CN103613646A - 经过优化的非规范锌指蛋白 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经过优化的非规范锌指蛋白。本文中所公开的是包含CCHC锌配位残基的锌指。还描述了包含这些CCHC锌指的锌指蛋白和融合蛋白以及编码这些蛋白质的多核苷酸。还描述了使用这些蛋白质进行基因编辑和基因调控的方法。

Description

经过优化的非规范锌指蛋白
本申请是申请日为2007年12月13日、中国申请号为200780051258.2、发明名称为“经过优化的非规范锌指蛋白”的发明申请的分案申请。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2006年12月14日提交的美国临时申请No.60/874,911和2007年5月30日提交的美国临时申请No.60/932,497的权益，本文通过提及而完整收录两者的公开内容。
发明领域
本公开内容在基因组工程(genome engineering)、基因打靶(genetargeting)、靶向染色体整合(targeted chromosomal integration)、蛋白质表达(protein expression)和外因基因组编辑(epigenome editing)领域中。
发明背景
蛋白质对DNA、RNA、蛋白质和其它分子的序列特异性结合涉及许多细胞过程，诸如例如转录、复制、染色质结构、重组、DNA修复、RNA加工和翻译。参与蛋白质-DNA、蛋白质-RNA和蛋白质-蛋白质相互作用的细胞结合蛋白的结合特异性有助于发育、分化和体内稳态。
锌指蛋白(ZFP)是能以序列特异性方式结合DNA的蛋白质。锌指最初在来自非洲爪蟾(African clawed toad)即Xenopus laevis卵母细胞的转录因子TFIIIA中鉴定出。这类ZFP的单个锌指结构域长约30个氨基酸，而且数项结构研究已经证明了它包含β-转角（包含两个保守的半胱氨酸残基）和α-螺旋（包含两个保守的组氨酸残基），它们经由两个半胱氨酸和两个组氨酸配位锌原子而保持特定构象。这类ZFP也称为C2H2ZFP。别的类型的ZFP也已经有提示。参见例如关于Cys-Cys-His-Cys(C3H)ZFP讨论的Jiang等(1996)J.Biol.Chem.271:10723-10730。迄今为止，已经在数千种已知的或推定的转录因子中鉴定出超过10,000种锌指序列。锌指结构域不仅参与DNA识别，而且还参与RNA结合和蛋白质-蛋白质结合。目前估计这类分子会占到所有人类基因的约2%。
大多数锌指蛋白具有保守的半胱氨酸和组氨酸残基，它们在每个指结构域中四面体形地配位单个锌原子。具体地，大多数ZFP以通式序列为-Cys-(X)2-4-Cys-(X)12-His-(X)3-5-His-(SEQ ID NO:1)的指构件为特征，其中X代表任何氨基酸(C2H2ZFP)。这种被最广泛呈现的类型的锌配位序列包含具有特定间距的两个半胱氨酸和两个组氨酸。每个指的折叠结构包含反向平行的β-转角、指尖区和短的两亲性α-螺旋。金属配位配体结合锌离子，并且在zif268型锌指的情况中，短的、两亲性α-螺旋在DNA的大沟中结合。另外，锌指的结构通过某些保守的疏水性氨基酸残基（例如指中就在第一个保守Cys之前的残基和螺旋区段第+4位的残基）和通过保守的半胱氨酸和组氨酸残基的锌配位而得到稳定化。
在产生直接碱基接触的位置、紧邻碱基接触位置的“支持性”或“支撑性”残基、和能够接触DNA磷酸酯主链的位置中具有改变的规范(C2H2)锌指蛋白已经有描述。参见例如美国专利No.6,007,988;6,013,453;6,140,081;6,866,997;6,746,838;6,140,081;6,610,512;7,101,972;6,453,242;6,785,613;7,013,219;PCT WO98/53059;Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416;Segal等(2000)Curr.Opin.Chem.Biol.4:34-39。
另外，包含具有改良锌配位残基的锌指的锌指蛋白也已经有描述（参见例如美国专利申请No.20030108880;20060246567;和20060246588；通过提及收录其公开内容）。然而，虽然包含这些非规范锌指的锌指蛋白保留了基因转录调控功能，但是它们起锌指核酸酶(ZFN)作用的能力在有些情况中相对于唯独由规范C2H2锌指组成的锌指蛋白有所降低。
如此，仍需要（特别是在锌指核酸酶的构建中）包含具有经过优化的非规范锌配位区的锌指的别的工程化锌指结合蛋白。
发明概述
本公开内容提供了在至少一个锌配位残基中具有改变的锌指DNA结合结构域。具体地，本文中描述了CCHC锌指。这些CCHC锌指可进一步地在锌配位残基附近（例如在锌指最C端的(C-terminal-most)锌配位残基周围的残基中）包含别的改变（替代、插入和/或删除）。还描述了包含一个或多个这些CCHC锌指的锌指多肽和融合蛋白、编码这些锌指和融合蛋白的多核苷酸、及使用这些锌指多肽和/或融合蛋白的方法。
如此，本公开内容涵盖但不限于下列编号的实施方案：
1.一种锌指蛋白，其包含非规范（非C2H2）锌指，其中所述非规范锌指具有牵涉DNA结合的螺旋部分且其中所述螺旋部分的锌配位区包含氨基酸序列HX1X2RCXL(SEQ ID NO:2)；且其中所述锌指蛋白被改造成结合靶序列。
2.实施方案1的锌指蛋白，其中Xl是A，而X2是Q。
3.实施方案1的锌指蛋白，其中X1是K，而X2是E。
4.实施方案1的锌指蛋白，其中X1是T，而X2是R。
5.实施方案1的锌指蛋白，其中XL是G。
6.一种锌指蛋白，其包含两个或更多个锌指，其中至少一个锌指包含序列Cys-(XA)2-4-Cys-(XB)12-His-(XC)3-5-Cys-(XD)l-10(SEQ ID NO:3)，其中XA、XB、XC和XD可以是任何氨基酸。
7.实施方案1至6任一项的锌指蛋白，其包含表1、表2、表3或表4任一中所示任一序列。
8.实施方案6或7的锌指蛋白，其中XD包含序列QLV或QKP。
9.实施方案8的锌指蛋白，其中所述序列QLV或QKP是所述锌指的3个C端氨基酸残基。
10.实施方案6至9任一项的锌指蛋白，其中XD包含1个、2个或3个Gly(G)残基。
11.一种锌指蛋白，其包含多个锌指，其中至少一个锌指包含依照实施方案1至10任一项的CCHC锌指。
12.实施方案11的锌指蛋白，其中所述锌指蛋白包含3个、4个、5个或6个锌指。
13.实施方案11或12的锌指蛋白，其中指2包含所述CCHC锌指。
14.实施方案11至13任一项的锌指蛋白，其中C端锌指包含所述CCHC指。
15.实施方案11至14任一项的锌指蛋白，其中至少两个锌指包含所述CCHC锌指。
16.实施方案11至15任一项的锌指蛋白，其中所述锌指蛋白包含表8中所示任一序列且被改造成结合IPP2-K基因中的靶序列。
17.一种融合蛋白，其包含实施方案1至16任一项的锌指蛋白和一个或多个功能域。
18.一种融合蛋白，其包含：
(a)切割半结构域(half-domain)，
(b)实施方案1至16任一项的锌指蛋白，和
(c)插入所述切割半结构域和所述锌指蛋白之间的ZC接头。
19.实施方案18的融合蛋白，其中所述ZC接头的长度是5个氨基酸。
20.实施方案19的融合蛋白，其中所述ZC接头的氨基酸序列是GLRGS(SEQ ID NO:4)。
21.实施方案18的融合蛋白，其中所述ZC接头的长度是6个氨基酸。
22.实施方案21的融合蛋白，其中所述ZC接头的氨基酸序列是GGLRGS(SEQ ID NO:5)。
23.一种多核苷酸，其编码依照实施方案1至16任一项的锌指蛋白或依照实施方案17至22任一项的融合蛋白。
24.一种用于在植物细胞中靶向切割细胞染色质的方法，所述方法包括在所述细胞中表达一对依照实施方案18至22任一项的融合蛋白，其中：
(a)所述融合蛋白的靶序列彼此相距10个核苷酸之内(within tennucleotides of each other)；且
(b)所述融合蛋白二聚化，并切割位于所述靶序列之间的DNA。
25.一种在宿主植物细胞中靶向遗传重组的方法，所述方法包括：
(a)在所述宿主细胞中表达一对依照实施方案18至22任一项的融合蛋白，其中所述融合蛋白的靶序列存在于选定的宿主靶基因座中；并
(b)鉴定在所述宿主靶基因座中展现出序列改变的重组宿主细胞。
26.实施方案24或25的方法，其中所述序列改变是选自下组的突变：遗传物质的删除、遗传物质的插入、遗传物质的替代及其任何组合。
27.实施方案24至26任一项的方法，其进一步包括将外源多核苷酸导入所述宿主细胞中。
28.实施方案27的方法，其中所述外源多核苷酸包含与所述宿主靶基因座同源的序列。
29.实施方案24至28任一项的方法，其中所述植物选自下组：单子叶植物、双子叶植物、裸子植物和真核藻类。
30.实施方案29的方法，其中所述植物选自下组：玉米、稻、小麦、马铃薯、大豆、番茄、烟草、芸苔科(Brassica family)成员、和拟南芥属(Arabidopsis)。
31.实施方案24至29任一项的方法，其中所述植物是树。
32.实施方案24至31任一项的方法，其中所述靶序列在IPP2K基因中。
33.一种用于降低种子中植酸水平的方法，所述方法包括依照实施方案32灭活或改变IPP2-K基因。
34.一种用于使磷在种子中更能被代谢利用的方法，所述方法包括依照实施方案32灭活或改变IPP2-K基因。
35.一种植物细胞，其包含依照实施方案1至16任一项的锌指蛋白、依照实施方案17至22任一项的融合蛋白、或依照实施方案23的多核苷酸。
36.实施方案35的植物细胞，其中所述细胞是种子。
37.实施方案36的植物细胞，其中所述种子是玉米种子。
38.实施方案35至37任一项的植物细胞，其中IPP2-K是被部分或完全灭活的。
39.实施方案38的植物细胞，其中所述种子中的植酸水平是降低的。
40.实施方案35至39的植物细胞，其中所述细胞中的磷的代谢可利用水平是提高的。
附图简述
图1是描绘在美国专利No.2005/0064474和下文中所述GFP细胞报道测定系统中以表达GFP的细胞的百分比测量的基因校正率(gene correction rate)的图形。ZFN变体称为“X-Y，”其中“X”指表号，而“Y”指给予具体选定表中的锌指的编号。例如，“2-21”指具有包含表2中第21行所示序列即HAQRCGLRGSQLV(SEQ ID NO:53)的指的ZFN。
图2是描绘由使用各种ZFN变体对进行切割引起的Cel-1信号的百分比的图形。通过查阅样品编号为每对ZFN显示两个实验的结果。在右上角在方框中显示了用于每个样品的变体对，其中“wt5-8”和“wt5-9”指美国专利申请No.2005/0064474的实施例14（表17）中披露的规范ZFN对。在样品3-12中，用非规范序列替换规范ZFN5-8或5-9的指2或指4的识别螺旋的C端区域。在图形上方在左上角显示了样品3-12中称为20、21、43、45、47和48的非规范ZFN变体的部分序列和这些变体在4个指的ZFN内的指位置。描绘样品8和9的实验2结果的柱形上方的星号指示道中的背景，导致ZFN功效的低估。
图3是描绘美国专利No.2005/0064474和本文中所述GFP细胞报道测定系统中的基因校正率的图形。在每个柱形下方显示了每个样品中所测试的ZFN对，其中所述锌指编号20、21、43、45、47和48是那些在实施例3中所述的，而CCHC锌指1a至10a包含表3和4中所示序列。图4中使用锌指20、21、7a、8a、9a和10a；图2中使用锌指43、45、47、48、1a、2a、3a、4a、5a和6a。
图4是质粒pDAB1585（一种用于烟草的靶载体）的线性图示。
图5是质粒pDAB1585（一种用于烟草的靶载体）的图示
图6（小图A和B）描绘了锌指核酸酶(ZFN)，即针对烟草的锌指核酸酶结合序列和靶位点设计。图6小图A是描绘ZFN结合的示意图。图6小图B显示了靶序列的序列。
图7是质粒pDAB1400的图示。
图8是质粒pDAB782的图示。
图9是质粒pDAB1582的图示。
图10是质粒pDAB354的图示。
图11是质粒pDAB1583的图示。
图12是质粒pDAB2407的图示。
图13是质粒pDAB1584的图示。
图14是质粒pDAB2418的图示。
图15是质粒pDAB4045的图示。
图16是质粒pDAB1575的图示。
图17是质粒pDAB1577的图示。
图18是质粒pDAB1579的图示。
图19是质粒pDAB1580的图示。
图20是质粒pDAB3401的图示。
图21是质粒pDAB1570的图示。
图22是质粒pDAB1572的图示。
图23是质粒pDAB4003的图示。
图24是质粒pDAB1571的图示。
图25是质粒pDAB7204的图示。
图26是质粒pDAB1573的图示。
图27是质粒pDAB1574的图示。
图28是质粒pDAB1581的图示。
图29是质粒pDAB1576的图示。
图30是质粒pDAB1600（用于烟草的供体DNA载体）的图示。
图31是质粒pDAB3731的图示。
图32是质粒pDAB4322的图示。
图33是质粒pDAB4331的图示。
图34是质粒pDAB4332的图示。
图35是质粒pDAB4333的图示。
图36是质粒pDAB4334的图示。
图37是质粒pDAB4336的图示。
图38是质粒pDAB4339的图示。
图39是质粒pDAB4321的图示。
图40是质粒pDAB4323的图示。
图41是质粒pDAB4341的图示。
图42是质粒pDAB4342的图示。
图43是质粒pDAB4343的图示。
图44是质粒pDAB4344的图示。
图45是质粒pDAB4346的图示。
图46是质粒pDAB4330的图示。
图47是质粒pDAB4351的图示。
图48是质粒pDAB4356的图示。
图49是质粒pDAB4359的图示。
图50是质粒pDAB7002的图示。
图51是质粒pDAB7025的图示。
图52是质粒pDAB1591的图示。
图53是质粒pcDNA3.1-SCD27a-L0-Fokl（用于PCR扩增Scd27 ZFN的DNA模板）的图示。
图54是质粒pDAB1594的图示。
图55是质粒pDAB1598（锌指-Fok1融合蛋白的基因表达载体）的图示。
图56是质粒pDAB1577的图示。
图57是质粒pDAB1578的图示。
图58是质粒pDAB1601（PAT基因对照载体）的图示。
图59是描绘了预测的、由IL-1-Fokl融合蛋白刺激的染色体内同源重组的示意图。
图60是质粒pDAB1590（阳性GFP表达对照）的图示。
图61是描绘了预测的、由IL-1锌指-Fokl融合蛋白刺激的染色体间同源重组的示意图。
图62是描绘了预测的、由Scd27锌指-Fokl融合蛋白刺激的染色体间同源重组的示意图。
图63是描绘了重组体PCR分析的凝胶。在凝胶上方标记了左侧前4道。标记的第1-5道显示了来自用C3H IL-1-Fokl融合蛋白基因进行的BY2-380转化的HR事件，标记的第6-7道显示了来自用C3H SCD27-FokI融合蛋白基因进行的BY2-380转化的HR事件。
图64显示了玉米IPP2K基因序列(SEQ ID NO:6)，其衍生自HiII细胞培养物，并且其充当用于靶向玉米IPP2K的ZFN的工程化的设计模板。
图65（小图A至E）描绘了ZFN表达载体克隆方案。使用逐步克隆策略来产生ZFN表达构建体。将各个ZFN编码基因克隆入载体pVAX-N2A-NLSop2-EGFP-FokMono(A)和pVAX-C2A-NLSop2-EGFP-FokMono(B)中以创建二元蛋白质盒(dual-protein cassette)(C)。将该盒连接入pDAB3872(D)中以生成最终的质粒(E)，用于表达ZFN异二聚体。
图66描绘了玉米IPP2K基因中的ZFN结合，即ZFN对玉米IPP2K基因的结合和切割。需要两个ZFN蛋白来实施对DNA的双链切割。显示了切割位点（用向下的箭头指示的）周围的序列(SEQ ID NO:7)。若一个蛋白质(8705)结合序列CTGTGGGGCCAT（上链）(SEQ ID NO:8)，则另一个蛋白质(8684、8685、或8686)结合下游序列(CTTGACCAACTCAGCCAG，下链)(SEQ ID NO:9)。
图67描绘了野生型（顶部序列，SEQ ID NO:10）和ZFN克隆127（底部序列，SEQ ID NO:11）的序列，即ZFN介导的删除。以灰色框突出显示了该ZFN的切割靶物。
图68显示了通过454测序所检测的玉米IPP2K基因中由ZFN介导的dsDNA断裂的非同源末端连接(NHEJ)引起的多种删除的比对，即ZFN介导的删除。以灰色框突出显示了该ZFN的切割靶物。
图69是描绘了在美国专利No.2005/0064474和本文中所述GFP细胞报道测定系统中的基因校正率的图形。在每个柱形下方显示了每个样品中所测试的ZFN对。
图70描绘了如实施例18B所述那样构建的质粒pDAB7471。
图71描绘了如实施例18C所述那样构建的质粒pDAB7451。
图72是描绘了例示性自主除草剂耐受基因表达盒的示意图。该结构如实施例18D所述的那样包含完整启动子-转录单位(PTU)，其包含启动子、除草剂耐受基因和聚腺苷酸化（聚腺苷酸(polyA)）终止序列。
图73描绘了如实施例18E所述那样构建的质粒pDAB7422。该质粒包含插入位置1质粒主链(backbone)中的完整启动子-转录单位(PTU)，其包含启动子、除草剂耐受基因和聚腺苷酸化（聚腺苷酸）终止序列。
图74描绘了如实施例18E所述那样构建的质粒pDAB7452。该质粒包含插入位置2质粒主链中的完整启动子-转录单位(PTU)，其包含启动子、除草剂耐受基因和聚腺苷酸化（聚腺苷酸）终止序列。
图75是描绘了例示性非自主除草剂耐受基因表达盒的示意图。该结构如实施例18F所述的那样包含不完整启动子-转录单位(PTU)，其包含除草剂耐受基因和聚腺苷酸化（聚腺苷酸）终止序列。
图76描绘了如实施例18G所述那样构建的质粒pDAB7423。该质粒包含插入位置1质粒主链中的不完整启动子-转录单位(PTU)，其包含除草剂耐受基因和聚腺苷酸化（聚腺苷酸）终止序列。
图77描绘了如实施例18G所述那样构建的质粒pDAB7454。该质粒如实施例18G所述的那样包含插入位置2质粒主链中的不完整启动子-转录单位(PTU)，其包含除草剂耐受基因和聚腺苷酸化（聚腺苷酸）终止序列。
图78描绘了如实施例18H所述那样构建的质粒pDAB7424（一种例示性的经
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改编(adapt)的位置1自主供体）。
图79描绘了如实施例18H所述那样构建的质粒pDAB7425（一种例示性的经改编的位置1自主供体）。
图80描绘了如实施例18H所述那样构建的质粒pDAB7426。pDAB7426是一种组合质粒，其包含位置1自主供体及ZFN表达盒。
图81描绘了如实施例18H所述那样构建的质粒pDAB7427。pDAB7427是一种组合质粒，其包含位置1自主供体及ZFN表达盒。
图82描绘了来自基因组DNA的供体DNA特异性序列的扩增。317bp产物的存在判断出插入玉米胼胝体(callus)系#61-72基因组中的、包含PAT基因的供体DNA的存在，如实施例20C所述的。HiII指示野生型阴性对照。
图83描绘了供体DNA和IPP2K特异的玉米基因组序列间的5’边界的扩增。如实施例21A所述，根据1.65Kbp的DNA片段的存在判断出由供体向IPP2K基因中靶向整合而衍生的再次PCR产物(secondary PCR product)。HiII指示野生型阴性对照。
图84描绘了供体DNA和IPP2K特异的玉米基因组序列间的3’边界的扩增。如实施例21A所述，根据1.99Kbp的DNA片段的存在判断出由供体向IPP2K基因中靶向整合而衍生的再次PCR产物。HiII指示野生型阴性对照。
图85描绘了基因组和供体之间的上游（5’）边界的扩增。如实施例21B所述，根据大小为1.35Kbp的DNA片段的存在判断出由供体向IPP2K基因（5’边界）中靶向整合而衍生的PCR产物。HiII指示野生型阴性对照。
图86描绘了供体和基因组之间的下游（3’）边界的扩增。如实施例21B所述，根据大小为1.66Kbp的DNA片段的存在判断出由供体向IPP2K基因（3’边界）中靶向整合而衍生的PCR产物。HiII指示野生型阴性对照。
图87描绘了位置15’同源性侧翼的序列(SEQ ID NO:171)。
图88描绘了位置13’同源性侧翼的序列(SEQ ID NO:172)。
图89描绘了位置25’同源性侧翼的序列(SEQ ID NO:139)。
图90描绘了位置23’同源性侧翼的序列(SEQ ID NO:140)。
图91描绘了ZFN靶向区域的上游(5’-)IPP2K基因组序列的序列(SEQ IDNO:141)。
图92描绘了ZFN靶向区域的下游(3’-)IPP2K基因组序列的序列(SEQ IDNO:142)。
发明详述
本文中所公开的是包含含有Cys-Cys-His-Cys形式非规范锌指的锌指结合多肽(ZFP)的组合物。由于锌配位为锌指提供了主要的折叠能量，锌配位残基的调整提供了一种用于修改指稳定性和结构的简便手段，稳定性和结构对锌指蛋白的多种重要功能性特征产生影响，包括例如细胞半衰期、与其它细胞因子的相互作用、DNA结合特异性和亲和力、及功能域的相对取向。
已经有显示，包含非规范锌指的锌指蛋白（诸如那些在美国专利申请No.20030108880；20060246567；和20060246588中所披露的）结合DNA并改变转录。然而，在被掺入锌指核酸酶（ZFN，参见例如美国专利申请公开文本No.2005/0064474）后，这些先前描述的非规范锌指蛋白有时会在切割靶DNA方面展现出欠佳的(sub-optimal)活性。
本文中所描述的是包含一个或多个CCHC锌指的锌指蛋白，其中C端锌配位残基对周围的特定序列已经被改变。本文中还描述的是包含这些经过优化的非规范锌指的融合蛋白，例如锌指核酸酶(ZFN)，其中所述ZFN以与使用包含规范(CCHH)锌指的ZFN实现的切割作用相当的速率或比率(rate)切割靶DNA。
本文中所公开的融合多肽能增强或抑制基因的转录和/或切割靶序列。还提供了编码经过优化的非规范锌指的多核苷酸、和编码包含一个或多个经过优化的非规范锌指的融合蛋白的多核苷酸。另外提供的是药用组合物，其包含与药学可接受载体组合的治疗有效量的本文所述任何锌指-核苷酸结合多肽或其功能性片段或治疗有效量的编码任何改良锌指-核苷酸结合多肽或其功能性片段的核苷酸序列。还提供的是农用组合物，其包含与农学可接受载体组合的农艺学有效量的本文所述任何锌指-核苷酸结合多肽或其功能性片段或农艺学有效量的编码任何改良锌指-核苷酸结合多肽或其功能性片段的核苷酸序列。还提供的是用于获得能结合基因组序列的改良锌指-核苷酸结合多肽的筛选方法。
基因组序列包括那些存在于染色体、附加体、细胞器基因组（例如线粒体、叶绿体）、人工染色体和细胞中存在的任何其它类型的核酸（诸如例如扩增序列、双微染色体、和内源的或感染的细菌和病毒的基因组）中的。基因组序列可以是正常的（即野生型）或突变的；突变序列可以包含例如插入、删除、替代、易位、重排、和/或点突变。基因组序列还可以包含许多不同的等位基因之一。
通用技术
除非另有说明，本文所公开组合物的制备和使用以及方法的实施采用分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、计算化学、细胞培养、重组DNA及相关领域中的常规技术，这些技术是在本领域技术范围内的。这些技术在文献中有全面的解释。参见例如Sambrook等,MOLECULAR CLONING:ALABORATORY MANUAL,第二版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989及第三版,2001;Ausubel等,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULARBIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,1987及定期更新;丛书METHODSIN ENZYMOLOGY,Academic Press,San Diego;Wolffe,CHROMATINSTRUCTURE AND FUNCTION,第三版,Academic Press,San Diego,1998;METHODS IN ENZYMOLOGY,卷304,“Chromatin”(P.M.Wassarman和A.P.Wolffe编),Academic Press,San Diego,1999;及METHODS IN MOLECULARBIOLOGY,卷119,“Chromatin Protocols”(P.B.Becker编),Humana Press,Totowa,1999。
定义
术语“核酸”、“多核苷酸”、和“寡核苷酸”可互换使用，指处于线性或环状构象的，及或是单链或是双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。为了本公开的目的，这些术语不解释为关于聚合物长度的限制。该术语可以涵盖天然核苷酸的已知类似物以及碱基、糖和/或磷酸模块中有修饰的核苷酸（例如硫代磷酸酯主链）。一般而言，特定核苷酸的类似物具有相同的碱基配对特异性；即A的类似物会与T进行碱基配对。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。该术语还应用于其中一个或多个氨基酸是相应天然存在氨基酸的化学类似物或修饰衍生物的氨基酸聚合物。
“结合”指大分子间（例如蛋白质和核酸间）序列特异性的、非共价的相互作用。结合相互作用的所有成分并非都必需是序列特异性的（例如与DNA主链中磷酸残基接触），只要作为整体的相互作用是序列特异性的。一般地，此类相互作用的特征在于解离常数(Kd)为10-6M-1或更低。“亲和力”指结合强度：结合亲和力升高与Kd降低相关。
“结合蛋白”指能够非共价结合另一分子的蛋白质。结合蛋白可以结合例如DNA分子（DNA结合蛋白）、RNA分子（RNA结合蛋白）和/或蛋白质分子（蛋白质结合蛋白）。在蛋白质结合蛋白的情况中，它可以结合其本身（以形成同二聚体、同三聚体、等等）和/或它可以结合一个或多个分子的不同的一种或多种蛋白质。结合蛋白可以具有超过一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合及蛋白质结合活性。
“锌指DNA结合蛋白”（或结合结构域）指经由一个或多个锌指、以序列特异性方式结合DNA的蛋白质或较大蛋白质内的结构域，所述锌指是结合结构域内的氨基酸序列区域且其结构通过锌离子配位而稳定化。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。
锌指结合结构域可以“改造或工程化”(engineer)成结合预定的核苷酸序列。设计和选择是用于工程化锌指蛋白的方法的非限制性例子。设计的锌指蛋白是自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要源自合理标准(rationalcriteria)。用于设计的合理标准包括应用替代规则和计算机化算法，用于处理存储现有ZFP设计和结合数据信息的数据库中的信息。参见例如美国专利6,140,081；6,453,242；6,534,261；及6,785,613；还可参见WO98/53058；WO98/53059；WO98/53060；WO02/016536和WO03/016496；及美国专利6,746,838；6,866,997；及7,030,215。
“选择的”锌指蛋白指自然界中没有找到的蛋白质，其生成主要源自经验方法，诸如噬菌体展示、相互作用陷阱、或杂合物选择。参见例如US5,789,538；US5,925,523；US6,007,988；US6,013,453；US6,200,759；US6,733,970；US RE39,229；及WO95/19431；WO96/06166；WO98/53057；WO98/54311；WO00/27878；WO01/60970；WO01/88197及WO02/099084。
“非规范的”锌指蛋白指包含非规范（非C2H2）锌指的蛋白质。如此，与天然存在C2H2锌指蛋白相比，非规范锌指包含至少一个氨基酸的替代、添加和/或删除。非规范锌指的非限制性例子包括那些包含Cys-Cys-His-Cys（例如C3H）（从氨基至羧基）锌配位残基的。
“同源序列”指与第二序列分享某种程度的序列同一性，而且其序列可以与第二序列的序列相同的第一序列。“同源但不相同的序列”指与第二序列分享某种程度的序列同一性，但其序列与第二序列的序列不相同的第一序列。例如，包含突变型基因之野生型序列的多核苷酸与突变型基因的序列同源但不相同。在某些实施方案中，两个序列之间的同源性程度足以容许它们之间利用正常细胞机制进行同源重组。两个同源但不相同的序列可以是任何长度，而且它们的非同源性程度可以小至单个核苷酸（例如用于通过靶向同源重组来校正基因组点突变）或大至10千碱基或更多（例如用于在染色体中预定位点处插入基因）。包含同源但不相同序列的两个多核苷酸不必具有相同长度。例如，可以使用20和10,000个核苷酸或核苷酸对之间的外源多核苷酸（即供体多核苷酸）。
用于测定核酸和氨基酸序列同一性的技术是本领域已知的。典型地，此类技术包括对基因测定mRNA的核苷酸序列和/或测定由其所编码的氨基酸序列，并将这些序列与第二核苷酸或氨基酸序列进行比较。基因组序列也可以以这种方式进行测定和比较。一般而言，同一性指两个多核苷酸序列间准确的核苷酸与核苷酸(nucleotide-to-nucleotide)对应或两个多肽序列间准确的氨基酸与氨基酸(amino acid-to-amino acid)对应。两个或更多个序列（多核苷酸或氨基酸）可以通过测定它们的百分比同一性来进行比较。两个序列（无论是核酸序列还是氨基酸序列）的百分比同一性是两个比对序列之间的准确匹配的数目除以较短序列的长度并乘以100。核酸序列的近似比对由Smith和Waterman,Advances in Applied Mathematics2:482-489(1981)的局部同源性算法提供。该算法可以通过使用如下评分矩阵而应用于氨基酸序列，所述评分矩阵由Dayhoff,Atlas of Protein Sequences and Structure,M.O.Dayhoff编,5suppl.3:353-358,National Biomedical Research Foundation,Washington,D.C.,USA开发，并由Gribskov,Nucl.Acids Res.14(6):6745-6763(1986)标准化。该算法测定序列百分比同一性的例示性执行由Genetics Computer Group(Madison,WI)在“最佳拟合”(“BestFit”)实用申请(utility application)中提供。这种方法的缺省参数记载于Wisconsin Sequence Analysis Package ProgramManual,第8版(1995)(可得自Genetics Computer Group,Madison,WI)。在本公开的背景中建立百分比同一性的例示性方法是使用MPSRCH程序包，所述MPSRCH程序包的版权为University of Edinburgh所有，由John F.Collins和Shane S.Sturrok开发，并由IntelliGenetics,Inc.(Mountain View,CA)销售。自这套程序包，可以采用Smith-Waterman算法，其中将缺省参数用于评分表（例如缺口打开罚分为12，缺口延伸罚分为1，且缺口为6）。自所产生的数据，“匹配”值反映序列同一性。其它适于计算序列间百分比同一性或相似性的程序是本领域普遍知道的，例如，另一种比对程序是与缺省参数一起使用的BLAST。例如，可以使用BLASTN和BLASTP，其使用以下缺省参数：遗传代码=标准；滤器(filter)=无；链=双链(both)；截留(cutoff)=60；期望(expect)=10；矩阵(Matrix)=BLOSUM62；描述(Descriptions)=50个序列；排序(sort by)=HIGH SCORE；数据库(Databases)=非冗余的，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss蛋白质+Spupdate+PIR。这些程序的详情可以在因特网上找到。关于本文所述序列，序列同一性的期望程度范围是大约35%至100%和其间的任何整数值。典型地，序列间百分比同一性是至少35%-40%；40%-45%；45%-50%；50%-60%；60%-70%；70-75%，优选80-82%，更优选85%-90%，甚至更优选92%，还更优选95%，并且最优选98%的序列同一性。
或者，多核苷酸间序列相似性的程度可以如下测定，即在容许同源区间形成稳定双链体的条件下进行多核苷酸杂交，接着使用单链特异性核酸酶进行消化，并测定消化后片段的大小。若根据使用上述方法的测定，两个核酸序列或两个多肽序列在限定长度的分子里展现至少大约70%-75%，优选80%-82%，更优选85%-90%，甚至更优选92%，还更优选95%，并且最优选98%的序列同一性，则所述两个核酸序列或两个多肽序列彼此基本上同源。在用于本文时，基本上同源还指相对于指定的DNA或多肽序列显示完全同一性的序列。基本上同源的DNA序列可以在Southern杂交实验中于例如严格条件（由那种特定系统所确定）下鉴定。确定合适杂交条件是在本领域技术范围内的。参见例如Sambrook等,见上文;Nucleic Acid Hybridization:APractical Approach,编辑B.D.Hames和SJ.Higgins,(1985)Oxford;Washington,DC;IRL Press。
两个核酸片段的选择性杂交可以如下测定。两个核酸分子之间序列同一性的程度影响此类分子间杂交事件的效率和强度。部分相同的核酸序列至少会部分抑制完全相同序列与靶分子的杂交。对完全相同序列的杂交的抑制可以使用本领域公知的杂交测定法来评估（例如Southern(DNA)印迹、Northern(RNA)印迹、溶液杂交等，参见Sambrook等,Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.）。此类测定法可以使用不同程度的选择性（例如使用从低严格性至高严格性的不同条件）来实施。如果采用低严格性条件，那么非特异性结合的缺乏可以如下评估，即使用甚至缺乏部分程度序列同一性的第二探针（例如与靶分子具有小于大约30%序列同一性的探针），使得在没有非特异性结合事件时，所述第二探针不会与靶物杂交。
在利用基于杂交的检测系统时，选择与参照核酸序列互补的核酸探针，然后通过选择合适的条件，使得所述探针和参照序列彼此选择性杂交或结合以形成双链体分子。能够在中等严格杂交条件下选择性杂交参照序列的核酸分子典型地在如下条件发生杂交，所述条件容许检测与选定核酸探针序列具有至少大约70%序列同一性的、长度为至少大约10-14个核苷酸的靶核酸序列。严格杂交条件典型地容许检测与选定核酸探针序列具有大于大约90-95%序列同一性的、长度为至少大约10-14个核苷酸的靶核酸序列。对于探针/参照序列杂交有用的杂交条件（其中探针和参照序列具有特定程度的序列同一性）可以如本领域所知的那样确定（参见例如Nucleic Acid Hybridization:APractical Approach,编辑B.D.Hames和S.J.Higgins,(1985)Oxford;Washington,DC;IRL Press）。
杂交条件对于本领域技术人员是公知的。杂交严格性指杂交条件不利于形成含有错配核苷酸的杂合物所达到的程度，其中较高的严格性与对错配杂合物较低的耐受性相关。影响杂交严格性的因素对于本领域技术人员是公知的，并且包括但不限于温度、pH、离子强度、及有机溶剂（诸如例如甲酰胺和二甲亚砜）浓度。正如本领域技术人员所知的，杂交严格性由于温度升高、离子强度降低及溶剂浓度降低而增加。
关于杂交的严格性条件，本领域公知的是可以采用很多等同条件来建立特定的严格性，这通过改变例如下列因素来实现：序列的长度和性质、各种序列的碱基组成、盐类和其它杂交溶液成分的浓度、杂交溶液中是否存在封闭剂（例如硫酸右旋糖苷和聚乙二醇）、杂交反应温度及时间参数；以及改变洗涤条件来实现。杂交条件的具体集合的选择遵循本领域的标准方法进行（参见例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第二版,(1989)Cold Spring Harbor,N.Y.）。
“重组”指两个多核苷酸之间交换遗传信息的过程。为了本公开的目的，“同源重组(HR)”指在例如细胞中双链断裂的修复过程中发生的此类交换的专门化形式。这种过程要求核苷酸序列同源性，使用“供体”分子来进行“靶物”分子（即经历了双链断裂的分子）的模板修复，并且因为其导致遗传信息从供体转移至靶物，因而不同地称为“非交叉型基因转换”(“non-crossovergene conversion”)或“短道基因转换”(“short tract gene conversion”)。在不希望被任何具体理论限制的前提下，这种转移可以牵涉断裂的靶物和供体之间所形成的异源双链体DNA的错配校正，和/或“合成依赖性链退火”(“synthesis-dependent strand annealing”)（其中使用供体来再合成会变为靶物一部分的遗传信息），和/或相关过程。这种专门化的HR通常导致靶物分子序列的改变，使得供体多核苷酸序列的部分或整个掺入靶多核苷酸中。
“切割”指DNA分子共价主链的断裂。切割可以通过多种方法来启动，包括但不限于磷酸二酯键的酶促或化学水解。单链切割和双链切割两者都是可能的，而且双链切割可以因为两个不同的单链切割事件而发生。DNA切割可以导致平末端或交错末端的产生。在某些实施方案中，将融合多肽用于靶向双链DNA切割。
“切割结构域”包含拥有对DNA切割的催化活性的一种或多种多肽序列。切割结构域可以包含在单条多肽链中，或者切割活性可以源自两个（或更多个）多肽的结合。
“切割半结构域”指与第二多肽（或是相同的或是不同的）结合而形成具有切割活性（优选双链切割活性）的复合物的多肽序列。
术语“切割结构域”和“切割半结构域”包括切割结构域或切割半结构域的野生型结构域和部分或突变体，其保留多聚化（例如二聚化）以形成功能性切割结构域的能力。
“染色质”指包含细胞基因组的核蛋白结构。细胞染色质包含核酸（主要是DNA）及蛋白质（包括组蛋白和非组蛋白染色体蛋白质）。大多数真核细胞染色质以核小体形式存在，其中核小体核心包含大约150个碱基对的DNA，该DNA与包含双份各为组蛋白H2A、H2B、H3和H4的八聚体结合；并且连接区DNA（是可变长度的，取决于生物体）在核小体核心之间延伸。一般地，一分子组蛋白H1与连接区DNA结合。为了本公开的目的，术语“染色质”意图涵盖细胞核蛋白的所有类型，原核生物的及真核生物的两者。细胞染色质包括染色体型的和附加体型的染色质两者。
“染色体”指包含细胞基因组的整个或部分的染色质复合物。通常，细胞基因组的特征在于其核型，其是构成细胞基因组的所有染色体的集合(collection)。细胞基因组可包含一个或多个染色体。
“附加体”(episome)指复制型核酸、核蛋白复合物或包含不是细胞染色体核型一部分的核酸的其它结构。附加体的例子包括质粒和某些病毒基因组。
“可及区”(accessible region)指细胞染色质中的如下位点，其中核酸中存在的靶位点可以被识别该靶位点的外源分子结合。在不希望被任何具体理论限制的前提下，认为可及区是不被包装入核小体结构中的区域。不同的可及区结构通常可以通过其对化学和酶探针（例如核酸酶）的敏感性来检测。
“靶位点”或“靶序列”指对结合分子会结合（倘若存在足以使结合发生的条件的话）的核酸部分进行限定的核酸序列。例如，序列5’-GAATTC-3’是Eco RI限制性内切核酸酶的靶位点。
“外源的”分子指正常情况下不存在于细胞中但可以通过一种或多种遗传的、生化的或其它方法而导入细胞中的分子。“正常存在于细胞中”是相对于细胞的特定发育阶段和环境条件而确定的。如此，例如，仅存在于肌肉的胚胎发育过程中的分子是相对于成年肌肉细胞的外源分子。类似地，由热休克所诱导的分子是相对于未热休克细胞的外源分子。外源分子可以包含例如机能失常的(malfunctioning)内源分子的机能(functioning)型式或正常机能的内源分子的机能失常型式。
外源分子可以是小分子（诸如通过组合式化学方法所生成的）、或大分子（诸如蛋白质、核酸、碳水化合物、脂质、糖蛋白、脂蛋白、多糖）、上述分子的任何修饰衍生物、或任何包含一种或多种上述分子的复合物等等。核酸包括DNA和RNA，可以是单链或双链；可以是线性的、分枝的或环状的；而且可以是任何长度的。核酸包括那些能够形成双链体的核酸，以及形成三链体的核酸。参见例如美国专利No.5,176,996和5,422,251。蛋白质包括但不限于DNA结合蛋白、转录因子、染色质重建因子(chromatin remodeling factor)、甲基化DNA结合蛋白、聚合酶、甲基化酶、脱甲基酶、乙酰化酶(acetylase)、脱乙酰基酶、激酶、磷酸酶、整合酶、重组酶、连接酶、拓扑异构酶、促旋酶、及解旋酶。
外源分子可以是与内源分子相同类型的分子，例如外源蛋白质或核酸。例如，外源核酸可以包含感染性病毒基因组、根癌土壤杆菌(Agrogacteriumtumefacians)T链、导入细胞中的质粒或附加体、或正常情况下不存在于细胞中的染色体。但是，外源核酸或多核苷酸可包含与内源序列同源或相同的序列。相对于特定内源基因组区域，“外源序列”指不存在于该区域的核苷酸序列。该外源序列可存在于另一内源染色体位置或其可能根本不存在于基因组中。如此，外源多核苷酸可包含外源和内源序列两者：例如，侧翼为与基因组区域同源的序列的转基因。在下文所述用于靶向整合和靶向重组的方法中使用此类外源核酸。用于将外源分子导入细胞中的方法对于本领域技术人员是已知的，并且包括但不限于脂质介导的转移（即脂质体，其包括中性脂质和阳离子脂质）、电穿孔、直接注射、细胞融合、粒子轰击、磷酸钙共沉淀、DEAE-右旋糖苷介导的转移、及病毒载体介导的转移。
比较而言，“内源的”分子指正常存在于特定环境条件下处于特定发育阶段的特定细胞中的分子。例如，内源核酸可以包含染色体，线粒体、叶绿体或其它细胞器的基因组，或天然存在的附加体型核酸。别的内源分子可以包括蛋白质，例如转录因子和酶。
“融合（物）”分子指其中有两个或更多个亚基分子连接（例如共价地）在一起的分子。亚基分子可以是相同化学类型的分子，或者可以是不同化学类型的分子。第一种类型的融合分子的例子包括但不限于融合蛋白（例如ZFPDNA结合结构域和切割结构域之间的融合物）和融合核酸（例如编码上文所述融合蛋白的核酸）。第二种类型的融合分子的例子包括但不限于形成三链体的核酸和多肽之间的融合物，及小沟结合物和核酸之间的融合物。
融合蛋白在细胞中的表达可以源自将该融合蛋白投递至细胞或者通过将编码该融合蛋白的多核苷酸投递至细胞，其中所述多核苷酸被转录，而且转录物被翻译，以生成所述融合蛋白。蛋白质在细胞中的表达还可以牵涉反式剪接、多肽切割和多肽连接。用于将多核苷酸和多肽投递至细胞的方法在本公开的别处提出。
“基因”为了本公开的目的包括编码基因产物的DNA区域（见下文），以及调节基因产物生成的所有DNA区域，无论此类调节序列是否邻近编码序列和/或被转录序列。因而，基因包括但不必限于启动子序列、终止子、翻译调节序列（诸如核糖体结合位点和内部核糖体进入位点）、增强子、沉默基因(silencer)、绝缘子(insulator)、边界元件、复制起点、基质附着位点、及基因座控制区。
“基因表达”指基因中所含信息转换成基因产物。基因产物可以是基因的直接转录产物（例如mRNA、tRNA、rRNA、反义RNA、核酶、结构性RNA或任何其它类型的RNA）或通过mRNA翻译所生成的蛋白质。基因产物还包括通过加帽、聚腺苷酸化、甲基化和编辑等过程所修饰的RNA，及通过例如甲基化、乙酰化、磷酸化、遍在蛋白化、ADP-核糖基化、肉豆蔻基化和糖基化所修饰的蛋白质。
基因表达的“调控”指基因活性的变化。表达调控可以包括但不限于基因激活和基因阻抑。
“植物”细胞包括但不限于单子叶(monocot)或双子叶(dicot)植物的细胞。单子叶植物的非限制性例子包括谷类植物，诸如玉米、稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、甘蔗、菠萝、洋葱、香蕉、及椰子。双子叶植物的非限制性例子包括烟草、番茄、向日葵、棉、甜菜、马铃薯、莴苣、甜瓜(melon)、大豆、芸苔（油菜）、及苜蓿。植物细胞可以来自植物的任何部分和/或来自植物发育的任何阶段。
“感兴趣区域”指期望与外源分子结合的任何细胞染色质区域，诸如例如基因或基因内或与基因邻近的非编码序列。结合可以是为了靶向DNA切割和/或靶向重组的目的。例如，感兴趣区域可以存在于染色体、附加体、细胞器基因组（例如线粒体的、叶绿体的）、或感染性病毒基因组中。感兴趣区域可以在基因的编码区内、转录的非编码区（诸如例如前导序列、尾随序列或内含子）内、或非转录区（或是编码区上游或是编码区下游）内。感兴趣区域的长度可以小至单个核苷酸对或高达25,000个核苷酸对，或任何整数值的核苷酸对。
术语“可操作连接”关于两个或更多个构件（诸如序列元件）并列时可互换使用，其中对所述构件进行排列使得两个构件都正常发挥功能，并容许所述构件中至少一个可以介导施加于其它构件中至少一个的功能的可能性。举例而言，若转录调节序列在应答一种或多种转录调节因子存在与否时控制编码序列的转录水平，则该转录调节序列（诸如启动子）可操作连接至该编码序列。转录调节序列一般顺式地与编码序列可操作连接，但不需直接与其邻近。例如，增强子是与编码序列可操作连接的转录调节序列，即使它们不是连续的。
关于融合多肽，术语“可操作连接”可以指每个构件在连接另一个构件时执行的功能与其在不如此连接时其会执行的功能相同的实情。例如，关于其中ZFP DNA结合结构域融合至切割结构域的融合多肽，如果在该融合多肽中，ZFP DNA结合结构域部分能够结合其靶位点和/或其结合位点，而切割结构域能够切割靶位点附近的DNA，那么该ZFP DNA结合结构域和该切割结构域是可操作连接的。
蛋白质、多肽或核酸的“功能性片段”指其序列与全长蛋白质、多肽或核酸不同，但仍保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同功能的蛋白质、多肽或核酸。功能性片段可以拥有与相应天然分子相比更多、更少或相同的残基数目，和/或可以包含一处或多处氨基酸或核苷酸替代。用于测定核酸功能（例如编码功能、与另一核酸杂交的能力）的方法是本领域公知的。类似地，用于测定蛋白质功能的方法是公知的。例如，多肽结合DNA的功能可以通过例如滤器结合(filter-binding)、电泳迁移率变动、或免疫沉淀测定法来测定。对DNA的切割可以通过凝胶电泳来测定。参见Ausubel等，见上文。一种蛋白质与另一种蛋白质相互作用的能力可以通过例如免疫共沉淀、双杂交测定法或互补（遗传的和生化的两者）来测定。参见例如Fields等,(1989) Nature340:245-246；美国专利No.5,585,245及PCT WO98/44350。
锌指结合结构域
本文中所描述的是非规范锌指结合结构域和编码这些锌指结合结构域的多核苷酸。在某些实施方案中，本文所述非规范锌指结合结构域是C3H锌指，其中两个保守的锌配位组氨酸残基之一被转换为半胱氨酸。在别的实施实施方案中，最C端的组氨酸残基被转换为半胱氨酸残基，生成“CCHC蛋白”。
锌指结合结构域可包含一个或多个锌指（例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多个锌指），而且可被改造成结合任何靶序列（例如基因组序列）。锌指结合结构域可结合DNA、RNA和/或蛋白质。典型地，单个锌指结构域的长度为约30个氨基酸。锌指包括规范C2H2锌指（即那些其中锌离子由两个半胱氨酸和两个组氨酸残基配位的锌指）和非规范锌指（包括例如C3H锌指，即那些其中锌离子由三个半胱氨酸残基和一个组氨酸残基配位的锌指）两者。还可参见美国专利申请No.20030108880；20060246567；和20060246588，通过提及而收录它们的公开内容。
结构研究已经证实，规范锌指结构域（基序）包含两个β片层（保持在包含两个不变的半胱氨酸残基的β转角中）和一个α螺旋（包含两个不变的组氨酸残基），它们通过两个半胱氨酸和两个组氨酸配位锌原子而以特定的构象保持。本文中所公开的非规范锌指保持这种β-β-α结构。
本文所述非规范锌指可以是天然存在锌指结合结构域。然而，更典型地，本文所述非规范锌指包括一个或多个如下锌指构件，其中已经用一个或多个氨基酸替换至少一个锌配位半胱氨酸或组氨酸残基。例如，在某些实施方案中，用Cys残基替换规范锌指结合模块的C端His残基。
本文所述CCHC锌指还可包含氨基酸残基序列中除锌配位残基外的一处或多处改变（相对于天然存在C2H2锌指序列）。此类改变可包含替代、删除、和/或插入。可在锌指中任何地方改变氨基酸。改变的非限制性例子包括：(1)被改变的锌配位残基周围的单个残基替代；(2)被改变的锌配位残基之前或之后的额外残基插入，（例如在最C端的His残基被转换为Cys的情况中，额外氨基酸残基的添加可通过补偿较短的半胱氨酸侧链而促进锌配位）；和/或(3)将位于天然存在CCHC锌指的His和Cys残基间的残基替换至非规范CCHC锌指的相应区域中。
在某些实施方案中，本文所述锌指蛋白包含至少一个锌指，其包括非规范（非C2H2）锌指，其中非规范锌指具有牵涉DNA结合的螺旋部分且其中螺旋部分的锌配位区包含氨基酸序列HX1X2RCXL(SEQ ID NO:2)；且其中锌指蛋白被改造成结合靶序列。在某些实施方案中，X1是A或K或T；X2是Q或E或R；而XL是G。
在其它实施方案中，本文所述非规范锌指具有一般结构：Cys-(XA)2-4-Cys-(XB)12-His-(XC)3-5-Cys-(XD)1-10(SEQ ID NO:3)，其中XA、XB、XC和XD代表任何氨基酸。在XC包含3个残基的实施方案中，(i)与规范CCHC锌指相比，改变这些残基中至少一个；和/或(ii)XD包含与规范CCHH锌指相比的至少一处删除、替代或插入。在某些实施方案中，XD包含序列QLV或QKP。在其它实施方案中，XD包含一个或多个（例如1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、或10个）Gly(G)残基。
在表1、表2、表3和表4中显示了例示性非规范锌指的部分氨基酸序列（在第3个锌配位残基的C端并包括第3个锌配位残基）。在所有的表中，两个最C端（即第3个和第4个）锌配位残基(H和C)加了下划线。以双下划线显示了与“野生型”非规范指序列（表1和表3的第2行）相比的改变（例如替代、插入、删除）。
表1
Figure BDA0000418219450000221
Figure BDA0000418219450000231
表2
Figure BDA0000418219450000232
Figure BDA0000418219450000241
Figure BDA0000418219450000251
表3
Figure BDA0000418219450000253
表4
Figure BDA0000418219450000252
如上文所述，ZFP可包括任何数目的锌指结合结构域，例如至少3个锌指。此外，一个、超过一个、或所有锌指可以是本文所述非规范锌指。
在某些实施方案中，多个指的锌指蛋白的最C端指包含规范锌指。在其它实施方案中，多个指的锌指蛋白的最C端指包含本文所述CCHC指，例如包含最C端锌配位Cys残基C端的一处或多处氨基酸插入的CCHC指。参见实施例1-5，其描述了4个指的锌指蛋白，其中指2(F2)和/或指4(F4)是本文所述非规范锌指。
锌指结合结构域可以改造成结合所选择的序列。参见例如Beerli等(2002)Nature Biotechnol.20:135-141;Pabo等(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313-340;Isalan等(2001)Nature Biotechnol.19:656-660;Segal等(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632-637;Choo等(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411-416。与天然存在的锌指蛋白相比，工程化锌指结合结构域可以具有新的结合特异性。改造方法包括但不限于合理设计和各种类型的选择（例如针对单个靶核苷酸序列筛选多种不同锌指序列的方法）。合理设计包括例如使用包含三联体（或四联体）核苷酸序列的数据库和各种锌指氨基酸序列，其中每种三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一种或多种氨基酸序列关联。参见例如共有的美国专利6,453,242和6,534,261。别的设计方法披露于例如美国专利6,746,838;6,785,613;6,866,997;及7,030,215。锌指结合结构域结合特异性的增强已经记载于例如共有的美国专利No.6,794,136。
例示性的选择方法（包括噬菌体展示和双杂交系统）披露于美国专利5,789,538;5,925,523;6,007,988;6,013,453;6,410,248;6,140,466;6,200,759;及6,242,568;以及WO98/37186;WO98/53057;WO00/27878;WO01/88197及GB2,338,237。
由于各种锌指结合3个核苷酸的（即三联体）序列（或者4个核苷酸的序列，其可以与相邻锌指的4个核苷酸的结合位点有一个核苷酸的重叠），所以锌指结合结构域改造后结合的序列（例如靶序列）长度将决定工程化锌指结合结构域中锌指的数目。例如，对于其中锌指基序不结合交叠亚位点的ZFP，6个核苷酸的靶序列由2个指的结合结构域所结合；9个核苷酸的靶序列由3个指的结合结构域所结合；等等。靶位点中锌指个体的结合位点（即亚位点）不必是连续的，而是可以由一个或数个核苷酸分开，这取决于多指结合结构域中锌指间氨基酸序列（即指间接头）的长度和性质。参见例如美国专利6,479,626;6,903,185和7,153,949及美国专利申请公开文本No.2003/0119023;通过提及而收录它们的公开内容。
在多指锌指结合结构域中，相邻的锌指可以由大约5个氨基酸的氨基酸接头序列（所谓“规范的”指间接头）或者由一个或多个非规范接头所分开。参见例如共有的美国专利No.6,453,242及6,534,261。对于包含超过三个指的工程化锌指结合结构域，在某些锌指之间插入较长的（“非规范的”）指间接头序列可提高结合结构域结合的亲和力和/或特异性。参见例如美国专利No.6,479,626和美国专利申请公开文本No.2003/0119023，通过提及而收录它们的公开内容。因而，多指锌指结合结构域还可在非规范指间接头的存在和位置方面来表征。较长指间接头的使用还可促进锌指蛋白对包含非连续核苷酸的靶位点的结合。因此，锌指结合结构域的靶位点中的一个或多个亚位点可由1、2、3、4、5或更多个核苷酸彼此分开。仅提供一个例子，4个指的结合结构域可结合13个核苷酸的靶位点，其顺次包含两个连续的3个核苷酸的亚位点、一个间插核苷酸、和两个连续的三联体亚位点。
靶亚位点是单个锌指所结合的核苷酸序列（通常为3个或4个核苷酸）。然而，靶位点不必是三个核苷酸的倍数。例如，在发生交叉链相互作用的情况中（参见例如美国专利6,453,242和6,794,136），多指结合结构域的一个或多个锌指个体可结合交叠的四联体亚位点。还可参见美国专利6,746,838和6,866,997。仅提供一个例子，3个指的结合结构域可结合10个核苷酸的靶位点，其包含三个交叠的4个核苷酸的亚位点。
可依照例如共有的美国专利No.6,453,242（2002年9月17日）中披露的方法来实现细胞染色质中锌指结构域结合序列（例如靶位点）的选择，该专利还披露了用于设计结合选定序列的ZFP的方法。对本领域技术人员清楚的是，还可通过简单目视检查核苷酸序列来选择靶位点。因而，可在本文所述方法中使用任何用于靶位点选择的手段。
多指锌指蛋白可通过连接例如通过设计或选择获得的锌指个体来构建。或者，可使用规范的或较长的、非规范的指间接头（参见上文）将由两个锌指组成的结合模块(module)彼此连接，以生成4个指和6个指的蛋白质。此类两个指的模块可通过例如在多指蛋白质（通常为3个指）的背景中选择两个相邻的、结合特定的6个核苷酸的靶序列的指来获得。参见例如WO98/53057和美国专利申请公开文本No.2003/0119023，通过提及而收录它们的公开内容。或者，两个指的模块可通过锌指个体的装配来构建。
如此，可单独使用本文所述锌指结构域或以各种组合使用本文所述锌指结构域以构建能结合任何靶位点的多指锌指蛋白。
序列（例如靶位点）间的距离指间插在两个序列之间的核苷酸或核苷酸对的数目，正如自彼此最接近的序列边缘所测量的。
在使用ZFN的实施方案中，例如其中切割作用依赖于两个锌指结构域/切割半结构域融合分子对分开的靶位点的结合，两个靶位点可在对立的DNA链上。在其它实施方案中，两个靶位点在相同的DNA链上。参见例如WO2005/084190，通过提及而收录它的公开内容。
编码锌指或锌指蛋白的多核苷酸也在本公开的范围之内。这些多核苷酸可使用标准技术来构建，并可插入载体中，而且可将该载体导入细胞中（参见下文关于载体和用于将多核苷酸导入细胞中的方法的别的公开），使得在细胞中表达所编码的蛋白质。
融合蛋白
还提供了包含一个或多个本文所述非规范锌指构件的融合蛋白。
通过本领域技术人员公知的克隆和生物化学缀合方法来构建融合分子。融合分子包含含有CCHC的ZFP和例如切割结构域、切割半结构域、转录激活结构域、转录阻抑结构域、染色质重建复合物的成分、绝缘子结构域、这些结构域之任一的功能性片段；和/或两个或更多个功能域或其片段的任何组合。
在某些实施方案中，融合分子包含改良植物锌指蛋白和至少两个功能域（例如绝缘子结构域或甲基结合蛋白结构域，和另外地，转录激活或阻抑结构域）。
任选地，融合分子还包含核定位信号（诸如例如来自SV40T抗原或玉米不透明二号(Opaque-2)NLS的）和表位标签（诸如例如FLAG或血凝素）。设计融合蛋白（和编码它们的核酸）以使得在融合物的各构件之间保持翻译读码框。
用于设计和构建融合蛋白（和编码它们的多核苷酸）的方法是本领域技术人员已知的。例如，用于设计和构建包含锌指蛋白的融合蛋白（和编码它们的多核苷酸）的方法记载于共有的美国专利6,453,242和6,534,261。
编码此类融合蛋白的多核苷酸也在本公开的范围之内。这些多核苷酸可使用标准技术来构建，并可插入载体中，而且可将该载体导入细胞中（参见下文关于载体和用于将多核苷酸导入细胞中的方法的别的公开）。
用于与ZFP DNA结合结构域融合的、要用于阻抑基因表达的例示性功能域是来自人KOX-1蛋白的KRAB阻抑结构域（参见例如Thiesen等,NewBiologist2,363-374(1990);Margolin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91,4509-4513(1994);Pengue等,Nucl.Acids Res.22:2908-2914(1994);Witzgall等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA91,4514-4518(1994)）。KOX结构域也适于用作阻抑结构域。另一种合适的阻抑结构域是甲基结合结构域蛋白2B(MBD-2B)（关于MBD蛋白的描述还可参见Hendrich等(1999)Mamm Genome10:906-912）。另一种有用的阻抑结构域是与v-ErbA蛋白结合的。参见例如Damm等(1989)Nature339:593-597;Evans(1989)Int.J.Cancer Suppl.4:26-28;Pain等(1990)New Biol.2:284-294;Sap等(1989)Nature340:242-244;Zenke等(1988)Cell52:107-119;及Zenke等(1990)Cell61:1035-1049。别的例示性阻抑结构域包括但不限于甲状腺激素受体(TR)、SID、MBD1、MBD2、MBD3、MBD4、MBD样蛋白、DNMT家族成员（例如DNMT1、DNMT3A、DNMT3B）、Rb、MeCP1和MeCP2。参见例如Zhang等(2000)Ann Rev Physiol62:439-466;Bird等(1999)Cell99:451-454;Tyler等(1999)Cell 99:443-446;Knoepfler等(1999)Cell 99:447-450;及Robertson等(2000)Nature Genet.25:338-342。别的例示性阻抑结构域包括但不限于ROM2和AtHD2A。参见例如Chern等(1996)Plant Cell8:305-321;及Wu等(2000)Plant J.22:19-27。
适于实现激活的结构域包括HSV VP16激活结构域(参见例如Hagmann等,J.Virol.71,5952-5962(1997))；核激素受体(参见例如Torchia等,Curr.Opin.Cell.Biol.10:373-383(1998))；核因子κB的p65亚基(Bitko和Barik,J.Virol.72:5610-5618(1998);Doyle和Hunt,Neuroreport8:2937-2942(1997);Liu等,Cancer Gene Ther.5:3-28(1998))；或人工嵌合功能域，诸如VP64(Seifpal等,EMBO J.11,4961-4968(1992))。
别的例示性激活结构域包括但不限于p300、CBP、PCAF、SRC1PvALF、和ERF-2。参见例如Robyr等(2000)Mol.Endocrinol.14:329-347;Collingwood等(1999)J.Mol.Endocrinol.23:255-275;Leo等(2000)Gene245:1-11;Manteuffel-Cymborowska(1999)Acta Biochim.Pol.46:77-89;McKenna等(1999)J.Steroid Biochem.Mol.Biol.69:3-12;Malik等(2000)Trends Biochem.Sci.25:277-283;及Lemon等(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:499-504。别的例示性激活结构域包括但不限于OsGAI、HALF-1、C1、AP1，ARF-5、-6、-7、和-8，CPRF1、CPRF4、MYC-RP/GP、和TRAB1。参见例如Ogawa等(2000)Gene245:21-29;Okanami等(1996)Genes Cells1:87-99;Goff等(1991)GenesDev.5:298-309;Cho等(1999)Plant Mol.Biol.40:419-429;Ulmason等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:5844-5849;Sprenger-Haussels等(2000)Plant J.22:1-8;Gong等(1999)Plant Mol.Biol.41:33-44;及Hobo等(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:15,348-15,353。
别的功能域披露于例如共有的美国专利No.6,933,113。此外，适于在融合分子中使用的绝缘子结构域、染色质重建蛋白（诸如含有ISWI的结构域）、和甲基结合结构域蛋白记载于例如共有的国际公开文本WO01/83793和WO02/26960。
在其它的实施方案中，融合蛋白是如下锌指核酸酶(ZFN)，其包含一个或多个本文所述CCHC锌指和切割结构域（或切割半结构域）。锌指可改造成识别任何选定基因组区域中的靶序列，并且在被导入细胞中之后会导致融合蛋白对其结合位点的结合，而且在所述基因组区域内或所述基因组区域附近进行切割。该切割可导致非同源末端连接之后的基因组区域的核苷酸序列改变（例如突变）。或者，若包含与基因组区域同源的序列的外源多核苷酸也存在于该细胞中，则在ZFN进行的靶向切割之后，以高比率(rate)在基因组区域和外源多核苷酸之间发生同源重组。同源重组可导致外源序列的靶向序列替换或靶向整合，这取决于外源多核苷酸的核苷酸序列。
本文所述非规范锌指在被引入ZFN后提供了改进的切割功能。如实施例中所述，包含至少一个本文所述CCHC指的4个指的ZFN至少与唯独包含CCHH指的核酸酶一样好地进行切割。在某些实施方案中，在C端指包含非规范CCHC锌指时，第3个和第4个锌配位残基之间（即C端His和Cys残基之间）的残基与那些存在于规范CCHH锌指中的残基不同，而且在C端Cys残基之后插入一个或多个甘氨酸残基（例如1、2、3、4、5或更多个）。
本文所公开的ZFN的切割结构域部分可获自任何内切核酸酶或外切核酸酶。可衍生切割结构域的例示性内切核酸酶包括但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见例如2002-2003产品目录,New England Biolabs,Beverly,MA;及Belfort等(1997)Nucleic Acids Res.25:3379-3388。别的切割DNA的酶是已知的（例如S1核酸酶；绿豆核酸酶；胰DNA酶I；微球菌核酸酶；酵母HO内切核酸酶；还可参见Linn等（编）Nucleases,Cold Spring HarborLaboratory Press,1993）。这些酶（或其功能性片段）中的一种或多种可以作为切割结构域和切割半结构域的来源使用。
类似地，切割半结构域可以衍生自如上文所提出的任何核酸酶或其部分，倘若切割半结构域的切割活性需要二聚化。一般而言，如果融合蛋白包含切割半结构域，那么对基因组DNA的靶向切割需要两个融合蛋白。或者，可以使用包含两个切割半结构域的单个蛋白质。两个切割半结构域可以衍生自相同的内切核酸酶，或者每个切割半结构域可以衍生自不同的内切核酸酶。另外，两个融合蛋白的靶位点相对于彼此布置成使得两个融合蛋白与它们各自靶位点的结合以容许切割半结构域形成功能性切割结构域（例如通过二聚化）的彼此空间取向放置切割半结构域。如此，在某些实施方案中，靶位点的近边缘(near edge)由5-8个核苷酸对或由15-18个核苷酸对分开。在别的实施方案中，靶位点彼此相距10个核苷酸对之内。然而，任何整数数目的核苷酸或核苷酸对可以间插在两个靶位点之间（例如从2个至50个核苷酸或更多）。一般而言，切割点位于靶位点之间。
限制性内切核酸酶（限制酶）存在于许多物种中，而且能够序列特异性结合DNA（在识别位点处），并且在结合位点处或接近结合位点处切割DNA。某些限制酶（例如IIS型）在与识别位点远离的位点切割DNA，而且具有可分的结合和切割结构域。例如，IIS型酶Fok I催化对DNA的双链切割，在一条链上距离其识别位点9个核苷酸处而在另一条上距离其识别位点13个核苷酸处进行。参见例如美国专利5,356,802;5,436,150及5,487,994;以及Li等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4275-4279;Li等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2764-2768;Kim等(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883-887;Kim等(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978-31,982。如此，在一个实施方案中，融合蛋白包含来自至少一种IIS型限制酶的切割结构域（或切割半结构域）和一个或多个锌指结合结构域（其可以是改造的或未改造的）。
切割结构域与结合结构域是可分的例示性IIS型限制酶是Fok I。这种特定的酶作为二聚体是有活性的。Bitinaite等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10,570-10,575。因而，为了本公开的目的，认为所公开融合蛋白中所使用的Fok I酶部分是切割半结构域。如此，对于使用包含锌指的ZFN-Fok I融合物来对细胞序列进行的靶向双链切割和/或靶向替换，可以使用两个融合蛋白（每个包含Fok I切割半结构域）来重建具有催化活性的切割结构域。或者，也可以使用包含一个锌指结合结构域和两个Fok I切割半结构域的单个多肽分子。使用锌指-Fok I融合物来进行靶向切割和靶向序列改变的参数提供于本公开的别处和例如美国专利申请公开文本No.2005/0064474，通过提及而收录它们的公开内容。
在别的实施方案中，Fok I切割半结构域可包括一处或多处任何影响二聚化的氨基酸残基处的突变。此类突变可用于阻止一对ZFP/Fok I融合物之一经历可导致在不想要序列处进行切割的同二聚化。例如，Fok I的第446位、第447位、第479位、第483位、第484位、第486位、第487位、第490位、第491位、第496位、第498位、第499位、第500位、第531位、第534位、第537位、及第538位氨基酸残基均与二聚化界面足够接近以影响二聚化。因而，可使用一处或多处上述位置的氨基酸序列改变来改变切割半结构域的二聚化特性。可以通过例如构建在这些位置含有（或编码）不同氨基酸残基的文库并选择具有期望特性的变体，或者通过合理设计个别突变体来引入此类变化。在阻止同二聚化之外，还可能的是，与使用两个野生型切割半结构域所获得的切割效率相比，这些突变中的一些可以提高切割效率。
如此，对于使用一对ZFP/Fok I融合物进行的靶向切割，融合蛋白之一或二者可包含一处或多处如下氨基酸变化，其抑制自我二聚化(self-dimerization)但容许发生两种融合蛋白的异二聚化，使得在想要的靶位点发生切割。在某些实施方案中，改变存在于两种融合蛋白中，并且改变具有叠加效应；即，使导致异常切割的任一融合物同二聚化最小化或消除，而与使用野生型切割半结构域获得的异二聚化相比，促进了所述两种融合蛋白的异二聚化。
在某些实施方案中，切割结构域包含两个切割半结构域（两者都是包含结合结构域的单个多肽的一部分），即第一切割半结构域和第二切割半结构域。切割半结构域可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，只要它们发挥切割DNA的功能。
切割半结构域还可以在分开的分子中提供。例如，可在细胞中表达两种融合多肽，其中每种多肽包含结合结构域和切割半结构域。切割半结构域可具有相同的氨基酸序列或不同的氨基酸序列，只要它们发挥切割DNA的功能。此外，结合结构域结合靶序列，其典型地以如下方式布置，使得融合多肽结合后，两个切割半结构域以容许切割结构域重建（例如通过半结构域的二聚化）的彼此空间取向呈现，由此将半结构域相对于彼此放置以形成功能性切割结构域，导致对感兴趣区域中细胞染色质的切割。一般而言，由重建的切割结构域所进行的切割发生在位于两个靶序列之间的位点处。蛋白质之一或二者可以改造成结合其靶位点。
两种融合蛋白在细胞中的表达可以源自将所述两种蛋白质投递至所述细胞；将一种蛋白质和编码所述蛋白质之一的一种核酸投递至所述细胞；将两种各编码所述蛋白质之一的核酸投递至所述细胞；或通过将编码两种蛋白质的单一核酸投递至所述细胞。在别的实施方案中，融合蛋白包含单条多肽链，其包含两个切割半结构域和一个锌指结合结构域。在这种情况中，在细胞中表达单一融合蛋白，并且（在不希望被理论限制的前提下）认为其由于形成切割半结构域的分子内二聚体而切割DNA。
在某些实施方案中，将ZFP的构件排列成使得锌指结构域距离融合蛋白的氨基端最近，并使得切割半结构域距离羧基端最近。这反映了天然存在的二聚化切割结构域（诸如那些衍生自Fok I酶的）中切割结构域的相对取向，其中DNA结合结构域距离氨基末端最近而切割半结构域距离羧基末端最近。在这些实施方案中，切割半结构域二聚化而形成功能性核酸酶是通过融合蛋白结合至对立DNA链上的位点而引起的，其中结合位点的5’端彼此接近。
在这种取向中，最C端的锌指接近Fok I切割半结构域。先前已经确定，在CCHC型锌指以最C端指存在时，非规范锌指蛋白最高效地结合其DNA靶物。因此，有可能的是，与Fok I切割半结构域接近的先前所述CCHC型锌指的存在抑制其功能。若情况如此，则本公开的经过优化的CCHC锌指显然没有展现出此假定的抑制活性。
在别的实施方案中，将融合蛋白（例如ZFP-Fok I融合物）的构件排列成使得切割半结构域距离融合蛋白的氨基末端最近且锌指结构域距离羧基末端最近。在这些实施方案中，切割半结构域二聚化而形成功能性核酸酶是通过融合蛋白结合至对立DNA链上的位点而引起的，其中结合位点的3’端彼此接近。
在别的实施方案中，第一融合蛋白包含距离该融合蛋白的氨基末端最近的切割半结构域和距离羧基末端最近的锌指结构域，并将第二融合蛋白排列成使得锌指结构域距离该融合蛋白的氨基末端最近且切割半结构域距离羧基末端最近。在这些实施方案中，两种融合蛋白结合相同的DNA链，其中包含距离羧基末端最近的锌指结构域的第一融合蛋白的结合位点位于包含距离氨基末端最近的锌指结构域的第二融合蛋白的结合位点的5’侧。还可参见WO2005/084190，通过提及收录其公开内容。
锌指结构域和切割结构域（或切割半结构域）之间的氨基酸序列称为“ZC接头”。ZC接头与上文所述指间接头有所区别。关于获得优化切割的ZC接头的详情参见例如美国专利公开文本20050064474A1和20030232410，及国际专利公开文本WO2005/084190，通过提及而收录它们的公开内容。
表达载体
可以将编码一种或多种ZFP或ZFP融合蛋白（例如ZFN）的核酸克隆入载体中，用以转化入原核细胞或真核细胞中以复制和/或表达。载体可以是原核载体或真核载体，包括但不限于质粒、穿梭载体、昆虫载体、二元载体（参见例如美国专利No.4,940,838;Horsch等(1984)Science233:496-498,及Fraley等(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA80:4803）等。也可以将编码ZFP的核酸克隆入表达载体中，用于给植物细胞施用。
为了表达融合蛋白，典型地将编码ZFP或ZFP融合物的序列亚克隆入含有指导转录的启动子的表达载体中。合适的细菌和真核启动子在本领域是公知的，并记载于例如Sambrook等,Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第2版,1989;第3版,2001);Kriegler,Gene Transfer and Expression:A LaboratoryManual(1990)；及Current Protocols in Molecular Biology（Ausubel等,见上文）。在例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和沙门氏菌属(Salmonella)中可以获得用于表达ZFP的细菌表达系统(Palva等,Gene22:229-235(1983))。这些表达系统的试剂盒是商品化的。用于哺乳动物细胞、酵母和昆虫细胞的真核表达系统对于本领域技术人员是公知的，而且也是商品化的。
用于指导编码ZFP的核酸表达的启动子取决于特定的应用。例如，典型地使用适合于宿主细胞的强组成型启动子来表达和纯化ZFP。
比较而言，在体内施用ZFP以调节植物基因时（参见下文“将核酸投递至植物细胞”部分），使用组成型或诱导型启动子，这取决于ZFP的特定用途。植物启动子的非限制性例子包括自下组衍生的启动子序列：拟南芥(A.thaliana)遍在蛋白-3(ubi-3)(Callis等,1990,J.Biol.Chem.265:12486-12493)；根癌土壤杆菌(A.tumifaciens)甘露碱合酶(Δmas)(Petolino等,美国专利No.6,730,824)；和/或木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)(Verdaguer等,1996,Plant Molecular Biology31:1129-1139)。还可参见实施例。
在启动子之外，表达载体典型地包含转录单元或表达盒，其包含在宿主细胞（或是原核的或是真核的）中表达核酸所需的所有别的元件。如此，典型的表达盒包含与例如编码ZFP的核酸序列可操作连接的启动子，及所需的信号，例如用于转录物的有效聚腺苷酸化、转录终止、核糖体结合位点、或翻译终止。该盒的别的元件可以包括例如增强子，及异源剪接信号。
根据ZFP的预定用途，例如在植物、动物、细菌、真菌、原生动物等中表达，来选择用于将遗传信息转运入细胞中的特定表达载体（参见下文所述表达载体）。标准的细菌和动物表达载体在本领域中是已知的，并详细记载于例如美国专利公开文本20050064474A1及国际专利公开文本WO05/084190；WO05/014791；和WO03/080809，通过提及而收录它们的公开内容。
可以使用标准转染方法来产生表达大量蛋白质的细菌、哺乳动物、酵母或昆虫细胞系，然后可以使用标准技术来纯化所述蛋白质（参见例如Colley等,J.Biol.Chem.264:17619-17622(1989);Guide to Protein Purification,于Methods in Enzymology,卷182(Deutscher编,1990)）。真核细胞和原核细胞的转化依照标准技术实施（参见例如Morrison,J.Bact.132:349-351(1977);Clark-Curtiss和Curtiss,Methods in Enzymology101:347-362(Wu等编,1983)）。
可以使用任何用于将外来核苷酸序列导入此类宿主细胞中的公知规程。这些包括使用磷酸钙转染、Polybrene、原生质体融合、电穿孔、超声方法（例如声穿孔(sonoporation)）、脂质体、显微注射、裸DNA、质粒载体、病毒载体（附加体型的和整合型的两种）、及任何用于将所克隆的基因组DNA、cDNA、合成DNA或其它外来遗传物质导入宿主细胞中的其它公知方法（参见例如Sambrook等，见上文）。唯一必须的是，所使用的特定遗传工程规程能够成功地将至少一种基因导入能够表达选定蛋白质的宿主细胞中。
将核酸投递至植物细胞
如上文所述，DNA构建体可以通过多种常规技术来导入期望的植物宿主中（例如导入其基因组中）。对于此类技术的综述，参见例如Weissbach和Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology(1988,Academic Press,N.Y.)节VIII,页421-463;及Grierson和Corey,Plant Molecular Biology(1988,第2版),Blackie,London,章7-9。
例如，DNA构建体可以使用诸如电穿孔和显微注射植物细胞原生质体等技术来导入植物细胞中，或者DNA构建体可以使用生物射弹法(biolisticmethod)来直接导入植物组织中，诸如DNA粒子轰击（参见例如Klein等(1987)Nature327:7073）。或者，DNA构建体可以与合适的T-DNA侧翼区组合，并导入常规的根癌土壤杆菌宿主载体中。根癌土壤杆菌介导的转化技术（包括二元载体的使用和消除(disarming)）完全记载于科学文献中。参见例如Horsch等(1984)Science233:496498,及Fraley等(1983)Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA80:4803。
此外，基因转移可以使用非土壤杆菌属的细菌或病毒（诸如根瘤菌NGR234(Rhizobium sp.NGR234)、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizoboium meliloti)、百脉根中生根瘤菌(Mesorhizobium loti)、马铃薯X病毒、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒和/或烟草花叶病毒）来实现。参见例如Chung等(2006)Trends Plant Sci.11(1):1-4。
根癌土壤杆菌宿主的毒力功能会在使用二元T DNA载体(Bevan(1984)Nuc.Acid Res.12:8711-8721)或共培养规程(Horsch等(1985)Science227:1229-1231)由所述细菌感染所述细胞后指导构建体和邻近标志物插入植物细胞DNA中。一般而言，使用土壤杆菌属转化系统来改造双子叶植物(Bevan等(1982)Ann.Rev.Genet16:357-384;Rogers等(1986)MethodsEnzymol.118:627-641)。土壤杆菌属转化系统还可以用于转化以及转移DNA至单子叶植物和植物细胞。参见美国专利No.5,591,616;Hernalsteen等(1984)EMBO J3:3039-3041;Hooykass Van Slogteren等(1984)Nature311:763-764;Grimsley等(1987)Nature325:1677-179;Boulton等(1989)Plant Mol.Biol.12:31-40;及Gould等(1991)Plant Physiol.95:426-434。
备选的基因转移和转化方法包括但不限于通过钙、聚乙二醇(PEG)或电穿孔介导的裸DNA摄取进行的原生质体转化（参见Paszkowski等(1984)EMBO J3:2717-2722;Potrykus等(1985)Molec.Gen.Genet.199:169-177;Fromm等(1985)Proc.Nat.Acad.Sci.USA82:5824-5828;及Shimamoto(1989)Nature338:274-276）和植物组织的电穿孔(D’Halluin等(1992)Plant Cell4:1495-1505)。用于植物细胞转化的别的方法包括显微注射、碳化硅介导的DNA摄取(Kaeppler等(1990)Plant Cell Reporter9:415-418)、及微粒轰击(参见Klein等(1988)Proc.Nat.Acad.Sci.USA85:4305-4309;及Gordon-Kamm等(1990)Plant Cell2:603-618)。
所公开的方法和组合物可以用于将外源序列插入植物细胞基因组中预定的位置。这是有用的，因为导入植物基因组中的转基因的表达关键取决于其整合位点。因而，编码例如养分、抗生素或治疗性分子的基因可以通过靶向重组而插入植物基因组中有利于其表达的区域。
可以培养通过任何上述转化技术产生的转化植物细胞以再生拥有所转化的基因型和因此期望的表型的完整植株。此类再生技术依赖于组织培养生长培养基中某些植物激素的操作，典型地依赖于已经与期望的核苷酸序列一起导入的生物杀灭剂和/或除草剂标志物。从培养的原生质体再生植物记载于Evans等,“Protoplasts Isolation and Culture”于Handbook of Plant Cell Culture,pp.124-176,Macmillian Publishing Company,New York,1983;及Binding,Regeneration of Plants,Plant Protoplasts,pp.21-73,CRC Press,Boca Raton,1985。还可以从植物胼胝体(callus)、外植体、器官、花粉、胚或其部分获得再生。此类再生技术一般性地记载于Klee等(1987)Ann.Rev.of Plant Phys.38:467-486。
导入植物细胞中的核酸可用于赋予基本上任何植物以期望性状。可以使用本公开的核酸构建体和上述各种转化方法来对极其多种植物和植物细胞系统改造本文所述期望的生理学和农学特征。在某些实施方案中，用于改造的目标植物和植物细胞包括不限于那些单子叶和双子叶植物，诸如农作物，其包括谷类作物（例如小麦、玉米、稻、黍(millet)、大麦）、水果作物（例如番茄、苹果、梨、草莓、柑/桔/橙）、草料作物（例如苜蓿）、根菜作物(rootvegetable crop)（例如胡萝卜、马铃薯、甜菜、薯蓣）、叶菜作物(leafy vegetablecrop)（例如莴苣、菠菜）；有花植物（例如矮牵牛、蔷薇/玫瑰、菊）、松柏植物和松树（例如冷杉(pine fir)、云杉）；用于植物除污(phytoremediation)的植物（例如重金属积累植物(heavy metal accumulating plant)）；油料作物（例如向日葵、油菜籽）和用于实验目的的植物（例如拟南芥属）。如此，所公开的方法和组合物在广泛的植物上有用途，其包括但不限于来自如下属的物种：天门冬属(Asparagus)、燕麦属(Avena)、芸苔属(Brassica)、柑橘属(Citrus)、西瓜属(Citrullus)、辣椒属(Capsicum)、南瓜属(Cucurbita)、胡萝卜属(Daucus)、大豆属(Glycine)、棉属(Gossypium)、大麦属(Hordeum)、莴苣属(Lactuca)、番茄属(Lycopersicon)、苹果属(Malus)、木薯属(Manihot)、烟草属(Nicotiana)、稻属(Oryza)、鳄梨属(Persea)、豌豆属(Pisum)、梨属(Pyrus)、李属(Prunus)、萝卜属(Raphanus)、黑麦属(Secale)、茄属(Solanum)、高粱属(Sorghum)、小麦属(Triticum)、葡萄属(Vitis)、豇豆属(Vigna)、及玉蜀黍属(Zea)。
本领域技术人员会认可的是，在表达盒被稳定掺入转基因植物中并证实是可操作的后，其可以通过有性杂交而导入其它植物中。可以使用许多标准育种技术之任一种，这取决于待杂交的物种。
经转化的植物细胞、胼胝体、组织或植株可以通过对改造后的植物材料选择或筛选由所转化DNA上存在的标志基因所编码的性状来鉴定和分离。例如，可以如下实施选择，即将改造后的植物材料在含有抑制量抗生素或除草剂的培养基上培养，所转化基因构建体赋予对所述抗生素或除草剂的抗性。此外，经转化的植物和植物细胞还可以通过筛选可以存在于重组核酸构建体上的任何可见标志基因（例如β-葡糖醛酸糖苷酶、萤光素酶、B或C1基因）的活性来鉴定。此类选择和筛选方法对于本领域技术人员是公知的。
也可以使用物理和生物化学方法来鉴定含有所插入的基因构建体的植物或植物细胞转化体。这些方法包括但不限于：1)Sourthern分析或PCR扩增，用于检测和测定重组DNA插入物的结构；2)Northern印迹、S1RNA酶保护、引物延伸或反转录酶-PCR扩增，用于检测和检查基因构建体的RNA转录物；3)酶测定法，用于检测酶或核酶活性，其中此类基因产物由基因构建体编码；4)蛋白质凝胶电泳、Western印迹技术、免疫沉淀、或酶联免疫测定法，其中基因构建体产物是蛋白质。也可以使用别的技术（诸如原位杂交、酶染色、及免疫染色）来检测重组构建体在特定植物器官和组织中的存在或表达。用于进行所有这些测定法的方法对于本领域技术人员是公知的。
使用本文所公开方法进行的基因操作的效果可以通过例如自感兴趣组织分离的RNA（例如mRNA）的Northern印迹来观察。典型地，如果mRNA的量增加了，那么可以认为相应的内源基因正以比之前更快的速率表达。可以使用测量基因和/或CYP74B活性的其它方法。可以使用不同类型的酶测定法，取决于使用的底物和检测反应产物或副产物增加或减少的方法。另外，所表达的蛋白质和/或CYP74B蛋白的水平可以通过免疫化学方法测量，即ELISA、RIA、EIA及对于本领域技术人员公知的其它基于抗体的测定法，诸如通过电泳检测测定法（或是使用染色或是使用Western印迹）。转基因可以在植物的一些组织中或在一些发育阶段选择性表达，或者转基因可以在基本上所有的植物组织中，基本上在其整个生命周期中表达。然而，任何组合表达模式也是可应用的。
本公开还涵盖上文所述转基因植物的种子，其中所述种子具有转基因或基因构建体。本公开还涵盖上述转基因植物的后代、克隆、细胞系或细胞，其中所述后代、克隆、细胞系或细胞具有所述转基因或基因构建体。
ZFP和编码ZFP的表达载体可以直接给植物施用，用于靶向切割和/或重组。
有效量的施用通过通常用于导入ZFP并最终与待处理的植物细胞接触的任何路径进行。以任何合适的方式施用ZFP。施用此类组合物的合适方法是可获得的，并且对于本领域技术人员是公知的，并且虽然可以使用超过一种的路径来施用特定的组合物，但是特定的路径通常可以提供比另一种路径更及时(immediate)且更有效的反应。
还可以使用载体，并且其部分根据正在施用的特定组合物，以及根据用于施用该组合物的特定方法来决定。因而，存有可使用的极其多种合适的药物组合物配制剂（参见例如Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,1985)）。
应用
包含一个或多个本文所述非规范锌指的锌指蛋白可用于目前使用规范C2H2ZFP进行的所有基因组调控和编辑应用，包括但不限于：基因激活；基因阻抑；基因组编辑（切割、靶向插入、替换或删除）；和外因基因组编辑（经由组蛋白或DNA的共价修饰的靶向）。
包含本文所公开非规范锌指的ZFN可用于切割细胞染色质中感兴趣区域处的DNA（例如在基因组中想要的或预定的位点处，例如在突变型或野生型的基因中）。对于此类靶向DNA切割，锌指结合结构域改造成结合预定切割位点处或附近的靶位点，并在细胞中表达包含工程化锌指结合结构域和切割结构域的融合蛋白。在融合蛋白的锌指部分结合至靶位点后，通过切割结构域在靶位点附近切割DNA。切割的准确位点可取决于ZC接头的长度。
或者，在细胞中表达两种各包含锌指结合结构域和切割半结构域的ZFN，并结合至靶位点，其以使得功能性切割结构域得以重建且DNA在靶位点附近得以切割的方式并列。在一个实施方案中，切割发生在两个锌指结合结构域的靶位点之间。锌指结合结构域之一或二者可以进行改造。
对于使用锌指结合结构域-切割结构域融合多肽进行的靶向切割，结合位点可以涵盖切割位点，或者结合位点的近边缘可以距离切割位点1个、2个、3个、4个、5个、6个、10个、25个、50个或更多核苷酸（或介于1个和50个核苷酸之间的任何整数值）。结合位点相对于切割位点的准确位置会取决于特定的切割结构域和ZC接头的长度。对于其中使用两种各包含锌指结合结构域和切割半结构域的融合蛋白的方法，结合位点一般跨越切割位点。如此，第一结合位点的近边缘可以是切割位点一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、10个、25个或更多核苷酸（或介于1个和50个核苷酸之间的任何整数值），而第二结合位点的近边缘可以是切割位点另一侧的1个、2个、3个、4个、5个、6个、10个、25个或更多核苷酸（或介于1个和50个核苷酸之间的任何整数值）。用于在体外和在体内对切割位点作图的方法对本领域技术人员是已知的。
一旦导入靶细胞中或在靶细胞中表达，融合蛋白结合至靶序列，并在靶序列处或附近进行切割。切割的准确位点取决于切割结构域的性质和/或结合和切割结构域之间的接头序列的存在和/或性质。在其中使用两种各包含切割半结构域的ZFN的情况中，结合位点的近边缘之间的距离可以是1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、25个或更多核苷酸（或介于1个和50个核苷酸之间的任何整数值）。切割作用的最佳水平还可以取决于两个ZFN的结合位点之间的距离（参见例如Smith等(2000)Nucleic Acids Res.28:3361-3369;Bibikova等(2001)Mol.Cell.Biol.21:289-297）和每个ZFN中ZC接头的长度两者。还可参见美国专利公开文本20050064474A1和国际专利公开文本WO05/084190；WO05/014791；和WO03/080809，通过提及而收录它们的公开内容。
两个各包含切割半结构域的ZFN可以在感兴趣区域中以相同的或对立的极性结合，而且它们的结合位点（即靶位点）可以由任何数目的核苷酸（例如从0至50个核苷酸对或其间的任何整数值）分开。在某些实施方案中，两个各包含锌指结合结构域和切割半结构域的融合蛋白的结合位点可以相距介于5个和18个核苷酸对之间，例如相距5-8个核苷酸对，或相距15-18个核苷酸对，或相距6个核苷酸对，或相距16个核苷酸对，或彼此相距10个核苷酸对之内，正如根据各结合位点与另一结合位点最接近的边缘所测量的，并且切割发生在结合位点之间。
对DNA进行切割所在的位点一般位于两个融合蛋白的结合位点之间。DNA的双链断裂通常源自两个偏移(offset)1个、2个、3个、4个、5个、6个或更多核苷酸的单链断裂(break)或“切口”(nick)（例如天然Fok I对双链DNA的切割源自偏移4个核苷酸的单链断裂）。如此，切割不必在每条DNA链上恰好对立的位点发生。另外，融合蛋白的结构和靶位点间的距离可影响切割是否邻近单个核苷酸对发生，或切割是否在数个位点发生。然而，对于许多应用（包括靶向重组和靶向诱变），一定范围核苷酸内的切割一般是足够的，并且不需要特定碱基对间的切割。
如上文所述，将多肽和/或多核苷酸导入细胞中之后可在细胞中表达一种或多种融合蛋白。例如，可以将两种各包含编码上述多肽之一的序列的多核苷酸导入细胞中，并在多肽表达且各多肽结合至其靶序列后，在靶序列处或附近发生切割。或者，将包含编码两种融合多肽的序列的单个多核苷酸导入细胞中。多核苷酸可以是DNA、RNA或DNA和/或RNA的任何修饰形式或类似物。
在某些实施方案中，基因组区域中由ZFN进行的靶向切割导致在通过非同源末端连接(NHEJ)修复该切割事件后该区域核苷酸序列的改变。
在其它实施方案中，基因组区域中由ZFN进行的靶向切割还可以是如下规程的一部分，在所述规程中经由同源性依赖性机制用同源但不相同的序列替换基因组序列（例如细胞染色质中的感兴趣区域）（即通过靶向重组）（例如包含外源序列以及一段或多段与预定基因组序列（即靶位点）相同或同源但不相同的序列的供体序列的插入）。因为细胞DNA中的双链断裂在切割位点附近刺激细胞修复机制达数千倍，用本文所述ZFN进行的靶向切割容许基因组中实际上任何位点的序列改变或替换（经由同源性指导的修复）。
在本文所述ZFN外，选定基因组序列的靶向替换还需要导入外源（供体）多核苷酸。可以将供体多核苷酸在表达ZFN之前、同时、或之后导入细胞中。供体多核苷酸与基因组序列含有足够的同源性以支持其和与其具有同源性的基因组序列之间的同源重组（或同源性指导的修复）。大约25个、50个、100个、200个、500个、750个、1,000个、1,500个、2,000个核苷酸或更多的序列同源性（或介于10个和2,000个核苷酸间的任何整数值，或更多）会支持同源重组。供体多核苷酸的长度范围可以从10至5,000个核苷酸（或其间核苷酸的任何整数值）或更长。
显而易见的是，典型地，供体多核苷酸的核苷酸序列与其替换的基因组序列不相同。例如，供体多核苷酸的序列可以含有一个或多个相对于基因组序列的替换、插入、删除、倒位或重排，只要与染色体序列存在足够的同源性。此类序列变化可以是任何大小，而且可以小至单个核苷酸对。或者，供体多核苷酸可以包含侧翼为两个同源性区域的非同源序列（即外源序列，其与外源多核苷酸相区别）。另外，供体多核苷酸可构成载体分子，其含有与细胞染色质中感兴趣区域没有同源性的序列。一般而言，供体多核苷酸的同源区与期望重组的基因组序列会具有至少50%的序列同一性。在某些实施方案中，存在60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%、或99.9%的序列同一性。可以存在介于1%和100%序列同一性之间的任何数值，这取决于供体多核苷酸的长度。
供体分子可以包含数个与细胞染色质具有同源性的不连续区域。例如，对于靶向插入正常情况下不存在于感兴趣区域中的序列，所述序列可以存在于供体核酸分子中，并且其侧翼为与感兴趣区域中的序列具有同源性的区域。
为了简化用于确定来自供体多核苷酸的序列得到成功插入的测定法（例如杂交、PCR、限制酶消化），供体序列中可以存在与基因组序列相比的某些序列差异。优选地，如果位于编码区中，那么此类核苷酸序列差异不会改变氨基酸序列，或者会产生沉默的氨基酸变化（即不影响蛋白质结构或功能的变化）。供体多核苷酸可以任选地包含感兴趣区域中与锌指结构域结合位点对应的序列中的变化，以阻止对已经通过同源重组而导入细胞染色质中的供体序列的切割。
可以将多核苷酸作为载体分子的一部分导入细胞中，所述载体分子具有别的序列，诸如例如复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因。此外，可以裸核酸形式、以与试剂（诸如脂质体或Poloxamer）复合的核酸形式来导入供体多核苷酸，或者可以通过细菌或病毒（例如土壤杆菌属、根瘤菌NGR234、苜蓿中华根瘤菌、百脉根中生根瘤菌、烟草花叶病毒、马铃薯X病毒、花椰菜花叶病毒和木薯叶脉花叶病毒）来投递供体多核苷酸。参见例如Chung等(2006)Trends Plant Sci.11(1):1-4。
对于染色体序列的改变，不必将供体的全部序列拷贝到染色体中，只要拷贝的供体序列足以实现期望的序列改变。
通过同源重组进行的供体序列插入的效率与细胞DNA中双链断裂和期望进行重组的位点之间的距离成反比。换言之，在双链断裂与期望进行重组的位点较近时观察到较高的同源重组效率。在不预定精确的重组位点的情况中（例如期望的重组事件可以在一段基因组序列里发生），对供体核酸的长度和序列，及切割位点进行选择以获得期望的重组事件。在期望的事件设计成改变基因组序列中单个核苷酸对的序列的情况中，在那个核苷酸对的任一侧10,000个核苷酸内切割细胞染色质。在某些实施方案中，在序列要被改变的核苷酸对的任一侧1,000个、500个、200个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个、20个、10个、5个、或2个核苷酸，或介于2个和1,000个核苷酸间的任何整数值内发生切割。
通过使用ZFN进行的基因组区域中的靶向切割，同时提供包含外源序列的外源（供体）多核苷酸，实现将外源序列靶向插入基因组区域中。典型地，供体多核苷酸还包含外源序列侧翼的序列，其与基因组区域含有的同源性足以支持基因组序列中双链断裂的同源性指导的修复，由此将外源序列插入基因组区域中。因此，供体核酸可以是足以支持通过同源性依赖性修复机制（例如同源重组）而整合外源序列的任何大小。不希望被任何具体理论限制，认为外源序列侧翼的同源性区域给断裂的染色体末端提供了用于再合成双链断裂位点处遗传信息的模板。
上文所述外源序列的靶向整合可用于在选定染色体位置插入标志基因。标志基因包括但不限于编码介导抗生素抗性（例如氨苄青霉素抗性、新霉素抗性、G418抗性、嘌呤霉素抗性）的蛋白质的序列，编码有色的或荧光的或发光的蛋白质（例如绿色荧光蛋白、增强型绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、萤光素酶），及介导增强的细胞生长和/或基因扩增的蛋白质（例如二氢叶酸还原酶）的序列。如此，例示性标志基因包括但不限于β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)、膦丝菌素N-乙酰转移酶(PAT,BAR)、新霉素磷酸转移酶、β-内酰胺酶、儿茶酚双加氧酶、α-淀粉酶、酪氨酸酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、水母发光蛋白、EPSP合酶、腈水解酶、乙酰乳酸合酶(ALS)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、茅草枯脱卤素酶、和邻氨基苯甲酸合酶。在某些实施方案中，靶向整合可用于插入RNA表达构建体，例如负责微小RNA或siRNA的受调节表达的序列。RNA表达构建体中还可以掺入启动子、增强子或别的转录调节序列。
包含锌指/核酸酶融合分子和供体DNA分子的细胞中靶向重组效率的进一步增加是如下实现的，即将细胞阻断在细胞周期的G2期，此时同源性驱动的修复过程具有最大活性。这种阻滞可以以许多方式来实现。例如，可以用例如影响细胞周期进程的药物、化合物和/或小分子来处理细胞，使得将细胞阻滞在G2期。这种类型的例示性分子包括但不限于影响微管聚合的化合物（例如长春碱(vinblastine)、诺考达唑(nocodazole)、泰素(Taxol)）、与DNA相互作用的化合物（例如顺式-铂(II)二氨二氯化物(cis-platinum(II)diaminedichloride)、顺铂(Cisplatin)、多柔比星(doxorubicin)）和/或影响DNA合成的化合物（例如胸苷、羟基脲、L-含羞草氨酸(L-mimosine)、依托泊苷(etoposide)、5-氟尿嘧啶）。重组效率的再增加是如下实现的，即使用改变染色质结构的组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂（例如丁酸钠、制滴菌素A(trichostatin A)）来使基因组DNA更易被细胞重组机器(machinery)接近。
用于细胞周期阻滞的别的方法包括过表达抑制CDK细胞周期激酶活性的蛋白质，例如通过将编码该蛋白质的cDNA导入细胞中或通过将激活编码所述蛋白质的基因表达的工程化ZFP导入细胞中来实现。细胞周期阻滞还可以如下实现，即使用例如RNAi方法（例如美国专利No.6,506,559）来抑制细胞周期蛋白和CDK的活性，或通过将如下工程化ZFP导入细胞中，所述工程化ZFP阻抑细胞周期进程中所牵涉的一种或多种基因（诸如例如细胞周期蛋白和/或CDK基因）的表达。关于合成用于调节基因表达的工程化锌指蛋白的方法参见例如共有的美国专利No.6,534,261。
如上文所述，所公开的用于靶向切割的方法和组合物可用于诱导基因组序列中的突变。靶向切割还可用于产生基因敲除（例如用于功能基因组学或靶标确认(target validation)）及用于促进序列靶向插入基因组中（即基因敲入）。可以如下实现插入，即通过同源重组或通过靶向整合来替换染色体序列，其中将侧翼为与染色体中感兴趣区域同源的序列的新序列（即感兴趣区域中不存在的序列）插在预定的靶位点。相同的方法还可以用于用突变型序列替换野生型序列，或用于将一种等位基因转换成不同的等位基因。
对所感染的或所整合的植物病原体的靶向切割可以用于治疗植物宿主中的病原体感染，例如通过对病原体的基因组进行切割使得其病原性降低或消除来实现。另外，对编码植物病毒受体的基因的靶向切割可用于阻断此类受体的表达，由此阻止植物中的病毒感染和/或病毒传播。
例示性的植物病原体包括但不限于植物病毒，诸如苜蓿花叶病毒属(Alfamovirus)、α潜隐病毒属(Alphacryptovirus)、杆状DNA病毒属(Badnavirus)、β潜隐病毒属(Betacryptovirus)、Bigeminivirus、雀麦花叶病毒属(Bromovirus)、大麦黄化花叶病毒属(Bymovirus)、毛状病毒属(Capillovirus)、香石竹病毒属(Carlavirus)、香石竹斑驳病毒属(Carmovirus)、花椰菜花叶病毒组(Caulimovirus)、长线形病毒组(Closterovirus)、豇豆花叶病毒组(Comovirus)、黄瓜花叶病毒组(Cucumovirus)、质型弹状病毒属(Cytorhabdovirus)、石竹病毒属(Dianthovirus)、碗豆耳突花叶病毒组(Enamovirus)、蚕豆萎蔫病毒组(Fabavirus)、斐济病毒属(Fijivirus)、真菌传杆状病毒组(Furovirus)、大麦病毒属(Hordeivirus)、Hybrigeminivirus、悬钩子病毒属(Idaeovirus)、烟草线条病毒组(Ilarvirus)、甘薯轻型斑驳病毒属(Ipomovirus)、大麦黄矮病毒组(Luteovirus)、玉米退绿斑驳病毒属(Machlomovirus)、橙桑花叶病毒属(Macluravirus)、玉米雷亚多非纳病毒属(Marafivirus)、Monogeminivirus、矮缩病毒属(Nanavirus)、坏死病毒属(Necrovirus)、线虫传多角体病毒组(Nepovirus)、核型弹状病毒属(Nucleorhabdovirus)、水稻病毒属(Oryzavirus)、Ourmiavirus、植物呼肠病毒(Phytoreovirus)、马铃薯X病毒组(Potexvirus)、马铃薯Y病毒组(Poteyvirus)、黑麦草花叶病毒属(Rymovirus)、卫星RNA、卫星病毒(satellivirus)、伴生病毒属(Sequivirus)、南方菜豆花叶病毒组(Sobemovirus)、纤细病毒属(Tenuivirus)、烟草花叶病毒组(Tobamovirus)、烟草脆裂病毒组(Tobravirus)、番茄丛矮病毒组(Tombusvirus)、番茄斑萎病毒属(Tospovirus)、发状病毒属(Trichovirus)、芜菁黄花叶病毒组(Tymovirus)、伞形植物病毒属(Umbravirus)、巨脉病毒属(Varicosavirus)及矮化病毒属(Waikavirus)；真菌病原体诸如黑粉菌（例如黑粉菌目(Ustilaginales)）、锈菌（锈菌目(Uredinales)）、麦角菌(Clavicepts pupurea)和霉；霉菌（卵菌纲(Oomycetes)），诸如马铃薯晚疫病菌(Phytophthora infestans)（马铃薯疫病）；细菌病原体，诸如欧文氏菌属(Erwinia)（例如草生欧文氏菌属(E.herbicola)）、假单胞菌属(Pseudomonas)（例如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、丁香假单胞菌(P.syringae)、荧光假单胞菌(P.fluorescense)和恶臭假单胞菌(P.putida)）、Ralstonia(例如R.solanacearum)、土壤杆菌属(Agrobacterium)和黄单胞菌属(Xanthomonas)；线虫（线虫纲(Nematoda)）；及Phytomyxea（Polymyxa和根种菌属(Plasmodiophora)）。
所公开的用于靶向重组的方法可用于用同源但不相同的序列替换任何基因组序列。例如，突变型基因组序列可用其野生型对应物(counterpart)替换，由此提供用于治疗植物疾病的方法；提供对植物病原体的抗性；提高作物产量等等。类似地，基因的一种等位基因可以用不同的等位基因替换，使用本文所公开的靶向重组方法进行。
在许多这些情况中，感兴趣区域包含突变，而供体多核苷酸包含相应的野生型序列。类似地，野生型基因组序列可以用突变型序列替换，如果想要这样的话。确实，以任何方式依赖于特定基因组序列的任何病理可以使用本文所公开的方法和组合物来纠正或缓和。
靶向切割和靶向重组还可以用于改变非编码序列（例如调节序列，诸如启动子、增强子、起始子、终止子、剪接位点）以改变基因产物的表达水平。此类方法可以用于例如治疗目的、细胞生理学和生物化学的改变、功能基因组学和/或靶标确认研究。
本文所述方法和组合物还可用于激活和阻抑基因表达，其使用非规范锌指结合结构域和功能域间的融合物来实现。此类方法披露于例如共有的美国专利6,534,261;6,824,978；和6,933,113，通过提及而收录它们的公开内容。别的阻抑方法包括靶向待阻抑的基因序列的反义寡核苷酸和/或小干扰RNA（siRNA或RNAi）的使用。
在别的实施方案中，在本文所公开的锌指-切割结构域融合物之外或代替本文所公开的锌指-切割结构域融合物，锌指结合结构域和重组酶（或其功能性片段）之间的一种或多种融合物可用于促进靶向重组。参见例如共有的美国专利No.6,534,261及Akopian等(2003)Proc.Natl.Acad.Sci.USA100:8688-8691。
在别的实施方案中，所公开的方法和组合物可用于提供ZFP结合结构域与转录激活或阻抑结构域的融合物，所述转录激活或阻抑结构域的活性需要二聚化（或是同二聚化或是异二聚化）。在这些情况中，融合多肽包含锌指结合结构域和功能域单体（例如来自二聚体转录激活或阻抑结构域的单体）。两个此类融合多肽与适当定位的靶位点结合容许进行二聚化，使得重建功能性转录激活或阻抑结构域。
实施例
在下述实施例中进一步解释本发明，其中除非另作说明，所有分数和百分比均按重量计，而温度按摄氏温标计。应当理解的是，虽然这些实施例指明了本发明的某些实施方案，但是其仅作为例证给出。从上文的讨论和这些实施例，本领域技术人员可确定本发明的本质特征，并且在不背离其精神和范围的前提下，可对本发明进行各种改变和修饰以使其适于各种用途和条件。
实施例1：ZFN表达载体
如下修饰美国专利公开文本2005/0064474（通过提及而收录它的公开内容）（参见该申请的实施例2）的实施例2和14中所述包含编码4个指的ZFN（称为“5-8”和“5-9”）的序列的表达载体。简言之，将5-8和5-9ZFN（其包含经由4个氨基酸的ZC接头与IIS型限制酶Fok I的核酸酶结构域（Wah等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10564-10569的序列的第384-579位氨基酸）融合的4个锌指结构域）修饰为CCHC结构。还对C端His和Cys锌配位结构间的残基和/或指2和/或指4的C端Cys的C端残基进行别的修饰（替代和插入）。
实施例2：报道细胞系中eGFP的基因校正
在Urnov(2005)Nature435(7042):646-51和美国专利公开文本No.20050064474（例如实施例6-11）所述GFP系统中测试包含本文所述CCHC锌指的ZFN促进同源重组的能力。简言之，依照Invitrogen Lipofectamine 2000方案，每个样品使用2μL Lipofectamine2000将50ng每种ZFN和500ng无启动子的GFP供体(Urnov(2005)Nature)转染入500,000个报道细胞中。
转染后24小时添加0.2μM终浓度的长春碱，并在转染后72小时除去。
转染后5天通过在Guava台式FACS分析仪上每次转染测量40,000个细胞来对细胞测定GFP表达。
如图1所示，包含上文表1和2所示经改变的CCHC锌指的大多数ZFN促进报道(GFP)基因座处的同源重组，导致高于未修饰CCHC锌指的水平的GFP表达，而且数种ZFN的性能与包含CCHH锌指的ZFN相当。性能最佳的变体在被放置于指4(F4)中时包含如下序列（在His锌配位残基的C端并包括His锌配位残基）：HAQRCGLRGSQLV(SEQ ID NO:53)（表2中称为#21且图1中以“2-21”所示的锌指）。性能最佳的变体在被放置于指2(F2)中时包含如下序列（在His锌配位残基的C端并包括His锌配位残基）：HIRTCTGSQKP(SEQ IDNO:75)（表2中称为#43且图1中以“2-43”所示的锌指）。
实施例3：通过靶向重组编辑染色体IL2Rγ基因
还在Urnov(2005)Nature435(7042):646-51和美国专利公开文本No.20050064474的实施例2所述内源IL2Rγ测定法中测定本文所述ZFN。简言之，使用Nucleofector(Amaxa)将2.5μg每种ZFN表达构建体转染入500,000个K562细胞中。收获基因组DNA，并使用Surveyor内切核酸酶试剂盒在内源IL2Rγ基因座处测定基因破坏。
图2的左上部显示了ZFN。具体地，经改变的锌指20指包含序列HTRRCGLRGSQLV的CCHC锌指；锌指21包含序列HAQRCGLRGSQLV(SEQ ID NO:53)；锌指43包含序列HIRTCTGSQKP(SEQ ID NO:75)；锌指45包含序列HIRTGCTGSQKP；锌指47包含序列HIRRCTGSQKP；而锌指48包含序列HIRRGCTGSQKP。在4个指的ZFN的指4中使用锌指20和21，而在4个指的ZFN的指2中使用锌指43、45、47、和48。
在上文图2中且于该图的右侧及在表5中显示了所测试的ZFN对：
表5
Figure BDA0000418219450000481
Figure BDA0000418219450000491
为了测定是否已经在切割位点处诱导突变，使用Cel-1测定法来分析扩增产物，在所述Cel-1测定法中将扩增产物变性，并复性，接着用错配特异性Cel-1核酸酶处理。参见例如Oleykowski等(1998)Nucleic Acids Res.26:4597-4602;Qui等(2004)BioTechniques36:702-707;Yeung等(2005)BioTechniques38:749-758。
在图2中为每个样品显示了两个实验的结果。样品8和9的实验#2在道中具有显著的背景噪声，其降低了这些ZFN的表观功效。
如图2所示，某些CCHC变体基本上与野生型C2H2ZFN等同。指4处的锌指21（样品5和9）比指4处的锌指20（样品4和8）产生更好的结果。在指2中，锌指43产生最好的结果。
实施例4：报道细胞系中eGFP的基因校正
基于图1和2中所示结果，生成上文表3和4中所示CCHC锌指（称为1a至10a）。将这些锌指掺入5-8和5-9ZFN中，并在上文实施例2所述GFP基因校正测定法中测试。在每个柱形下方显示了每个样品中所测试的ZFN对，其中锌指编号20、21、43、45、47和48是那些在实施例3中所述的，并且CCHC锌指1a至10a包含上文表3和4中所示序列。在指4中使用锌指20、21、7a、8a、9a和10a；在指2中使用锌指43、45、47、48、1a、2a、3a、4a、5a、和6a。
在图3中显示了结果。每个柱形下方的首行指掺入ZFN5-8中的锌指，而每个柱形下方的末行指掺入ZFN5-9中的锌指。例如，图3上自左侧起的第2个柱形指用5-8和5-9ZFN转染的样品，其中两种ZFN的F4包含锌指20的序列。如所显示的，许多包含CCHC锌指的ZFN的性能与野生型(CCHH)ZFN相当。
实施例5：靶载体的设计和生成
A.靶序列的总体结构
用于烟草（双子叶植物）的靶构建体包括以下7个构件，如图4和5所示：i)潮霉素磷酸转移酶(HPT)表达盒，其包含驱动由根癌土壤杆菌(A.tumifaciens)可读框-24(orf-24)3’非翻译区(UTR)(Gelvin等,1987,EP222493)所终止的大肠杆菌HPT基因(Waldron等,1985,Plant Mol.Biol.18:189-200)的拟南芥(A.thaliana)遍在蛋白-3(ubi-3)启动子(Callis等,1990,J.Bio.Chem.265:12486-12493)；ii)同源序列-1，其包含烟草(N.tabacum)RB7基质附着区(MAR)(Thompson等,1997,WO9727207)；iii)5’绿色荧光蛋白(GFP)基因片段(Evrogen Joint Stock Company,Moscow,Russia)，其由改良根癌土壤杆菌甘露碱合酶(Δmas)启动子(Petolino等,美国专利No.6,730,824)所驱动；iv)β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)表达盒，其包含驱动由根癌土壤杆菌胭脂碱合酶(nos)3’UTR(DePicker等,1982,J.Mol.Appl.Genet.1:561-573)所终止的GUS基因(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)的木薯叶脉花叶病毒(CsVMV)启动子(Verdaguer等,1996,Plant Molecular Biology31:1129-1139)；v)由根癌土壤杆菌orf-13’UTR(Huang等,J.Bacteriol.172:1814-1822)所终止的3’GFP基因片段(Evrogen Joint Stock Company,Moscow,Russia)；vi)同源序列-2，其包含拟南芥4-香豆酰-CoA合酶(4-CoAS)内含子-1（基因座At3g21320,GenBank NC003074）；及vii)由根癌土壤杆菌ORF-25/263’UTR(Gelvin等,1987,EP222493)所终止的绿色产色链霉菌(S.viridochromogenes)膦丝菌素磷酸转移酶(PAT)(Wohlleben等,1988,Gene70:25-37)3’基因片段。
将锌指-Fok1融合蛋白结合位点(IL-1-L0-Fok1)(Urnov等,2005,US2005/0064474)插入CsVMV启动子(Verdaguer等,1996,Plant MolecularBiology31:1129-1139)下游，并与GUS编码序列(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)在N端融合。在5’和3’GFP基因片段(Evrogen Joint StockCompany,Moscow,Russia)侧翼有两拷贝的第二锌指-Fok1融合蛋白结合位点(Scd27-L0-Fok1)(Urnov等,2005,US2005/0064474)。每个结合位点含有特定锌指-Fok1融合蛋白识别序列的四个串联重复，使得每个结合位点的大小为约200bp（图6小图A）。这种设计是为确保识别序列在复杂的染色质环境中会被锌指-Fok1融合蛋白所易接近。每个识别序列包括反向重复序列，单个锌指-Fok1融合蛋白以同二聚体形式结合至该反向重复序列并切割双链DNA（图6小图B）。5’和3’GFP基因片段交叠达540bp，这提供了靶序列内的同源性，并将终止密码子插在5’GFP片段的3’端以确保没有来自靶序列的功能性GFP翻译。
如下文所述通过多步骤克隆方法来产生包含靶序列的转化载体。
B.HPT二元载体(pDAB1584)的构建
将含有GUS表达盒的载体pDAB1400用作开始的基础构建体（图7），所述GUS表达盒包含驱动由根癌土壤杆菌orf-1UTR(Huang等,J.Bacteriol.172:1814-1822)所终止的GUS基因(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)的拟南芥ubi-3启动子(Callis等,1990,J.Bio.Chem.265:12486-12493)。
为了消除靶构建体中任何不必要的重复调节元件，用根癌土壤杆菌orf-24UTR(Gelvin等,1987,EP222493)替换pDAB1400中的根癌土壤杆菌orf-1UTR(Huang等,J.Bacteriol.172:1814-1822)，所述根癌土壤杆菌orf-24UTR作为SacI/XbaI片段切自pDAB782（图8），并克隆入pDAB1400中的相同位点。所得的构建体含有驱动由根癌土壤杆菌orf-24UTR(Gelvin等,1987,EP222493)所终止的GUS基因(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)的拟南芥ubi-3启动子(Callis等,1990,J.Bio.Chem.265:12486-12493)，并命名为pDAB1582（图9）。
使用引物P1和P2从pDAB354质粒（图10）PCR扩增HPT编码序列(Waldron等,1985,Plant Mol.Biol.18:189-200)。在引物P1的5’端添加BbsI位点，而在引物P2的3’端保留SacI位点。将HPTII PCR片段用BbsI/SacI消化，并克隆入经NcoI-SacI消化的pDAB1582中，以用来自PCR片段的HPT基因替换GUS基因。所得的质粒命名为pDAB1583（图11）。
然后通过NotI消化从pDAB1583中切出拟南芥ubi-3/HPT/根癌土壤杆菌orf-24片段，并用T4DNA聚合酶处理以产生平末端。将经过末端补平处理的HPT表达盒在PmeI位点克隆入pDAB2407（图12）（一种二元基础载体），产生质粒pDAB1584（图13）。
C.包含同源序列和Scd27锌指-Fok1融合蛋白结合位点的载体 (pDAB1580)的构建
用根癌土壤杆菌orf25/26UTR(Gelvin等,1987,EP222493)替换pDAB2418（图14）中的根癌土壤杆菌orf-1UTR(Huang等,J.Bacteriol.172:1814-1822)，以消除靶载体中的重复调节序列。为了进行UTP交换，使用引物P3和P4从pDAB4045质粒（图15）中PCR扩增根癌土壤杆菌orf25/26UTR(Gelvin等,1987,EP222493)。在PCR片段的3’端添加SmaI和AgeI位点，而在5’端保留SacI位点。将含有PAT基因表达盒的pDAB2418质粒DNA用SacI和AgeI消化，并回收两种最大的片段，所述PAT基因表达盒包含驱动由根癌土壤杆菌orf-1UTR(Huang等,J.Bacteriol.172:1814-1822)所终止的PAT基因(Wohlleben等,1988,Gene70:25-37)的拟南芥泛蛋白-10(ubi-10)启动子(Callis等,1990,J.Biol.Chem.265:12486-12493)）和烟草RB7MAR序列(Thompson等,1997,WO9727207)。将这些片段与经SacI和AgeI消化的根癌土壤杆菌orf25/26UTR(Gelvin等,1987,EP222493)PCR产物连接。所得的质粒命名为pDAB1575（图16）。烟草RB7MAR(Thompson等,1997,WO9727207)充当靶载体中的同源序列-1。
选择拟南芥4-CoAS的内含子-1（基因座At3g21320,GenBank NC003074）充当靶载体中的同源序列-2。对PAT基因(Wohlleben等,1988,Gene70:25-37)编码序列进行了分析，并将起始密码子下游299/300bp处鉴定为用于插入内含子的位点，使得会形成合适的5’和3’剪接位点。然后通过DNA合成(PicoscriptLtd.,LLP,Houston,Texas)将全长内含子与253bp的3’部分PAT编码序列融合。分别将NotI和SacI位点添加至DNA片段的5’和3’端。然后将合成的DNA片段用NotI/SacI消化，并在相同位点插入pDAB1575以替换全长PAT编码序列。所得的构建体命名为pDAB1577（图17）。
合成(Picoscript Ltd.,LLP,Houston,Texas)含有Scd27-L0-Fok1识别位点的4个串联重复的241bp DNA片段（图6），其中将SmaI位点添加至该片段的5’和3’两端。然后将合成的含锌指-Fok1结合位点的片段用SmaI消化，并在MscI位点插入pDAB1577中。所得的载体命名为pDAB1579（图18）。然后将第二个经SmaI消化的含锌指-Fok1结合位点的片段在SwaI位点插入pDAB1579中。所得的构建体命名为pDAB1580（图19）。该载体包含同源序列1和2（分别是烟草RB7MAR和拟南芥4-CoAS内含子1）及两个合成的Scd27锌指-Fok1结合位点（各含有Scd27-L0-Fok1识别位点的4个串联重复）。
D.包含两个部分重复的非功能性GFP片段的载体(pDAB1572)的构建
GFP基因CopGFP购自Evrogen Joint Stock Company(Moscow,Russia)，并使用引物P5和P6来PCR扩增全长编码序列。分别将BbsI和SacI位点添加至PCR产物的5’和3’端。然后将CopGFP PCR产物用BbsI/SacI消化，并在NcoI/SacI位点克隆入pDAB3401（图20）（其包含驱动由根癌土壤杆菌orf-13’UTR(Huang等,J.Bacteriol.172:1814-1822)所终止的GUS基因(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)的改良根癌土壤杆菌Δmas启动子(Petolino等,US6730824)）以替换GUS基因。所得的载体命名为pDAB1570（图21）。
为了制备两种部分重复的非功能性GFP片段，使用引物P9和P10来PCR扩增如下DNA片段，该DNA片段含有CopGFP编码序列的大部分但5’端有47bp删除。将ApaI位点添加至5’和3’两端，并且将额外的StuI位点添加至5’端且在ApaI位点的下游。然后将PCR产物用ApaI消化，并在ApaI位点插入pDAB1570，由此在相同的载体中产生具有540bp重复序列的两个非功能性GFP片段。所得的构建体命名为pDAB1572（图22）。
E.包含IL-1锌指-Fok1融合蛋白结合位点/GUS基因融合物的载体 (pDAB1573)的构建
由Picoscript Ltd.,LLP,(Houston,Texas)合成包含IL-1_L0-Fok1识别位点的4个串联重复的233bp DNA片段（图6），其中分别将NcoI和AflIII位点添加至5’和3’端。然后将合成的片段用NcoI/AflIII消化，并在NcoI位点插入pDAB4003（图23），其包含由CsVMV启动子(Verdaguer等,1996,PlantMolecular Biology31:1129-1139)所驱动、由根癌土壤杆菌orf-13’UTR(Huang等,J.Bacteriol.172:1814-1822)所终止的GUS基因(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)。然后产生了IL-1_L0-Fok1结合位点和GUS编码序列之间的N端融合物。所得的载体命名为pDAB1571（图24）。
为了消除靶载体中的重复3’UTR元件，将根癌土壤杆菌nos3’UTR(DePicker等,1982,J.Mol.Appl.Genet.1:561-573)作为SacI/PmeI片段从pDAB7204（图25）中切出，并克隆入经SacI/NaeI消化的pDAB1571以替换根癌土壤杆菌orf-13’UTR(Huang等,J.Bacteriol.172:1814-1822)。所得的质粒命名为pDAB1573（图26）。
F.最终的靶载体(pDAB1585)的构建
为了构建最终的靶载体，通过NotI消化从pDAB1573中切出具有IL-1-Fok1融合蛋白靶位点插入的GUS表达盒，补平末端，并在StuI位点插入pDAB1572。所得的中间载体命名为pDAB1574（图27）。从pDAB1574中切出完整的盒，并在NotI位点插入pDAB1580，所述完整的盒包含改良Δmas启动子(Petolino等,US6730824)、5’部分重复GFP序列(Evrogen Joint StockCompany,Moscow,Russia)、CsVMV启动子(Verdaguer等,1996,PlantMolecular Biology31:1129-1139)、IL-1-Fok1融合蛋白靶序列、GUS基因(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)编码区、根癌土壤杆菌nos3’UTR(DePicker等,1982,J.Mol.Appl.Genet.1:561-573)、3’部分重复GFP(Evrogen Joint Stock Company,Moscow,Russia)、及根癌土壤杆菌orf-13’UTR(Huang等,J.Bacteriol.172:1814-1822)。所得的质粒命名为pDAB1581（图28）。然后将pDAB1581的AgeI片段在AgeI位点插入pDAB1584，由此产生最终的靶构建体pDAB1585（图4和5）。
实施例6：具有整合的靶序列的转基因细胞系的生成
使用烟草细胞悬浮培养物（其称为BY2），经由土壤杆菌属转化而向其中稳定整合实施例5的靶序列。基础细胞系BY2获自Jun Ueki(Japan Tobacco,Iwata,Shizuoka,Japan)。该培养物在100-150个细胞簇(cell cluster)中增殖为5-10μ直径的细胞，其中倍增时间为大致18小时。将BY2细胞悬浮培养物维持在含有下列成分的培养基中：LS基础盐类(PhytoTechnology Labs L689)、170mg/L KH2PO4、30g/L蔗糖、0.2mg/L2,4-D及0.6mg/L盐酸硫胺素，pH6.0。通过添加50mL基于LS的培养基(LS-based medium)至0.25mL PCV来每7天对BY2细胞进行传代培养。将BY2细胞悬浮培养物维持在旋转式摇瓶机(25℃,125RPM)上的250mL烧瓶中。
为了产生具有整合的靶序列的转基因BY2细胞培养物，将一瓶传代培养后4天的烟草悬浮液分成10-12份4mL的等分试样，将其与100μL过夜培养至OD600约1.5的包含pDAB1585的土壤杆菌菌株LBA4404共培养于100x25mm皮氏皿中。将各皿用石蜡封口膜包裹，并在25℃在不进行摇动的情况下温育3天，之后，将过量的液体除去，并用11mL含有500mg/L羧苄青霉素的基于LS的基础培养基替换。
使烟草细胞重悬浮后，将1mL悬浮液分配至用8g/L TC琼脂固化的、含有500mg/L羧苄青霉素和200mg/L潮霉素的适当基础培养基的100x25mm平板上，并在28℃以未包裹形式在黑暗中温育。这导致一次处理产生120-144块选择平板。在铺板后10-14天出现个别的潮霉素抗性分离群(isolate)，并将其转移至各个60x20mm平板（每块平板一个分离群），其中按照14天传代培养日程表将它们以胼胝体形式维持，直至需要用于分析和随后的再转化实验。
实施例7：靶转基因事件的筛选和表征
对自靶载体转化入BY2烟草细胞培养物所产生的潮霉素抗性转基因事件（如实施例6所述）进行如下分析。
为了筛选这些转基因事件而进行的最初分析包括GUS表达分析以表明靶序列的可接近性、部分和全长靶序列的PCR分析以证实靶载体的存在和完整性、及Southern印迹分析以测定所整合的靶序列的拷贝数。显示GUS表达的转基因事件的一个子集包含一个单拷贝的全长靶序列；对它们选择以用于重建悬浮培养物以产生供随后再转化用的靶系。这些重建的靶系还经历进一步的表征，其包括更彻底的Southern印迹分析、整个靶插入物的测序确证、及侧翼基因组序列分析。
对自所选事件启动的转基因烟草胼胝体或悬浮培养物如下分析GUS活性，即将50mg样品在150μL测定缓冲液中在37℃温育24-48小时。测定缓冲液含0.2M磷酸钠pH8.0、各0.1mM的铁氰化钾和亚铁氰化钾、1.0mM钠盐EDTA、0.5mg/mL5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-葡糖苷酸(glucuronide)和0.6%(v/v)Triton X-100(Jefferson,1987,Plant Mol.Biol.Rep.5:387-405)。将蓝色有色区域的出现用作GUS基因表达的指示物，其表明靶序列插入是具有转录活性的，因此在局部的基因组环境中是可接近的。
通过使用引物对P15/P16的PCR来对表达GUS的转基因事件进行测定，所述使用引物对P15/P16的PCR导致从靶序列5’端的HTP表达盒的3’UTR延伸至靶序列3’端的部分PAT基因盒的3’UTR的10kb DNA片段扩增。因为所有的事件都是在潮霉素选择下获得的，因此认为HPT表达盒在所有靶事件中都是完整的。因此，全长PCR分析中仅覆盖HPT表达盒的3’UTR。还对事件的一个子集使用引物对P15/P17和P18/P19进行PCR测定以分别测定靶序列的5’和3’端的完整性。通过Southern印迹分析对所有经PCR分析证实的靶事件进行进一步测定以测定所整合的靶序列的拷贝数。
对所有通过GUS表达和全长PCR筛选的靶事件实施Southern印迹分析。将10μg基因组DNA用靶序列内的一次切割者(unique cutter)NsiI消化。将经消化的基因组DNA在0.8%琼脂糖凝胶上分开，并转移至尼龙膜上。在交联后，用HPT基因探针来杂交所述膜上的转移DNA以测定靶序列的5’端的拷贝数。然后将相同的印迹剥离(strip)，并与PAT基因探针再杂交以测定靶序列的3’端的拷贝数。
选择多个显示了GUS表达并含有单拷贝全长靶序列的事件用于进一步表征，其包括更彻底的Southern印迹分析、整个靶序列确证、及侧翼基因组序列分析。基于分子表征选择一个称为BY2-380的事件。从该事件重建悬浮培养物，用于随后的使用包含供体DNA的载体和非C2H2锌指-Fok1融合蛋白基因进行的再转化。
为了确保自靶事件BY2-380建立的悬浮培养物包含预期的完整靶序列，使用引物对P15/P16PCR扩增靶序列主体（从靶序列5’端的HPT表达盒的3’UTR至靶序列3’端的部分PAT基因盒的3’UTR），并克隆入pCR2.1TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,California)。TOPO载体中插入的PCR产物由Larktechnology,Inc.(Houston,Texas)进行测序。序列结果指明，BY2-380具有预期的完整靶序列。
使用通用GenomeWalker试剂盒(Clontech,Mountain View,California)来对BY2-380细胞系进行进一步分析以获得侧翼基因组序列。简言之，在分开的反应中使用三种平端限制酶EcoRV、DraI及StuI来消化2.5μg基因组DNA。将经消化的DNA通过酚/氯仿抽提来纯化，并与BD GenomeWalker衔接头连接。实施嵌套式PCR扩增，其中该连接作为模板且引物P20（在靶序列插入的5’端上游步行）和P21（在靶序列插入的3’端下游步行）用于一级PCR反应，而引物P22（在靶序列插入的5’端上游步行）和P23（在靶序列插入的3’端下游步行）用于二级嵌套式PCR反应。将来自二级PCR反应的扩增片段克隆入pCR2.1TOPO或pCR Blunt II TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,California)，并使用染料终止物循环测序试剂盒(Dye Terminator Cycle Sequencing Kit,Beckman Coulter,Fullerton,CA)来测序。经由该方法自BY2-380靶系中获得侧翼基因组序列。然后基于侧翼基因组序列设计引物，并用于扩增整个靶序列。
自该靶系获得的扩增片段具有预期的大小。通过测序证实扩增片段的两末端。
实施例8：供体DNA载体的设计和生成
供体DNA构建体包括同源序列-1(烟草RB7MAR)(Thompson等,1997,WO9727207)、全长拟南芥ubi10启动子(Callis等,1990,J.Biol.Chem.265:12486-12493)、299bp的5’部分PAT基因编码序列(Wohlleben等,1988,Gene70:25-37)及同源序列-2(拟南芥4-CoAS内含子-1)(基因座At3g21320,GenBank NC003074)。供体载体中的同源序列-1和序列-2两者与靶载体(pDAB1585)中相应的同源序列-1和序列-2是相同的。
为了构建供体载体，通过Picoscript Ltd.,LLP,(Houston,Texas)进行的DNA合成来将299bp的5’部分PAT编码序列与全长拟南芥4-CoAS内含子-1(基因座At3g21320,GenBank NC003074)融合。分别将NcoI和XhoI位点添加至该片段的5’和3’端。然后将该合成的DNA片段用NcoI/XhoI消化，并在相同位点插入pDAB1575以替换全长PAT基因编码序列及其3’UTR。所得的构建体命名为pDAB1576（图29）。
然后用AgeI消化pDAB1576，并将包含侧翼为同源序列-1和同源序列-2的5’部分PAT表达盒的整个片段在相同位点插入pDAB2407（一种二元基础载体）。所得的构建体命名为pDAB1600（图30），并且是供植物细胞再转化用的二元型式的供体载体。
实施例9：锌指核酸酶表达载体的设计和生成
锌指-Fok1融合蛋白基因由CsVMV启动子和5’UTR所驱动(Verdaguer等,1996,Plant Molecular Biology31:1129-1139)。该盒中还包含的是根癌土壤杆菌可读框-24(orf-24)3’非翻译区(UTR)(Gelvin等,1987,EP222493)。
为了构建这些载体，上文实施例1至4中所述IL-1-Fok1和Scd27-Fok1编码序列的C2H2对照及其C3H变体从它们的最初设计中PCR扩增，分别将BbsI或NcoI和SacI位点添加至PCR片段的5’和3’端，并克隆入经NcoI-SacI消化的pDAB3731（图31）中。所得的质粒命名为pDAB4322（图32）、pDAB4331（图33）、pDAB4332（图34）、pDAB4333（图35）、pDAB4334（图36）、pDAB4336（图37）、和pDAB4339（图38）。所有这些载体包含ZFN表达盒侧翼的attL1和attL2位点，并且与GatewayTM克隆系统(Invitrogen,Carlsbad,California)相容。
为IL-1-FokI融合蛋白构建两套二元型式载体。一套包含PAT选择标志基因，而另一套不包含PAT选择标志基因。对于SCd27-FokI融合蛋白，仅构建不含PAT选择标志基因的二元型式载体。为了构建含PAT选择标志基因的二元载体，使用LR ClonaseTM酶混合物(Invitrogen,Carlsbad,California)经由LR重组反应将pDAB4322、pDAB4331、pDAB4332、pDAB4333、pDAB4334、和pDAB4336中的IL-1-FokI融合蛋白表达盒克隆入pDAB4321（图39）中。所得的质粒命名为pDAB4323（图40）、pDAB4341（图41）、pDAB4342（图42）、pDAB4343（图43）、pDAB4344（图44）、pDAB4346（图45）。为了构建不含PAT选择标志基因的二元载体，使用LR ClonaseTM酶混合物(Invitrogen,Carlsbad,California)经由LR重组反应分别将分别在pDAB4331、pDAB4336和pDAB4339中的C2H2IL-1-FokI、C3H IL-1-FokI和Scd27-FokI表达盒克隆入pDAB4330（图46）中。所得的质粒分别命名为pDAB4351（图47）、pDAB4356（图48）和pDAB4359（图49）。
为了构建SCD27-FokI的C2H2对照，用包含驱动GUS的CsVMV启动子及5’UTR和烟草5’UTR的片段（其是用HindIII/SacI从pDAB7025(图51)中切割的）替换pDAB7002（图50）中包含驱动PAT的CsVMV启动子和5’UTR的HindIII/SacI片段。所得的质粒命名为pDAB1591（图52）。Scd27-L0-Fok1编码序列使用引物对P13/P14从其最初载体pCDNA3.1-SCD27a-L0-FokI(图53)PCR扩增。分别将BbsI和SacI位点添加至PCR片段的5’和3’端。经由SacI/NcoI克隆用锌指融合蛋白基因PCR片段替换pDAB1591中的PAT基因。所得的质粒命名为pDAB1594（图54）。如下构建该载体的二元型式，即从pDAB1594中以PmeI/XhoI片段切出锌指融合蛋白基因表达盒，补平末端，并在PmeI位点克隆入pDAB2407。所得的质粒命名为pDAB1598（图55）。表6中总结了用于植物转化的所有二元载体的详情。
表6：锌指核酸酶表达载体
Figure BDA0000418219450000581
Figure BDA0000418219450000591
*FokI结构域是植物密码子偏爱的。
实施例10：阳性对照载体的设计和生成
为了评估非常规重组频率并充当阳性对照，使用含有PAT基因表达盒的载体。为了可与最终的重组体进行比较，在PAT编码序列(Wohlleben等,1988,Gene70:25-37)的299/300bp处插入拟南芥4-CoAS内含子-1(基因座At3g21320,GenBank NC003074)。为了构建这种构建体，将来自pDAB1576的2559bpSwaI/ClaI片段连接经相同限制酶消化的pDAB1577（图56）的主链片段。所得的载体包含PAT基因表达盒且其在PAT编码序列(Wohlleben等,1988,Gene70:25-37)中间有1743bp的拟南芥4-CoAS内含子-1(基因座At3g21320,GenBank NC003074)(基因座At3g21320,GenBank NC003074)插入。该载体命名为pDAB1578（图57）。
为了构建pDAB1578的二元型式，用PmeI/XhoI从pDAB1578中切出具有拟南芥内含子-1(基因座At3g21320,GenBank NC003074)的PAT基因表达盒。在对该片段的3’端进行补平末端处理后，将其在PmeI位点插入二元基础载体pDAB2407。所得的载体命名为pDAB1601（图58），其包含由拟南芥ubi10启动子(Callis等,1990,J.Biol.Chem.265:12486-12493)所驱动的且由根癌土壤杆菌orf25/263’UTR(Gelvin等,1987,EP222493)所终止的包含拟南芥4-CoAS内含子-1(基因座At3g21320,GenBank NC003074)的PAT基因(Wohlleben等,1988,Gene70:25-37)。
实施例11：通过用C3H锌指核酸酶基因再转化靶细胞培养物来证明染色体内的同源重组
为了证实C3H锌指核酸酶在刺激染色体内同源重组中的功能性，如图59所示，靶载体中包括具有540bp交叠序列的两个非功能性GFP片段。在这两个片段之间的是GUS基因表达盒。将IL-1-Fok1融合蛋白结合序列与GUS编码序列在其N端融合。不限于一种理论，假定在IL-1-Fok1融合蛋白存在下，IL-1ZFN结合序列会被识别，并且双链DNA断裂会被诱导，这会刺激内源DNA修复过程。在没有供体DNA存在下，两个部分同源的GFP片段会经历染色体内同源重组过程，并且功能性GFP基因会被重建。
使用BY2-380转基因细胞系（其含有单拷贝的、全长整合的靶序列）来再次启动悬浮培养，即将约250-500mg胼胝体组织放入40-50mL含有100mg/L潮霉素的基于LS的基础培养基中，并如上文所述那样每7天进行传代培养。在再转化之前，将悬浮培养物转移至不含潮霉素的基础培养基达至少两代。
如上文所述实施土壤杆菌介导的靶细胞培养物转化。对于每个实验，如下产生8块共培养平板：1块平板包含与300μL基础土壤杆菌菌株LBA4404共培养的细胞；1块平板包含与300μL包含pDAB1590（功能性GFP构建体）的土壤杆菌菌株共培养的细胞；6块平板各包含与300μL分别包含pDAB4323、pDAB4341、pDAB4342、pDAB4343、pDAB4344、和pDAB4346的土壤杆菌菌株共培养的细胞。在使用上文所述方法进行共培养后，将细胞铺于装有补充有500mg/L羧苄青霉素而不含选择剂的基于LS的基础培养基的8块平板上。所组建的功能性GFP基因的表观表达导致转化后约5-8天可见的荧光。通过观察每块平板5个“随机的”显微镜视野来对每个视野的绿色荧光位置的数目计数（在每个实验中每种构建体8块平板），并自6个独立实验计算平均值。
如表7所总结，自两种C3H锌指核酸酶，即pDAB4346和pDAB4343分别观察到每个视野平均9.50和7.57个绿色荧光位置。IL-1-FokI的这两种C3H设计比其C2H2对照，即pDAB4341（每个视野6.37个位置）和pDAB4323（每个视野5.53个位置）性能更好。同时，与C2H2对照相比，IL-1-FokI融合蛋白的另两种C3H变体即pDAB4344（每个视野4.39个位置）和pDAB4342（每个视野0.25个位置）的功能显著地受损，特别是pDAB4342，其中C3H转换仅通过在第4个指中用组氨酸替换第二个半胱氨酸进行。在用基础土壤杆菌菌株LBA4404转化的阴性对照中没有观察到超过轻微背景的可察觉到的荧光。
表7
经由IL-1-Fok1锌指融合蛋白刺激的染色体内同源重组进行的功能性GFP的构建
载体 ZFP类型 GFP表达 Tukey检验**
pDAB4346 C3H 9.50 A
pDAB4343 C3H 7.57 B
pDAB4341 C2H2 6.37 C
pDAB4323* C2H2 5.53 D
pDAB4344 C3H 4.39 E
pDAB4342 C3H 0.25 F
*包含非植物密码子偏爱的FokI结构域
**不以相同字母联系的均值在0.05水平是有显著性差异的
实施例12：通过用C3H锌指核酸酶基因和供体DNA序列再转化靶细胞培养物来证明染色体间同源重组
为了证实C3H锌指-Fok1融合蛋白在刺激例示性烟草系统中染色体间同源重组中的功能性，开发并测试两种策略。
策略1中，靶构建体（图61）的中部包括锌指-Fok1融合蛋白结合位点(IL-1-L0-Fok1)。在该策略中，结合位点两侧侧翼均为约3kb的非同源序列，接着上游和下游分别为同源序列-1(烟草RB7MAR)和同源序列-2(拟南芥4-CoAS内含子-1)。如先前所证实（例如美国专利公开文本No.20050064474），在C2H2IL-1锌指-Fok1融合蛋白存在下，IL-1-L0-Fok1结合序列被识别，并且在该特定位点诱导双链DNA断裂，这刺激内源DNA修复过程。在供体DNA（其包含与靶序列中的同源序列相同的同源序列）存在下，5’部分PAT基因及其启动子经由同源重组来替换靶物中同源序列间的整个约6kb DNA片段。通过这种方法，两个部分PAT基因序列（拟南芥4-CoAS内含子-1间插其间）重建功能性PAT基因，导致PAT表达和除草剂抗性表型。
策略2中，靶载体中包括两个锌指-Fok1结合位点(Scd27-L0-FokI)：一个正好位于烟草RB7MAR下游，而另一个正好位于拟南芥4-CoAS内含子-1上游（图62）。两个锌指-Fok1融合蛋白结合位点之间的是约6kb的序列，其包括5’GFP片段、GUS表达盒和3’GFP片段。如先前所证实（例如美国专利公开文本No.20050064474），在Scd27锌指-Fok1融合蛋白存在下，两个结合序列被识别，并且在两个位置诱导双链DNA断裂，这除去这两个结合序列之间的约6kb DNA片段，并刺激内源DNA修复过程。与策略1类似，在供体DNA（其包含与靶序列中的同源序列相同的同源序列）存在下，5’部分PAT基因及其启动子通过在诱导双链DNA断裂的位点处进行的同源重组而被插入靶序列。通过这种方法，两个部分PAT基因序列（拟南芥4-CoAS内含子-1间插其间）重建功能性PAT基因，导致PAT表达和除草剂抗性表型。
如上文所述实施土壤杆菌介导的BY2-380靶细胞培养物转化。对于每个实验，如下产生12块共培养平板：1块平板包含与50μL包含pDAB1600（供体DNA）的土壤杆菌菌株和250μL土壤杆菌基础菌株LBA4404共培养的细胞；1块平板包含与50μL包含pDAB1601（PAT选择标志）的土壤杆菌菌株和250μL土壤杆菌基础菌株LBA4404共培养的细胞；2块平板包含与50μL包含pDAB1600（供体DNA）的土壤杆菌菌株和250μL包含pDAB4351(C2H2IL-1ZFP-Fok1)的土壤杆菌菌株共培养的细胞；3块平板包含与50μL包含pDAB1600（供体DNA）土壤杆菌菌株和250μL包含pDAB4356(C3H IL-1ZFP-Fok1)的土壤杆菌菌株共培养的细胞；2块平板包含与50μL包含pDAB1600（供体DNA）的土壤杆菌菌株和250μL包含pDAB1598(C2H2 Scd27a ZFP-Fok1)的土壤杆菌菌株共培养的细胞；3块平板包含50μL包含pDAB1600（供体DNA）的土壤杆菌菌株和250μL包含pDAB4359(C3H Scd27aZFP-Fok1)的土壤杆菌菌株共培养的细胞。使用上文所述方法进行共培养后，将细胞铺入含有500mg/L羧苄青霉素和15mg/L
Figure BDA0000418219450000621
的基于LS的基础培养基上。铺板后2-4周出现个别的
Figure BDA0000418219450000622
抗性分离群，并将其转移至各个60x20mm平板（每块平板一个分离群），其中按照14天传代培养日程表将它们以胼胝体形式维持，直至需要用于分析。
自C3H IL-1锌指核酸酶(pDAB4356)和C3H Scd27锌指核酸酶(pDAB4359)都获得多个
Figure BDA0000418219450000623
抗性分离群。通过使用引物对P24/25的PCR（其扩增跨越重建的PAT基因的DNA片段）来分析这些分离群。引物P24与供体DNA中PAT编码序列的5’端是同源的，而引物P25与靶DNA中PAT编码序列的3’端是同源的。若两个部分PAT编码序列通过同源重组来连接，则会产生2.3kbPCR片段。如图63所示，从所分析的多个分离群中获得2.3kb PCR产物。从C3H IL-1锌指-Fok1融合蛋白基因/供体DNA和C3H Scd27锌指-Fok1融合蛋白基因/供体DNA的共转化中都获得这些分离群。将来自多个独立分离群（其代表自C3H IL-1锌指-Fok1和C3H Scd27锌指-Fok1融合蛋白基因转化两者衍生的分离群）的2.3kb PCR产物从琼脂糖凝胶中纯化，并克隆入pCR2.1TOPO载体(Invitrogen,Carlsbad,California)。然后使用染料终止物循环测序试剂盒(Beckman Coulter)对TOPO载体中插入的2.3kb PCR产物进行测序。测序结果证实，TOPO载体中克隆的所有PCR产物包含预测的重组序列，其包括5’和3’部分PAT基因序列以及间插的拟南芥4-CoAS内含子-1。这些结果证实了经由C3H锌指-Fok1融合蛋白基因表达发生了对所测试的两种策略预测的染色体间重组及所例示的基因靶向。
实施例13：玉米细胞培养物中靶基因序列的鉴定
A.序列鉴定
在本实施例中，选择已知功能的内源玉米基因的DNA序列作为使用工程化锌指核酸酶进行的基因组编辑的靶物。该基因（称为IPP2-K，其衍生自专卖的玉米近交系5XH751）的基因组结构和序列已经记载于WO2006/029296，通过提及而收录其公开内容。
特别地，使用BLAST算法，使用IPP2-K基因组序列来查询TIGR玉米基因组数据库（可在因特网上在http://www.tigr.org/tdb/tgi/maize/获得）。鉴定出数个别的基因组片段具有与IPP2-K有交叠同源性的区段，包括但不限于登录号AZM515213和TC311535。基于这些登录号的序列以及IPP2-K序列，使用Primer3程序(Rozen,S.和Skaletsky,H.J.(2000)Primer3on the WWW forgeneral users and for biologist programmers.于:Krawetz S,Misener S(编)Bioinformatics Methods and Protocols:Methods in Molecular Biology.HumanaPress,Totowa,NJ,pp365-386；也可在因特网上获得)，设计多个短的寡核苷酸，以用作PCR引物。这些引物包括但不限于下列正向寡核苷酸：
1.5’-ATGGAGATGGATGGGGTTCTGCAAGCCGC-3’(SEQ ID NO:104)
2.5’-CTTGGCAAGGTACTGCGGCTCAAGAAGATTC-3’(SEQ ID NO:161)
3.5’-ATGAAGAAAGACAGGGAATGAAGGAC-3’(SEQ ID NO:162)
4.5’-ATGAAGAAAGACAGGGAATGAAGGACCGCCAC-3’(SEQ ID NO:163)
5.5’-CATGGAGGGCGACGAGCCGGTGTAGCTG-3’(SEQ ID NO:164)
6.5’-ATCGACATGATTGGCACCCAGGTGTTG-3’(SEQ ID NO:165)另外，引物包括但不限于下列反向寡核苷酸：
7.5’-TTTCGACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAAC-3’(SEQ ID NO:166)
8.5’-ACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAACAC-3’(SEQ ID NO:167)
9.5’-TTCGACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAACAC-3’(SEQ ID NO:168)
10.5’-TGCTAAGAACATTCTTTTCGACAAGCTCC-3’(SEQ ID NO:169)
11.5’-GAACATTCTTTTCGACAAGCTCCAGAAAATCC-3’(SEQ ID NO:170)
所有寡核苷酸引物均由Integrated DNA Technologies(IDT,Coralville,IA)合成并自其购买。
B.Hi II玉米细胞培养物
为了获得用于启动胼胝体培养的未成熟胚，在温室培养的Hi-II亲本A和B(Armstrong,C.,Green,C.和Phillips,R.(1991)Maize Genet.Coop.News Lett.65:92-93)之间进行F1杂交。从健康的穗中收获大小约1.0-1.2mm（授粉后约9-10天）的胚，并通过用
Figure BDA0000418219450000641
肥皂擦洗来进行表面灭菌，在70%乙醇中浸没2-3分钟，然后在20%商品化漂白剂（0.1%次氯酸钠）中浸没30分钟。
在无菌的蒸馏水中漂洗穗，并在无菌条件下切出未成熟的合子胚，并在15Ag10培养基（N6培养基(Chu C.C.,Wang C.C.,Sun C.S.,Hsu C.,Yin K.C.,Chu C.Y.,和Bi F.Y.(1975)Sci.Sinica18:659-668)、1.0mg/L2,4-D、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物（酶促消化物）、25mM L-脯氨酸、10mg/L AgNO3、2.5g/L Gelrite，pH5.8)上培养2-3周，其中盾片(scutellum)背向培养基。将显示预期形态学的组织(Welter,ME,Clayton,DS,Miller,MA,Petolino,JF.(1995)Plant Cell Rep:14:725-729)以两周一次的间隔选择性转移至新鲜15Ag10培养基上，达约6周，然而以两周一次的间隔转移至4培养基（N6培养基、1.0mg/L2,4-D、20g/L蔗糖、100mg/L酪蛋白水解物（酶促消化物）、6mM L-脯氨酸、2.5g/L Gelrite，pH5.8)上，达约2个月。
为了启动胚发生悬浮培养，将大约3ml充实细胞体积(PCV)的源自单个胚的胼胝体组织添加至大约30ml H9CP+液体培养基（MS基础盐混合物(Murashige T.和Skoog F.(1962)Physiol.Plant.15:473-497)、含有少10倍的烟酸和高5倍的盐酸硫胺素的改良MS维生素、2.0mg/L2,4-D、2.0mg/Lα-萘乙酸(NAA)、30g/L蔗糖、200mg/L酪蛋白水解物（酸消化物）、100mg/L肌肉-肌醇、6mM L-脯氨酸、5%v/v椰子汁（就在传代培养前添加），pH6.0）。在黑暗条件下在设置成125rpm、28℃的温控摇瓶机中在125ml Erlenmeyer烧瓶中维持悬浮培养物。在细胞系建立期间（2-3个月），通过使用大孔移液管将3ml PCV细胞和7ml条件化培养基添加至20ml新鲜H9CP+液体培养基来每3.5天对悬浮液进行传代培养。达到成熟（如通过生长倍增所证明的）后，将悬浮液在500ml烧瓶中放大，并维持，由此将12ml PCV细胞和28ml条件化培养基转移至80ml H9CP+培养基中。在完全建立悬浮培养物后，将等分试样进行低温保藏，供未来使用。参见WO2005/107437。
C.DNA分离和扩增
在250ml烧瓶中于标准GN6培养基（N6培养基、2.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、2.5g/L Gelrite，pH5.8)中培养上文所述玉米HiII细胞培养物，并使用Qiagen(Valencia,CA)植物DNeasy提取试剂盒依照制造商的推荐提取基因组DNA。在如下条件下实施以所有可能的组合使用上文所述引物的PCR扩增反应：25μl反应体积，在酶制造商的缓冲液中含有20ng gDNA模板、20pmol每种引物、1%DMSO和10个单位的AccuprimeTMPf聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)。大小范围500bp至2kb的扩增产物源自由95℃-1’，(95℃-30”、57-62℃-30”、72℃-1’)X30，72℃-5’，4℃-保持组成的扩增循环。使用TA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)依照制造商的推荐将扩增片段直接克隆入载体pCR2.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。
D.序列分析
对玉米近交系5XH751和HiII细胞培养物中IPP2-K基因的先前分析已经指明构成小基因家族的2-3个不同基因的存在(Sun等，印刷中，PlantPhysiology；WO2006029296)。因此，用CEQ染料终止物循环测序试剂盒(CEQDye Terminator Cycle Sequencing Kit,Beckman Coulter,Fullerton,CA)依照制造商的推荐对所分离的克隆片段测序。对多个克隆的序列分析揭示，已经从HiII细胞中分离出2个不同的基因片段，其衍生自玉米基因组中2个不同的且先前表征的基因座。
自HiII培养细胞分离的2个序列的比较指明，在预测编码区中，2个旁系同系物之间存在微小的差异（诸如单核苷酸多态性，SNP），而内含子和非编码区在核苷酸水平显著不同。注意到2个旁系同系物之间的这些差异是因为它们突出显示可被序列依赖性DNA结合蛋白（诸如锌指结构域）辨别的序列区域。本领域技术人员可设计结合一种基因序列而不结合另一种高度相似的基因序列的锌指DNA结合结构域。选择与感兴趣旁系同系物对应的1.2kb部分基因序列（图66）作为供锌指核酸酶蛋白设计用的模板，随后进行上文所述锌指DNA结合结构域分析。
实施例14：IPP2-K锌指DNA结合结构域的设计
使用为IPP2-K鉴定的靶位点，为IPP2-K锌指选择识别螺旋。在下表8中显示了锌指设计。
表8:IPP2-K锌指设计
Figure BDA0000418219450000661
在下表9中显示了锌指设计的靶位点。
表9：IPP2-K锌指的靶位点
ZFN名称 靶位点(5’至3’)
IPP2-K-1072a1 GAACTGGTTGAGTCGGTC(SEQ ID NO:128)
IPP2-K-1072b1 GAACTGGTTGAGTCGGTC(SEQ ID NO:129)
IPP2-K-1072c1 GAACTGGTTGAGTCGGTC(SEQ ID NO:129)
IPP2-K-r1065a1 ATGGCCCCACAG(SEQ ID NO:130)
IPP2-K-r1149a2 GGCACCCAGGTGTTG(SEQ ID NO:131)
IPP2-K-1156a2 GTCGATGGTGGGGTATGG(SEQ ID NO:132)
将IPP2-K设计掺入编码具有CCHC结构的蛋白质的锌指表达载体中。参见上文表1至表4。然后将非规范锌指编码序列与IIS型限制酶FokI的核酸酶结构域（Wah等(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA95:10564-10569的序列的第384-579位氨基酸，经由4个氨基酸的ZC接头）融合以形成IPP2-K ZFN。
实施例15：使用IPP2-K锌指核酸酶进行的基因校正
在Urnov(2005)Nature435(7042):646-51和美国专利公开文本No.20050064474（例如实施例6-11）所述GFP系统中测试本文所述IPP2-K ZFN促进同源重组的能力。简言之，依照Invitrogen Lipofectamine2000方案，每个样品使用2μL Lipofectamine2000，将50ng每种ZFN和500ng无启动子的GFP供体(Urnov(2005)Nature)转染入500,000个报道细胞中。
转染后24小时添加0.2μM终浓度的长春碱，并在转染后72小时除去。
转染后5天通过在Guava台式FACS分析仪上每次转染测量40,000个细胞来对细胞测定GFP表达。结果显示于图69。
实施例16：在玉米HiII细胞中表达C3H1ZFN
A.载体设计
构建用于在玉米细胞中表达ZFN蛋白的质粒载体。为了优化形成功能性锌指核酸酶异二聚体所需的2个不同蛋白质的表达和相对化学计量，采用如下表达策略，其导致在单个载体上插入两种ZFN单体的可读框，它们由单个启动子驱动。该策略利用自Thesoa assigna病毒衍生的2A序列(Mattion,N.M.,Harnish,E.C.,Crowley,J.C.和Reilly,P.A.(1996)J.Virol.70,8124-8127)、来自不透明二号基因(opaque-2,op-2)的玉米核定位信号(NLS)(Maddaloni,M.,DiFonzo,N.,Hartings,H.,Lazzaroni,N.,Salaminil,F.,Thompson,R.,和Motto M.(1989)Nucleic Acids Research Vol.17(18):7532)、和自玉米遍在蛋白-1基因衍生的启动子(Christensen A.H.,Sharrock R.A.,和Quail P.H.(1992)Plant MolBiol.18(4):675-89)的功能性。设计逐步模块(modular)克隆方案以开发这些表达载体，用于任何自图书馆档案选择的或从头合成的给定成对ZFN编码基因。
首先，修饰pVAX载体（参见例如美国专利公开文本2005-0267061，通过提及而收录其公开内容）以包含图65小图A-E所示N端表达结构域。该改良质粒(pVAX-N2A-NLSop2-EGFP-FokMono)（图65小图A）的特征包括重新设计并合成的、编码自玉米op-2衍生的NLS(RKRKESNRESARRSRYRK,SEQ ID NO:133)的区段和重新设计并合成的、编码利用玉米密码子偏爱的FokI核酸酶结构域的区段。另外，在唯一的XhoI位点下游的单个核苷酸插入(C)创建额外的SacI位点以方便克隆。
其次，还修饰pVAX载体（参见例如美国专利公开文本2005-0267061）以包含C端表达结构域。该改良质粒(pVAX-C2A-NLSop2-EGFP-FokMono)（图65小图B）的特征包括重新设计并合成的、编码自玉米op-2衍生的NLS(RKRKESNRESARRSRYRK,SEQ ID NO:133)的区段和重新设计并合成的、编码利用玉米密码子偏爱的FokI核酸酶结构域的区段。另外，为了2个蛋白质编码结构域的随后连接，在ZFN ORF的N端引入来自Thosea asigna病毒的2A序列(EGRGSLLTCGDVEENPGP,SEQ ID NO:134)。
使用限制酶KpnI和BamHI来产生相容末端，经由连接将编码各个锌指蛋白的ORF的基因盒克隆入N2A或C2A载体中。接着，将来自C2A载体的BglII/XhoI片段经由相同的限制性位点插入N2A载体中，产生包含如下盒的中间构建体，所述盒包括侧翼有NcoI和SacI限制性位点的2个ZFN编码结构域。
最后，包含两个ZFN基因的NcoI/SacI盒使用那些酶经由限制性消化从该中间构建体中切出（图65小图C），并连接至质粒主链pDAB3872中（图65小图D）。所得的质粒包括ZFN基因加上相关启动子和终止子序列，加上用于维持质粒的选择标志。
在最终的构建体（它们的一个例子显示于图65小图E）中，ZFN表达盒（包括启动子和终止子元件）侧翼有attL位点以方便使用Gateway系统（Invitrogen,Carlsbad,CA）进行的操作。将使用该克隆方案生成的每种ZFN构建体转化入大肠杆菌DH5α细胞(Invitrogen,Carlsbad,CA)中，随后在合适的选择下维持。
B.DNA投递和瞬时表达
使用无内切核酸酶的Gigaprep试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)依照制造商的推荐从2L在加有抗生素的LB培养基中培养的大肠杆菌细胞培养物中产生如图65小图E所述构建的ZFN表达载体的质粒制备物。使用多种方法将质粒DNA直接投递至玉米HiII培养细胞。
在一个例子中，经由WhiskersTM对玉米细胞进行DNA投递。DNA投递前大约24小时，将加有7ml条件化培养基的3ml PCV HiII玉米悬浮细胞传代培养至20ml在125ml Erlenmeyer烧瓶中的GN6液体培养基（缺乏Gelrite的GN6培养基）中，并在摇瓶机（125rpm，28℃）上放置24小时。取出2mL PCV，并添加至12ml在125ml Erlenmeyer烧瓶中的GN6S/M渗透培养基（N6培养基、2.0mg/L2,4-D、30g/L蔗糖、45.5g/L山梨醇、45.5g/L甘露醇、100mg/L肌肉-肌醇，pH6.0）。在黑暗中在28℃在中等搅动(125rpm)情况下温育烧瓶达30-35分钟。这此期间，通过将合适体积的GN6S/M液体培养基添加至预先称重的无菌晶须(whisker)来制备50mg/ml碳化硅晶须(Advanced CompositeMaterials,Inc.,Eureka Springs,AK)悬浮液。在GN6S/M中温育后，将每个烧瓶的内容物倒入15mL锥底离心管中。
在细胞沉降后，吸取大约(all but)1mL GN6S/M液体，并收集在125mL烧瓶中，供未来使用。以最高速度使预先湿润的晶须悬浮液涡旋60秒，使用大孔的、过滤式移液管管尖将160μL添加至离心管，并添加20μg DNA。对该管进行“手指涡旋”(“finger vortexed”)，并立即放置在Caulk“Vari-Mix II”牙科汞合金搅拌机（其被修改成能容纳17x100mm的培养管）中，然后以中等速度搅动60秒。搅动后，将细胞、培养基、晶须和DNA的混合物连同18ml添加的GN6液体培养基一起返回Erlenmeyer烧瓶。容许细胞在摇瓶机（125RPM，28℃）上在黑暗中恢复2小时。
使用与室内真空管线连接的玻璃细胞收集器单元(glass cell collector unit)将大约5-6mL分散的悬浮液过滤至Whatman#4滤纸(5.5cm)上，使得每个样品获得5-6张滤纸。将滤纸放置至60x20mm的GN6培养基平板上，并在28℃在黑暗条件下培养。24、48、或72小时后，刮下来自2-5张滤纸的细胞，收集至管中，放置在干冰上，然后在-80℃冷冻。
在DNA投递的另一个例子中，使用从仪器制造商的方案改编的微粒轰击技术将纯化的无内切核酸酶的质粒制备物直接投递至玉米细胞。用生物射弹PDS-1000/HeTM系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)进行所有的轰击。对于粒子包被，将3mg1.0微米直径的金颗粒用100%乙醇清洗1次，用无菌蒸馏水清洗2次，并在硅化Eppendorf管中的50μl水中重悬。将5μg质粒DNA、20μl亚精胺(0.1M)和50μl氯化钙(2.5M)添加至金悬浮液。将混合物在室温温育10分钟，以10K rpm沉淀10秒，在60μl冷的100%乙醇中重悬，并将8-9μl分配至每个宏载体(macrocarrier)上。为了制备用于轰击的细胞，传代培养后3天从液体培养物中取出细胞簇(cell cluster)，并在皮氏皿中由加有各0.256M的甘露醇和山梨醇的生长培养基组成的渗透培养基上放置成直径为2.5cm的一个圆。轰击前将细胞在渗压剂中温育4小时。在上文所述仪器中发生轰击，这通过在1100psi和27英寸Hg(in of Hg)的真空条件下将组织放置在中间的支架上并遵循操作手册来进行。在处理后24小时的时间点，收获经轰击的细胞簇，在液氮中冷冻，并贮存在-80℃。
玉米细胞中DNA投递和ZFN瞬时表达的另一个例子牵涉原生质体制备物的利用。使用自Mitchell和Petolino(1991)J.Plant.Physiol.137:530-536和Lyznik等(1995)Plant J.8(2):177-186改良的方法，自HiII玉米细胞培养物制备原生质体。通过以1000rpm离心5分钟，在传代培养后48小时（对数生长中期）收获悬浮培养物。除去培养基，并在10ml W5培养基(154mM NaCl2；125mM CaCl2·H2O；5mM KCl2；5mM葡萄糖；pH5.8)中温和清洗5ml充实的PCV。
通过以100rpm离心5分钟来收集清洗后的细胞，随后在如下酶混合物中温育，所述酶混合物在25ml经过滤法除菌的K3培养基（2.5g KNO3；250mgNH4NO3；900mg CaCl2（二水合物）；250mg Mg2SO4；250mg NH4SO4；150mgNaPO4（单碱的）；250mg木糖；10ml硫酸亚铁/螯合物(chealate)储液(F318)；1ml B5微量营养物（1000X储液–750mg碘化钾；250mg钼酸（钠盐）脱水物；25mg氯化钴；25mg硫酸铜）；10ml K3维生素（100X储液–1g肌肉-肌醇；10mg盐酸吡哆醇；100mg盐酸硫胺素；10mg烟酸）；+0.6M甘露醇;pH5.8）中含有3%纤维素酶Y-C+0.3%果胶溶酶Y23(pectolyase Y23)(KarlanResearch Products Corp.,Cottonwood,AZ)。在温和搅动(50rpm)情况下在25℃温育细胞达5-6小时以便消化次生植物细胞壁。
细胞壁降解后，将酶-细胞混合物流经100微米的细胞滤网(cell strainer)过滤，并用等体积的K3+0.6M甘露醇培养基清洗包含原生质体和细胞碎片的流出液。以800rpm离心原生质体达5分钟，弃去上清液，并重复清洗。清洗原生质体沉淀物，并在20ml K3+0.6M甘露醇+9%Ficoll400溶液中重悬。将10ml该溶液分配至2个无菌塑料管中，并将2ml TM培养基(19.52g MES；36.45g甘露醇；40ml2M CaCl2·H2O储液；pH5.5))温和地覆盖在悬浮液上，形成不连续的梯度。
通过以800rpm离心5分钟来将能存活的原生质体与不能存活的原生质体、细胞碎片和完整的悬浮细胞分开。用移液管取出在梯度界面形成的不同原生质体带，并用10ml新鲜TM溶液清洗，接着以800rpm离心5分钟。在1mlTM培养基中重悬所得的原生质体沉淀物，并在血细胞计数器中用25mg/mg荧光素二乙酸酯(FDA)染色来对能存活的原生质体数目定量。将原生质体溶液调节至TM培养基中1x107个原生质体/ml的终浓度。
将大约1x106个原生质体(100μl)转移至装有10-80μg纯化的质粒DNA的2ml Eppendorf管。逐滴添加100μl40%PEG-3350(Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO)溶液，并温和地混合悬浮液。将原生质体/DNA混合物在室温温育30分钟，接着用1ml GN6生长培养基逐滴稀释。将经稀释的原生质体在该培养基中在25℃温育24小时，随后收获，在液氮中冷冻，并贮存在-80℃。
实施例17：体内ZFN功能性
在本实施例中ZFN的功能性理解为包括（但不限于）ZFN在作物物种的细胞中表达的能力及ZFN通过识别、结合和切割其期望的靶物来介导该作物的内源基因组中的双链断裂的能力。还应理解的是，在本实施例中，ZFN的靶物是作物基因组内内源基因座和构造中的基因。
为了评估工程化ZFN是否具有针对基因组环境中预测靶基因的功能性，开发了基于DNA序列的测定法。预测ZFN诱导的双链DNA断裂诱导修复机制，诸如非同源末端连接(NHEJ)（综述见Cahill等,(2006)Mechanisms FrontBiosci.1(11):1958-76）。NHEJ的一个结果是断裂DNA链的一部分会以不完善的方式被修复，导致在切割位点处少量的删除、插入或替代。本领域技术人员可通过多种方法来检测DNA序列中的这些变化。
A.基于PCR的克隆和测序
在一个例子中，在转化后24小时分离表达ZFN蛋白的玉米HiII培养细胞，冷冻，并使用Qiagen(Valencia,CA)植物DNeasy提取试剂盒依照制造商的推荐进行基因组DNA提取。使用对靶基因特异的且在预测的ZFN切割位点侧翼的寡核苷酸引物来实施PCR扩增。组合使用对靶定IPP2-K基因旁系同系物特异的正向PCR引物(5’-GGA AGC ATT ATT CCA ATT TGA TGA TAA TGG-3’)(SEQ ID NO:135)和反向PCR引物(5’-CCC AAG TGT CGA GGT TGT CAATAT GTT AC-3’)(SEQ ID NO:136)来在如下条件下扩增纯化的基因组DNA：25μl反应体积，在酶制造商的缓冲液中含有20ng gDNA模板、20pmol每种引物、1%DMSO和10个单位的Accuprime Pf聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)。具有预期大小的扩增产物源自由95℃-1’，(95℃-30”、61℃-30”、72℃-1’)X30，72℃-5’，4℃-保持组成的扩增循环。
使用TA克隆试剂盒(Invitrogen,Carlsbad,CA)将扩增片段直接克隆入载体pCR2.1(Invitrogen,Carlsbad,CA)中。用CEQ染料终止物循环测序试剂盒(Beckman Coulter,Fullerton,CA)依照制造商的推荐以96孔形式对所分离的克隆片段测序。在该实验中，预测ZFN蛋白结合2个短的IPP2-K基因特异性序列以产生能切割图66所示ds-DNA的异二聚体核酸酶。
对来自多个克隆的测序结果的分析揭示克隆#127包含正好在预测的ZFN切割位点处的小删除，指明NHEJ机制已经在此位点处介导了DNA序列的不完善修复（图67）。
这些结果证实这些工程化ZFN以特异性方式在作物物种内的内源基因座处诱导靶向的双链断裂的能力。
B.大规模平行测序分析
在另一个例子中，应用PCR和大规模平行高温测序(pyrosequencing)方法的组合来询问(interrogate)表达靶向此相同序列的不同ZFN蛋白的多个细胞样品的基因组。合成正向PCR引物的三种变体(5’-XXX CAC CAA GTT GTATTG CCT TCT CA-3’)(SEQ ID NO:137)（其中XXX=GGG、CCC或GGC）和反向PCR引物的三种变体(5’-XX XAT AGG CTT GAG CCA AGC AATCTT-3’)(SEQ ID NO:138)（其中XXX=GCC、CCG或CGG）(IDT,Coralville,IA)。每个引物5’端的3bp标签充当标识符密匙，并指明扩增子源自哪个细胞样品。组合使用具有匹配标识符标签（密匙）的引物对以在如下条件下扩增纯化的、自玉米细胞样品衍生的基因组DNA：50μl反应体积，在酶制造商的缓冲液中含有40ng gDNA模板、20pmol每种引物、1%DMSO和10个单位的Accuprime Pf聚合酶(Invitrogen,Carlsbad,CA)。具有预期大小的扩增产物源自由95℃-1’，(95℃-30”、61℃-30”、72℃-1’)X30，4℃-保持组成的扩增循环，并使用MinElute PCR纯化试剂盒(Qiagen,Valencia,CA)依照制造商的推荐来纯化。
由454Life Sciences(Branford,CT)如(Margulies等(2005)Nature437:376-380)中所述对PCR产物直接进行大规模平行高温测序反应（也称为454测序）。通过鉴定包含DNA分子内预期大小和位置的删除的序列读出来实施454测序结果的分析。
这些分析的结果指明在这些ZFN的预期切割位点处存在多种小的删除，如图68中所示的。这些删除精确地定位于ZFN靶位点，并指明在基因组中产生由ZFN所诱导的双链断裂，随后通过NHEJ进行修复。这些结果进一步证实这些工程化ZFN以特异性方式在作物物种内的内源基因座处诱导靶向的双链断裂的能力。
实施例18：用于靶向整合的供体DNA设计
在本实施例中，供体DNA理解为包括被投递至植物细胞中并掺入核基因组中的双链DNA分子。该掺入发生的机制可以是经由核DNA中双链断裂位点处的不依赖同源性的非同源末端连接（NHEJ；综述见Cahill等,(2006)Mechanisms Front Biosci.1:1958-76）或者另一种相似机制。供体DNA向基因组中的此类NHEJ驱动的、连接样掺入称为随机整合，因为供体DNA的整合位置主要由双链DNA断裂的存在决定。在该机制中，供体DNA向基因组中的整合不依赖于基因组中断裂位点处的核苷酸序列或者供体自身的核苷酸序列。因此，随机整合过程中，基因组中掺入供体DNA的“地址”不是基于供体DNA序列规定的或预测的。随机整合是标准植物转化过程中发生供体DNA基因转移的主要机制，所述标准植物转化经由土壤杆菌介导的或生物射弹介导的DNA向活植物细胞中的投递实现。
与随机整合相反，还可经由靶向整合在基因组中掺入供体DNA。靶向整合理解为经由同源性依赖性机制，诸如同源性依赖性单链退火或同源重组（综述见van den Bosch等(2002)Biol Chem.383(6):873-892）在双链断裂位点（位置）发生。在同源性依赖性DNA断裂修复的情况中，可在此位点处掺入包含与断裂位点处的DNA具有同一性或相似性的核苷酸序列的供体DNA。因此，供体DNA整合至基因组中的“地址”取决于基因组和供体DNA分子之间的核苷酸序列同一性或序列相似性。在植物系统中，已知DNA中双链断裂的修复利用NHEJ和同源性依赖性途径两者（综述见Puchta(2005)J.Exp.Bot.56:1-14）。
在本实施例中，我们描述了经由在序列特异性ZFN蛋白诱导的双链断裂位点处的靶向整合而要被整合至基因组中的供体DNA分子的设计和构建。不同ZFN蛋白可在靶基因序列中的不同核苷酸处诱导双链断裂；所诱导的双链断裂的特定位点称为位置。
如实施例13中所述，我们已经表征了来自玉米的靶基因IPP2K的核苷酸序列。随后，我们设计了结合该靶基因特定碱基的ZFN蛋白（实施例14），并证实其在两种异源系统中的靶基因内的该序列处和针对玉米细胞中内源基因的结合/切割活性（实施例15-17）。这里，我们描述了设计用于经由靶向整合而在IPP2K基因中ZFN介导的双链断裂位置掺入玉米基因组中的各种供体分子的构建。对于核苷酸序列已知且预测该序列包含双链断裂的任何基因组中的任何位置，本领域技术人员可构建设计用于经由同源性驱动的靶向整合而被掺入ZFN诱导的双链断裂中的供体DNA分子。
在本文所述的一个实施方案中，供体DNA分子包含以与靶定位置的靶基因IPP2K的核苷酸序列相同的核苷酸序列区段为界的自主除草剂耐受基因表达盒。在该实施方案中，自主除草剂耐受盒理解为包括完整启动子-转录单位(PTU)，其包含启动子、除草剂耐受基因和已知在植物细胞中为功能性的终止子序列。本领域技术人员可选择任何启动子、基因和终止子组合来构成自主PTU。该质粒构建体上还包括的是与玉米中所示位置的靶基因(IPP2K)具有序列同一性的DNA片段。这些片段充当供体DNA的“同源性侧翼”，并经由靶向整合在指定位置将该供体直接掺入靶基因中。在PTU的上游和下游以相对于PTU的正确5’-3’取向放置同源性侧翼。本领域技术人员了解供体DNA构建中具有不同大小和取向的同源性侧翼。
在本文所述的另一个实施方案中，供体DNA分子包括如下质粒构建，其包含以与靶位置的IPP2K核苷酸序列相同的核苷酸序列区段为界的非自主除草剂耐受基因表达盒。在该实施方案中，非自主除草剂耐受盒理解为包括缺乏功能性启动子的不完整启动子-转录单位(PTU)。非自主PTU确实包含除草剂耐受基因和已知在植物细胞中为功能性的终止子序列。本领域技术人员可选择任何基因和终止子组合来构成非自主PTU。在非自主供体的该例子中，除草剂耐受基因的表达依赖于供体区段向与功能性启动子接近的基因组位置中的掺入，所述功能性启动子可驱动该基因的表达。可了解相对罕见的如下情形，其中供体会经由随机整合而掺入其中存在偶然发现的启动子且该启动子可用于驱动除草剂耐受基因表达的遗传基因座中。或者，基于供体DNA构建内与玉米中特定位置的靶基因具有序列同一性的、合适长度的DNA片段的同源性侧翼的存在，可发生供体DNA向特定位置的靶基因中的精确靶向整合（如关于自主供体所述的），因此使用所述靶基因的内源启动子。在该实施方案中，在PTU的上游和下游以相对于PTU的正确5’-3’取向放置同源性侧翼。本领域技术人员连接供体DNA构建中具有不同大小和取向的同源性侧翼。
在本文所述的两个实施方案（自主的和非自主的供体设计）中，质粒构建典型地包含实现除草剂耐受基因克隆、表达、和随后分析的别的元件。此类元件包括细菌复制起点、改造的限制性位点等，并且在下文有记载。本领域技术人员了解构成供体DNA分子的不同元件的利用。
A.细菌菌株和培养条件
使用Luria-Bertani肉汤（LB:10g/L细菌培养用胰蛋白胨，10g/L NaCl、5g/L细菌培养用酵母提取物）、LB琼脂（加有15g/L细菌培养用琼脂的LB肉汤）、或Terrific肉汤（TB:12g/L细菌培养用胰蛋白胨，24g/L细菌培养用酵母提取物、0.4%v/v甘油，17mM KH2PO4、72mM K2HPO4)在37℃培养大肠杆菌菌株(One 
Figure BDA0000418219450000751
Top 10化学感受态细胞；MAX 
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DH5αTM化学感受态细胞，Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)达16小时。以200rpm摇动液体培养物。在需要时将氯霉素(50μg/ml)、卡那霉素(50μg/ml)、或氨苄青霉素(100μg/ml)添加至培养基。本研究中使用的所有抗生素、培养基和缓冲试剂均购自Sigma-Aldrich Corporation(St.Louis,MO)或Difco Laboratories(Detroit,MI)。
B.质粒主链位置-1
将包含IPP2K位置-1的同源性侧翼的质粒主链改造成容许将任何供体DNA序列整合至IPP2K基因的相应靶位点中。本领域技术人员了解使用各种克隆位点、模块设计元件和与感兴趣基因组内的任何靶序列同源的序列的质粒主链。这里例示的质粒主链由基础质粒载体pBC SK(-)噬菌粒(3.4Kbp)(Stratagene,La Jolla,CA)开始。使用下文所述4步合成来构建位置-1质粒主链。
在步骤#1中，制备基础质粒。在37℃使用10个单位Spe I和10个单位Not I(New England Biolabs,Beverly,MA)限制性内切核酸酶达1小时来使3μg pBCSK(-)线性化。在补充有0.5%溴化乙锭(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO)的1.0%TAE(0.04M Tris-乙酸盐,0.002M EDTA)琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现DNA片段，并通过与1Kbp DNA梯(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)比较来估计片段大小。对3.4Kbp经Spe I/Not I消化的亚克隆载体pBC SK(-)进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit,QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。
在步骤#2中，分离来自IPP2K位置-1的5’和3’同源性侧翼。由IntegratedDNA Technologies,Inc.(Coralville,IA)在标准脱盐条件下合成下列寡核苷酸引物，并用水稀释至0.125μg/ul的浓度：
5’-GCGGCCGCGTCTCACCGCGGCTTGGGGATTGGATACGGAGCT-3’(SEQ ID NO:143)
5’-ACTAGTGATATGGCCCCACAGGAGTTGCTCATGACTTG-3’(SEQ IDNO:144)
5’-ACTAGTCCAGAACTGGTTGAGTCGGTCAAACAAGATTGCT-3’(SEQID NO:145)
5’-GTCGACCTTGATGCTACCCATTGGGCTGTTGT-3’(SEQ ID NO:146)。
使用由TaKaRa Biotechnology Inc.,Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan提供的试剂实施PCR扩增反应，其组成如下：5μl10X LA PCRTM缓冲液II(Mg2+)、20ng双链gDNA模板（玉米HiII）、10pmol正向寡核苷酸引物、10pmol反向寡核苷酸引物、8μl dNTP混合物（各2.5mM）、33.5μl H2O、0.5μl（2.5个单位）TaKaRa LA TaqTMDNA聚合酶、1滴矿物油。使用Perkin-Elmer Cetus48样品DNA热循环仪(Norwalk,CT)在如下循环条件下进行PCR反应：94℃4分钟/1个循环；98℃20秒，65℃1分钟，68℃1分钟/30个循环；72℃，5分钟/1个循环；4℃/保持。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对15μl每个PCR反应电泳1小时。用紫外线显现扩增片段，并通过与1KbpDNA梯比较来估计片段大小。根据0.821Kbp（5’同源性侧翼）或0.821Kbp（3’同源性侧翼）DNA片段的存在来判断预期的扩增产物。
对这些片段进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGENInc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。然后使用TOPO TA
Figure BDA0000418219450000761
试剂盒（含
Figure BDA0000418219450000762
2.1载体）和One
Figure BDA0000418219450000763
TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)依照制造商的方案将纯化的片段克隆入pCR2.1质粒中。
将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000772
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位Spe I和Not I消化自5’同源性侧翼克隆质粒分离的3μg质粒。用10个单位Spe I和20个单位Sal I(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)消化3’同源性侧翼克隆质粒。将所有的质粒消化物在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据3.9Kbp
Figure BDA0000418219450000771
2.1载体外的0.821Kbp（5’同源性侧翼）或0.821Kbp（3’同源性侧翼）的插入DNA片段的存在来判断预期的质粒克隆。
使用CEQTM DTCS-快速开始试剂盒(CEQTM DTCS-Quick Start Kit,Beckman-Coulter,Palo Alto,CA)如制造商所述的那样实施质粒克隆的双链测序反应。使用Performa DTR凝胶过滤筒(Performa DTR Gel FiltrationCartridges,Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那样纯化反应。在Beckman-Coulter CEQTM2000XL DNA分析系统上分析序列反应，并使用SequencherTM4.1.4版(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)来进行核苷酸表征。在图87中显示了与自IPP2K衍生的位置-15’同源性侧翼对应的0.821Kbp片段的序列(SEQ ID NO:171)。在图88中显示了与自IPP2K衍生的位置-13’同源性侧翼对应的0.821Kbp片段的序列(SEQ ID NO:172)。
在步骤#3中，将位置-15’同源性侧翼连接至基础质粒中。对与包含正确位置-15’同源性侧翼序列的克隆对应的限制性片段进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。然后使用500个单位T4DNA连接酶(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)将与位置-15’同源性侧翼对应的片段(0.821Kbp)以1:5载体:插入物比例在20μl反应体积中在16℃水浴中温育16小时的条件下连接至用SpeI/Not I消化的纯化的基础质粒（步骤#1）。随后将5μl连接反应转化至大肠杆菌One
Figure BDA0000418219450000781
Top 10化学感受态细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)中，并在制造商所述的选择条件下铺板。将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。
温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000782
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位Spe I和Not I(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)消化3μg分离的质粒DNA，并在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据3.4Kbp基础质粒外的0.821Kbp插入DNA片段（5’同源性侧翼）的存在来判断预期的质粒克隆。
在步骤#4中，将位置-13’同源性侧翼连接至步骤#3的产物中。在37℃使用10个单位Spe I和20个单位Sal I(New England Biolabs,Beverly,MA)限制性内切核酸酶达1小时来使3μg步骤#3中所述改造产物线性化。在补充有0.5%溴化乙锭(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO)的1.0%TAE(0.04M Tris-乙酸盐,0.002M EDTA)琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现DNA片段，并通过与1Kbp DNA梯(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)比较来估计片段大小。对约4.2Kbp经Spe I/Sal I消化的来自步骤#3的产物进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。
随后使用1:5的载体:插入物比例和500个单位T4DNA连接酶(InvitrogenLife Technologies,Carlsbad,CA)将步骤#2中生成的3’同源性侧翼供体的分离片段(0.821Kbp)与如上文所述用Spe I/Sal I消化并纯化的步骤#3产物在20μl连接反应中混合。将连接反应在16℃水浴中温育16小时。连接之后，将5μl连接反应转化至MAX 
Figure BDA0000418219450000783
DH5αTM化学感受态细胞(Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，这依照制造商的推荐进行。将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml氯霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中。
将培养物在200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000791
质粒试剂盒(BDBiosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位Sal I和Not I(New England Biolabs,Beverly,MA)消化3μg分离的质粒，并在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据1.64Kbp（插入物）和3.33Kbp（基础质粒）的两种DNA片段的存在来判断预期克隆。所得的质粒命名为pDAB7471（图70）。
C.质粒主链位置-2
将包含IPP2K位置-2的同源性侧翼的质粒主链改造成容许将任何供体DNA序列整合至IPP2K基因的相应靶位点中。本领域技术人员了解使用各种克隆位点、模块设计元件和与感兴趣基因组内的任何靶序列同源的序列的质粒主链。这里例示的质粒主链由基础质粒载体pBC SK(-)噬菌粒(3.4Kbp)(Stratagene,La Jolla,CA)开始。使用下文所述4步合成来构建位置-2质粒主链。
在步骤#1中，制备基础质粒。在37℃使用10个单位Spe I和10个单位Not I(New England Biolabs,Beverly,MA)限制性内切核酸酶达1小时来使3μg pBCSK(-)线性化。在补充有0.5%溴化乙锭(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO)的1.0%TAE(0.04M Tris-乙酸盐,0.002M EDTA)琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现DNA片段，并通过与1Kbp DNA梯(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)比较来估计片段大小。对3.4Kbp经Spe I/Not I消化的亚克隆载体pBC SK(-)进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAquick Gel Extraction Kit,QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。
在步骤#2中，分离来自IPP2K位置-2的5’和3’同源性侧翼。由IntegratedDNA Technologies,Inc.(Coralville,IA)在标准脱盐条件下合成下列寡核苷酸引物，并用水稀释至0.125μg/ul的浓度：
5’-GCGGCCGCTAGATAGCAGATGCAGATTGCT-3’(SEQ ID NO:147)
5’-ACTAGTATTGGCACCCAGGTGTTGGCTCA-3’(SEQ ID NO:148)
5’-ACTAGTCATGTCGATGGTGGGGTATGGTTCAGATTCAG-3’(SEQ IDNO:149)
5’-GTCGACGTACAATGATTTCAGGTTACGGCCTCAGGAC-3’(SEQ IDNO:150)。
使用由TaKaRa Biotechnology Inc.,Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan提供的试剂实施PCR扩增反应，其组成如下：5μl10X LA PCRTM缓冲液II(Mg2+)、20ng双链gDNA模板（玉米HiII）、10pmol正向寡核苷酸引物、10pmol反向寡核苷酸引物、8μl dNTP混合物（各2.5mM）、33.5μl H2O、0.5μl（2.5个单位）TaKaRa LA TaqTMDNA聚合酶、1滴矿物油。使用Perkin-Elmer Cetus48样品DNA热循环仪(Norwalk,CT)在如下循环条件下实施PCR反应：94℃4分钟/1个循环；98℃20秒，55℃1分钟，68℃1分钟/30个循环；72℃5分钟/1个循环；4℃/保持。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对15μl每个PCR反应电泳1小时。用紫外线显现扩增片段，并通过与1KbpDNA梯比较来估计片段大小。根据0.855Kbp（5’同源性侧翼）或0.845Kbp（3’同源性侧翼）DNA片段的存在来判断预期的扩增产物。对这些片段进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。然后使用TOPO TA 
Figure BDA0000418219450000801
试剂盒（含2.1载体）和One 
Figure BDA0000418219450000803
TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)依照制造商的方案将纯化的片段克隆入pCR2.1质粒中。
将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000804
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位Spe I和Not I消化自5’同源性侧翼克隆质粒分离的3μg质粒。用10个单位Spe I和20个单位Sal I(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)消化3’同源性侧翼克隆质粒(threeprime-homology flank clone plasmid)。将所有的质粒消化物在37℃温育1小时。
在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据3.9Kbp 
Figure BDA0000418219450000805
2.1载体外的0.855Kbp（5’同源性侧翼）或0.845Kbp（3’同源性侧翼）的插入DNA片段的存在来判断预期的质粒克隆。
使用CEQTM DTCS-快速开始试剂盒(CEQTM DTCS-Quick Start Kit,Beckman-Coulter,Palo Alto,CA)如制造商所述的那样实施质粒克隆的双链测序反应。使用Performa DTR凝胶过滤筒(Performa DTR Gel FiltrationCartridges,Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那样纯化反应。在Beckman-Coulter CEQTM2000XL DNA分析系统上分析序列反应，并使用SequencherTM4.1.4版(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)来进行核苷酸表征。在图89中显示了与自IPP2K衍生的位置-25’同源性侧翼对应的0.855Kbp片段的序列(SEQ ID NO:139)。在图90中显示了与自IPP2K衍生的位置-23’同源性侧翼对应的0.845Kbp片段的序列(SEQ ID NO:140)。
在步骤#3中，将位置-15’同源性侧翼连接至基础质粒中。对与包含正确位置-25’同源性侧翼序列的克隆对应的限制性片段进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。然后使用500个单位T4DNA连接酶(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)将与位置-15’同源性侧翼对应的片段(0.855Kbp)以1:5载体:插入物比例在20μl反应体积中在16℃水浴中温育16小时的条件下连接至用SpeI/Not I消化的纯化的基础质粒（步骤#1）。
随后将5μl连接反应转化至大肠杆菌One 
Figure BDA0000418219450000811
Top 10化学感受态细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)中，并在制造商所述的选择条件下铺板。将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000812
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位Spe I和Not I(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)消化3μg分离的质粒DNA，并在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据3.4Kbp基础质粒外的0.855Kbp插入DNA片段（5’同源性侧翼）的存在来判断预期的质粒克隆。
在步骤#4中，将位置-23’同源性侧翼连接至步骤#3的产物中。在37℃使用10个单位Spe I和20个单位Sal I(New England Biolabs,Beverly,MA)限制性内切核酸酶达1小时来使3μg步骤#3中所述改造产物线性化。在补充有0.5%溴化乙锭(Sigma-Aldrich Corporation,St.Louis,MO)的1.0%TAE(0.04M Tris-乙酸盐,0.002M EDTA)琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现DNA片段，并通过与1Kbp DNA梯(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)比较来估计片段大小。对4.25Kbp经Spe I/Sal I消化的来自步骤#3的产物进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。
随后使用1:5的载体:插入物比例和500个单位T4DNA连接酶(InvitrogenLife Technologies,Carlsbad,CA)将步骤#2中生成的3’同源性侧翼供体的分离片段(0.845Kbp)与如上文所述用Spe I/Sal I消化并纯化的步骤#3产物在20μl连接反应中混合。将连接反应在16℃水浴中温育16小时。连接之后，将5μl连接反应转化至MAX 
Figure BDA0000418219450000821
DH5αTM化学感受态细胞(Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，这依照制造商的推荐进行。将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml氯霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中。将培养物在200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000822
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位Sal I和Not I(New EnglandBiolabs,Beverly,MA)消化3μg分离的质粒，并在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据约1.7Kbp（插入物）和3.33Kbp（基础质粒）的两种DNA片段的存在来判断预期克隆。所得的质粒命名为pDAB7451（图71）。
D.自主除草剂耐受基因表达盒构建
构建包含完整启动子-转录单位(PTU)的自主除草剂耐受基因表达盒（图72），所述完整启动子-转录单位(PTU)包含启动子、除草剂耐受基因、和聚腺苷酸化（聚腺苷酸）终止序列。在该实施方案中，启动子序列衍生自稻(O.sativa)肌动蛋白1[McElroy等(Plant Cell2,163-171;1990);GenBank登录号S44221和GenBank登录号X63830]。除草剂耐受基因包含PAT（膦丝菌素乙酰转移酶）基因，其赋予对除草剂Bialaphos的抗性（最初自绿色产色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)衍生的PAT编码区(GenBank登录号M22827；Wohlleben等Gene70,25-37;1988)的修饰型式）。对M22827的最长可读框的最初序列的修饰是实质性的，并包括改变密码子利用样式以优化植物中的表达。除用甲硫氨酸替换缬氨酸作为第一个编码氨基酸，并添加丙氨酸作为第二个编码氨基酸之外，自pDAB3014的PAT可读框编码的蛋白质与登录号M22827的最长可读框编码的蛋白质相同。以GenBank登录号I43995找到PAT的再建(rebulit)型式。终止子序列衍生自玉蜀黍(Z.mays L.)脂肪酶[GenBank登录号L35913的玉米脂肪酶cDNA克隆，只是用pDAB3014中第2468位G替换L35913第1093位C。该玉米序列为PAT基因包含3’非翻译区/转录终止子区]。
由Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,IA)在标准脱盐条件下合成下列寡核苷酸引物，并用水稀释至0.125μg/μl浓度：
5’-ACTAGTTAACTGACCTCACTCGAGGTCATTCATATGCTTGA-3’(SEQID NO:151)
5’-ACTAGTGTGAATTCAGCACTTAAAGATCT-3’(SEQ ID NO:152)。
使用由TaKaRa Biotechnology Inc.,Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan提供的试剂实施PCR扩增反应，其组成如下：5μl10X LA PCRTM缓冲液II(Mg2+)、20ng双链模板[pDAB3014质粒DNA]、10pmol正向寡核苷酸引物、10pmol反向寡核苷酸引物、8μl dNTP混合物（各2.5mM）、33.5μl H2O、0.5μl（2.5个单位）TaKaRa LA TaqTMDNA聚合酶、1滴矿物油。使用Perkin-ElmerCetus 48样品DNA热循环仪(Norwalk,CT)在如下循环条件下实施PCR反应：94℃4分钟/1个循环；98℃20秒，55℃1分钟，68℃3分钟/30个循环；72℃5分钟/1个循环；4℃/保持。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对15μl每个PCR反应电泳1小时。
用紫外线显现扩增片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据2.3Kbp DNA片段的存在来判断预期的扩增产物。对该片段进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。然后使用TOPO TA
Figure BDA0000418219450000831
试剂盒将纯化片段克隆入pCR2.1质粒中，并转化至OneTOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)中，均依照制造商的方案进行。
将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000841
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位Spe I和Not I消化3μg分离的质粒。将所有质粒消化物在37℃温育1小时。
在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据3.9Kbp
Figure BDA0000418219450000842
2.1载体外的2.325Kbp的插入DNA片段的存在来判断预期的质粒克隆。使用CEQTM DTCS-快速开始试剂盒(Beckman-Coulter,Palo Alto,CA)如制造商所述的那样实施质粒克隆的双链测序反应。使用Performa DTR凝胶过滤筒(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那样纯化反应。在Beckman-Coulter CEQTM2000XL DNA分析系统上分析序列反应，并使用SequencherTM4.1.4版(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)来进行核苷酸表征。
E.自主除草剂耐受基因盒插入质粒主链——自主供体中
为了创建供体质粒，将实施例18D中所述自主除草剂耐受基因盒插入实施例18B和18C中所述质粒主链构建体中。对自包含上文所述预期2.325Kbp序列的克隆衍生的限制性片段（图72）进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导来进行纯化。
然后将该片段与已经用限制酶Spe I消化、且随后去磷酸化的纯化的pDAB7471（位置-1质粒主链，图70）或pDAB7451（位置-2质粒主链，图71）在连接反应中组合。在如下条件下实施连接：在20μl的反应体积中1:5载体:插入物比例和500个单位T4DNA连接酶(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)，在16℃水浴中温育16小时的条件下。随后将5μl连接反应转化至50μl大肠杆菌MAX
Figure BDA0000418219450000844
DH5αTM化学感受态细胞(Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,CA)中，并在制造商所述选择条件下铺板。
将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml氯霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000843
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位Spe I(New England Biolabs,Beverly,MA)消化3μg分离的质粒DNA，并在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据2.325Kbp和约4.9Kbp（pDAB7471载体）或2.325Kbp和约5.0Kbp（pDAB7451载体）DNA片段的存在来判断预期的质粒克隆。
所得的质粒分别命名为pDAB7422（位置-1自主供体）（图73）和pDAB7452（位置-2自主供体）（图74）。
F.非自主除草剂耐受基因表达盒构建
构建包含不完整启动子-转录单位(PTU)的非自主除草剂耐受基因表达盒（图75）。在该实施方案中，使用利用自Thesoa assigna病毒衍生的2A序列(Mattion,N.M.,Harnish,E.C.,Crowley,J.C.和Reilly,P.A.(1996)J.Virol.70,8124-8127)、除草剂耐受基因和聚腺苷酸化（聚腺苷酸）终止序列（但没有启动子）的功能性的策略。在该实施方案中，2A翻译终止信号序列已经被改造成与除草剂耐受基因以符合读码框的方式翻译。另外，2A/除草剂编码序列已经被改造成与IPP2K基因靶物的翻译读码框相符。除草剂耐受基因包含PAT（膦丝菌素乙酰转移酶）基因，其赋予对除草剂Bialaphos的抗性（最初自绿色产色链霉菌衍生的PAT编码区(GenBank登录号M22827；Wohlleben等,Gene70,25-37;1988)的修饰型式）。对M22827的最长可读框的最初序列的修饰是实质性的，并包括改变密码子利用样式以优化植物中的表达。除用甲硫氨酸替换缬氨酸作为第一个编码氨基酸，并添加丙氨酸作为第二个氨基酸之外，自pDAB3014的PAT可读框编码的蛋白质与M22827的最长可读框（其开始于M22827第244位的GTG）编码的蛋白质相同。以GenBank登录号I43995找到PAT的再建(rebulit)型式。终止子序列衍生自玉蜀黍脂肪酶[GenBank登录号L35913的玉米脂肪酶cDNA克隆，只是用pDAB3014中第2468位G替换L35913第1093位C]。该玉米序列为PAT基因包含3’非翻译区/转录终止子区。
由Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,IA)在标准脱盐条件下合成下列寡核苷酸引物，并用水稀释至0.125μg/μl浓度：
5’-ACTAGTGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGATGGCTTCTCCGGAGAGGAGACCAGTTGA-3(SEQ ID NO:153)
5’-ACTAGTATGCATGTGAATTCAGCACTTAAAGATCT-3’(SEQ IDNO:154)。
使用由TaKaRa Biotechnology Inc.(Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan)提供的试剂实施PCR扩增反应，其组成如下：5μl10X LA PCRTM缓冲液II(Mg2+)、20ng双链模板(pDAB3014质粒DNA)、10pmol正向寡核苷酸引物、10pmol反向寡核苷酸引物、8μl dNTP混合物（各2.5mM）、33.5μl H2O、0.5μl（2.5个单位）TaKaRa LA TaqTMDNA聚合酶、1滴矿物油。使用Perkin-ElmerCetus 48样品DNA热循环仪(Norwalk,CT)在如下循环条件下实施PCR反应：94℃4分钟/1个循环；98℃20秒，55℃1分钟，68℃2分钟/30个循环；72℃5分钟/1个循环；4℃/保持。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对15μl每个PCR反应电泳1小时。用紫外线显现扩增片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据约1Kbp DNA片段的存在来判断预期的扩增产物。对该片段进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。然后使用TOPO TA
Figure BDA0000418219450000861
试剂盒将纯化片段克隆入pCR2.1质粒中，并转化至One 
Figure BDA0000418219450000862
TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)中，均依照制造商的方案进行。
将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000863
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位Spe I消化3μg分离的质粒。将所有质粒消化物在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据约1.0Kbp插入DNA片段和3.9Kbp(
Figure BDA0000418219450000864
2.1载体)的存在来判断预期的质粒克隆。使用CEQTM DTCS-快速开始试剂盒(Beckman-Coulter,Palo Alto,CA)如制造商所述的那样实施质粒克隆的双链测序反应。使用Performa DTR凝胶过滤筒(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那样纯化反应。在Beckman-CoulterCEQTM2000XL DNA分析系统上分析序列反应，并使用SequencherTM4.1.4版(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)来进行核苷酸表征。
G.非自主除草剂耐受基因盒插入质粒主链——非自主供体中
为了创建供体质粒，将实施例18F中所述非自主除草剂耐受基因盒插入实施例18B和18C中所述质粒主链构建体中。对与包含正确的1Kbp序列的克隆对应的限制性片段进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导来纯化。然后将该片段与已经用限制酶Spe I消化、且随后去磷酸化的纯化的pDAB7471（位置-1质粒主链）（图70）或pDAB7451（位置-2质粒主链）（图71）在连接反应中组合。在如下条件下实施连接：在20μl的反应体积中的1:5载体:插入物比例和500个单位T4DNA连接酶(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)，在16℃水浴中温育16小时的条件下。随后将5μl连接反应转化至50μl大肠杆菌MAX
Figure BDA0000418219450000871
DH5αTM化学感受态细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)中，并在制造商所述选择条件下铺板。
将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml氯霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000872
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位Spe I(New England Biolabs,Beverly,MA)消化3μg分离的质粒DNA，并在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据1.0Kbp和4.96Kbp（pDAB7471载体）或1.0Kbp和约5.0Kbp（pDAB7451载体）DNA片段的存在来判断预期的质粒克隆。所得的质粒分别命名为pDAB7423（位置-1非自主供体）（图76）和pDAB7454（位置-2非自主供体）（图77）。
H.位置1ZFN+HR供体序列：组合质粒
作为两个分开的质粒向植物细胞中投递（例如一个质粒包含ZFN元件而另一个包含除草剂耐受供体序列）的替代策略，单一的质粒被改造成包含本专利中例示的所有必要元件。本实施例中所述组合质粒包含设计用于靶向特定IPP2K基因座并在那里产生双链断裂的ZFN以及设计用于整合至那些断裂位点中的自主PAT PTU和/或非自主2A/PAT PTU和供体侧翼两者。
利用
Figure BDA0000418219450000873
技术（其使用基于λ噬菌体的位点特异性重组(Landy,A.(1989)Ann.Rev.Biochem.58:913)）来将载体pDAB7422和pDAB7423（实施例6E和6G中所述的）转变成
Figure BDA0000418219450000881
目的载体。一旦被转变，可容易地将包含ZFN表达盒（收容在
Figure BDA0000418219450000882
进入载体(entry vector)中）的质粒动员(mobilize)至目的载体，创建ZFN/供体组合质粒。在37℃用10个单位Not I(New England Biolabs,Beverly,MA)消化各1μg此类质粒达1小时。在65℃将Not I限制性内切核酸酶加热灭活15分钟，随后使用3个单位虾碱性磷酸酶(SAP)(Roche Diagnostics GmbH,Mannheim,Germany)在37℃对片段末端进行去磷酸化达1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现载体片段（pDB7422=7.317Kbp，pDAB7423=5.971Kbp），通过与1Kbp DNA梯比较来估计大小，进行凝胶切割，随后使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。
然后将该载体片段与包含
Figure BDA0000418219450000883
Technology元件attR1、ccdB、CmR、和attR2的2.274Kbp Not I片段在以如下条件下实施的连接反应中组合：在20μl的反应体积中1:5的载体:插入物比例和500个单位T4DNA脂肪酶(InvitrogenLife Technologies,Carlsbad,CA)，在16℃水浴中温育16小时的条件下。随后将5μl的连接反应转化至50μl大肠杆菌One ccdB SurvivalTM化学感受态细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)中，并在制造商所述选择条件下铺板。
将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml氯霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000885
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位EcoRII(New EnglandBioLabs,Inc.,Beverly,MA)消化3μg分离的质粒DNA，并在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp DNA梯比较来估计片段大小。根据1.448Kbp、1.946Kbp、和6.197Kbp的DNA片段（自主PAT PTU位置-1HR供体）和5.807Kbp和2.438Kbp的DNA片段（非自主PAT位置-1HR供体）的存在来判断预期的质粒克隆。所得的质粒分别命名为pDAB7424（经
Figure BDA0000418219450000886
改编的位置-1自主供体）（图78）和pDAB7425（经
Figure BDA0000418219450000891
改编的位置-1非自主供体）（图79）。
作为这些克隆操作的结果，将质粒pDAB7424和pDAB7425设计为
Figure BDA0000418219450000892
目的载体。pDAB7412具有作为包含如下元件的
Figure BDA0000418219450000893
进入载体的功能性：ZmUbi1v.2/ZFN12/Zm Per53’UTR。为了将ZFN表达盒（进入载体）转移至自主的或非自主的供体分子（
Figure BDA0000418219450000895
目的载体）中，以50ng（进入载体）:150ng/μl（目的载体）的比例实施LR ClonaseTM II(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)反应，如制造商所概述的那样进行。所得的阳性组合载体命名为pDAB7426（位置-1自主HR供体/ZFN12）（图80）和pDAB7427（非自主HR供体/ZFN12）（图81）。
实施例19：ZFN和供体DNA向植物细胞中的投递
为了经由靶向整合而实现ZFN介导的、供体DNA向植物基因组中的整合，应理解的是，需要投递编码ZFN的DNA，接着在植物细胞中表达功能性ZFN蛋白。还需要的是供体DNA向所述植物细胞的相伴投递，使得功能性ZFN蛋白可在靶DNA上诱导双链断裂，然后所述双链断裂经由供体DNA向靶基因座中的同源性驱动整合而得到修复。本领域技术人员了解，可通过数种方法来实现功能性ZFN蛋白的表达，包括但不限于ZFN编码构建体的基因转移、或ZFN编码构建体的瞬时表达。在这两种情况中，在植物细胞中同时实现功能性ZFN蛋白的表达和供体DNA的投递以驱动靶向整合。
在这里引用的实施例中，我们演示用于向植物细胞中相伴投递ZFN编码DNA和供体DNA的方法。本领域技术人员可使用多种适于植物细胞的DNA投递方法之任一种，包括但不限于土壤杆菌介导的转化、基于生物射弹的DNA投递或WhiskersTM介导的DNA投递。在这里所述的一个实施方案中，使用供体DNA与ZFN编码DNA构建体的各种组合来实施WhiskersTM介导的DNA投递实验。这些组合包括1)包含ZFN编码序列和供体DNA两者的单一质粒和2)两个不同的质粒，一个包含ZFN编码序列而另一个包含供体DNA。在另一个实施方案中，使用供体DNA与ZFN编码DNA构建体的各种组合来实施基于生物射弹的DNA投递。本领域技术人员了解这些组合可包括1)包含ZFN编码序列和供体DNA两者的单一质粒和2)两个不同的质粒，一个包含ZFN编码序列而另一个包含供体DNA。
A.Whiskers TM 介导的DNA投递
如本文较早所述，生成玉米的胚发生Hi-II细胞培养物，并用作证实靶向整合的活植物细胞的来源。本领域技术人员可利用自多种植物物种衍生的细胞培养物、或自多种植物物种衍生的分化植物组织作为证实靶向整合的活植物细胞的来源。
在本实施例中，将12ml来自先前低温保存细胞系的PCV加上28ml条件化培养基传代培养至500ml Erlenmeyer烧瓶中的80ml GN6液体培养基（N6培养基(Chu等,1975)，2.0mg/L2,4-D，30g/L蔗糖，pH5.8）中，并在摇瓶机（125rpm，28℃）上放置。使用相同的细胞系重复该步骤两次，使得总共36mlPCV在3个烧瓶间分配。24小时后，除去GN6液体培养基，并用72ml GN6S/M渗透培养基（N6培养基，2.0mg/L2,4-D，30g/L蔗糖，45.5g/L山梨醇，45.5g/L甘露醇，100mg/L肌肉-肌醇，pH6.0）替换。在中等搅动(125rpm)情况中在28℃在黑暗中温育烧瓶达30-35分钟。温育期期间，通过将8.1ml GN6S/M液体培养基添加至405mg无菌的、碳化硅晶须(Advanced Composite Materials,LLC,Greer,SC)来制备50mg/ml碳化硅晶须悬浮液。
在GN6S/M渗透培养基中温育后，将每个烧瓶的内含物合并至250ml离心瓶中。在烧瓶中的所有细胞沉降至底部后，吸取超过约14ml GN6S/M液体的内含物体积，并收集在无菌的1L烧瓶中，供未来使用。以最高速度使预先湿润的晶须悬浮液涡旋混合60秒，然后添加至离心瓶。
在将包含ZFN编码序列加上供体DNA两者的单一质粒投递至植物细胞中的一个例子中，将170μg纯化的环状质粒DNA添加至瓶中。在将两个不同的质粒进行共投递（一个包含ZFN编码序列而另一个包含供体DNA）的一个备选例子中，评估关于DNA量的多种策略。一种策略利用85μg供体DNA和85μg锌指编码DNA。其它改良形式利用10、5、或1倍供体DNA比1倍锌指DNA的摩尔比例，这基于质粒个体的大小（以千个碱基对计），使得每个瓶子添加总共170μg DNA。在所有共投递的情况中，在管中预先冷却DNA，之后添加至离心瓶中。一旦添加DNA，立即将瓶子放置在改良的Red Devil5400商用涂料混合器(Red Devil Equipment Co.,Plymouth,MN)中，并搅动10秒。搅动后，将细胞、培养基、晶须和DNA的混合物连同125ml新鲜的GN6液体培养基一起添加至1L烧瓶的内含物以降低渗压剂(osmoticant)。容许细胞在设置成125rpm的摇瓶机上恢复2小时。使用与室内真空管线连接的玻璃细胞收集器单元将6mL分散的悬浮液过滤至Whatman#4滤纸(5.5cm)上，使得每个瓶子获得60张滤纸。将滤纸放置在60x20mm GN6固体培养基（与GN6液体培养基相同，只是具有2.5g/L Gelrite胶凝剂）平板上，并在28℃在黑暗条件下培养1周。
B.生物射弹介导的DNA投递
在这里引用的例子中，将玉米的胚发生悬浮液传代培养至GN6液体培养基中24小时，之后进行本文较早所述实验。取出过量的液体培养基，并将约0.4PCV细胞在含有用2.5g/L Gelrite凝固的GN6S/M培养基的100x15mm皮氏皿的中心上稀疏地涂布成直径2.5cm的一个圆。将细胞在黑暗条件下培养4小时。为了用DNA包被生物射弹颗粒，将3mg1.0微米直径的金颗粒用100%乙醇清洗1次，用无菌蒸馏水清洗2次，并在50μl在硅化Eppendorf管中的水中重悬。将总共5μg质粒DNA、20μl亚精胺(0.1M)和50μl氯化钙(2.5M)分开添加至金悬浮液，并涡旋混合。将混合物在室温温育10分钟，在台式微型离心机中以10,000rpm沉淀10秒，在60μl冷的100%乙醇中重悬，并将8-9μl分配至每个宏载体上。
使用生物射弹PDS-1000/HeTM系统(Bio-Rad Laboratories,Hercules,CA)进行轰击。在1100psi和27英寸Hg真空条件下将含有细胞的平板放置在中间的支架上，并遵循操作手册来进行轰击。轰击后16小时，将组织以小块转移至GN6(1H)培养基，并在28℃在黑暗条件下培养2-3周。每2-4周继续转移，直至出现源自供体DNA整合的推定转基因分离群。经由生物射弹介导的DNA投递产生的推定供体DNA整合事件的鉴定、分离和再生与用于经由WhiskersTM介导的DNA投递产生的推定供体DNA整合事件的方法相同，并在下文描述。
C.推定靶向整合转基因事件的鉴定和分离
DNA投递后1周，将滤纸转移至60x20mm GN6(1H)选择培养基（N6培养基，2.0mg/L2,4-D，30g/L蔗糖，100mg/L肌肉-肌醇，1.0mg/L来自Herbiace(Meiji Seika,Japan)的Bialaphos，2.5g/L Gelrite，pH5.8）平板上。将这些选择平板在28℃在黑暗中温育1周。
在黑暗中选择1周后，通过将一半来自每块平板的细胞刮入装有3.0mL保持在37-38℃的GN6琼脂糖培养基（N6培养基，2.0mg/L2,4-D，30g/L蔗糖，100mg/L肌肉-肌醇，7g/L 
Figure BDA0000418219450000911
琼脂糖，pH5.8，在121℃高压灭菌仅10分钟）和1mg/L来自Herbiace的Bialaphos的管中来将组织埋置于新鲜培养基上。
用刮铲打碎琼脂糖/组织混合物，随后将3mL琼脂糖/组织混合物均匀地倒到100x15mm包含GN6(1H)培养基的皮氏皿的表面上。对每块平板中两边半块重复该过程。一旦包埋所有组织，则用
Figure BDA0000418219450000921
或
Figure BDA0000418219450000922
各个密封平板，并在28℃在黑暗条件下培养长达10周。从包埋平板中取出在这些选择条件下生长的推定转化分离群，并转移至60x20mm平板中的新鲜选择培养基。若在约2周后持续生长是明显的，则事件视为对所应用的除草剂(Bialophos)有抗性，随后将细胞的等分试样收获至2mL Eppendorf管中，用于基因型分析。
本领域技术人员可利用供体DNA中编码任何合适选择标志的基因，并对活细胞应用相当的选择条件。例如，可执行备选的选择标志基因（诸如AAD-1，如WO2005/107437A2所述的）作为供体，用于本文所述玉米细胞中整合事件的选择和回收。
实施例20：经由PCR基因型分型来筛选靶向整合事件
在本实施例中，PCR基因型分型理解为包括但不限于聚合酶链式反应(PCR)扩增自分离的玉米胼胝体（其预测包含嵌入基因组中的供体DNA）衍生的基因组DNA，接着是PCR扩增产物的标准克隆和序列分析。PCR基因型分型的方法已经有详细记载（例如Rios,G.等(2002)Plant J.32:243-253），并可应用于自任何植物物种或组织类型（包括细胞培养物）衍生的基因组DNA。
本领域技术人员可设计用于PCR基因型分型的策略，其包括（但不限于）植物基因组中特定序列的扩增、植物基因组中多个特定序列的扩增、植物基因组中非特定序列的扩增、或其组合。扩增后接着可以是克隆和测序（如本实施例中所述的），或扩增产物的直接序列分析。本领域技术人员了解可用于分析本文所产生扩增片段的备选方法。
在本文所述的一个实施方案中，在PCR扩增中采用对基因靶物特异的寡核苷酸引物。在本文所述的另一个实施方案中，在PCR扩增中采用对供体DNA序列特异的寡核苷酸引物。另一个实施方案包括结合基因靶序列和供体DNA序列两者的寡核苷酸引物的组合。本领域技术人员可设计用于询问基因组的别的引物组合和扩增反应。
A.基因组DNA提取
自分离的、除草剂耐受的实施例19所述玉米细胞中提取基因组DNA(gDNA)，并用作PCR基因型分型实验的模板。依照
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96植物试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)详述的制造商方案自约100-300μl充实细胞体积(PCV)的如上文所述分离的除草剂耐受的HiII胼胝体提取gDNA。在100μl试剂盒提供的洗脱缓冲液中洗脱基因组DNA，产生20-200ng/μl的终浓度，随后经由下文概述的基于PCR的基因型分型方法来分析。
B.用于PCR基因型分型的引物设计
本领域技术人员可使用多种用于设计和实施基于PCR的基因型分型的策略。设计用于退火至基因靶物、供体DNA序列和/或两者组合的寡核苷酸引物是可行的。为了设计能退火至不为被构建至供体DNA分子中的同源性侧翼所包围的区域中的IPP2K基因靶物的寡核苷酸引物，经由DNA测序来表征包含别的基因靶序列数据的质粒克隆。使用CEQTM DTCS-快速开始试剂盒(Beckman-Coulter,Palo Alto,CA)如制造商所述进行质粒克隆的双链测序反应。使用Performa DTR凝胶过滤筒(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商方案所述的那样纯化反应。在Beckman-Coulter CEQTM2000XL DNA分析系统上分析序列反应，并使用4.1.4版(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)进行核苷酸表征。这些序列对应于ZFN靶定区域上游(5’-)和下游(3’-)的IPP2K基因区域，并描绘在图91(SEQ ID NO:141)和图92(SEQ IDNO:142)中。
在这里提出的例子中，由Integrated DNA Technologies,Inc.(Coralville,IA)在标准脱盐条件下合成所有的寡核苷酸引物，并用水稀释至100μM浓度。下组正向和反向寡核苷酸引物设计用于退火至位于供体DNA序列的边界外的、IPP2K基因靶物特异的gDNA序列。这些寡核苷酸如下：
5’-TGGACGGAGCGAGAGCCAGAATTCGACGCT G-3’(SEQ ID NO:153)
5’-GTGCAAGAATGTATTGGGAATCAACCTGAT G-3’(SEQ ID NO:154)。
第二组正向和反向寡核苷酸引物也设计用于退火至供体DNA序列的边界外的、IPP2K基因靶物特异的gDNA序列，但是其嵌套在第一对之内：
5’-CTGTGGTACCAGTACTAGTACCAGCATC-3’(SEQ ID NO:155)
5’-TCT TGGATCAAGGCATCAAGC ATTCCAATCT-3’(SEQ ID NO:156)。
另外设计用于特异性退火至与除草剂耐受基因的编码区对应的供体DNA的正向和反向寡核苷酸引物：
5’-TGGGTAACTGGCCTAACTGG-3’(SEQ ID NO:157)
5’-TGGAAGGCTAGGAACGCTTA-3’(SEQ ID NO:158)
5’-CCAGTTAGGCCAGTTACCCA-3’(SEQ ID NO:159)
5’TAAGCGTTCCTAGCCTTCCA-3’(SEQ ID NO:160)。
C.供体DNA特异的PCR扩增
使用由TaKaRa Biotechnology Inc.,Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan提供的试剂实施初次PCR扩增反应，其组成如下：2.5μl10X Ex TaqPCRTM缓冲液、40-200ng双链基因组DNA模板、10μM正向寡核苷酸引物、10μM反向寡核苷酸引物、2μl dNTP混合物（各2.5mM）、16μl H2O、0.5μl（2.5个单位）Ex TaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad,96样品DNA Engine Tetrad2,Peltier热循环仪(Hercules,CA)在如下循环条件下进行PCR反应：94℃3分钟/1个循环；94℃30秒，64℃30秒，72℃5分钟/35个循环；72℃10分钟/1个循环；4℃/保持。
随后在包含如下成分的再次PCR反应中再次扩增初次PCR反应的扩增产物：2.5μl10X Ex Taq PCRTM缓冲液、2μl模板（初次PCR反应在H2O中1:100稀释）、10μM正向寡核苷酸引物、10μM反向寡核苷酸引物、2μl dNTP混合物（各2.5mM）、16μl H2O、0.5μl（2.5个单位）Ex TaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad,96样品DNA Engine Tetrad2,Peltier热循环仪(Hercules,CA)在如下循环条件下进行PCR反应：95℃1分钟/1个循环；94℃15秒，61℃30秒，72℃30秒/30个循环；72℃1分钟/1个循环；4℃/保持。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对10μl各扩增产物电泳1小时。用紫外线显现扩增片段，并通过与1Kbp Plus DNA梯(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)比较来估计片段大小。如图82所示，根据0.317Kbp DNA片段的存在来判断包含预期片段的PCR产物。
实施例21：靶向整合事件的检测
在包含编码除草剂耐受基因盒的整合供体DNA分子的除草剂耐受事件中，一定比例的所述事件是供体DNA靶向整合入ZFN诱导的双链断裂位点中的产物。为了区分这些靶向整合事件与那些自除草剂耐受基因盒随机整合衍生的事件，利用基于PCR的基因型分型策略，其使用基因组特异的PCR引物和随后的基因组特异的加上供体特异的PCR引物的组合。
A.基因组特异的扩增和随后的基因组/供体特异的扩增
在本实施方案中，初次PCR反应利用供体整合区上游和下游IPP2K基因靶物区特异的寡核苷酸引物（例如图92和93）。使用由TaKaRa BiotechnologyInc.,Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan提供的试剂实施初次PCR扩增反应，其组成如下：2.5μl10X Ex Taq PCRTM缓冲液、40-200ng双链玉米gDNA模板、10μM正向寡核苷酸引物、10μM反向寡核苷酸引物、2μl dNTP混合物（各2.5mM）、16μl H2O、0.5μl（2.5个单位）Ex TaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad,96样品DNA Engine Tetrad2,Peltier热循环仪(Hercules,CA)在如下循环条件下进行PCR反应：94℃3分钟/1个循环；94℃30秒，64℃30秒，72℃5分钟/35个循环；72℃10分钟/1个循环；4℃/保持。
随后将初次PCR反应产物在H2O中1:100稀释，并用作两个不同的再次PCR反应的模板DNA。在本实施方案中，再次反应利用在IPP2K基因组区和供体分子中结合的引物，产生横跨基因组和供体之间的整合边界的扩增子。第一个反应聚焦于基因组和供体之间的5’边界。第二个反应聚焦于供体和基因组之间的3’边界。两个反应均组成如下：2.5μl10X Ex Taq PCRTM缓冲液、2μl模板[初次PCR反应物1:100稀释]、10μM正向寡核苷酸引物、10μM反向寡核苷酸引物、2μl dNTP混合物（各2.5mM）、16μl H2O、0.5μl（2.5个单位）Ex TaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad,96样品DNA Engine Tetrad2,Peltier热循环仪(Hercules,CA)在如下循环条件下进行PCR反应：94℃3分钟/1个循环；94℃30秒，60℃30秒，72℃2分钟/35个循环；72℃10分钟/1个循环；4℃/保持。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对20μl各再次PCR反应物电泳1小时。
用紫外线显现扩增片段，并通过与1Kbp Plus DNA梯(Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,CA)比较来估计片段大小。根据DNA片段1.65Kbp（5’边界）（图83）或1.99Kbp（3’边界）（图84）的存在来判断自供体向IPP2K基因中的靶向整合衍生的PCR产物。对这些片段进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。随后使用TOPO TA 
Figure BDA0000418219450000951
试剂盒（含2.1载体）和One 
Figure BDA0000418219450000953
TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)依照制造商的方案将纯化的片段克隆入pCR2.1质粒中。
将个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(FisherScientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000961
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位EcoRI(New England BioLabs,Beverly,MA)消化3μg分离的质粒。将所有质粒消化物在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp Plus DNA梯(Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,CA)比较来估计片段大小。
根据3.9Kbp 
Figure BDA0000418219450000962
2.1载体外的合适大小的插入DNA片段的存在来判断预期的质粒克隆。使用CEQTM DTCS-快速开始试剂盒(Beckman-Coulter,PaloAlto,CA)如制造商所述的那样实施质粒克隆的双链测序反应。使用PerformaDTR凝胶过滤筒(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那样纯化反应。在Beckman-Coulter CEQTM2000XL DNA分析系统上分析序列反应，并使用SequencherTM4.1.4版(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)来进行核苷酸表征。使用Vector NTi10.1版(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)进行核苷酸比对。
如下进行来自靶向整合事件（事件#073）的序列数据分析。对横跨整个基因组整合位点的初次PCR产物进行聚焦于基因组和供体之间的5’或3’边界的再次扩增。与这些再次扩增产物对应的克隆片段与野生型IPP2K基因组序列以及靶向整合事件的预期序列的比对清楚指明在靶位点发生了供体DNA的精确整合。
IPP2K基因组基因座的核苷酸序列、基因组/供体边界、与IPP2K同源性侧翼对应的供体区域的核苷酸序列和除草剂耐受盒的核苷酸序列均保存在自该事件衍生的多个克隆PCR产物中。因此，该事件代表在特定基因靶物处发生ZFN介导的双链断裂的同源性驱动修复和供体DNA的靶向整合的基因组。已经获得了代表发生独特靶向整合的别的转化事件，证实本文所教导的方法在玉米胼胝体中是可再现的。本领域技术人员可将这些方法应用于任何植物物种中认为想要靶向整合的任何基因靶物。
B.嵌套式基因组/供体特异的扩增
在本实施方案中，初次的和随后再次的PCR反应两者均利用供体整合区域上游或下游的IPP2K基因靶物区域特异的寡核苷酸引物（附录V和VI）与供体序列特异的寡核苷酸引物的组合。在本例子中，使用由TaKaRaBiotechnology Inc.,Seta3-4-1,Otsu,Shiga,520-2193,Japan提供的试剂实施初次PCR扩增反应，其组成如下：2.5μl10X Ex Taq PCRTM缓冲液、40-200ng双链玉米gDNA模板、10μM正向寡核苷酸引物、10μM反向寡核苷酸引物、2μldNTP混合物（各2.5mM）、16μl H2O、0.5μl（2.5个单位）Ex TaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad,96样品DNA Engine Tetrad2,Peltier热循环仪(Hercules,CA)在如下循环条件下进行PCR反应：94℃3分钟/1个循环；94℃30秒，52℃或64℃30秒，72℃2分钟/35个循环；72℃10分钟/1个循环；4℃/保持。
然后将初次PCR反应在H2O中稀释1:100，并用作再次PCR反应的模板DNA。在本实施方案中，再次反应也利用在IPP2K基因组区域和供体分子中结合的引物，产生横跨基因组和供体之间的整合边界的扩增子。所使用的具体引物决定扩增子是聚焦于基因组和供体之间的5’还是3’边界。这些反应的试剂组成如下：2.5μl10X Ex Taq PCRTM缓冲液、2μl模板[初次PCR反应1:100稀释]、10μM正向寡核苷酸引物、10μM反向寡核苷酸引物、2μl dNTP混合物（各2.5mM）、16μl H2O、0.5μl（2.5个单位）Ex TaqTMDNA聚合酶。使用Bio-Rad,96样品DNA Engine Tetrad2,Peltier热循环仪(Hercules,CA)在如下循环条件下进行PCR反应：94℃3分钟/1个循环；94℃30秒，54℃或60℃30秒，72℃2分钟/35个循环；72℃10分钟/1个循环；4℃/保持。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对20μl各再次PCR反应电泳1小时。
用紫外线显现扩增片段，并通过与1Kbp Plus DNA梯(Invitrogen LifeTechnologies,Carlsbad,CA)比较来估计片段大小。根据DNA片段1.35Kbp（5’边界）（图85）或1.66Kbp（3’边界）（图86）的存在来判断自供体向IPP2K基因中的靶向整合衍生的PCR产物。对这些片段进行凝胶切割，并使用QIA快速凝胶提取试剂盒(QIAGEN Inc.,Valencia,CA)依照制造商的指导进行纯化。然后使用TOPO TA 
Figure BDA0000418219450000971
试剂盒（含
Figure BDA0000418219450000972
2.1载体）和One 
Figure BDA0000418219450000973
TOP10化学感受态大肠杆菌细胞(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)依照制造商的方案将纯化的片段克隆入pCR2.1质粒中。
C.基因型分型PCR产物的核苷酸序列分析
将实施例21B中所述个别菌落接种至14ml含2ml补充有50μl/ml卡那霉素的TB的Falcon管(Becton-Dickinson,Franklin Lakes,NJ)中，并在以200rpm摇动的情况下在37℃温育16小时。温育后，将1.5ml细胞转移至1.7ml Costar微量离心管(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)中，并以16,000x g沉淀1分钟。除去上清液，并使用
Figure BDA0000418219450000981
质粒试剂盒(BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel,Palo Alto,CA)如上文所述那样分离质粒DNA。用10个单位EcoRI(New England BioLabs,Beverly,MA)消化3μg分离的质粒。将所有的质粒消化物在37℃温育1小时。在补充有0.5%溴化乙锭的1.0%TAE琼脂糖凝胶中在100V对限制性DNA电泳1小时。用紫外线显现片段，并通过与1Kbp Plus DNA梯(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)比较来估计片段大小。
根据3.9Kbp 
Figure BDA0000418219450000982
2.1载体外的插入DNA片段的存在来判断质粒克隆。使用CEQTM DTCS-快速开始试剂盒(Beckman-Coulter,Palo Alto,CA)如制造商所述的那样实施质粒克隆的双链测序反应。使用Performa DTR凝胶过滤筒(Edge BioSystems,Gaithersburg,MD)如制造商的方案所述的那样纯化反应。在Beckman-Coulter CEQTM2000XL DNA分析系统上分析序列反应，并使用SequencherTM4.1.4版(Gene Codes Corporation,Ann Arbor,MI)来进行核苷酸表征。使用Vector NTi10.1版(Invitrogen Life Technologies,Carlsbad,CA)进行核苷酸比对。
还获得涵盖自多个靶向整合事件衍生的在上游(5’-)IPP2K基因组序列和供体DNA之间的边界的序列数据，包括涵盖自多个靶向整合事件衍生的在供体DNA和下游(3’-)IPP2K基因组序列之间的边界的序列数据以及包括自单个转化胼胝体事件(#114)衍生的上游(5’-)边界序列的序列数据。转化的靶向整合事件(#114)是自主供体整合至IPP2K基因靶物中的结果。
在这些分析中，初次的和再次的PCR扩增反应两者都聚焦于基因组和供体之间的5’或3’边界。与这些再次扩增产物对应的克隆片段与野生型IPP2K基因组序列以及靶向整合事件的预期序列的比对揭示在靶位点发生供体DNA的整合。IPP2K基因组基因座的核苷酸序列、基因组/供体边界、与IPP2K同源性侧翼对应的供体区域的核苷酸序列和除草剂耐受盒的核苷酸序列均保存在自该事件衍生的多个克隆PCR产物中。
因此，该事件代表在特定基因靶物处发生了ZFN介导的双链断裂的同源性驱动修复的基因组。已经获得了代表发生独特靶向整合的别的转化事件，证实本文所教导的方法在玉米胼胝体中是可再现的。本领域技术人员可将这些方法应用于任何植物物种中认为想要靶向整合的任何基因靶物。
实施例22：从玉米胼胝体组织再生能育的完整植株
可将自HiII细胞培养物衍生的、除草剂耐受的玉米细胞的分离的胼胝体再生为完整的、能育的玉米植株。本领域技术人员可从多种胚发生玉米细胞培养物再生完整的、能育的玉米植株。
在本实施例中，通过将分离的胼胝体组织转移至基于细胞分裂素的诱导培养基28(1H)来启动分离的、Bialophos抗性的HiII胼胝体的再生，所述基于细胞分裂素的诱导培养基28(1H)包含MS盐类和维生素、30.0g/L蔗糖、5mg/L苄氨基嘌呤、0.25mg/L2,4-D、1mg/L Bialaphos、和2.5g/L Gelrite；pH5.7。容许细胞在低光照(13μEm-2s-1)中生长1周，接着转移至较高光照条件(40μEm-2s-1)达1周。然后将细胞转移至再生培养基36(1H)，其与诱导培养基相同，只是其缺乏植物生长调节剂。用手工工具切出小的(3-5cm)小植株，并放入包含SHGA培养基(Schenk和Hildebrandt基础盐类和维生素，1972,Can.J.Bot50:199-204；1g/L肌肉-肌醇、10g/L蔗糖、2.0g/L Gelrite，pH5.8)的无菌150x25-mm玻璃培养管中。
一旦小植株发育为足够大的且分化的根系和茎轴系，将它们移植入装有Metro-Mix360生长培养基(Sun Gro Horticulture Canada Ltd.)的4英寸罐中，并放置在温室中。用透明的塑料杯完全或部分覆盖小植株达2-7天，然后移植至装有由95%Metro-Mix360生长培养基和5%粘土/壤土组成的混合物的5加仑罐，并培养至成熟。可对植株进行自花传粉或与近交系进行异花传粉以分别产生T1或F1种子。本领域技术人员可对再生的植株进行自花传粉或者将再生的植株与多种种质进行异花传粉以实现玉米育种。
可以在美国专利申请公开文本US-2003-0232410;US-2005-0026157;US-2005-0064474;US-2005-0208489及US-2006-0188987；和2006年7月26日提交的美国专利申请流水号11/493,423中找到与靶向切割、靶向重组及靶向整合相关的别的信息，通过提及而完整收录这些申请的公开内容以用于所有目的。
以此通过提及而完整收录本文中所提及的所有专利、专利申请和出版物以用于所有目的。
尽管为了理解清楚的目的已经较详细地通过举例说明来提供公开内容，但是对本领域技术人员显而易见的是，可以在不背离本公开内容的精神或范围的前提下实施各种变化和修饰。因而，以上说明书和实施例不应当解释为限制。
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Claims (17)

1.一种锌指蛋白，其包含多个锌指，其中至少一个锌指是非规范（非C2H2）锌指，所述非规范锌指具有牵涉DNA结合的螺旋部分且包含序列Cys-(XA)2-4-Cys-(XB)12-His-(XC)3-5-Cys-(XD)l-10(SEQ ID NO:3)，其中XA、XB、XC和XD可以是任何氨基酸且其中
(i)所述锌指蛋白被改造成结合靶序列；
(ii)所述至少一个非规范锌指与规范C2H2锌指相邻；且
(iii)其中(XD)1-10由3个氨基酸组成，所述3个氨基酸残基包括至少一个Arg(R)残基或至少一个Lys(K)残基。
2.权利要求1的锌指蛋白，其包含表1、表2、表3或表4任一中所示任一序列。
3.权利要求1的锌指蛋白，其中XD包含序列QLV、QKP、G、GG或GGG。
4.权利要求1至3任一项的锌指蛋白，其中所述锌指蛋白包含一个非规范锌指。
5.权利要求1至4任一项的锌指蛋白，其中所述锌指蛋白包含表8中所示任一序列且被改造成结合IPP2-K基因中的靶序列。
6.一种融合蛋白，其包含权利要求1至5任一项的锌指蛋白和一个或多个功能域。
7.权利要求6的融合蛋白，其中所述功能域包含切割半结构域，且其中所述融合蛋白包含插入所述切割半结构域和所述锌指蛋白之间的ZC接头。
8.权利要求7的融合蛋白，其中所述ZC接头的长度是5或6个氨基酸。
9.一种多核苷酸，其编码依照权利要求1至8任一项的至少一种锌指蛋白或融合蛋白。
10.一种植物细胞，其包含依照权利要求1至9任一项的至少一种锌指蛋白、至少一种融合蛋白或至少一种多核苷酸。
11.权利要求10的植物细胞，其中所述细胞是种子。
12.权利要求10或11的植物细胞，其中IPP2-K是被部分或完全灭活的且种子中植酸水平是降低的。
13.一种用于在植物细胞中靶向切割细胞染色质的方法，所述方法包括在所述细胞中表达一对依照权利要求7的融合蛋白或至少一种编码所述一对融合蛋白的多核苷酸，其中：
(a)所述融合蛋白的靶序列彼此相距10个核苷酸之内；且
(b)所述融合蛋白二聚化并切割位于所述靶序列之间的DNA。
14.一种在宿主植物细胞中靶向遗传重组的方法，所述方法包括：
(a)在所述宿主细胞中表达一对依照权利要求7的融合蛋白或至少一种编码所述一对融合蛋白的多核苷酸，其中所述融合蛋白的靶序列存在于选定的宿主靶基因座中；并
(b)鉴定在所述宿主靶基因座中展现出序列改变的重组宿主细胞；并
(c)任选将外源多核苷酸导入所述宿主细胞中，其中所述外源多核苷酸在存在时整合至所述宿主植物细胞的基因组中。
15.权利要求14的方法，其中所述序列改变是选自下组的突变：遗传物质的删除、遗传物质的插入、遗传物质的替代及其任何组合。
16.一种用于降低植物种子中植酸水平或使磷在植物种子中更能被代谢利用的方法，所述方法包括依照权利要求14灭活或改变IPP2-K基因。
17.一种锌指蛋白，其包含非规范（非C2H2）锌指，其中所述非规范锌指具有牵涉DNA结合的螺旋部分且其中所述螺旋部分的锌配位区包含氨基酸序列HX1X2RCXL(SEQ ID NO:2)；且其中所述非规范锌指包含被改造成结合靶序列的非天然存在识别螺旋区，
其中Xl是A，而X2是Q；或
其中X1是K，而X2是E；或
其中X1是T，而X2是R。
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