あらかじめ湿潤化したウィスカーの懸濁液を最大速度で６０秒間ボルテックスし、広口のフィルター付きピペットチップを用いて１６０μＬを遠心分離管に添加し、ＤＮＡ２０μｇを添加した。分離管を「指でボルテックス（finger vortexed）」し、直ちに、１７×１００ｍｍ培養管を保持するように改変された、Ｃａｕｌｋ 「Ｖａｒｉ−Ｍｉｘ ＩＩ」歯科用アマルガメーターに入れて、中間速度で６０秒間攪拌した。攪拌後、細胞、培地、ウィスカー及びＤＮＡのカクテルを、さらなるＧＮ６液体培地１８ｍｌと共にエルレンマイヤーフラスコに戻した。細胞を、暗所にて２８℃で２時間、１２５ＲＰＭの振とう機上で回復させた。
分散懸濁液約５〜６ｍＬを、各試料について５〜６フィルターが得られるように家庭用真空掃除機（house vacuum line）に接続したガラス製細胞収集機ユニットを使用してＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．４ろ紙（５．５ｃｍ）でろ過した。フィルターをＧＮ６培地の６０×２０ｍｍプレートに置き、暗条件下に２８℃で培養した。２４、４８又は７２時間後、２〜５のろ紙からの細胞をすくい取り、管に収集して、ドライアイス上に置き、その後−８０℃で凍結した。
ＤＮＡ送達のもう１つの例では、精製したエンドヌクレアーゼ不含プラスミド試料を、装置の製造者のプロトコールから適合させたパーティクルガン手法（micro-projectile bombardment）を用いてトウモロコシ細胞に直接送達した。すべての打ち込みは、Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で実施した。粒子被覆のために、直径１．０ミクロンの金粒子３ｍｇを１００％エタノールで１回、滅菌蒸留水で２回洗浄し、シリコン処理したエッペンドルフ管中で水５０μｌに再懸濁した。プラスミドＤＮＡ ５μｇ、スペルミジン（０．１Ｍ）２０μｌ及び塩化カルシウム（２．５Ｍ）５０μｌを金懸濁液に添加した。混合物を室温で１０分間インキュベートし、１０Ｋ ｒｐｍで１０秒間ペレット化して、低温１００％エタノール６０μｌに再懸濁し、８〜９μｌを各々のマクロキャリアーに分配した。打ち込み用の細胞を調製するため、継代培養後３日目の液体培養物から細胞クラスターを取り出し、ペトリ皿の増殖培地プラス各０．２５６Ｍのマンニトール及びソルビトールからなる浸透培地の直径２．５ｃｍの円に置いた。打ち込み前の４時間、細胞を浸透圧調節物質中でインキュベートした。打ち込みは、１１００ｐｓｉ及び２７インチＨｇ真空の条件下で組織を中段の棚に置き、操作マニュアルに従って上述した装置において実施した。処理後２４時間目の時点で、打ち込んだ細胞クラスターを採取し、液体Ｎ２中で凍結して、−８０℃で保存した。
トウモロコシ細胞におけるＺＦＮのＤＮＡ送達と一過性発現のもう１つの例は、プロトプラスト試料の使用を含んだ。Mitchell and Petolino (1991) J. Plant. Physiol. 137: 530-536及びLyznik et al. (1995) Plant J. 8(2): 177-186から修正された方法を用いて、ＨｉＩＩトウモロコシ細胞培養物からプロトプラストを調製した。懸濁培養物を、１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって継代培養後４８時間目（対数期の中間部）に採取した。培養培地を取り出し、充填ＰＣＶ ５ｍｌをＷ５培地（１５４ｍＭ ＮａＣｌ２；１２５ｍＭ ＣａＣｌ２ Ｈ２Ｏ；５ｍＭ ＫＣｌ２；５ｍＭ グルコース；ｐＨ５．８）１０ｍｌ中で静かに洗浄した。
洗浄した細胞を１００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって収集し、その後、フィルター滅菌したＫ３培地（ＫＮＯ３ ２．５ｇ；ＮＨ４ＮＯ３ ２５０ｍｇ；ＣａＣｌ２（二水和物）９００ｍｇ；Ｍｇ２ＳＯ４ ２５０ｍｇ；ＮＨ４ＳＯ４ ２５０ｍｇ；ＮａＰＯ４（一塩基性）１５０ｍｇ；キシロース２５０ｍｇ；硫酸第一鉄／ｃｈｅａｌａｔｅ原液（Ｆ３１８）１０ｍｌ；Ｂ５微量栄養素１ｍｌ（１０００Ｘ原液−ヨウ化カリウム７５０ｍｇ；モリブデン酸（ナトリウム塩）脱水物２５０ｍｇ；塩化コバルト２５ｍｇ；硫酸銅２５ｍｇ）；Ｋ３ビタミン１０ｍｌ（１００Ｘ原液−ミオイノシトール１ｇ；ピリドキシンＨＣｌ １０ｍｇ；チアミンＨＣｌ １００ｍｇ；ニコチン酸１０ｍｇ）；＋０．６Ｍ マンニトール；ｐＨ＝５．８］２５ｍｌ中の３％セルラーゼＹ−Ｃ＋０．３％ペクトリアーゼＹ２３を含む酵素カクテル（Ｋａｒｌａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｃｏｒｐ．，Ｃｏｔｔｏｎｗｏｏｄ，ＡＺ）においてインキュベートした。二次植物細胞壁を消化するため、細胞を静かに攪拌しながら（５０ｒｐｍ）２５℃で５〜６時間インキュベートした。
細胞壁の分解後、酵素−細胞混合物を１００ミクロンのセルストレーナーでろ過し、プロトプラストと細胞デブリを含むフロースルーを等量のＫ３＋０．６Ｍ マンニトール培地で洗浄した。プロトプラストを８００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上清を廃棄して、洗浄を繰り返した。プロトプラストペレットを洗浄し、Ｋ３＋０．６Ｍ マンニトール＋９％フィコール４００溶液２０ｍｌに再懸濁した。この溶液１０ｍｌを２つの滅菌プラスチックチューブに分注し、ＴＭ培地（ＭＥＳ １９．５２ｇ；マンニトール３６．４５ｇ；２Ｍ ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏ原液４０ｍｌ；ｐＨ＝５．５）２ｍｌを懸濁液上に静かに重ねて、不連続勾配を形成した。
生存可能プロトプラストを、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離によって非生存可能プロトプラスト、細胞デブリ及び無傷懸濁細胞から分離した。勾配界面に形成された明確なプロトプラストバンドをピペットで取り出し、新鮮ＴＭ溶液１０ｍｌで洗浄して、次に８００ｒｐｍで５分間遠心分離した。生じたプロトプラストペレットをＴＭ培地１ｍｌに再懸濁し、生存プロトプラストの数を血球計での２５ｍｇ／ｍｇ フルオレセインジアセテート（ＦＤＡ）染色によって定量した。プロトプラスト溶液をＴＭ培地中１×１０７プロトプラスト／ｍｌの最終濃度に調整した。
約１×１０６プロトプラスト（１００μｌ）を、精製プラスミドＤＮＡ１０−８０μｇを含む２ｍｌエッペンドルフ管に移した。４０％ＰＥＧ−３３５０（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）溶液１００μｌを滴下して加え、懸濁液を静かに混合した。プロトプラスト／ＤＮＡ混合物を室温で３０分間インキュベートし、次にＧＮ６増殖培地１ｍｌで滴下希釈した。希釈したプロトプラストをこの培地中２５℃で２４時間インキュベートし、その後採取して、液体Ｎ２中で凍結し、−８０℃で保存した。
インビボでのＺＦＮの機能性
本実施例におけるＺＦＮの機能性は、作物種の細胞において発現するＺＦＮの能力、及びその所望標的の認識、所望標的への結合及びその切断を通してその作物の内因性ゲノム内での二本鎖断裂を媒介するＺＦＮの能力を包含する（がこれらに限定されない）ことが了解される。また本実施例において、ＺＦＮの標的は、作物ゲノム内の内因性遺伝子座及び立体配座の遺伝子であることも了解される。
操作したＺＦＮがゲノム環境において予測される標的遺伝子に対して機能性を有するかどうかを評価するため、ＤＮＡ配列に基づくアッセイを実施した。ＺＦＮが誘導する二本鎖ＤＮＡ断裂は、修復機構、例えば非相同的末端接合（ＮＨＥＪ）(Cahill et al., (2006) Mechanisms Front Biosci. 1(11): 1958-76によって総説されている)を誘導すると予測される。ＮＨＥＪの１つの結果は、断裂したＤＮＡ鎖の一部が不完全に修復され、切断部位で小さな欠失、挿入又は置換を生じることである。当業者は、様々な方法を通してＤＮＡ配列におけるこれらの変化を検出し得る。
Ａ．ＰＣＲに基づくクローニングと配列決定
一例では、ＺＦＮタンパク質を発現するトウモロコシＨｉＩＩ培養細胞を形質転換の２４時間後に単離し、凍結して、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）Ｐｌａｎｔ ＤＮｅａｓｙ抽出キットを製造者の推奨に従って使用するゲノムＤＮＡ抽出に供した。ＺＦＮの標的遺伝子に特異的であり、予測切断部位に隣接するオリゴヌクレオチドプライマーを使用してＰＣＲ増幅を実施した。標的ＩＰＰ２−Ｋ遺伝子パラログに特異的な正方向ＰＣＲプライマー（５’−ＧＧＡＡＧＣＡＴＴＡＴＴＣＣＡＡＴＴＴＧＡＴＧＡＴＡＡＴＧＧ−３’）（配列番号１３５）及び逆方向ＰＣＲプライマー（５’−ＣＣＣＡＡＧＴＧＴＣＧＡＧＧＴＴＧＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＡＣ−３’）（配列番号１３６）を組み合わせて、以下の条件下で精製ゲノムＤＮＡを増幅するために使用した。酵素製造者の緩衝液中に、ｇＤＮＡ鋳型２０ｎｇ、各々のプライマー２０ｐｍｏｌ、１％ ＤＭＳＯ及びＡｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｐｆポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１０単位を含む反応物容量２５μｌ。予想された大きさの増幅産物が、９５℃−１分間、（９５℃−３０秒間、６１℃−３０秒間、７２℃−１分間）×３０、７２℃−５分間、４℃−保持からなる増幅サイクルから生じた。
増幅したフラグメントを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）からのＴＡクローニングキットを使用してベクターｐＣＲ２．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に直接クローニングした。単離したクローン化フラグメントを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ，ＣＡ）からのＣＥＱ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔにより、９６穴形式で製造者の推奨に従って配列決定した。この実験において、ＺＦＮタンパク質は、図６６に示すように２つの短いＩＰＰ２−Ｋ遺伝子特異的配列に結合して、二本鎖ＤＮＡを切断するヘテロ二量体ヌクレアーゼを創製すると予測される。
多数のクローンからの配列決定結果の解析は、クローンＮｏ．１２７が正確にＺＦＮの予測切断部位に小さな欠失を含むことを明らかにし、ＮＨＥＪ機構がその部位でＤＮＡ配列の不完全な修復を媒介していたことを指示した（図６７）。
これらの結果は、これらの操作されたＺＦＮの、作物種内の内因性遺伝子座で標的二本鎖切断を特異的に誘導する能力を明らかにする。
Ｂ．大規模並列塩基配列解析（Massively parallel sequencing analysis）
もう１つの例では、この同じ配列に対して標的される種々のＺＦＮタンパク質を発現する多数の細胞試料のゲノムの問い合わせを行うために、ＰＣＲと大規模並列パイロシーケンシング法の組み合わせを適用した。正方向ＰＣＲプライマー（５’−ＸＸＸＣＡＣＣＡＡＧＴＴＧＴＡＴＴＧＣＣＴＴＣＴＣＡ−３’）（配列番号１３７）［式中、ＸＸＸ＝ＧＧＧ、ＣＣＣ又はＧＧＣ］の３つの変異体及び逆方向ＰＣＲプライマー（５’−ＸＸＸＡＴＡＧＧＣＴＴＧＡＧＣＣＡＡＧＣＡＡＴＣＴＴ−３’）（配列番号１３８）［式中、ＸＸＸ＝ＧＣＣ、 ＣＣＧ又はＣＧＧ］の３つの変異体を合成した（ＩＤＴ，Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）。各々のプライマーの５’末端の３ｂｐタグはキー識別子として働き、アンプリコンがどの細胞試料に由来するかを指示する。マッチする識別子タグ（キー）を有するプライマー対を、以下の条件下でトウモロコシ細胞試料に由来する精製ゲノムＤＮＡを増幅するために組み合わせて使用した。酵素製造者の緩衝液中に、ｇＤＮＡ鋳型４０ｎｇ、各々のプライマー２０ｐｍｏｌ、１％ ＤＭＳＯ及びＡｃｃｕｐｒｉｍｅ Ｐｆポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）１０単位を含む反応物容量５０μｌ。予想された大きさの増幅産物が、９５℃−１分間、（９５℃−３０秒間、６５℃−３０秒間、７２℃−１分間）×３０、４℃−保持からなる増幅サイクルから生じ、それらを、Ｑｉａｇｅｎ（Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）のＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ精製キットを製造者の推奨に従って使用して精製した。
大規模並列パイロシーケンシング反応（４５４配列決定法としても知られる）を、４５４ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｂｒａｎｆｏｒｄ，ＣＴ）により、(Margulies et al. (2005) Nature 437: 376-380)に述べられているＰＣＲ産物に関して直接実施した。４５４配列決定結果の解析を、予想された大きさの欠失を含む配列読取りとＤＮＡ分子内の位置を同定することによって実施した。
これらの解析の結果は、図６８に示すように、これらのＺＦＮについての予想される切断部位に多数の小さな欠失の存在を指示した。これらの欠失は、ＺＦＮ標的部位に正確に局在し、ＺＦＮによって誘導される二本鎖切断がゲノム内で生じ、その後ＮＨＥＪによって修復されたことを示す。これらの結果はさらに、これらの操作されたＺＦＮの、作物種内の内因性遺伝子座で標的二本鎖切断を特異的に誘導する能力を明らかにする。
標的組込みのためのドナーＤＮＡの設計
本実施例において、ドナーＤＮＡは、植物細胞に送達され、核ゲノムに組み込まれる二本鎖ＤＮＡ分子を含むことが了解される。この組込みが起こる機構は、相同性に依存しない非相同的末端接合（ＮＨＥＪ；Cahill et al., (2006) Mechanisms Front Biosci. 1: 1958-76によって総説されている)又は核ＤＮＡ内の二本鎖断裂部位におけるもう１つの類似機構によってであり得る。ドナーＤＮＡのゲノム内へのそのようなＮＨＥＪが駆動する連結様組込みは、ドナーＤＮＡの組込み位置が主として二本鎖ＤＮＡ断裂の存在によって決定されるので、ランダム組込みと称される。この機構において、ゲノムへのドナーＤＮＡの組込みは、断裂部位のゲノムのヌクレオチド配列又はドナー自体のヌクレオチド配列のいずれにも依存しない。従って、ランダム組込みにおいて、ドナーＤＮＡが組み込まれるゲノム内の「アドレス」は、ドナーＤＮＡの配列に基づいて規定されず、また予測されない。ランダム組込みは、アグロバクテリウム又はパーティクルガンを介した生存植物細胞へのＤＮＡ送達による標準植物形質転換の間にドナーＤＮＡの遺伝子導入が起こる主要機構である。
ランダム組込みに対して、ドナーＤＮＡはまた、標的組込みによってもゲノムに組み込まれ得る。標的組込みは、相同性依存型の機構、例えば相同性依存型一本鎖アニーリング又は相同組換え（van den Bosch et al. (2002) Biol Chem. 383(6): 873-892において総説されている)によって二本鎖断裂の部位（ポジション）で起こることが了解される。相同性依存型ＤＮＡ断裂修復の場合、断裂部位のＤＮＡに同一性又は類似性を有するヌクレオチド配列を含むドナーＤＮＡがその部位に組み込まれ得る。従って、ドナーＤＮＡがゲノムに組み込まれる「アドレス」は、ゲノムとドナーＤＮＡ分子の間のヌクレオチド配列同一性又は配列類似性に依存する。植物系では、ＤＮＡにおける二本鎖断裂の修復は、ＮＨＥＪと相同性依存経路の両方を利用することが公知である（Puchta (2005) J. Exp. Bot. 56: 1-14において総説されている)。
本実施例において、我々は、配列特異的ＺＦＮタンパク質によって誘導される二本鎖断裂の部位における標的組込みによってゲノムに組み込まれるドナーＤＮＡ分子の設計と構築を述べる。種々のＺＦＮタンパク質が標的遺伝子配列内の種々のヌクレオチドで二本鎖断裂を誘導し得る；誘導される二本鎖断裂の特定部位をポジション（position）と称する。
実施例１３で述べたように、我々は、標的遺伝子である、トウモロコシからのＩＰＰ２Ｋのヌクレオチド配列を特性決定した。その後、その標的遺伝子の特定塩基に結合するＺＦＮタンパク質を設計し（実施例１４）、異種系における標的遺伝子内のその配列での及びトウモロコシ細胞における内因性遺伝子に対しての、それらの結合／切断活性を検証した（実施例１５〜１７）。ここで我々は、標的組込みにより、ＩＰＰ２Ｋ遺伝子内のＺＦＮを介した二本鎖断裂の位置でトウモロコシゲノムに組み込むために設計された様々なドナー分子の構築を述べる。当業者は、ヌクレオチド配列が公知であり、配列が二本鎖断裂を含むと予測される何らかのゲノム内の何らかの位置で、相同性が駆動する標的組込みによってＺＦＮ誘導性二本鎖断裂に組み込むために設計されたドナーＤＮＡ分子を構築し得る。
ここで述べる１つの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、標的位置で標的遺伝子、ＩＰＰ２Ｋのヌクレオチド配列に同一なヌクレオチド配列のセグメントによって隣接される自律的除草剤耐性遺伝子発現カセットを含む。本実施形態では、自律的除草剤耐性カセットは、プロモーター、除草剤耐性遺伝子、及び植物細胞において機能性であることが公知のターミネーター配列を含む完全なプロモーター−転写ユニット（ＰＴＵ）を含むことが了解される。当業者は、自律的ＰＴＵを構成するプロモーター、遺伝子及びターミネーターの何らかの組み合わせを選択し得る。また、指示される位置でトウモロコシにおける標的遺伝子（ＩＰＰ２Ｋ）に配列同一性を有するＤＮＡフラグメントもこのプラスミド構築物に含まれる。これらのフラグメントは、ドナーＤＮＡ及び標的組込みによる特定位置での標的遺伝子へのこのドナーの直接組込みの「相同性フランク（homology flanks）」として働く。相同性フランクは、ＰＴＵに対して正しい５’−３’方向でＰＴＵの上流と下流の両方に位置する。当業者は、ドナーＤＮＡの構築物における様々な大きさと方向の相同性フランクを想定し得る。
ここで述べるもう１つの実施形態では、ドナーＤＮＡ分子は、標的位置でＩＰＰ２Ｋのヌクレオチド配列に同一なヌクレオチド配列のセグメントによって隣接される非自律的除草剤耐性遺伝子発現カセットを含むプラスミド構築物を含有する。本実施形態では、非自律的除草剤耐性カセットは、機能性プロモーターを欠く不完全なプロモーター−転写ユニット（ＰＴＵ）を含むことが了解される。非自律的ＰＴＵは、除草剤耐性遺伝子、及び植物細胞において機能性であることが公知のターミネーター配列を含む。当業者は、非自律的ＰＴＵを構成する遺伝子とターミネーターの何らかの組み合わせを選択し得る。非自律的ドナーの本実施例では、除草剤耐性遺伝子の発現は、その遺伝子の発現を駆動し得る機能性プロモーターに近接したゲノム位置へのドナーセグメントの組込みに依存する。ドナーが、偶然にプロモーターが存在する遺伝子座にランダム組込みによって組み込まれ、除草剤耐性遺伝子の発現を駆動するために使用可能であるという比較的まれな状況が想定され得る。あるいは、ドナーＤＮＡ構築物内のトウモロコシにおける特定位置の標的遺伝子に配列同一性を有する適切な長さのＤＮＡフラグメントの相同性フランクの存在に基づき、特定位置での標的遺伝子へのドナーＤＮＡの正確な標的組込みが起こることがあり（自律的ドナーに関して述べたように）、従って前記標的遺伝子の内因性プロモーターを利用し得る。本実施例では、相同性フランクは、ＰＴＵに対して正しい５’−３’方向でＰＴＵの上流と下流の両方に位置する。当業者は、ドナーＤＮＡの構築物における様々な大きさと方向の相同性フランクを想定し得る。
ここで述べる両方の実施形態（自律的及び非自律的ドナー設計）において、プラスミド構築物は、典型的にはクローニング、除草剤耐性遺伝子の発現、及びその後の分析を可能にする付加的なエレメントを含む。そのようなエレメントは、細菌複製起点、操作された制限部位等を含み、以下で説明される。当業者は、ドナーＤＮＡ分子を含む種々のエレメントの利用を想定し得る。
Ａ．細菌株及び培養条件
大腸菌株（Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ １０化学的コンピテント細胞；ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）化学的コンピテント細胞、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を、ルリア・ベルタニブロス（ＬＢ：１０ｇ／Ｌ バクトトリプトン、１０ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、５ｇ／Ｌ バクト酵母抽出物）、ＬＢ寒天（ＬＢブロス＋１５ｇ／Ｌ バクト寒天）又はテリフィックブロス（ＴＢ：１２ｇ／Ｌ バクトトリプトン、２４ｇ／Ｌ バクト酵母抽出物、０．４％ｖ／ｖグリセロール、１７ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、７２ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４）を用いて３７℃で１６時間増殖させた。液体培養物を２００ｒｐｍで振とうした。クロラムフェニコール（５０μｇ／ｍｌ）、カナマイシン（５０μｇ／ｍｌ）又はアンピシリン（１００μｇ／ｍｌ）を必要に応じて培地に添加した。この試験で使用したすべての抗生物質、培養培地及び緩衝液試薬はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）又はＤｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）から購入した。
Ｂ．プラスミド骨格ポジション−１
ＩＰＰ２Ｋのポジション−１についての相同性フランクを含むプラスミド骨格を、ＩＰＰ２Ｋ遺伝子の対応する標的部位への任意のドナーＤＮＡ配列の組込みを可能にするように操作した。当業者は、様々なクローニング部位、モジュラー設計エレメント及び対象ゲノム内の何らかの標的配列に相同な配列を使用したプラスミド骨格を構想し得る。ここで例示するプラスミド骨格は、基本プラスミドベクターｐＢＣ ＳＫ（−）ファージミド（３．４Ｋｂｐ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に由来した。以下で述べる４段階合成を、ポジション−１のプラスミド骨格を構築するために使用した。
工程Ｎｏ．１では、基本プラスミドを作製した。ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ１０単位とＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限エンドヌクレアーゼ１０単位を用いてｐＢＣ ＳＫ（−）３μｇを３７℃で１時間線状化した。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した１．０％ＴＡＥ（０．０４Ｍ トリス−アセテート、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ）アガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。ＤＮＡフラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）との比較によってフラグメントの大きさを推定した。３．４ＫｂｐのＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ消化したサブクローニングベクター、ｐＢＣ ＳＫ（−）をゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。
工程Ｎｏ．２では、ＩＰＰ２Ｋのポジション−１から５’及び３’相同性フランクを単離した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーは、標準脱塩の条件下でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成され、水で０．１２５μｇ／μｌの濃度に希釈された。
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＴＣＴＣＡＣＣＧＣＧＧＣＴＴＧＧＧＧＡＴＴＧＧＡＴＡＣＧＧＡＧＣＴ−３’（配列番号：１４３）
５’−ＡＣＴＡＧＴＧＡＴＡＴＧＧＣＣＣＣＡＣＡＧＧＡＧＴＴＧＣＴＣＡＴＧＡＣＴＴＧ−３’（配列番号：１４４）
５’−ＡＣＴＡＧＴＣＣＡＧＡＡＣＴＧＧＴＴＧＡＧＴＣＧＧＴＣＡＡＡＣＡＡＧＡＴＴＧＣＴ−３’（配列番号：１４５）
５’−ＧＴＣＧＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＴＡＣＣＣＡＴＴＧＧＧＣＴＧＴＴＧＴ−３’（配列番号：１４６）
ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓｅｔａ ３−４−１，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，５２０−２１９３，Ｊａｐａｎから提供された、以下からなる試薬を用いてＰＣＲ増幅反応を実施した。１０Ｘ ＬＡ ＰＣＲ（商標）Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ２ ＋）５μｌ、二本鎖ｇＤＮＡ鋳型（トウモロコシＨｉＩＩ）２０ｎｇ、正オリゴヌクレオチドプライマー１０ｐｍｏｌ、逆オリゴヌクレオチドプライマー１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物（各々２．５ｍＭ）８μｌ、Ｈ２Ｏ ３３．５μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位）、鉱物油１滴。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、４８試料ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を使用して、以下のサイクリング条件下でＰＣＲ反応を実施した。９４℃、４分間／１サイクル；９８℃、２０秒間、６５℃、１分間、６８℃、１分間／３０サイクル；７２℃、５分間／１サイクル；４℃／保持。各々のＰＣＲ反応物１５μｌを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。増幅したフラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想された増幅産物は、０．８２１Ｋｂｐ（５’相同性フランク）又は０．８２１Ｋｂｐ（３’相同性フランク）のいずれかのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。
これらのフラグメントをゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。精製したフラグメントを、次に、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ（ｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターと共に）及びＯｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ １０化学的コンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者のプロトコールに従って使用して、ｐＣＲ２．１プラスミドにクローニングした。
個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ カナマイシンを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。５’相同性フランククローンプラスミドからの単離プラスミド３μｇをＳｐｅＩ及びＮｏｔＩの各１０単位で消化した。３つのプライム−相同性（prime-homology）フランククローンプラスミドをＳｐｅＩ １０単位及びＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）２０単位で消化した。すべてのプラスミド消化物を３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたプラスミドクローンは、３．９ＫｂｐのｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターに加えて０．８２１Ｋｂｐ（５’相同性フランク）又は０．８２１Ｋｂｐ（３’相同性フランク）の挿入ＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。
プラスミドクローンの二本鎖塩基配列決定反応を、ＣＥＱ（商標）ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて製造者によって述べられているように実施した。反応物を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ ＤＴＲ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて製造者のプロトコールによって述べられているように精製した。配列反応物をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣＥＱ（商標）２０００ ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで分析し、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）バージョン４．１．４（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いてヌクレオチド特性決定を実施した。ＩＰＰ２Ｋに由来するポジション−１の５’相同性フランクに対応する０．８２１Ｋｂｐフラグメントの配列を図８７に示す（配列番号１７１）。ＩＰＰ２Ｋに由来するポジション−１の３’相同性フランクに対応する０．８２１Ｋｂｐフラグメントの配列を図８８に示す（配列番号１７２）。
工程Ｎｏ．３では、ポジション−１の５’相同性フランクを基本プラスミドに連結した。正しいポジション−１の５’相同性フランク配列を含むクローンに対応する制限フラグメントをゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。ポジション−１の５’相同性フランクに対応するフラグメント（０．８２１Ｋｂｐ）を、次に、１６℃水浴中での１６時間のインキュベーションの条件下に２０μｌの反応物容量で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５００単位を使用して１：５のベクター：挿入物比で、ＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ（工程Ｎｏ．１）で消化した精製基本プラスミドに連結した。連結反応物５μｌを、その後、大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ １０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、製造者によって述べられている選択条件下で平板培養した。個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ カナマイシンを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。
インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミドＤＮＡ ３μｇをＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の各１０単位で消化し、３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたプラスミドクローンは、３．４Ｋｂｐの基本プラスミドに加えて０．８２１Ｋｂｐの挿入ＤＮＡフラグメント（５’相同性フランク）の存在によって診断された。
工程Ｎｏ．４では、ポジション−１の３’相同性フランクを工程Ｎｏ．３の産物に連結した。工程Ｎｏ．３で述べた操作産物３μｇを、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ１０単位とＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限エンドヌクレアーゼ２０単位を用いて３７℃で１時間線状化した。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した１．０％ＴＡＥ（０．０４Ｍ トリス−アセテート、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ）アガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。ＤＮＡフラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）との比較によってフラグメントの大きさを推定した。〜４．２ＫｂｐのＳｐｅＩ／ＳａｌＩ消化した工程Ｎｏ．３からの産物をゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。
工程Ｎｏ．２で作製した３’相同性フランクドナー（０．８２１Ｋｂｐ）の単離フラグメントを、その後、ＳｐｅＩ／ＳａｌＩで消化した工程Ｎｏ．３の産物と組み合わせ、１：５のベクター：挿入物比及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５００単位を使用して２０μｌの連結反応物として上述したように精製した。連結反応物を１６℃水浴中で１６時間インキュベートした。連結後、連結反応物５μｌを、製造者の推奨に従ってＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ クロラムフェニコールを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種した。
培養物を、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミド３μｇをＳａｌＩ及びＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の各１０単位で消化し、３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたクローンは、１．６４Ｋｂｐ（挿入物）及び３．３３Ｋｂｐ（基本プラスミド）の２つのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。生じたプラスミドをｐＤＡＢ７４７１（図７０）と命名した。
Ｃ．プラスミド骨格位置−２
ＩＰＰ２Ｋのポジション−２についての相同性フランクを含むプラスミド骨格を、ＩＰＰ２Ｋ遺伝子の対応する標的部位への任意のドナーＤＮＡ配列の組込みを可能にするように操作した。当業者は、様々なクローニング部位、モジュラー設計エレメント及び対象ゲノム内の何らかの標的配列に相同な配列を使用したプラスミド骨格を構想し得る。ここで例示するプラスミド骨格は、基本プラスミドベクターｐＢＣ ＳＫ（−）ファージミド（３．４Ｋｂｐ）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）に由来した。以下で述べる４段階合成を、ポジション−２のプラスミド骨格を構築するために使用した。
工程Ｎｏ．１では、基本プラスミドを作製した。ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ１０単位とＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限エンドヌクレアーゼ１０単位を用いてｐＢＣ ＳＫ（−）３μｇを３７℃で１時間線状化した。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した１．０％ＴＡＥ（０．０４Ｍ トリス−アセテート、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ）アガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。ＤＮＡフラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）との比較によってフラグメントの大きさを推定した。３．４ＫｂｐのＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ消化したサブクローニングベクター、ｐＢＣ ＳＫ（−）をゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。
工程Ｎｏ．２では、ＩＰＰ２Ｋのポジション−２から５’及び３’相同性フランクを単離した。以下のオリゴヌクレオチドプライマーは、標準脱塩の条件下でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成され、水で０．１２５μｇ／μｌの濃度に希釈された。
５’−ＧＣＧＧＣＣＧＣＴＡＧＡＴＡＧＣＡＧＡＴＧＣＡＧＡＴＴＧＣＴ−３’（配列番号：１４７）
５’−ＡＣＴＡＧＴＡＴＴＧＧＣＡＣＣＣＡＧＧＴＧＴＴＧＧＣＴＣＡ−３’（配列番号：１４８）
５’−ＡＣＴＡＧＴＣＡＴＧＴＣＧＡＴＧＧＴＧＧＧＧＴＡＴＧＧＴＴＣＡＧＡＴＴＣＡＧ−３’（配列番号：１４９）
５’−ＧＴＣＧＡＣＧＴＡＣＡＡＴＧＡＴＴＴＣＡＧＧＴＴＡＣＧＧＣＣＴＣＡＧＧＡＣ−３’（配列番号：１５０）
ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓｅｔａ ３−４−１，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，５２０−２１９３，Ｊａｐａｎから提供された、以下からなる試薬を用いてＰＣＲ増幅反応を実施した。１０Ｘ ＬＡ ＰＣＲ（商標） Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ２ ＋）５μｌ、二本鎖ｇＤＮＡ鋳型（トウモロコシＨｉＩＩ）２０ｎｇ、正オリゴヌクレオチドプライマー１０ｐｍｏｌ、逆オリゴヌクレオチドプライマー１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物（各々２．５ｍＭ）８μｌ、Ｈ２Ｏ ３３．５μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位）、鉱物油１滴。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、４８試料ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を使用して、以下のサイクリング条件下でＰＣＲ反応を実施した。９４℃、４分間／１サイクル；９８℃、２０秒間、５５℃、１分間、６８℃、１分間／３０サイクル；７２℃、５分間／１サイクル；４℃／保持。各々のＰＣＲ反応物１５μｌを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。増幅したフラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想増幅産物は、０．８５５Ｋｂｐ（５’相同性フランク）又は０．８４５Ｋｂｐ（３’相同性フランク）のいずれかのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。これらのフラグメントをゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。精製したフラグメントを、次に、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ（ｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターと共に）及びＯｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ １０化学的コンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者のプロトコールに従って使用して、ｐＣＲ２．１プラスミドにクローニングした。
個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ カナマイシンを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。５’相同性フランククローンプラスミドからの単離プラスミド３μｇをＳｐｅＩ及びＮｏｔＩの各１０単位で消化した。３つのプライム−相同性フランククローンプラスミドをＳｐｅＩ １０単位及びＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）２０単位で消化した。すべてのプラスミド消化物を３７℃で１時間インキュベートした。
制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたプラスミドクローンは、３．９ＫｂｐのｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターに加えて０．８５５Ｋｂｐ（５’相同性フランク）又は０．８４５Ｋｂｐ（３’相同性フランク）の挿入ＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。
プラスミドクローンの二本鎖塩基配列決定反応を、ＣＥＱ（商標）ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて製造者によって述べられているように実施した。反応物を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ ＤＴＲ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて製造者のプロトコールによって述べられているように精製した。配列反応物をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣＥＱ（商標）２０００ ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで分析し、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）バージョン４．１．４（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いてヌクレオチド特性決定を実施した。ＩＰＰ２Ｋに由来するポジション−２の５’相同性フランクに対応する０．８５５Ｋｂｐフラグメントの配列を図８９に示す（配列番号１３９）。ＩＰＰ２Ｋに由来するポジション−２の３’相同性フランクに対応する０．８４５Ｋｂｐフラグメントの配列を図９０に示す（配列番号１４０）。
工程Ｎｏ．３では、ポジション−１の５’相同性フランクを基本プラスミドに連結した。正しいポジション−２の５’相同性フランク配列を含むクローンに対応する制限フラグメントをゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。ポジション−１の５’相同性フランクに対応するフラグメント（０．８５５Ｋｂｐ）を、次に、１６℃水浴中での１６時間のインキュベーションの条件下に２０μｌの反応物容量で、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５００単位を使用して１：５のベクター：挿入物比で、ＳｐｅＩ／ＮｏｔＩ（工程Ｎｏ．１）で消化した精製基本プラスミドに連結した。
連結反応物５μｌを、その後、大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ １０化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換し、製造者によって述べられている選択条件下で平板培養した。個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ カナマイシンを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミドＤＮＡ ３μｇをＳｐｅＩ及びＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の各１０単位で消化し、３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたプラスミドクローンは、３．４Ｋｂｐの基本プラスミドに加えて０．８５５Ｋｂｐの挿入ＤＮＡフラグメント（５’相同性フランク）の存在によって診断された。
工程Ｎｏ．４では、ポジション−２の３’相同性フランクを工程Ｎｏ．３の産物に連結した。工程Ｎｏ．３で述べた操作産物３μｇを、ＳｐｅＩ制限エンドヌクレアーゼ１０単位とＳａｌＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）制限エンドヌクレアーゼ２０単位を用いて３７℃で１時間線状化した。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を添加した１．０％ＴＡＥ（０．０４Ｍ トリス−アセテート、０．００２Ｍ ＥＤＴＡ）アガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。ＤＮＡフラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）との比較によってフラグメントの大きさを推定した。４．２５ＫｂｐのＳｐｅＩ／ＳａｌＩ消化した工程Ｎｏ．３からの産物をゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。
工程Ｎｏ．２で作製した３’相同性フランクドナー（０．８４５Ｋｂｐ）の単離フラグメントを、その後、ＳｐｅＩ／ＳａｌＩで消化した工程Ｎｏ．３の産物と組み合わせ、１：５のベクター：挿入物比及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５００単位を使用して２０μｌの連結反応物として上述したように精製した。連結反応物を１６℃水浴中で１６時間インキュベートした。連結後、連結反応物５μｌを、製造者の推奨に従ってＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ クロラムフェニコールを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種した。培養物を、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミド３μｇをＳａｌＩ及びＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）の各１０単位で消化し、３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたクローンは、〜１．７Ｋｂｐ（挿入物）及び３．３３Ｋｂｐ（基本プラスミド）の２つのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。生じたプラスミドをｐＤＡＢ７４５１（図７１）と命名した。
Ｄ．自律的除草剤耐性遺伝子発現カセットの構築
プロモーター、除草剤耐性遺伝子及びポリアデニル化（ポリＡ）終結配列を含む完全なプロモーター−転写ユニット（ＰＴＵ）を含有する自律的除草剤耐性遺伝子発現カセットを構築した（図７２）。本実施形態では、プロモーター配列はイネ（オリザ・サティバ（O. sativa））アクチン１[McElroy et al. (Plant Cell 2, 163-171; 1990); ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＳ４４２２１及びＧｅｎＢａｎｋアクセッションＸ６３８３０］に由来する。除草剤耐性遺伝子は、除草剤ビアラホス（bialaphos）（もともとはストレプトミセス・ビリドクロモゲネス（Streptomyces viridochromogenes）に由来するＰＡＴコード領域の修飾型(ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭ２２８２７;Wohlleben et al. Gene 70, 25-37; 1988)）に対する耐性を与える、ＰＡＴ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を含む。Ｍ２２８２７の最長オープンリーディングフレームのもとの配列に対する修飾は実質的であり、植物における発現を最適化するようにコドン使用パターンを変化させることを含む。１番目のコードされるアミノ酸としてのバリンのメチオニンによる置換、及び２番目のコードされるアミノ酸としてのアラニンの付加を除き、ｐＤＡＢ３０１４のＰＡＴオープンリーディングフレームからコードされるタンパク質は、アクセッションＭ２２８２７の最長オープンリーディングフレームによってコードされるものと同一である。再構築型のＰＡＴはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩ４３９９５の下で認められる。ターミネーター配列は、トウモロコシ（Z. mays）Ｌ．リパーゼ［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３５９１３の位置１０９３のＣが、ｐＤＡＢ３０１４では位置２４６８でＧによって置換されていることを除き、Ｌ３５９１３のトウモロコシリパーゼｃＤＮＡクローン。このトウモロコシ配列は、ＰＡＴ遺伝子についての３’非翻訳領域／転写ターミネーター領域を含む］に由来する。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーは、標準脱塩の条件下でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成され、水で０．１２５μｇ／μｌの濃度に希釈された。
５’−ＡＣＴＡＧＴＴＡＡＣＴＧＡＣＣＴＣＡＣＴＣＧＡＧＧＴＣＡＴＴＣＡＴＡＴＧＣＴＴＧＡ−３’（配列番号：１５１）
５’−ＡＣＴＡＧＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴ−３’（配列番号：１５２）
ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓｅｔａ ３−４−１，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，５２０−２１９３，Ｊａｐａｎから提供された、以下からなる試薬を用いてＰＣＲ増幅反応を実施した。１０Ｘ ＬＡ ＰＣＲ（商標） Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ２ ＋）５μｌ、二本鎖鋳型［ｐＤＡＢ３０１４プラスミドＤＮＡ］２０ｎｇ、正オリゴヌクレオチドプライマー１０ｐｍｏｌ、逆オリゴヌクレオチドプライマー１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物（各々２．５ｍＭ）８μｌ、Ｈ２Ｏ ３３．５μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位）、鉱物油１滴。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、４８試料ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を使用して、以下のサイクリング条件下でＰＣＲ反応を実施した。９４℃、４分間／１サイクル；９８℃、２０秒間、５５℃、１分間、６８℃、３分間／３０サイクル；７２℃、５分間／１サイクル；４℃／保持。各々のＰＣＲ反応物１５μｌを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。
増幅したフラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想増幅産物は、２．３ＫｂｐのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。このフラグメントをゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。精製したフラグメントを、次に、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔを用いてｐＣＲ２．１プラスミドにクローニングし、製造者のプロトコールに従ってＯｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ １０化学的コンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。
個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ カナマイシンを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離プラスミド３μｇをＳｐｅＩ及びＮｏｔＩの各１０単位で消化した。すべてのプラスミド消化物を３７℃で１時間インキュベートした。
制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたプラスミドクローンは、３．９ＫｂｐのｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターに加えて２．３２５Ｋｂｐの挿入ＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。プラスミドクローンの二本鎖塩基配列決定反応を、ＣＥＱ（商標）ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて製造者によって述べられているように実施した。反応物を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ ＤＴＲ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて製造者のプロトコールによって述べられているように精製した。配列反応物をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣＥＱ（商標）２０００ ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで分析し、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）バージョン４．１．４（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いてヌクレオチド特性決定を実施した。
Ｅ．プラスミド骨格の自律的ドナーへの自律的除草剤耐性遺伝子カセットの挿入
ドナープラスミドを創製するため、実施例１８Ｄで述べた自律的除草剤耐性遺伝子カセットを実施例１８Ｂ及び１８Ｃで述べたプラスミド骨格構築物に挿入した。上述した、予想された２．３２５Ｋｂｐ配列（図７２）を含むクローンに由来する制限フラグメントをゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。
次にこのフラグメントを、制限酵素ＳｐｅＩで消化し、その後脱リン酸化しておいた精製ｐＤＡＢ７４７１（ポジション−１のプラスミド骨格、図７０）又はｐＤＡＢ７４５１（ポジション−２のプラスミド骨格、図７１）のいずれかと、連結反応において組み合わせた。以下の条件下で連結を実施した。１６℃水浴中での１６時間のインキュベーションの条件下に２０μｌの反応物容量で、１：５のベクター：挿入物比及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５００単位。連結反応物５μｌを、その後、大腸菌ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５０μｌに形質転換し、製造者によって述べられている選択条件下で平板培養した。
個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ クロラムフェニコールを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミドＤＮＡ ３μｇをＳｐｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）１０単位で消化し、３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたプラスミドクローンは、２．３２５Ｋｂｐと〜４．９Ｋｂｐ（ｐＤＡＢ７４７１ベクター）又は２．３２５Ｋｂｐと〜５．０Ｋｂｐ（ｐＤＡＢ７４５１ベクター）のＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。
生じたプラスミドを、それぞれｐＤＡＢ７４２２（ポジション−１の自律的ドナー）（図７３）及びｐＤＡＢ７４５２（ポジション−２の自律的ドナー）（図７４）と命名した。
Ｆ．非自律的除草剤耐性遺伝子発現カセットの構築
不完全なプロモーター−転写ユニット（ＰＴＵ）を含む非自律的除草剤耐性遺伝子発現カセットを構築した（図７５）。本実施形態では、テソア・アシニアウイルスに由来する２Ａ配列(Mattion, N.M., Harnish, E.C., Crowley, J. C. & Reilly, P.A. (1996)J. Virol. 70, 8124-8127)、除草剤耐性遺伝子及びポリアデニル化（ポリＡ）終結配列の機能性を利用し、プロモーターを使用しない戦略を用いた。本実施形態では、２Ａ翻訳終結シグナル配列を除草剤耐性遺伝子と翻訳的にインフレームであるように操作した。加えて、２Ａ／除草剤コード配列をＩＰＰ２Ｋ遺伝子標的の翻訳リーディングフレームと一致するように操作した。除草剤耐性遺伝子は、除草剤ビアラホス（もともとはストレプトミセス・ビリドクロモゲネスに由来するＰＡＴコード領域の修飾型(ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＭ２２８２７;Wohlleben et al. Gene 70, 25-37; 1988)）に対する耐性を与える、ＰＡＴ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）遺伝子を含む。Ｍ２２８２７の最長オープンリーディングフレームのもとの配列に対する修飾は実質的であり、植物における発現を最適化するようにコドン使用パターンを変化させることを含む。１番目のコードされるアミノ酸としてのバリンのメチオニンによる置換、及び２番目のアミノ酸としてのアラニンの付加を除き、ｐＤＡＢ３０１４のＰＡＴオープンリーディングフレームからコードされるタンパク質は、Ｍ２２８２７の最長オープンリーディングフレーム（Ｍ２２８２７の位置２４４でＧＴＧから始まる）によってコードされるものと同一である。再構築型のＰＡＴはＧｅｎＢａｎｋアクセッションＩ４３９９５の下で認められる。ターミネーター配列は、トウモロコシ（Z. mays）Ｌ．リパーゼ［ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｌ３５９１３の位置１０９３のＣが、ｐＤＡＢ３０１４では位置２４６８でＧによって置換されていることを除き、Ｌ３５９１３のトウモロコシリパーゼｃＤＮＡクローン］に由来する。このトウモロコシ配列は、ＰＡＴ遺伝子についての３’非翻訳領域／転写ターミネーター領域を含む。
以下のオリゴヌクレオチドプライマーは、標準脱塩の条件下でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成され、水で０．１２５μｇ／μｌの濃度に希釈された。
５’−ＡＣＴＡＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＡＧＧＧＣＡＧＡＧＧＡＡＧＴＣＴＴＣＴＡＡＣＡＴＧＣ
ＧＧＴＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＴＣＣＣＧＧＣＣＣＴＡＧＧＡＴＧＧＣＴＴＣＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣ
ＣＡＧＴＴＧＡ−３（配列番号：１５３）
５’−ＡＣＴＡＧＴＡＴＧＣＡＴＧＴＧＡＡＴＴＣＡＧＣＡＣＴＴＡＡＡＧＡＴＣＴ−３’（配列番号：１５４）
ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｓｅｔａ ３−４−１，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，５２０−２１９３，Ｊａｐａｎ）から提供された、以下からなる試薬を用いてＰＣＲ増幅反応を実施した。１０Ｘ ＬＡ ＰＣＲ（商標） Ｂｕｆｆｅｒ ＩＩ（Ｍｇ２ ＋）５μｌ、二本鎖鋳型［ｐＤＡＢ３０１４プラスミドＤＮＡ］２０ｎｇ、正オリゴヌクレオチドプライマー１０ｐｍｏｌ、逆オリゴヌクレオチドプライマー１０ｐｍｏｌ、ｄＮＴＰ混合物（各々２．５ｍＭ）８μｌ、Ｈ２Ｏ ３３．５μｌ、ＴａＫａＲａ ＬＡ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位）、鉱物油１滴。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ、４８試料ＤＮＡ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｎｏｒｗａｌｋ，ＣＴ）を使用して、以下のサイクリング条件下でＰＣＲ反応を実施した。９４℃、４分間／１サイクル；９８℃、２０秒間、５５℃、１分間、６８℃、２分間／３０サイクル；７２℃、５分間／１サイクル；４℃／保持。各々のＰＣＲ反応物１５μｌを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。増幅したフラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想増幅産物は、〜１ＫｂｐのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。このフラグメントをゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。精製したフラグメントを、次に、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔを用いてｐＣＲ２．１プラスミドにクローニングし、製造者のプロトコールに従ってＯｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ １０化学的コンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）に形質転換した。
個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ カナマイシンを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離プラスミド３μｇをＳｐｅＩ １０単位で消化した。すべてのプラスミド消化物を３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたプラスミドクローンは、〜１．０Ｋｂｐ及び３．９Ｋｂｐ（ｐＣＲ（登録商標）２．１ベクター）の挿入ＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。プラスミドクローンの二本鎖塩基配列決定反応を、ＣＥＱ（商標）ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて製造者によって述べられているように実施した。反応物を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ ＤＴＲ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて製造者のプロトコールによって述べられているように精製した。配列反応物をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣＥＱ（商標）２０００ ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで分析し、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）バージョン４．１．４（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いてヌクレオチド特性決定を実施した。
Ｇ．プラスミド骨格の非自律的ドナーへの非自律的除草剤耐性遺伝子カセットの挿入
ドナープラスミドを創製するため、実施例１８Ｆで述べた非自律的除草剤耐性遺伝子カセットを実施例１８Ｂ及び１８Ｃで述べたプラスミド骨格構築物に挿入した。正しい１Ｋｂｐ配列を含むクローンに対応する制限フラグメントをゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。次にこのフラグメントを、制限酵素ＳｐｅＩで消化し、その後脱リン酸化しておいた精製ｐＤＡＢ７４７１（ポジション−１のプラスミド骨格）（図７０）又はｐＤＡＢ７４５１（ポジション−２のプラスミド骨格）（図７１）のいずれかと、連結反応において組み合わせた。以下の条件下で連結を実施した。１６℃水浴中での１６時間のインキュベーションの条件下に２０μｌの反応物容量で、１：５のベクター：挿入物比及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５００単位。連結反応物５μｌを、その後、大腸菌ＭＡＸ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５０μｌに形質転換し、製造者によって述べられている選択条件下で平板培養した。
個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ クロラムフェニコールを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミドＤＮＡ ３μｇをＳｐｅＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）１０単位で消化し、３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたプラスミドクローンは、１．０Ｋｂｐと４．９６Ｋｂｐ（ｐＤＡＢ７４７１ベクター）又は１．０Ｋｂｐと〜５．０Ｋｂｐ（ｐＤＡＢ７４５１ベクター）のＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。生じたプラスミドを、それぞれｐＤＡＢ７４２３（ポジション−１の非自律的ドナー）（図７６）及びｐＤＡＢ７４５４（ポジション−２の非自律的ドナー）（図７７）と命名した。
Ｈ．ポジション１のＺＦＮ＋ＨＲドナー配列：組み合わせプラスミド
２つの別々のプラスミドを１つの植物細胞に（例えば１つのプラスミドがＺＦＮエレメントを含み、２番目のプラスミドが除草剤耐性ドナー配列を含む）送達するための選択的戦略として、この特許において説明したすべての必要なエレメントを含む単一プラスミドを工作した。本実施例で述べる組み合わせプラスミドは、特定のＩＰＰ２Ｋ遺伝子座を標的し、そこで二本鎖断裂を生じるように設計されたＺＦＮ並びに自律的ＰＡＴ ＰＴＵ及び／又は非自律的２Ａ／ＰＡＴ ＰＴＵと、それらの断裂部位に組み込まれるように設計されたドナーフランクの両方を含む。
ベクターｐＤＡＢ７４２２及びｐＤＡＢ７４２３（実施例６Ｅ及び６Ｇで述べた）をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）デスティネーションベクターに変換するために、λファージに基づく部位特異的組換え(Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 55:913)を用いる、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）技術を利用した。ひとたび変換されれば、ＺＦＮ発現カセットを含むプラスミド（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターに収納されている）を、ＺＦＮ／ドナー組み合わせプラスミドを創製するデスティネーションベクターに容易に動員することができる。各々のそのようなプラスミド１μｇをＮｏｔＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）１０単位により３７℃で１時間消化した。ＮｏｔＩ制限エンドヌクレアーゼを６５℃で１５分間熱不活性化し、その後フラグメントの末端を、エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ ＧｍｂＨ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）３単位を用いて３７℃で１時環脱リン酸化した。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。ベクターフラグメント（ｐＤＢ７４２２＝７．３１７Ｋｂｐ、ｐＤＡＢ７４２３＝５．９７１Ｋｂｐ）をＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によって大きさを推定して、ゲル切り出しし、その後ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。
このベクターフラグメントを、次に、以下の条件下で実施した連結反応において、Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙエレメント、ａｔｔＲｌ、ｃｃｄＢ、ＣｍＲ及びａｔｔＲ２を含む２．２７４Ｋｂｐ ＮｏｔＩフラグメントと組み合わせた。１６℃水浴中での１６時間のインキュベーションの条件下に２０μｌの反応物容量で、１：５のベクター：挿入物比及びＴ４ ＤＮＡリガーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５００単位。連結反応物５μｌを、その後、大腸菌Ｏｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）ｃｃｄＢ Ｓｕｒｖｉｖａｌ（商標）化学的コンピテント細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）５０μｌに形質転換し、製造者によって述べられている選択条件下で平板培養した。
個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ クロラムフェニコールを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミドＤＮＡ ３μｇをＥｃｏＲＩＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）１０単位で消化し、３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ ＤＮＡラダーとの比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたプラスミドクローンは、自律的ＰＡＴ ＰＴＵポジション−１ ＨＲドナーについては１．４４８Ｋｂｐ、１．９４６Ｋｂｐ及び６．１９７Ｋｂｐ、及び非自律的ＰＡＴポジション−１ ＨＲドナーについては５．８０７Ｋｂｐ及び２．４３８ＫｂｐのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。生じたプラスミドを、それぞれｐＤＡＢ７４２４（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）適合ポジション−１自律的ドナー）（図７８）及びｐＤＡＢ７４２５（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）適合ポジション−１非自律的ドナー）（図７９）と命名した。
これらのクローニング操作の結果として、プラスミドｐＤＡＢ７４２４及びｐＤＡＢ７４２５をＧａｔｅｗａｙ（登録商標）デスティネーションベクターとして指定した。ｐＤＡＢ７４１２は、以下のエレメントを含むＧａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクターとして機能性を有する。ＺｗＵｂｉｌｖ．２／ＺＦＮ１２／Ｚｍ Ｐｅｒ５ ３’ＵＴＲ。ＺＦＮ発現カセット（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）エントリーベクター）を自律的又は非自律的ドナー分子（Ｇａｔｅｗａｙ（登録商標）デスティネーションベクター）に移すため、ＬＲ Ｃｌｏｎａｓｅ（商標）ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）反応を、５０ｎｇ（エントリーベクター）；１５０ｎｇ／μｌ（デスティネーションベクター）の比率で製造者によって概説されているように実施した。生じた明確な（positive）組み合わせプラスミドをｐＤＡＢ７４２６（ポジション−１自律的ＨＲドナー／ＺＦＮ１２）（図８０）及びｐＤＡＢ７４２７（非自律的ＨＲドナー／ＺＦＮ１２）（図８１）と命名した。
植物細胞へのＺＦＮ及びドナーＤＮＡの送達
標的組込みによる、植物ゲノムへのドナーＤＮＡのＺＦＮを介した組込みを可能にするために、ＺＦＮをコードするＤＮＡの送達とそれに続く植物細胞での機能性ＺＦＮタンパク質の発現が必要であることは了解される。また、機能性ＺＦＮタンパク質が標的ＤＮＡで二本鎖断裂を誘導し、その後ドナーＤＮＡの標的遺伝子座への相同性駆動組込みによって前記断裂が修復されるように、前記植物細胞へのドナーＤＮＡの同時送達も必要である。当業者は、機能性ＺＦＮタンパク質の発現が、ＺＦＮコード構築物の遺伝子導入又はＺＦＮコード構築物の一過性発現を含むがこれらに限定されない、いくつかの方法によって達成され得ることを考慮し得る。これらのどちらの場合も、標的組込みを駆動するために、植物細胞での機能性ＺＦＮタンパク質の発現とドナーＤＮＡの送達は同時に達成される。
ここで述べる実施例では、我々は、ＺＦＮコードＤＮＡとドナーＤＮＡの植物細胞への同時送達のための方法を明らかにする。当業者は、植物細胞のために適切な種々のＤＮＡ送達方法のいずれかを使用することができ、それらは、アグロバクテリウムを介した形質転換、パーティクルガンに基づくＤＮＡ送達又はＷｈｉｓｋｅｒｓ（商標）を介したＤＮＡ送達を含むが、これらに限定されない。ここで述べる１つの実施形態では、Ｗｈｉｓｋｅｒｓ（商標）を介したＤＮＡ送達実験を、ＺＦＮをコードするＤＮＡ構築物とドナーＤＮＡの様々な組み合わせを用いて実施した。これらの組み合わせは、１）ＺＦＮコード配列とドナーＤＮＡの両方を含む単一プラスミド及び２）１つがＺＦＮコード配列を含み、他方がドナーＤＮＡを含む、２つの別個のプラスミドを含む。もう１つの実施形態では、パーティクルガンに基づくＤＮＡ送達を、ＺＦＮをコードするＤＮＡ構築物とドナーＤＮＡの様々な組み合わせを用いて実施した。当業者は、これらの組み合わせが、１）ＺＦＮコード配列とドナーＤＮＡの両方を含む単一プラスミド及び２）１つがＺＦＮコード配列を含み、他方がドナーＤＮＡを含む、２つの別個のプラスミドを含み得ることを推測し得る。
Ａ．Ｗｈｉｓｋｅｒｓ（商標）を介したＤＮＡ送達
ここで先に述べたように、トウモロコシの胚形成Ｈｉ−ＩＩ細胞培養物を生産し、標的組込みを明らかにする生存植物細胞の供給源として使用した。当業者は、標的組込みを明らかにする生存植物細胞の供給源としての、様々な植物種に由来する細胞培養物、又は様々な植物種に由来する分化した植物組織の使用を考慮し得る。
本実施例では、あらかじめ凍結保存した細胞系からのＰＣＶ １２ｍｌプラス馴化培地２８ｍｌを、５００ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中のＧＮ６液体培地（Ｎ６培地(Chu et al., 1975)、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌ スクロース、ｐＨ５．８）８０ｍｌに継代培養し、２８℃、１２５ｒｐｍの振とう機上に置いた。合計３６ｍｌのＰＣＶが３つのフラスコ全体に分配されるように、同じ細胞系を使用してこの工程を２回反復した。２４時間後、ＧＮ６液体培地を取り出し、ＧＮ６ Ｓ／Ｍ浸透培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌ スクロース、４５．５ｇ／Ｌ ソルビトール、４５．５ｇ／Ｌ マンニトール、１００ｍｇ／Ｌ ミオイノシトール、ｐＨ６．０）７２ｍｌと交換した。フラスコを、穏やかに攪拌しながら（１２５ｒｐｍ）２８℃で３０〜３５分間、暗所でインキュベートした。このインキュベーション期間中に、ＧＮ６ Ｓ／Ｍ液体培地８．１ｍｌを滅菌シリコンカーバイドウィスカー４０５ｍｇに添加することにより、シリコンカーバイドウィスカーの５０ｍｇ／ｍｌ懸濁液（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｅ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，ＬＬＣ，Ｇｒｅｅｒ，ＳＣ）を調製した。
ＧＮ６ Ｓ／Ｍ浸透培地でのインキュベーション後、各々のフラスコの内容物を２５０ｍｌ遠心瓶にプールした。フラスコ中のすべての細胞が底部に沈降した後、ＧＮ６ Ｓ／Ｍ液体約１４ｍＬを超える内容物容量を取り出し、後日の使用のために滅菌１Ｌフラスコに収集した。あらかじめ湿潤化したウィスカーの懸濁液をボルテックスにて最大速度で６０秒間混合し、その後遠心瓶に添加した。
ＺＦＮコード配列とドナーＤＮＡの両方を含む単一プラスミドを植物細胞に送達する１つの実施例では、精製環状プラスミドＤＮＡ １７０μｇを瓶に添加した。１つがＺＦＮコード配列を含み、他方がドナーＤＮＡを含む、２つの別個のプラスミドを同時送達する選択的な実施例では、ＤＮＡの量に関する多くの戦略を評価した。１つの戦略は、ドナーＤＮＡ８５μｇとジンクフィンガーをコードするＤＮＡ８５μｇを使用した。他の修正法は、各瓶につき合計１７０μｇのＤＮＡが添加されるように個々のプラスミドの大きさ（キロ塩基対）に基づき、１０、５又は１倍（1-fold）ドナーＤＮＡ対１倍ジンクフィンガーＤＮＡのモル比を使用した。同時送達のすべての場合に、遠心瓶に添加する前にＤＮＡをチューブ内にあらかじめプールした。ひとたびＤＮＡを添加すれば、瓶を直ちに改変Ｒｅｄ Ｄｅｖｉｌ ５４００市販塗料ミキサー（Ｒｅｄ Ｄｅｖｉｌ Ｅｑｕｉｐｍｅｎｔ Ｃｏ．，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ，ＭＮ）に入れ、１０秒間攪拌した。攪拌後、細胞、培地、ウィスカー及びＤＮＡのカクテルを、浸透圧調節剤（osmoticant）を低減するために新鮮ＧＮ６液体培地１２５ｍｌと共に１Ｌフラスコの内容物に添加した。細胞を、１２５ｒｐｍに設定した振とう機上で２時間回復させた。分散懸濁液６ｍＬを、各瓶について６０フィルターが得られるように家庭用真空掃除機に接続したガラス製細胞収集機ユニットを使用してＷｈａｔｍａｎ Ｎｏ．４ろ紙（５．５ｃｍ）でろ過した。フィルターをＧＮ６固形培地（２．５ｇ／Ｌ ゲルライトゲル化剤を含むことを除き、ＧＮ６液体培地と同じ）の６０×２０ｍｍプレートに置き、暗条件下に２８℃で１週間培養した。
Ｂ．パーティクルガンを介したＤＮＡ送達
ここで述べる実施例では、ここで先に述べたように実験の約２４時間前にトウモロコシの胚形成懸濁液をＧＮ６液体培地に継代培養した。過剰の液体培地を取り出し、約０．４ ＰＣＶの細胞を、２．５ｇ／Ｌ ゲルライトで凝固させたＧＮ６ Ｓ／Ｍ培地を含む１００×１５ｍｍペトリ皿の中央の直径２．５ｃｍの円の中に薄く広げた。細胞を暗条件下で４時間培養した。パーティクルガン粒子をＤＮＡで被覆するため、直径１．０ミクロンの金粒子３ｍｇを１００％エタノールで１回、滅菌蒸留水で２回洗浄し、シリコン処理したエッペンドルフ管中で水５０μｌに再懸濁した。プラスミドＤＮＡ ５μｇ、スペルミジン（０．１Ｍ）２０μｌ及び塩化カルシウム（２．５Ｍ）５０μｌを別々に金懸濁液に添加し、ボルテックスで混合した。混合物を室温で１０分間インキュベートし、卓上微量遠心機にて１０，０００ｒｐｍで１０秒間ペレット化して、低温１００％エタノール６０μｌに再懸濁し、８〜９μｌを各々のマクロキャリアーに分配した。
Ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ ＰＤＳ−１０００／Ｈｅ（商標）システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して打ち込みを実施した。細胞を含むプレートを、１１００ｐｓｉ及び２７インチＨｇ真空の条件下で中段の棚に置き、操作マニュアルに従って打ち込んだ。打ち込み後１６時間目に、組織を小さな塊としてＧＮ６（１Ｈ）培地に移し、暗条件下に２８℃で２〜３週間培養した。ドナーＤＮＡの組込みから生じる推定上のトランスジェニック単離物が出現するまで、２〜４週間ごとに転移を続けた。パーティクルガンを介したＤＮＡ送達によって生じる推定上のドナーＤＮＡ組込み事象の同定、単離及び再生は、Ｗｈｉｓｋｅｒｓ（商標）を介したＤＮＡ送達によって生じる推定上のドナーＤＮＡ組込み事象について使用される、以下で述べる工程と同じである。
Ｃ．推定上の標的組込みトランスジェニック事象の同定と単離
ＤＮＡ送達の１週間後に、ろ紙を、ＧＮ６（１Ｈ）選択培地（Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌ スクロース、１００ｍｇ／Ｌ ミオイノシトール、Ｈｅｒｂｉａｃｅ（Ｍｅｉｊｉ Ｓｅｉｋａ，Ｊａｐａｎ）からの１．０ｍｇ／Ｌ ビアラホス、２．５ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ５．８）の６０×２０ｍｍプレートに移した。これらの選択プレートを暗所にて２８℃で１週間インキュベートした。
暗所での１週間の選択後、各々のプレートから細胞の半分を、３７〜３８℃に保持したＧＮ６アガロース培地（１２１℃で１０分間だけ加圧滅菌した、Ｎ６培地、２．０ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、３０ｇ／Ｌ スクロース、１００ｍｇ／Ｌ ミオイノシトール、７ｇ／Ｌ ＳｅａＰｌａｑｕｅ（登録商標）アガロース、ｐＨ５．８）３．０ｍＬ及びＨｅｒｂｉａｃｅからの１ｍｇ／Ｌ ビアラホスを含む管にすくい取ることによって組織を新鮮培地に包埋した。
アガロース／組織混合物をへらで粉砕し、その後アガロース／組織混合物３ｍＬを、ＧＮ６（１Ｈ）培地を含む１００×１５ｍｍペトリ皿の表面に均一に注いだ。この工程を各々のプレートの半分の両方について反復した。ひとたびすべての組織が包埋されれば、プレートをＮｅｓｃｏｆｉｌｍ（登録商標）又はＰａｒａｆｉｌｍ Ｍ（登録商標）で個別に密封し、暗条件下に２８℃で１０週間まで培養した。これらの選択条件下で増殖した推定上の形質転換単離物を包埋したプレートから取り出し、６０×２０ｍｍプレート中の新鮮選択培地に移した。約２週間後に持続的な増殖が明らかである場合、事象は適用された除草剤（ビアラホス）に対して耐性であるとみなし、その後、遺伝子型分析のために細胞のアリコートを２ｍＬエッペンドルフ管に採取した。
当業者は、ドナーＤＮＡにおいて何らかの適切な選択マーカーをコードする遺伝子を利用し、生細胞に同等の選択条件を適用し得る。例えば代替的な選択マーカー遺伝子、例えば国際公開公報第ＷＯ２００５／１０７４３７ Ａ２号に述べられているＡＡＤ−１を、組込み事象の選択と回収のためのドナーとしてここで述べるトウモロコシ細胞において使用することができる。
ＰＣＲ遺伝子型解析による標的組込み事象についてのスクリーニング
本実施例において、ＰＣＲ遺伝子型解析は、ゲノム内に包埋されたドナーＤＮＡを含むと予測される単離トウモロコシカルス組織に由来するゲノムＤＮＡのポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、及びそれに続くＰＣＲ増幅産物の標準クローニングと配列分析を含むが、これらに限定されないことは了解される。ＰＣＲ遺伝子型解析の方法は広く記述されており（例えばRios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-253)、細胞培養物を含む、いかなる植物種又は組織型に由来するゲノムＤＮＡにも適用され得る。
当業者は、植物ゲノム内の特異的配列の増幅、植物ゲノム内の多数の特異的配列の増幅、植物ゲノム内の非特異的配列の増幅、又はそれらの組み合わせを含む（が、これらに限定されない）、ＰＣＲ遺伝子型解析のための戦略を考案し得る。増幅は、本実施例で述べるように、その後にクローニングと配列決定、又は増幅産物の直接配列分析を伴い得る。当業者は、ここで生成される増幅産物の分析のための代替的方法を考慮し得る。
ここで述べる１つの実施形態では、遺伝子標的に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅において使用する。ここで述べるもう１つの実施形態では、ドナーＤＮＡ配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーをＰＣＲ増幅において使用する。もう１つの実施形態は、遺伝子標的配列とドナーＤＮＡ配列の両方に結合するオリゴヌクレオチドプライマーの組み合わせを含む。当業者は、ゲノムの問い合わせを行うための付加的なプライマーの組み合わせ及び増幅反応を考案し得る。
Ａ．ゲノムＤＮＡ抽出
ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、実施例１９で述べた、単離した除草剤耐性トウモロコシ細胞から抽出し、ＰＣＲ遺伝子型解析実験のための鋳型として使用した。ｇＤＮＡを、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）９６ Ｐｌａｎｔ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）に詳述されている製造者のプロトコールに従って上記のように単離した約１００〜３００μｌ充填細胞容積（ＰＣＶ）の除草剤耐性ＨｉＩＩカルスから抽出した。キットが提供する溶出緩衝液１００μｌ中でゲノムＤＮＡを溶出して２０〜２００ｎｇ／μｌの最終濃度にし、その後、以下で概説するＰＣＲベースの遺伝子型解析法によって解析した。
Ｂ．ＰＣＲ遺伝子型解析のためのプライマーの設計
当業者は、ＰＣＲに基づく遺伝子型解析の設計と実施のために様々な戦略を使用し得る。遺伝子標的、ドナーＤＮＡ配列及び／又はその２つの組み合わせにアニーリングするように設計されたオリゴヌクレオチドプライマーが実現可能である。ドナーＤＮＡ分子に組み込まれた相同性フランクに包含されない領域においてＩＰＰ２Ｋ遺伝子標的にアニーリングし得るオリゴヌクレオチドプライマーを設計するために、付加的な遺伝子標的配列データを含むプラスミドクローンをＤＮＡ塩基配列決定によって特性決定した。プラスミドクローンの二本鎖配列決定反応を、ＣＥＱ（商標）ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて製造者によって述べられているように実施した。反応物を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ ＤＴＲ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて製造者のプロトコールによって述べられているように精製した。配列反応物をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣＥＱ（商標）２０００ ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで分析し、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）バージョン４．１．４（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いてヌクレオチド特性決定を実施した。これらの配列は、ＺＦＮ標的領域の上流（５’側）及び下流（３’側）のＩＰＰ２Ｋ遺伝子の領域に対応し、図９１（配列番号１４１）及び図９２（配列番号１４２）に示されている。
ここで提示する実施例において、すべてのオリゴヌクレオチドプライマーは、標準脱塩の条件下でＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）によって合成され、水で１００μＭの濃度に希釈された。正及び逆オリゴヌクレオチドプライマーの以下のセットを、ドナーＤＮＡ配列の境界の外側に位置するＩＰＰ２Ｋ遺伝子標的に特異的なｇＤＮＡ配列にアニーリングするように設計した。これらのオリゴヌクレオチドは以下のとおりである。
５’−ＴＧＧＡＣＧＧＡＧＣＧＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＴＴＣＧＡＣＧＣＴＧ−３’（配列番号：１５３）
５’−ＧＴＧＣＡＡＧＡＡＴＧＴＡＴＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＣＣＴＧＡＴＧ−３’（配列番号：１５４）
正及び逆オリゴヌクレオチドプライマーの２番目のセットも、ドナーＤＮＡ配列の境界の外側であるが、まだ最初の対の中にネストされている、ＩＰＰ２Ｋ遺伝子標的に特異的なｇＤＮＡ配列にアニーリングするように設計した。
５’−ＣＴＧＴＧＧＴＡＣＣＡＧＴＡＣＴＡＧＴＡＣＣＡＧＣＡＴＣ−３’（配列番号：１５５）
５’−ＴＣＴＴＧＧＡＴＣＡＡＧＧＣＡＴＣＡＡＧＣＡＴＴＣＣＡＡＴＣＴ−３’（配列番号：１５６）
正及び逆オリゴヌクレオチドプライマーを、付加的に、除草剤耐性遺伝子のコード領域に対応するドナーＤＮＡに特異的にアニーリングするように設計した。
５’−ＴＧＧＧＴＡＡＣＴＧＧＣＣＴＡＡＣＴＧＧ−３’（配列番号：１５７）
５’−ＴＧＧＡＡＧＧＣＴＡＧＧＡＡＣＧＣＴＴＡ−３’（配列番号：１５８）
５’−ＣＣＡＧＴＴＡＧＧＣＣＡＧＴＴＡＣＣＣＡ−３’（配列番号：１５９）
５’ＴＡＡＧＣＧＴＴＣＣＴＡＧＣＣＴＴＣＣＡ−３’（配列番号：１６０）
Ｃ．ドナーＤＮＡ特異的ＰＣＲ増幅
一次ＰＣＲ増幅反応は、ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓｅｔａ ３−４−１，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，５２０−２１９３，Ｊａｐａｎによって提供された、以下からなる試薬を用いて実施した。１０Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲ（商標）Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μｌ、二本鎖ゲノムＤＮＡ鋳型４０〜２００ｎｇ、正オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、逆オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、ｄＮＴＰ混合物（各々２．５ｍＭ）２μｌ、Ｈ２Ｏ １６μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ、９６試料ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ２，Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、以下のサイクリング条件下でＰＣＲ反応を実施した。９４℃、３分間／１サイクル；９４℃、３０秒間、６４℃、３０秒間、７２℃、５分間／３５サイクル；７２℃、１０分間／１サイクル；４℃／保持。
一次ＰＣＲ反応の増幅産物を、その後、以下からなる二次ＰＣＲ反応において再増幅した。１０Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲ（商標）Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μｌ、鋳型（Ｈ２Ｏ中の一次ＰＣＲ反応物の１：１００希釈）２μｌ、正オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、逆オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、ｄＮＴＰ混合物（各々２．５ｍＭ）２μｌ、Ｈ２Ｏ １６μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ、９６試料ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ２，Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、以下のサイクリング条件下でＰＣＲ反応を実施した。９５℃、１分間／１サイクル；９４℃、１５秒間、６１℃、３０秒間、７２℃、３０秒間／３０サイクル；７２℃、１分間／１サイクル；４℃／保持。各々の増幅産物１０μｌを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。増幅フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）との比較によってフラグメントの大きさを推定した。予想されたフラグメントを含むＰＣＲ産物は、図８２に示すように、０．３１７ＫｂｐのＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。
標的組込み事象の検出
除草剤耐性遺伝子カセットをコードする、組み込まれたドナーＤＮＡ分子を含む除草剤耐性物事象について、前記事象の一部の割合は、ＺＦＮ誘導性二本鎖断裂の部位へのドナーＤＮＡの標的組込みの産物であると予想される。これらの標的組込み事象を除草剤耐性遺伝子カセットのランダムな組込みに由来するものから識別するため、ゲノム特異的ＰＣＲプライマーと、その後ゲノム特異的プラスドナー特異的ＰＣＲプライマーの組み合わせを用いたＰＣＲに基づく遺伝子型解析戦略を利用した。
Ａ．ゲノム特異的及びその後ゲノム／ドナー特異的増幅
本実施形態において、一次ＰＣＲ反応は、ドナー組込み領域の上流と下流のＩＰＰ２Ｋ遺伝子標的の領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した（例えば図９２及び９３）。一次ＰＣＲ増幅反応は、ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓｅｔａ ３−４−１，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，５２０−２１９３，Ｊａｐａｎによって提供された、以下からなる試薬を用いて実施した。１０Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲ（商標）Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μｌ、二本鎖トウモロコシｇＤＮＡ鋳型４０〜２００ｎｇ、正オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、逆オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、ｄＮＴＰ混合物（各々２．５ｍＭ）２μｌ、Ｈ２Ｏ １６μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ、９６試料ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ２，Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、以下のサイクリング条件下でＰＣＲ反応を実施した。９４℃、３分間／１サイクル；９４℃、３０秒間、６４℃、３０秒間、７２℃、５分間／３５サイクル；７２℃、１０分間／１サイクル；４℃／保持。
一次ＰＣＲ反応産物を、その後、Ｈ２Ｏ中で１：１００希釈し、２つの異なる二次ＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡとして使用した。本実施形態において、二次反応は、ＩＰＰ２Ｋゲノム領域内で結合するプライマーとドナー分子を使用し、ゲノムとドナーの間の組込みの境界にまたがるアンプリコンを生じさせた。最初の反応はゲノムとドナーの間の５’側境界を焦点とした。２番目の反応はドナーとゲノムの間の３’側境界を焦点とした。両方の反応は以下からなった。１０Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲ（商標）Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μｌ、鋳型［一次ＰＣＲ反応物の１：１００希釈］２μｌ、正オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、逆オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、ｄＮＴＰ混合物（各々２．５ｍＭ）２μｌ、Ｈ２Ｏ １６μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ、９６試料ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ２，Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、以下のサイクリング条件下でＰＣＲ反応を実施した。９４℃、３分間／１サイクル；９４℃、３０秒間、６９℃、３０秒間、７２℃、２分間／３５サイクル；７２℃、１０分間／１サイクル；４℃／保持。各々の二次ＰＣＲ反応物２０μｌを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。
増幅したフラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）との比較によってフラグメントの大きさを推定した。ＩＰＰ２Ｋ遺伝子へのドナーの標的組込みに由来するＰＣＲ産物は、１．６５Ｋｂｐ（５’境界）（図８３）又は１．９９Ｋｂｐ（３’境界）（図８４）のＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。これらのフラグメントをゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。精製したフラグメントを、その後、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ（ｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターと共に）及びＯｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ １０化学的コンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者のプロトコールに従って使用して、ｐＣＲ２．１プラスミドにクローニングした。
個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ カナマイシンを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミド３μｇをＥｃｏ ＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）１０単位で消化した。すべてのプラスミド消化物を３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）との比較によってフラグメントの大きさを推定した。
予想されたプラスミドクローンは、３．９ＫｂｐのｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターに加えて適切な大きさの挿入ＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。プラスミドクローンの二本鎖塩基配列決定反応を、ＣＥＱ（商標）ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて製造者によって述べられているように実施した。反応物を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ ＤＴＲ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて製造者のプロトコールによって述べられているように精製した。配列反応物をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣＥＱ（商標）２０００ ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで分析し、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）バージョン４．１．４（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いてヌクレオチド特性決定を実施した。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴｉバージョン１０．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてヌクレオチドアラインメントを実施した。
標的組込み事象（事象Ｎｏ．０７３）からの配列データの解析を以下のように実施した。ゲノムの組込み部位全体にわたる一次ＰＣＲ産物を、ゲノムとドナーの間の５’又は３’境界に焦点を合わせた二次増幅に供した。野生型ＩＰＰ２Ｋゲノム配列とこれらの二次増幅産物に対応するクローン化フラグメントのアラインメント並びに標的組込み事象の予想された配列は、標的部位でドナーＤＮＡの正確な組込みが起こったことを明確に指示した。
ＩＰＰ２Ｋゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列、ゲノム／ドナー境界、ＩＰＰ２Ｋ相同性フランクに対応するドナー領域のヌクレオチド配列及び除草剤耐性カセットのヌクレオチド配列はすべて、この事象に由来する多数のクローン化されたＰＣＲ産物において保存されていた。従って、この事象は、ＺＦＮを介した二本鎖断裂の相同性駆動性修復及び特定遺伝子標的でのドナーＤＮＡの標的組込みが起こったゲノムを示した。ユニーク標的組込みの発生を示す付加的な形質転換事象が得られており、ここで教示する方法がトウモロコシカルスにおいて再現可能であることを明らかにした。当業者は、これらの方法を、標的組込みが望ましいと考えられるいかなる植物種のいかなる遺伝子標的に対しても適用し得る。
Ｂ．ネステッドゲノム／ドナー特異的増幅
本実施形態では、一次及びその後の二次ＰＣＲ反応の両方が、ドナー配列に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーと組み合わせて、ドナー組込み領域（付属物Ｖ及びＶＩ）の上流又は下流のＩＰＰ２Ｋ遺伝子標的の領域に特異的なオリゴヌクレオチドプライマーを使用した。本実施例において、一次ＰＣＲ増幅反応は、ＴａＫａＲａ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ｓｅｔａ ３−４−１，Ｏｔｓｕ，Ｓｈｉｇａ，５２０−２１９３，Ｊａｐａｎによって提供された、以下からなる試薬を用いて実施した。１０Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲ（商標）Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μｌ、二本鎖トウモロコシｇＤＮＡ鋳型４０〜２００ｎｇ、正オリゴヌクレオチド１０μＭ、逆オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、ｄＮＴＰ混合物（各々２．５ｍＭ）２μｌ、Ｈ２Ｏ １６μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ、９６試料ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ２，Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、以下のサイクリング条件下でＰＣＲ反応物をインキュベートした。９４℃、３分間／１サイクル；９４℃、３０秒間、５２℃又は６４℃、３０秒間、７２℃、２分間／３５サイクル；７２℃、１０分間／１サイクル；４℃／保持。
一次ＰＣＲ反応物を、次に、Ｈ２Ｏ中で１：１００希釈し、二次ＰＣＲ反応のための鋳型ＤＮＡとして使用した。本実施形態では、二次反応も、ＩＰＰ２Ｋゲノム領域内で結合するプライマーとドナー分子を使用し、ゲノムとドナーの間の組込みの境界にまたがるアンプリコンを生じさせた。使用した特異的プライマーは、増幅がゲノムとドナーの間の５’又は３’境界のいずれかを焦点とするかどうかを判定する。これらの反応のための試薬は以下からなった。１０Ｘ Ｅｘ Ｔａｑ ＰＣＲ（商標）Ｂｕｆｆｅｒ ２．５μｌ、鋳型［一次ＰＣＲ反応物の１：１００希釈］２μｌ、正オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、逆オリゴヌクレオチドプライマー１０μＭ、ｄＮＴＰ混合物（各々２．５ｍＭ）２μｌ、Ｈ２Ｏ １６μｌ、Ｅｘ Ｔａｑ（商標）ＤＮＡポリメラーゼ０．５μｌ（２．５単位）。Ｂｉｏ−Ｒａｄ、９６試料ＤＮＡ Ｅｎｇｉｎｅ Ｔｅｔｒａｄ２，Ｐｅｌｔｉｅｒ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｌｅｒ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を使用して、以下のサイクリング条件下でＰＣＲ反応を実施した。９４℃、３分間／１サイクル；９４℃、３０秒間、５４℃又は６０℃、３０秒間、７２℃、２分間／３５サイクル；７２℃、１０分間／１サイクル；４℃／保持。各々の二次ＰＣＲ反応物２０μｌを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。
増幅したフラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）との比較によってフラグメントの大きさを推定した。ＩＰＰ２Ｋ遺伝子へのドナーの標的組込みに由来するＰＣＲ産物は、１．３５Ｋｂｐ（５’境界）（図８５）又は１．６６Ｋｂｐ（３’境界）（図８６）のＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。これらのフラグメントをゲル切り出しし、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ Ｉｎｃ．，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を用いて製造者の指示に従って精製した。精製したフラグメントを、その後、ＴＯＰＯ ＴＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ（登録商標）Ｋｉｔ（ｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターと共に）及びＯｎｅ Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｔｏｐ １０化学的コンピテント大腸菌細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を製造者のプロトコールに従って使用して、ｐＣＲ２．１プラスミドにクローニングした。
Ｃ．遺伝子型解析ＰＣＲ産物のヌクレオチド配列分析
実施例２１Ｂで述べた個々のコロニーを、５０μｌ／ｍｌ カナマイシンを添加したＴＢ ２ｍｌを含む１４ｍｌファルコンチューブ（Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｆｒａｎｋｌｉｎ Ｌａｋｅｓ，ＮＪ）に接種し、２００ｒｐｍで振とうしながら３７℃で１６時間インキュベートした。インキュベーション後、細胞１．５ｍｌを１．７ｍｌ Ｃｏｓｔａｒマイクロ遠心管（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）に移し、１６，０００×ｇで１分間ペレット化した。上清を取り、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｐｌａｓｍｉｄ Ｋｉｔ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ／Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を使用して上述したようにプラスミドＤＮＡを単離した。単離したプラスミド３μｇをＥｃｏ ＲＩ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）１０単位で消化した。すべてのプラスミド消化物を３７℃で１時間インキュベートした。制限ＤＮＡを、０．５％臭化エチジウムを添加した１．０％ＴＡＥアガロースゲル中１００Ｖで１時間電気泳動した。フラグメントをＵＶ光で視覚化し、１Ｋｂｐ Ｐｌｕｓ ＤＮＡラダー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）との比較によってフラグメントの大きさを推定した。
プラスミドクローンは、３．９ＫｂｐのｐＣＲ（登録商標）２．１ベクターに加えて挿入されたＤＮＡフラグメントの存在によって診断された。プラスミドクローンの二本鎖塩基配列決定反応を、ＣＥＱ（商標）ＤＴＣＳ−Ｑｕｉｃｋ Ｓｔａｒｔ Ｋｉｔ（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）を用いて製造者によって述べられているように実施した。反応物を、Ｐｅｒｆｏｒｍａ ＤＴＲ Ｇｅｌ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅｓ（Ｅｄｇｅ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて製造者のプロトコールによって述べられているように精製した。配列反応物をＢｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ ＣＥＱ（商標）２０００ ＸＬ ＤＮＡ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍで分析し、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（商標）バージョン４．１．４（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）を用いてヌクレオチド特性決定を実施した。Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴｉバージョン１０．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いてヌクレオチドアラインメントを実施した。
多数の標的組込み事象に由来する上流（５’側）ＩＰＰ２Ｋゲノム配列とドナーＤＮＡとの間の境界を含む配列データも、多数の標的組込み事象に由来するドナーＤＮＡと下流（３’側）ＩＰＰ２Ｋゲノム配列との間の境界を含む配列データ並びに単一形質転換カルス事象（Ｎｏ．１１４）に由来する上流（５’側）境界配列を含む配列データを含めて、入手した。形質転換標的組込み事象（Ｎｏ．１１４）は、ＩＰＰ２Ｋ遺伝子標的への自律的ドナーの組込みの結果であった。
これらの分析では、一次及び二次ＰＣＲ増幅反応の両方が、ゲノムとドナーの間の５’又は３’境界のいずれかに焦点を合わせた。野生型ＩＰＰ２Ｋゲノム配列とこれらの二次増幅産物に対応するクローン化フラグメントのアラインメント並びに標的組込み事象の予想された配列は、標的部位でドナーＤＮＡの組込みが起こったことを明らかにした。ＩＰＰ２Ｋゲノム遺伝子座のヌクレオチド配列、ゲノム／ドナー境界、ＩＰＰ２Ｋ相同性フランクに対応するドナー領域のヌクレオチド配列及び除草剤耐性カセットのヌクレオチド配列はすべて、この事象に由来する多数のクローン化されたＰＣＲ産物において保存されていた。
従って、この事象は、特定遺伝子標的でのＺＦＮを介した二本鎖断裂の相同性駆動性修復が起こったゲノムを示す。ユニーク標的組込みの発生を示す付加的な形質転換事象が得られており、ここで教示する方法がトウモロコシカルスにおいて再現可能であることを明らかにした。当業者は、これらの方法を、標的組込みが望ましいと考えられるいかなる植物種のいかなる遺伝子標的に対しても適用し得る。
トウモロコシカルス組織からの稔性無傷植物の再生
ＨｉＩＩ細胞培養物に由来する除草剤耐性トウモロコシ細胞の単離カルスは、無傷稔性トウモロコシ植物に再生され得る。当業者は、様々な胚形成トウモロコシ細胞培養物から無傷稔性トウモロコシ植物を再生し得る。
本実施例では、単離したカルス組織を、ＭＳ塩及びビタミン、３０．０ｇ／Ｌ スクロース、５ｍｇ／Ｌ ベンジルアミノプリン、０．２５ｍｇ／Ｌ ２，４−Ｄ、１ｍｇ／Ｌ ビアラホス、２．５ｇ／Ｌ ゲルライト；ｐＨ５．７を含むサイトカイニンベースの誘導培地、２８（１Ｈ）に移すことによって単離ビアラホス耐性ＨｉＩＩカルスの再生を開始した。細胞を弱光（１３μＥｍ−２ｓ−１）中で１週間、その後より強い光（４０μＥｍ−２ｓ−１）の条件に移してさらに１週間増殖させた。次に、植物成長調節因子を欠くことを除いて誘導培地と同じである再生培地、３６（１Ｈ）に細胞を移した。小さな（３〜５ｃｍ）植物体を手工具で切り出し、ＳＨＧＡ培地（シェンク及びヒルデブラント（Schenk and Hildebrandt）基本塩及びビタミン、1972, Can. J. Bot 50:199-204；１ｇ／Ｌ ミオイノシトール、１０ｇ／Ｌ スクロース、２．０ｇ／Ｌ ゲルライト、ｐＨ５．８）を含む滅菌１５０×２５ｍｍガラス培養管に入れた。
ひとたび植物体が十分な大きさの分化した根と苗条系に発育すれば、それらを、Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ ３６０生育培地（Ｓｕｎ Ｇｒｏ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｃａｎａｄａ Ｌｔｄ．）を含む４インチ鉢に移植し、温室内に置いた。植物体を透明なプラスチックコップで完全に又は部分的に２〜７日間覆い、その後９５％ Ｍｅｔｒｏ−Ｍｉｘ ３６０生育培地と５％粘土／ローム土壌からなる混合物を含む５ガロン鉢に移して、成熟まで生育させた。それぞれＴ１又はＦ１種子を生産するために植物を自家受粉させ得るか又は近交系と他家受粉させ得る。当業者は、トウモロコシ育種を可能にするため、再生した植物を自家受粉させ得るか又は再生した植物を様々な生殖質と他家受粉させ得る。
標的切断、標的組換え及び標的組込みに関する付加的な情報は、それらの開示がすべての目的のために全体として参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開公報第ＵＳ−２００３−０２３２４１０号；同第ＵＳ−２００５−００２６１５７号；同第ＵＳ−２００５−００６４４７４号；同第ＵＳ−２００５−０２０８４８９号；及び同第ＵＳ−２００６−０１８８９８７号；及び２００６年７月２６日出願の米国特許出願第１１／４９３，４２３号に見出される。
ここで言及するすべての特許、特許出願及び特許公開は、それらの全体が、すべての目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
開示は、理解を明瞭にするために説明と実施例によって多少詳細に提供したが、開示の精神又は範囲から逸脱することなく様々な変更と修正を実施し得ることは当業者に明白である。従って、前記の説明と実施例は限定とみなされるべきではない。

Claims (18)

  1. 非正準（非Ｃ２Ｈ２）ジンクフィンガーを含む非天然ジンクフィンガータンパク質であって、非正準ジンクフィンガーがＤＮＡ結合に関与するらせん部分を有し、少なくとも１つのジンクフィンガーが、配列Ｃｙｓ−（ＸＡ）２−４−Ｃｙｓ−（ＸＢ）１２−Ｈｉｓ−（ＸＣ）３−５−Ｃｙｓ−（ＸＤ）１−１０（配列番号３）［式中、ＸＡ、ＸＢ、ＸＣ及びＸＤはいずれのアミノ酸でもよい］を含み、
    （ｉ）非天然ジンクフィンガータンパク質は標的配列に結合するように操作されており、
    （ｉｉ）（ＸＤ）１−１０はＣ末端Ｃｙｓ残基に接するＣ末端がＱＫＰ、ＱＬＶおよびＧ残基からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、
    （ｉｉｉ）（ＸＤ）１−１０がアミノ酸配列ＱＫＰを含み、（ＸＣ）が３個のアミノ酸からなるとき、（ＸＣ）の残基はＩＲＴ、ＩＲＲ、ＴＫＩ及びＡＱＲからなる群から選択される、
    前記非天然ジンクフィンガータンパク質。
  2. 配列番号１３−８７、および、８９−９３のいずれかに示す配列のいずれかを含む、請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質。
  3. ＸＤが配列ＱＬＶ、ＱＫＰ、Ｇ、ＧＧ又はＧＧＧを含む、請求項１に記載のジンクフィンガータンパク質。
  4. 前記ジンクフィンガーの少なくとも１つが、請求項１から請求項３のいずれかに記載のＣＣＨＣジンクフィンガーを含む、複数のジンクフィンガーを含むジンクフィンガータンパク質。
  5. 前記ジンクフィンガータンパク質が、ＩＰＰ２−Ｋ−１０７２ａ１、ＩＰＰ２−Ｋ−１０７２ｂ１、ＩＰＰ２−Ｋ−１０７２ｃ１、ＩＰＰ２−Ｋ−ｒ１０６５ａ１、ＩＰＰ２−Ｋ−ｒ１１４９ａ２、または、ＩＰＰ２−Ｋ−１１５６ａ２を含み、ＩＰＰ２−Ｋ遺伝子内の標的配列に結合するように操作されている、請求項１から請求項４のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質。
  6. 請求項１から請求項５のいずれかに記載のジンクフィンガータンパク質及び１又はそれ以上の機能性ドメインを含む融合タンパク質。
  7. 前記機能性ドメインは切断ハーフドメインを含み、さらに前記融合タンパク質が切断ハーフドメインとジンクフィンガータンパク質の間に介在するＺＣリンカーを含む、請求項６に記載の融合タンパク質。
  8. 前記ＺＣリンカーの長さが５アミノ酸又は６アミノ酸である、請求項７に記載の融合タンパク質。
  9. 請求項１から請求項５のいずれかに記載の少なくとも１つのジンクフィンガータンパク質又は請求項６から請求項８のいずれかに記載の少なくとも１つの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
  10. 請求項１から請求項５のいずれかに記載の少なくとも１つのジンクフィンガータンパク質、請求項６から請求項８のいずれかに記載の少なくとも１つの融合タンパク質又は請求項９に記載の少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む植物細胞。
  11. 細胞が種子である、請求項１０に記載の植物細胞。
  12. ＩＰＰ２−Ｋが部分的に又は完全に不活性化されており、種子中のフィチン酸のレベルが低下している請求項１０又は請求項１１に記載の植物細胞。
  13. 植物細胞において、請求項７に記載の一対の融合タンパク質、又は一対の前記融合タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを発現させることを含む、植物細胞中の細胞クロマチンの標的切断のための方法であって、
    （ａ）融合タンパク質の標的配列が互いの１０ヌクレオチド内であり、
    （ｂ）融合タンパク質が二量体化して、標的配列の間に位置するＤＮＡを切断する、
    前記方法。
  14. 宿主植物細胞における標的遺伝子組み換えの方法であって、
    （ａ）請求項７に記載の一対の融合タンパク質、又は一対の前記融合タンパク質をコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを宿主植物細胞において発現させ、前記融合タンパク質の標的配列が選択された宿主標的遺伝子座に存在すること、
    （ｂ）前記宿主標的遺伝子座において配列変化を示す組換え宿主植物細胞を同定すること、及び
    （ｃ）場合により、外因性ポリヌクレオチドを前記宿主植物細胞に導入し、外因性ポリヌクレオチドが前記宿主植物細胞のゲノムに組み込まれることを含む、
    前記方法。
  15. 配列変化が、遺伝物質の欠失、遺伝物質の挿入、遺伝物質の置換及びそれらの何らかの組み合わせからなる群より選択される突然変異である、請求項１４に記載の方法。
  16. 植物種子中のフィチン酸のレベルを低下すること、植物種子中のリンをより代謝的に使用可能にすること、ＩＰＰ２−Ｋ遺伝子を不活性化又は変化させることを含む、請求項１４に記載の方法。
  17. 請求項１０から１２のいずれか１つに記載のいずれかの植物細胞の子孫である組み換え植物細胞。
  18. 請求項１３から１６のいずれか１つに記載のいずれかの方法によって作製された植物細胞。
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