KR20090088904A - 최적화된 비-정규 아연 손가락 단백질 - Google Patents

최적화된 비-정규 아연 손가락 단백질 Download PDF

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Abstract

CCHC 아연 배위결합 잔기를 포함하는 아연 손가락이 본원에서 개시된다. 이러한 CCHC 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질 및 융합 단백질, 뿐만 아니라 이러한 단백질들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 기술된다. 이러한 단백질들을 유전자 편집 및 유전자 조절에 사용하는 방법이 또한 기술된다.
CCHC 아연 손가락, 아연 손가락 뉴클레아제, 아연 손가락-FokI 융합 단백질, 상동 재조합, IPP2K 유전자

Description

최적화된 비-정규 아연 손가락 단백질{OPTIMIZED NON-CANONICAL ZINC FINGER PROTEINS}
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 미국 가출원 번호 60/874,911 (2006년 12월 14일 출원) 및 미국 특허 가출원 번호 60/932,497 (2007년 5월 30일 출원)을 우선권으로 청구하고, 상기 특허 양쪽 모두의 개시내용은 거명에 의해 전문이 본원에 포함된다.
본 발명은 게놈 조작, 유전자 표적화, 표적화된 염색체 통합, 단백질 발현 및 에피게놈(epigenome) 편집 분야에 속한다.
DNA, RNA, 단백질 및 기타 분자에 대한 단백질의 서열-특이적 결합이 다수의 세포 프로세스, 예를 들어, 전사, 복제, 염색질 구조, 재조합, DNA 복구, RNA 프로세싱 및 번역에서 수반된다. 단백질-DNA, 단백질-RNA 및 단백질-단백질 상호작용에 참여하는 세포성 결합 단백질의 결합 특이성은 발달, 분화 및 항상성에 기여한다.
아연 손가락 단백질 (ZFP)은 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합할 수 있는 단백질이다. 아연 손가락은 아프리카 발톱 두꺼비인 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis)의 난모세포로부터의 전사 인자 TFIIIA에서 최초로 확인되었다. 이러한 클래스의 ZFP의 단일 아연 손가락 도메인은 길이가 아미노산 약 30개이고, 여러 구조 연구들은 이것이 베타 회전 (2개의 보존된 시스테인 잔기 함유) 및 알파 나선 (2개의 보존된 히스티딘 잔기 함유)를 함유하고, 이들은 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘에 의한 아연 원자의 배위결합을 통해 특정 형상으로 유지된다는 것을 나타냈다. 이러한 클래스의 ZFP들은 C2H2 ZFP로 또한 공지된다. 추가적인 클래스의 ZFP들이 또한 제안되었다. 예를 들어, Cys-Cys-His-Cys (C3H) ZFP의 논의에 대해 [Jiang et al. (1996) J. Biol. Chem. 271:10723-10730] 참조. 현재까지, 10,000개를 초과하는 아연 손가락 서열이 수천개의 공지된 또는 추정된 전사 인자에서 확인되었다. 아연 손가락 도메인은 DNA 인식에서뿐만 아니라, RNA 결합 및 단백질-단백질 결합에서 또한 수반된다. 현재, 이러한 클래스의 분자들이 모든 인간 유전자의 약 2％를 구성할 것으로 추정된다.
대부분의 아연 손가락 단백질에는 각각의 손가락 도메인 내에서 단일 아연 원자와 4면체적으로 배위결합하는 보존된 시스테인 및 히스티딘 잔기가 있다. 특히, 대부분의 ZFP는 일반식 -CyS-(X)2-4-Cys-(X)12-His-(X)3-5-His- (서열 1) [식중, X는 임의의 아미노산을 나타낸다]의 손가락 성분을 특징으로 한다 (C2H2 ZFP). 이러한 가장 광범위하게 나타나는 클래스의 아연-배위결합 서열은 특정한 간격의 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘을 함유한다. 각각의 손가락의 폴딩(folding)된 구조는 역평행 β-회전, 손가락 팁(tip) 영역 및 짧은 양친매성 α-나선을 함유한다. 금속 배위결합 리간드가 아연 이온에 결합하고, zif268 유형의 아연 손가락의 경우, 짧은 양친매성 α-나선이 DNA의 큰 홈(major groove)에서 결합한다. 또한, 아연 손가락의 구조는 특정한 보존된 소수성 아미노산 잔기 (예를 들어, 첫번째 보존된 Cys 바로 앞의 잔기 및 손가락의 나선형 절편의 +4 위치의 잔기), 및 보존된 시스테인 및 히스티딘 잔기를 통한 아연 배위결합에 의해 안정화된다.
직접적으로 염기에 접촉하는 위치, 염기-접촉 위치에 바로 인접한 '지지' 또는 '버팀' 잔기, 및 DNA의 포스페이트 골격에 접촉할 수 있는 위치에서의 변경이 있는 정규 (C2H2) 아연 손가락 단백질이 기술되었다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,007,988; 6,013,453; 6,140,081; 6,866,997; 6,746,838; 6,140,081; 6,610,512; 7,101,972; 6,453,242; 6,785,613; 7,013,219; PCT WO 98/53059; [Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416]; [Segal et al. (2000) Curr. Opin. Chem. Biol. 4:34-39] 참조.
또한, 변형된 아연 배위결합 잔기가 있는 아연 손가락을 함유하는 아연 손가락 단백질들이 또한 기술되었다 (예를 들어, 미국 특허 출원 번호 20030108880, 20060246567 및 20060246588 참조 (이들의 개시내용은 거명에 의해 포함됨)). 그러나, 이러한 비-정규 아연 손가락을 함유하는 아연 손가락 단백질에서 유전자 전사 조절 능력이 보존되지만, 일부 경우에는 정규 C2H2 아연 손가락으로만 구성된 아연 손가락 단백질에 비해 아연 손가락 뉴클레아제 (ZFN)로서 작용하는 능력이 감소된다.
따라서, 특히 아연 손가락 뉴클레아제의 구축에서, 비-정규 아연 배위결합 영역이 최적화된 아연 손가락을 함유하는 추가적인 조작된 아연 손가락 결합 단백질이 여전히 요구된다.
발명의 개요
본 출원은 하나 이상의 아연 배위결합 잔기에서의 변경이 있는 아연 손가락 DNA-결합 도메인을 제공한다. 특히, CCHC 아연 손가락이 본원에서 기술된다. 이러한 CCHC 아연 손가락들은 아연 배위결합 잔기 부근에서, 예를 들어 아연 손가락의 가장 C-말단인 아연 배위결합 잔기 주변의 잔기에서 추가적인 변경 (치환, 삽입 및/또는 결실)을 더 포함할 수 있다. 하나 이상의 이러한 CCHC 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 폴리펩티드 및 융합 단백질, 이러한 아연 손가락 및 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 이러한 아연 손가락 폴리펩티드 및/또는 융합 단백질을 사용하는 방법이 또한 기술된다.
따라서, 본 출원은 하기의 번호가 매겨진 실시양태들을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다:
1. 비-정규 (비-C2H2) 아연 손가락을 포함하고, 이때 비-정규 아연 손가락에 DNA 결합에 수반되는 나선형 부분이 있으며, 나선형 부분의 아연-배위결합 영역이 아미노산 서열 HX1X2RCXL (서열 2)을 포함하고, 아연 손가락 단백질이 표적 서열에 결합하도록 조작된, 아연 손가락 단백질.
2. 실시양태 1에 있어서, X1이 A이고, X2가 Q인 아연 손가락 단백질.
3. 실시양태 1에 있어서, X1이 K이고, X2가 E인 아연 손가락 단백질.
4. 실시양태 1에 있어서, X1이 T이고, X2가 R인 아연 손가락 단백질.
5. 실시양태 1에 있어서, XL이 G인 아연 손가락 단백질.
6. 2개 이상의 아연 손가락을 포함하고, 이때 하나 이상의 아연 손가락이 서열 Cys-(XA)2-4-Cys-(XB)12-His-(XC)3-5-Cys-(XD)1-10 (서열 3) [식중, XA, XB, XC 및 XD는 임의의 아미노산일 수 있다]을 포함하는 아연 손가락 단백질.
7. 실시양태 1 내지 6 중 어느 하나에 있어서, 표 1, 2, 3 또는 4 중 임의의 것에서 제시된 임의의 서열을 포함하는 아연 손가락 단백질.
8. 실시양태 6 또는 7에 있어서, XD가 서열 QLV 또는 QKP를 포함하는 아연 손가락 단백질.
9. 실시양태 8에 있어서, 서열 QLV 또는 QKP가 아연 손가락의 3개의 C-말단 아미노산 잔기인 아연 손가락 단백질.
10. 실시양태 6 내지 9 중 어느 하나에 있어서, XD가 1개, 2개 또는 3개의 Gly (G) 잔기를 포함하는 아연 손가락 단백질.
11. 다수의 아연 손가락을 포함하고, 이때 아연 손가락들 중 하나 이상이 실시양태 1 내지 10 중 어느 하나에 따른 CCHC 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질.
12. 실시양태 11에 있어서, 아연 손가락 단백질이 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질.
13. 실시양태 11 또는 12에 있어서, 손가락 2가 CCHC 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질.
14. 실시양태 11 내지 13 중 어느 하나에 있어서, C-말단 아연 손가락이 CCHC 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질.
15. 실시양태 11 내지 14 중 어느 하나에 있어서, 2개 이상의 아연 손가락이 CCHC 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질.
16. 실시양태 11 내지 15 중 어느 하나에 있어서, 아연 손가락 단백질이 표 8에 제시된 서열들 중 임의의 서열을 포함하고, IPP2-K 유전자 내의 표적 서열에 결합하도록 조작된 아연 손가락 단백질.
17. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나의 아연 손가락 단백질 및 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 융합 단백질.
18. (a) 절단 절반-도메인,
(b) 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나의 아연 손가락 단백질, 및
(c) 절단 절반-도메인과 아연 손가락 단백질 사이에 개재된 ZC 링커
을 포함하는 융합 단백질.
19. 실시양태 18에 있어서, ZC 링커의 길이가 아미노산 5개인 융합 단백질.
20. 실시양태 19에 있어서, ZC 링커의 아미노산 서열이 GLRGS (서열 4)인 융합 단백질.
21. 실시양태 18에 있어서, ZC 링커의 길이가 아미노산 6개인 융합 단백질.
22. 실시양태 21에 있어서, ZC 링커의 아미노산 서열이 GGLRGS (서열 5)인 융합 단백질.
23. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 아연 손가락 단백질 또는 실시양태 17 내지 22 중 어느 하나에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
24. 세포 내에서 한 쌍의 실시양태 18 내지 22 중 어느 하나에 따른 융합 단백질을 발현시키는 것을 포함하고, 이때
(a) 융합 단백질들의 표적 서열들이 서로 뉴클레오티드 10개 이내에 있고;
(b) 융합 단백질들이 이량체화하여, 표적 서열들 사이에 위치한 DNA를 절단하는,
식물 세포 내의 세포 염색질의 표적화된 절단 방법.
25. (a) 숙주 세포 내에서 한 쌍의 실시양태 18 내지 22 중 어느 하나에 따른 융합 단백질을 발현시키고, 이때 융합 단백질들의 표적 서열들이 선택된 숙주 표적 유전자좌 내에 존재하는 단계; 및
(b) 숙주 표적 유전자좌에서의 서열 변경을 나타내는 재조합 숙주 세포를 확인하는 단계
를 포함하는, 숙주 식물 세포에서의 표적화된 유전자 재조합 방법.
26. 실시양태 24 또는 25에 있어서, 서열 변경이 유전자 물질의 결실, 유전자 물질의 삽입, 유전자 물질의 치환 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 돌연변이인 방법.
27. 실시양태 24 내지 26 중 어느 하나에 있어서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
28. 실시양태 27에 있어서, 외인성 폴리뉴클레오티드가 숙주 표적 유전자좌에 상동성인 서열을 포함하는 방법.
29. 실시양태 24 내지 28 중 어느 하나에 있어서, 식물이 단자엽식물, 쌍자엽식물, 겉씨식물 및 진핵 조류로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
30. 실시양태 29에 있어서, 식물이 옥수수, 쌀, 밀, 감자, 대두, 토마토, 담배, 브라시카(Brassica) 과의 구성원, 및 아라비돕시스(Arabidopsis)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
31. 실시양태 24 내지 29 중 어느 하나에 있어서, 식물이 나무인 방법.
32. 실시양태 24 내지 31 중 어느 하나에 있어서, 표적 서열이 IPP2K 유전자 내에 있는 방법.
33. 실시양태 32에 따른 IPP2-K 유전자를 불활성화 또는 변경시키는 것을 포함하는, 종자 내의 피트산(phytic acid)의 수준을 감소시키는 방법.
34. 실시양태 32에 따른 IPP2-K 유전자를 불활성화 또는 변경시키는 것을 포함하는, 종자 내에서 인을 더욱 대사적으로 이용가능하게 만드는 방법.
35. 실시양태 1 내지 16 중 어느 하나에 따른 아연 손가락 단백질, 실시양태 17 내지 22 중 어느 하나에 따른 융합 단백질 또는 실시양태 23에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포.
36. 실시양태 35에 있어서, 세포가 종자인 식물 세포.
37. 실시양태 36에 있어서, 종자가 옥수수 종자인 식물 세포.
38. 실시양태 35 내지 37 중 어느 하나에 있어서, IPP2-K가 부분적으로 또는 완전하게 불활성화된 식물 세포.
39. 실시양태 38에 있어서, 종자 내의 피트산의 수준이 감소된 식물 세포.
40. 실시양태 35 내지 39 중 어느 하나에 있어서, 세포 내의 인의 대사적으로 이용가능한 수준이 증가된 식물 세포.
도 1은 미국 특허 번호 2005/0064474 및 하기에 기술된 바와 같은 GFP 세포 리포터 분석법 시스템에서, GFP를 발현하는 세포의 백분율에 의해 측정된, 유전자 수정율을 묘사하는 그래프이다. ZFN 변이체는 "X-Y"로 지시되고, 이때 "X"는 표 번호를 지칭하고, "Y"는 특정하게 선택된 표에서 아연 손가락에 주어진 번호를 지칭한다. 예를 들어, "2-21"은 표 2에서 21번 줄에 제시된 서열, 즉 HAQRCGLRGSQLV (서열 53)를 포함하는 손가락이 있는 ZFN을 지칭한다.
도 2는 ZFN 변이체들의 다양한 쌍을 사용한 절단으로부터 생성된 Cel-1 신호의 백분율을 묘사하는 그래프이다. 2회의 실험의 결과가 샘플 번호의 언급에 의해 ZFN의 각각의 쌍에 대해 제시된다. 각각의 샘플에 대해 사용된 변이체들의 쌍이 오른쪽 위에 있는 상자에서 제시되고, 이때 "wt 5-8" 및 "wt 5-9"는 미국 특허 출원 번호 2005/0064474의 실시예 14 (표 17)에 개시된 정규 ZFN 쌍을 지칭한다. 샘플 3-12에서, 정규 ZFN 5-8 또는 5-9의 손가락 2 또는 손가락 4의 인식 나선의 C-말단 영역이 비-정규 서열로 교체되었다. 샘플 3-12 내의 20, 21, 43, 45, 47 및 48로 지정된 비-정규 ZFN 변이체의 부분적인 서열 및 4-손가락 ZFN 내에서의 이러한 변이체들의 손가락 위치가 그래프 위의 왼쪽 상부에서 제시된다. 샘플 8 및 9 에 대한 실험 2로부터의 결과를 묘사하는 막대 위의 별표는 ZFN 효율의 과소평가를 초래하는, 레인 내의 배경값을 가리킨다.
도 3은 미국 특허 번호 2005/0064474 및 본원에서 기술된 GFP 세포 리포터 분석법 시스템에서의 유전자 수정율을 묘사하는 그래프이다. 각각의 샘플에서 테스트된 ZFN 쌍이 각각의 막대 아래에서 제시되고, 이때 아연 손가락 번호 20, 21, 43, 45, 47 및 48는 실시예 3에 기술된 것들이고, CCHC 아연 손가락 1a 내지 10a는 표 3 및 4에 제시된 서열을 포함한다. 아연 손가락 20, 21, 7a, 8a, 9a 및 10a가 손가락 4에서 사용되었고; 아연 손가락 43, 45, 47, 48, 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 및 6a가 손가락 2에서 사용되었다.
도 4는 담배에 대한 표적 벡터인 플라스미드 pDAB1585의 선형 개략도이다.
도 5는 담배에 대한 표적 벡터인 플라스미드 pDAB1585의 개략도이다.
도 6A 및 6B는 아연 손가락 뉴클레아제 (ZFN)를 묘사한다. 도 6A는 ZFN 결합을 묘사하는 개략도이다. 도 6B는 표적 서열의 서열을 나타낸다.
도 7은 플라스미드 pDAB1400의 개략도이다.
도 8은 플라스미드 pDAB782의 개략도이다.
도 9는 플라스미드 pDAB1582의 개략도이다.
도 10은 플라스미드 pDAB354의 개략도이다.
도 11은 플라스미드 pDAB1583의 개략도이다.
도 12는 플라스미드 pDAB2407의 개략도이다.
도 13은 플라스미드 pDAB1584의 개략도이다.
도 14는 플라스미드 pDAB2418의 개략도이다.
도 15는 플라스미드 pDAB4045의 개략도이다.
도 16은 플라스미드 pDAB1575의 개략도이다.
도 17은 플라스미드 pDAB1577의 개략도이다.
도 18은 플라스미드 pDAB1579의 개략도이다.
도 19는 플라스미드 pDAB1580의 개략도이다.
도 20은 플라스미드 pDAB3401의 개략도이다.
도 21은 플라스미드 pDAB1570의 개략도이다.
도 22는 플라스미드 pDAB1572의 개략도이다.
도 23은 플라스미드 pDAB4003의 개략도이다.
도 24는 플라스미드 pDAB1571의 개략도이다.
도 25는 플라스미드 pDAB7204의 개략도이다.
도 26은 플라스미드 pDAB1573의 개략도이다.
도 27은 플라스미드 pDAB1574의 개략도이다.
도 28은 플라스미드 pDAB1581의 개략도이다.
도 29는 플라스미드 pDAB1576의 개략도이다.
도 30은 플라스미드 pDAB1600의 개략도이다.
도 31은 플라스미드 pDAB3731의 개략도이다.
도 32는 플라스미드 pDAB4322의 개략도이다.
도 33은 플라스미드 pDAB4331의 개략도이다.
도 34는 플라스미드 pDAB4332의 개략도이다.
도 35는 플라스미드 pDAB4333의 개략도이다.
도 36은 플라스미드 pDAB4334의 개략도이다.
도 37은 플라스미드 pDAB4336의 개략도이다.
도 38은 플라스미드 pDAB4339의 개략도이다.
도 39는 플라스미드 pDAB4321의 개략도이다.
도 40은 플라스미드 pDAB4323의 개략도이다.
도 41은 플라스미드 pDAB4341의 개략도이다.
도 42는 플라스미드 pDAB4342의 개략도이다.
도 43은 플라스미드 pDAB4343의 개략도이다.
도 44는 플라스미드 pDAB4344의 개략도이다.
도 45는 플라스미드 pDAB4346의 개략도이다.
도 46은 플라스미드 pDAB4330의 개략도이다.
도 47은 플라스미드 pDAB4351의 개략도이다.
도 48은 플라스미드 pDAB4356의 개략도이다.
도 49는 플라스미드 pDAB4359의 개략도이다.
도 50은 플라스미드 pDAB7002의 개략도이다.
도 51은 플라스미드 pDAB7025의 개략도이다.
도 52는 플라스미드 pDAB1591의 개략도이다.
도 53은 Scd27 ZFN의 PCR 증폭에 사용된 DNA 주형인 플라스미드 pcDNA3.1- SCD27a-L0-FokI의 개략도이다.
도 54는 플라스미드 pDAB1594의 개략도이다.
도 55는 플라스미드 pDAB1598의 개략도이다.
도 56은 플라스미드 pDAB1577의 개략도이다.
도 57은 플라스미드 pDAB1578의 개략도이다.
도 58은 PAT 유전자 대조군 벡터인 플라스미드 pDAB1601의 개략도이다.
도 59는 예상되는, IL-1-Fok1 융합 단백질에 의해 자극되는 염색체내 상동 재조합을 묘사하는 개략도이다.
도 60은 양성 GFP-발현 대조군인 플라스미드 pDAB1590의 개략도이다.
도 61은 예상되는, IL-1-Fok1 융합 단백질에 의해 자극되는 염색체간 상동 재조합을 묘사하는 개략도이다.
도 62는 예상되는, Scd27 아연 손가락-Fok1 융합 단백질에 의해 자극되는 염색체간 상동 재조합을 묘사하는 개략도이다.
도 63은 재조합체의 PCR 분석을 묘사하는 젤이다. 왼쪽의 처음 4개의 레인은 젤 상에 표지된다. 1-5로 표지된 레인은 C3H IL-1-FokI 융합 단백질 유전자로의 BY2-380의 형질전환으로부터의 HR 이벤트를 나타내고, 6-7로 표지된 레인은 C3H SCD27-FokI 융합 단백질 유전자로의 BY2-380의 형질전환으로부터의 HR 이벤트를 나타낸다.
도 64는 HiII 세포 배양물로부터 유래된 옥수수 IPP2K 유전자 서열 (서열 6)을 나타내고, 이는 옥수수 IPP2K에 대해 표적화된 ZFN의 조작을 위한 디자인 주형 으로서 작용한다.
도 65, 패널 A 내지 E는 ZFN 발현 벡터 클로닝 계획을 묘사한다. 계단식 클로닝 전략이 ZFN 발현 구축물을 생성시키는데 사용되었다. 개별적인 ZFN-코딩 유전자들을 벡터 pVAX-N2A-NLSop2-EGFP-FokMono (A) 및 pVAX-C2A-NLSop2-EGFP-FokMono (B) 내로 클로닝하여, 이중-단백질 카세트 (C)를 생성시켰다. 이러한 카세트를 pDAB3872 (D) 내로 결찰시켜, ZFN 이종이량체의 발현을 위한 최종 플라스미드 (E)를 생성시켰다.
도 66은 옥수수 IPP2K 유전자에서의 ZFN 결합을 묘사한다. 2개의 ZFN 단백질이 DNA의 이중-가닥 절단을 수행하기 위해 필요하였다. 절단 부위 (하향 화살표로 지시됨) 주변의 서열이 제시된다 (서열 7). 1개의 단백질 (8705)은 서열 CTGTGGGGCCAT (상부 가닥) (서열 8)에 결합하였고, 또다른 단백질 (8684, 8685, 또는 8686)은 하류 서열 (CTTGACCAACTCAGCCAG, 하부 가닥) (서열 9)에 결합하였다.
도 67은 야생형 (상부 서열, 서열 10) 및 ZFN 클론 127 (하부 서열, 서열 11)의 서열을 묘사한다. 이러한 ZFN에 대한 절단 표적이 회색 상자에서 강조된다.
도 68은 454 서열분석에 의해 검출된, 옥수수 IPP2K 유전자에서의 ZFN-매개 dsDNA 파손의 비-상동 말단 연결 (NHEJ)로부터 초래된 여러 결실들의 정렬을 나타낸다. 이러한 ZFN에 대한 절단 표적이 회색 상자에서 강조된다.
도 69는 미국 특허 번호 2005/0064474 및 본원에서 기술된 GFP 세포 리포터 분석법 시스템에서의 유전자 수정율을 묘사하는 그래프이다. 각각의 샘플에서 테스트된 ZFN 쌍들이 각각의 막대 아래에 제시된다.
도 70은 실시예 18B에 기술된 바와 같이 구축된 플라스미드 pDAB7471을 묘사한다.
도 71은 실시예 18C에 기술된 바와 같이 구축된 플라스미드 pDAB7451을 묘사한다.
도 72는 예시적인 자율 제초제-내성 유전자 발현 카세트를 묘사하는 개략도이다. 이러한 구축물은 실시예 18D에 기술된 바와 같이 프로모터, 제초제 내성 유전자 및 폴리아데닐화 (polyA) 종결 서열을 함유하는 완전한 프로모터-전사 단위 (PTU)를 포함한다 .
도 73은 실시예 18E에 기술된 바와 같이 구축된 플라스미드 pDAB7422를 묘사한다. 이러한 플라스미드는 위치-1 플라스미드 골격 내로 삽입된 프로모터, 제초제 내성 유전자 및 폴리아데닐화 (polyA) 종결 서열을 함유하는 완전한 프로모터-전사 단위 (PTU)를 포함한다.
도 74는 실시예 18E에 기술된 바와 같이 구축된 플라스미드 pDAB7452를 묘사한다. 이러한 플라스미드는 위치-2 플라스미드 골격 내로 삽입된 프로모터, 제초제 내성 유전자 및 폴리아데닐화 (polyA) 종결 서열을 함유하는 완전한 프로모터-전사 단위 (PTU)를 포함한다.
도 75는 예시적인 비-자율 제초제-내성 유전자 발현 카세트를 묘사하는 개략도이다. 이러한 구축물은 실시예 18F에 기술된 바와 같이 제초제 내성 유전자 및 폴리아데닐화 (polyA) 종결 서열을 함유하는 불완전한 프로모터-전사 단위 (PTU)를 포함한다.
도 76은 실시예 18G에 기술된 바와 같이 구축된 플라스미드 pDAB7423을 묘사한다. 이러한 플라스미드는 위치-1 플라스미드 골격 내로 삽입된 제초제 내성 유전자 및 폴리아데닐화 (polyA) 종결 서열을 함유하는 불완전한 프로모터-전사 단위 (PTU)를 포함한다..
도 77은 실시예 18G에 기술된 바와 같이 구축된 플라스미드 pDAB7454를 묘사한다. 이러한 플라스미드는 실시예 18G에 기술된 바와 같이 위치-2 플라스미드 골격 내로 삽입된 제초제 내성 유전자 및 폴리아데닐화 (polyA) 종결 서열을 함유하는 불완전한 프로모터-전사 단위 (PTU)를 포함한다.
도 78은 실시예 18H에 기술된 바와 같이 구축된 플라스미드 pDAB 7424 (예시적인 Gateway®-개조 위치-1 자율 도너(donor))를 묘사한다.
도 79는 실시예 18H에 기술된 바와 같이 구축된 플라스미드 pDAB 7425 (예시적인 Gateway®-개조 위치-1 자율 도너)를 묘사한다.
도 80은 실시예 18H에 기술된 바와 같이 구축된 플라스미드 pDAB 7426을 묘사한다. pDAB 7426은 ZFN-발현 카세트와 함께 위치-1 자율 도너를 함유하는 조합 플라스미드이다.
도 81은 실시예 18H에 기술된 바와 같이 구축된 플라스미드 pDAB 7427을 묘사한다. pDAB 7427은 ZFN-발현 카세트와 함께 위치-1 자율 도너를 함유하는 조합 플라스미드이다.
도 82는 게놈 DNA로부터의 도너-DNA 특이적 서열의 증폭을 묘사한다. 317 bp 생성물의 존재는 실시예 20C에 기술된 바와 같은 옥수수 캘러스 세포주 # 61 - 72의 게놈 내로 삽입된 PAT 유전자를 함유하는 도너 DNA의 존재를 나타낸다. HiII는 야생형 음성 대조군을 가리킨다.
도 83은 도너-DNA와 IPP2K에 특이적인 옥수수 게놈 서열 간의 5'-경계의 증폭을 묘사한다. IPP2K 유전자 내로의 도너의 표적화된 통합으로부터 유래된 2차 PCR 생성물이 실시예 21A에 기술된 바와 같이 1.65 Kbp의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. HiII는 야생형 음성 대조군을 가리킨다.
도 84는 도너-DNA와 IPP2K에 특이적인 옥수수 게놈 서열 간의 3'-경계의 증폭을 묘사한다. IPP2K 유전자 내로의 도너의 표적화된 통합으로부터 유래된 2차 PCR 생성물이 실시예 21A에 기술된 바와 같이 1.99 Kbp의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. HiII는 야생형 음성 대조군을 가리킨다.
도 85는 게놈과 도너 간의 상류 (5'-) 경계의 증폭을 묘사한다. IPP2K 유전자 내로의 도너의 표적화된 통합으로부터 유래된 PCR 생성물 (5'-경계)이 실시예 21B에 기술된 바와 같이 크기가 1.35 Kbp인 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. HiII는 야생형 음성 대조군을 가리킨다.
도 86은 도너와 게놈 간의 하류 (3'-) 경계의 증폭을 묘사한다. IPP2K 유전자 내로의 도너의 표적화된 통합으로부터 유래된 PCR 생성물 (3'-경계)이 실시예 21B에 기술된 바와 같이 크기가 1.66 Kbp인 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. HiII는 야생형 음성 대조군을 가리킨다.
도 87은 위치-1 5'-상동성 플랭크(flank)의 서열 (서열 171)을 묘사한다.
도 88은 위치-1 3'-상동성 플랭크의 서열 (서열 172)을 묘사한다.
도 89는 위치-2 5'-상동성 플랭크의 서열 (서열 139)을 묘사한다.
도 90은 위치-2 3'-상동성 플랭크의 서열 (서열 140)을 묘사한다.
도 91은 ZFN 표적화 영역의 상류 (5'-) IPP2K 게놈 서열의 서열 (서열 141)을 묘사한다.
도 92는 ZFN 표적화 영역의 하류 (3'-) IPP2K 게놈 서열의 서열 (서열 142)을 묘사한다.
Cys-Cys-His-Cys 형식의 비-정규 아연 손가락을 함유하는 아연 손가락 결합 폴리펩티드 (ZFP)를 포함하는 조성물이 본원에서 개시된다. 아연 배위결합이 아연 손가락에 주된 폴딩 에너지를 제공하기 때문에, 아연 배위결합 잔기의 조정은 손가락 안정성 및 구조를 변형시키기 위한 용이한 수단을 제공하고, 이는 세포 반감기, 다른 세포 인자와의 상호작용, DNA 결합 특이성 및 친화성, 및 기능성 도메인들의 상대적인 배향이 예를 들어 포함되는 아연 손가락 단백질의 다양한 중요한 기능적 양상들에 강한 영향을 미친다.
비-정규 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질, 예컨대 미국 특허 출원 번호 20030108880; 20060246567; 및 20060246588에 개시된 것들은 DNA에 결합하고 전사를 변경시키는 것으로 나타났다. 그러나, 아연 손가락 뉴클레아제 (ZFN, 예를 들어 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0064474 참조) 내로 혼입되는 경우, 이러한 기존에 기술된 비-정규 아연 손가락 단백질은 표적 DNA의 절단에서 때때로 준-최적 활성을 나타낼 수 있다.
아연 배위결합 잔기의 C-말단 쌍 주변의 특정 서열이 변경된, 하나 이상의 CCHC 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질이 본원에서 기술된다. 이러한 최적화된 비-정규 아연 손가락을 포함하는 융합 단백질, 예를 들어 아연 손가락 뉴클레아제 (ZFN)가 또한 본원에서 기술되고, 이때 이러한 ZFN은 정규 (CCHH) 아연 손가락을 포함하는 ZFN을 사용하여 달성된 절단에 필적하는 비율로 표적 DNA를 절단한다.
본원에 개시된 바와 같은 융합 폴리펩티드는 유전자의 전사를 강화 또는 억제할 수 있고/있거나 표적 서열을 절단할 수 있다. 최적화된 비-정규 아연 손가락을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 및 하나 이상의 최적화된 비-정규 아연 손가락을 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 제공된다. 추가적으로, 제약상 허용가능한 담체와 조합된, 치료적 유효량의 임의의 본원에 기술된 아연 손가락-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드 또는 이의 기능성 단편; 또는 치료적 유효량의 임의의 변형된 아연 손가락-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드 또는 이의 기능성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제약 조성물이 제공된다. 농업상 허용가능한 담체와 조합된, 농업적 유효량의 임의의 본원에 기술된 아연 손가락-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드 또는 이의 기능성 단편; 또는 농업적 유효량의 임의의 변형된 아연 손가락-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드 또는 이의 기능성 단편을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 농업 조성물이 추가로 제공된다. 게놈 서열에 결합하는 변형된 아연 손가락-뉴클레오티드 결합 폴리펩티드를 수득하기 위한 스크리닝 방법이 또한 제공된다.
게놈 서열은 염색체, 에피솜, 세포소기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 인공 염색체, 및 세포 내에 존재하는 임의의 기타 유형의 핵산, 예를 들어, 증폭된 서열, 이중 미세 염색체 및 내인성 또는 감염성 박테리아 및 바이러스의 게놈 내에 존재하는 것들을 포함한다. 게놈 서열은 정상이거나 (즉, 야생형), 또는 돌연변이체일 수 있고, 돌연변이체 서열은 삽입, 결실, 치환, 전위, 재배열 및/또는 점 돌연변이를 예를 들어 포함할 수 있다. 게놈 서열은 다수의 상이한 대립유전자들 중 하나를 또한 포함할 수 있다.
일반적인 내용
본원에 개시된 방법의 실행, 뿐만 아니라 조성물의 제조 및 사용은, 달리 지시되지 않는 한, 당업계의 기술 내에 속하는 분자 생물학, 생화학, 염색질 구조 및 분석, 계산 화학, 세포 배양, 재조합 DNA 및 관련 분야에서의 통상적인 기술을 사용한다. 이러한 기술들은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들어, [Sambrook et al. MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, Second edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989 & Third edition, 2001]; [Ausubel et al., CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, New York, 1987 & 정기 개정판]; 시리즈 [METHODS IN ENZYMOLOGY, Academic Press, San Diego]; [Wolffe, CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION, Third edition, Academic Press, San Diego, 1998]; [METHODS IN ENZYMOLOGY, Vol. 304, "Chromatin" (P.M. Wassarman and A.P. Wolffe, eds.), Academic Press, San Diego, 1999]; 및 [METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY, Vol. 119, "Chromatin Protocols" (P.B. Becker, ed.) Humana Press, Totowa, 1999] 참조.
정의
용어 "핵산", "폴리뉴클레오티드", 및 "올리고뉴클레오티드"는 상호교환가능하게 사용되고, 선형 또는 원형 형상이고 단일 또는 이중 가닥 형태인 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 중합체를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, 이러한 용어들은 중합체의 길이와 관련하여 제한적으로 해석되지 않아야 한다. 이러한 용어들은 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체, 뿐만 아니라 염기, 당 및/또는 포스페이트 모이어티(moiety) (예를 들어, 포스포로티오에이트 골격)에서 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일반적으로, 특정 뉴클레오티드의 유사체는 염기쌍을 형성하는 특이성이 동일하고, 즉 A의 유사체는 T와 염기쌍을 형성할 것이다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질"은 상호교환가능하게 사용되고, 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭한다. 이 용어는 하나 이상의 아미노산이 상응하는 천연-발생 아미노산의 화학적 유사체 또는 변형된 유도체인 아미노산 중합체에 또한 적용된다.
"결합"은 거대분자들 간의 (예를 들어, 단백질과 핵산 간의) 서열-특이적인 비-공유결합 상호작용을 지칭한다. 전체로서의 상호작용이 서열-특이적인 한, 결합 상호작용의 모든 성분이 서열-특이적일 필요는 없다 (예를 들어, DNA 골격 내의 포스페이트 잔기와의 접촉). 일반적으로 이같은 상호작용은 10-6 M-1 이하의 해리 상수 (Kd)를 특징으로 한다. "친화력"은 결합 강도를 지칭하고, 증가된 결합 친화력은 더 낮은 Kd와 상관된다.
"결합 단백질"은 또다른 분자에 비-공유결합적으로 결합할 수 있는 단백질이다. 결합 단백질은, 예를 들어, DNA 분자 (DNA-결합 단백질), RNA 분자 (RNA-결합 단백질) 및/또는 단백질 (단백질-결합 단백질)에 결합할 수 있다. 단백질-결합 단백질의 경우, 이는 자신에게 결합할 수 있고/있거나 (동종이량체, 동종삼량체 등을 형성), 상이한 단백질 또는 단백질들의 하나 이상의 분자에 결합할 수 있다. 결합 단백질은 결합 활성의 유형이 한가지를 초과할 수 있다. 예를 들어, 아연 손가락 단백질은 DNA-결합 활성, RNA-결합 활성 및 단백질-결합 활성이 있다.
"아연 손가락 DNA 결합 단백질" (또는 결합 도메인)은 하나 이상의 아연 손가락을 통해 서열-특이적 방식으로 DNA에 결합하는, 단백질 또는 더 큰 단백질 내의 도메인이고, 이때 상기 아연 손가락은 아연 이온의 배위결합을 통해 구조가 안정화되는 결합 도메인 내의 아미노산 서열의 영역이다. 용어 아연 손가락 DNA 결합 단백질은 종종 아연 손가락 단백질 또는 ZFP로 약기된다.
아연 손가락 결합 도메인은 미리 정해진 뉴클레오티드 서열에 결합하도록 "조작"될 수 있다. 아연 손가락 단백질의 조작 방법의 비-제한적인 예는 디자인 및 선별이다. 디자인된 아연 손가락 단백질은 논리적인 규범으로부터 주로 디자인/조성되는, 자연에서 발생하지 않는 단백질이다. 디자인을 위한 논리적인 규범은 기존의 ZFP 디자인 및 결합 데이터의 정보가 저장된 데이터베이스 내의 정보를 프로세싱하기 위한 전산화된 알고리즘 및 치환 규칙의 적용을 포함한다. 예를 들어, 미국 특허 6,140,081; 6,453,242; 6,534,261; 및 6,785,613을 참조하고, WO 98/53058; WO 98/53059; WO 98/53060; WO 02/016536 및 WO 03/016496; 및 미국 특허 6,746,838; 6,866,997; 및 7,030,215를 또한 참조한다.
"선별된" 아연 손가락 단백질은 실험적인 프로세스 예컨대 파지 디스플레이, 상호작용 트랩(trap) 또는 하이브리드(hybrid) 선별로부터 주로 생산되는, 자연에서 발견되지 않는 단백질이다. 예를 들어, 미국 5,789,538; 미국 5,925,523; 미국 6,007,988; 미국 6,013,453; 미국 6,200,759; 미국 6,733,970; 미국 RE39,229; 및 WO 95/19431; WO 96/06166; WO 98/53057; WO 98/54311; WO 00/27878; WO 01/60970; WO 01/88197 및 WO 02/099084 참조.
"비-정규" 아연 손가락 단백질은 비-정규 (비-C2H2) 아연 손가락을 포함하는 단백질이다. 따라서, 비-정규 아연 손가락은 천연 발생 C2H2 아연 손가락 단백질과 비교하여 하나 이상의 아미노산의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 비-정규 아연 손가락의 비제한적인 예로는 Cys-Cys-His-Cys (예를 들어, C3H)의 아연 배위결합 잔기 (아미노 → 카르복시)를 포함하는 것들이 포함된다.
"상동성 서열"은 제2서열과 상당한 서열 동일성을 공유하고, 제2서열과 서열이 동일할 수 있는 제1서열을 지칭한다. "동일하지 않은 상동성 서열"은 제2서열과 상당한 서열 동일성을 공유하지만, 제2서열과 서열이 동일하지 않은 제1서열을 지칭한다. 예를 들어, 돌연변이체 유전자의 야생형 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드는 돌연변이체 유전자의 서열에 대해 상동성이고 동일하지 않다. 특정 실시양태에서, 2개의 서열 간의 상동성의 정도는 일반적인 세포 메커니즘을 사용하여 이들 간에 상동 재조합이 일어나도록 하는데 충분하다. 2개의 동일하지 않은 상동성 서열들은 임의의 길이일 수 있고, 이들의 비-상동성 정도는 단일 뉴클레오티드만큼 작거나 (예를 들어, 표적화된 상동 재조합에 의한 게놈 점 돌연변이의 수정을 위해), 또는 10 킬로베이스 이상만큼 클 수 있다 (예를 들어, 염색체 내의 미리 정해진 부위에서의 유전자의 삽입을 위해). 동일하지 않은 상동성 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드는 길이가 동일할 필요가 없다. 예를 들어, 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍 20개 내지 10,000개 사이의 외인성 폴리뉴클레오티드 (즉, 도너 폴리뉴클레오티드)가 사용될 수 있다.
핵산 및 아미노산 서열 동일성을 결정하기 위한 기술은 당업계에 공지되어 있다. 전형적으로, 이같은 기술은 유전자에 대한 mRNA의 뉴클레오티드 서열을 결정하는 것 및/또는 이에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 결정하는 것, 및 이러한 서열을 제2의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열과 비교하는 것을 포함한다. 게놈 서열들을 또한 이러한 방식으로 결정하여 비교할 수 있다. 일반적으로, 동일성은 2개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 서열 각각의 정확한 뉴클레오티드-대-뉴클레오티드 또는 아미노산-대-아미노산 일치를 지칭한다. 2개 이상의 서열 (폴리뉴클레오티드 또는 아미노산)을 이들의 ％ 동일성을 결정함으로써 비교할 수 있다. 2개의 서열 (핵산 또는 아미노산 서열)의 ％ 동일성은 정렬된 2개의 서열들 간의 정확한 매치(match)의 수를 더 짧은 서열의 길이로 나누고 100을 곱한 것이다. 핵산 서열들에 대한 대략적인 정렬은 [Smith and Waterman, Advances in Applied Mathematics 2:482-489 (1981)]의 국소적인 상동성 알고리즘에 의해 제공된다. 이러한 알고리즘은 [Dayhoff, Atlas of Protein Sequences and Structure, M.O. Dayhoff ed., 5 suppl. 3:353-358, National Biomedical Research Foundation, Washington, D.C., USA]에 의해 개발되고 [Gribskov, Nucl. Acids Res. 14(6):6745-6763 (1986)]에 의해 표준화된 채점 매트릭스를 사용함으로써 아미노산 서열에 적용될 수 있다. 서열의 ％ 동일성을 결정하기 위한 이러한 알고리즘의 예시적인 실행이 <Genetics Computer Group (Madison, WI)>에 의해 "BestFit" 유틸리티 애플리케이션에서 제공된다. 이러한 방법의 디폴트 파라메터가 [Wisconsin Sequence Analysis Package Program Manual, Version 8 (1995)] (Genetics Computer Group (Madison, WI)으로부터 입수가능)에 기술되어 있다. 본 발명의 정황에서 ％ 동일성을 수립하는 예시적인 방법은 <University of Edinburgh>에 저작권이 있고, John F. Collins 및 Shane S. Sturrok가 개발하였으며, IntelliGenetics, Inc. (Mountain View, CA)에서 공급하는 MPSRCH 패키지를 사용하는 것이다. 이러한 한벌의 패키지로부터, Smith-Waterman 알고리즘을 사용할 수 있고, 이때 디폴트 파라메터가 채점표에 사용된다 (예를 들어, 갭 오픈 패널티 12, 갭 확장 페널티 1, 및 갭 6). 생성된 데이터로부터, "매치" 값이 서열 동일성을 반영한다. 서열들 간의 ％ 동일성 또는 유사성을 계산하기 위한 기타 적절한 프로그램이 당업계에 일반적으로 공지되어 있고, 예를 들어, 또다른 정렬 프로그램은 디폴트 파라메터와 함께 사용되는 BLAST이다. 예를 들어, 하기의 디폴트 파라메터를 사용하여 BLASTN 및 BLASTP를 사용할 수 있다: 유전자 코드 = 표준; 필터 = 없음; 가닥 = 양쪽; 컷오프(cutoff) = 60; 예상 = 10; 매트릭스 = BLOSUM62; 설명 = 50개의 서열; 분류 방식 = HIGH SCORE; 데이터베이스 = 비-중복성, GenBank + EMBL + DDBJ + PDB + GenBank CDS 번역 + Swiss 단백질 + Spupdate + PIR. 이러한 프로그램의 상세사항을 인터넷에서 확인할 수 있다. 본원에 기술된 서열과 관련하여, 원하는 서열 동일성 정도의 범위는 약 35％ 내지 100％ 및 이들 사이의 임의의 정수값이다. 전형적으로, 서열들 간의 ％ 동일성은 적어도 35％-40％; 40％-45％; 45％-50％; 50％-60％; 60％-70％; 70-75％, 바람직하게는 80-82％, 더욱 바람직하게는 85-90％, 더욱 더 바람직하게는 92％, 더더욱 바람직하게는 95％, 가장 바람직하게는 98％의 서열 동일성이다.
별법적으로, 상동성 영역들 간에 안정적인 듀플렉스(duplex)가 형성되도록 하는 조건 하에 폴리뉴클레오티드들을 혼성화시킨 후, 단일 가닥 특이적 뉴클레아제(들)로 소화시키고, 소화된 단편들의 크기를 결정함으로써 폴리뉴클레오티드들 간의 서열 유사성 정도를 결정할 수 있다. 2개의 핵산, 또는 2개의 폴리펩티드 서열들은, 상기의 방법들을 사용하여 결정했을 때 서열들이 적어도 약 70％-75％, 바람직하게는 80％-82％, 더욱 바람직하게는 85％-90％, 더욱 더 바람직하게는 92％, 더더욱 바람직하게는 95％, 가장 바람직하게는 98％의 서열 동일성을 나타내는 경우, 서로에 대해 실질적으로 상동성이다. 본원에서 사용된 실질적인 상동성은 특정 DNA 또는 폴리펩티드 서열에 완전한 동일성을 나타내는 서열을 또한 지칭한다. 실질적으로 상동성인 DNA 서열들은 서던(Southern) 혼성화 실험, 예를 들어, 특정 시스템에 대해 정의되는 바와 같은 엄격한 조건 하에서의 실험에서 확인될 수 있다. 적합한 혼성화 조건을 규정하는 것은 당업계의 기술에 속한다. 예를 들어, [Sambrook et al., 상기 문헌]; [Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press] 참조.
2개의 핵산 단편의 선택적인 혼성화를 하기와 같이 결정할 수 있다. 2개의 핵산 분자 간의 서열 동일성 정도는 이같은 분자들 간의 혼성화 이벤트의 효율 및 강도에 영향을 미친다. 부분적으로 동일한 핵산 서열은 표적 분자에 대한 완전히 동일한 서열의 혼성화를 적어도 부분적으로 억제할 것이다. 완전히 동일한 서열의 혼성화의 억제를 당업계에 주지된 혼성화 분석법 (예를 들어, 서던 (DNA) 블롯, 노던(Northern) (RNA) 블롯, 용액 혼성화 등; [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조)을 사용하여 평가할 수 있다. 다양한 정도의 선택성을 사용하여, 예를 들어, 낮은 엄격도에서 높은 엄격도까지 다양한 조건을 사용하여, 이같은 분석법을 수행할 수 있다. 낮은 엄격도의 조건이 사용된 경우, 부분적인 정도의 서열 동일성도 없는 2차 프로브 (예를 들어, 표적 서열과의 서열 동일성이 약 30％ 미만인 프로브)를 사용하여 비-특이적 결합의 부재를 평가할 수 있고, 이때 비-특이적 결합 이벤트의 부재 하에 2차 프로브는 표적에 혼성화하지 않을 것이다.
혼성화를 기초로 하는 검출 시스템을 사용하는 경우, 기준 핵산 서열에 상보적인 핵산 프로브가 선택된 후, 적합한 조건의 선택에 의해 프로브 및 기준 서열이 선택적으로 서로 혼성화 또는 결합하여, 듀플렉스 분자를 형성한다. 전형적으로, 중간 정도의 엄격한 혼성화 조건 하에 기준 서열에 선택적으로 혼성화할 수 있는 핵산 분자는 선택된 핵산 프로브의 서열과의 서열 동일성이 약 70％ 이상인, 길이가 뉴클레오티드 약 10-14개 이상인 표적 핵산 서열의 검출을 허용하는 조건 하에 혼성화한다. 전형적으로, 엄격한 혼성화 조건은 선택된 핵산 프로브의 서열과의 서열 동일성이 약 90-95％를 초과하는, 길이가 뉴클레오티드 약 10-14개 이상인 표적 핵산 서열의 검출을 허용한다. 프로브 및 기준 서열이 특정한 정도의 서열 동일성을 갖는 경우, 프로브/기준 서열 혼성화에 유용한 혼성화 조건은 당업계에 공지된 바와 같이 결정될 수 있다 (예를 들어, [Nucleic Acid Hybridization: A Practical Approach, editors B.D. Hames and S.J. Higgins, (1985) Oxford; Washington, DC; IRL Press] 참조).
혼성화 조건은 당업자에게 주지되어 있다. 혼성화 엄격도는 혼성화 조건이 미스매칭(mismatching)된 뉴클레오티드들을 함유하는 하이브리드의 형성을 냉대하는 정도를 지칭하고, 엄격도가 높을수록 미스매칭된 하이브리드에 대한 허용이 낮아진다. 혼성화의 엄격도에 영향을 미치는 인자들은 당업자에게 주지되어 있고, 온도, pH, 이온 강도, 및 유기 용매 예컨대 포름아미드 및 디메틸술폭시드의 농도를 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 당업자에게 주지된 바와 같이, 혼성화 엄격도는 온도가 높을수록, 이온 강도가 낮을수록, 그리고 용매 농도가 낮을수록 증가된다.
혼성화에 대한 엄격도 조건과 관련하여, 예를 들어, 서열의 길이 및 성질, 다양한 서열의 염기 조성, 염 및 기타 혼성화 용액 성분의 농도, 혼성화 용액 내의 차단제 (예를 들어, 덱스트란 술페이트, 및 폴리에틸렌 글리콜)의 존재 또는 부재, 혼성화 반응 온도 및 시간 파라메터를 변화시킴으로써, 뿐만 아니라 세정 조건을 변화시킴으로써, 수많은 등가의 조건을 사용하여 특정 엄격도를 수립할 수 있다는 것이 당업계에 주지되어 있다. 특정 셋트의 혼성화 조건의 선택은 당업계의 표준 방법을 따라 선택된다 (예를 들어, [Sambrook, et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second Edition, (1989) Cold Spring Harbor, N.Y.] 참조).
"재조합"은 2개의 폴리뉴클레오티드 간의 유전자 정보의 교환 프로세스를 지칭한다. 본 발명의 목적을 위해, "상동 재조합 (HR)"은 세포 내에서의 이중 가닥 파손의 복구 동안 예를 들어 일어나는, 특수화된 형태의 이같은 교환을 지칭한다. 이러한 프로세스는 뉴클레오티드 서열 상동성을 필요로 하고, "표적" 분자 (즉, 이중 가닥이 파손된 분자)의 주형 복구를 위해 "도너" 분자를 사용하며, "비-교차 유전자 전환" 또는 "숏트랙(short tract) 유전자 전환"으로 다양하게 알려져 있는데, 이는 도너로부터 표적으로 유전자 정보가 전달되기 때문이다. 어떠한 특정 이론에도 구속되기를 원치 않으면서, 이같은 전달에는 파손된 표적과 도너 사이에 형성된 헤테로듀플렉스(heteroduplex) DNA의 미스매치 수정, 및/또는 표적의 일부가 될 유전자 정보를 재합성하는데 도너가 사용되는 "합성-의존적 가닥 어닐링(annealing)", 및/또는 관련된 프로세스가 수반될 수 있다. 이같은 특수화된 HR로 표적 분자의 서열의 변경이 종종 초래되어, 도너 폴리뉴클레오티드의 서열의 일부분 또는 전체가 표적 폴리뉴클레오티드 내로 혼입된다.
"절단"은 DNA 분자의 공유결합 골격의 파손을 지칭한다. 포스포디에스테르 결합의 효소적 또는 화학적 가수분해를 포함하지만 이에 한정되지 않는 다양한 방법에 의해 절단이 개시될 수 있다. 단일 가닥 절단 및 이중 가닥 절단 모두가 가능하고, 이중 가닥 절단은 2개의 별도의 단일 가닥 절단 이벤트의 결과로서 발생할 수 있다. DNA 절단으로 블런트(blunt) 말단 또는 엇갈린(staggered) 말단이 생산될 수 있다. 특정 실시양태에서, 융합 폴리펩티드가 표적화된 이중 가닥 DNA 절단에 사용된다.
"절단 도메인"은 DNA 절단을 위한 촉매적 활성을 지니는 폴리펩티드 서열을 하나 이상 포함한다. 절단 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬 내에 함유될 수 있거나, 절단 활성이 2개 (또는 그 이상)의 폴리펩티드의 회합으로부터 초래될 수 있다.
"절단 절반-도메인"은, 제2의 폴리펩티드 (동일하거나 상이함)와 함께, 절단 활성 (예를 들어, 이중 가닥 절단 활성)이 있는 복합체를 형성하는 폴리펩티드 서열이다.
용어 "절단 도메인" 및 "절단 절반-도메인"은 야생형 도메인, 및 기능성 절단 도메인을 형성하기 위한 다량체화 (예를 들어, 이량체화) 능력을 유지하는 절단 도메인 또는 절단 절반-도메인의 일부분 또는 돌연변이체를 포함한다.
"염색질"은 세포 게놈을 포함하는 핵단백질 구조물이다. 세포 염색질은 핵산 (주로 DNA), 및 히스톤 및 비-히스톤 염색체 단백질이 포함되는 단백질을 포함한다. 대다수의 진핵생물 세포 염색질은 뉴클레오솜의 형태로 존재하고, 이때 뉴클레오솜 코어(core)는 히스톤 H2A, H2B, H3 및 H4를 각각 2개씩 포함하는 8량체와 회합된 약 150개의 염기쌍의 DNA를 포함하고, 링커(linker) DNA (생물에 따라 길이가 다양함)가 뉴클레오솜 코어들 사이에 연장된다. 히스톤 H1의 분자가 링커 DNA와 일반적으로 회합된다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 "염색질"은 모든 유형의 세포 핵단백질 (원핵생물 및 진핵생물 모두)를 포함하도록 의도된다. 세포 염색질은 염색체 염색질 및 에피솜 염색질 모두를 포함한다.
"염색체"는 세포의 게놈 전체 또는 이의 일부분을 이루는 염색질 복합체이다. 세포의 게놈은 세포의 게놈을 이루는 염색체 모두의 수집물인 핵형에 의해 종종 특성화된다. 세포의 게놈은 하나 이상의 염색체를 포함할 수 있다.
"에피솜"은 세포의 염색체 핵형의 일부분이 아닌, 복제성 핵산, 핵단백질 복합체 또는 핵산을 포함하는 기타 구조물이다. 에피솜의 예로는 플라스미드 및 특정 바이러스 게놈이 포함된다.
"접근가능 영역"은 핵산 내에 존재하는 표적 부위에 표적 부위를 인식하는 외인성 분자가 결합할 수 있는, 세포 염색질 내의 부위이다. 어떠한 특정한 이론에도 제한되기를 원치 않으면서, 접근가능 영역은 뉴클레오솜 구조물 내로 패키징되지 않는 영역인 것으로 여겨진다. 접근가능 영역의 독특한 구조는 화학적 및 효소적 프로브, 예를 들어, 뉴클레아제에 대한 감도에 의해 종종 검출될 수 있다.
"표적 부위" 또는 "표적 서열"은 결합에 충분한 조건이 존재하는 경우, 결합 분자가 결합할 핵산의 부분을 규정하는 핵산 서열이다. 예를 들어, 서열 5'-GAATTC-3'은 Eco RI 제한 엔도뉴클레아제에 대한 표적 부위이다.
"외인성" 분자는 정상적으로는 세포 내에 존재하지 않지만 하나 이상의 유전학적, 생화학적 또는 기타 방법에 의해 세포 내로 도입될 수 있는 분자이다. "세포 내의 정상적인 존재"는 세포의 특정 발달 단계 및 환경 조건과 관련되어 결정된다. 따라서, 예를 들어, 근육의 배아 발달 동안에만 존재하는 분자는 성체 근육 세포에 대해 외인성 분자이다. 유사하게, 열 충격에 의해 유도된 분자는 열 충격을 받지 않은 세포에 대해 외인성 분자이다. 외인성 분자는, 예를 들어, 기능부전 내인성 분자의 기능화 버젼 또는 정상적으로 기능하는 내인성 분자의 기능부전 버젼을 포함할 수 있다.
특히, 외인성 분자는 소형 분자, 예컨대 조합 화학 프로세스에 의해 생성된 분자, 또는 거대 분자 예컨대 단백질, 핵산, 탄수화물, 지질, 당단백질, 지단백질, 다당류, 상기 분자들의 임의의 변형 유도체, 또는 상기 분자를 하나 이상 포함하는 임의의 복합체일 수 있다. 핵산에는 DNA 및 RNA가 포함되고, 이는 단일- 또는 이중 가닥일 수 있으며, 선형, 분지형 또는 원형일 수 있고, 임의의 길이일 수 있다. 핵산에는 듀플렉스를 형성할 수 있는 것들, 뿐만 아니라 트리플렉스-형성 핵산이 포함된다. 예를 들어, 미국 특허 번호 5,176,996 및 5,422,251 참조. 단백질에는 DNA-결합 단백질, 전사 인자, 염색질 리모델링 인자, 메틸화 DNA 결합 단백질, 폴리머라제, 메틸라제, 데메틸라제, 아세틸라제, 데아세틸라제, 키나제, 포스파타제, 인테그라제, 리컴비나제, 리가제, 토포이소머라제, 자이라제 및 헬라카제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
외인성 분자는 내인성 분자와 동일한 유형의 분자, 예를 들어, 외인성 단백질 또는 핵산일 수 있다. 예를 들어, 외인성 핵산은 감염성 바이러스 게놈, 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) T-가닥, 세포 내로 도입된 플라스미드 또는 에피솜, 또는 정상적으로는 세포 내에 존재하지 않는 염색체를 포함할 수 있다. 그러나, 외인성 핵산 또는 폴리뉴클레오티드는 내인성 서열과 상동성이거나 동일한 서열을 함유할 수 있다. 특정한 내인성 게놈 영역에 대해, "외인성 서열"은 이러한 영역에 존재하지 않는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 이같은 외인성 서열은 또다른 내인성 염색체 위치에 존재할 수 있거나, 또는 게놈 내에 전혀 존재하지 않을 수 있다. 따라서, 외인성 폴리뉴클레오티드는 외인성 서열 및 내인성 서열 양쪽 모두를 함유할 수 있다: 예를 들어, 게놈 영역에 상동성인 서열들이 플랭킹(flanking)된 트랜스진(transgene). 이같은 외인성 핵산은 하기에 기술된 바와 같이 표적화된 통합 및 표적화된 재조합을 위한 방법에서 사용된다. 외인성 분자를 세포 내로 도입하는 당법은 당업자에게 주지되어 있고, 지질-매개 전달 (즉, 리포솜 (중성 및 양이온성 지질 포함)), 전기천공, 직접적인 주입, 세포 융합, 입자 포격, 인산칼슘 공동침전, DEAE-덱스트란-매개 전달 및 바이러스 벡터-매개 전달을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다.
반면에, "내인성" 분자는 특정 환경 조건 하에 특정 발달 단계에서 특정 세포 내에 정상적으로 존재하는 분자이다. 예를 들어, 내인성 핵산은 염색체, 미토콘드리아, 엽록체 또는 기타 세포소기관의 게놈, 또는 천연-발생 에피솜 핵산을 포함할 수 있다. 추가적인 내인성 분자에는 단백질, 예를 들어, 전사 인자 및 효소가 포함될 수 있다.
"융합" 분자는 2개 이상의 서브유닛 분자가 연결된, 예를 들어, 공유결합으로 연결된 분자이다. 서브유닛 분자들은 동일한 화학 유형의 분자일 수 있거나, 또는 상이한 화학 유형의 분자일 수 있다. 제1 유형의 융합 분자의 예에는 융합 단백질 (예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인 간의 융합물) 및 융합 핵산 (예를 들어, 상기에 기술된 융합 단백질을 코딩하는 핵산)이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 제2 유형의 융합 분자의 예로는 트리플렉스-형성 핵산과 폴리펩티드 간의 융합물, 및 마이너 그루브(minor groove) 결합제와 핵산 간의 융합물이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
세포 내에서의 융합 단백질의 발현은 융합 단백질을 세포에 전달함으로써 또는 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 세포에 전달함으로써 초래될 수 있고, 후자의 경우 상기 폴리뉴클레오티드가 전사되고, 전사물이 번역되어 융합 단백질이 생성된다. 트랜스-스플라이싱, 폴리펩티드 절단 및 폴리펩티드 결찰이 세포 내에서의 단백질의 발현에서 또한 수반될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 세포에 전달하는 방법이 본 발명의 다른 곳에서 제시된다.
본 발명의 목적을 위해, "유전자"는 유전자 생성물 (하기 참조)를 코딩하는 DNA 영역을 포함하고, 뿐만 아니라 유전자 생성물의 생산을 조절하는 모든 DNA 영역을 포함한다 (이같은 조절 서열이 코딩 서열 및/또는 전사된 서열에 이웃하는지 여부와 상관없이). 따라서, 유전자에는 프로모터 서열, 종결인자, 번역 조절 서열 예컨대 리보솜 결합 부위 및 내부 리보솜 도입 부위, 인핸서, 사일런서, 인슐레이터, 경계 요소, 복제 기원, 매트릭스 부착 부위 및 유전자좌 제어 영역이 포함되지만, 이에 반드시 한정되지는 않는다.
"유전자 발현"은 유전자 내에 함유된 정보가 유전자 생성물로 전환되는 것을 지칭한다. 유전자 생성물은 유전자의 직접적인 전사 생성물 (예를 들어, mRNA, tRNA, rRNA, 안티센스(antisense) RNA, 리보자임, 구조 RNA 또는 임의의 기타 유형의 RNA), 또는 mRNA의 번역에 의해 생산되는 단백질일 수 있다. 유전자 생성물에는 캡핑(capping), 폴리아데닐화, 메틸화, 및 편집과 같은 프로세스에 의해 변형된 RNA, 및 메틸화, 아세틸화, 인산화, 유비퀴틴화, ADP-리보실화, 미리스틸화, 및 글리코실화에 의해 예를 들어 변형된 단백질이 또한 포함된다.
유전자 발현의 "조정"은 유전자 활성에서의 변화를 지칭한다. 발현 조정에는 유전자 활성화 및 유전자 억제가 포함될 수 있지만, 이에 한정되지 않는다.
"식물" 세포에는 단자엽 또는 쌍자엽 식물의 세포가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 단자엽 식물의 비-제한적인 예로는 곡초류 예컨대 옥수수, 쌀, 보리, 귀리, 밀, 수수, 호밀, 사탕수수, 파인애플, 양파, 바나나, 및 코코넛이 포함된다. 쌍자엽 식물의 비-제한적인 예로는 담배, 토마토, 해바라기, 면, 사탕무, 감자, 양상추, 멜론, 대두, 캐놀라 (평지씨), 및 알팔파가 포함된다. 식물 세포는 식물의 임의의 부분으로부터 및/또는 임의의 식물 발달 단계로부터 수득될 수 있다.
"당해 영역"은 이러한 영역 내에서 외인성 분자에 결합하는 것이 바람직한 세포 염색질의 임의의 영역, 예컨대 유전자 또는 유전자 내부의 또는 유전자에 이웃한 비-코딩 서열이다. 결합은 표적화된 DNA 절단 및/또는 표적화된 재조합을 목적으로 할 수 있다. 예를 들어, 당해 영역은 염색체, 에피솜, 세포소기관 게놈 (예를 들어, 미토콘드리아, 엽록체), 또는 감염성 바이러스 게놈 내에 존재할 수 있다. 당해 영역은 유전자의 코딩 영역 내에, 전사된 비-코딩 영역 예컨대 리더(leader) 서열, 트레일러 서열 또는 인트론 내에, 또는 코딩 영역의 상류 또는 하류의 비-전사 영역 내에 있을 수 있다. 당해 영역의 길이는 단일 뉴클레오티드 쌍만큼 작을 수 있거나, 또는 25,000개까지의 뉴클레오티드 쌍, 또는 임의의 정수값의 뉴클레오티드 쌍일 수 있다.
용어 "작동적 연결" 및 "작동적으로 연결된" (또는 "작동가능하게 연결된")은 2개 이상의 성분 (예컨대 서열 요소)의 병렬과 관련하여 상호교환가능하게 사용되고, 이때 성분들은 양쪽 성분 모두가 정상적으로 기능하고 하나 이상의 성분이 하나 이상의 다른 성분에 발휘되는 기능을 매개할 수 있게 하도록 정렬된다. 예를 들어, 전사 조절 서열, 예컨대 프로모터는, 전사 조절 서열이 하나 이상의 전사 조절 인자의 존재 또는 부재에 응답하여 코딩 서열의 전사 수준을 제어한다면, 코딩 서열에 작동적으로 연결된 것이다. 일반적으로 전사 조절 서열은 코딩 서열과 시스(cis) 형태로 작동적으로 연결되지만, 이에 직접적으로 이웃할 필요는 없다. 예를 들어, 인핸서와 코딩 서열이 인접성이지 않더라도, 인핸서는 코딩 서열에 작동적으로 연결된 전사 조절 서열이다.
융합 폴리펩티드와 관련하여, 용어 "작동적으로 연결된"은 각각의 성분이 다른 성분에 연결된 상태에서 이렇게 연결되지 않았을 때와 동일한 기능을 수행한다는 사실을 지칭할 수 있다. 예를 들어, ZFP DNA-결합 도메인이 절단 도메인에 융합된 융합 폴리펩티드와 관련하여, 융합 폴리펩티드 내에서, ZFP DNA-결합 도메인 부분이 이의 표적 부위 및/또는 이의 결합 부위에 결합할 수 있으면서 절단 도메인이 표적 부위 부근에서 DNA를 절단할 수 있다면, ZFP DNA-결합 도메인과 절단 도메인은 작동적으로 연결되어 있다.
단백질, 폴리펩티드 또는 핵산의 "기능성 단편"은 서열이 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일하지는 않지만 전장 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산과 동일한 기능을 보유하는 단백질, 폴리펩티드 또는 핵산이다. 기능성 단편은 상응하는 천연 분자보다 많거나, 적거나 또는 이와 동일한 개수의 잔기를 보유할 수 있고/있거나, 하나 이상의 아미노산 또는 뉴클레오티드 치환을 함유할 수 있다. 핵산의 기능 (예를 들어, 코딩 기능, 또다른 핵산에 혼성화하는 능력)을 결정하는 방법은 당업계에 주지되어 있다. 유사하게, 단백질의 기능을 결정하는 방법이 주지되어 있다. 예를 들어, 폴리펩티드의 DNA-결합 기능을, 예를 들어, 필터-결합, 전기영동 이동도-시프트, 또는 면역침전 분석법에 의해 결정할 수 있다. 젤 전기영동에 의해 DNA 절단을 분석할 수 있다. [Ausubel et al., 상기 문헌] 참조. 또다른 단백질과 상호작용하는 단백질의 능력을, 예를 들어, 공동-면역침전, 2-하이브리드 분석법 또는 상보성 (유전학적 및 생화학적 모두)에 의해 결정할 수 있다. 예를 들어, [Fields et al. (1989) Nature 340:245-246]; 미국 특허 번호 5,585,245 및 PCT WO 98/44350 참조.
아연 손가락 결합 도메인
비-정규 아연 손가락 결합 도메인 및 이러한 아연 손가락 결합 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본원에서 기술된다. 특정 실시양태에서, 본원에 기술된 비-정규 아연 손가락 결합 도메인은 2개의 보존된 아연-배위결합 히스티딘 잔기 중 1개가 시스테인으로 전환된 C3H 아연 손가락이다. 추가적인 실시양태에서, 가장 C-말단인 히스티딘 잔기가 시스테인 잔기로 전환되어, "CCHC 단백질"이 생성된다.
아연 손가락 결합 도메인은 하나 이상의 아연 손가락 (예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 또는 그 이상의 아연 손가락)을 포함할 수 있고, 임의의 표적 서열 (예를 들어, 게놈 서열)에 결합하도록 조작될 수 있다. 아연 손가락 결합 도메인은 DNA, RNA 및/또는 단백질에 결합할 수 있다. 전형적으로, 단일 아연 손가락 도메인은 길이가 아미노산 약 30개이다. 아연 손가락은 정규 C2H2 아연 손가락 (즉, 아연 이온이 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘 잔기에 배위결합된 손가락), 및 C3H 아연 손가락 (아연 이온이 3개의 시스테인 잔기 및 1개의 히스티딘 잔기에 배위결합된 손가락)을 예를 들어 포함하는 비-정규 아연 손가락 양쪽 모두를 포함한다. 미국 특허 출원 번호 20030108880, 20060246567 및 20060246588를 또한 참조한다 (이들의 개시내용은 거명에 의해 포함됨).
정규 아연 손가락 도메인 (모티프)이 2개의 베타 시트 (2개의 불변 시스테인 잔기를 함유하는 베타 회전으로 유지됨) 및 알파 나선 (2개의 불변 히스티딘 잔기 함유)을 함유하고, 이들은 2개의 시스테인 및 2개의 히스티딘에 의한 아연 원자의 배위결합을 통해 특정 형상으로 유지된다는 것이 구조 연구에서 설명되었다. 본원에 개시된 비-정규 아연 손가락은 이러한 베타-베타-알파 구조를 유지한다.
본원에 기술된 비-정규 아연 손가락은 천연 발생 아연 손가락 결합 도메인일 수 있다. 그러나, 더욱 전형적으로, 본원에 기술된 바와 같은 비-정규 아연 손가락은 아연-배위결합 시스테인 또는 히스티딘 잔기들 중 1개 이상이 하나 이상의 아미노산으로 교체된 아연 손가락 성분을 하나 이상 포함한다. 예를 들어, 특정 실시양태에서, 정규 아연 손가락 결합 모듈(module)의 C-말단 His 잔기가 Cys 잔기로 교체된다.
본원에 기술된 CCHC 아연 손가락은 아연 배위결합 잔기 이외의 아미노산 잔기의 서열 내에 하나 이상의 변경 (천연 발생 C2H2 아연 손가락의 서열과 비교하여)을 또한 포함할 수 있다. 이같은 변경은 치환, 결실, 및/또는 삽입을 포함할 수 있다. 아미노산은 아연 손가락 내의 어디에서든지 변경될 수 있다. 변경의 비제한적인 예로는 (1) 변경된 아연-배위결합 잔기 주변의 단일 잔기들의 치환; (2) 변경된 아연-배위결합 잔기 앞 또는 뒤에서의 여분의 잔기의 부가 (예를 들어, 가장 C-말단의 His 잔기가 Cys로 전환되는 경우, 여분의 아미노산 잔기들의 부가가 더 짧은 시스테인 측쇄를 보상함으로써 아연 배위결합을 용이하게 할 수 있다); 및/또는 (3) 천연 발생 CCHC 아연 손가락의 His 잔기와 Cys 잔기 사이에 위치한 잔기들의 비-정규 CCHC 아연 손가락의 상응하는 영역 내로의 치환이 포함된다.
특정 실시양태에서, 본원에 기술된 아연 손가락 단백질은 비-정규 (비-C2H2) 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락을 하나 이상 포함하고, 이때 비-정규 아연 손가락에는 DNA 결합에 수반되는 나선형 부분이 있고, 나선형 부분의 아연-배위결합 영역은 아미노산 서열 HX1X2RCXL (서열 2)을 포함하며, 아연 손가락 단백질은 표적 서열에 결합하도록 조작된다. 특정 실시양태에서, X1은 A 또는 K 또는 T이고; X2는 Q 또는 E 또는 R이며; XL은 G이다.
또다른 실시양태에서, 본원에 기술된 비-정규 아연 손가락의 일반식은 하기와 같다: Cys-(XA)2-4-Cys-(XB)12-His-(XC)3-5-Cys-(XD)1-10 (서열 3) [식중, XA, XB, XC 및 XD는 임의의 아미노산을 나타낸다]. XC가 3개의 잔기를 포함하는 실시양태에서, (i) 이러한 잔기들 중 1개 이상이 정규 CCHC 아연 손가락과 비교하여 변경되고/되거나; (ii) XD가 정규 CCHC 아연 손가락과 비교하여 1개 이상의 결실, 치환 또는 삽입을 포함한다. 특정 실시양태에서, XD는 서열 QLV 또는 QKP를 포함한다. 또다른 실시양태에서, XD는 1개 이상 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 또는 10개)의 Gly (G) 잔기를 포함한다.
예시적인 비-정규 아연 손가락의 부분적인 아미노산 서열 (3번째 아연 배위결합 잔기를 포함하고 이에 대해 C-말단)이 표 1, 2, 3 및 4에서 제시된다. 모든 표에서, 가장 C-말단인 2개 (즉, 세번째 및 네번째)의 아연 배위결합 잔기 (H 및 C)에 밑줄이 그어진다. "야생형" 비-정규 손가락의 서열 (표 1 및 3의 2열)과 비교했을 때의 변경 (예를 들어, 치환, 삽입, 결실)은 이중 밑줄로 표시된다.
Figure 112009035680027-PCT00001
Figure 112009035680027-PCT00002
Figure 112009035680027-PCT00003
Figure 112009035680027-PCT00004
Figure 112009035680027-PCT00005
상기 언급된 바와 같이, ZFP는 임의의 개수의 아연 손가락 결합 도메인, 예를 들어 3개 이상의 아연 손가락을 포함할 수 있다. 또한, 아연 손가락들 중 1개, 1개 초과, 또는 모두가 본원에 기술된 바와 같은 비-정규 아연 손가락일 수 있다.
특정 실시양태에서, 다중-손가락 아연 손가락 단백질의 가장 C-말단의 손가락은 정규 아연 손가락을 포함한다. 또다른 실시양태에서, 다중-손가락 아연 손가락 단백질의 가장 C-말단의 손가락은 본원에 기술된 바와 같은 CCHC 손가락, 예를 들어, 가장 C-말단의 아연-배위결합 Cys 잔기에 대해 C-말단인 하나 이상의 아미노산 삽입을 포함하는 CCHC 손가락을 포함한다. 손가락 2 (F2) 및/또는 손가락 4 (F4)가 본원에 기술된 바와 같은 비-정규 아연 손가락인 4-손가락 아연 손가락 단백질이 기술된 실시예 1-5 참조.
아연 손가락 결합 도메인은 선택된 서열에 결합하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, [Beerli et al. (2002) Nature Biotechnol. 20:135-141]; [Pabo et al. (2001) Ann. Rev. Biochem. 70:313-340]; [Isalan et al. (2001) Nature Biotechnol. 19:656-660]; [Segal et al. (2001) Curr. Opin. Biotechnol. 12:632-637]; [Choo et al. (2000) Curr. Opin. Struct. Biol. 10:411-416] 참조. 조작된 아연 손가락 결합 도메인에는 천연 발생 아연 손가락 단백질과 비교하여 신규한 결합 특이성이 있을 수 있다. 조작 방법에는 논리적 디자인 및 다양한 유형의 선별 (예를 들어, 다수의 상이한 아연 손가락 서열들을 단일 표적 뉴클레오티드 서열에 대해 스크리닝하는 방법)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 논리적 디자인은, 예를 들어, 3중자 (또는 4중자) 뉴클레오티드 서열 및 개별적인 아연 손가락 아미노산 서열을 포함하는 데이터베이스를 사용하는 것을 포함하고, 이때 각각의 3중자 또는 4중자 뉴클레오티드 서열이 특정 3중자 또는 4중자 서열에 결합하는 아연 손가락의 하나 이상의 아미노산 서열과 관련된다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261 참조. 추가적인 디자인 방법이, 예를 들어, 미국 특허 6,746,838; 6,785,613; 6,866,997; 및 7,030,215에 개시되어 있다. 아연 손가락 결합 도메인에 대한 결합 특이성의 강화가, 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 번호 6,794,136에 기술되어 있다.
파지 디스플레이 및 2-하이브리드 시스템이 포함되는 예시적인 선별 방법이 미국 특허 5,789,538; 5,925,523; 6,007,988; 6,013,453; 6,410,248; 6,140,466; 6,200,759; 및 6,242,568; 뿐만 아니라 WO 98/37186; WO 98/53057; WO 00/27878; WO 01/88197 및 GB 2,338,237에 개시되어 있다.
개별적인 아연 손가락이 뉴클레오티드 3개 (즉, 3중자)의 서열 (또는 이웃한 아연 손가락의 4-뉴클레오티드 결합 부위와 1개의 뉴클레오티드가 중첩될 수 있는 4-뉴클레오티드 서열)에 결합하기 때문에, 아연 손가락 결합 도메인이 결합하도록 조작되는 서열 (예를 들어, 표적 서열)의 길이는 조작된 아연 손가락 결합 도메인 내의 아연 손가락의 개수를 결정할 것이다. 예를 들어, 아연 손가락 모티프가 중첩성 하위부위에 결합하지 않는 ZFP에 대해, 6-뉴클레오티드 표적 서열에 2-손가락 결합 도메인이 결합하고, 9-뉴클레오티드 표적 서열에 3-손가락 결합 도메인이 결합한다. 표적 부위 내의 개별적인 아연 손가락들에 대한 결합 부위 (즉, 하위부위)는 인접할 필요가 없고, 다중-손가락 결합 도메인 내의 아연 손가락들 사이의 아미노산 서열 (즉, 손가락간 링커)의 길이 및 성질에 따라, 1개 또는 여러개의 뉴클레오티드에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 6,479,626; 6,903,185 및 7,153,949 및 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0119023 참조 (이들의 개시내용은 거명에 의해 포함됨).
다중-손가락 아연 손가락 결합 도메인에서, 이웃한 아연 손가락들은 아미노산 약 5개의 아미노산 링커 서열 (소위 "정규" 손가락간 링커)에 의해, 또는 별법적으로 하나 이상의 비-정규 링커에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 번호 6,453,242 및 6,534,261 참조. 3개를 초과하는 손가락을 포함하는 조작된 아연 손가락 결합 도메인에 대해, 특정 아연 손가락들 사이에 더 긴 ("비-정규") 손가락간 링커를 삽입하는 것은 결합 도메인에 의한 결합의 친화력 및/또는 특이성을 증가시킬 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 번호 6,479,626 및 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0119023 참조 (이들의 개시내용은 거명에 의해 포함됨). 따라서, 다중-손가락 아연 손가락 결합 도메인이 비-정규 손가락간 링커의 존재 및 위치와 관련하여 또한 특성화될 수 있다. 더 긴 손가락간 링커의 사용은 아연 손가락 단백질이 비-인접 뉴클레오티드들을 포함하는 표적 부위들에 결합하는 것을 또한 용이하게 할 수 있다. 결과적으로, 아연 손가락 결합 도메인에 대한 표적 부위 내의 하나 이상의 하위부위가 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상의 뉴클레오티드에 의해 서로로부터 분리될 수 있다. 하나만 예를 들면, 4-손가락 결합 도메인이 2개의 인접한 3-뉴클레오티드 하위부위, 개재성 뉴클레오티드, 및 2개의 인접한 3중자 하위부위를 포함하는, 13-뉴클레오티드 표적 부위에 결합할 수 있다.
표적 하위부위는 단일 아연 손가락이 결합하는 뉴클레오티드 서열 (일반적으로 뉴클레오티드 3개 또는 4개)이다. 그러나, 표적 부위가 뉴클레오티드 3개의 배수일 필요는 없다. 예를 들어, 가닥-교차 상호작용이 발생하는 경우 (예를 들어, 미국 특허 6,453,242 및 6,794,136 참조), 다중-손가락 결합 도메인의 개별적인 아연 손가락들 중 하나 이상이 중첩성 4중자 하위부위에 결합할 수 있다. 미국 특허 6,746,838 및 6,866,997을 또한 참조한다. 하나만 예를 들면, 3-손가락 결합 도메인이 3개의 중첩성 4-뉴클레오티드 하위부위를 포함하는 10-뉴클레오티드 표적 부위에 결합할 수 있다.
예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 번호 6,453,242 (2002년 9월 17일)에 개시된 방법에 따라, 아연 손가락 도메인이 결합하는 세포 염색질 내의 서열 (예를 들어, 표적 부위)을 선별할 수 있고, 상기 특허에는 선별된 서열에 결합하는 ZFP를 디자인하는 방법이 또한 개시되어 있다. 뉴클레오티드 서열의 간단한 육안 검사를 표적 부위의 선별에 또한 사용할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 표적 부위 선별을 위한 임의의 수단이 본원에 기술된 방법에서 사용될 수 있다.
디자인 또는 선별에 의해 예를 들어 수득된 개별적인 아연 손가락들을 연결함으로써 다중-손가락 아연 손가락 단백질을 구축할 수 있다. 별법적으로, 2개의 아연 손가락으로 구성된 결합 모듈들을 정규 손가락간 링커 또는 더 긴 비-정규 손가락간 링커 (상기 참조)를 사용하여 서로 연결시겨, 4-손가락 및 6-손가락 단백질을 생성시킬 수 있다. 이같은 2-손가락 모듈은 다중-손가락 단백질 (일반적으로, 3개의 손가락)의 정황에서 특정한 6-뉴클레오티드 표적 서열에 결합하는 2개의 이웃한 손가락들을 선별함으로써 예를 들어 수득될 수 있다. 예를 들어, WO 98/53057 및 미국 특허 출원 공보 번호 2003/0119023 참조 (이들의 개시내용은 거명에 의해 포함됨). 별법적으로, 개별적인 아연 손가락들의 조립에 의해 2-손가락 모듈을 구축할 수 있다.
따라서, 본원에 기술된 아연 손가락 도메인은 임의의 표적 부위에 결합하는 다중-손가락 아연 손가락 단백질을 구축하기 위해 개별적으로 또는 다양하게 조합되어 사용될 수 있다.
서열들 (예를 들어, 표적 부위들) 간의 거리는 서로 가장 가까운 서열 가장자리들로부터 측정된, 2개의 서열 사이에 개재된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍의 개수를 지칭한다.
ZFN를 사용하는 실시양태, 예를 들어 절단이 2개의 아연 손가락 도메인/절단 절반-도메인 융합 분자가 별도의 표적 부위들에 결합하는 것에 좌우되는 실시양태에서, 2개의 표적 부위는 마주보는 DNA 가닥들 상에 있을 수 있다. 또다른 실시양태에서는, 양쪽 표적 부위 모두가 동일한 DNA 가닥 상에 있다. 예를 들어, WO 2005/084190 참조 (이의 개시내용은 거명에 의해 포함됨).
아연 손가락 또는 아연 손가락 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 이러한 폴리뉴클레오티드들을 표준 기술을 사용하여 구축할 수 있고, 벡터 내로 삽입할 수 있으며, 이러한 벡터를 코딩된 단백질이 세포에서 발현되도록 세포 내로 도입할 수 있다 (폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 벡터 및 방법에 관한 추가적인 개시내용에 대해 하기 참조).
융합 단백질
하나 이상의 본원에 기술된 비-정규 아연 손가락 성분을 포함하는 융합 단백질이 또한 제공된다.
융합 분자는 당업자에게 주지된 클로닝 및 생화학적 접합 방법에 의해 구축된다. 융합 분자는 CCHC-함유 ZFP 및, 예를 들어, 절단 도메인, 절단 절반-도메인, 전사 활성화 도메인, 전사 억제 도메인, 염색질 리모델링 복합체의 성분, 인슐레이터 도메인, 임의의 이러한 도메인들의 기능성 단편; 및/또는 2개 이상의 기능성 도메인 또는 이의 단편의 임의의 조합물을 포함한다.
특정 실시양태에서, 융합 분자는 변형된 식물 아연 손가락 단백질 및 2개 이상의 기능성 도메인 (예를 들어, 인슐레이터 도메인 또는 메틸 결합 단백질 도메인, 및 추가적으로 전사 활성화 또는 억제 도메인)을 포함한다.
융합 분자는 핵 국소화 신호 (예를 들어, SV40 T-항원 또는 옥수수 불투명(Opaque)-2 NLS로부터의 신호) 및 에피토프 태그(tag) (예를 들어, FLAG 또는 적혈구응집소)를 또한 임의로 포함한다. 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 핵산)은 융합물의 성분들 간에 번역 리딩 프레임(reading frame)이 보존되도록 디자인된다.
융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 디자인 및 구축을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 아연 손가락 단백질을 포함하는 융합 단백질 (및 이를 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 디자인 및 구축을 위한 방법이 공동 소유의 미국 특허 6,453,242 및 6,534,261에 기술되어 있다.
이같은 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또한 본 발명의 범주 내에 속한다. 이러한 폴리뉴클레오티드들을 표준 기술을 사용하여 구축할 수 있고, 벡터 내로 삽입할 수 있으며, 이러한 벡터를 세포 내로 도입할 수 있다 (폴리뉴클레오티드를 세포 내로 도입하기 위한 벡터 및 방법에 관한 추가적인 개시내용에 대해 하기 참조).
유전자 발현을 억제하기 위해 사용될, ZFP DNA-결합 도메인과 융합시키기 위한 예시적인 도메인은 인간 KOX-I 단백질로부터의 KRAB 억제 도메인이다 (예를 들어, [Thiesen et al., New Biologist 2, 363-374 (1990)]; [Margolin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4509-4513 (1994)]; [Pengue et al., Nucl. Acids Res. 22:2908-2914 (1994)]; [Witzgall et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4514-4518 (1994)] 참조). KOX 도메인이 억제 도메인으로서 사용하기에 또한 적절하다. 또다른 적절한 억제 도메인은 메틸 결합 도메인 단백질 2B (MBD-2B)이다 (MBD 단백질의 기술(記述)을 위해 [Hendrich et al. (1999) Mamm Genome 10:906-912]를 또한 참조. 또다른 유용한 억제 도메인은 v-ErbA 단백질과 회합된 것이다. 예를 들어, [Damm, et al. (1989) Nature 339:593-597]; [Evans (1989) Int. J. Cancer Suppl. 4:26-28]; [Pain et al. (1990) New Biol. 2:284-294]; [Sap et al. (1989) Nature 340:242-244]; [Zenke et al. (1988) Cell 52:107-119]; 및 [Zenke et al. (1990) Cell 61:1035-1049] 참조. 추가적인 예시적인 억제 도메인에는 갑상선 호르몬 수용체 (TR), SID, MBD1, MBD2, MBD3, MBD4, MBD-유사 단백질, DNMT 패밀리의 구성원 (예를 들어, DNMT1, DNMT3A, DNMT3B), Rb, MeCP1 및 MeCP2가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, [Zhang et al. (2000) Ann Rev Physiol 62:439-466]; [Bird et al. (1999) Cell 99:451-454]; [Tyler et al. (1999) Cell 99:443-446]; [Knoepfler et al. (1999) Cell 99:447-450]; 및 [Robertson et al. (2000) Nature Genet. 25:338-342] 참조. 추가적인 예시적인 억제 도메인에는 R0M2 및 AtHD2A가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, [Chern et al. (1996) Plant Cell 8:305-321]; 및 [Wu et al. (2000) Plant J. 22:19-27] 참조.
활성화를 달성하기 위한 적절한 도메인에는 HSV VP16 활성화 도메인 (예를 들어, [Hagmann et al., J. Virol. 71, 5952-5962 (1997)] 참조), 핵 호르몬 수용체 (예를 들어, [Torchia et al., Curr. Opin. Cell. Biol. 10:373-383 (1998)] 참조); 핵 인자 카파 B의 p65 서브유닛 ([Bitko & Bank, J. Virol. 72:5610-5618 (1998)] 및 [Doyle & Hunt, Neuroreport 8:2937-2942 (1997)]); [Liu et al., Cancer Gene Ther. 5:3-28 (1998)]), 또는 인공적인 키메라 기능성 도메인 예컨대 VP64 ([Seifpal et al., EMBO J. 11, 4961-4968 (1992)])가 포함된다.
추가적인 예시적인 활성화 도메인에는 p300, CBP, PCAF, SRC1 PvALF, 및 ERF-2가 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, [Robyr et al. (2000) Mol. Endocrinol. 14:329-347]; [Collingwood et al. (1999) J. Mol. Endocrinol. 23:255-275]; [Leo et al. (2000) Gene 245:1-11]; [Manteuffel-Cymborowska (1999) Acta Biochim. Pol. 46:77-89]; [McKenna et al. (1999) J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 69:3-12]; [Malik et al. (2000) Trends Biochem. Sci. 25:277-283]; 및 [Lemon et al. (1999) Curr. Opin. Genet. Dev. 9:499-504] 참조. 추가적인 예시적인 활성화 도메인에는 OsGAI, HALF-1, C1, AP1, ARF-5, -6, -7, 및 -8, CPRF1, CPRF4, MYC-RP/GP, 및 TRAB1이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다. 예를 들어, [Ogawa et al. (2000) Gene 245:21-29]; [Okanami et al. (1996) Genes Cells 1:87-99]; [Goff et al (1991) Genes Dev. 5:298-309]; [Cho et al. (1999) Plant Mol. Biol. 40:419-429]; [Ulmason et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:5844-5849]; [Sprenger-Haussels et al. (2000) Plant J. 22:1-8]; [Gong et al. (1999) Plant Mol. Biol. 41:33-44]; 및 [Hobo et al. (1999) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96:15,348-15,353] 참조.
추가적인 기능성 도메인이, 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 번호 6,933,113에 개시되어 있다. 또한, 융합 분자에서 사용하기에 적절한 인슐레이터 도메인, 염색질 리모델링 단백질 예컨대 ISWI-함유 도메인, 및 메틸 결합 도메인 단백질이, 예를 들어, 공동 소유의 국제 공보 WO 01/83793 및 WO 02/26960에 기술되어 있다.
또다른 실시양태에서, 융합 단백질은 하나 이상의 본원에 기술된 바와 같은 CCHC 아연 손가락 및 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인)을 포함하는 아연 손가락 뉴클레아제 (ZFN)이다. 아연 손가락은 선택된 임의의 게놈 영역 내의 표적 서열을 인식하도록 조작될 수 있고, 세포 내로 도입되는 경우, 융합 단백질(들)이 이(들)의 결합 부위에 결합하는 것 및 상기 게놈 영역 내 또는 근처에서의 절단을 초래할 것이다. 이같은 절단으로 비-상동 말단 연결에 이어서 게놈 영역의 뉴클레오티드 서열의 변경 (예를 들어, 돌연변이)이 초래될 수 있다. 별법적으로, 게놈 영역에 상동성인 서열을 함유하는 외인성 폴리뉴클레오티드가 이같은 세포 내에 또한 존재하면, ZFN에 의한 표적화된 절단에 이어서, 게놈 영역과 외인성 폴리뉴클레오티드 사이에 높은 비율로 상동 재조합이 발생한다. 외인성 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열에 따라, 상동 재조합은 외인성 서열의 표적화된 통합 또는 표적화된 서열 교체를 초래할 수 있다.
본원에 기술된 비-정규 아연 손가락은 ZFN 내로 혼입되는 경우 개선된 절단 기능을 제공한다. 실시예에 기술된 바와 같이, 1개 이상의 본원에 기술된 바와 같은 CCHC 손가락을 함유하는 4-손가락 ZFN은 적어도 CCHH 손가락만을 함유하는 뉴클레아제만큼 절단한다. 특정 실시양태에서, C-말단 손가락이 비-정규 CCHC 아연 손가락을 포함하는 경우, 3번째 아연-배위결합 잔기와 4번째 아연-배위결합 잔기 사이 (즉, C-말단 His 잔기와 Cys 잔기 사이)의 잔기는 정규 CCHH 아연 손가락 내에 존재하는 것과 상이하고, 하나 이상의 글리신 잔기 (예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 그 이상)가 C-말단 Cys 잔기 뒤에 삽입된다.
본원에 개시된 ZFN의 절단 도메인 부분은 임의의 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제로부터 수득될 수 있다. 절단 도메인이 유래될 수 있는 예시적인 엔도뉴클레아제에는 제한 엔도뉴클레아제 및 귀소성 엔도뉴클레아제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, [2002-2003 Catalogue, New England Biolabs, Beverly, MA]; 및 [Belfort et al. (1997) Nucleic Acids Res. 25:3379-3388] 참조. DNA를 절단하는 추가적인 효소들이 공지되어 있다 (예를 들어, S1 뉴클레아제; 녹두 뉴클레아제; 췌장 DNase I; 마이크로코쿠스 뉴클레아제; 효모 HO 엔도뉴클레아제; [Linn et al. (eds.) Nucleases, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1993]를 또한 참조). 이러한 효소들 (또는 이의 기능성 단편) 중 하나 이상이 절단 도메인 및 절단 절반-도메인의 공급원으로 사용될 수 있다.
유사하게, 절단 절반-도메인은, 절단 절반-도메인이 절단 활성을 위해 이량체화를 필요로 하는 한, 상기 기재된 바와 같은 임의의 뉴클레아제 또는 이의 일부분으로부터 유래될 수 있다. 일반적으로, 융합 단백질이 절단 절반-도메인을 포함한다면 2개의 융합 단백질이 게놈 DNA의 표적화된 절단에 필요하다. 별법적으로, 2개의 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 단백질이 사용될 수 있다. 2개의 절단 절반-도메인이 동일한 엔도뉴클레아제로부터 유래될 수 있거나, 또는 각각의 절단 절반-도메인이 상이한 엔도뉴클레아제로부터 유래될 수 있다. 또한, 2개의 융합 단백질이 각각의 표적 부위에 결합하는 것이 절단 절반-도메인들이 기능성 절단 도메인을 형성 (예를 들어, 이량체화에 의해 형성)하도록 절단 절반-도메인들을 서로에 대해 공간적으로 배향시키도록, 2개의 융합 단백질에 대한 표적 부위들이 서로 관련되어 배치된다. 따라서, 특정 실시양태에서, 표적 부위들의 가까운 가장자리들은 뉴클레오티드 쌍 5-8개 또는 뉴클레오티드 쌍 15-18개에 의해 분리된다. 추가적인 실시양태에서, 표적 부위들은 서로 뉴클레오티드 쌍 10개 이내에 있다. 그러나, 임의의 정수의 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 쌍이 2개의 표적 부위들 사이에 개재될 수 있다 (예를 들어, 2개 내지 50개의 뉴클레오티드 또는 그 이상). 일반적으로, 절단점은 표적 부위들 사이에 존재한다.
제한 엔도뉴클레아제 (제한 효소)는 다수의 종 내에 존재하고, DNA에 서열-특이적으로 결합할 수 있고 (인식 부위에서), 결합 부위에서 또는 결합 부위 근처에서 DNA를 절단할 수 있다. 특정 제한 효소 (예를 들어, IIS형)는 인식 부위에서 떨어진 부위에서 DNA를 절단하고, 분리가능한 결합 도메인 및 절단 도메인이 있다. 예를 들어, IIS형 효소 Fok I은 한쪽 가닥 상의 인식 부위로부터 9개의 뉴클레오티드, 및 다른쪽 가닥 상의 인식 부위로부터 13개의 뉴클레오티드에서 DNA의 이중 가닥 절단을 촉매한다. 예를 들어, 미국 특허 5,356,802; 5,436,150 및 5,487,994; 뿐만 아니라 [Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279]; [Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768]; [Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887]; [Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269:31,978-31,982] 참조. 따라서, 한 실시양태에서, 융합 단백질은 하나 이상의 IIS형 제한 효소로부터의 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인), 및 조작되거나 조작되지 않을 수 있는 하나 이상의 아연 손가락 결합 도메인을 포함한다.
절단 도메인이 결합 도메인으로부터 분리가능한 예시적인 IIS형 제한 효소는 Fok I이다. 이러한 특정 효소는 이량체로서 활성이다. [Bitinaite et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 10,570-10,575]. 따라서, 본 발명의 목적을 위해, 개시된 융합 단백질에서 사용된 Fok I 효소의 일부분은 절단 절반-도메인으로 간주된다. 따라서, 아연 손가락-Fok I 융합물을 포함하는 ZFN을 사용하는 세포 서열의 표적화된 이중 가닥 절단 및/또는 표적화된 교체를 위해, 각각 Fok I 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질이 촉매적으로 활성인 절단 도메인을 재구성하는데 사용될 수 있다. 별법적으로, 아연 손가락 결합 도메인 및 2개의 Fok I 절단 절반-도메인을 함유하는 단일 폴리펩티드 분자가 또한 사용될 수 있다. 아연 손가락-Fok I 융합물을 사용하는 표적화된 절단 및 표적화된 서열 변경을 위한 파라메터가 본 발명의 다른 곳, 및, 예를 들어, 미국 특허 출원 공보 번호 2005/0064474 (이의 개시내용은 거명에 의해 포함됨)에서 제공된다.
추가적인 실시양태에서, FokI 절단 절반-도메인은 이량체화에 영향을 미치는 임의의 아미노산 잔기에서 하나 이상의 돌연변이를 포함할 수 있다. 이같은 돌연변이는 한쌍의 ZFP/FokI 융합물 중 하나에 원치않는 서열에서의 절단에 이를 수 있는 동종이량체화가 진행되는 것을 방지하는데 유용할 수 있다. 예를 들어, FokI의 위치 446, 447, 479, 483, 484, 486, 487, 490, 491, 496, 498, 499, 500, 531, 534, 537, 및 538에서의 아미노산 잔기들이 모두 이량체화 계면에 충분히 가까와서, 이량체화에 영향을 미친다. 따라서, 상기 언급된 위치들 중 하나 이상에서의 아미노산 서열 변경이 절단 절반-도메인의 이량체화 성질을 변경시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이러한 위치들에서 상이한 아미노산 잔기를 함유하는 (또는 코딩하는) 라이브러리를 구축하고 원하는 성질이 있는 변이체를 선별함으로써, 또는 개별적인 돌연변이체들을 적합하게 디자인함으로써, 이같은 변화가 도입될 수 있다. 동종이량체화를 방지하는 것에 더하여, 이러한 돌연변이들 중 일부가 절단 효율을 2개의 야생형 절단 절반-도메인으로 수득된 것에 비하여 증가시킬 수 있는 것이 또한 가능하다.
따라서, 한쌍의 ZFP/FokI 융합물을 사용하는 표적화된 절단을 위해, 자가-이량체화를 억제하지만, 원하는 표적 부위에서 절단이 일어나도록 2개의 융합 단백질의 이종이량체화가 일어나도록 하는 하나 이상의 아미노산 변경을 융합 단백질들 중 하나 또는 양쪽 모두가 포함할 수 있다. 특정 실시양태에서, 변경이 양쪽 모두의 융합 단백질에 존재하고, 변경에 추가적인 효과가 있으며, 즉, 부적절한 절단에 이르는, 어느 한쪽 융합물의 동종이량체화가 최소화되거나 폐지되면서, 야생형 절단 절반-도메인들로 수득되는 것에 비하여 2개의 융합 단백질의 이종이량체화가 용이해진다.
특정 실시양태에서, 절단 도메인은 2개의 절단 절반-도메인을 포함하고, 이들 모두는 결합 도메인, 제1 절단 절반-도메인 및 제2 절단 절반-도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드의 일부분이다. 절단 절반-도메인들은 DNA를 절단하는 기능을 하는 한 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있다.
절단 절반-도메인들이 별개의 분자에서 또한 제공될 수 있다. 예를 들어, 2개의 융합 폴리펩티드가 세포 내에서 발현될 수 있고, 이때 각각의 폴리펩티드가 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함한다. 절단 절반-도메인들은 DNA를 절단하는 기능을 하는 한 아미노산 서열이 동일하거나 상이할 수 있다. 추가로, 융합 폴리펩티드들이 결합되면, 절단 도메인의 재구성 (예를 들어, 절반-도메인들의 이량체화에 의한 재구성)을 허용하도록 2개의 절단 절반-도메인이 서로에 대해 공간적으로 배향됨으로써, 기능성 절단 도메인이 형성되도록 절단-도메인들이 서로에 대해 놓여, 당해 영역 내의 세포 염색질의 절단을 초래하는 방식으로 전형적으로 배열된 표적 서열들에 결합 도메인들이 결합한다. 일반적으로, 재구성된 절단 도메인에 의한 절단은 2개의 표적 서열들 사이에 위치한 부위에서 일어난다. 단백질들 중 하나 또는 양쪽 모두가 이의 표적 부위에 결합하도록 조작될 수 있다.
세포 내에서의 2개의 융합 단백질의 발현은 2개의 단백질을 세포에 전달하는 것; 1개의 단백질 및 단백질들 중 1개를 코딩하는 핵산을 세포에 전달하는 것; 각각 단백질들 중 하나를 코딩하는 2개의 핵산을 세포에 전달하는 것; 또는 양쪽 단백질을 코딩하는 단일 핵산을 세포에 전달하는 것으로부터 초래될 수 있다. 추가적인 실시양태에서, 융합 단백질은 2개의 절단 절반 도메인 및 아연 손가락 결합 도메인을 포함하는 단일 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 이러한 경우에, 단일 융합 단백질이 세포 내에서 발현되고, 이론에 제한되기를 원치 않으면서, 절단 절반-도메인들의 분자내 이량체가 형성된 결과로 DNA를 절단하는 것으로 여겨진다.
특정 실시양태에서, 아연 손가락 도메인이 융합 단백질의 가장 아미노 말단쪽에 있고, 절단 절반-도메인이 가장 카르복시 말단쪽에 있도록 ZFN의 성분들이 정렬된다. 이는 DNA-결합 도메인이 가장 아미노 말단쪽에 있고 절단 절반-도메인이 가장 카르복시 말단쪽에 있는, 이량체를 형성하는 천연 발생 절단 도메인들 예컨대 Fok I 효소로부터 유래된 것들에서의 절단 도메인의 상대적인 배향을 반영한다. 이러한 실시양태에서, 기능성 뉴클레아제를 형성하기 위한 절단 절반-도메인들의 이량체화는 융합 단백질들이 마주보는 DNA 가닥들 상의 부위에 결합하는 것에 의해 초래되고, 이때 결합 부위들의 5' 말단들이 서로에 대해 근접한다.
이러한 배향에서, 가장 C-말단인 아연 손가락이 FokI 절단 절반-도메인에 근접한다. CCHC-유형 아연 손가락이 가장 C-말단인 손가락으로 존재하는 경우에 비-정규 아연 손가락 단백질이 이의 DNA 표적에 가장 효율적으로 결합하는 것으로 기존에 결정되었다. 따라서, 기존에 기술된 CCHC-유형 아연 손가락이 FokI 절단 절반-도메인에 근접하여 존재하는 것이 이의 기능을 억제하였을 수 있다. 이러한 이유라면, 본원에서 개시된 최적화된 CCHC 아연 손가락은 이러한 가정된 억제 활성을 명백하게 나타내지 않는다.
추가적인 실시양태에서, 절단 절반-도메인이 융합 단백질의 가장 아미노 말단쪽에 있고, 아연 손가락 도메인이 가장 카르복시 말단쪽에 있도록 융합 단백질 (예를 들어, ZFP-Fok I 융합물)의 성분들이 정렬된다. 이러한 실시양태에서, 기능성 뉴클레아제를 형성하기 위한 절단 절반-도메인들의 이량체화는 융합 단백질들이 마주보는 DNA 가닥들 상의 부위에 결합하는 것에 의해 초래되고, 이때 결합 부위들의 3' 말단들이 서로에 대해 근접한다.
또다른 추가적인 실시양태에서, 제1 융합 단백질은 융합 단백질의 가장 아미노 말단쪽에 있는 절단 절반-도메인 및 가장 카르복시 말단쪽에 있는 아연 손가락 도메인을 함유하고, 제2 융합 단백질은 아연 손가락 도메인이 융합 단백질의 가장 아미노 말단 쪽에 있고 절단 절반-도메인이 가장 카르복시 말단쪽에 있도록 정렬된다. 이러한 실시양태에서, 양쪽 융합 단백질이 동일한 DNA 가닥에 결합하고, 이때 가장 카르복시 말단 쪽에 아연 손가락 도메인을 함유하는 제1 융합 단백질의 결합 부위가 가장 아미노 말단 쪽에 아연 손가락 도메인을 함유하는 제2 융합 단백질의 결합 부위의 5' 측면에 위치한다. WO 2005/084190 (이의 개시 내용은 거명에 의해 본원에 포함됨)을 또한 참조한다.
아연 손가락 도메인과 절단 도메인 (또는 절단 절반-도메인) 간의 아미노산 서열은 "ZC 링커"로 표시된다. ZC 링커는 상기 논의된 손가락간 링커와 구별되어야 한다. 절단을 최적화하는 ZC 링커를 수득하는 것에 관한 상세사항에 대해서는, 예를 들어, 미국 특허 공보 20050064474A1 및 20030232410, 및 국제 특허 공보 WO 2005/084190 참조 (이들의 개시 내용은 거명에 의해 본원에 포함됨).
발현 벡터
하나 이상의 ZFP 또는 ZFP 융합 단백질 (예를 들어, ZFN)을 코딩하는 핵산이 복제 및/또는 발현을 위해 원핵생물 또는 진핵생물 세포 내로의 형질전환용 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 벡터는 플라스미드, 셔틀 벡터, 곤충 벡터, 이원성 벡터 (예를 들어, 미국 특허 번호 4,940,838; [Horsch et al (1984) Science 233:496-498], 및 [Fraley et al (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803] 참조) 등이 포함되지만 이에 한정되지 않는 원핵생물 또는 진핵생물 벡터일 수 있다. ZFP를 코딩하는 핵산은 식물 세포로의 투여를 위해 발현 벡터 내로 또한 클로닝될 수 있다.
융합 단백질을 발현시키기 위해, ZFP 또는 ZFP 융합물을 코딩하는 서열이 전사를 지시하는 프로모터를 함유하는 발현 벡터 내로 전형적으로 서브클로닝된다. 적절한 박테리아 및 진핵생물 프로모터들이 당업계에 주지되어 있고, 예를 들어, [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (2nd ed. 1989; 3rd ed., 2001)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990)]; 및 [Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., 상기 문헌)]에 기술되어 있다. ZFP 발현을 위한 박테리아 발현 시스템은, 예를 들어, 대장균, 바실루스 종(Bacillus sp.), 및 살모넬라(Salmonella)에서 입수가능하다 ([Palva et al., Gene 22:229-235 (1983)]). 이같은 발현 시스템을 위한 키트가 시판된다. 포유류 세포, 효모 및 곤충 세포를 위한 진핵생물 발현 시스템이 당업자에게 주지되어 있고, 또한 시판된다.
ZFP-코딩 핵산의 발현을 지시하기 위해 사용된 프로모터는 특정 용도에 좌우된다. 예를 들어, 숙주 세포에 적합한 강한 구성성 프로모터가 ZFP의 발현 및 정제에 전형적으로 사용된다.
반면에, 식물 유전자 조절을 위해 ZFP가 생체 내 투여되는 경우 (하기의 "식물 세포에의 핵산 전달" 섹션 참조), ZFP의 특정 용도에 따라 구성성 또는 유도성 프로모터가 사용된다. 식물 프로모터의 비-제한적인 예로는 아라비돕시스 탈리아나(A. thaliana) 유비퀴틴-3 (ubi-3) ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493]); 아그로박테리움 투메파시엔스 만노파인 신타제 (Δmas) (미국 특허 번호 6,730,824 (Petolino 등)); 및/또는 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 (CsVMV) ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129- 1139])로부터 유래된 프로모터 서열이 포함된다. 실시예를 또한 참조한다.
프로모터에 더하여, 발현 벡터는 숙주 세포 (원핵생물 또는 진핵생물)에서의 핵산 발현에 필요한 모든 추가적인 요소들을 함유하는 전사 단위 또는 발현 카셋트를 전형적으로 함유한다. 따라서, 전형적인 발현 카셋트는 ZFP를 코딩하는 핵산 서열에 예를 들어 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 신호, 예를 들어, 전사물의 효율적인 폴리아데닐화, 전사 종결, 리보솜 결합 부위 또는 번역 종결에 필요한 신호를 함유한다. 카셋트의 추가적인 요소는, 예를 들어, 인핸서, 및 이종성 스플라이싱 신호를 포함할 수 있다.
유전자 정보를 세포 내로 전달하는데 사용되는 특정 발현 벡터는 ZFP의 의도된 용도, 예를 들어, 식물, 동물, 박테리아, 진균류, 원생동물 등에서의 발현과 관련하여 선택된다. (하기에 기술된 발현 벡터 참조). 표준 박테리아 및 동물 발현 벡터들이 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 미국 특허 공보 20050064474A1 및 국제 특허 공보 WO05/084190, WO05/014791 및 WO03/080809 (이들의 개시내용은 거명에 의해 포함됨)에 상세하게 기술되어 있다.
표준 형질감염 방법을 사용하여, 다량의 단백질을 발현하는 박테리아, 포유류, 효모 또는 곤충 세포주를 생산할 수 있고, 그후, 표준 기술을 사용하여 단백질을 정제할 수 있다 (예를 들어, [Colley et al., J. Biol. Chem. 264:17619-17622 (1989)]; [Guide to Protein Purification, in Methods in Enzymology, vol. 182 (Deutscher, ed., 1990)] 참조). 진핵생물 및 원핵생물 세포의 형질전환은 표준 기술에 따라 수행된다 (예를 들어, [Morrison, J. Bact. 132:349-351 (1977)]; [Clark-Curtiss & Curtiss, Methods in Enzymology 101:347-362 (Wu et al, eds., 1983)] 참조).
외래 뉴클레오티드 서열을 이같은 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 주지된 절차를 사용할 수 있다. 여기에는 인산칼슘 형질감염, 폴리브렌, 원형질체 융합, 전기천공, 초음파 방법 (예를 들어, 초음파천공), 리포솜, 미세주사, 네이키드(naked) DNA, 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터 (에피솜성 및 통합성 모두), 및 클로닝된 게놈 DNA, cDNA, 합성 DNA 또는 기타 외래 유전자 물질을 숙주 세포 내로 도입하기 위한 임의의 기타 주지된 방법을 사용하는 것을 포함한다 (예를 들어, [Sambrook et al., 상기 문헌] 참조). 사용된 특정 유전자 조작 절차가 하나 이상의 유전자를 선택된 단백질을 발현할 수 있는 숙주 세포 내로 성공적으로 도입할 수 있는 것만이 필요하다.
식물 세포에의 핵산 전달
상기 언급된 바와 같이, 다양한 통상적인 기술에 의해 DNA 구축물이 원하는 식물 숙주 내로 (예를 들어, 이의 게놈 내로) 도입될 수 있다. 이같은 기술의 리뷰를 위해서, 예를 들어, [Weissbach & Weissbach Methods for Plant Molecular Biology (1988, Academic Press, N.Y.) Section VIII, pp. 421-463]; 및 [Grierson & Corey, Plant Molecular Biology (1988, 2d Ed.), Blackie, London, Ch. 7-9] 참조.
예를 들어, 식물 세포 원형질체의 전기천공 및 미세주입과 같은 기술을 사용하여 DNA 구축물을 식물 세포 내로 도입할 수 있거나, 또는 바이오리스틱(biolistic) 방법, 예컨대 DNA 입자 포격을 사용하여 DNA 구축물을 식물 조직으로 직접 도입할 수 있다 (예를 들어, [Klein et al. (1987) Nature 327:70-73] 참조). 별법적으로, DNA 구축물을 적절한 T-DNA 플랭킹 영역과 조합하여, 통상적인 아그로박테리움 투메파시엔스 숙주 벡터 내로 도입할 수 있다. 무장해제 및 이원성 벡터의 사용을 포함하는 아그로박테리움 투메파시엔스-매개 형질전환 기술은 과학 문헌에 상술되어 있다. 예를 들어 [Horsch et al. (1984) Science 233:496-498], 및 [Fraley et al. (1983) Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 80:4803] 참조.
또한, 비-아그로박테리움 박테리아 또는 바이러스 예컨대 리조비움 종(Rhizobium sp.) NGR234, 시노리조비움 멜리오티(Sinorhizobium meliloti), 메소리조비움 로티(Mesorhizobium loti), 감자 바이러스 X, 컬리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 및/또는 담배 모자이크 바이러스를 사용하여 유전자를 전달할 수 있다. 예를 들어, [Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4] 참조.
아그로박테리움 투메파시엔스 숙주의 병원성 기능은 이원성 T DNA 벡터 ([Bevan (1984) Nuc. Acid Res. 12:8711-8721]) 또는 공동-배양 절차 ([Horsch et al. (1985) Science 227:1229-1231])를 사용하여 박테리아에 의해 세포가 감염되었을 때 구축물 및 이웃한 마커가 식물 세포 DNA 내로 삽입되도록 지시할 것이다. 일반적으로, 아그로박테리움 형질전환 시스템은 쌍자엽 식물을 조작하는데 사용된다 ([Bevan et al. (1982) Ann. Rev. Genet 16:357-384]; [Rogers et al. (1986) Methods Enzymol. 118:627-641]). 또한 아그로박테리움 형질전환 시스템은 단자엽 식물 및 식물 세포에 DNA를 형질전환시키는데, 뿐만 아니라 전달하는데 사용될 수 있다. 미국 특허 번호 5,591,616; [Hernalsteen et al. (1984) EMSO J 3:3039-3041]; [Hooykass-Van Slogteren et al. (1984) Nature 311:763-764]; [Grimsley et al. (1987) Nature 325:1677-179]; [Boulton et al. (1989) Plant Mol. Biol. 12:31-40]; 및 [Gould et al. (1991) Plant Physiol. 95:426-434] 참조.
별법적인 유전자 전달 및 형질전환 방법에는 네이키드 DNA의 칼슘-, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)- 또는 전기천공-매개 흡수를 통한 원형질체 형질전환 ([Paszkowski et al. (1984) EMBO J 3:2717-2722], [Potrykus et al. (1985) Molec. Gen. Genet. 199:169-177]; [Fromm et al. (1985) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 82:5824-5828]; 및 [Shimamoto (1989) Nature 338:274-276] 참조) 및 식물 조직의 전기천공 ([D'Halluin et al. (1992) Plant Cell 4:1495-1505])이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 식물 세포 형질전환을 위한 추가적인 방법에는 미세주입, 탄화규소-매개 DNA 흡수 ([Kaeppler et al. (1990) Plant Cell Reporter 9:415-418]), 및 미세발사물 포격 ([Klein et al. (1988) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85:4305-4309]; 및 [Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603-618] 참조)이 포함된다.
개시된 방법 및 조성물을 사용하여, 외인성 서열을 식물 세포 게놈 내의 미리 정해진 위치 내로 삽입할 수 있다. 이는 식물 게놈 내로 도입된 트랜스진의 발현이 이의 통합 부위에 결정적으로 좌우되기 때문에 유용하다. 따라서, 영양소, 항생제 또는 치료용 분자를 예를 들어 코딩하는 유전자가 표적화된 재조합에 의해 이의 발현에 유리한 식물 게놈의 영역 내로 삽입될 수 있다.
임의의 상기 형질전환 기술에 의해 생산된 형질전환된 식물 세포를 배양하여, 형질전환된 유전자형을 지니고, 따라서 원하는 표현형을 지니는 전체 식물을 재생시킬 수 있다. 이같은 재생 기술은 조직 배양 성장 배지 내의 특정 식물 호르몬의 조작에 의존하고, 전형적으로, 원하는 뉴클레오티드 서열과 함께 도입된 살생제 및/또는 제초제 마커에 의존한다. 배양된 원형질체로부터의 식물 재생이 [Evans, et al., "Protoplasts Isolation and Culture", Handbook of Plant Cell Culture, pp. 124-176, Macmillian Publishing Company, New York, 1983]; 및 [Binding, Regeneration of Plants, Plant Protoplasts, pp. 21-73, CRC Press, Boca Raton, 1985]에 기술되어 있다. 식물 캘러스(callus), 외식편, 기관, 화분, 배아 또는 이의 일부분으로부터 재생이 또한 수득될 수 있다. 이같은 재생 기술이 일반적으로 [Klee et al. (1987) Ann. Rev. of Plant Phys. 38:467-486]에 기술되어 있다.
식물 세포 내로 도입된 핵산을 사용하여, 본질적으로 모든 식물에 원하는 소질을 부여할 수 있다. 본 발명의 핵산 구축물 및 상기 언급된 다양한 형질전환 방법을 사용하여 본원에 기술된 원하는 생리학적 및 농업적 특성에 대해 광범위한 식물 및 식물 세포 시스템을 조작할 수 있다. 특정 실시양태에서, 조작하기 위한 표적 식물 및 식물 세포에는 단자엽 및 쌍자엽 식물, 예컨대 곡물 작물 (예를 들어, 밀, 옥수수, 쌀, 기장, 보리), 과일 작물 (예를 들어, 토마토, 사과, 배, 딸기, 오렌지), 사료 작물 (예를 들어, 알팔파), 근채류 작물 (예를 들어, 당근, 감자, 사탕무, 참마), 엽채류 작물 (예를 들어, 양상추, 시금치); 개화 식물 (예를 들어, 페튜니아, 장미, 국화), 침엽수 및 소나무 (예를 들어, 전나무, 가문비나무); 식물정화(phytoremediation)에 사용되는 식물 (예를 들어, 중금속 축적 식물); 유지 작물 (예를 들어, 해바라기, 평지씨) 및 실험 목적으로 사용되는 식물 (예를 들어, 아라비돕시스)가 포함되는 작물이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서, 개시된 방법 및 조성물은 아스파라거스(Asparagus) 속, 아베나(Avena) 속, 브라시카(Brassica) 속, 시트러스(Citrus) 속, 시트룰루스(Citrullus) 속, 캅시쿰(Capsicum) 속, 쿠쿠르비타(Cucurbita) 속, 다우쿠스(Daucus) 속, 글리신(Glycine) 속, 고십피움(Gossypium) 속, 호르데움(Hordeum) 속, 락투카(Lactuca) 속, 리코페르시콘(Lycopersicon) 속, 말루스(Malus) 속, 마니호트(Manihot) 속, 니코티아나(Nicotiana) 속, 오리자(Oryza) 속, 페르세아(Persea) 속, 피숨(Pisum) 속, 피러스(Pyrus) 속, 프루누스(Prunus) 속, 라파누스(Raphanus) 속, 세칼레(Secale) 속, 솔라눔(Solanum) 속, 소르굼(Sorghum) 속, 트리티쿰(Triticum) 속, 비티스(Vitis) 속, 비그나(Vigna) 속, 및 제아(Zea) 속으로부터의 종을 포함하지만 이에 한정되지 않는 광범위한 식물에 걸쳐 사용된다.
당업자는 발현 카셋트가 트랜스제닉 식물 내로 안정적으로 혼입되고, 작동가능한 것으로 확인된 후, 유성 교배에 의해 다른 식물 내로 도입될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 교배될 종에 따라, 임의의 다수의 표준 번식 기술이 사용될 수 있다.
조작된 식물 물질을 형질전환 DNA 상에 존재하는 마커 유전자가 코딩하는 소질에 대해 선별 또는 스크리닝함으로써, 형질전환된 식물 세포, 캘러스, 조직 또는 식물을 확인 및 단리할 수 있다. 예를 들어, 조작된 식물 물질을 억제량의 항생제 또는 제초제 (형질전환 유전자 구축물이 이에 대한 저항성을 부여함)를 함유하는 배지 상에서 성장시킴으로써 선별할 수 있다. 추가로, 재조합 핵산 구축물 상에 존재할 수 있는 임의의 가시적인 마커 유전자 (예를 들어, β-글루쿠로니다제, 루시페라제, B 또는 C1 유전자)의 활성을 스크리닝함으로써 형질전환된 식물 및 식물 세포를 또한 확인할 수 있다. 이같은 선별 및 스크리닝 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
물리적 및 생화학적 방법을 또한 사용하여, 삽입된 유전자 구축물을 함유하는 식물 또는 식물 세포 형질전환체를 확인할 수 있다. 이러한 방법에는 1) 재조합 DNA 삽입물을 검출하고 이의 구조를 결정하기 위한 서던 분석 또는 PCR 증폭; 2) 유전자 구축물의 RNA 전사물을 검출하고 시험하기 위한 노던 블롯, S1 RNase 보호, 프라이머-확장 또는 역전사효소-PCR 증폭; 3) 효소 또는 리보자임 활성을 검출하기 위한 효소 분석법 (이같은 유전자 생성물이 유전자 구축물에 의해 코딩되는 경우); 4) 단백질 젤 전기영동, 웨스턴 블롯 기술, 면역침전, 또는 효소-결합 면역분석법 (유전자 구축물 생성물이 단백질인 경우)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 추가적인 기술, 예컨대 원위치 혼성화, 효소 염색, 및 면역염색을 또한 사용하여, 특정 식물 기관 및 조직에서의 재조합 구축물의 존재 또는 발현을 검출할 수 있다. 모든 이러한 분석법을 행하기 위한 방법은 당업자에게 주지되어 있다.
본원에 개시된 방법을 사용하는 유전자 조작의 효과를, 예를 들어, 당해 조직으로부터 단리된 RNA (예를 들어, mRNA)의 노던 분석에 의해 관찰할 수 있다. 전형적으로, mRNA의 양이 증가되었으면, 상응하는 내인성 유전자가 이전보다 높은 속도로 발현되고 있는 것으로 가정할 수 있다. 유전자 및/또는 CYP74B 활성을 측정하는 또다른 방법을 사용할 수 있다. 사용된 기질 및 반응 생성물 또는 부산물의 증가 또는 감소를 검출하는 방법에 따라, 상이한 유형의 효소 분석법을 사용할 수 있다. 또한, 발현된 CYP74B 단백질 및/또는의 수준을 면역화학적으로, 즉, ELISA, RIA, EIA 및 당업자에게 주지된 기타 항체-기반 분석법에 의해, 예컨대 전기영동 검출 분석법 (염색 또는 웨스턴 블롯팅과 함께)에 의해 측정할 수 있다. 트랜스진이 식물의 일부 조직에서 또는 일부 발달 단계에서 선택적으로 발현될 수 있거나, 또는 트랜스진이 실질적으로 모든 식물 조직에서, 실질적으로 전체적인 생활주기에 걸쳐 발현될 수 있다. 그러나, 임의의 조합형 발현 방식이 또한 적용가능하다.
본 발명은 트랜스진 또는 유전자 구축물이 있는, 상기 기술된 트랜스제닉 식물의 종자를 또한 포함한다. 본 발명은 트랜스진 또는 유전자 구축물이 있는, 상기 기술된 트랜스제닉 식물의 자손, 클론, 세포주 또는 세포를 추가로 포함한다.
ZFP 및 ZFP를 코딩하는 발현 벡터는 표적화된 절단 및/또는 재조합을 위해 식물에 직접 투여될 수 있다.
ZFP가 처리될 식물 세포와 궁극적으로 접촉하도록 하는데 일반적으로 사용되는 임의의 경로에 의해 유효량이 투여된다. ZFP는 임의의 적절한 방식으로 투여된다. 이같은 조성물을 투여하는 적절한 방법은 당업자가 이용가능하고 이들에게 주지되어 있으며, 한가지를 초과하는 경로가 특정 조성물을 투여하는데 사용될 수 있지만, 종종 특정 경로가 또다른 경로보다 더욱 즉각적이고 더욱 효과적인 반응을 제공한다.
담체가 또한 사용될 수 있고, 이는 투여될 특정 조성물, 뿐만 아니라 조성물을 투여하는데 사용되는 특정 방법에 의해 부분적으로 결정된다. 따라서, 이용가능한 제약 조성물의 광범위한 적절한 제형이 존재한다 (예를 들어, [Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed. 1985] 참조).
용도
하나 이상의 본원에 기술된 바와 같은 비-정규 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질은 유전자 활성화; 유전자 억제; 게놈 편집 (절단, 표적화된 삽입, 교체 또는 결실); 및 에피게놈 편집 (DNA 또는 히스톤의 공유결합 변형의 표적화를 통한 편집)이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 정규 C2H2 ZFP가 현재 사용되는 모든 게놈 조절 및 편집 용도에 유용하다
본원에 개시된 바와 같은 비-정규 아연 손가락을 포함하는 ZFN은 세포 염색질 내의 당해 영역 (예를 들어, 게놈, 예를 들어 유전자 (돌연변이체 또는 야생형) 내의 원하는 부위 또는 미리 정해진 부위)에서 DNA를 절단하는데 사용될 수 있다. 이같은 표적화된 DNA 절단을 위해, 아연 손가락 결합 도메인이 미리 정해진 절단 부위에서 또는 이러한 부위 근처에서 표적 부위에 결합하도록 조작되고, 조작된 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 도메인을 포함하는 융합 단백질이 세포 내에서 발현된다. 융합 단백질의 아연 손가락 부분이 표적 부위에 결합하면, DNA가 절단 도메인에 의해 표적 부위 근처에서 절단된다. 정확한 절단 부위는 ZC 링커의 길이에 좌우될 수 있다.
별법적으로, 각각 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 ZFN이 세포 내에서 발현되고, 기능성 절단 도메인이 재구성되고 표적 부위 부근에서 DNA가 절단되는 방식으로 병렬된 표적 부위들에 결합한다. 한 실시양태에서, 절단은 2개의 아연 손가락 결합 도메인의 표적 부위들 사이에서 일어난다. 아연 손가락 결합 도메인들 중 하나 또는 양쪽 모두가 조작될 수 있다.
아연 손가락 결합 도메인-절단 도메인 융합 폴리펩티드를 사용하는 표적화된 절단을 위해, 결합 부위가 절단 부위를 포함할 수 있거나, 또는 결합 부위의 가까운 가장자리가 절단 부위로부터 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 10개, 25개, 50개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 (또는 1개 내지 50개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드)에 있을 수 있다. 절단 부위와 관련하여, 결합 부위의 정확한 위치는 특정 절단 도메인, 및 ZC 링커의 길이에 좌우될 것이다. 각각 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 폴리펩티드가 사용되는 방법을 위해, 일반적으로 결합 부위들은 절단 부위에 걸쳐진다. 따라서, 제1 결합 부위의 가까운 가장자리는 절단 부위의 한쪽 측면 상의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 10개, 25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 (또는 1개 내지 50개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드)에 있을 수 있고, 제2 결합 부위의 가까운 가장자리는 절단 부위의 또다른 측면 상의 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 10개, 25개 또는 그 이상의 뉴클레오티드 (또는 1개 내지 50개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드)에 있을 수 있다. 시험관내 및 생체내에서 절단 부위의 지도를 작성하는 방법은 당업자에게 공지되어 있다.
일단 표적 세포 내로 도입되거나 표적 세포 내에서 발현되면, 융합 단백질이 표적 서열에 결합하고, 표적 서열에서 또는 표적 서열 근처에서 절단한다. 정확한 절단 부위는 절단 도메인의 성질 및/또는 결합 도메인과 절단 도메인 사이의 링커 서열의 존재 및/또는 성질에 좌우된다. 각각 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 ZFN이 사용되는 경우, 결합 부위들의 가까운 가장자리들 간의 거리는 뉴클레오티드 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 25개 또는 그 이상 (또는 1개 내지 50개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드)일 수 있다. 최적 수준의 절단은 2개의 ZFN의 결합 부위 간의 거리 (예를 들어, [Smith et al. (2000) Nucleic Acids Res. 28:3361-3369]; [Bibikova et al. (2001) Mol. Cell. Biol. 21:289-297] 참조) 및 각각의 ZFN 내의 ZC 링커의 길이 양쪽 모두에 또한 좌우될 수 있다. 미국 특허 공보 20050064474A1 및 국제 특허 공보 WO05/084190, WO05/014791 및 WO03/080809를 또한 참조 (이들의 개시내용은 거명에 의해 포함됨).
각각 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 ZFN이 동일한 극성 또는 반대의 극성으로 당해 영역에서 결합할 수 있고, 이들의 결합 부위 (즉, 표적 부위)는 임의의 개수의 뉴클레오티드, 예를 들어, 0개 내지 50개의 뉴클레오티드 쌍 또는 이들 사이의 임의의 정수값에 의해 분리될 수 있다. 특정 실시양태에서, 각각 아연 손가락 결합 도메인 및 절단 절반-도메인을 포함하는 2개의 융합 단백질에 대한 결합 부위들은 다른 결합 부위에 가장 가까운 각각의 결합 부위의 가장자리로부터 측정했을 때 5개 내지 18개의 뉴클레오티드 쌍, 예를 들어, 5-8개의 뉴클레오티드 쌍, 또는 15-18개의 뉴클레오티드 쌍, 또는 6개의 뉴클레오티드 쌍, 또는 16개의 뉴클레오티드 쌍만큼 떨어져 있을 수 있거나, 10개의 뉴클레오티드 쌍 이내에 있을 수 있고, 절단은 결합 부위들 사이에서 일어난다.
DNA가 절단되는 위치는 일반적으로 2개의 융합 단백질에 대한 결합 부위들 사이에 존재한다. DNA의 이중 가닥 파손은 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 또는 그 이상의 뉴클레오티드만큼 오프셋(offset)된 2개의 단일 가닥 파손 또는 "닉(nick)"으로부터 종종 초래된다 (예를 들어, 천연 Fok I에 의한 이중 가닥 DNA의 절단은 4개의 뉴클레오티드만큼 오프셋된 단일 가닥 파손들로부터 초래된다). 따라서, 절단이 반드시 각각의 DNA 가닥 상의 정확히 마주보는 부위들에서 일어나지는 않는다. 또한, 융합 단백질들의 구조 및 표적 부위들 간의 거리가 단일 뉴클레오티드 쌍 근처에서 절단이 일어나는지, 또는 여러 부위에서 절단이 일어나는지에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, 표적화된 재조합 및 표적화된 돌연변이유발이 포함되는 다수의 용도에 대해, 광범위한 뉴클레오티드 내에서의 절단이 일반적으로 충분하고, 특정 염기쌍들 사이에서의 절단이 요구되지 않는다.
상기 언급된 바와 같이, 융합 단백질(들)이 폴리펩티드 및/또는 폴리뉴클레오티드의 세포 내로의 도입 후에 세포 내에서 발현될 수 있다. 예를 들어, 각각 상기 언급된 폴리펩티드들 중 하나를 코딩하는 서열을 포함하는 2개의 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있고, 폴리펩티드들이 발현되어 각각 이의 표적 서열에 결합하면, 표적 서열에서 또는 근처에서 절단이 일어난다. 별법적으로, 양쪽 융합 폴리펩티드를 코딩하는 서열들을 포함하는 단일 폴리뉴클레오티드가 세포 내로 도입될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 또는 DNA 및/또는 RNA의 임의의 변형 형태 또는 유사체일 수 있다.
특정 실시양태에서, ZFN에 의한 게놈 영역에서의 표적화된 절단으로 비-상동 말단 연결 (NHEJ)에 의한 절단 이벤트의 복구에 이어서 영역의 뉴클레오티드 서열의 변경이 초래된다.
또다른 실시양태에서, ZFN에 의한 게놈 영역에서의 표적화된 절단은 상동성-의존적 메커니즘 (예를 들어, 미리 정해진 게놈 서열 (즉, 표적 부위)과 동일하거나 또는 동일하지 않지만 상동성인 하나 이상의 서열과 함께 외인성 서열을 포함하는 도너 서열의 삽입)을 통해 게놈 서열 (예를 들어, 세포 염색질 내의 당해 영역)이 동일하지 않은 상동성 서열로 (즉, 표적화된 재조합에 의해) 교체되는 절차의 일부분일 수도 있다. 세포 DNA 내의 이중 가닥 파손은 절단 부위 부근에서 세포성 복구 메커니즘을 수천배 자극하기 때문에, 본원에 기술된 바와 같은 ZFN으로의 표적화된 절단은 게놈 내의 실질적으로 모든 부위에서 서열을 변경 또는 교체시킨다 (상동성-지시 복구를 통해).
본원에 기술된 ZFN에 더하여, 선별된 게놈 서열의 표적화된 교체는 외인성 (도너) 폴리뉴클레오티드의 도입을 필요로 한다. 도너 폴리뉴클레오티드는 ZFN의 발현 전에, 이와 동시에, 또는 이에 이어서 세포 내로 도입될 수 있다. 도너 폴리뉴클레오티드는 게놈 서열에 대한 충분한 상동성을 함유하여, 자신이 상동성인 게놈 서열과 자신 간의 상동 재조합 (또는 상동성-지시 복구)을 지지한다. 뉴클레오티드 약 25개, 50개, 100개, 200개, 500개, 750개, 1,000개, 1,500개, 2,000개 또는 그 이상 (또는 뉴클레오티드 10개 내지 2,000개 사이, 또는 그 이상의 임의의 정수값)의 서열 상동성이 상동 재조합을 지지할 것이다. 도너 폴리뉴클레오티드의 길이는 10개 내지 5,000개의 뉴클레오티드 (또는 이들 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드) 또는 그 이상의 범위일 수 있다.
도너 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드 서열은 전형적으로 자신이 교체하는 게놈 서열과 동일하지 않다는 것이 명백할 것이다. 예를 들어, 염색체 서열과의 충분한 상동성이 존재하는 한, 도너 폴리뉴클레오티드의 서열은 게놈 서열과 관련하여 하나 이상의 치환, 삽입, 결실, 역위 또는 재배열을 함유할 수 있다. 이같은 서열 변화는 임의의 크기일 수 있고, 단일 뉴클레오티드 쌍만큼 작을 수 있다. 별법적으로, 도너 폴리뉴클레오티드는 2개의 상동성 영역이 플랭킹(flanking)된 비-상동성 서열 (즉, 외인성 폴리뉴클레오티드로부터 구별되는 외인성 서열)을 함유할 수 있다. 추가적으로, 도너 폴리뉴클레오티드는 세포 염색질 내의 당해 영역에 상동성이지 않은 서열을 함유하는 벡터 분자를 포함할 수 있다. 일반적으로, 도너 폴리뉴클레오티드의 상동성 영역(들)은 재조합을 원하는 게놈 서열과의 서열 동일성이 50％ 이상일 것이다. 특정 실시양태에서, 60％, 70％, 80％, 90％, 95％, 98％, 99％, 또는 99.9％의 서열 동일성이 존재한다. 도너 폴리뉴클레오티드의 길이에 따라, 1％ 내지 100％ 사이의 임의의 값의 서열 동일성이 존재할 수 있다.
도너 분자는 세포 염색질에 대한 여러 개의 비연속적인 상동성 영역을 함유할 수 있다. 예를 들어, 정상적으로는 당해 영역 내에 존재하지 않는 서열의 표적화된 삽입을 위해, 상기 서열이 도너 핵산 분자 내에 존재할 수 있고, 당해 영역 내의 서열에 대한 상동성 영역이 상기 서열에 플랭킹될 수 있다.
도너 폴리뉴클레오티드로부터의 서열의 성공적인 삽입을 결정하기 위한 분석법 (예를 들어, 혼성화, PCR, 제한 효소 소화)을 단순화하기 위해, 게놈 서열과 비교하여 도너 서열 내에 특정한 서열 차이가 존재할 수 있다. 바람직하게는, 코딩 영역 내에 위치하는 경우, 이같은 뉴클레오티드 서열 차이는 아미노산 서열을 변화시키지 않거나, 또는 침묵 아미노산 변화 (즉, 단백질의 구조 또는 기능에 영향을 미치지 않는 변화)를 일으킬 것이다. 도너 폴리뉴클레오티드는 당해 영역 내의 아연 손가락 도메인 결합 부위에 상응하는 서열에서의 변화를 임의로 함유하여, 상동 재조합에 의해 세포 염색질 내로 도입된 도너 서열의 절단을 방지할 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 복제 기원, 프로모터 및 항생제 저항성을 코딩하는 유전자와 같은 추가적인 서열이 있는 벡터 분자의 일부로서 세포 내로 도입될 수 있다. 또한, 도너 폴리뉴클레오티드는 네이키드 핵산으로서, 리포솜 또는 폴록사머와 같은 작용제와 복합체를 이룬 핵산으로서 도입될 수 있거나, 또는 박테리아 또는 바이러스 (예를 들어, 아그로박테리움, 리조비움 종 NGR234, 시노리조비움 멜리오티, 메조리조비움 로티, 담배 모자이크 바이러스, 감자 바이러스 X, 컬리플라워 모자이크 바이러스 및 카사바 엽맥 모자이크 바이러스)에 의해 전달될 수 있다. 예를 들어, [Chung et al. (2006) Trends Plant Sci. 11(1):1-4 참조.
염색체 서열의 변경을 위해, 원하는 서열 변경을 일으키도록 충분한 도너 서열이 카피되는 한, 도너의 전체 서열이 염색체 내부로 카피될 필요는 없다.
상동 재조합에 의한 도너 서열 삽입의 효율은 재조합을 원하는 부위와 이중 가닥 파손 간의 거리 (세포 DNA 내에서의 거리)에 반비례한다. 바꿔 말하면, 이중 가닥 파손이 재조합을 원하는 부위에 가까울수록 더 높은 상동 재조합 효율이 관찰된다. 정확한 재조합 부위가 미리 정해지지 않은 경우 (예를 들어, 원하는 재조합 이벤트가 게놈 서열의 간격에 걸쳐 일어날 수 있다), 도너 핵산의 길이 및 서열이, 절단 부위(들)과 함께, 원하는 재조합 이벤트가 수득되도록 선택될 수 있다. 원하는 이벤트가 게놈 서열 내의 단일 뉴클레오티드 쌍의 서열을 변화시키도록 디자인되는 경우, 세포 염색질이 이러한 뉴클레오티드 쌍의 어느 한쪽 측면 상의 뉴클레오티드 10,000개 이내에서 절단된다. 특정 실시양태에서, 절단은 서열이 변화되는 뉴클레오티드 쌍의 어느 한쪽 측면 상의 뉴클레오티드 1,000개, 500개, 200개, 100개, 90개, 80개, 70개, 60개, 50개, 40개, 30개, 20개, 10개, 5개, 또는 2개 이내, 또는 2개 내지 1,000개 사이의 임의의 정수값의 뉴클레오티드 이내에서 일어난다.
게놈 영역 내로의 외인성 서열의 표적화된 삽입은 외인성 서열을 함유하는 외인성 (도너) 폴리뉴클레오티드의 제공과 함께, ZFN을 사용한 게놈 영역에서의 표적화된 절단에 의해 달성된다. 도너 폴리뉴클레오티드는 외인성 서열에 플랭킹된 서열을 또한 전형적으로 함유하고, 이는 게놈 영역에 대한 충분한 상동성을 함유하여 게놈 서열 내의 이중-가닥 파손의 상동성-지시 복구를 지지함으로써, 외인성 서열을 게놈 영역 내로 삽입시킨다. 따라서, 도너 핵산은 상동성-의존적 복구 메커니즘 (예를 들어, 상동 재조합)에 의한 외인성 서열의 통합을 지지하는데 충분한 임의의 크기일 수 있다. 어떠한 특정 이론에도 제한되기를 원치 않으면서, 외인성 서열에 플랭킹된 상동성 영역은 파손된 염색체 말단에 이중 가닥 파손 부위에서의 유전자 정보의 재합성을 위한 주형을 제공하는 것으로 생각된다.
상기 기술된 바와 같은 외인성 서열의 표적화된 통합은 선택된 염색체 위치에 마커 유전자를 삽입하는데 사용될 수 있다. 마커 유전자에는 항생제 저항성 (예를 들어, 앰피실린 저항성, 네오마이신 저항성, G418 저항성, 푸로마이신 저항성)을 매개하는 단백질을 코딩하는 서열, 유색 또는 형광 또는 발광 단백질 (예를 들어, 녹색 형광 단백질, 강화된 녹색 형광 단백질, 적색 형광 단백질, 루시페라제)을 코딩하는 서열, 및 강화된 세포 성장 및/또는 유전자 증폭을 매개하는 단백질 (예를 들어, 디히드로폴레이트 리덕타제)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 따라서 예시적인 마커 유전자에는 β-글루쿠로니다제 (GUS), 포스피노트리신 N-아세틸 트랜스페라제 (PAT, BAR), 네오마이신 포스포트랜스페라제, β-락타마제, 카테콜 디옥시게나제, α-아밀라제, 티로시나제, β-갈락토시다제, 루시페라제, 애큐오린, EPSP 신타제, 니트릴라제, 아세토락테이트 신타제 (ALS), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 달라폰 데할로게나제 및 안트라닐레이트 신타제가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 특정 실시양태에서, RNA 발현 구축물, 예를 들어, 마이크로 RNA 또는 siRNA의 조절된 발현을 담당하는 서열을 삽입하는데 표적화된 통합이 사용된다. 프로모터, 인핸서 및 추가적인 전사 조절 서열이 RNA 발현 구축물 내로 또한 혼입될 수 있다.
아연 손가락/뉴클레아제 융합 분자 및 도너 DNA 분자를 포함하는 세포에서, 상동성에 의해 구동되는 복구 프로세스가 최대로 활성일 때, 세포 주기의 G2 단계의 세포를 차단함으로써, 표적화된 재조합의 효율이 추가적으로 증가된다. 이같은 정지는 다수의 방식으로 달성될 수 있다. 예를 들어, 세포를 G2 단계에 정지시키도록 세포-주기 진행에 영향을 미치는 약물, 화합물 및/또는 소형 분자로 예를 들어 세포를 처리할 수 있다. 예시적인 이러한 유형의 분자에는 미세관 중합에 영향을 미치는 화합물 (예를 들어, 빈블라스틴, 노코다졸, 탁솔), DNA와 상호작용하는 화합물 (예를 들어, 시스-플래티늄(II) 디아민 디클로라이드, 시스플라틴, 독소루비신) 및/또는 DNA 합성에 영향을 미치는 화합물 (예를 들어, 티미딘, 히드록시우레아, L-미모신, 에토포시드, 5-플루오로우라실)이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 염색체 구조를 변경시켜 게놈 DNA가 세포 재조합 기계에 더욱 접근하기 쉽도록 만드는 히스톤 데아세틸라제 (HDAC) 억제제 (예를 들어, 소듐 부티레이트, 트리코스타틴 A)를 사용함으로써 재조합 효율이 추가적으로 증가된다.
세포-주기 정지를 위한 추가적인 방법은, 예를 들어, 단백질을 코딩하는 cDNA를 세포 내로 도입함으로써 또는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 활성화시키는 조작된 ZFP를 세포 내로 도입함으로써, CDK 세포 주기 키나제의 활성을 억제하는 단백질을 과발현시키는 것을 포함한다. RNAi 방법 (예를 들어, 미국 특허 번호 6,506,559)을 예를 들어 사용하여 사이클린 및 CDK의 활성을 억제함으로써, 또는 세포 주기 진행에서 수반되는 하나 이상의 유전자 예컨대 사이클린 및/또는 CDK 유전자의 발현을 억제하는 조작된 ZFP를 세포 내로 도입함으로써, 세포 주기가 또한 정지될 수 있다. 예를 들어, 유전자 발현의 조절을 위한 조작된 아연 손가락 단백질의 합성 방법에 대해서 공동 소유의 미국 특허 번호 6,534,261 참조.
상기 기술된 바와 같이, 표적화된 절단을 위한 개시된 방법 및 조성물을 사용하여, 게놈 서열에서 돌연변이를 유도할 수 있다. 표적화된 절단을 유전자 녹-아웃(knock-out)을 생성시키는데 (예를 들어, 기능 유전체학(genomics) 또는 표적 확인을 위해), 그리고 게놈 내로의 서열의 표적화된 삽입 (즉, 유전자 녹-인(knock-in))을 촉진하는데 또한 사용할 수 있다. 상동 재조합을 통한 염색체 서열의 교체에 의해, 또는 염색체 내의 당해 영역에 상동성인 서열이 플랭킹된 새로운 서열 (즉, 당해 영역에 존재하지 않는 서열)이 미리 정해진 표적 부위에서 삽입되는 표적화된 통합에 의해 삽입이 이루어질 수 있다. 동일한 방법이 야생형 서열을 돌연변이체 서열로 교체하는데, 또는 한 대립유전자를 다른 대립유전자로 전환시키는데 또한 사용될 수 있다.
감염성 또는 통합된 식물 병원체의 표적화된 절단을 사용하여, 예를 들어, 병원체의 게놈을 절단하여 병원성이 감소 또는 제거되도록 함으로써, 식물 숙주에서의 병원체 감염을 치료할 수 있다. 추가적으로, 식물 바이러스에 대한 수용체를 코딩하는 유전자의 표적화된 절단을 사용하여, 이같은 수용체의 발현을 차단함으로써, 식물에서의 바이러스 감염 및/또는 바이러스 확산을 방지할 수 있다.
예시적인 식물 병원체로는 식물 바이러스 예컨대 알파모바이러스(Alfamovirus), 알파크립토바이러스(Alphacryptovirus), 바드나바이러스(Badnavirus), 베타크립토바이러스(Betacryptovirus), 비게미니바이러스(Bigeminivirus), 브로모바이러스(Bromovirus), 비모바이러스(Bymovirus), 카필로바이러스(Capillovirus), 카를라바이러스(Carlavirus), 카르모바이러스(Carmovirus), 카울리모바이러스(Caulimovirus), 클로스테로바이러스(Closterovirus), 코모바이러스(Comovirus), 쿠쿠모바이러스(Cucumovirus), 사이토랍도바이러스(Cytorhabdovirus), 디안토바이러스(Dianthovirus), 에나모바이러스(Enamovirus), 파바바이러스(Fabavirus), 피지바이러스(Fijivirus), 푸로바이러스(Furovirus), 호르데이바이러스(Hordeivirus), 히브리게미니바이러스(Hybrigeminivirus), 이다에오바이러스(Idaeovirus), 일라르바이러스(Ilarvirus), 이포모바이러스(Ipomovirus), 루테오바이러스(Luteovirus), 마클로모바이러스(Machlomovirus), 마클루라바이러스(Macluravirus), 마라피바이러스(Marafivirus), 모노게미니바이러스(Monogeminivirus), 나나바이러스(Nanavirus), 네크로바이러스(Necrovirus), 네포바이러스(Nepovirus), 누클레오랍도바이러스(Nucleorhabdovirus), 오리자바이러스(Oryzavirus), 오우르미아바이러스(Ourmiavirus), 파이토레오바이러스(Phytoreovirus), 포텍스바이러스(Potexvirus), 포티바이러스(Potyvirus), 라이모바이러스(Rymovirus), 위성 RNA, 새틀리바이러스(satellivirus), 세퀴바이러스(Sequivirus), 소베모바이러스(Sobemovirus), 테누이바이러스(Tenuivirus), 토바모바이러스(Tobamovirus), 토브라바이러스(Tobravirus), 톰부스바이러스(Tombusvirus), 토스포바이러스(Tospovirus), 트리코바이러스(Trichovirus), 타이모바이러스(Tymovirus), 움브라바이러스(Umbravirus), 바리코사바이러스(Varicosavirus) 및 와이카바이러스(Waikavirus); 진균 병원체 예컨대 흑수병 (예를 들어 유스틸라기날레스(Ustilaginales)), 녹병 (유레디날레스(Uredinales)), 맥각병 (클라비셉트스 푸푸레아(Clavicepts pupurea)) 및 노균병; 사상균 (오오마이세테스(Oomycetes)) 예컨대 파이토프토라 인펜스탄스(Phytophthora infestans) (감자 잎마름병); 박테리아 병원체 예컨대 에르위니아(Erwinia) (예를 들어, 에르위니아 헤르비콜라(E. herbicola)), 슈도모나스(Pseudomonas) (예를 들어, 슈도모나스 아에루기노사(P. aeruginosa), 슈도모나스 시린가에(P. syringae), 슈도모나스 플루오레센스(P. fluorescense) 및 슈도모나스 푸티다(P. putida)), 랄스토니아(Ralstonia) (예를 들어, 랄스토니아 솔라나세아룸(R. solanacearum)), 아그로박테리움 및 잔토모나스(Xanthomonas); 회충 (네마토다(Nematoda)); 및 파이토믹세아(Phytomyxea) (폴리믹사(Polymyxa) 및 플라스모디오포라(Plasmodiophora))가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.
개시된 표적화된 재조합 방법을 사용하여, 임의의 게놈 서열을 동일하지 않는 상동성 서열로 교체할 수 있다. 예를 들어, 돌연변이체 게놈 서열을 이의 야생형 대응물로 교체함으로써, 식물 질환 치료 방법을 제공하는 것, 식물 병원체에 대한 저항성을 제공하는 것, 작물 수율을 증가시키는 것 등이 가능하다. 유사한 방식으로, 본원에 개시된 표적화된 재조합 방법을 사용하여 유전자의 한 대립유전자를 다른 대립유전자로 교체할 수 있다.
다수의 이러한 사례에서, 당해 영역은 돌연변이를 포함하고, 도너 폴리뉴클레오티드는 상응하는 야생형 서열을 포함한다. 유사하게, 야생형 게놈 서열이 돌연변이체 서열로 교체될 수 있다 (이같은 교체가 바람직한 경우). 실제로, 임의의 방식으로 특정 게놈 서열에 의존하는 모든 병리학을 본원에 개시된 방법 및 조성물을 사용하여 수정 또는 경감시킬 수 있다.
표적화된 절단 및 표적화된 재조합을 비-코딩 서열 (예를 들어, 조절 서열 예컨대 프로모터, 인핸서, 개시인자, 종결인자, 스플라이스 부위)을 변경시켜 유전자 생성물의 발현 수준을 변경시키는데 또한 사용할 수 있다. 이같은 방법은, 예를 들어, 치료 목적, 세포 생리학 및 생화학에서의 변경, 기능 유전체학 및/또는 표적 확인 연구를 위해 사용될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 조성물은 비-정규 아연 손가락 결합 도메인과 기능성 도메인 간의 융합물을 사용하는 유전자 발현의 활성화 및 억제에 또한 사용될 수 있다. 이같은 방법은, 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 6,534,261; 6,824,978 및 6,933,113 (이들의 개시내용은 거명에 의해 포함됨)에 개시되어 있다. 추가적인 억제 방법은 억제될 유전자의 서열에 대해 표적화된 안티센스 올리고뉴클레오티드 및/또는 소형 간섭 RNA (siRNA 또는 RNAi)의 사용을 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 아연 손가락 결합 도메인과 리컴비나제 (또는 이의 기능성 단편) 간의 하나 이상의 융합물을 본원에 개시된 아연 손가락-절단 도메인 융합물에 더하여 또는 이러한 융합물 대신 사용하여, 표적화된 재조합을 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 공동 소유의 미국 특허 번호 6,534,261 및 [Akopian et al. (2003) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:8688-8691] 참조.
추가적인 실시양태에서, 개시된 방법 및 조성물을 사용하여, ZFP 결합 도메인과 활성을 위해 이량체화 (동종이량체화 또는 이종이량체화)를 필요로 하는 전사 활성화 또는 억제 도메인의 융합물을 제공할 수 있다. 이러한 경우에서, 융합 폴리펩티드는 아연 손가락 결합 도메인 및 기능성 도메인 단량체 (예를 들어, 이량체성 전사 활성화 또는 억제 도메인으로부터의 단량체)를 포함한다. 2개의 이같은 융합 폴리펩티드가 적합하게 놓인 표적 부위들에 결합하면, 기능성 전사 활성화 또는 억제 도메인이 재구성되도록 이량체가 형성된다.
본 발명은 하기의 실시예에서 추가로 정의되고, 이때 달리 언급되지 않는 한 모든 비율 및 백분율은 중량을 기준으로 하고, 온도는 섭씨 온도이다. 이러한 실시예는 본 발명의 특정 실시양태들을 가리키지만 단지 설명의 목적으로만 제공된다는 것을 이해하여야 한다. 상기의 논의 및 이러한 실시예로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 확인할 수 있고, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서, 본 발명을 다양한 용법 및 조건에 적응시키기 위해 다양하게 변화 및 변형시킬 수 있다.
실시예 1 : ZFN 발현 벡터
개시내용이 거명에 의해 포함되는 미국 특허 공보 2005/0064474의 실시예 2 및 14에 기술된 4-손가락 ZFN ("5-8" 및 "5-9"로 지정됨) (상기 출원의 실시예 2 참조)을 코딩하는 서열을 포함하는 발현 벡터를 하기와 같이 변형시켰다. 간략하게, 5-8 및 5-9 ZFN (4-아미노산 ZC 링커를 통해 IIS형 제한 효소 FokI의 뉴클레아제 도메인 ([Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569]의 서열의 아미노산 384-579)에 융합된 4개의 아연 손가락 도메인 포함)을 CCHC 구조로 변형시켰다. C-말단 His 아연 배위결합 구조와 Cys 아연 배위결합 구조 사이의 잔기 및/또는 손가락 2 및/또는 손가락 4에 대한 C-말단에 대해 C-말단인 잔기를 추가적으로 변형시켰다 (치환 및 삽입).
실시예 2: 리포터 세포주에서의 eGFP의 유전자 수정
본원에 기술된 바와 같은 CCHC 아연 손가락을 포함하는 ZFN의 상동 재조합을 용이하게 하는 능력을 [Urnov (2005) Nature 435(7042):646-51] 및 미국 특허 공보 번호 20050064474 (예를 들어, 실시예 6-11)에 기술된 GFP 시스템에서 테스트하였다. 간략하게, Invitrogen Lipofectamine 2000 프로토콜에 따라 샘플 당 2 ㎕의 리포펙타민(Lipofectamine) 2000을 사용하여, 각각의 ZFN 50 ng 및 프로모터가 없는(promoter-less) GFP 도너 ([Urnov (2005) Nature]) 500 ng을 500,000개의 리포터 세포 내로 형질감염시켰다.
빈블라스틴을 형질감염 24시간 후 0.2 uM의 최종 농도로 첨가하고, 형질감염 72시간 후 제거하였다.
Guava 벤치 탑 FACS 분석기 상에서 형질감염 당 40,000개의 세포를 측정함으로써 세포를 형질감염 5일 후 GFP 발현에 대해 분석하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 상기 표 1 및 2에 제시된 변경된 CCHC 아연 손가락을 포함하는 대부분의 ZFN은 리포터 (GFP) 유전자좌에서 상동 재조합을 용이하게 하여, 변형되지 않은 CCHC 아연 손가락을 초과하는 수준의 GFP 발현이 초래되었고, 몇몇은 CCHH 아연 손가락을 포함하는 ZFN에 필적하게 작동하였다. 손가락 4 (F4)에 놓였을 때의 최적 수행 변이체는 하기의 서열을 포함하였다 (His 아연 배위결합 잔기를 포함하고 이에 대해 C-말단): HAQRCGLRGSQLV (서열 53) (표 2에서 #21로 지정되고 도 1에서 "2-21"로 제시된 아연 손가락). 손가락 2 (F2)에 놓였을 때의 최적 수행 변이체는 하기의 서열을 포함하였다 (His 아연 배위결합 잔기를 포함하고 이에 대해 C-말단): HIRTCTGSQKP (서열 75) (표 2에서 #43으로 지정되고 도 1에서 "2-43"으로 제시된 아연 손가락).
실시예 3: 표적화된 재조합에 의한 염색체 IL2Rγ 유전자의 편집
본원에 기술된 바와 같은 ZFN들을 [Urnov (2005) Nature 435(7042):646-51] 및 미국 특허 공보 번호 20050064474의 실시예 2에 기술된 내인성 IL2Rγ 분석법에서 또한 분석하였다. 간략하게, 각각 ZFN 발현 구축물을 함유하는 2 1/2의 미생물을 Nucleofector (Amaxa)를 사용하여 500,000개의 K562 세포 내로 형질감염시켰다. 게놈 DNA를 수확하고, 유전자 파괴를 내인성 IL2Rγ 유전자좌에서 Surveyor 엔도뉴클레아제 키트를 사용하여 분석하였다.
ZFN들이 도 2의 왼쪽 상부에서 제시된다. 특히, 변경된 아연 손가락 20은 서열 HTRRCGLRGSQLV을 포함하는 CCHC 아연 손가락을 지칭하고; 아연 손가락 21은 서열 HAQRCGLRGSQLV (서열 53)을 포함하고; 아연 손가락 43은 서열 HIRTCTGSQKP (서열 75)를 포함하고; 아연 손가락 45는 서열 HIRTGCTGSQKP를 포함하고; 아연 손가락 47은 서열 HIRRCTGSQKP를 포함하고; 아연 손가락 48은 서열 HIRRGCTGSQKP를 포함한다. 아연 손가락 20 및 21은 4-손가락 ZFN의 손가락 4에서 사용되었고, 아연 손가락 43, 45, 47, 및 48은 4-손가락 ZFN의 손가락 2에서 사용되었다.
테스트된 ZFN 쌍이 도 2의 그래프의 오른쪽 위, 및 표 5에서 제시된다:
Figure 112009035680027-PCT00006
절단 부위에서 돌연변이가 유도되었는지를 결정하기 위해, 증폭 생성물을 Cel-1 분석법을 사용하여 분석하였고, 이때 증폭 생성물을 변성 및 재생시킨 후, 미스매치-특이적 Cel-1 뉴클레아제로 처리하였다. 예를 들어, [Oleykowski et al. (1998) Nucleic Acids res. 26:4597-4602]; [Qui et al. (2004) BioTechniques 36:702-707]; [Yeung et al. (2005) BioTechniques 38:749-758] 참조.
2회의 실험의 결과가 도 2에서 각각의 샘플에 대해 제시된다. 샘플 8 및 9에 대한 실험 #2에는 레인 내에 유의한 배경값 노이즈가 있었고, 이는 이러한 ZFN의 겉보기 효율을 감소시켰다.
도 2에 나타난 바와 같이, 특정 CCHC 변이체들은 야생형 C2H2 ZFN과 본질적으로 등가였다. 손가락 4에서의 아연 손가락 21 (샘플 5 및 9)에서는 손가락 4에서의 아연 손가락 20 (샘플 4 및 8)보다 양호한 결과가 생성되었다. 도 2에서, 아연 손가락 43에서 최상의 결과가 생성되었다.
실시예 4: 리포터 세포주에서의 eGFP의 유전자 수정
도 1 및 2에 제시된 결과들을 기초로, 상기 표 3 및 4에 제시된 CCHC 아연 손가락 (1a 내지 10a로 지정됨)이 생산되었다. 이러한 아연 손가락들을 5-8 및 5-9 ZFN 내로 혼입하여, 상기 실시예 2에 기술된 GFP 유전자 수정 분석법에서 테스트하였다. 각각의 샘플에서 테스트된 ZFN 쌍이 각각의 막대 아래에서 제시되고, 이때 아연 손가락 번호 20, 21, 43, 45, 47 및 48은 실시예 3에 기술된 것들이고, CCHC 아연 손가락 1a 내지 10a는 표 3 및 4에 제시된 서열을 포함한다. 아연 손가락 20, 21, 7a, 8a, 9a 및 10a가 손가락 4에서 사용되었고; 아연 손가락 43, 45, 47, 48, 1a, 2a, 3a, 4a, 5a, 및 6a가 손가락 2에서 사용되었다.
결과가 도 3에 제시된다. 각각의 막대 아래의 윗줄은 ZFN 5-8 내로 혼입된 아연 손가락을 지칭하고, 아랫줄은 ZFN 5-9 내로 혼입된 아연 손가락을 지칭한다. 예를 들어, 도 3의 그래프의 왼쪽에서 2번째 막대는 양쪽 ZFN의 F4가 아연 손가락 20의 서열을 포함하는 5-8 및 5-9 ZFN으로 형질감염된 샘플을 지칭한다. 제시된 바와 같이, CCHC 아연 손가락을 포함하는 다수의 ZFN들이 야생형 (CCHH) ZFN에 필적하게 작동하였다.
실시예 5: 표적 벡터의 디자인 및 생성
A. 표적 서열의 전체적인 구조
담배 (쌍자엽 식물)용 표적 구축물은 도 4 및 5에 제시된 바와 같이 하기의 7개의 성분을 포함하였다: i) 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임-24 (orf-24) 3' 비-번역 영역 (UTR) (EP222493 (Gelvin 등, 1987))으로 종결되는 대장균 HPT 유전자 ([Waldron et al., 1985, Plant Mol. Biol. 18:189-200])를 구동시키는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴-3 (ubi-3) 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493])를 포함하는 히그로마이신 포스포트랜스페라제 (HPT) 발현 카셋트; ii) 니코티아나 타바쿰(N. tabacum) RB7 매트릭스 부착 영역 (MAR) (WO9727207 (Thompson 등, 1997))을 포함하는 상동성 서열-1; iii) 변형된 아그로박테리움 투메파시엔스 만노핀 신타제 (Δmas) 프로모터 (미국 특허 번호 6,730,824 (Petolino 등))에 의해 구동되는 5' 녹색 형광 단백질 (GFP) 유전자 단편 (Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia)); iv) 아그로박테리움 투메파시엔스 노팔린 신타제 (nos) 3'UTR ([DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573])로 종결되는 GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])를 구동시키는 카사바 엽맥 모자이크 바이러스 (CsVMV) 프로모터 ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139])를 포함하는 β-글루쿠로니다제 (GUS) 발현 카셋트 ; v) 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 3' UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])로 종결되는 3' GFP 유전자 단편 (Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia)); vi) 아라비돕시스 탈리아나 4-쿠마로일-CoA 신타제 (4-CoAS) 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)를 포함하는 상동성 서열-2; 및 vii) 아그로박테리움 투메파시엔스 ORF-25/26 3' UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))로 종결되는 스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(S. viridochromogenes) 포스피노트리신 포스포트랜스페라제 (PAT) ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37]) 3' 유전자 단편.
아연 손가락-Fok1 융합 단백질 결합 부위 (IL-1-L0-Fok1) (미국 2005/0064474 (Urnov 등, 2005))를 CsVMV 프로모터 ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139])의 하류에 삽입하고, GUS 코딩 서열 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])과 N-말단에서 융합시켰다. 제2의 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 결합 부위 (Scd27-L0-Fok1) (미국 2005/0064474 (Urnov 등, 2005))의 2개의 카피가 5' 및 3' GFP 유전자 단편 (Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia))에 플랭킹되었다. 각각의 결합 부위는 특정 아연 손가락-Fok1 융합 단백질의 인식 서열의 4개의 직렬 반복물을 함유하여, 각각의 결합 부위는 크기가 약 200 bp였다 (도 6A). 이는 복잡한 염색질 환경에서 인식 서열이 아연 손가락-Fok1 융합 단백질에 접근하기 쉬울 것임을 확실히 하기 위해 디자인되었다. 각각의 인식 서열은 단일 아연 손가락-Fok1 융합 단백질이 동종이량체로서 결합하여 이중 가닥 DNA를 절단하는 역위 반복 서열을 포함하였다 (도 6B). 5' 및 3' GFP 유전자 단편은 표적 서열 내에서의 상동성을 제공하는 540 bp만큼 중첩되었고, 정지 코돈이 5' GFP 단편의 3' 말단에 삽입되어, 표적 서열로부터 기능성 GFP가 번역되지 않는 것을 확실히 하였다.
표적 서열을 포함하는 형질전환 벡터가 하기 기술된 바와 같은 다단계 클로닝 프로세스를 통해 생성되었다.
B. HPT 이원성 벡터 (pDAB1584)의 구축
벡터 pDAB1400는 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])로 종결되는 GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])를 구동시키는 아라비돕시스 탈리아나 ubi-3 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493])를 포함하는 GUS 발현 카셋트를 함유하였고, 이를 출발 기본 구축물로 사용하였다 (도 7).
표적 구축물 내의 모든 불필요한 반복된 조절 요소를 방지하기 위해, pDAB1400 내의 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])을 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-24 UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))로 교체하였고, 이는 pDAB782 (도 8)로부터 SacI/XbaI 단편으로 절단되어 pDAB1400 내의 동일한 부위 내로 클로닝되었다. 생성된 구축물은 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-24 UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))로 종결되는 GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])를 구동시키는 아라비돕시스 탈리아나 ubi-3 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493])를 함유하였고, pDAB1582(도 9)로 명명되었다 .
HPT 코딩 서열 ([Waldron et al., 1985, Plant Mol. Biol. 18:189-200)]을 pDAB354 플라스미드 (도 10)로부터 프라이머 P1 및 P2를 사용하여 PCR 증폭시켰다. BbsI 부위가 프라이머 P1의 5' 말단에 부가되었고, SacI 부위가 프라이머 P2의 3' 말단에 보유되었다. HPTII PCR 단편을 BbsI/SacI로 절단하고, NcoI-SacI으로 소화된 pDAB1582 내로 클로닝하여, GUS 유전자를 PCR 단편으로부터의 HPT 유전자로 교체하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB1583 (도 11)으로 명명하였다.
그후, 아라비돕시스 탈리아나 ubi-3/HPT/아그로박테리움 투메파시엔스 orf-24 단편을 pDAB1583으로부터 NotI 소화에 의해 절제하고, T4 DNA 폴리머라제로 처리하여, 블런트-말단을 생성시켰다. 블런트-말단 처리된 HPT 발현 카셋트를 이원성 기본 벡터인 pDAB2407 (도 12) 내로 PmeI 부위에서 클로닝하여, 플라스미드 pDAB1584 (도 13)가 생성되었다.
C. 상동성 서열 및 Scd27 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 결합 부위를 포함하는 벡터 (pDAB1580)의 구축
pDAB2418 (도 14) 내의 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])을 아그로박테리움 투메파시엔스 orf25/26 UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))로 교체하여, 표적 벡터 내의 반복된 조절 서열을 방지하였다. UTR을 교환시키기 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스 orf25/26 UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))을 pDAB4045 플라스미드 (도 15)로부터 프라이머 P3 및 P4를 사용하여 PCR 증폭시켰다. SmaI 및 AgeI 부위가 PCR 단편의 3' 말단에 부가되었고, SacI 부위가 5' 말단에 보유되었다. 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])로 종결되는 PAT 유전자 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37])를 구동시키는 아라비돕시스 탈리아나 유비퀴틴-10 (ubi-10) 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493])를 포함하는 PAT 유전자 발현 카셋트, 및 니코티아나 타바쿰 RB7 MAR 서열 (WO9727207 (Thompson 등, 1997))을 함유한 pDAB2418 플라스미드 DNA를 SacI 및 AgeI으로 소화시키고, 2개의 가장 큰 단편을 회수하였다. 이러한 단편들을 SacI 및 AgeI로 소화된 아그로박테리움 투메파시엔스 orf25/26 UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987)) PCR 생성물과 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 pDAB1575 (도 16)로 명명하였다. 니코티아나 타바쿰 RB7 MAR (WO9727207 (Thompson 등, 1997))은 표적 벡터 내의 상동성 서열-1로 작용한다.
아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS의 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)을 표적 벡터 내의 상동성 서열-2로 작용하도록 선택하였다. PAT 유전자 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37]) 코딩 서열을 분석하였고, 출발 코돈의 299/300 bp 하류가 적합한 5' 및 3' 스플라이싱 부위가 형성되도록 인트론을 삽입하기 위한 부위로 확인되었다. 그후, 전장 인트론을 DNA 합성에 의해 253 bp의 3' 부분적 PAT 코딩 서열 (Picoscript Ltd., LLP (Houston, Texas))과 융합시켰다. NotI 및 SacI 부위가 DNA 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. 그후, 합성된 DNA 단편을 NotI/SacI으로 소화시키고, 동일한 부위에서 pDAB1575 내로 삽입하여, 전장 PAT 코딩 서열을 교체하였다. 생성된 구축물을 pDAB1577 (도 17)로 명명하였다.
Scd27-L0-Fok1 인식 부위 (도 6)의 4개의 직렬 반복물을 함유하는 241 bp DNA 단편을 합성하였고 (Picoscript Ltd., LLP (Houston, Texas)), 이때 단편의 5' 및 3' 말단 양쪽 모두에 SmaI 부위가 부가되었다. 그후, 합성된 아연 손가락-Fok1 결합 부위-함유 단편을 SmaI으로 소화시키고, pDAB1577 내로 MscI 부위에서 삽입하였다. 생성된 벡터를 pDAB1579 (도 18)로 명명하였다. 그후, SmaI으로 소화된 제2의 아연 손가락-Fok1 결합 부위-함유 단편을 pDAB1579 내로 SwaI 부위에서 삽입하였다. 생성된 구축물을 pDAB1580 (도 19)으로 명명하였다. 이러한 벡터는 상동성 서열 1 및 2 (각각 니코티아나 타바쿰 RB7 MAR 및 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론 1), 및 각각 Scd27-L0-Fok1 인식 부위의 4개의 반복물을 함유하는 2개의 합성된 Scd27 아연 손가락-Fok1 결합 부위를 함유한다.
D. 2개의 부분적으로 중복된 비-기능성 GFP 단편을 함유하는 벡터 (pDAB1572)의 구축
GFP 유전자인 CopGFP를 Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia)로부터 구입하고, 전장 코딩 서열을 프라이머 P5 및 P6을 사용하여 PCR 증폭시켰다. BbsI 및 SacI 부위가 PCR 생성물의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. 그후, CopGFP PCR 생성물을 BbsI/SacI으로 소화시키고, 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 3' UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])로 종결되는 GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])를 구동시키는 변형된 아그로박테리움 투메파시엔스 Δmas 프로모터 (US6730824 (Petolino 등))를 포함하는 pDAB3401 (도 20) 내로 NcoI/SacI 부위에서 클로닝하여, GUS 유전자를 교체시켰다. 생성된 벡터를 pDAB1570 (도 21)으로 명명하였다.
2개의 부분적으로 중복된 비-기능성 GFP 단편을 만들기 위해, CopGFP의 코딩 서열 대부분을 함유하지만 5' 말단에서 47 bp가 결실된 DNA 단편을 프라이머 P9 및 P10을 사용하여 PCR 증폭시켰다. ApaI 부위가 5' 및 3' 말단 양쪽 모두에 부가되었고, 추가적인 StuI 부위가 ApaI 부위의 5' 말단 하류에 부가되었다. 그후, PCR 생성물을 ApaI으로 소화시키고, pDAB1570 내로 ApaI 부위에서 삽입함으로써, 2개의 비-기능성 GFP 단편이 동일한 벡터 내에 생성되었고, 이때 540 bp의 서열이 중복되었다. 생성된 구축물을 pDAB1572 (도 22)로 명명하였다.
E. IL-1 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 결합 부위/GUS 유전자 융합물을 함유하는 벡터 (pDAB1573)의 구축
IL-1_L0-Fok1 인식 부위 (도 6)의 4개의 직렬 반복물을 함유하는 233 bp DNA 단편이 Picoscript Ltd., LLP (Houston, Texas)에 의해 합성되었고, 이때 NcoI 및 AfIIII 부위가 각각 5' 및 3' 말단에 부가되었다. 그후, 합성된 단편을 NcoI/AflIII으로 소화시키고, CsVMV 프로모터 ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139])로 구동되고 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 3' UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])로 종결되는 GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405])를 함유하는 pDAB4003 (도 23) 내로 NcoI 부위에서 삽입하였다. 그후, IL-1_L0-Fok1 결합 부위와 GUS 코딩 서열 간의 N-말단 융합물이 생성되었다. 생성된 벡터를 pDAB1571 (도 24)로 명명하였다.
표적 벡터 내의 반복되는 3' UTR 요소를 방지하기 위해, 아그로박테리움 투메파시엔스 nos 3' UTR ([DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573])을 pDAB7204 (도 25)에서 SacI/PmeI 단편으로 절제하고, SacI/NaeI로 소화된 pDAB1571 내로 클로닝하여, 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 3' UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])을 교체하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB1573 (도 26)으로 명명하였다.
F. 최종 표적 벡터 (pDAB1585)의 구축
최종 표적 벡터를 만들기 위해, IL-1-Fok1 융합 단백질 표적 부위가 삽입된 GUS 발현 카셋트를 pDAB1573으로부터 NotI 소화에 의해 절제하고, 블런트-말단이 되도록 처리하고, pDAB1572 내로 StuI 부위에서 삽입하였다. 생성된 중간체 벡터를 pDAB1574 (도 27)로 명명하였다. 변형된 Δmas 프로모터 (US6730824 (Petolino 등)), 5' 부분 중복 GFP 서열 (Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia)), CsVMV 프로모터 ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139]), IL-1-Fok1 융합 단백질 표적 서열, GUS 유전자 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405]) 코딩 영역, 아그로박테리움 투메파시엔스 nos 3' UTR ([DePicker et al., 1982, J. Mol. Appl. Genet. 1:561-573]), 3' 부분 중복 GFP (Evrogen Joint Stock Company (Moscow, Russia)) 및 아그로박테리움 투메파시엔스 orf-1 3' UTR ([Huang et al., J. Bacteriol. 172:1814-1822])을 함유하는 전체 카셋트를 pDAB1574로부터 절제하고, pDAB1580 내로 NotI 부위에서 삽입하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB1581 (도 28)로 명명하였다. 그후, pDAB1581의 AgeI 단편을 pDAB1584 내로 AgeI 부위에서 삽입함으로써, 최종 표적 구축물 pDAB1585 (도 4 및 5)가 생성되었다.
실시예 6: 표적 서열이 통합된 트랜스제닉 세포주의 생성
BY2로 지칭되는 담배 세포 현탁 배양물을 사용하여, 실시예 5의 표적 서열을 아그로박테리움 형질전환을 통해 안정적으로 통합시켰다. 기본 세포주 BY2를 Japan Tobacco (Iwata, Shizuoka, Japan)의 Jun Ueki로부터 수득하였다. 이러한 배양물은 세포 100-150개의 클러스터 내의 5-10 마이크로미터 직경의 세포로 증식하고, 이때 배가 시간은 약 18시간이다. BY2 세포 현탁 배양물을 LS 기초 염 (PhytoTechnology Labs L689), 170 ㎎/ℓ KH2PO4, 30 g/ℓ 수크로스, 0.2 ㎎/ℓ 2,4-D 및 0.6 ㎎/ℓ 티아민-HCL을 함유하는 pH 6.0의 배지에서 유지시켰다. 0.25 ㎖ PCV에 50 ㎖의 LS계 배지를 첨가함으로써 BY2 세포를 7일마다 서브클로닝하였다. BY2 세포 현탁 배양물을 25℃ 및 125 RPM의 회전식 진탕기 상의 250-㎖ 플라스크에서 유지시켰다.
표적 서열이 통합된 트랜스제닉 BY2 세포 배양물을 생성시키기 위해, 하위배양 4일 후의 담배 현탁액의 플라스크를 10-12개의 4 ㎖ 분취량으로 나누고, 이들을 약 1.5의 OD600으로 하룻밤 동안 성장된 pDAB1585가 서식하는 아그로박테리움 균주 LBA4404 100 ㎕와 함께 100×25 mm 페트리접시에서 공동-배양하였다. 접시들을 파라필름으로 포장하고, 진탕하지 않으면서 25℃에서 3일 동안 인큐베이션한 후, 과량의 액체를 제거하고, 500 ㎎/ℓ 카르베니실린을 함유하는 11 ㎖의 LS계 기초 배지로 교체하였다.
담배 세포의 재현탁 후, 현탁액 1 ㎖를 8 g/ℓ TC 한천으로 고체화된 500 ㎎/ℓ 카르베니실린 및 200 ㎎/ℓ 히그로마이신을 함유하는 적합한 기초 배지의 100×25 mm 플레이트 상에 배분하고, 포장되지 않은 채로 28℃에서 암실에서 인큐베이션하였다. 이로써, 단일 처리를 위한 120-144개의 선별 플레이트가 생성되었다. 개별적인 히그로마이신-저항성 단리물들이 플레이팅하고 나서 10-14일 후에 나타났고, 이를 개별적인 60×20 mm 플레이트 (플레이트 당 1개의 단리물)로 옮겨서, 분석 및 추후의 재형질전환 실험에 필요할 때까지 14일 하위배양 스케쥴로 캘러스(callus)로 유지시켰다.
실시예 7: 표적 트랜스제닉 이벤트의 스크리닝 및 특성화
BY2 담배 세포 배양물 내로의 표적 벡터의 형질전환으로부터 생성된 히그로마이신-저항성 트랜스제닉 이벤트 (실시예 6에 기술됨)를 하기와 같이 분석하였다.
이러한 트랜스제닉 이벤트를 스크리닝하기 위해 수행된 초기의 분석법은 표적 서열의 접근가능성을 가리키기 위한 GUS 발현 분석, 표적 벡터의 존재 및 무손상성을 확인하기 위한 부분적 및 전장 표적 서열의 PCR 분석, 및 통합된 표적 서열의 카피수를 결정하기 위한 서던 블롯 분석을 포함하였다. GUS 발현을 나타낸 트랜스제닉 이벤트의 부분집합은 전장 표적 서열의 1개의 단일 카피를 함유하였고, 이들을 현탁 배양물을 재확립시키기 위해 선택하여, 후속 재형질전환을 위한 표적 세포주를 생성시켰다. 이러한 재확립된 표적 세포주를 또한 추가적으로 특성화하였고, 이러한 특성화는 더욱 철저한 서던 블롯 분석, 전체 표적 삽입물의 서열분석 확인, 및 플랭킹된 게놈 서열 분석을 포함하였다.
선별된 이벤트로부터 시작된 트랜스제닉 담배 캘러스 조직 또는 현탁 배양물을 150 ㎕의 분석 완충제 내의 50 ㎎ 샘플을 24-48시간 동안 37℃에서 인큐베이션함으로써 GUS 활성에 대해 분석하였다. 분석 완충제는 0.2 M 인산나트륨 (pH 8.0,), 각각 0.1 mM의 페리시안화칼륨 및 페로시안화칼륨, 1.0 mM 소듐 EDTA, 0.5 ㎎/㎖ 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-글루쿠로니드 및 0.6％ (v/v) 트리톤(Triton) X-100으로 구성되었다 ([Jefferson, 1987, Plant Mol. Biol. Rep. 5:387-405]). 청색 영역의 출현을 GUS 유전자 발현의 지표로 사용하였고, 이러한 발현은 표적 서열 삽입물이 전사적으로 활성이고, 따라서 국소적인 게놈 환경에서 접근가능하였음을 가리켰다.
GUS를 발현하는 트랜스제닉 이벤트를 표적 서열의 5' 말단의 HTP 발현 카셋트의 3' UTR에서 표적 서열의 3' 말단의 부분적 PAT 발현 카셋트의 3' UTR까지 연장된 10kb DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍 P15/P16을 사용하여 PCR에 의해 분석하였다. 모든 이벤트가 히그로마이신 선별 하에 수득되기 때문에, HPT 발현 카셋트가 모든 표적 이벤트에서 무손상인 것으로 가정되었다. 따라서, HPT 발현 카셋트의 3' UTR만이 전장 PCR 분석에서 커버되었다. 이벤트들의 부분집합을 프라이머 쌍 P15/P17 및 P18/P19를 사용하여 또한 PCR 분석하여, 표적 서열의 5' 및 3' 말단의 무손상성을 각각 결정하였다. PCR 분석으로 확인된 모든 표적 이벤트들을 서던 블롯 분석으로 추가로 분석하여, 통합된 표적 서열의 카피수를 결정하였다.
GUS 발현 및 전장 PCR의 스크리닝을 통과한 모든 표적 이벤트에 대해 서던 블롯 분석을 수행하였다. 10 ㎍의 게놈 DNA를 표적 서열 내의 독특한 절단기인 NsiI로 소화시켰다. 소화된 게놈 DNA를 0.8％ 아가로스 젤 상에서 분리하고, 나일론 막으로 옮겼다. 가교 후, 막 상의 옮겨진 DNA를 HPT 유전자 프로브와 혼성화시켜, 표적 서열의 5' 말단의 카피수를 결정하였다. 그후, 동일한 블롯을 벗겨내고, PAT 유전자 프로브와 재혼성화시켜, 표적 서열의 3' 말단의 카피수를 결정하였다.
GUS 발현을 나타내고 전장 표적 서열의 단일 카피를 함유한 여러 이벤트를 더욱 철저한 서던 블롯 분석, 전체적인 표적 서열 확인 및 플랭킹된 게놈 서열 분석을 포함하는 추가적인 특성화를 위해 선별하였다. BY2-380으로 지칭된 한 이벤트가 분자 특성화를 기초로 선별되었다. 도너 DNA 및 비-C2H2 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자를 포함하는 벡터를 사용하는 추후의 재형질전환을 위해, 이러한 이벤트로부터 현탁 배양물을 재확립시켰다.
표적 이벤트 BY2-380으로부터 확립된 현탁 배양물이 예상 대로 표적 서열을 함유하였음을 확실히 하기 위해, 표적 서열의 5' 말단의 HPT 발현 카셋트의 3' UTR에서 표적 서열의 3' 말단의 부분적 PAT 유전자 카셋트의 3' UTR까지의 주요 표적 서열을 프라이머 쌍 P15/P16을 사용하여 PCR 증폭시키고, pCR2.1 TOPO 벡터 (Invitrogen (Carlsbad, California)) 내로 클로닝하였다. TOPO 벡터 내로 삽입된 PCR 생성물을 Lark technology, Inc. (Houston, Texas)에 의해 서열분석하였다. 서열 결과는 BY2-380에 예상대로 완전한 표적 서열이 있었음을 가리켰다.
BY2-380 세포주를 추가로 분석하여, 플랭킹된 게놈 서열을 Universal Genome Walker Kit (Clontech (Mountain View, California))를 사용하여 수득하였다. 간략하게, 2.5 ㎍의 게놈 DNA를 3개의 블런트-말단 제한 효소 EcoRV, DraI 및 StuI로 개별적인 반응들에서 소화시켰다. 소화된 DNA를 페놀/클로로포름 추출을 통해 정제하고, BD Genome Walker Adaptor와 결찰시켰다. 결찰물을 주형으로 사용하여, 1차 PCR 반응을 위한 프라이머 P20 (표적 서열 삽입물의 5' 말단의 상류에서 보행) 및 P21 (표적 서열 삽입물의 3' 말단의 하류에서 보행), 및 2차 PCR 반응을 위한 프라이머 P22 (표적 서열 삽입물의 5' 말단의 상류에서 보행) 및 P23 (표적 서열 삽입물의 3' 말단의 하류에서 보행)으로 네스티드(nested) PCR 증폭을 수행하였다. 2차 PCR 반응으로부터의 증폭된 단편을 pCR2.1 TOPO 또는 pCR Blunt II TOPO 벡터 (Invitrogen (Carlsbad, California)) 내로 클로닝하고, Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter (Fullerton, CA))를 사용하여 서열분석하였다. 이러한 프로세스를 통해 BY2-380 표적 세포주로부터 플랭킹된 게놈 서열을 수득하였다. 그후, 플랭킹된 게놈 서열을 기초로 프라이머를 디자인하여, 전체 표적 서열을 증폭시키는데 사용하였다.
이러한 표적 세포주로부터 수득된 증폭된 단편은 예상된 크기였다. 증폭된 단편들의 양쪽 말단을 서열분석에 의해 확인하였다.
실시예 8: 도너 DNA 벡터의 디자인 및 생성
도너 DNA 구축물은 상동성 서열-1 (니코티아나 타바쿰 RB7 MAR) (WO9727207 (Thompson 등, 1997)), 전장 아라비돕시스 탈리아나 ubi10 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493]), 299 bp의 5' 부분적 PAT 유전자 코딩 서열 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37]) 및 상동성 서열-2 (아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1) (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)를 포함하였다. 도너 벡터 내의 상동성 서열-1 및 서열-2 모두는 표적 벡터 (pDAB1585) 내의 상응하는 상동성 서열-1 및 서열-2와 동일하였다.
도너 벡터를 구축하기 위해, 299 bp의 5' 부분적 PAT 코딩 서열을 Picoscript Ltd., LLP (Houston, Texas)에 의해 DNA 합성을 통해 전장 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)와 융합시켰다. NcoI 및 XhoI 부위가 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. 그후, 이러한 합성된 DNA 단편을 NcoI/XhoI으로 소화시키고, pDAB1575 내로 동일한 부위에서 삽입하여, 전장 PAT 유전자 코딩 서열 및 이의 3' UTR을 교체하였다. 생성된 구축물을 pDAB1576 (도 29)으로 명명하였다.
그후, pDAB1576을 AgeI으로 소화시키고, 상동성 서열-1 및 상동성 서열-2가 플랭킹된 5' 부분적 PAT 발현 카셋트를 함유하는 전체 단편을 이원성 기본 벡터인 pDAB2407 내로 동일한 부위에서 삽입하였다. 생성된 구축물을 pDAB1600으로 명명하였고, 이는 식물 세포 재형질전환을 위한 이원성 버젼의 도너 벡터였다 (도 30).
실시예 9: 아연 손가락 뉴클레아제 발현 벡터의 디자인 및 생성
아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자가 CsVMV 프로모터 및 5' UTR ([Verdaguer et al., 1996, Plant Molecular Biology 31:1129-1139])에 의해 구동되었다. 카셋트 내에 아그로박테리움 투메파시엔스 오픈 리딩 프레임-24 (orf-24) 3' 비번역 영역 (UTR) (EP222493 (Gelvin 등, 1987))이 또한 포함되었다.
이러한 벡터들을 만들기 위해, 상기 실시예 1 내지 4에 기술된 IL-1-Fok1 및 Scd27-Fok1 코딩 서열의 C2H2 대조군 및 이의 C3H 변이체를 이들의 원래 디자인으로부터 PCR 증폭시켜, BbsI 또는 NcoI 및 SacI 부위가 PCR 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었고, 이를 NcoI-SacI로 소화된 pDAB3731 (도 31) 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드들을 pDAB4322 (도 32), pDAB4331 (도 33), pDAB4332 (도 34), pDAB4333 (도 35), pDAB4334 (도 36), pDAB4336 (도 37), 및 pDAB4339 (도 38)로 명명하였다. 이러한 벡터들 모두가 ZFN 발현 카세트에 플랭킹된 attL1 및 attL2 부위를 함유하였고, Gateway™ 클로닝 시스템 (Invitrogen (Carlsbad, California))과 상용성이었다.
이원성 버젼 벡터들의 2개의 셋트를 IL-1-FokI 융합 단백질에 대해 구축하였다. 1개는 PAT 선별성 마커 유전자를 함유하였고, 또다른 1개는 PAT 선별성 마커 유전자를 함유하지 않았다. SCd27-FokI 융합 단백질에 대해, PAT 선별성 마커 유전자가 없는 이원성 버젼의 벡터만이 구축되었다. PAT 선별성 마커 유전자가 있는 이원성 벡터를 만들기 위해, pDAB4322, pDAB4331, pDAB4332, pDAB4333, pDAB4334, 및 pDAB4336 내의 IL-1-FokI 융합 단백질 발현 카세트를 LR Clonase™ Enzyme Mix (Invitrogen (Carlsbad, California))를 사용하여 LR 재조합 반응을 통해 pDAB4321 (도 39) 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB4323 (도 40), pDAB4341 (도 41), pDAB4342 (도 42), pDAB4343 (도 43), pDAB4344 (도 44), pDAB4346 (도 45)으로 명명하였다. PAT 선별성 마커 유전자가 없는 이원성 벡터를 만들기 위해, 각각 pDAB4331, pDAB4336 및 pDAB4339 내의 C2H2 IL-1-FokI, C3H IL-1-FokI 및 Scd27-FokI 발현 카세트를 LR Clonase™ Enzyme Mix (Invitrogen (Carlsbad, California))를 사용하여 LR 재조합 반응을 통해 pDAB4330 (도 46) 내로 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 각각 pDAB4351 (도 47), pDAB4356 (도 48) 및 pDAB4359 (도 49)로 명명하였다.
SCD27-FokI의 C2H2 대조군을 만들기 위해, pDAB7002 (도 50) 내의 PAT를 구동시키는 CsVMV 프로모터 및 5'UTR을 포함하는 HindIII/SacI 단편을 pDAB7025 (도 51)로부터 HindIII/SacI으로 절제된, GUS를 구동시키는 CsVMV 프로모터 및 5' UTR 및 니코티아나 타바쿰 5' UTR을 포함하는 단편으로 교체하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB1591 (도 52)로 명명하였다. Scd27-L0-FokI 코딩 서열을 이의 원래의 벡터인 pCDNA3.1-SCD27a-L0-FokI (도 53)으로부터 프라이머 쌍 P13/P14를 사용하여 PCR 증폭시켰다. BbsI 및 SacI 부위가 PCR 단편의 5' 및 3' 말단에 각각 부가되었다. pDAB1591 내의 PAT 유전자를 SacI/NcoI 클로닝을 통해 아연 손가락 융합 단백질 유전자 PCR 단편으로 교체하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB1594 (도 54)로 명명하였다. 이원성 버젼의 이러한 벡터를 pDAB1594로부터 아연 손가락 융합 단백질 유전자 발현 카셋트를 PmeI/XhoI 단편으로 절제하고, 말단들을 채우고, pDAB2407 내로 PmeI 부위에서 클로닝함으로써 구축하였다. 생성된 플라스미드를 pDAB1598 (도 55)로 명명하였다. 식물 형질전환에 사용된 모든 이원성 벡터의 상세사항이 표 6에서 요약된다.
Figure 112009035680027-PCT00007
실시예 10: 양성 대조군 벡터의 디자인 및 생성
재조합 빈도를 변칙화시키고, 양성 대조군으로서 작용하기 위해, PAT 유전자 발현 카셋트를 함유하는 벡터를 사용하였다. 최종 재조합체와 유사하게 하기 위해, 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)을 PAT 코딩 서열 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37])의 299/300 bp에서 삽입하였다. 이러한 구축물을 만들기 위해, pDAB1576으로부터의 2559 bp SwaI/ClaI 단편을 동일한 제한 효소로 소화된 pDAB1577 (도 56)의 골격 단편과 결찰시켰다. 생성된 벡터는 1743 bp의 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)이 PAT 코딩 서열 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37])의 중앙에 삽입된 PAT 유전자 발현 카셋트를 함유하였다. 이러한 벡터를 pDAB1578 (도 57)로 명명하였다.
이원성 버젼의 pDAB1578을 만들기 위해, 아라비돕시스 탈리아나 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074)이 있는 PAT 유전자 발현 카셋트를 pDAB1578로부터 PmeI/XhoI로 절제하였다. 단편의 3' 말단을 블런트-말단 처리한 후, 이를 이원성 기본 벡터인 pDAB2407 내로 PmeI 부위에서 삽입하였다. 생성된 벡터를 pDAB1601 (도 58)로 명명하였고, 이는 아라비돕시스 탈리아나 ubi10 프로모터 ([Callis, et al., 1990, J. Biol. Chem. 265-12486-12493])에 의해 구동되고 아그로박테리움 투메파시엔스 orf25/26 3' UTR (EP222493 (Gelvin 등, 1987))로 종결되는 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1 (Locus At3g21320, GenBank NC 003074) 서열을 함유하는 PAT 유전자 ([Wohlleben et al., 1988, Gene 70:25-37])를 포함하였다.
실시예 11: C3H 아연 손가락 뉴클레아제 유전자로의 표적 세포 배양물의 재형질전환에 의한 염색체내 상동 재조합의 실연
염색체내 상동 재조합을 자극하는 것에서의 C3H 아연 손가락 뉴클레아제의 기능성을 확인하기 위해, 540 bp 중첩 서열이 있는 2개의 비-기능성 GFP 단편이 도 59에 제시된 바와 같이 표적 벡터 내에 포함되었다. 이러한 2개의 단편 사이에, GUS 유전자 발현 카세트가 있었다. IL-1-Fok1 융합 단백질 결합 서열이 GUS 코딩 서열과 이의 N-말단에서 융합되었다. 1가지 이론에 제한되지 않으면서, IL-1-Fok1 융합 단백질의 존재 하에, IL-1 ZFN 결합 서열이 인식될 것이고, 이중 가닥 DNA 파손이 유도될 것이며, 이는 내인성 DNA 복구 프로세스를 자극할 것으로 가정되었다. 도너 DNA가 존재하지 않으면, 2개의 부분적으로 상동성인 GFP 단편에 염색체내 상동 재조합 프로세스가 진행될 것이고, 기능성 GFP 유전자가 재구성될 것이다.
표적 서열의 단일 전장 통합 카피를 함유하는 BY2-380 트랜스제닉 세포주를 사용하여, 약 250-500 ㎎의 캘러스 조직을 100 ㎎/ℓ 히그로마이신을 함유하는 LS계 기초 배지 40-50 ㎖ 내로 놓고 상기 기술된 바와 같이 7일마다 하위배양함으로써 현탁 배양을 다시 시작하였다. 재형질전환 전에, 현탁 배양물을 적어도 2회의 계대 동안 히그로마이신이 없는 기초 배지로 옮겼다.
표적 세포 배양물의 아그로박테리움-매개 형질전환을 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 각각의 실험에 대해, 8개의 공동-배양 플레이트를 하기와 같이 생성시켰다: 1개의 플레이트는 기본 아그로박테리움 균주 LBA4404 300 ㎕와 함께 공동 배양된 세포를 포함하였고; 1개의 플레이트는 pDAB1590 (기능성 GFP 구축물)을 보유하는 아그로박테리움 균주 300 ㎕와 함께 공동 배양된 세포를 포함하였으며; 6개의 플레이트 각각은 pDAB4323, pDAB4341, pDAB4342, pDAB4343, pDAB4344, 및 pDAB4346을 각각 보유하는 아그로박테리움 균주 300 ㎕와 함께 공동 배양된 세포를 포함하였다. 상기 기술된 방법을 사용한 공동-배양 후, 세포를 선별 시약 없이 500 ㎎/ℓ 카르베니실린이 보충된 LS계 기초 배지를 함유하는 8개의 플레이트 상에 플레이팅하였다. 구성된 기능성 GFP 유전자의 명백한 발현으로 형질전환 5-8일 후 눈에 보이는 형광이 초래되었다. 각각의 실험에서 플레이트 당 5개의 '무작위' 현미경 필드, 구축물 당 8개의 플레이트를 검시함으로써 필드 당 녹색 형광 반점의 개수를 계수하고, 6회의 독립적인 실험으로부터 평균하였다.
표 7에 요약된 바와 같이, 필드 당 평균 9.50개 및 7.57개의 녹색 형광 반점이 2개의 C3H 아연 손가락 뉴클레아제 pDAB4346 및 pDAB4343으로부터 각각 관찰되었다. IL-1-FokI의 이러한 2개의 C3H 디자인은 이들의 C2H2 대조군인 pDAB4341 (필드 당 6.37개의 반점) 및 pDAB4323 (필드 당 5.53개의 반점)보다 양호하게 작동하였다. 동시에, C2H2 대조군과 비교하여, IL-1-FokI 융합 단백질의 또다른 2개의 C3H 변이체인 pDAB4344 (필드 당 4.39개의 반점) 및 pDAB4342 (필드 당 0.25개의 반점)의 기능이 현저하게 손상되었고, 4번째 손가락에서 제2 시스테인을 히스티딘으로 교체함으로써 간단하게 C3H 전환이 이루어진 pDAB4342에서 특히 손상되었다. 기본 아그로박테리움 균주 LBA4404로 형질전환된 음성 대조군에서는 경미한 배경을 넘어서는 감지할 수 있는 형광이 관찰되지 않았다.
Figure 112009035680027-PCT00008
실시예 12: C3H 아연 손가락 뉴클레아제 유전자 및 도너 DNA 서열로의 표적 세포 배양물의 재형질전환에 의한 염색체간 상동 재조합의 실연
예시적인 담배 시스템에서 염색체간 상동 재조합을 자극하는 것에서의 C3H 아연 손가락-FokI 융합 단백질의 기능성을 확인하기 위해, 2가지 전략이 개발되어 테스트되었다.
전략 1에서, 아연 손가락-Fok1 융합 단백질에 대한 결합 부위 (IL-1-L0-Fok1)가 표적 구축물의 중앙에 포함되었다 (도 61). 이러한 전략에서, 결합 부위에 약 3 kb의 비-상동성 서열이 양쪽 측면 상에서 플랭킹되었고, 여기에 상동성 서열-1 (니코티아나 타바쿰 RB7 MAR) 및 상동성 서열-2 (아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1)가 상류 및 하류에 각각 이어졌다. 앞서 실연된 바와 같이 (예를 들어, 미국 특허 공보 번호 20050064474), C2H2 IL-1 아연 손가락-Fok1 융합 단백질의 존재 하에, IL-1-L0-Fok1 결합 서열이 인식되었고, 이러한 특정 부위에서 이중 가닥 DNA 파손이 유도되었으며, 이러한 파손은 내인성 DNA 복구 프로세스를 자극하였다. 표적 서열 내의 것과 동일한 상동성 서열을 함유한 도너 DNA의 존재 하에, 5' 부분적 PAT 유전자가 이의 프로모터와 함께 상동 재조합을 통해 표적 내의 상동성 서열들 간의 전체 약 6 kb의 DNA 단편을 교체하였다. 이러한 프로세스를 통해, 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1이 사이에 개재된 2개의 부분적 PAT 유전자 서열이 기능성 PAT 유전자를 재구성하여, PAT 발현 및 제초제 저항성 표현형이 초래되었다.
전략 2에서, 2개의 아연 손가락-Fok1 결합 부위 (Scd27-L0-Fok1)가 표적 벡터 내에 포함되었고, 이때 1개는 니코티아나 타바쿰 RB7 MAR의 하류에 직접적으로, 나머지 1개는 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론 1의 상류에 직접적으로 포함되었다 (도 62). 2개의 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 결합 부위 사이에 5' GFP 단편, GUS 발현 카셋트 및 3' GFP 단편을 포함한 약 6 kb의 서열이 있었다. 앞서 실연된 바와 같이 (예를 들어, 미국 특허 공보 번호 20050064474), Scd27 아연 손가락-Fok1 융합 단백질의 존재 하에, 2개의 결합 서열이 인식되었고, 양쪽 위치에서 이중 가닥 DNA 파손이 유도되었으며, 이러한 파손은 이러한 2개의 결합 서열 사이의 약 6 kb의 DNA 단편을 제거하였고 내인성 DNA 복구 프로세스를 자극하였다. 전략 1과 유사하게, 표적 서열 내의 것과 동일한 상동성 서열을 함유한 도너 DNA의 존재 하에, 5' 부분적 PAT 유전자가 이의 프로모터와 함께 이중 가닥 DNA 파손이 유도된 부위에서 상동 재조합을 통해 표적 서열 내로 삽입되었다. 이러한 프로세스를 통해, 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1이 사이에 개재된 2개의 부분적 PAT 유전자 서열이 기능성 PAT 유전자를 재구성하여, PAT 발현 및 제초제 저항성 표현형이 초래되었다.
BY2-380 표적 세포 배양물의 아그로박테리움-매개 형질전환을 상기 기술된 바와 같이 수행하였다. 각각의 실험을 위해, 12개의 공동-배양 플레이트를 하기와 같이 생성시켰다: 1개의 플레이트는 pDAB1600 (도너 DNA)을 보유하는 아그로박테리움 균주 50 ㎕ 및 아그로박테리움 기본 균주 LBA4404 250 ㎕와 함께 공동 배양된 세포를 포함하였고; 1개의 플레이트는 pDAB1601 (PAT 선별성 마커)을 보유하는 아그로박테리움 균주 50 ㎕ 및 아그로박테리움 기본 균주 LBA4404 250 ㎕와 함께 공동 배양된 세포를 포함하였으며; 2개의 플레이트는 pDAB1600 (도너 DNA)을 보유하는 아그로박테리움 균주 50 ㎕ 및 pDAB4351 (C2H2 IL-1 ZFP-Fok1)을 보유하는 아그로박테리움 균주 250 ㎕와 함께 공동 배양된 세포를 포함하였고; 3개의 플레이트는 pDAB1600 (도너 DNA)을 보유하는 아그로박테리움 균주 50 ㎕ 및 pDAB4356 (C3H IL-1 ZFP-Fok1)을 보유하는 아그로박테리움 균주 250 ㎕와 함께 공동 배양된 세포를 포함하였고; 2개의 플레이트는 pDAB1600 (도너 DNA)을 보유하는 아그로박테리움 균주 50 ㎕ 및 pDAB1598 (C2H2 Scd 27a ZFP-Fok1)을 보유하는 아그로박테리움 균주 250 ㎕와 함께 공동 배양된 세포를 포함하였으며; 3개의 플레이트는 pDAB1600 (도너 DNA)을 보유하는 아그로박테리움 균주 50 ㎕ 및 pDAB4359 (C3H Scd27a ZFP-Fok1)을 보유하는 아그로박테리움 균주 250 ㎕와 함께 공동 배양된 세포를 포함하였다. 상기 기술된 방법을 사용한 공동-배양 후, 세포를 500 ㎎/ℓ 카르베니실린 및 15 ㎎/ℓ Bialaphos®를 함유하는 LS계 기초 배지를 함유하는 플레이트 상에 플레이팅하였다. 개별적인 Bialaphos®-저항성 단리물들이 플레이팅하고 나서 2-4주 후에 나타났고, 이들을 개별적인 60×20 ㎜ 플레이트 (플레이트 당 1개의 단리물)로 옮겨서, 분석에 필요할 때까지 14일 하위배양 스케쥴로 캘러스로 유지시켰다.
다수의 Bialaphos®-저항성 단리물을 C3H IL-1 아연 손가락 뉴클레아제 (pDAB4356) 및 C3H Scd27 아연 손가락 뉴클레아제 (pDAB4359) 양쪽 모두로부터 수득하였다. 이러한 단리물들을 재구성된 PAT 유전자에 스패닝(spanning)된 DNA 단편을 증폭시키는 프라이머 쌍 P24/25을 사용하여 PCR에 의해 분석하였다. 프라이머 P24는 도너 DNA 내의 PAT 코딩 서열의 5' 말단에 상동성이었고, 프라이머 P25는 표적 DNA 내의 PAT 코딩 서열의 3' 말단에 상동성이었다. 2개의 부분적인 PAT 코딩 서열이 상동 재조합을 통해 연결되면, 2.3 kb PCR 단편이 초래되었다. 도 63에 나타난 바와 같이, 다수의 분석된 단리물들로부터 2.3 kb PCR 생성물이 수득되었다. 이러한 단리물들은 C3H IL-1 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자/도너 DNA 및 C3H Scd27 아연 손가락-Fok 융합 단백질 유전자/도너 DNA의 공동-형질전환 모두로부터 수득되었다. C3H IL-1 아연 손가락-Fok1 및 C3H Scd27 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자 형질전환 양쪽 모두로부터 유래된 것들을 대표하는 다수의 독립적인 단리물들로부터의 2.3kb PCR 생성물을 아가로스 젤로부터 정제하고, pCR2.1 TOPO 벡터 (Invitrogen (Carlsbad, California)) 내로 클로닝하였다. 그후, TOPO 벡터 내에 삽입된 2.3 kb PCR 생성물을 Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter)를 사용하여 서열분석하였다. 서열분석 결과로, TOPO 벡터 내에 클로닝된 모든 PCR 생성물이 5' 및 3' 부분적 PAT 유전자 서열 + 개재성 아라비돕시스 탈리아나 4-CoAS 인트론-1을 포함하는 예상된 바와 같은 재조합된 서열을 함유하였음이 확인되었다. 이러한 결과들로, 테스트된 양쪽 전략 모두에 대해 예상된 염색체간 재조합이 확인되었고, C3H 아연 손가락-Fok1 융합 단백질 유전자의 발현을 통한 유전자 표적화가 예시되었다.
실시예 13: 옥수수 세포 배양물 내의 표적 유전자 서열의 확인
A. 서열 확인
본 실시예에서, 공지된 기능의 내인성 옥수수 유전자에 대한 DNA 서열을 조작된 아연-손가락 뉴클레아제를 사용하는 게놈 편집을 위한 표적으로 선별하였다. 사유 옥수수 순계 5XH751로부터 유래된 IPP2-K로 지칭되는 이러한 유전자의 게놈 구조 및 서열이 WO2006/029296 (이의 개시내용은 거명에 의해 본원에 포함됨)에 기술되어 있다.
특히, BLAST 알고리즘을 사용하여 TIGR 옥수수 게놈 데이터베이스 (인터넷 상에서 http://www.tigr.org/tdb/tgi/maize/에서 입수가능)에 질의하는데 IPP2-K 게놈 서열을 사용하였다. 접속번호 AZM515213 및 TC311535가 포함되지만 이에 한정되지 않는, IPP2-K에 대한 중첩 상동성의 절편들이 있는 여러 추가적인 게놈 단편들이 확인되었다. 이러한 접속번호들의 서열, 뿐만 아니라 IPP2-K 서열을 기초로, Primer3 프로그램 ([Rozen, S. and Skaletsky, H.J. (2000) Primer 3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds.) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386]; 인터넷 상에서 또한 입수가능)을 사용하여 여러 짧은 올리고뉴클레오티드들을 PCR 프라이머로 사용하기 위해 디자인하였다. 이러한 프라이머에는 하기의 전방향 올리고뉴클레오티드들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다:
1. 5'-ATGGAGATGGATGGGGTTCTGCAAGCCGC-3' (서열 104)
2. 5'-CTTGGCAAGGTACTGCGGCTCAAGAAGATTC-3' (서열 161)
3. 5'-ATGAAGAAAGACAGGGAATGAAGGAC-3' (서열 162)
4. 5'-ATGAAGAAAGACAGGGAATGAAGGACCGCCAC-3' (서열 163)
5. 5'-CATGGAGGGCGACGAGCCGGTGTAGCTG-3' (서열 164)
6. 5'-ATCGACATGATTGGCACCCAGGTGTTG-3' (서열 165)
또한, 이러한 프라이머에는 하기의 역방향 올리고뉴클레오티드들이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다:
7. 5'-TTTCGACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAAC-3' (서열 166)
8. 5'-ACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAACAC-3' (서열 167)
9. 5'-TTCGACAAGCTCCAGAAAATCCCTAGAAACAC-3' (서열 168)
10. 5'-TGCTAAGAACATTCTTTTCGACAAGCTCC-3' (서열 169)
11. 5'-GAACATTCTTTTCGACAAGCTCCAGAAAATCC-3' (서열 170)
Integrated DNA Technologies (IDT (Coralville, IA))에서 모든 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 합성되었고, 이를 구입하였다.
B. Hi II 옥수수 세포 배양
캘러스 배양 개시를 위한 미성숙 배아를 수득하기 위해, 온실에서 성장된 Hi-II 어버이 A 및 B ([Armstrong, C., Green, C. and Phillips, R. (1991) Maize Genet. Coop. News Lett. 65: 92-93]) 간의 F1 교배를 수행하였다. 약 1.0-1.2 mm 크기의 배아 (수분 9-10일 후)를 건강한 알갱이들로부터 수확하고, Liqui-Nox® 비누로 문지름으로써 표면을 멸균하고, 70％ 에탄올에 2-3분 동안 함침시킨 후, 20％ 시판 표백제 (0.1％ 차아염소산나트륨)에 30분 동안 함침시켰다.
알갱이들을 무균 증류수에서 헹구고, 미성숙 접합 배아를 무균적으로 절제하여, 15Ag10 배지 (N6 배지 ([Chu C.C., Wang C.C., Sun C.S., Hsu C., Yin K.C., Chu C.Y., and Bi F.Y. (1975) Sci. Sinica 18:659-668]), 1.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 20 g/ℓ 수크로스, 100 ㎎/ℓ 카세인 가수분해물 (효소 소화물), 25 mM L-프롤린, 10 ㎎/ℓ AgNO3, 2.5 g/ℓ Gelrite, pH 5.8) 상에서 배반이 배지를 향하지 않게 하면서 2-3주 동안 배양하였다. 예상된 형태 ([Welter, ME, Clayton, DS, Miller, MA, Petolino, JF. (1995) Plant Cell Rep: 14:725-729])를 나타내는 조직을 약 6주 동안 격주 간격으로 신선한 15Ag10 배지 상으로 선별적으로 옮긴 후, 4 배지 (N6 배지, 1.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 20 g/ℓ 수크로스, 100 ㎎/ℓ 카세인 가수분해물 (효소 소화물), 6 mM L-프롤린, 2.5 g/ℓ Gelrite, pH 5.8)로 약 2개월 동안 격주 간격으로 옮겼다.
배아발생성 현탁 배양을 개시시키기 위해, 약 3 ㎖ 충전 세포 용적 (PCV)의 단일 배아로부터 유래된 캘러스 조직을 약 30 ㎖의 H9CP+ 액체 배지 (MS 기초 염 혼합물 ([Murashige T., & Skoog F. (1962) Physiol. Plant. 15:473-497]), 니코틴산을 10배 덜 함유하고 티아민-HCl을 5배 더 함유하는 변형된 MS 비타민, 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 2.0 ㎎/ℓ α-나프탈렌아세트산 (NAA), 30 g/ℓ 수크로스, 200 ㎎/ℓ 카세인 가수분해물 (산 소화물), 100 ㎎/ℓ 마이오-이노시톨, 6 mM L-프롤린, 5％ v/v 코코넛 워터 (하위배양 직전에 첨가됨), pH 6.0)에 첨가하였다. 현탁 배양물을 125 rpm, 28℃로 설정된 온도-제어 진탕기 내의 125 ㎖ 삼각 플라스크에서 암실 조건 하에 유지시켰다. 세포주 확립 (2-3개월) 동안, 대구경 피펫을 사용하여 3 ㎖ PCV의 세포 및 7 ㎖의 컨디셔닝 배지를 20 ㎖의 새로운 H9CP+ 액체 배지에 첨가함으로써 현탁액을 3.5일마다 하위배양하였다. 성장 배가로 증명되는 성숙기에 도달했을 때, 현탁액의 규모를 증진시키고, 500 ㎖ 플라스크에서 유지시킴으로써, 12 ㎖ PCV의 세포 및 28 ㎖의 컨디셔닝 배지를 80 ㎖ H9CP+ 배지 내로 옮겼다. 현탁 배양물이 완전하게 확립되었을 때, 추후의 사용을 위해 분취량을 냉동보존하였다. WO 2005/107437 참조.
C. DNA 단리 및 증폭
상기 기술된 바와 같은 옥수수 HiII 세포 배양물을 250 ㎖ 플라스크에서 표준 GN6 배지 (N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 2.5 g/ℓ Gelrite, pH 5.8)에서 성장시키고, 게놈 DNA를 Qiagen (Valencia, CA)의 Plant DNeasy 추출 키트를 사용하여 제작사의 권고사항에 따라 추출하였다. 모든 가능한 조합의 상기 기술된 프라이머들을 사용한 PCR 증폭 반응을 하기의 조건 하에 수행하였다: 효소 제작사의 완충제 내의 20 ng의 gDNA 주형, 20 pmol의 각각의 프라이머, 1％ DMSO 및 10 유닛의 Accuprime™ Pf 폴리머라제 (Invitrogen (Carlsbad, CA))를 함유하는 25 ㎕ 반응 부피. 95℃-1', (95℃-30", 57-62℃-30", 72℃-1')×30, 72℃-5', 4℃-유지로 구성된 증폭 사이클로부터 크기가 500 bp 내지 2 kb 범위인 증폭 생성물이 생성되었다. 증폭된 단편을 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터의 TA 클로닝 키트를 사용하여 제작사의 권고사항에 따라 벡터 pCR2.1 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) 내로 직접 클로닝하였다.
D. 서열 분석
옥수수 순계 5XH751 및 HiII 세포 배양물 내의 IPP2-K 유전자의 기존의 연구는 소형 유전자 패밀리를 포함하는 2-3개의 독특한 유전자의 존재를 가리켰다 ([Sun et al., 발행 중, Plant Physiology]; WO2006029296). 따라서, 단리된 클로닝된 단편들을 CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter (Fullerton, CA))로 제작사의 권고사항에 따라 서열분석하였다. 여러 클론들의 서열 분석은 옥수수 게놈의 2개의 독특하고 기존에 특성화된 유전자좌로부터 유래된 2개의 독특한 유전자 단편이 HiII 세포로부터 단리되었음을 나타냈다.
HiII 배양 세포로부터 단리된 2개의 서열의 비교는 예상 코딩 영역 내에는 2개의 파라로그(paralog) 간에 작은 차이 예컨대 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP)이 존재하는 반면, 인트론성 및 비-코딩 영역은 뉴클레오티드 수준에서 현저하게 변한다는 것을 가리켰다. 2개의 파라로그 간의 이러한 차이는 서열-의존적 DNA 결합 단백질 예컨대 아연-손가락 도메인이 구별할 수 있는 서열 영역을 강조하기 때문에 이러한 차이가 주목된다. 당업자는 한 유전자 서열에는 결합하지만 또다른 매우 유사한 유전자 서열에는 결합하지 않는 아연-손가락 DNA 결합 도메인을 디자인할 수 있다. 당해 파라로그에 상응하는 1.2 kb의 부분적인 유전자 서열 (도 66)을 아연-손가락 뉴클레아제 단백질 디자인을 위한 주형으로 선별하였고, 이어서 상기 기술된 아연-손가락 DNA 결합 도메인 분석에 적용하였다.
실시예 14: IPP2-K 아연-손가락 DNA 결합 도메인의 디자인
IPP2-K에 대해 확인된 표적 부위를 사용하여, IPP2-K 아연 손가락에 대해 인식 나선이 선별되었다. 아연 손가락 디자인이 하기 표 8에서 제시된다:
Figure 112009035680027-PCT00009
아연 손가락 디자인의 표적 부위가 하기 표 9에서 제시된다:
Figure 112009035680027-PCT00010
IPP2-K 디자인을 CCHC 구조의 단백질을 코딩하는 아연 손가락 발현 벡터 내로 혼입하였다. 상기 표 1 내지 4 참조. 그후, 비-정규 아연 손가락-코딩 서열을 IIS형 제한 효소 FokI의 뉴클레아제 도메인 ([Wah et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:10564-10569]의 서열의 아미노산 384-579)에 4-아미노산 ZC 링커를 통해 융합시켜, IPP2-K ZFN을 형성시켰다.
실시예 15: IPP2-K 아연-손가락 뉴클레아제를 사용한 유전자 수정
상동 재조합을 용이하게 하는 본원에 기술된 바와 같은 IPP2-K ZFN의 능력을 [Urnov (2005) Nature 435(7042):646-51] 및 미국 특허 공보 번호 20050064474 (예를 들어, 실시예 6-11)에 기술된 GFP 시스템에서 테스트하였다. 간략하게, Invitrogen Lipofectamine 2000 프로토콜에 따라 샘플 당 2 ㎕의 리포펙타민 2000을 사용하여, 각각의 ZFN 50 ng 및 프로모터가 없는 GFP 도너 ([Urnov (2005) Nature]) 500 ng을 500,000개의 리포터 세포 내로 형질감염시켰다.
빈블라스틴을 형질감염 24시간 후 0.2 uM의 최종 농도로 첨가하고, 형질감염 72시간 후 제거하였다.
Guava 벤치탑 FACS 분석기 상에서 형질감염 당 40,000개의 세포를 측정함으로써 세포를 형질감염 5일 후 GFP 발현에 대해 분석하였다. 결과가 도 69에 제시된다.
실시예 16: 옥수수 HiII 세포에서의 C3H1 ZFN의 발현
A. 벡터 디자인
옥수수 세포에서의 ZFN 단백질의 발현을 위한 플라스미드 벡터를 구축하였다. 기능성 아연-손가락 뉴클레아제 이종이량체를 형성하는데 필요한 2개의 별개의 단백질의 발현 및 상대적인 화학량론을 최적화하기 위해, 양쪽 ZFN 단량체의 오픈 리딩 프레임이 단일 벡터 상에 삽입되어 단일 프로모터에 의해 구동되도록 하는 발현 전략이 채택되었다. 이러한 전략은 토세아 아시그나(Thosea assigna) 바이러스로부터 유래된 2A 서열 ([Mattion, N.M., Harnish, E.C., Crowley, J.C. & Reilly, P.A. (1996) J. Virol. 70, 8124-8127]), 불투명-2 유전자 (op-2)로부터의 옥수수 핵 국소화 (NLS) 신호 ([Maddaloni, M., Di Fonzo, N., Hartings, H., Lazzaroni, N., Salaminil, F., Thompson, R., & Motto M. (1989) Nucleic Acids Research Vol. 17(18):7532]), 및 옥수수 유비퀴틴-1 유전자로부터 유래된 프로모터 ([Christensen A.H., Sharrock R.A., & Quail P.H. (1992) Plant Mol Biol. 18(4):675-89])의 기능성을 활용한다. 라이브러리 보관소로부터 선별되거나 신생(de novo) 합성된 ZFN-코딩 유전자들의 임의의 소정의 쌍에 대한 이러한 발현 벡터들을 개발하기 위해 계단식 모듈형 클로닝 계획이 고안되었다.
먼저, pVAX 벡터 (예를 들어 미국 특허 공보 2005-0267061 (이의 개시내용은 거명에 의해 본원에 포함됨)를 도 65, 패널 A 내지 E에 제시된 바와 같이 N-말단 발현 도메인을 포함하도록 변형시켰다. 이러한 변형된 플라스미드 (pVAX-N2A-NLSop2-EGFP-FokMono) (도 65A)의 양상은 옥수수 op-2로부터 유래된 NLS를 코딩하는 재디자인 및 합성된 절편 (RKRKESNRESARRSRYRK, 서열 133), 및 옥수수 코돈-편향물을 사용하는 FokI 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 재디자인 및 합성된 절편을 포함한다. 추가적으로, 독특한 XhoI 부위의 하류의 단일 뉴클레오티드 삽입 (C)으로 클로닝 편의를 위한 추가적인 SacI 부위가 생성되었다.
두번째로, pVAX 벡터 (예를 들어 미국 특허 공보 2005-0267061 참조)를 C-말단 발현 도메인을 포함하도록 또한 변형시켰다. 이러한 변형된 플라스미드 (pVAX-C2A-NLSop2-EGFP-FokMono) (도 65B)의 양상은 옥수수 op-2로부터 유래된 NLS를 코딩하는 재디자인 및 합성된 절편 (RKRKESNRESARRSRYRK, 서열 133), 및 옥수수 코돈-편향물을 사용하는 FokI 뉴클레아제 도메인을 코딩하는 재디자인 및 합성된 절편을 포함한다. 추가적으로, 토세아 아시그나 바이러스로부터의 2A 서열 (EGRGSLLTCGD VEENPGP, 서열 134)이 2개의 단백질 코딩 도메인을 추후에 연결시키려는 목적으로 ZFN ORF의 N-말단에 도입되었다.
개별적인 아연-손가락 단백질들의 ORF를 코딩하는 유전자 카셋트들을 상용성 말단을 생성시키기 위해 제한 효소 KpnI 및 BamHI을 사용하는 결찰을 통해 N2A 또는 C2A 벡터 내로 클로닝하였다. 이어서, C2A 벡터로부터의 BglII/XhoI 단편을 N2A 벡터 내로 동일한 제한 부위를 통해 삽입하여, NcoI 및 SacI 제한 부위가 플랭킹된 2개의 ZFN-코딩 도메인을 포함하는 카셋트를 함유하는 중간체 구축물을 산출시켰다.
마지막으로, 양쪽 ZFN 유전자를 함유하는, 이러한 중간체 구축물로부터의 NcoI/SacI 카셋트 (도 65C)를 이러한 효소들을 사용하는 제한을 통해 절제하고, 플라스미드 골격 pDAB3872 (도 65D) 내로 결찰시켰다. 생성된 플라스미드는 ZFN 유전자 + 관련된 프로모터 및 종결인자 서열, + 플라스미드 유지에 대한 선별성 마커를 포함한다.
최종 구축물 (도 65E에 예가 제시됨)에서, ZFN 발현 카세트 (프로모터 및 종결인자 요소 포함)에 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터의 Gateway 시스템을 사용하는 편리한 조작을 위한 attL 부위가 플랭킹된다. 이러한 클로닝 전략을 사용하여 생성된 각각의 ZFN 구축물들을 대장균 DH5a 세포 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) 내로 형질전환시키고, 이어서 적합한 선별 하에 유지시켰다.
B. DNA 전달 및 일시적인 발현
도 65E에 기술된 바와 같이 구축된 ZFN 발현 벡터의 플라스미드 제제가 제작사의 권고사항에 따라 Qiagen (Valencia, CA)의 엔도뉴클레아제-프리(free) Gigaprep 키트를 사용하여 LB 배지 + 항생제에서 성장된 대장균 세포의 2ℓ 배양물로부터 생성되었다. 다양한 방법을 사용하여 옥수수 HiII 배양 세포에 플라스미드가 직접 전달되었다.
한 예에서, 옥수수 세포에 Whiskers™을 통해 DNA를 전달하였다. DNA를 전달하기 약 24시간 전에, 3 ㎖ PCV의 HiII 옥수수 현탁액 세포 + 7 ㎖의 컨디셔닝 배지를 125 ㎖ 삼각 플라스크 내의 20 ㎖의 GN6 액체 배지 (Gelrite가 없는 GN6 배지) 내로 하위배양하고, 125 rpm, 28℃의 진탕기 상에 24시간 동안 놓았다. 2 ㎖ PCV를 제거하여 125 ㎖ 삼각 플라스크 내의 12 ㎖ GN6 S/M 삼투성 배지 (N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 45.5 g/ℓ 소르비톨, 45.5 g/ℓ 만니톨, 100 ㎎/ℓ 마이오이노시톨, pH 6.0)에 첨가하였다. 적당하게 교반하면서 (125 rpm), 플라스크를 암실에서 30-35분 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 이러한 시간 동안, 적당한 부피의 GN6 S/M 액체 배지를 미리 칭량된 무균성 휘스커에 첨가함으로써 탄화규소 휘스커 (Advanced Composite Materials, Inc. (Eureka Springs, AK))의 50 ㎎/㎖ 현탁액을 제조하였다. GN6 S/M에서의 인큐베이션 후, 각각의 플라스크의 내용물을 15 ㎖ 원뿔형 원심분리 튜브에 부었다.
세포들이 침강된 후, 거의 1 ㎖의 GN6 S/M 액체를 따라내어 추후의 사용을 위해 125 ㎖ 플라스크에 수집하였다. 휘스커의 미리 습윤화된 현탁액을 최대 속도로 60초 동안 와동시키고, 160 ㎕를 대구경의 여과된 피펫 팁을 사용하여 원심분리 튜브로 옮기고, 20 ㎍ DNA를 첨가하였다. 튜브를 '손가락으로 와동'시키고, 즉시 Caulk 'Vari-Mix II' 치과용 아말감혼합기 내에 놓고, 17×100 ㎜ 배양 튜브를 홀딩하도록 변형시킨 후, 60초 동안 중간 속도에서 교반하였다. 교반 후, 세포, 배지, 휘스커 및 DNA의 칵테일을 18 ㎖의 추가적인 GN6 액체 배지와 함께 삼각 플라스크로 돌려보냈다. 암실에서 2시간 동안 28℃에서 125 RPM의 진탕기 상에서 세포가 회수되도록 하였다.
약 5-6 ㎖의 분산된 현탁액을 샘플 당 5-6개의 필터가 수득되도록 하우스 진공 라인에 연결된 유리 세포 수집기 유닛을 사용하여 Whatman #4 필터지 (5.5 cm) 상에서 여과하였다. 필터를 GN6 배지의 60×20 mm 플레이트 상에 놓고, 28℃에서 암실 조건 하에 배양하였다. 24시간, 48시간, 또는 72시간 후, 2-5개의 필터지로부터의 세포를 긁어내어 튜브 내로 수집하고, 드라이 아이스 상에 놓은 후, -80℃에서 냉동시켰다.
DNA 전달의 또다른 예에서, 정제된 엔도뉴클레아제-프리 플라스미드 제제를 기기 제작사의 프로토콜로부터 개조된 미세발사 포격 기술을 사용하여 옥수수 세포에 직접 전달하였다. 모든 포격은 Biolistic PDS-1000/He™ 시스템 (Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA))으로 수행되었다. 입자 코팅을 위해, 1.0 마이크로미터 직경의 금 입자 3 ㎎을 100％ 에탄올로 1번, 무균 증류수로 2번 세정하고, 실리콘화 에펜도르프 튜브 내의 50 ㎕의 물에 재현탁시켰다. 5 ㎍의 플라스미드 DNA, 20 ㎕의 스퍼미딘 (0.1 M) 및 50 ㎕ 염화칼슘 (2.5 M)을 금 현탁액에 첨가하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 10K rpm에서 10초 동안 펠렛화시키고, 60 ㎕의 저온 100％ 에탄올에 재현탁시키고, 8-9 ㎕를 각각의 마크로캐리어 상에 배분하였다. 포격용 세포를 제조하기 위해, 세포 클러스터를 하위배양 3일 후 액체 배양물로부터 제거하여, 페트리접시 내의 성장 배지 + 각각 0.256 M의 만니톨 및 소르비톨로 구성된 삼투성 배지의 직경 2.5 cm의 원 안에 놓았다. 포격하기 전에 4시간 동안 세포를 삼투압조절제(osmoticum) 내에서 인큐베이션하였다. 조직을 1100 psi 및 27 인치의 Hg 진공의 조건 하에 중간 선반 상에 놓고 조작 지침서를 따름으로써 상기 기술된 기기 내에서 포격이 일어났다. 처리 후 24시간의 시점에, 포격된 세포 클러스터를 수확하고, 액체 N2에서 냉동하여, -80℃에서 보관하였다.
옥수수 세포에서의 ZFN의 DNA 전달 및 일시적인 발현의 또다른 예는 원형질체 제제의 활용을 수반하였다. [Mitchell and Petolino (1991) J. Plant. Physiol. 137: 530-536] 및 [Lyznik et al. (1995) Plant J. 8(2): 177-186]로부터 변형된 방법을 사용하여, 원형질체를 HiII 옥수수 세포 배양물로부터 제조하였다. 하위배양 48시간 후에 (중간-로그 성장), 1000 rpm에서 5분 동안의 원심분리에 의해 현탁 배양물을 수확하였다. 배양 배지를 제거하고, 5 ㎖의 패킹된 PCV를 10 ㎖ W5 배지 (154 mM NaCl2; 125 mM CaCl2 H2O; 5 mM KCl2; 5 mM 글루코스; pH 5.8)에서 부드럽게 세정하였다.
세정된 세포를 100 rpm에서 5분 동안의 원심분리를 통해 수집하고, 이어서 25 ㎖의 필터 살균 K3 배지 (2.5 g KNO3; 250 ㎎ NH4NO3; 900 ㎎ CaCl2 (2수화물); 250 ㎎ Mg2SO4; 250 ㎎ NH4SO4; 150 ㎎ NaPO4 (1염기성); 250 ㎎ 자일로스; 10 ㎖ 황산제1철/킬레이트 스톡 (F318); 1 ㎖ B5 미량영양소 (10000× 스톡 - 750 ㎎ 요오드화칼륨; 250 ㎎ 몰리브덴산 (나트륨 염) 2수화물; 25 ㎎ 염화코발트; 25 ㎎ 황산구리); 10 ㎖ K3 비타민 (100× 스톡 - 1 g 마이오-이노시톨; 10 ㎎ 피리독신 HCl; 100 ㎎ 티아민 HCl; 10 ㎎ 니코틴산); + 0.6M 만니톨; pH=5.8) 내의 3％ Cellulase Y-C + 0.3％ 펙토리아제(pectolyase) Y23 (Karlan Research Products Corp. (Cottonwood, AZ))을 함유하는 효소 칵테일에서 인큐베이션하였다. 2차 식물 세포벽을 소화시키기 위해 세포를 부드럽게 교반 (50 rpm)하면서 25℃에서 5-6시간 동안 인큐베이션하였다.
세포벽이 분해되면, 효소-세포 혼합물을 100 마이크로미터 세포 여과기를 통해 여과하고, 원형질체 및 세포 잔해물을 함유하는 통과물을 동일한 부피의 K3 + 0.6M 만니톨 배지로 세정하였다. 원형질체를 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 폐기하고, 세정을 반복하였다. 세정된 원형질체 펠렛을 20 ㎖ K3 + 0.6M 만니톨 + 9％ Ficoll 400 용액 내에 재현탁시켰다. 이러한 용액 10 ㎖를 2개의 무균성 플라스틱 튜브 내로 분배하고, 2 ㎖의 TM 배지 (19.52 g MES; 36.45 g 만니톨; 40 ㎖ 2M CaCl2 H2O 스톡; pH=5.5))를 현탁액 상에 부드럽게 놓아서, 불연속 구배를 형성시켰다.
800 rpm에서 5분 동안의 원심분리를 통해 가시적인 원형질체를 가시적이지 않은 원형질체, 세포 잔해물 및 무손상 현탁액 세포로부터 분리하였다. 구배 계면에서 형성된 독특한 원형질체 밴드를 피펫으로 제거하고, 10 ㎖의 신선한 TM 용액으로 세정한 후, 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 생성된 원형질체 펠렛을 1 ㎖의 TM 배지에 재현탁시키고, 혈구계에서 25 ㎎/㎎ 플루오레세인 디아세테이트 (FDA) 염색으로 가시적인 원형질체의 개수를 정량하였다. 원형질체 용액을 TM 배지에서 1×107 개의 원형질체/㎖의 최종 농도로 조정하였다.
약 1×106 개의 원형질체 (100 ㎕)를 10-80 ㎍의 정제된 플라스미드 DNA를 함유하는 2 ㎖ 에펜도르프 튜브로 옮겼다. 100 ㎕의 40％ PEG-3350 (Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO)) 용액을 적가하고, 현탁액을 부드럽게 혼합하였다. 원형질체/DNA 혼합물을 30분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 1 ㎖ GN6 성장 배지로 적가 희석하였다. 희석된 원형질체를 이러한 배지 내에서 24 시간 동안 25℃에서 인큐베이션하고, 이어서 수확하고, 액체 N2에서 냉동하여 -8O℃에서 보관하였다.
실시예 17: 시험관내 ZFN 기능성
본 실시예에서의 ZFN의 기능성은 작물 종의 세포에서 발현되는 ZFN의 능력, 및 이러한 ZFN이 자신의 원하는 표적의 인식, 표적에의 결합 및 표적의 절단을 통해 이러한 작물의 내인성 게놈에서의 이중 가닥 파손을 매개하는 능력을 포함하는 (그러나, 이에 한정되지는 않는) 것으로 이해된다. 본 실시예에서, ZFN의 표적이 작물 게놈 내의 내인성 유전자좌 및 형상인 것으로 또한 이해된다.
조작된 ZFN에 게놈 환경 내의 예상 표적 유전자에 대한 기능성이 있는지 여부를 평가하기 위해, DNA-서열 기반 분석법이 개발되었다. ZFN-유도 이중-가닥 DNA 파손은 복구 메커니즘 예컨대 비-상동 말단 연결 (NHEJ)을 유도할 것으로 예측된다 (Cahill et al., (2006) Mechanisms Front Biosci. 1(11): 1958-76]에서 리뷰됨). NHEJ의 한가지 결과는 파손된 DNA 가닥의 일부분이 불완전한 방식으로 복구되어, 절단 부위에서 소형 결실, 삽입 또는 치환이 초래될 것이라는 것이다. 당업자는 다양한 방법을 통해 DNA 서열에서의 이러한 변화를 검출할 수 있다.
A. PCR-기반 클로닝 및 서열분석
한 예에서, ZFN 단백질을 발현하는 옥수수 HiII 배양 세포를 형질전환 24시간 후 단리하고, 냉동시키고, Qiagen (Valencia, CA)의 Plant DNeasy 추출 키트를 사용하여 제작사의 권고사항에 따라 게놈 DNA를 추출하였다. 표적 유전자에 특이적이고 ZFN의 예상 절단 부위에 플랭킹된 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하여 PCR 증폭을 수행하였다. 표적화된 IPP2-K 유전자 파라로그에 특이적인 전방향 PCR 프라이머 (5'-GGAAGCATTATTCCAATTTGATGATAATGG-3') (서열 135) 및 역방향 PCR 프라이머 (5'-CCCAAGTGTCGAGGTTGTCAATATGTTAC-3') (서열 136)를 조합하여 사용하여, 정제된 게놈 DNA를 하기의 조건 하에 증폭시켰다: 효소 제작사의 완충제 내의 20 ng의 gDNA 주형, 20 pmol의 각각의 프라이머, 1％ DMSO 및 10 유닛의 Accuprime Pf 폴리머라제 (Invitrogen (Carlsbad, CA))를 함유하는 25 ㎕의 반응 부피. 95℃-1', (95℃-30", 61℃-30", 72℃-1')×30, 72℃-5', 4℃-유지로 구성된 증폭 사이클로부터 예상된 크기의 증폭 생성물이 생성되었다.
증폭된 단편을 Invitrogen (Carlsbad, CA)으로부터의 TA 클로닝 키트를 사용하여 벡터 pCR2.1 (Invitrogen (Carlsbad, CA)) 내로 직접 클로닝하였다. 단리된 클로닝된 단편을 CEQ Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Beckman Coulter (Fullerton, CA))로 제작사의 권고사항에 따라 96웰 포맷으로 서열분석하였다. 이러한 실험에서, ZFN 단백질이 2개의 짧은 IPP2-K 유전자-특이적 서열에 결합하여, 도 66에 제시된 바와 같이 ds-DNA를 절단하는 이종이량체성 뉴클레아제가 생성되는 것으로 예측된다.
여러 클론으로부터의 서열분석 결과의 분석은 클론 #127이 정확하게 ZFN의 예상 절단 부위에서 소형 결실을 함유하였음을 나타냈고, 이는 NHEJ 메커니즘이 이러한 부위에서의 DNA 서열의 불완전한 복구를 매개하였음을 가리킨다 (도 67).
이러한 결과는 곡물 종 내의 내인성 유전자좌에서 특이적인 방식으로 표적화된 이중 가닥 파손을 유도하는 이러한 조작된 ZFN의 능력을 나타낸다.
B. 대규모 병렬 서열분석
또다른 예에서, PCR 및 대규모-병렬 파이로시퀀싱(pyrosequencing) 방법의 조합을 이러한 동일한 서열에 대해 표적화된 상이한 ZFN 단백질들을 발현하는 여러 세포 샘플의 게놈에 질의하는데 적용하였다. 전방향 PCR 프라이머의 3개의 변이체 (5'-XXXCACCAAGTTGTATTGCCTTCTCA-3') (서열 137) [식중 XXX = GGG, CCC, 또는 GGC이다] 및 역방향 PCR 프라이머의 3개의 변이체 (5'-XXXATAGGCTTGAGCCAAGCAATCTT-3') (서열 138) [식중 XXX = GCC, CCG 또는 CGG이다]를 합성하였다 (IDT (Coralville, IA)). 각각의 프라이머의 5'-말단에서의 3-bp 태그는 식별인자 키(key)로 작용하고, 어떤 세포 샘플에서 앰플리콘(amplicon)이 기원하는지를 가리킨다. 매칭되는 식별인자 태그 (키)가 있는 프라이머 쌍들을 조합하여 사용하여, 하기의 조건 하에 옥수수 세포 샘플로부터 유래된 정제된 게놈 DNA를 증폭시켰다: 효소 제작사의 완충제 내의 40 ng의 gDNA 주형, 20 pmol의 각각의 프라이머, 1％ DMSO 및 10 유닛의 Accuprime Pf 폴리머라제 (Invitrogen (Carlsbad, CA))를 함유하는 50 ㎕의 반응 부피. 95℃-1', (95℃-30", 65℃-30", 72℃-1')×30, 72℃-5', 4℃-유지로 구성된 증폭 사이클로부터 예상된 크기의 증폭 생성물이 생성되었고, 이를 Qiagen (Valencia, CA)의 MinElute PCR 정제 키트를 사용하여 제작사의 권고사항에 따라 정제하였다.
대규모 병렬 파이로시퀀싱 반응 (454 서열분석으로 또한 알려짐)을 454 Life Sciences (Branford, CT)에 의해 [Margulies et al. (2005) Nature 437: 376-380]에 기술된 바와 같이 PCR 생성물 상에 직접 수행하였다. DNA 분자 내의 예상된 크기 및 위치의 결실을 함유하는 서열 판독물을 확인함으로써 454 서열분석 결과의 분석을 수행하였다.
이러한 분석의 결과는 도 68에 제시된 바와 같은, 이러한 ZFN에 대한 예상된 절단 부위에서의 여러 소형 결실의 존재를 가리킨다. 이러한 결실은 ZFN 표적 부위에 정확하게 국소화되고, ZFN에 의해 유도된 ds 파손이 게놈 내에서 생성된 후 NHEJ에 의해 복구되었음을 가리킨다. 이러한 결과는 곡물 종 내의 내인성 유전자좌에서 특이적인 방식으로 표적화된 이중 가닥 파손을 유도하는 이러한 조작된 ZFN들의 능력을 추가로 설명한다.
실시예 18: 표적화된 삽입을 위한 도너 DNA 디자인
본 실시예에서, 도너 DNA는 식물 세포 내로 전달되어 핵 게놈 내로 혼입되는 이중-가닥 DNA 분자를 포함하는 것으로 이해된다. 이러한 혼입이 일어나는 메커니즘은 핵 DNA 내의 이중 가닥 파손 부위에서의 상동성-비의존적 비-상동 말단 연결 (NHEJ; [Cahill et al., (2006) Mechanisms Front Biosci. 1: 1958-76]에 리뷰됨) 또는 또다른 유사한 메커니즘을 통한 것일 수 있다. 게놈 내로의 도너 DNA의 이같은 NHEJ에 의해 구동되는 결찰 유사 혼입은 무작위 삽입으로 지칭되는데, 도너 DNA의 통합 위치가 이중 가닥 DNA 파손의 존재에 의해 주로 결정되기 때문이다. 이러한 메커니즘에서, 게놈 내로의 도너 DNA 통합은 파손 부위에서의 게놈의 뉴클레오티드 서열 또는 도너 자체의 뉴클레오티드 서열에 의존적이지 않다. 따라서, 무작위 통합 동안, 도너 DNA가 혼입되는 게놈 내의 "주소"는 도너 DNA의 서열을 기초로 구체화 또는 예측되지 않는다. 무작위 통합은 살아있는 식물 세포 내로의 아그로박테리움- 또는 바이오리스틱-매개 DNA 전달을 통한 표준 식물 형질전환 동안 도너 DNA의 트랜스제네시스(transgenesis)가 일어나는 주요 메커니즘이다.
무작위 통합과 반대로, 도너 DNA는 표적화된 통합을 통해 또한 게놈 내로 혼입될 수 있다. 표적화된 통합은 상동성-의존적 메커니즘 예컨대 상동성-의존적 단일 가닥 어닐링 또는 상동 재조합을 통해 이중 가닥 파손 부위 (위치)에서 일어나는 것으로 이해된다 ([van den Bosch et al. (2002) Biol Chem. 383(6): 873-892]에서 리뷰됨). 상동성-의존적 DNA 파손 복구의 경우, 파손 부위에서의 DNA와 동일성 또는 상동성이 있는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 도너 DNA가 이러한 부위에서 혼입될 수 있다. 따라서, 도너 DNA가 게놈 내로 혼입되는 "주소"는 게놈과 도너 DNA 분자 간의 뉴클레오티드 서열 동일성 또는 서열 유사성을 기초로 한다. 식물 시스템에서, DNA 내의 이중-가닥 파손의 복구는 NHEJ 및 상동성-의존적 경로 양쪽 모두를 활용하는 것으로 공지되어 있다 ([Puchta (2005) J. Exp. Bot. 56: 1-14]에서 리뷰됨).
본 실시예에서, 서열-특이적 ZFN 단백질에 의해 유도된 이중 가닥 파손 부위에서 표적화된 통합을 통해 게놈 내로 통합되는 도너 DNA 분자의 디자인 및 구축이 기술된다. 상이한 ZFN 단백질들이 표적 유전자 서열 내의 상이한 뉴클레오티드들에서 이중-가닥 파손을 유도할 수 있다; 유도된 이중 가닥 파손의 특정 부위가 위치로 지칭된다.
실시예 13에 기술된 바와 같이, 본 발명가들은 표적 유전자인 옥수수로부터의 IPP2K의 뉴클레오티드 서열을 특성화하였다. 이어서, 이러한 표적 유전자의 특정 염기에 결합하는 ZFN 단백질들을 디자인하였고 (실시예 14), 표적 유전자 내의 이러한 서열에서의 이들의 결합/절단 활성을 이종성 시스템에서 및 옥수수 세포 내의 내인성 유전자에 대해서 확인하였다 (실시예 15-17). 본 실시예에서는, 표적화된 통합을 통해 IPP2K 유전자 내의 ZFN-매개 이중 가닥 파손 위치에서 옥수수 게놈 내로 혼입되도록 디자인된 다양한 도너 분자의 구축이 기술된다. 당업자는 뉴클레오티드 서열이 공지되어 있고 이러한 서열이 이중 가닥 파손을 함유하는 것으로 예측되는 임의의 게놈 내의 임의의 위치에서 상동성에 의해 구동되는 표적화된 통합을 통해 ZFN-유도 이중 가닥 파손 내로 혼입되도록 디자인된 도너 DNA 분자를 구축할 수 있다.
본원에 기술된 한 실시양태에서, 도너 DNA 분자는 표적화된 위치에서 표적 유전자 IPP2K의 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열의 절편들이 결합된 자율 제초제-내성 유전자 발현 카세트를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 자율 제초제 내성 카셋트는 프로모터, 제초제 내성 유전자, 및 식물 세포에서 기능성인 것으로 알려진 종결인자 서열을 함유하는 완전한 프로모터-전사 단위 (PTU)를 포함하는 것으로 이해된다. 당업자는 자율 PTU를 구성하도록 임의의 프로모터, 유전자 및 종결인자 조합을 선별할 수 있다. 지시된 위치에서 옥수수 내의 표적 유전자 (IPP2K)에 대한 서열 동일성이 있는 DNA 단편들이 이러한 플라스미드 구축물 상에 또한 포함된다. 이러한 단편들은 도너 DNA의 "상동성 플랭크"로 작용하고, 이러한 도너가 특정 위치에서 표적화된 통합을 통해 표적 유전자 내로 혼입되도록 한다. 상동성 플랭크들은 PTU에 대해 올바른 5'- → 3'- 배향으로 PTU의 상류 및 하류 양쪽 모두에 놓인다. 당업자는 도너 DNA 구축물 내의 다양한 크기 및 배향의 상동성 플랭크들을 구현할 수 있다.
본원에 기술된 또다른 실시양태에서, 도너 DNA 분자는 표적 위치에서 IPP2K의 서열과 동일한 뉴클레오티드 서열의 절편들이 결합된 비-자율 제초제-내성 유전자 발현 카세트를 포함한다. 이러한 실시양태에서, 비-자율 제초제 내성 카셋트는 기능성 프로모터가 없는 불완전한 프로모터-전사 단위 (PTU)를 포함하는 것으로 이해된다. 비-자율 PTU는 제초제 내성 유전자, 및 식물 세포에서 기능성인 것으로 알려진 종결인자 서열을 함유한다. 당업자는 비-자율 PTU를 구성하도록 임의의 유전자 및 종결인자 조합을 선별할 수 있다. 비-자율 도너의 이러한 예에서, 제초제 내성 유전자의 발현은 유전자의 발현을 구동할 수 있는 기능성 프로모터에 근접한 게놈 위치 내로의 도너 절편의 혼입에 의존적이다. 도너가 우연한 프로모터가 존재하여 제조제 내성 유전자의 발현을 구동시키는데 이용가능한 유전자좌 내로 무작위 통합을 통해 혼입되는 비교적 드문 상황이 구현될 수 있다. 별법적으로, 도너 DNA 구축물 내에 옥수수 내의 특정 위치에서의 표적 유전자에 대한 서열 동일성이 있는 적합한 길이의 DNA 단편의 상동성 플랭크가 존재하는 것을 기초로, 특정 위치에서의 표적 유전자 내로의 도너 DNA의 정확한 표적화된 통합이 일어날 수 있고 (자율 도너에 대해 기술된 바와 같이), 따라서 상기 표적 유전자의 내인성 프로모터를 이용할 수 있다. 이러한 실시양태에서, 상동성 플랭크들은 PTU에 대해 올바른 5'- → 3'- 배향으로 PTU의 상류 및 하류 양쪽 모두에 놓인다. 당업자는 도너 DNA 구축물 내의 다양한 크기 및 배향의 상동성 플랭크들을 구현할 수 있다.
본원에 기술된 양쪽 실시양태 (자율 및 비-자율 도너 디자인)에서, 플라스미드 구축물들은 클로닝, 제초제 내성 유전자의 발현, 및 후속 분석을 가능하게 하는 추가적인 요소들을 전형적으로 함유한다. 이같은 요소들에는 박테리아 복제 기원, 조작된 제한 부위 등이 포함되고, 하기에 기술된다. 당업자는 도너 DNA 분자를 이루는 여러 요소들의 활용을 구현할 수 있다.
A. 박테리아 균주 및 배양 조건
대장균 균주 (One Shot® Top 10 화학적 수용성 세포; MAX Efficiency® DH5α™ 화학적 수용성 세포, Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))를 37℃에서 16시간 동안 루리아-베르타니(Luria-Bertani) 브로스(broth) (LB: 10 g/ℓ 박토-트립톤(Bacto-tryptone), 10 g/ℓ NaCl, 5 g/ℓ 박토-효모(Bacto-yeast) 추출물), LB 한천 (LB 브로스 + 15 g/ℓ 박토-한천(Bacto-agar)), 또는 테리픽(Terrific) 브로스 (TB: 12 g/ℓ 박토-트립톤, 24 g/ℓ 박토-효모 추출물, 0.4％ v/v 글리세롤, 17 mM KH2PO4, 72 mM K2HPO4)를 사용하여 성장시켰다. 액체 배양물을 200 rpm에서 진탕시켰다. 클로람페니콜 (50 ㎍/㎖), 카나마이신 (50 ㎍/㎖), 또는 앰피실린 (100 ㎍/㎖)을 필요에 따라 배지에 첨가하였다. 이러한 연구에서 사용된 모든 항생제, 배양 배지 및 완충제 시약을 Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO) 또는 Difco Laboratories (Detroit, MI)에서 구입하였다.
B. 플라스미드 골격 위치-1
IPP2K의 위치-1에 대한 상동성 플랭크들을 함유하는 플라스미드 골격을 조작하여, 임의의 도너 DNA 서열이 IPP2K 유전자의 상응하는 표적 부위 내로 통합되도록 하였다. 당업자는 다양한 클로닝 부위, 모듈형 디자인 요소 및 당해 게놈 내의 임의의 표적 서열에 상동성인 서열을 사용하여 플라스미드 골격을 구현할 수 있다. 본 실시예에서 예시된 플라스미드 골격은 기본 플라스미드 벡터 pBC SK(-) 파지미드 (3.4 Kbp) (Stratagene (La Jolla, CA))에서 유래되었다. 하기에 기술된 4-단계 합성을 사용하여, 위치-1 플라스미드 골격을 구축하였다.
단계 #1에서, 기본 플라스미드를 제조하였다. 3 ㎍의 pBC SK(-)를 10 유닛의 SpeI 및 10 유닛의 NotI (New England Biolabs (Beverly, MA)) 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 1시간 동안 37℃에서 선형화시켰다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE (0.04 M 트리스-아세테이트, 0.002 M EDTA) 아가로스 젤 (Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO))에서 전기영동하였다. UV광으로 DNA 단편을 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더(ladder) (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))와의 비교에 의해 추정하였다. 3.4 Kbp의 SpeI/NotI로 소화된 서브클로닝 벡터 pBC SK(-)를 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다.
단계 #2에서, IPP2K 위치-1로부터의 5'- 및 3'-상동성 플랭크들을 단리하였다. 하기의 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)에서 표준 탈염 조건 하에 합성되었고, 0.125 ㎍/㎕의 농도로 물로 희석되었다:
5'-GCGGCCGCGTCTCACCGCGGCTTGGGGATTGGATACGGAGCT -3' (서열 143)
5'-ACTAGTGATATGGCCCCACAGGAGTTGCTCATGACTTG-3' (서열 144)
5'-ACTAGTCCAGAACTGGTTGAGTCGGTCAAACAAGATTGCT-3' (서열 145)
5'-GTCGACCTTGATGCTACCCATTGGGCTGTTGT-3' (서열 146)
PCR 증폭 반응을 TaKaRa Biotechnology Inc. (Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japan)에서 제공되고 하기로 구성된 시약을 사용하여 수행하였다: 5 ㎕의 10× LA PCR™ 완충제 II (Mg2+), 20 ng의 이중-가닥 gDNA 주형 (옥수수 HiII), 10 pmol의 전방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10 pmol의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 8 ㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 33.5 ㎕의 H2O, 0.5 ㎕ (2.5 유닛)의 TaKaRa LA Taq™ DNA 폴리머라제, 1 방울의 미네랄 오일. Perkin-Elmer Cetus, 48-샘플 DNA 열 사이클러 (Norwalk, CT)를 사용하여 하기의 사이클 조건 하에 PCR 반응을 수행하였다: 94℃, 4분/1 사이클; 98℃ 20초, 65℃ 1분, 68℃ 1분/30 사이클; 72℃, 5분/1 사이클; 4℃/유지. 각각의 PCR 반응물 15 ㎕를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 증폭된 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 증폭 생성물이 0.821 Kbp (5'-상동성 플랭크) 또는 0.821 Kbp (3'-상동성 플랭크)의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다.
이러한 단편들을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다. 그후, 정제된 단편들을 pCR2.1 플라스미드 내로 TOPO TA Cloning® 키트 (pCR®2.1 벡터 사용) 및 One Shot® TOP10 화학적 수용성 대장균 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 따라 클로닝하였다.
개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 카나마이신이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘(Falcon) 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타(Costar) 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 5'-상동성 플랭크 클론 플라스미드로부터의 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 SpeI 및 NotI으로 소화시켰다. 3'-상동성 플랭크 클론 플라스미드를 10 유닛의 SpeI 및 20 유닛의 SalI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 소화시켰다. 모든 플라스미드 소화물들을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 플라스미드 클론이 3.9 Kbp pCR®2.1 벡터에 더하여 0.821 Kbp (5'-상동성 플랭크) 또는 0.821 Kbp (3'-상동성 플랭크)의 삽입된 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다.
플라스미드 클론의 이중-가닥 서열분석 반응을 CEQ™ DTCS-Quick Start Kit (Beckman-Coulter (Palo Alto, CA))를 사용하여 제작사가 기술한 바와 같이 수행하였다. 반응물을 Performa DTR 젤 여과 카트리지 (Edge BioSystems (Gaithersburg, MD))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 기술된 바와 같이 정제하였다. 서열 반응물을 Beckman-Coulter CEQ™ 2000 XL DNA 분석 시스템 상에서 분석하였고, 뉴클레오티드를 Sequencher™ 버젼 4.1.4 (Gene Codes Corporation (Ann Arbor, MI))를 사용하여 특성화하였다. IPP2K로부터 유래된 위치-1 5'-상동성 플랭크에 상응하는 0.821 Kbp 단편의 서열이 도 87 (서열 171)에서 제시된다. IPP2K로부터 유래된 위치-1 3'-상동성 플랭크에 상응하는 0.821 Kbp 단편의 서열이 도 88 (서열 172)에서 제시된다.
단계 #3에서, 위치-1 5'-상동성 플랭크들을 기본 플라스미드 내로 결찰시켰다. 올바른 위치-1 5'-상동성 플랭크 서열을 함유하는 클론에 상응하는 제한절단된 단편들을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 여과 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다. 그후, 16℃ 수조에서의 16시간 인큐베이션의 조건 하에 20 ㎕의 반응 부피로 500 유닛의 T4 DNA 리가제 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))를 사용하여 위치-1 5'-상동성 플랭크 (0.821 Kbp)에 상응하는 단편들을 SpeI/NotI로 소화된 정제된 기본 플라스미드 (단계 #1)에 1:5 벡터:삽입물 비율로 결찰시켰다. 이어서 5 ㎕의 결찰 반응물을 대장균 One Shot® Top 10 화학적 수용성 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))에 형질전환시키고, 제작사가 기술한 선별 조건 하에 플레이팅하였다. 개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 카나마이신이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 SpeI 및 NotI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 소화시키고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 플라스미드 클론이 3.4 Kbp 기본 플라스미드에 더하여 0.821 Kbp (5'-상동성 플랭크)의 삽입된 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다.
단계 #4에서, 위치-1 3'-상동성 플랭크들을 단계 #3 생성물 내로 결찰시켰다. 3 ㎍의 단계 #3에서 기술된 조작 생성물을 10 유닛의 SpeI 및 20 유닛의 SalI (New England Biolabs (Beverly, MA)) 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 1시간 동안 37℃에서 선형화시켰다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE (0.04 M 트리스-아세테이트, 0.002 M EDTA) 아가로스 젤 (Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO))에서 전기영동하였다. DNA 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))와의 비교에 의해 추정하였다. 단계 #3으로부터의 약 4.2 Kbp의 SpeI/SalI 소화 생성물을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다.
이어서, 1:5 벡터:삽입물 비율 및 500 유닛의 T4 DNA 리가제 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))를 사용하여 20 ㎕의 결찰 반응물로 단계 #2에서 생성된 3'-상동성 플랭크 도너의 단리된 단편들 (0.821 Kbp)을 상기 기술된 바와 같이 SpeI/SalI로 소화되고 정제된 단계 #3 생성물과 조합하였다. 결찰 반응물을 16시간 동안 16℃ 수조에서 인큐베이션하였다. 결찰 후, 5 ㎕의 결찰 반응물을 MAX Efficiency® DH5α™ 화학적 수용성 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)) 내로 제작사의 권고사항에 따라 형질전환시켰다. 개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 클로람페니콜이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하였다.
배양물들을 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 SpeI 및 NotI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 소화시키고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 클론이 1.64 Kbp (삽입물) 및 3.33 Kbp (기본 플라스미드)의 2개의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 생성된 플라스미드를 pDAB7471 (도 70)로 명명하였다.
C. 플라스미드 골격 위치-2
IPP2K의 위치-2에 대한 상동성 플랭크들을 함유하는 플라스미드 골격을 조작하여, 임의의 도너 DNA 서열이 IPP2K 유전자의 상응하는 표적 부위 내로 통합되도록 하였다. 당업자는 다양한 클로닝 부위, 모듈형 디자인 요소 및 당해 게놈 내의 임의의 표적 서열에 상동성인 서열을 사용하여 플라스미드 골격을 구현할 수 있다. 본 실시예에서 예시된 플라스미드 골격은 기본 플라스미드 벡터 pBC SK(-) 파지미드 (3.4 Kbp) (Stratagene (La Jolla, CA))에서 유래되었다. 하기에 기술된 4-단계 합성을 사용하여, 위치-2 플라스미드 골격을 구축하였다.
단계 #1에서, 기본 플라스미드를 제조하였다. 3 ㎍의 pBC SK(-)를 10 유닛의 SpeI 및 10 유닛의 NotI (New England Biolabs (Beverly, MA)) 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 1시간 동안 37℃에서 선형화시켰다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE (0.04 M 트리스-아세테이트, 0.002 M EDTA) 아가로스 젤 (Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO))에서 전기영동하였다. UV광으로 DNA 단편을 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))와의 비교에 의해 추정하였다. 3.4 Kbp의 SpeI/NotI로 소화된 서브클로닝 벡터 pBC SK(-)를 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다.
단계 #2에서, IPP2K 위치-2로부터의 5'- 및 3'-상동성 플랭크들을 단리하였다. 하기의 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)에서 표준 탈염 조건 하에 합성되었고, 0.125 ㎍/㎕의 농도로 물로 희석되었다:
5'-GCGGCCGCTAGATAGCAGATGCAGATTGCT-3' (서열 147)
5'-ACTAGTATTGGCACCCAGGTGTTGGCTCA-3' (서열 148)
5'-ACTAGTCATGTCGATGGTGGGGTATGGTTCAGATTCAG-3' (서열 149)
5'-GTCGACGTACAATGATTTCAGGTTACGGCCTCAGGAC-3' (서열 150)
PCR 증폭 반응을 TaKaRa Biotechnology Inc. (Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japan)에서 제공되고 하기로 구성된 시약을 사용하여 수행하였다: 5 ㎕의 10× LA PCR™ 완충제 II (Mg2+), 20 ng의 이중-가닥 gDNA 주형 (옥수수 HiII), 10 pmol의 전방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10 pmol의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 8 ㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 33.5 ㎕의 H2O, 0.5 ㎕ (2.5 유닛)의 TaKaRa LA Taq™ DNA 폴리머라제, 1 방울의 미네랄 오일. Perkin-Elmer Cetus, 48-샘플 DNA 열 사이클러 (Norwalk, CT)를 사용하여 하기의 사이클 조건 하에 PCR 반응을 수행하였다: 94℃, 4분/1 사이클; 98℃ 20초, 55℃ 1분, 68℃ 1분/30 사이클; 72℃, 5분/1 사이클; 4℃/유지. 각각의 PCR 반응물 15 ㎕를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 증폭된 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 증폭 생성물이 0.855 Kbp (5'-상동성 플랭크) 또는 0.845 Kbp (3'-상동성 플랭크)의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 이러한 단편들을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다. 그후, 정제된 단편들을 pCR2.1 플라스미드 내로 TOPO TA Cloning® 키트 (pCR®2.1 벡터 사용) 및 One Shot® TOP10 화학적 수용성 대장균 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 따라 클로닝하였다.
개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 카나마이신이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 5'-상동성 플랭크 클론 플라스미드로부터의 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 SpeI 및 NotI으로 소화시켰다. 3'-상동성 플랭크 클론 플라스미드를 10 유닛의 SpeI 및 20 유닛의 SalI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 소화시켰다. 모든 플라스미드 소화물들을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 플라스미드 클론이 3.9 Kbp pCR®2.1 벡터에 더하여 0.855 Kbp (5'-상동성 플랭크) 또는 0.845 Kbp (3'-상동성 플랭크)의 삽입된 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다.
플라스미드 클론의 이중-가닥 서열분석 반응을 CEQ™ DTCS-Quick Start Kit (Beckman-Coulter (Palo Alto, CA))를 사용하여 제작사가 기술한 바와 같이 수행하였다. 반응물을 Performa DTR 젤 여과 카트리지 (Edge BioSystems (Gaithersburg, MD))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 기술된 바와 같이 정제하였다. 서열 반응물을 Beckman-Coulter CEQ™ 2000 XL DNA 분석 시스템 상에서 분석하였고, 뉴클레오티드를 Sequencher™ 버젼 4.1.4 (Gene Codes Corporation (Ann Arbor, MI))를 사용하여 특성화하였다. IPP2K로부터 유래된 위치-2 5'-상동성 플랭크에 상응하는 0.855 Kbp 단편의 서열이 도 89 (서열 139)에서 제시된다. IPP2K로부터 유래된 위치-2 3'-상동성 플랭크에 상응하는 0.845 Kbp 단편의 서열이 도 90 (서열 140)에서 제시된다.
단계 #3에서, 위치-1 5'-상동성 플랭크들을 기본 플라스미드 내로 결찰시켰다. 올바른 위치-2 5'-상동성 플랭크 서열을 함유하는 클론에 상응하는 제한절단된 단편들을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 여과 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다. 그후, 16℃ 수조에서의 16시간 인큐베이션의 조건 하에 20 ㎕의 반응 부피로 500 유닛의 T4 DNA 리가제 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))를 사용하여 위치-1 5'-상동성 플랭크 (0.855 Kbp)에 상응하는 단편들을 SpeI/NotI로 소화된 정제된 기본 플라스미드 (단계 #1)에 1:5 벡터:삽입물 비율로 결찰시켰다.
이어서 5 ㎕의 결찰 반응물을 대장균 One Shot® Top 10 화학적 수용성 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))에 형질전환시키고, 제작사가 기술한 선별 조건 하에 플레이팅하였다. 개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 카나마이신이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 SpeI 및 NotI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 소화시키고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 플라스미드 클론이 3.4 Kbp 기본 플라스미드에 더하여 0.855 Kbp (5'-상동성 플랭크)의 삽입된 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다.
단계 #4에서, 위치-2 3'-상동성 플랭크들을 단계 #3 생성물 내로 결찰시켰다. 3 ㎍의 단계 #3에서 기술된 조작 생성물을 10 유닛의 SpeI 및 20 유닛의 SalI (New England Biolabs (Beverly, MA)) 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 1시간 동안 37℃에서 선형화시켰다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE (0.04 M 트리스-아세테이트, 0.002 M EDTA) 아가로스 젤 (Sigma-Aldrich Corporation (St. Louis, MO))에서 전기영동하였다. DNA 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))와의 비교에 의해 추정하였다. 단계 #3으로부터의 4.25 Kbp의 SpeI/SalI 소화 생성물을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다.
이어서, 1:5 벡터:삽입물 비율 및 500 유닛의 T4 DNA 리가제 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))를 사용하여 20 ㎕의 결찰 반응물로 단계 #2에서 생성된 3'-상동성 플랭크 도너의 단리된 단편들 (0.845 Kbp)을 상기 기술된 바와 같이 SpeI/SalI로 소화되고 정제된 단계 #3 생성물과 조합하였다. 결찰 반응물을 16시간 동안 16℃ 수조에서 인큐베이션하였다. 결찰 후, 5 ㎕의 결찰 반응물을 MAX Efficiency® DH5α™ 화학적 수용성 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)) 내로 제작사의 권고사항에 따라 형질전환시켰다. 개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 클로람페니콜이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하였다. 배양물들을 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 SpeI 및 NotI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 소화시키고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 클론이 약 1.7 Kbp (삽입물) 및 3.33 Kbp (기본 플라스미드)의 2개의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 생성된 플라스미드를 pDAB7451 (도 71)로 명명하였다.
D. 자율 제초제-내성 유전자 발현 카세트 구축
프로모터, 제초제 내성 유전자, 및 폴리아데닐화 (polyA) 종결 서열을 함유하는 완전한 프로모터-전사 단위 (PTU)를 포함하는 자율 제초제-내성 유전자 발현 카세트를 구축하였다 (도 72). 이러한 실시양태에서, 프로모터 서열은 오리자 사티바(O. sativa) 액틴 1 ([McElroy et al., Plant Cell 2, 163-171; 1990]; GenBank 접속번호 S44221 및 GenBank 접속번호 X63830)로부터 유래된다. 제초제-내성 유전자는 제초제 비알라포스(bialaphos)에 대한 저항성을 부여하는 PAT (포스피노트리신 아세틸 트랜스페라제) 유전자 (스트렙토마이세스 비리도크로모게네스(Streptomyces viridochromogenes)로부터 본래 유래된 PAT 코딩 영역 (GenBank 접속번호 M22827; [Wohlleben et al. Gene 70, 25-37; 1988])의 변형된 버젼)를 포함한다. M22827의 최장 오픈 리딩 프레임의 원래 서열에 대한 변형은 실질적이고, 식물에서의 발현을 최적화하도록 코돈 활용 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. 첫번째 코딩되는 아미노산으로 발린이 메티오닌으로 치환되는 것, 및 두번째로 코딩되는 아미노산으로 알라닌이 부가되는 것을 제외하고는, pDAB3014의 PAT 오픈 리딩 프레임으로부터 코딩되는 단백질은 접속번호 M22827의 최장 오픈 리딩 프레임에 의해 코딩되는 것과 동일하다. 재건 버젼의 PAT는 GenBank 접속 번호 I43995에서 확인된다. 종결인자 서열은 제아 메이스 엘(Z. mays L.) 리파제로부터 유래된다 (L35913의 위치 1093의 C가 pDAB3014 내의 위치 2468에서 G로 교체되는 것을 제외하고는 GenBank 접속 번호 L35913의 옥수수 리파제 cDNA 클론). 이러한 옥수수 서열은 PAT 유전자에 대한 3' 비번역 영역/전사 종결인자 영역을 포함한다.
하기의 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)에서 표준 탈염 조건 하에 합성되었고, 0.125 ㎍/㎕의 농도로 물로 희석되었다:
5'-ACTAGTTAACTGACCTCACTCGAGGTCATTCATATGCTTGA-3' (서열 151)
5'-ACTAGTGTGAATTCAGCACTTAAAGATCT-3' (서열 152)
PCR 증폭 반응을 TaKaRa Biotechnology Inc. (Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japan)에서 제공되고 하기로 구성된 시약을 사용하여 수행하였다: 5 ㎕의 10× LA PCR™ 완충제 II (Mg2+), 20 ng의 이중-가닥 gDNA 주형 (pDAB3014 플라스미드 DNA), 10 pmol의 전방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10 pmol의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 8 ㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 33.5 ㎕의 H2O, 0.5 ㎕ (2.5 유닛)의 TaKaRa LA Taq™ DNA 폴리머라제, 1 방울의 미네랄 오일. Perkin-Elmer Cetus, 48-샘플 DNA 열 사이클러 (Norwalk, CT)를 사용하여 하기의 사이클 조건 하에 PCR 반응을 수행하였다: 94℃, 4분/1 사이클; 98℃ 20초, 55℃ 1분, 68℃ 3분/30 사이클; 72℃, 5분/1 사이클; 4℃/유지. 각각의 PCR 반응물 15 ㎕를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다.
증폭된 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 증폭 생성물이 2.3 Kbp의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 이러한 단편을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다. 그후, 정제된 단편을 제작사의 프로토콜에 따라 pCR2.1 플라스미드 내로 TOPO TA Cloning® 키트를 사용하여 클로닝하고, One Shot® TOP10 화학적 수용성 대장균 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)) 내로 형질전환시켰다.
개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 카나마이신이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 SpeI 및 NotI으로 소화시켰다. 모든 플라스미드 소화물들을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다.
제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 플라스미드 클론이 3.9 Kbp pCR®2.1 벡터에 더하여 2.325 Kbp의 삽입된 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 플라스미드 클론의 이중-가닥 서열분석 반응을 CEQ™ DTCS-Quick Start Kit (Beckman-Coulter (Palo Alto, CA))를 사용하여 제작사가 기술한 바와 같이 수행하였다. 반응물을 Performa DTR 젤 여과 카트리지 (Edge BioSystems (Gaithersburg, MD))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 기술된 바와 같이 정제하였다. 서열 반응물을 Beckman-Coulter CEQ™ 2000 XL DNA 분석 시스템 상에서 분석하였고, 뉴클레오티드를 Sequencher™ 버젼 4.1.4 (Gene Codes Corporation (Ann Arbor, MI))를 사용하여 특성화하였다.
E. 플라스미드 골격 내로의 자율 제초제 내성 유전자 카셋트 삽입 - 자율 도너
도너 플라스미드를 생성시키기 위해, 실시예 18D에 기술된 자율 제초제 내성 유전자 카셋트를 실시예 18B 및 18C에 기술된 플라스미드 골격 구축물 내로 삽입하였다. 상기 기술된 2.325 Kbp의 예상 서열 (도 72)을 함유한 클론으로부터 유래된 제한절단된 단편을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다.
그후, 이러한 단편을 제한 효소 SpeI으로 소화되고 이어서 탈인산화된 정제된 pDAB7471 (위치-1 플라스미드 골격, 도 70) 또는 pDAB 7451 (위치-2 플라스미드 골격, 도 71)과 결찰 반응으로 조합하였다. 하기의 조건 하에 결찰을 수행하였다: 1:5 벡터:삽입물 비율 및 500 유닛의 T4 DNA 리가제 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)), 20 ㎕의 반응 부피, 16℃ 수조에서의 16시간 인큐베이션의 조건. 이어서, 5 ㎕의 결찰 반응물을 50 ㎕의 대장균 MAX Efficiency® DH5α™ 화학적 수용성 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)) 내로 형질전환시키고, 제작사가 기술한 선별 조건 하에 플레이팅하였다.
개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 클로람페니콜이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 SpeI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 소화시키고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 플라스미드 클론이 2.325 Kbp 및 약 4.9 Kbp (pDAB7471 벡터) 또는 2.325 Kbp 및 약 5.0 Kbp (pDAB7451 벡터)의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다.
생성된 플라스미드들을 각각 pDAB7422 (위치-1 자율 도너) (도 73) 및 pDAB7452 (위치-2 자율 도너) (도 74)로 명명하였다.
F. 비-자율 제초제-내성 유전자 발현 카세트 구축
불완전한 프로모터-전사 단위 (PTU)를 포함하는 비-자율 제초제-내성 유전자 발현 카세트가 구축되었다 (도 75). 이러한 실시양태에서, 토세아 아시그나 바이러스로부터 유래된 2A 서열 ([Mattion, N.M., Harnish, E.C., Crowley, J.C. & Reilly, P.A. (1996) J. Virol. 70, 8124- 8127]), 제초제 내성 유전자 및 폴리아데닐화 (polyA) 종결 서열의 기능성을 이용하지만 프로모터의 기능성은 이용하지 않는 전략이 사용되었다. 이러한 실시양태에서, 2A 번역 종결 신호 서열이 제초제 내성 유전자와 번역면에서 인-프레임(in-frame)이도록 조작되었다. 또한, IPP2K 유전자 표적의 번역 리딩 프레임과 부합하도록 2A/제초제 코딩 서열이 조작되었다. 제초제-내성 유전자는 제초제 비알라포스에 대한 저항성을 부여하는 PAT (포스피노트리신 아세틸 트랜스페라제) 유전자 (스트렙토마이세스 비리도크로모게네스로부터 본래 유래된 PAT 코딩 영역 (GenBank 접속번호 M22827; [Wohlleben et al. Gene 70, 25-37; 1988])의 변형된 버젼)를 포함한다. M22827의 최장 오픈 리딩 프레임의 원래 서열에 대한 변형은 실질적이고, 식물에서의 발현을 최적화하도록 코돈 활용 패턴을 변경시키는 것을 포함한다. 첫번째 코딩되는 아미노산으로 발린이 메티오닌으로 치환되는 것, 및 두번째로 코딩되는 아미노산으로 알라닌이 부가되는 것을 제외하고는, pDAB3014의 PAT 오픈 리딩 프레임으로부터 코딩되는 단백질은 M22827의 최장 오픈 리딩 프레임 (M22827의 위치 244에서 GTG로 시작함)에 의해 코딩되는 것과 동일하다. 재건 버젼의 PAT는 GenBank 접속 번호 I43995에서 확인된다. 종결인자 서열은 제아 메이스 엘 리파제로부터 유래된다 (L35913의 위치 1093의 C가 pDAB3014 내의 위치 2468에서 G로 교체되는 것을 제외하고는 GenBank 접속 번호 L35913의 옥수수 리파제 cDNA 클론). 이러한 옥수수 서열은 PAT 유전자에 대한 3' 비번역 영역/전사 종결인자 영역을 포함한다.
하기의 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)에서 표준 탈염 조건 하에 합성되었고, 0.125 ㎍/㎕의 농도로 물로 희석되었다:
5'-ACTAGTGGCGGCGGAGAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGC
GGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTAGGATGGCTTCTCCGGAGAGGAGAC
CAGTTGA-3' (서열 153)
5'-ACTAGTATGCATGTGAATTCAGCACTTAAAGATCT-3' (서열 154)
PCR 증폭 반응을 TaKaRa Biotechnology Inc. (Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japan)에서 제공되고 하기로 구성된 시약을 사용하여 수행하였다: 5 ㎕의 10× LA PCR™ 완충제 II (Mg2+), 20 ng의 이중-가닥 gDNA 주형 (pDAB3014 플라스미드 DNA), 10 pmol의 전방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10 pmol의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 8 ㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 33.5 ㎕의 H2O, 0.5 ㎕ (2.5 유닛)의 TaKaRa LA Taq™ DNA 폴리머라제, 1 방울의 미네랄 오일. Perkin-Elmer Cetus, 48-샘플 DNA 열 사이클러 (Norwalk, CT)를 사용하여 하기의 사이클 조건 하에 PCR 반응을 수행하였다: 94℃, 4분/1 사이클; 98℃ 20초, 55℃ 1분, 68℃ 2분/30 사이클; 72℃, 5분/1 사이클; 4℃/유지. 각각의 PCR 반응물 15 ㎕를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 증폭된 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 증폭 생성물이 약 1 Kbp의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 이러한 단편을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다. 그후, 정제된 단편을 제작사의 프로토콜에 따라 pCR2.1 플라스미드 내로 TOPO TA Cloning® 키트를 사용하여 클로닝하고, One Shot® TOP10 화학적 수용성 대장균 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)) 내로 형질전환시켰다.
개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 카나마이신이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 SpeI 및 NotI으로 소화시켰다. 모든 플라스미드 소화물들을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 플라스미드 클론이 3.9 Kbp (pCR®2.1 벡터) 및 약 1 Kbp의 삽입된 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 플라스미드 클론의 이중-가닥 서열분석 반응을 CEQ™ DTCS-Quick Start Kit (Beckman-Coulter (Palo Alto, CA))를 사용하여 제작사가 기술한 바와 같이 수행하였다. 반응물을 Performa DTR 젤 여과 카트리지 (Edge BioSystems (Gaithersburg, MD))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 기술된 바와 같이 정제하였다. 서열 반응물을 Beckman-Coulter CEQ™ 2000 XL DNA 분석 시스템 상에서 분석하였고, 뉴클레오티드를 Sequencher™ 버젼 4.1.4 (Gene Codes Corporation (Ann Arbor, MI))를 사용하여 특성화하였다.
G. 플라스미드 골격 내로의 비-자율 제초제 내성 유전자 카셋트 삽입 - 비-자율 도너
도너 플라스미드를 생성시키기 위해, 실시예 18F에 기술된 비-자율 제초제 내성 유전자 카셋트를 실시예 18B 및 18C에 기술된 플라스미드 골격 구축물 내로 삽입하였다. 올바른 1 Kbp 서열을 함유한 클론에 상응하는 제한절단된 단편을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다. 그후, 이러한 단편을 제한 효소 SpeI으로 소화되고 이어서 탈인산화된 정제된 pDAB7471 (위치-1 플라스미드 골격, 도 70) 또는 pDAB 7451 (위치-2 플라스미드 골격, 도 71)과 결찰 반응으로 조합하였다. 하기의 조건 하에 결찰을 수행하였다: 1:5 벡터:삽입물 비율 및 500 유닛의 T4 DNA 리가제 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)), 20 ㎕의 반응 부피, 16℃ 수조에서의 16시간 인큐베이션의 조건. 이어서, 5 ㎕의 결찰 반응물을 50 ㎕의 대장균 MAX Efficiency® DH5α™ 화학적 수용성 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)) 내로 형질전환시키고, 제작사가 기술한 선별 조건 하에 플레이팅하였다.
개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 클로람페니콜이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 SpeI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 소화시키고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 플라스미드 클론이 1.0 Kbp 및 4.96 Kbp (pDAB7471 벡터) 또는 1.0 Kbp 및 약 5.0 Kbp (pDAB7451 벡터)의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 생성된 플라스미드들을 각각 pDAB7423 (위치-1 비-자율 도너) (도 76) 및 pDAB7454 (위치-2 비-자율 도너) (도 77)로 명명하였다.
H. 위치 1 ZFN + HR 도너 서열: 조합 플라스미드
식물 세포 내로 2개의 별도의 플라스미드 (예를 들어, ZFN 요소를 함유하는 1개의 플라스미드 및 제초제 내성 도너 서열을 함유하는 제2 플라스미드)를 전달하는 것에 대한 별법적인 전략으로서, 본 특허에서 설명된 모든 필요한 요소들을 함유하는 단일 플라스미드를 조작하였다. 본 실시예에 기술된 조합 플라스미드는 특정 IPP2K 유전자좌를 표적으로 하고 여기서 이중-가닥 파손을 생성시키도록 디자인된 ZFN, 뿐만 아니라 이러한 파손 부위 내로 통합되도록 디자인된 자율 PAT PTU 및/또는 비-자율 2A/PAT PTU 및 도너 플랭크 양쪽 모두를 함유한다.
람다 파지를 기초로 하는 부위-특이적 재조합을 사용하는 Gateway® 기술 ([Landy, A. (1989) Ann. Rev. Biochem. 55:913])을 이용하여, 벡터 pDAB7422 및 pDAB7423 (실시예 6E 및 6G에 기술됨)을 Gateway® 목적지 벡터로 전환시켰다. 일단 전환되면, ZFN 발현 카세트를 함유하는 플라스미드 (Gateway® 진입 벡터 내에 하우징(housing)됨)가 목적지 벡터로 쉽게 동원될 수 있어, ZFN/도너 조합 플라스미드가 생성된다. 1 ㎍의 각각의 이같은 플라스미드를 10 유닛의 NotI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 1시간 동안 37℃에서 소화시켰다. NotI 제한 엔도뉴클레아제를 65℃에서 15분 동안 열-불활성화시키고, 이어서 단편 말단들을 3 유닛의 새우 알칼리성 포스파타제 (SAP) (Roche Diagnostics GmbH (Mannheim, Germany))를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 탈인산화시켰다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 벡터 단편 (pDB7422 = 7.317 Kbp, pDAB7423 = 5.971 Kbp)을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하고, 젤에서 절제하고, 이어서 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다.
그후, 이러한 벡터 단편을 Gateway® Technology 요소 attR1, ccdB, CmR, 및 attR2를 함유하는 2.274 Kbp NotI 단편과 하기의 조건 하에서의 결찰 반응으로 조합하였다: 1:5 벡터:삽입물 비율 및 500 유닛의 T4 DNA 리가제 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)), 20 ㎕의 반응 부피, 16℃ 수조에서의 16시간 인큐베이션의 조건. 이어서, 5 ㎕의 결찰 반응물을 50 ㎕의 대장균 One Shot® ccdB Survival™ 화학적 수용성 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)) 내로 형질전환시키고, 제작사가 기술한 선별 조건 하에 플레이팅하였다.
개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 클로람페니콜이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 EcoRI I (New England BioLabs, Inc. (Beverly, MA))으로 소화시키고, 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp DNA 래더와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 플라스미드 클론이 자율 PAT PTU 위치-1 HR 도너에 대한 1.448 Kbp, 1.946 Kbp 및 6.197 Kbp, 및 비-자율 PAT 위치-1 HR 도너에 대한 5.807 Kbp 및 2.438 Kbp의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 생성된 플라스미드들을 각각 pDAB7424 (Gateway® 개조 위치-1 자율 도너) (도 78) 및 pDAB7425 (Gateway® 개조 위치-1 비-자율 도너) (도 79)로 명명하였다.
이러한 클로닝 조작의 결과로서, 플라스미드 pDAB7424 & pDAB7425가 Gateway® 목적지 벡터로 지정되었다. pDAB7412에는 하기의 요소들을 함유하는 Gateway® 진입 벡터로서의 기능성이 있다: ZmUbi1v.2/ZFN12/Zm Per5 3' UTR. ZFN 발현 카세트 (Gateway® 진입 벡터)를 자율 또는 비-자율 도너 분자 (Gateway® 목적지 벡터) 내로 이동시키기 위해, LR Clonase™ II (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA)) 반응을 50 ng (진입 벡터):150 ng/㎕ (목적지 벡터)의 비율로 제작사가 개요한 바와 같이 수행하였다. 생성된 양성 조합 플라스미드를 pDAB7426 (위치-1 자율 HR 도너/ZFN12) (도 80) & pDAB7427 (비-자율 HR 도너/ZFN12) (도 81)로 명명하였다.
실시예 19: 식물 세포 내로의 ZFN 및 도너 DNA 전달
표적화된 통합을 통한 식물 게놈 내로의 도너 DNA의 ZFN-매개 통합을 가능하게 하기 위해, ZFN-코딩 DNA의 전달에 이은 식물 세포에서의 기능성 ZFN 단백질의 발현이 필요한 것으로 이해된다. 기능성 ZFN 단백질이 표적 DNA에서의 이중-가닥 파손을 유도할 수 있고, 그후 이러한 파손이 표적 유전자좌 내로의 도너 DNA의 상동성-구동 통합을 통해 복구되도록, 도너 DNA가 상기 식물 세포 내로 동시에 전달되는 것이 또한 필요하다. 당업자는 기능성 ZFN 단백질의 발현이 ZFN-코딩 구축물의 트랜스제네시스, 또는 ZFN-코딩 구축물의 일시적인 발현을 포함하지만 이에 한정되지 않는 여러 방법에 의해 달성될 수 있다는 것을 구현할 수 있다. 이러한 경우 양쪽 모두에서, 표적화된 통합을 구동시키기 위해 식물 세포 내에서의 기능성 ZFN 단백질의 발현 및 도너 DNA의 전달이 동시에 달성된다.
본 실시예에서 언급된 예에서, 식물 세포 내로 ZFN-코딩 및 도너 DNA를 동시에 전달하는 방법이 실연된다. 당업자는 아그로박테리움-매개 형질전환, 바이오리스틱-기반 DNA 전달 또는 Whiskers™-매개 DNA 전달을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 식물 세포에 적합한 임의의 다양한 DNA-전달 방법을 사용할 수 있다. 본 실시예에 기술된 한 실시양태에서, 도너 DNA와 ZFN-코딩 DNA 구축물의 다양한 조합을 사용하여 Whiskers™-매개 DNA 전달 실험이 수행되었다. 이러한 조합에는 1) ZFN-코딩 서열 및 도너 DNA 양쪽 모두를 함유하는 단일 플라스미드 및 2) 1개는 ZFN-코딩 서열을 함유하고 다른 1개는 도너 DNA를 함유하는 2개의 별도의 플라스미드가 포함된다. 또다른 실시양태에서, 도너 DNA와 ZFN-코딩 DNA 구축물의 다양한 조합을 사용하여 바이오리스틱-기반 DNA 전달이 수행되었다. 당업자는 이러한 조합에 1) ZFN-코딩 서열 및 도너 DNA 양쪽 모두를 함유하는 단일 플라스미드 및 2) 1개는 ZFN-코딩 서열을 함유하고 다른 1개는 도너 DNA를 함유하는 2개의 별도의 플라스미드가 포함될 수 있음을 추론할 수 있다.
A. Whiskers™-매개 DNA 전달
본원에서 앞서 기술된 바와 같이, 옥수수의 배아발생성 Hi-II 세포 배양물을 제조하여, 표적화된 통합이 실연되는 살아 있는 식물 세포의 공급원으로 사용하였다. 당업자는 다양한 식물 종으로부터 유래된 세포 배양물, 또는 다양한 식물 종으로부터 유래된 분화된 식물 조직을 표적화된 통합이 실연되는 살아 있는 식물 세포의 공급원으로 활용하는 것을 구현할 수 있다.
이러한 예에서, 이전에 냉동-보존된 세포주 + 28 ㎖의 컨디셔닝 배지로부터의 12 ㎖ PCV를 500 ㎖ 삼각 플라스크 내의 80 ㎖의 GN6 액체 배지 (N6 배지 ([Chu et al., 1975]), 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 수크로스, pH 5.8) 내로 하위배양하고, 28℃에서 125 rpm의 진탕기 상에 놓았다. 총 36 ㎖의 PCV가 3개의 플라스크에 분배되도록 이러한 단계를 동일한 세포주를 사용하여 2회 반복하였다. 24시간 후, GN6 액체 배지를 제거하고, 72 ㎖의 GN6 S/M 삼투성 배지 (N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 45.5 g/ℓ 소르비톨, 45.5 g/ℓ 만니톨, 100 ㎎/ℓ 마이오-이노시톨, pH 6.0)로 교체하였다. 적당하게 교반하면서 (125 rpm), 플라스크를 암실에서 30-35분 동안 28℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 동안, 8.1 ㎖의 GN6 S/M 액체 배지를 405 ㎎의 무균성 탄화규소 휘스커에 첨가함으로써 탄화규소 휘스커 (Advanced Composite Materials, LLC (Greer, SC))의 50 ㎎/㎖ 현탁액을 제조하였다.
GN6 S/M 삼투성 배지에서의 인큐베이션 후, 각각의 플라스크의 내용물을 250 ㎖ 원심분리병 내로 풀링(pooling)하였다. 플라스크 내의 모든 세포가 바닥으로 침강한 후, 약 14 ㎖를 초과하는 GN6 S/M 액체 내의 내용물 용량을 따라내고, 추후의 사용을 위해 무균성 1ℓ 플라스크에 수집하였다. 휘스커의 미리 습윤화된 현탁액을 60초 동안 와동기 상에서 최대 속도로 혼합한 후, 원심분리 병에 첨가하였다.
ZFN-코딩 서열 + 도너 DNA 양쪽 모두를 함유하는 단일 플라스미드가 식물 세포 내로 전달되는 한 예에서, 170 ㎍의 정제된 원형 플라스미드 DNA가 병에 첨가되었다. 1개는 ZFN-코딩 서열을 함유하고 다른 1개는 도너 DNA를 함유하는 2개의 별도의 플라스미드가 동시에 전달되는 별법적인 예에서, DNA 양에 대한 다중 전략이 평가되었다. 1가지 전략에서는 85 ㎍의 도너 DNA 및 85 ㎍의 아연-손가락 코딩 DNA가 사용되었다. 또다른 변형에서는, 병 당 총 170 ㎍의 DNA가 첨가되도록 개별적인 플라스미드들의 크기 (kb 단위)를 기초로 10배, 5배, 또는 1배 도너 DNA 대 1배 아연 손가락 DNA의 몰비가 사용되었다. 모든 공동-전달 경우에, DNA가 원심분리 병에 첨가되기 전에 튜브에서 미리 풀링되었다. 일단 DNA가 첨가되면, 병을 즉각적으로 변형된 Red Devil 5400 시판 페인트 혼합기 (Red Devil Equipment Co. (Plymouth, MN))에 놓고, 10초 동안 교반하였다. 교반 후, 세포, 배지, 휘스커 및 DNA의 칵테일을 삼투압조절제(osmoticant)를 감소시키기 위한 125 ㎖의 신선한 GN6 액체 배지와 함께 1ℓ 플라스크의 내용물에 첨가하였다. 125 rpm으로 설정된 진탕기 상에서 2시간 동안 세포들이 회수되도록 하였다. 6 ㎖의 분산된 현탁액을 병 당 60개의 필터가 수득되도록 하우스 진공 라인에 연결된 유리 세포 수집기 유닛을 사용하여 Whatman #4 필터지 (5.5 cm) 상에서 여과하였다. 필터를 GN6 고체 배지 (2.5 g/ℓ Gelrite 젤화제를 제외하고는 GN6 액체 배지와 동일)의 60×20 mm 플레이트 상에 놓고, 28℃에서 암실 조건 하에 1주일 동안 배양하였다.
B: 바이오리스틱-매개 DNA 전달
본 실시예에서 언급된 예에서, 본원에 앞서 기술된 바와 같이 실험 약 24시간 전에 옥수수의 배아발생성 현탁액을 GN6 액체 배지 내로 하위배양하였다. 과량의 액체 배지를 제거하고, 약 0.4 PCV의 세포를 2.5 g/ℓ Gelrite로 고체화된 GN6 S/M 배지를 함유하는 100×15 mm 페트리접시의 중앙에 직경 2.5 cm의 원으로 얇게 도포하였다. 세포를 암실 조건 하에 4시간 동안 배양하였다. 바이오리스틱 입자를 DNA로 코팅하기 위해, 3 ㎎의 1.0 마이크로미터 금 입자를 100％ 에탄올로 1번, 무균 증류수로 2번 세정하고, 실리콘화 에펜도르프 튜브 내의 50 ㎕의 물에 재현탁시켰다. 총 5 ㎍의 플라스미드 DNA, 20 ㎕의 스퍼미딘 (0.1 M) 및 50 ㎕ 염화칼슘 (2.5 M)을 개별적으로 금 현탁액에 첨가하고, 와동기 상에서 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 10분 동안 인큐베이션하고, 벤치탑(benchtop) 미세원심분리기에서10,000 rpm에서 10초 동안 펠렛화시키고, 60 ㎕의 저온 100％ 에탄올에 재현탁시키고, 8-9 ㎕를 각각의 마크로캐리어 상에 배분하였다.
바이오리스틱 PDS-1000/He™ 시스템 (Bio-Rad Laboratories (Hercules, CA))을 사용하여 포격하였다. 세포를 함유하는 플레이트를 1100 psi 및 27 인치의 Hg 진공의 조건 하에 중간 선반 상에 놓고, 조작 지침서에 따라 포격하였다. 포격 16시간 후, 조직을 GN6 (1H) 배지의 소형 클럼프로 옮기고, 2-3주 동안 28℃에서 암실 조건 하에 배양하였다. 도너 DNA의 통합으로부터 초래된 추정 트랜스제닉 단리물이 나타날 때까지, 2-4주마다 계속 옮겼다. 바이오리스틱-매개 DNA 전달을 통해 생성된 추정 도너 DNA 통합 이벤트의 확인, 단리 및 재생은 Whiskers™-매개 DNA 전달을 통해 생성된 추정 도너 DNA 통합 이벤트에 대해 이용되고 하기에 기술된 프로세스와 동일하다.
C. 추정되는 표적화된 통합 트랜스제닉 이벤트의 확인 및 단리
DNA 전달 1주일 후, 필터지를 GN6 (1H) 선별 배지 (N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 100 ㎎/ℓ 마이오-이노시톨, 1.0 ㎎/ℓ 비알라포스 (Herbiace (Meiji Seika, Japan)), 2.5 g/ℓ Gelrite, pH 5.8)의 60×20 mm 플레이트로 옮겼다. 이러한 선별 플레이트를 28℃에서 1주일 동안 암실에서 인큐베이션하였다.
암실에서 1주일 선별 후, 세포의 절반을 각각의 플레이트로부터 3.0 ㎖의 37-38℃에서 유지된 GN6 아가로스 배지 (N6 배지, 2.0 ㎎/ℓ 2,4-D, 30 g/ℓ 수크로스, 100 ㎎/ℓ 마이오-이노시톨, 7 g/ℓ SeaPlaque® 아가로스, pH 5.8; 121℃에서 10분 동안만 오토클레이빙(autoclaving)함) 및 1 ㎎/ℓ 비알라포스 (Herbiace)를 함유하는 튜브 내로 긁어냄으로써 조직을 신선한 배지 상에 매립하였다.
아가로스/조직 혼합물을 스패츌러로 분리하고, 이어서 3 ㎖의 아가로스/조직 혼합물을 GN6 (1H) 배지를 함유하는 100×15 mm 페트리 접시의 표면 상에 균일하게 부었다. 이러한 프로세스를 각각의 플레이트의 양쪽 절반에 대해 반복하였다. 일단 모든 조직이 매립되면, 플레이트들을 Nescofilm® 또는 Parafilm M®로 개별적으로 밀봉하고, 28℃에서 암실 조건에서 10주까지 배양하였다. 이러한 선별 조건 하에 성장한, 추정상 형질전환된 단리물들을 매립된 플레이트로부터 제거하고, 60×20 mm 플레이트 내의 신선한 선별 배지로 옮겼다. 약 2주 후에 지속적인 성장이 명백하면, 이벤트가 적용된 제초제 (비알라포스)에 저항성인 것으로 간주하였고, 이어서 세포의 분취량을 유전자형 분석을 위해 2 ㎖ 에펜도르프 튜브 내로 수확하였다.
당업자는 도너 DNA 내의 임의의 적합한 선별성 마커를 코딩하는 유전자를 이용할 수 있고, 살아 있는 세포에 유사한 선별 조건을 적용할 수 있다. 예를 들어, 별법적인 선별성 마커 유전자 예컨대 AAD-1이, WO 2005/107437 A2에 기술된 바와 같이, 본원에 기술된 바와 같은 옥수수 세포에서의 통합된 이벤트의 선별 및 회수를 위한 도너로서 실행될 수 있다.
실시예 20: PCR 유전자형결정을 통한 표적화된 통합 이벤트의 스크리닝
본 실시예에서, PCR 유전자형결정은 게놈 내에 매립된 도너 DNA를 함유하는 것으로 예측되는 단리된 옥수수 캘러스 조직으로부터 유래된 게놈 DNA의 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 증폭에 이은 PCR 증폭 생성물의 표준 클로닝 및 서열 분석을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는 것으로 이해된다. PCR 유전자형결정 방법은 잘 기술되어 있고 (예를 들어, [Rios, G. et al. (2002) Plant J. 32:243-253]), 임의의 식물 종 또는 조직 유형 (세포 배양물 포함)으로부터 유래된 게놈 DNA에 적용될 수 있다.
당업자는 식물 게놈 내의 특정 서열의 증폭, 식물 게놈 내의 다중 특정 서열의 증폭, 식물 게놈 내의 비-특정 서열의 증폭, 또는 이들의 조합을 포함하는 (그러나 이에 한정되지는 않는) PCR-유전자형결정을 위한 전략들을 고안할 수 있다. 증폭에 본 실시예에 기술된 바와 같이 클로닝 및 서열분석이 이어질 수 있거나, 또는 증폭 생성물의 직접적인 서열 분석이 이어질 수 있다. 당업자는 본원에서 생성된 증폭 생성물의 분석을 위한 별법적인 방법을 구현할 수 있다.
본원에 기술된 한 실시양태에서, 유전자 표적에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 PCR 증폭에서 사용된다. 본원에 기술된 또다른 실시양태에서, 도너 DNA 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 PCR 증폭에서 사용된다. 또다른 실시양태는 유전자 표적 서열 및 도너 DNA 서열 양쪽 모두에 결합하는 올리고뉴클레오티드 프라이머들의 조합을 포함한다. 당업자는 게놈에 대해 질의하기 위한 프라이머 및 증폭 반응의 추가적인 조합을 고안할 수 있다.
A. 게놈 DNA 추출
게놈 DNA (gDNA)를 실시예 19에 기술된 단리된 제초제-내성 옥수수 세포로부터 추출하여, PCR 유전자형결정 실험을 위한 주형으로 사용하였다. gDNA를 DNeasy® 96 Plant Kit (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))에 상술된 제작사의 프로토콜에 따라 상기 기술된 바와 같이 단리된 약 100-300 ㎕의 충전 세포 용적 (PCV)의 제초제-내성 HiII 캘러스로부터 추출하였다. 게놈 DNA를 100 ㎕의 키트에서 공급된 용출 완충제에 용출시켜 20-200 ng/㎕의 최종 농도를 산출시키고, 이어서 하기에 개요된 PCR-기반 유전자형결정 방법을 통해 분석하였다.
B. PCR 유전자형결정을 위한 프라이머 디자인
당업자는 PCR-기반 유전자형결정의 디자인 및 실행을 위한 다양한 전략을 사용할 수 있다. 유전자 표적, 도너 DNA 서열 및/또는 둘의 조합에 어닐링하도록 디자인된 올리고뉴클레오티드 프라이머가 실행가능하다. 도너 DNA 분자 내로 구축된 상동성 플랭크들에 포함되지 않는 영역 내의 IPP2K 유전자 표적에 어닐링할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프라이머를 디자인하기 위해, 추가적인 유전자 표적 서열 데이터를 함유하는 플라스미드 클론들을 DNA 서열분석을 통해 특성화하였다. 플라스미드 클론의 이중-가닥 서열분석 반응을 CEQ™ DTCS-Quick Start Kit (Beckman-Coulter (Palo Alto, CA))를 사용하여 제작사가 기술한 바와 같이 수행하였다. 반응물을 Performa DTR 젤 여과 카트리지 (Edge BioSystems (Gaithersburg, MD))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 기술된 바와 같이 정제하였다. 서열 반응물을 Beckman-Coulter CEQ™ 2000 XL DNA 분석 시스템 상에서 분석하였고, 뉴클레오티드를 Sequencher™ 버젼 4.1.4 (Gene Codes Corporation (Ann Arbor, MI))를 사용하여 특성화하였다. 이러한 서열들은 ZFN 표적화 영역의 IPP2K 유전자 상류 (5'-) 및 하류 (3'-)의 영역에 상응하고, 도 91 (서열 141) 및 도 92 (서열 142)에 기술된다.
본 실시예에서 제시된 예에서, 모든 올리고뉴클레오티드 프라이머들은 Integrated DNA Technologies, Inc. (Coralville, IA)에서 표준 탈염 조건 하에 합성되었고, 100 μM의 농도로 물로 희석되었다. 도너 DNA 서열의 경계 바깥에 있는 IPP2K 유전자 표적에 특이적인 gDNA 서열에 어닐링하도록 하기 셋트의 전방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 디자인되었다. 이러한 올리고뉴클레오티드들은 하기와 같다:
5'-TGGACGGAGCGAGAGCCAGAATTCGACGCT G-3' (서열 153)
5'-GTGCAAGAATGTATTGGGAATCAACCTGAT G-3' (서열 154)
도너 DNA 서열의 경계 바깥이지만 첫번째 쌍 내에 네스티드된 IPP2K 유전자 표적에 특이적인 gDNA 서열에 어닐링하도록 제2 셋트의 전방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 또한 디자인되었다:
5'-CTGTGGTACCAGTACTAGTACCAGCATC-3' (서열 155)
5'-TCT TGGATCAAGGCATCAAGC ATTCCAATCT-3' (서열 156)
제초제-내성 유전자의 코딩 영역에 상응하는 도너 DNA에 특이적으로 어닐링하도록 전방향 및 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 추가적으로 디자인되었다:
5'-TGGGTAACTGGCCTAACTGG-3' (서열 157)
5'-TGGAAGGCTAGGAACGCTTA-3' (서열 158)
5'-CCAGTTAGGCCAGTTACCCA-3' (서열 159)
5' TAAGCGTTCCTAGCCTTCCA-3' (서열 160)
C. 도너 DNA-특이적 PCR 증폭
1차 PCR 증폭 반응을 TaKaRa Biotechnology Inc. (Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japan)에서 제공되고 하기로 구성된 시약을 사용하여 수행하였다: 2.5 ㎕의 10× Ex Taq PCR™ 완충제, 40-200 ng의 이중-가닥 게놈 DNA 주형, 10 μM의 전방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10 μM의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2 ㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 16 ㎕의 H2O, 0.5 ㎕ (2.5 유닛)의 Ex Taq™ DNA 폴리머라제. Bio-Rad, 96-샘플 DNA Engine Tetrad2, Peltier 열 사이클러 (Hercules, CA)를 사용하여 하기의 사이클 조건 하에 PCR 반응을 수행하였다: 94℃, 3분/1 사이클; 94℃ 30초, 64℃ 30초, 72℃ 5분/35 사이클; 72℃, 10분/1 사이클; 4℃/유지.
이어서, 1차 PCR 반응의 증폭 생성물을 하기로 구성된 2차 PCR 반응에서 다시 증폭시켰다: 2.5 ㎕의 10× Ex Taq PCR™ Buffer, 2 ㎕의 주형 (H2O 내의 1차 PCR 반응의 1:100 희석물), 10 μM의 전방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10 μM의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2 ㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 16 ㎕의 H2O, 0.5 ㎕ (2.5 유닛)의 Ex Taq™ DNA 폴리머라제. Bio-Rad, 96-샘플 DNA Engine Tetrad2, Peltier 열 사이클러 (Hercules, CA)를 사용하여 하기의 사이클 조건 하에 PCR 반응을 수행하였다: 95℃, 1분/1 사이클; 94℃ 15초, 61℃ 30초, 72℃ 30초/30 사이클; 72℃, 1분/1 사이클; 4℃/유지. 10 ㎕의 각각의 증폭 생성물을 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 증폭된 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp Plus DNA 래더 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))와의 비교에 의해 추정하였다. 예상된 단편을 함유하는 PCR 생성물들이 도 82에 제시된 바와 같이 0.317 Kbp의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다.
실시예 21: 표적화된 통합 이벤트의 검출
제초제-내성 유전자 카셋트를 코딩하는 통합된 도너 DNA 분자를 함유하는 제초제-내성 이벤트들 중에서, 상기 이벤트들의 일부는 ZFN-유도 이중-가닥 파손 부위 내로의 도너 DNA의 표적화된 통합의 생성물인 것으로 예상된다. 이러한 표적화된 통합 이벤트들을 제초제-내성 유전자 카셋트의 무작위 통합으로부터 유래된 것들과 구별하기 위해, 게놈-특이적 및 이어지는 게놈-특이적 + 도너-특이적 PCR 프라이머의 조합을 사용하는 PCR-기반 유전자형결정 전략이 활용되었다.
A. 게놈-특이적 및 이어지는 게놈/도너 특이적 증폭
이러한 실시양태에서, 도너 통합 영역 (예를 들어, 도 92 및 93)의 상류 및 하류의 IPP2K 유전자 표적 영역에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머들이 1차 PCR 반응에서 사용되었다. 1차 PCR 증폭 반응을 TaKaRa Biotechnology Inc. (Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japan)에서 제공되고 하기로 구성된 시약을 사용하여 수행하였다: 2.5 ㎕의 10× Ex Taq PCR™ 완충제, 40-200 ng의 이중-가닥 옥수수 gDNA 주형, 10 μM의 전방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10 μM의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2 ㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 16 ㎕의 H2O, 0.5 ㎕ (2.5 유닛)의 Ex Taq™ DNA 폴리머라제. Bio-Rad, 96-샘플 DNA Engine Tetrad2, Peltier 열 사이클러 (Hercules, CA)를 사용하여 하기의 사이클 조건 하에 PCR 반응을 수행하였다: 94℃, 3분/1 사이클; 94℃ 30초, 64℃ 30초, 72℃ 5분/35 사이클; 72℃, 10분/1 사이클; 4℃/유지.
이어서, 1차 PCR 반응 생성물을 H2O에서 1:100 희석하고, 2가지 별개의 2차 PCR 반응에서 주형 DNA로 사용하였다. 이러한 실시양태에서, IPP2K 게놈 영역 및 도너 분자에서 결합하는 프라이머들이 2차 반응에서 사용되어, 게놈과 도너 간의 통합 경계에 스패닝된 앰플리콘이 생성되었다. 1차 반응은 게놈과 도너 간의 5'-경계에 초점을 맞추었다. 2차 반응은 게놈과 도너 간의 3'-경계에 초점을 맞추었다. 양쪽 반응 모두 하기로 구성되었다: 2.5 ㎕의 10× Ex Taq PCR™ Buffer, 2 ㎕의 주형 (1차 PCR 반응의 1:100 희석물), 10 μM의 전방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10 μM의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2 ㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 16 ㎕의 H2O, 0.5 ㎕ (2.5 유닛)의 Ex Taq™ DNA 폴리머라제. Bio-Rad, 96-샘플 DNA Engine Tetrad2, Peltier 열 사이클러 (Hercules, CA)를 사용하여 하기의 사이클 조건 하에 PCR 반응을 수행하였다: 94℃, 3분/1 사이클; 94℃ 30초, 60℃ 30초, 72℃ 2분/35 사이클; 72℃, 10분/1 사이클; 4℃/유지. 20 ㎕의 각각의 2차 PCR 반응물을 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다.
증폭된 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp Plus DNA 래더 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))와의 비교에 의해 추정하였다. IPP2K 유전자 내로의 도너의 표적화된 통합으로부터 유래된 PCR 생성물들이 1.65 Kbp (5'-경계) (도 83) 또는 1.99 Kbp (3'-경계) (도 84)의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 이러한 단편들을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다. 그후, 정제된 단편들을 pCR2.1 플라스미드 내로 TOPO TA Cloning® 키트 (pCR®2.1 벡터 사용) 및 One Shot® TOP10 화학적 수용성 대장균 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 따라 클로닝하였다.
개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 카나마이신이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 EcoRI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 소화시켰다. 모든 플라스미드 소화물들을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp Plus DNA 래더 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))와의 비교에 의해 추정하였다.
예상된 플라스미드 클론이 3.9 Kbp pCR®2.1 벡터에 더하여 적합한 크기의 삽입된 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 플라스미드 클론의 이중-가닥 서열분석 반응을 CEQ™ DTCS-Quick Start Kit (Beckman-Coulter (Palo Alto, CA))를 사용하여 제작사가 기술한 바와 같이 수행하였다. 반응물을 Performa DTR 젤 여과 카트리지 (Edge BioSystems (Gaithersburg, MD))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 기술된 바와 같이 정제하였다. 서열 반응물을 Beckman-Coulter CEQ™ 2000 XL DNA 분석 시스템 상에서 분석하였고, 뉴클레오티드를 Sequencher™ 버젼 4.1.4 (Gene Codes Corporation (Ann Arbor, MI))를 사용하여 특성화하였다. Vector NTi 버젼 10.1 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))을 사용하여 뉴클레오티드를 정렬하였다.
표적화된 통합 이벤트 (이벤트 #073)로부터의 서열 데이터를 하기와 같이 분석하였다. 게놈의 전체 통합 부위에 스패닝된 1차 PCR 생성물을 게놈과 도너 간의 5'- 또는 3'-경계에 초점을 맞춘 2차 증폭에 적용시켰다. 이러한 2차 증폭 생성물에 상응하는 클로닝된 단편들과 야생형 IPP2K 게놈 서열, 뿐만 아니라 표적화된 통합 이벤트의 예상 서열의 정렬은 표적 부위에서의 도너 DNA의 정확한 통합이 발생하였음을 명확하게 가리켰다.
IPP2K 게놈 유전자좌의 뉴클레오티드 서열, 게놈/도너 경계, IPP2K 상동성 플랭크에 상응하는 도너 영역의 뉴클레오티드 서열, 및 제초제 내성 카셋트의 뉴클레오티드 서열이 이러한 이벤트로부터 유래된 여러 클로닝된 PCR 생성물에서 모두 보존되었다. 따라서, 이러한 이벤트는 특정 유전자 표적에서의 ZFN-매개 이중-가닥 파손의 상동성-구동 복구 및 도너 DNA의 표적화된 통합이 발생한 게놈을 나타냈다. 독특한 표적화된 통합 발생을 나타내는 추가적인 형질전환 이벤트가 수득되었고, 이는 본원에 교시된 방법이 옥수수 캘러스에서 재현성이라는 것을 나타낸다. 당업자는 이러한 방법을 표적화된 통합이 바람직한 것으로 간주되는 임의의 종의 식물 내의 임의의 유전자 표적에 적용할 수 있다.
B. 네스티드 게놈/도너 특이적 증폭
이러한 실시양태에서, 도너 통합 영역의 상류 또는 하류의 IPP2K 유전자 표적의 영역에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머 (부록 V 및 VI)가 도너 서열에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머와 조합되어 1차 및 후속 2차 PCR 반응 양쪽 모두에서 사용되었다. 이러한 예에서, 1차 PCR 증폭 반응을 TaKaRa Biotechnology Inc. (Seta 3-4-1, Otsu, Shiga, 520-2193, Japan)에서 제공되고 하기로 구성된 시약을 사용하여 수행하였다: 2.5 ㎕의 10× Ex Taq PCR™ 완충제, 40-200 ng의 이중-가닥 옥수수 gDNA 주형, 10 μM의 전방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10 μM의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2 ㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 16 ㎕의 H2O, 0.5 ㎕ (2.5 유닛)의 Ex Taq™ DNA 폴리머라제. Bio-Rad, 96-샘플 DNA Engine Tetrad2, Peltier 열 사이클러 (Hercules, CA)를 사용하여 하기의 사이클 조건 하에 PCR 반응을 수행하였다: 94℃, 3분/1 사이클; 94℃ 30초, 52℃ 또는 64℃ 30초, 72℃ 2분/35 사이클; 72℃, 10분/1 사이클; 4℃/유지.
이어서, 1차 PCR 반응 생성물을 H2O에서 1:100 희석하고, 2차 PCR 반응에서 주형 DNA로 사용하였다. 이러한 실시양태에서, IPP2K 게놈 영역 및 도너 분자에서 결합하는 프라이머들이 2차 반응에서 또한 사용되어, 게놈과 도너 간의 통합 경계에 스패닝된 앰플리콘이 생성되었다. 사용된 특정 프라이머에 의해 증폭이 게놈과 도너 간의 5'- 또는 3'-경계에 초점을 맞추었는지 여부가 결정되었다. 이러한 반응을 위한 시약은 하기로 구성되었다: 2.5 ㎕의 10× Ex Taq PCR™ Buffer, 2 ㎕의 주형 (1차 PCR 반응의 1:100 희석물), 10 μM의 전방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 10 μM의 역방향 올리고뉴클레오티드 프라이머, 2 ㎕의 dNTP 믹스 (각각 2.5 mM), 16 ㎕의 H2O, 0.5 ㎕ (2.5 유닛)의 Ex Taq™ DNA 폴리머라제. Bio-Rad, 96-샘플 DNA Engine Tetrad2, Peltier 열 사이클러 (Hercules, CA)를 사용하여 하기의 사이클 조건 하에 PCR 반응을 수행하였다: 94℃, 3분/1 사이클; 94℃ 30초, 54℃ 또는 60℃ 30초, 72℃ 2분/35 사이클; 72℃, 10분/1 사이클; 4℃/유지. 20 ㎕의 각각의 2차 PCR 반응물을 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다.
증폭된 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp Plus DNA 래더 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))와의 비교에 의해 추정하였다. IPP2K 유전자 내로의 도너의 표적화된 통합으로부터 유래된 PCR 생성물들이 1.35 Kbp (5'-경계) (도 85) 또는 1.66 Kbp (3'-경계) (도 86)의 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 이러한 단편들을 젤에서 절제하고, 제작사의 지시에 따라 QIAquick 젤 추출 키트 (QIAGEN Inc. (Valencia, CA))를 사용하여 정제하였다. 그후, 정제된 단편들을 pCR2.1 플라스미드 내로 TOPO TA Cloning® 키트 (pCR®2.1 벡터 사용) 및 One Shot® TOP10 화학적 수용성 대장균 세포 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 따라 클로닝하였다.
C. 유전자형결정 PCR 생성물의 뉴클레오티드 서열 분석
실시예 21B에 기술된 개별적인 콜로니들을 50 ㎕/㎖ 카나마이신이 보충된 2 ㎖ TB를 함유하는 14 ㎖ 팔콘 튜브 (Becton-Dickinson (Franklin Lakes, NJ)) 내로 접종하고, 200 rpm에서 진탕시키면서 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 1.5 ㎖의 세포를 1.7 ㎖ 코스타 미세원심분리 튜브 (Fisher Scientific (Pittsburgh, PA))로 옮기고, 16,000×g에서 1분 동안 펠렛화시켰다. 상등액을 제거하고, 플라스미드 DNA를 상기 기술된 바와 같이 NucleoSpin® 플라스미드 키트 (BD Biosciences/Clontech/Macherey-Nagel (Palo Alto, CA))를 사용하여 단리하였다. 단리된 플라스미드 3 ㎍을 10 유닛의 EcoRI (New England Biolabs (Beverly, MA))으로 소화시켰다. 모든 플라스미드 소화물들을 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 제한절단된 DNA를 100V에서 1시간 동안 0.5％ 브롬화에티듐이 보충된 1.0％ TAE 아가로스 젤에서 전기영동하였다. 단편들을 UV광으로 시각화하고, 단편 크기를 1 Kbp Plus DNA 래더 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))와의 비교에 의해 추정하였다.
플라스미드 클론이 3.9 Kbp pCR®2.1 벡터에 더하여 삽입된 DNA 단편의 존재에 의해 진단되었다. 플라스미드 클론의 이중-가닥 서열분석 반응을 CEQ™ DTCS-Quick Start Kit (Beckman-Coulter (Palo Alto, CA))를 사용하여 제작사가 기술한 바와 같이 수행하였다. 반응물을 Performa DTR 젤 여과 카트리지 (Edge BioSystems (Gaithersburg, MD))를 사용하여 제작사의 프로토콜에 기술된 바와 같이 정제하였다. 서열 반응물을 Beckman-Coulter CEQ™ 2000 XL DNA 분석 시스템 상에서 분석하였고, 뉴클레오티드를 Sequencher™ 버젼 4.1.4 (Gene Codes Corporation (Ann Arbor, MI))를 사용하여 특성화하였다. Vector NTi 버젼 10.1 (Invitrogen Life Technologies (Carlsbad, CA))을 사용하여 뉴클레오티드를 정렬하였다.
여러 표적화된 통합 이벤트로부터 유래된 도너 DNA와 하류 (3'-) IPP2K 게놈 서열 사이의 경계를 포함하는 서열 데이터, 뿐만 아니라 단일 형질전환 캘러스 이벤트 (#114)로부터 유래된 상류 (5'-) 경계 서열을 포함하는 서열 데이터를 포함하여, 여러 표적화된 통합 이벤트로부터 유래된 상류 (5'-) IPP2K 게놈 서열과 도너 DNA 사이의 경계를 포함하는 서열 데이터가 또한 수득되었다. 형질전환된 표적화된 통합 이벤트 (#114)는 IPP2K 유전자 표적 내로 자율 도너가 통합된 결과이다.
이러한 분석에서, 1차 및 2차 양쪽 모두의 PCR 증폭 반응은 게놈과 도너 사이의 5'- 또는 3'-경계에 초점을 맞추었다. 이러한 2차 증폭 생성물에 상응하는 클로닝된 단편들과 야생형 IPP2K 게놈 서열, 뿐만 아니라 표적화된 통합 이벤트의 예상 서열의 정렬은 표적 부위에서의 도너 DNA의 통합이 발생하였음을 나타냈다. IPP2K 게놈 유전자좌의 뉴클레오티드 서열, 게놈/도너 경계, IPP2K 상동성 플랭크에 상응하는 도너 영역의 뉴클레오티드 서열, 및 제초제 내성 카셋트의 뉴클레오티드 서열이 이러한 이벤트로부터 유래된 여러 클로닝된 PCR 생성물에서 모두 보존되었다.
따라서, 이러한 이벤트는 특정 유전자 표적에서의 ZFN-매개 이중-가닥 파손의 상동성-구동 복구가 발생한 게놈을 나타낸다. 독특한 표적화된 통합 발생을 나타내는 추가적인 형질전환 이벤트가 수득되었고, 이는 본원에 교시된 방법이 옥수수 캘러스에서 재현성이라는 것을 나타낸다. 당업자는 이러한 방법을 표적화된 통합이 바람직한 것으로 간주되는 임의의 종의 식물 내의 임의의 유전자 표적에 적용할 수 있다.
실시예 22: 옥수수 캘러스 조직으로부터의 번식성 무손상 식물의 재생
HiII 세포 배양물로부터 유래된 제초제-내성 옥수수 세포의 단리된 캘러스가 무손상 번식성 옥수수 식물로 재생될 수 있다. 당업자는 다양한 배아발생성 옥수수 세포 배양물로부터 무손상 번식성 옥수수 식물을 재생시킬 수 있다.
본 실시예에서, 단리된 캘러스 조직을 MS 염 및 비타민, 30.0 g/ℓ 수크로스, 5 ㎎/ℓ 벤질아미노퓨린, 0.25 ㎎/ℓ 2,4-D, 1 ㎎/ℓ 비알라포스, 및 2.5 g/ℓ Gelrite를 함유하는 pH 5.7의 사이토키닌계 유도 배지 28 (1H)로 옮김으로써 단리된 비알라포스-저항성 HiII 캘러스의 재생이 시작되었다. 세포를 낮은 광도 (13 μEm-2s-1)에서 1주일 동안 성장시킨 후, 더 높은 광도 (40 μEm-2s-1)의 조건으로 옮겨서 1주일 동안 성장시켰다. 그후, 세포를 식물 성장 조절제가 없다는 것을 제외하고는 유도 배지와 동일한 재생 배지 36 (1H)로 옮겼다. 소형 (3-5 cm) 묘목을 수공구로 절단하고, SHGA 배지 (Schenk & Hildebrandt 기초 염 및 비타민, [Schenk & Hildebrandt, 1972, Can. J. Bot 50:199-204]; 1 g/ℓ 마이오-이노시톨, 10 g/ℓ 수크로스, 2.0 g/ℓ Gelrite, pH 5.8)를 함유하는 무균성 150×25-mm 유리 배양 튜브로 옮겼다.
일단 묘목이 충분히 크게 발달하고, 뿌리 및 새로운 가지 시스템으로 분화되면, 이들을 Metro-Mix 360 성장 배지 (Sun Gro Horticulture Canada Ltd.)를 함유하는 4인치 단지로 옮기고, 온실 내에 놓았다. 묘목을 2-7일 동안 투명한 플라스틱 컵으로 완전히 또는 부분적으로 덮은 후, 95％ Metro-Mix 360 성장 배지 및 5％ 식양토 토양으로 구성된 혼합물을 함유하는 5-갤런 단지로 옮기고, 성숙기까지 성장시켰다. 각각 T1 또는 F1 종자를 생산하기 위해 식물을 자가-수분시키거나 또는 순계와 교차-수분시킬 수 있었다. 당업자는 옥수수 번식을 가능하게 하기 위해 재생된 식물을 자가-수분시키거나 또는 재생된 식물을 다양한 배 형질과 교차-수분시킬 수 있다.
표적화된 절단, 표적화된 재조합 및 표적화된 통합과 관련된 추가적인 정보를 미국 특허 출원 공보 US-2003-0232410; US-2005-0026157; US-2005-0064474; US-2005-0208489; 및 US-2006-0188987, 및 미국 특허 출원 일련 번호 11/493,423 (2006년 7월 26일 출원)에서 확인할 수 있고, 이들의 개시내용은 모든 목적을 위해 전문이 거명에 의해 포함된다.
본원에서 언급된 모든 특허, 특허 출원 및 간행물은 모든 목적을 위해 전문이 거명에 의해 본원에 포함된다.
명료한 이해를 위해 설명 및 예의 방식으로 명세서가 다소 상세하게 제공되었지만, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다양한 변화 및 변형이 실행될 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 따라서, 상기의 상세한 설명 및 예는 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Cai, Qihua C Miller, Jeffrey Urnov, Fyodor Shukla, Vipula K Petolino, Joseph F Baker, Lisa W Garrison, Robbi J Blue, Ryan C Mitchell, Jon C Arnold, Nicole L Worden, Sarah E <120> Optimized Non-Canonical Zinc Finger Proteins <130> 8325-4002.40 <140> PCT/US2007/025455 <141> 2007-12-13 <150> 60/874,911 <151> 2006-12-14 <150> 60/932,497 <151> 2007-05-30 <160> 199 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <220> <221> MISC_FEATURE <222> (2)..(3) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (4)..(5) <223> Xaa = any amino acid Xaa can be present or absent <220> <221> MISC_FEATURE <222> (7)..(18) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (20)..(22) <223> Xaa = any amino acid <220> <221> MISC_FEATURE <222> (23)..(24) <223> Xaa = any amino acid Xaa can be present or absent <400> 1 Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 1 5 10 15 Xaa Xaa His Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa 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<213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 70 His Leu Lys Tyr Thr Pro Cys Gly Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 1 5 10 15 <210> 71 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 71 His Thr Lys Arg Cys Gly Arg Gly Ser Gln Leu Val 1 5 10 <210> 72 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 72 His Thr Lys Ile Gly Cys Gly Gly Arg Gly Ser Gln Leu Val 1 5 10 <210> 73 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 73 His Leu Lys Gly Asn Cys Gly Arg Gly Ser Gln Leu Val 1 5 10 <210> 74 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 74 His Leu Lys Gly Asn Cys Gly Gly Gly Ser Gln Leu Val 1 5 10 <210> 75 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 75 His Ile Arg Thr Cys Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 10 <210> 76 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 76 His Ile Arg Thr Cys Gly Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 10 <210> 77 <211> 12 <212> PRT 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finger motif <400> 84 His Ala Gln Arg Cys Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 10 <210> 85 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 85 His Thr Lys Ile Cys Gly Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 10 <210> 86 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 86 His Thr Lys Arg Cys Gly Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 10 <210> 87 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 87 His Ala Gln Arg Cys Gly Thr Gly Ser Gln Lys Pro 1 5 10 <210> 88 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 88 His Thr Lys Ile His Leu Arg Gly Ser Gln Leu Val 1 5 10 <210> 89 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 89 His Ala Gln Arg Cys Gly Gly 1 5 <210> 90 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 90 His Ala Gln Arg Cys Gly Gly Gly 1 5 <210> 91 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 91 His Thr Lys Ile Cys Gly Gly Gly 1 5 <210> 92 <211> 8 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motif <400> 100 Cys Cys His Thr Lys Ile His 1 5 <210> 101 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 101 Cys Cys His Ile Arg Thr Gly Cys 1 5 <210> 102 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 102 Cys Cys His Thr Lys Ile His 1 5 <210> 103 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger motif <400> 103 Cys Cys His Ala Gln Arg Cys Gly Gly 1 5 <210> 104 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 104 atggagatgg atggggttct gcaagccgc 29 <210> 105 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 105 Asp Arg Ser Ala Leu Ser Arg 1 5 <210> 106 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 106 Arg Asn Asp Asp Arg Lys Lys 1 5 <210> 107 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 107 Arg Ser Asp Asn Leu Ser Thr 1 5 <210> 108 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 108 His Ser His Ala Arg Ile Lys 1 5 <210> 109 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 109 Arg Ser Asp Val Leu Ser Glu 1 5 <210> 110 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 110 Gln Ser Gly Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 111 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 111 Arg Ser Asp Asn Leu Ala Arg 1 5 <210> 112 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 112 Thr Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 113 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 113 Thr Ser Gly Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 114 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 114 Arg Ser Asp His Leu Ser Glu 1 5 <210> 115 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 115 Gln Ser Ala Thr Arg Lys Lys 1 5 <210> 116 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 116 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<400> 124 Gln Ser Gly Ser Leu Thr Arg 1 5 <210> 125 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 125 Gln Asn His His Arg Ile Asn 1 5 <210> 126 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 126 Thr Gly Ser Asn Leu Thr Arg 1 5 <210> 127 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> zinc finger binding domain <400> 127 Asp Arg Ser Ala Leu Ala Arg 1 5 <210> 128 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPP2K zinc finger target sequence <400> 128 gaactggttg agtcggtc 18 <210> 129 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPP2K zinc finger target sequence <400> 129 gaactggttg agtcggtc 18 <210> 130 <211> 12 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPP2K zinc finger target sequence <400> 130 atggccccac ag 12 <210> 131 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPP2K zinc finger target sequence <400> 131 ggcacccagg tgttg 15 <210> 132 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> IPP2K zinc finger target sequence <400> 132 gtcgatggtg gggtatgg 18 <210> 133 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> NLS derived from maize op-2 <400> 133 Arg Lys Arg Lys Glu Ser Asn Arg Glu Ser Ala Arg Arg Ser Arg Tyr 1 5 10 15 Arg Lys <210> 134 <211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 2A sequence from Thosea asigna virus <400> 134 Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro 1 5 10 15 Gly Pro <210> 135 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 135 ggaagcatta ttccaatttg atgataatgg 30 <210> 136 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 136 cccaagtgtc gaggttgtca atatgttac 29 <210> 137 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 137 ssscaccaag ttgtattgcc ttctca 26 <210> 138 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 138 sssataggct tgagccaagc aatctt 26 <210> 139 <211> 855 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> position-1 3'-homology flank sequence <400> 139 gcggccgcta gatagcagat gcagattgct tgcttctctg gtttgatttt tggagtcacc 60 atttctgttt ggttcgtgtg cctcagtgtc tgacagcagc agatcctcga tggagatgga 120 tggggttctg caagccgcgg atgccaagga ctgggtttac aagggggaag gcgccgcgaa 180 tctcatcctc agctacaccg gcacgtcgcc ctccatggta agcgctgagt aggttcttac 240 tgagtgtgca cgcatcgatc acttgacttt aggggctcaa tgtgtgattc acgggtgccg 300 ccattcgagc tccagatcca gtatcgctcg agcaagtgat aaaacatgga gcagggacga 360 tcacgtggtc acttgaaaat tatgtgaggt ccggggcgac gatgtacggc gcggcgaact 420 ctcaaacact cacacagcca aaaccgcttc gtgttcgtct ttgttccaag cgaccgtgtg 480 gtgtgtttgt agtagttcgc cggcgccgca catcgtcgcc ccggatctga caaattaagc 540 tttcgttgct tttccacgat tgtgcatttt ctgagcatgc actgaatact atgatggata 600 tgtttggagg aagcattatt ccaatttgat gataatggtg ttatttacac ttgttttcag 660 cttggcaagg tactgcggct caagaagatt ctaaaaaaca agttgcagcg ggcaccaagt 720 tgtattgcct tctcaagtca tgagcaactc ctgtggggcc atatcccaga actggttgag 780 tcggtcaaac aagattgctt ggctcaagcc tatgcagtgc atgttatgag ccaacacctg 840 ggtgccaata ctagt 855 <210> 140 <211> 845 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> position-2 3'-homology flank sequence <400> 140 actagtcatg tcgatggtgg ggtatggttc agattcagtt catttatgtc ctgttattgt 60 gattttgatt ggtaacatat tgacaacctc gacacttggg atcagattca gttcacttat 120 ggaagaaatt ggagaattgt gataatttat ctataatcac ccctactgaa atagaaataa 180 catgacatca atgtgcatgc tattggattt tgacacgaat atgctttatt ctatcatatg 240 ttggtaattc cagcaggcag caggcactac tctttggatc cacgtgactt gacaaagaaa 300 tcatgccatc tttccacaat gcaggtccgt gtacgtgttt ctagggattt tctggagctt 360 gtcgaaaaga atgttcttag cagccgtcct gctgggagag taaatgcaag ttcaattgat 420 aacactgctg atgccgctct tctaatagca gaccactctt tattttctgg tacgtactct 480 atccctcttc ttaccataat ctgaatcttg ttaaggttta aaatatacga ttgattaagt 540 aaaatccaga gctctattca tatctcacgc actgatgttt tgatgaaacg cttgcagcaa 600 gacggttgcc tgttatttct atttgcatta gacaaacagt cacctttgtt tataaaggtc 660 tttgaatttg cagttcttat aggtttaagt ttgcaactgt tacttacaac agcccaatgg 720 gtagcatcaa gattgttttt ttcagtgatt cataacttaa ctcttggtta aaccgctaga 780 acatggttgg tgtcttaaaa tgcaactggt cctgaggccg taacctgaaa tcattgtacg 840 tcgac 845 <210> 141 <211> 484 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Upstream 5'-IPP2K genomic sequence of the ZFN targeted regions <400> 141 tggacggagc gagagccaga attcgacgct ggcggcggcg cgtcgccaat acgcagcgcg 60 gatgtggagc cacatgcaaa cgtgtgtccg cccgcgtggc gtccactctc cctccacgtt 120 tcggcgtcct cgtcgccttc ctgggaaatc tccagctact gcccactgcc ccttcccttc 180 agtccctttc cccgggctgt ggtaccagta ctagtaccag catctcttca ggctccacca 240 agcgcagaca ccgcagcagc ggcagcagca cgatccggtg accccccgcc gcgtccagcc 300 tgctcctccg gtgatcgccg gactggcggg gtaggaacca gcggagcgca gcccgcctcc 360 ttccgctggt aagagtgacg cccgcccgct cctcccttcg ctcgcttcct tgctcttccg 420 attctggcgt accagtctca ccgcggcttg gggatttgat gcggagctag ttaaccagca 480 gagc 484 <210> 142 <211> 729 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Downstream 3'-IPP2K genomic sequence of the ZFN targeted regions <400> 142 attgtttttt tcagtgattc ataacttaac tcttggttaa accgctagaa catggttggt 60 gtcttaaaat gcaactggtc ctgaggccgt aacctgaaat cattgtactt ttctctcatt 120 tctttagata tttccaaaac tctacattag atgatttatg tttgcttact tagtctttct 180 taatctcagg caatcctaag ggtagcagct gcatagctgt agagataaag gtactttgca 240 agcttcctct tttattctta tttttcattt cttatgtata tttctcctca accatttgac 300 ttcttttcgg catgctctac cttgcaggcc aaatgtgggt ttctgccatc atcagaatat 360 atatcagaag ataatactat caagaaacta gtaacgagat ataagatgca tcagcacctc 420 aaattttatc agggtgaggt gtgtagattg gaatgcttga tgccttgatc caagataaaa 480 ttccactctc ttttgcgcac ttaaaaaaca tccatcgatg atacaaactt gatcaaaata 540 ccttaaggct tgttatttac ggcactgttg taatattata ccgtctcttg ctttttgaca 600 tcaggttgat tcccaataca ttcttgcaca catttcagat atcgaagact agtgagtaca 660 atcctcttga tctattttct gggtcaaaag agagaatatg catggccatc aagtcccttt 720 tctcaactc 729 <210> 143 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 143 gcggccgcgt ctcaccgcgg cttggggatt ggatacggag ct 42 <210> 144 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 144 actagtgata tggccccaca ggagttgctc atgacttg 38 <210> 145 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 145 actagtccag aactggttga gtcggtcaaa caagattgct 40 <210> 146 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 146 gtcgaccttg atgctaccca ttgggctgtt gt 32 <210> 147 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 147 gcggccgcta gatagcagat gcagattgct 30 <210> 148 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 148 actagtattg gcacccaggt gttggctca 29 <210> 149 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 149 actagtcatg tcgatggtgg ggtatggttc agattcag 38 <210> 150 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 150 gtcgacgtac aatgatttca ggttacggcc tcaggac 37 <210> 151 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 151 actagttaac tgacctcact cgaggtcatt catatgcttg a 41 <210> 152 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 152 actagtgtga attcagcact taaagatct 29 <210> 153 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 153 actagtggcg gcggagaggg cagaggaagt cttctaacat gcggtgacgt ggaggagaat 60 cccggcccta ggatggcttc tccggagagg agaccagttg a 101 <210> 154 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 154 actagtatgc atgtgaattc agcacttaaa gatct 35 <210> 155 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 155 ctgtggtacc agtactagta ccagcatc 28 <210> 156 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 156 tcttggatca aggcatcaag cattccaatc t 31 <210> 157 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 157 tgggtaactg gcctaactgg 20 <210> 158 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 158 tggaaggcta ggaacgctta 20 <210> 159 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 159 ccagttaggc cagttaccca 20 <210> 160 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 160 taagcgttcc tagccttcca 20 <210> 161 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 161 cttggcaagg tactgcggct caagaagatt c 31 <210> 162 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 162 atgaagaaag acagggaatg aaggac 26 <210> 163 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 163 atgaagaaag acagggaatg aaggaccgcc ac 32 <210> 164 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 164 catggagggc gacgagccgg tgtagctg 28 <210> 165 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 165 atcgacatga ttggcaccca ggtgttg 27 <210> 166 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 166 tttcgacaag ctccagaaaa tccctagaaa c 31 <210> 167 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 167 acaagctcca gaaaatccct agaaacac 28 <210> 168 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 168 ttcgacaagc tccagaaaat ccctagaaac ac 32 <210> 169 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 169 tgctaagaac attcttttcg acaagctcc 29 <210> 170 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 170 gaacattctt ttcgacaagc tccagaaaat cc 32 <210> 171 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 171 tggacggagc gagagccaga attcgacgct 30 <210> 172 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> primer <400> 172 gtgcaagaat gtattgggaa tcaacctgat g 31 <210> 173 <211> 59 <212> DNA <213> Zea mays <400> 173 aagtcatgag caactcctgt ggggccatat cccagaactg gttgagtcgg tcaaacaag 59 <210> 174 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 174 aagtcatgag caactcctgt ggggccaaga actggttgag tcggtcaaac aag 53 <210> 175 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 175 aagtcatgag caactcctgt ggggccataa gaactggttg agtcggtcaa acaag 55 <210> 176 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 176 aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54 <210> 177 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 177 aagtcatgag caactcctgt ggggccatac agaactggtt gagtcggtca aacaag 56 <210> 178 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 178 aagtcatgag caactcctgt ggggccatac cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57 <210> 179 <211> 52 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 179 aagtcatgag caactcctgt ggggccagaa ctggttgagt cggtcaaaca ag 52 <210> 180 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 180 aagtcatgag caactcctgt ggggccatat cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57 <210> 181 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 181 aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54 <210> 182 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 182 aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54 <210> 183 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 183 aagtcatgag caactcctgg tggggccata cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57 <210> 184 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 184 aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54 <210> 185 <211> 53 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 185 aagcatgagc aactcctgtg gggccataga actggttgag tcggtcaaac aag 53 <210> 186 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 186 aagtcatgag caactcctgt ggggccatac agaactggtt gagtcggtca aacaag 56 <210> 187 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 187 aagtcatgag caactcctgt ggggccatat cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57 <210> 188 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 188 aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54 <210> 189 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 189 aagtcatgag caactcctgt ggggccacag aactggttga gtcggtcaaa caag 54 <210> 190 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 190 aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54 <210> 191 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 191 aagtcatgag caactcctgt ggggccatac cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57 <210> 192 <211> 54 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 192 aagtcatgag caactcctgt ggggccatag aactggttga gtcggtcaaa caag 54 <210> 193 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 193 aagtcatgag caactcctgt ggggccataa gaactggttg agtcggtcaa acaag 55 <210> 194 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 194 aagtcatgag caactcctgt ggggccatac agaactggtt gagtcggtca aacaag 56 <210> 195 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 195 aagtcatgag caactcctgt ggggccatat agaactggtt gagtcggtca aacaag 56 <210> 196 <211> 56 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 196 aagtcatgag caactcctgt ggggccatac agaactggtt gagtcggtca aacaag 56 <210> 197 <211> 57 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Maize IPP2K gene sequence with ZFN-mediated mutation <400> 197 aagtcatgag caactcctgt ggggccatac cagaactggt tgagtcggtc aaacaag 57 <210> 198 <211> 821 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> position-1 5'-homology flank sequence <400> 198 gcggccgcgt ctcaccgcgg cttggggatt ggatacggag ctagttaacc agcagagcta 60 gatagcagac gcagatcgct tgcttctctg gtttgatttt tggagtcacc atttctgttt 120 ggttcgtgtg cctcagtgtc tgacagcagc agatcctcga tggagatgga tggggttctg 180 caagccgcgg atgccaagga ctgggtttac aagggggaag gcgccgcgaa tctcatcctc 240 agctacaccg gcacgtcgcc ctccatggta agcgctgagt aggttcttac tgagtgtgca 300 cgcatcgatc acttgacttt aggggctcaa tgtgtgattc acgggtgccg ccattcgagc 360 tccagatcca gtatcgctcg agcaagtgat aaaacatgga gcagggacga tcacgtggtc 420 acttgaaaat tatgtgaggt ccggggcgac gatgtacggc gcggcgaact ctcaaacact 480 cacacagcca aaaccgcttc gtgttcgtct ttgttccaag cgaccgtgtg gtgtgtttgt 540 agtagttcgc cggcgccgca catcgtcgcc ccggatctga caaattaagc tttcgttgct 600 tttccacgat tgtgcatttt ctgagcatgc actgaatact atgatggata tgtttggagg 660 aagcattatt ccaatttgat gataatggtg ttatttacac ttgttttcag cttggcaagg 720 tactgcggct caagaagatt ctaaaaaaca agttgcagcg ggcaccaagt tgtattgcct 780 tctcaagtca tgagcaactc ctgtggggcc atatcactag t 821 <210> 199 <211> 821 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> position-1 3'-homology flank sequence <400> 199 actagtccag aactggttga gtcggtcaaa caagattgct tggctcaagc ctatgcagtg 60 catgttatga gccaacacct gggtgccaat catgtcgatg gtggggtatg gttcagattc 120 agttcattta tgtcctgtta ttgtgatttt gattggtaac atattgacaa cctcgacact 180 tgggatcaga ttcagttcac ttatggaaga aattggagaa ttgtgataat ttatctataa 240 tcacccctac tgaaatagaa ataacatgac atcaatgtgc atgctattgg attttgacac 300 gaatatgctt tattctatca tatgttggta attccagcag gcagcaggca ctactctttg 360 gatccacgtg acttgacaaa gaaatcatgc catctttcca caatgcaggt ccgtgtacgt 420 gtttctaggg attttctgga gcttgtcgaa aagaatgttc ttagcagccg tcctgctggg 480 agagtaaatg caagttcaat tgataacact gctgatgccg ctcttctaat agcagaccac 540 tctttatttt ctggtacgta ctctatccct cttcttacca taatctgaat cttgttaagg 600 tttaaaatat atgattgatt aagtaaaatc cagagctcta ttcatatctc acgcactgat 660 gttttgatga aacgcttgca gcaagacggt tgcctgttat ttctatttgc attagacaaa 720 cagtcacctt tgtttataaa ggtctttgaa tttgcagttc ttataggttt aagtttgcaa 780 ctgttactta caacagccca atgggtagca tcaaggtcga c 821

Claims (38)

  1. 비-정규 (비-C2H2) 아연 손가락을 포함하고, 이때 비-정규 아연 손가락에 DNA 결합에 수반되는 나선형 부분이 있으며, 나선형 부분의 아연-배위결합 영역이 아미노산 서열 HX1X2RCXL (서열 2)을 포함하고, 아연 손가락 단백질이 표적 서열에 결합하도록 조작된, 아연 손가락 단백질.
  2. 제1항에 있어서, X1이 A이고, X2가 Q인 아연 손가락 단백질.
  3. 제1항에 있어서, X1이 K이고, X2가 E인 아연 손가락 단백질.
  4. 제1항에 있어서, X1이 T이고, X2가 R인 아연 손가락 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, XL이 G인 아연 손가락 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 아연 손가락이 서열 Cys-(XA)2-4-Cys-(XB)12-His-(XC)3-5-Cys-(XD)1-10 (서열 3) [식중, XA, XB, XC 및 XD는 임의의 아미노산일 수 있다]을 포함하는 아연 손가락 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 표 1, 2, 3 또는 4 중 임의의 것 에서 제시된 임의의 서열을 포함하는 아연 손가락 단백질.
  8. 제6항 또는 제7항에 있어서, XD가 서열 QLV 또는 QKP를 포함하는 아연 손가락 단백질.
  9. 제8항에 있어서, 서열 QLV 또는 QKP가 아연 손가락의 3개의 C-말단 아미노산 잔기인 아연 손가락 단백질.
  10. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, XD가 1개, 2개 또는 3개의 Gly (G) 잔기를 포함하는 아연 손가락 단백질.
  11. 다수의 아연 손가락을 포함하고, 이때 아연 손가락들 중 하나 이상이 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 CCHC 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질.
  12. 제11항에 있어서, 아연 손가락 단백질이 3개, 4개, 5개 또는 6개의 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 손가락 2가 CCHC 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, C-말단 아연 손가락이 CCHC 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 2개 이상의 아연 손가락이 CCHC 아연 손가락을 포함하는 아연 손가락 단백질.
  16. 제11항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 아연 손가락 단백질이 표 8에 제시된 서열들 중 임의의 서열을 포함하고, IPP2-K 유전자 내의 표적 서열에 결합하도록 조작된 아연 손가락 단백질.
  17. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 아연 손가락 단백질 및 하나 이상의 기능성 도메인을 포함하는 융합 단백질.
  18. (a) 절단 절반-도메인,
    (b) 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항의 아연 손가락 단백질, 및
    (c) 절단 절반-도메인과 아연 손가락 단백질 사이에 개재된 ZC 링커
    을 포함하는 융합 단백질.
  19. 제18항에 있어서, ZC 링커의 길이가 아미노산 5개인 융합 단백질.
  20. 제19항에 있어서, ZC 링커의 아미노산 서열이 GLRGS (서열 4)인 융합 단백질.
  21. 제18항에 있어서, ZC 링커의 길이가 아미노산 6개인 융합 단백질.
  22. 제21항에 있어서, ZC 링커의 아미노산 서열이 GGLRGS (서열 5)인 융합 단백질.
  23. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 아연 손가락 단백질 또는 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  24. 세포 내에서 한 쌍의 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질을 발현시키는 것을 포함하고, 이때
    (a) 융합 단백질들의 표적 서열들이 서로 뉴클레오티드 10개 이내에 있고;
    (b) 융합 단백질들이 이량체화하여, 표적 서열들 사이에 위치한 DNA를 절단하는,
    식물 세포 내의 세포 염색질의 표적화된 절단 방법.
  25. (a) 숙주 세포 내에서 한 쌍의 제18항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 융 합 단백질을 발현시키고, 이때 융합 단백질들의 표적 서열들이 선택된 숙주 표적 유전자좌 내에 존재하는 단계; 및
    (b) 숙주 표적 유전자좌에서의 서열 변경을 나타내는 재조합 숙주 세포를 확인하는 단계
    를 포함하는, 숙주 식물 세포에서의 표적화된 유전자 재조합 방법.
  26. 제24항 또는 제25항에 있어서, 서열 변경이 유전자 물질의 결실, 유전자 물질의 삽입, 유전자 물질의 치환 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 돌연변이인 방법.
  27. 제24항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 외인성 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포 내로 도입하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  28. 제27항에 있어서, 외인성 폴리뉴클레오티드가 숙주 표적 유전자좌에 상동성인 서열을 포함하는 방법.
  29. 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 식물이 단자엽식물, 쌍자엽식물, 겉씨식물 및 진핵 조류로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 식물이 옥수수, 쌀, 밀, 감자, 대두, 토마토, 담배, 브라 시카(Brassica) 과의 구성원, 및 아라비돕시스(Arabidopsis)로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  31. 제24항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 식물이 나무인 방법.
  32. 제24항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 표적 서열이 IPP2K 유전자 내에 있는 방법.
  33. 제32항에 따른 IPP2-K 유전자를 불활성화 또는 변경시키는 것을 포함하는, 종자 내의 피트산(phytic acid)의 수준을 감소시키는 방법.
  34. 제32항에 따른 IPP2-K 유전자를 불활성화 또는 변경시키는 것을 포함하는, 종자 내에서 인을 더욱 대사적으로 이용가능하게 만드는 방법.
  35. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 아연 손가락 단백질, 제17항 내지 제22항 중 어느 한 항에 따른 융합 단백질 또는 제23항에 따른 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물 세포.
  36. 제35항에 있어서, 세포가 종자인 식물 세포.
  37. 제36항에 있어서, 종자가 옥수수 종자인 식물 세포.
  38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, IPP2-K가 부분적으로 또는 완전하게 불활성화된 식물 세포.
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