CN117042600A

CN117042600A - 具有经编辑的anp32基因的抗甲型流感动物

Info

Publication number: CN117042600A
Application number: CN202180090853.7A
Authority: CN
Inventors: 布莱恩·布尔格; 本杰明·比顿
Original assignee: Pig Improvement Co UK Ltd
Current assignee: Pig Improvement Co UK Ltd
Priority date: 2020-11-16
Filing date: 2021-11-15
Publication date: 2023-11-10
Also published as: CA3200855A1; US20240000051A1; EP4243609A1; WO2022101641A1

Abstract

提供了有蹄动物及其后代，其在至少一个编码ANP32蛋白的基因(例如编码ANP32A蛋白或ANP32B蛋白的基因)中包括至少一个经修饰的染色体序列。还提供了含有这种经修饰的染色体序列的有蹄动物细胞。该动物、后代、和细胞对甲型流感病毒的抗性增加。还提供了产生抗病原体有蹄动物或有蹄动物谱系的方法。

Description

具有经编辑的ANP32基因的抗甲型流感动物

在先申请的交叉引用

本申请要求在2020年11月16日申请的第63/114,084号美国临时申请的权益和优先权。该申请通过引用全部并入本文。

技术领域

本公开涉及有蹄动物，例如猪及其后代，其在至少一个编码ANP32蛋白的基因中(例如在编码ANP32A或ANP32B的基因中)包括至少一个经修饰的染色体序列。本公开内容还涉及有蹄动物细胞(例如猪细胞)，其在编码ANP32蛋白的至少一种基因中包括至少一种经修饰的染色体序列。该动物和细胞对病原体包含甲型流感病毒的抗性增加。本公开还涉及用于产生抗病原体有蹄动物或有蹄动物谱系的方法。

对电子提交的序列表的参考

序列表的官方拷贝作为ASCII格式的序列表通过EFS-Web电子提交，文件名为“TD-7-2020-WO1-SEQLST.txt”、于2021年11月11日创建、且大小为1,361,770字节，并且与说明书同时提交。包含在该ASCII格式的文件中的序列表是说明书的一部分，并且通过引用将其全部并入本文。

背景技术

甲型流感病毒(IAV)是有包膜的单链RNA病毒，其引起急性呼吸道疾病，导致每年养猪业的重大经济损失。迄今为止，已经鉴定IAV的三种主要亚型(H1N1、H1N2、和H3N2)为美国猪群的地方性疾病。

IAV被认为是影响北美猪的最重要的传染性疾病因子之一(Sandbulte et al.,2015)。IAV引起猪的实质性健康问题，包含高热、嗜睡、厌食、体重减轻、鼻和眼排出、咳嗽、打喷嚏、结膜炎、和呼吸困难(Rajao et al.,2014；CDC,2014；CFSPH,2016)。该疾病进展迅速，并且当与其它呼吸道病原体相关时可能是复杂的，导致肺炎和严重的临床体征(Rajaoet al.,2014)。猪流感还由于体重减轻、体重增加减少、和感染母猪由于高热而繁殖失败而引起重大经济损失(Rajao et al.,2014)。

此外，猪IAV对人类造成重大的动物传染威胁。通常感染猪的IAV变体可在人类中出现且引起疾病。例如，在2009年春天，新的猪源H1N1甲型流感病毒在墨西哥和美国出现，并且通过人与人的传播在全世界传播(Smith et al.,2009)。疾病控制和预防中心(CDC)估计，在从2009年四月至2010年三月的一年期间，大约60百万人被感染，导致大约12,000人死亡(CDC，2010)。

虽然猪的疫苗接种代表了控制IAV感染的一种策略，但猪IAV毒株非常多样化且易于突变，因此疫苗在本领域中通常具有令人失望的功效(Sandbulte et al.,2015)。此外，1998年以来，在美国猪中，IAV多样性有了显著的进化扩展，导致许多抗原性和遗传学上不同的IAV株的共循环，并使猪流感的控制复杂化(Rajao et al.,2014；也参见CFSPH，2016)。流感病毒的这种快速进化损害了疫苗的功效，导致对远缘相关毒株的亚最佳保护(Rajao等人，2014)。此外，疫苗消除或减少临床体征，但不总是防止感染或病毒脱落，尽管病毒脱落的量可能减少(CFSPH，2016)。此外，当疫苗病毒株与感染株不匹配时，以严重呼吸道疾病为特征的疫苗相关呼吸道疾病(VAERD)可与传统灭活疫苗一起发生(Rajao et al.,2014)。

因此，本领域需要开发用于控制猪中IAV的其它策略。

发明内容

大体而言，本教导提供并包含在ANP32基因中包括外源终止密码子的Sus scrofa，其中ANP32活性降低或不存在，且其中该Sus scrofa抗流感病毒。在一些实施方式中，Susscrofa具有包括经遗传编辑的内源ANP32基因的基因组，该基因可包括ANP32A基因或ANP32B基因，其中经编辑的ANP32基因相对于野生型基因可包括提前终止密码子。在一些配置中，提前终止密码子可以在N129和D130的上游。在各种配置中，经遗传编辑的内源ANP32基因可包括SEQ ID NO:7577或SEQ ID NO:7578。

在各种配置中，外源终止密码子赋予对流感病毒的抗性。在一些配置中，流感病毒可包括甲型流感病毒。在各种配置中，甲型流感病毒可包括H1N1亚型病毒、H1N2亚型病毒、或H3N2亚型病毒。

在各种配置中，动物、后代、或细胞对于经遗传编辑的内源ANP32基因可以是杂合的。在各种配置中，动物、后代、或细胞对于经遗传编辑的内源ANP32基因可以是纯合的。

还提供了从按照本文所述经编辑的Sus scrofa分离的细胞。

还提供了从本教导的Sus scrofa获得的分离的细胞系。在一些配置中，分离的细胞系可以是分离的成纤维细胞系。

在各种实施方式中，本教导提供并包含用于编辑Sus scrofa ANP32基因的向导RNA(gRNA)对，其可以是SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:26、SEQID NO:44和SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:58；或SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:59。在一些配置中，该gRNA可以是SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:55和SEQ IDNO:59。

本公开还提供并包含制备抗流感病毒的Sus scrofa的方法，其可包括：将CAS蛋白质和将提前终止密码子引入内源ANP32基因的gRNA对引入Sus scrofa的MII卵母细胞或合子，其中终止密码子可被引入卵母细胞或合子的内源ANP32基因；将从卵母细胞或合子获得的胚胎植入受体雌性，使得可从植入的胚胎获得Sus scrofa，其中获得的Sus scrofa对于包括提前终止密码子的ANP32基因可以是杂合的；将杂合的Sus scrofa与也可以在ANP32基因中包括提前终止密码子的异性Sus scrofa育种；从育种中选择对于ANP32基因中提前终止密码子纯合的后代，其中这些纯合后代抗流感。在一些配置中，该对gRNA可包括由SEQ IDNO:26和SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:59组成的序列。在各种配置中，CAS蛋白和gRNA可作为预先形成的核糖核蛋白(RNP)复合物引入。在各种配置中，提前终止密码子包括由SEQ ID NO:7577或SEQ ID NO:7578组成的核酸序列。

本公开还提供并包含制备可抗流感病毒的Sus scrofa的方法，其包括：将CAS蛋白质和将提前终止密码子引入内源ANP32基因的gRNA对引入Sus scrofa的MII卵母细胞或合子，其中终止密码子可被引入卵母细胞或合子的内源ANP32基因；将从卵母细胞或合子获得的胚胎植入受体雌性，使得可从植入的胚胎获得Sus scrofa，其中获得的Sus scrofa对于包含提前终止密码子的ANP32基因可以是纯合的；其中纯合Sus scrofa可以抗流感。在一些配置中，该对gRNA可包括由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:59组成的序列。在各种配置中，CAS蛋白和gRNA可作为预先形成的核糖核蛋白(RNP)复合物引入。在各种配置中，提前终止密码子包括由SEQ ID NO:7577或SEQ ID NO:7578组成的核酸序列。

本教导还提供并包含经编辑以赋予Sus scrofa流感抗性的ANP32基因，其中该编辑引入外源终止密码子，并且该经编辑的ANP32基因包括SEQ ID NO:7577或SEQ ID NO:7578。在一些配置中，使用SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:59来创建编辑。

在多个实施方式中，本教导提供并包含非繁殖Sus scrofa基因，其包括本发明的ANP32基因。在各种配置中，本教导还提供了包括多个非繁殖ANP32细胞的细胞系。在一些配置中，细胞系可以是成纤维细胞系。

提供了有蹄动物及其后代。该动物和后代在至少一个编码ANP32蛋白的基因中包括至少一个经修饰的染色体序列。

还提供了有蹄动物细胞。该细胞在编码ANP32蛋白的至少一个基因中包括至少一个经修饰的染色体序列。

提供了一种产生对病原体易感性降低的有蹄动物或有蹄动物谱系的方法。该方法包括修饰有蹄动物卵母细胞或有蹄动物精细胞以将编码ANP32蛋白的基因中的经修饰的染色体序列引入卵母细胞和精细胞中的至少一个，并用精细胞使卵母细胞受精以产生在编码ANP32蛋白的基因中含有经修饰的染色体序列的受精卵。该方法还包括将受精卵转移到代孕雌性有蹄动物中，其中妊娠和足月分娩产生后代动物。

提供了另一种产生对病原体易感性降低的有蹄动物或有蹄动物谱系的方法。该方法包括修饰有蹄动物受精卵，以将编码ANP32蛋白的基因中的经修饰的染色体序列引入受精卵。该方法还包括将受精卵转移到代孕雌性有蹄动物中，其中妊娠和足月分娩产生后代动物。

提供了另一种产生对病原体感染的易感性降低的有蹄动物或有蹄动物谱系的方法。该方法包括将有蹄动物卵母细胞去核，修饰供体有蹄动物体细胞以将经修饰的染色体序列引入编码ANP32蛋白的基因，将卵母细胞与经修饰的供体有蹄动物体细胞融合，以及活化卵母细胞以产生胚胎。

提供了一种提高有蹄动物对病原体感染的抗性的方法。该方法包括修饰至少一个编码ANP32蛋白的基因中的至少一个染色体序列，使得与在编码ANP32蛋白的基因中不含经修饰的染色体序列的有蹄动物中相同ANP32蛋白的产量或活性相比，ANP32蛋白的产生或活性降低。

在本文所述的任何有蹄动物、后代、细胞、或方法中，编码ANP32蛋白的基因可为编码ANP32A蛋白的基因或编码ANP32B蛋白的基因。

提供了有蹄动物的群体。该群体包括二种或更多种任何本文所述的有蹄动物和/或其后代。

提供了有蹄动物的另一个群体。该群体包括通过本文所述的任何方法制备的两个或更多个动物和/或其后代。

提供了向导RNA(gRNA)。gRNA可包括SEQ ID NO:15–7,576任一的核苷酸序列。

其它目的和特征将部分地是显而易见的，部分地在下文中指出。

具体实施方式

酸性(富含亮氨酸)核磷蛋白32kDa(ANP32)蛋白家族由小的进化保守蛋白组成，其特征在于氨基末端富含亮氨酸的重复结构域和羧基末端低复杂性酸性区(Reilly et al.,2014)。ANP32A家族的哺乳动物成员——ANP32A、ANP32B、和ANP32E——具有生理学上不同的功能，包括染色质修饰和重塑、凋亡caspase调节、蛋白磷酸酶抑制、转录调节和细胞内运输的调节(Reilly et al.,2014；Staller et al.,2014)。此外，已经发现ANP32蛋白在一系列癌症中失调(Reilly et al.,2014)。病毒复制需要ANP32蛋白与IAV聚合酶相互作用。在人细胞中，ANP32A/ANP32B双敲除几乎完全消除了病毒聚合酶活性和病毒复制(Staller etal.,2014)。

Sus scrofa(猪)基因组含有人ANP32A的几种同系物，包含ANP32A和ANP32B(也称为NANS)。猪ANP32A和ANP32B基因编码第129位天冬酰胺(N)(N129)和第130位天冬氨酸(D)(D130)，这些氨基酸已经被鉴定为人和鸡ANP32蛋白与甲型流感病毒聚合酶相互作用所需的氨基酸(Staller et al.,2019；Baker et al.,2019)。如下文进一步描述的，为了产生抗IAV猪，本发明人设计了修饰猪ANP32A和ANP32B基因的编辑策略。例如，设计编辑策略以在猪ANP32A和ANP32B基因的保守外显子序列中编码N129和D130的基因区域的上游引入终止密码子。经编辑以包括外源终止密码子的序列的实例包含SEQ ID NO:7577和7578。

因此，本发明涉及在至少一个编码ANP32蛋白的基因中包括至少一个经修饰的染色体序列的有蹄动物及其后代。本发明还涉及在至少一个编码ANP32蛋白的基因中包括至少一个经修饰的染色体序列的有蹄动物细胞。该动物和细胞对病原体包括甲型流感病毒的抗性增加。

该动物和细胞具有染色体修饰(例如插入、缺失、或取代)，其失活或以其他方式调节ANP32A和/或ANP32B基因活性。由于ANP32蛋白是IAV的病毒复制所需要的，因此当被激发时，具有修饰的ANP32基因的动物和细胞显示对IAV的抗性。

还提供了本文所述的任何动物的群体。

本发明还涉及产生抗病原体有蹄动物和这类动物谱系的方法。该方法包括将经修饰的染色体序列引入编码ANP32蛋白的基因。

还提供了用于产生动物和细胞的向导RNA。

动物、后代、细胞、动物群体、方法、和向导RNA在下文中进一步描述。

定义

当介绍本发明或其优选实施方式的元件时，冠词“一”、“一个”、“该”和“所述”意图表示存在一个或多个元件。

术语“和/或”是指与这术语相关联的任何一个项目、项目的任何组合、或所有项目。

“结合蛋白”是能够结合另一分子的蛋白。结合蛋白可以结合例如DNA分子(DNA结合蛋白)、RNA分子(RNA结合蛋白)和/或蛋白质分子(蛋白质结合蛋白)。在蛋白质结合蛋白的情况下，其可以结合到自身(以形成同二聚体、同三聚体等)和/或其可以结合到一个或多个不同蛋白质的分子。结合蛋白可以具有多于一种类型的结合活性。例如，锌指蛋白具有DNA结合、RNA结合和蛋白质结合活性。

术语“包括”、“包含”、和“具有”旨在是包含性的，并且表示除了所列出的元件之外还可以存在另外的元件。

术语“CRISPR”代表“成簇规律间隔短回文重复序列”。“CRISPR系统”包含I型、II型和III型CRISPR系统。

术语“Cas”是指“CRISPR相关蛋白”。“Cas蛋白”包含但不限于Cas9家族成员蛋白、Cas6家族成员蛋白(例如Csy4和Cas6)、Cas5家族成员蛋白、和Cas12家族成员蛋白。

术语“Cas9”通常可指与野生型Cas9多肽(例如来自化脓链球菌的Cas9)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。美国专利公开2016/0046963的SEQ IDNO:1–256和795–1346提供了示例性的Cas9序列。美国专利公开2016/0046963的SEQ ID NO:1–256和795–1346在此通过引用并入本文作为参考。“Cas9”可指与野生型Cas9多肽(例如来自化脓链球菌)具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、或99.9％、100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。“Cas9”可指Cas9蛋白的野生型或修饰形式，其可包括氨基酸改变，例如缺失、插入、取代、变体、融合、嵌合体、或其任意组合。

术语“Cas5”可通常指与野生型示例性Cas5多肽(例如来自脱硫弧菌的Cas5)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。美国专利公开2016/0046963的图42中提供了示例性的Cas5序列。美国专利公开2016/0046963的图42在此通过引用并入本文作为参考。“Cas5”通常可指与野生型Cas5多肽(例如来自脱硫弧菌的Cas5)具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。“Cas5”可指Cas5蛋白的野生型或修饰形式，其可包括氨基酸改变，例如缺失、插入、取代、变体、融合、嵌合体、或其任意组合。

术语“Cas6”通常可以指与野生型示例性Cas6多肽(例如来自嗜热链球菌的Cas6)具有至少约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。美国专利公开2016/0046963的图41中提供了示例性的Cas6序列。美国专利公开2016/0046963的图41在此通过引用并入本文作为参考。“Cas6”通常可以指与野生型Cas6多肽(例如来自嗜热链球菌)具有至多约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％、99％、99.5％、99.9％、或100％序列同一性和/或序列相似性的多肽。“Cas6”可指Cas6蛋白的野生型或修饰形式，其可包括氨基酸改变，例如缺失、插入、取代、变体、融合、嵌合体、或其任意组合。

术语“CRISPR/Cas9”或“CRISPR/Cas9系统”是指用于遗传编辑的可编程核酸酶系统，其包含Cas9蛋白、或其衍生物，和为Cas9提供CRISPR RNA(crRNA)和反式激活RNA(tracrRNA)的功能的一种或多种非编码向导RNA(“gRNA”)。crRNA和tracrRNA可以是分开的RNA分子，或者可以组合成单个RNA分子以产生“单向导RNA”(sgRNA)。crRNA或sgRNA的cRNA部分提供与基因组靶标互补的序列。

“疾病抗性”是动物的特征，其中动物避免了作为动物－病原体相互作用，例如猪类动物和甲型流感病毒之间的相互作用，的结果的疾病症状。即，防止病原体引起动物疾病和相关的疾病症状，或者，降低临床体征的发生率和/或严重性或减少临床症状。本领域技术人员将理解，本文公开的组合物和方法可与本领域可用的其它组合物和方法一起使用，用于保护动物免受病原体攻击。

关于特定核酸的“编码”或“被编码”是指包括用于翻译成特定蛋白的信息。编码蛋白质的核酸可以在核酸的翻译区内包括间插序列(例如内含子)，或者可以缺少这样的间插非翻译序列(例如，如在cDNA中)。编码蛋白质的信息通过使用密码子来确定。通常，氨基酸序列由使用“通用”遗传密码的核酸编码。当合成制备或改变核酸时，可利用待表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。

如本文所用，“基因编辑”、“经基因编辑”、“经遗传编辑”和“基因编辑效应物”是指使用归巢技术和天然存在的或人工改造的核酸酶，也称为“分子剪刀”、“归巢核酸内切酶”、或“靶向核酸内切酶”。核酸酶在基因组中的期望位置产生特异性双链染色体断裂(DSB)，在一些情况下，其利用细胞的内源机制来修复通过同源重组(HR)和/或非同源末端连接(NHEJ)的天然过程诱导的断裂。基因编辑效应物包含锌指核酸酶(ZFNs)、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统(例如CRISPR/Cas9系统)、和大范围核酸酶(例如作为归巢内切核酸酶重新工程化的大范围核酸酶)。该术语还包含使用转基因程序和技术，包含例如其中变化是缺失或相对小的插入(通常小于20nt)和/或不引入来自外来物种的DNA。该术语还包括子代动物，例如通过有性杂交或无性繁殖从经初始基因编辑的动物产生的那些。

术语“基因组编辑”、“经遗传编辑”和“经遗传编辑”可以指通过缺失、插入、取代、或以其他方式改变特定核酸序列来改变基因组。该改变可以是基因或位置特异性的。基因组编辑可以使用核酸酶来切割核酸，从而产生用于编辑的位点。还涵盖非基因组核酸的编辑。含有核酸酶结构域的蛋白质可以通过与核酸靶向核酸形成复合物来结合和切割靶核酸。在一个实例中，切割可在靶核酸中引入双链断裂。核酸可以例如通过内源非同源末端连接(NHEJ)机制或同源定向修复(HDR)机制来修复。前者不依赖于模板DNA来修复，并且通常可以导致靶核酸中的插入或缺失。HDR需要模板DNA，因此可以导致更高保真度的修复，并允许靶核酸中的取代(例如，单核苷酸取代)，而对周围区域的破坏最小。在另一个实例中，可以插入一段核酸。靶向核酸的核酸和定点多肽的修饰可以引入用于基因组编辑的新功能。

如本文所用，“归巢DNA技术”、“归巢技术”和“归巢核酸内切酶”包含允许特定分子靶向特定DNA序列的任何机制，包含锌指(ZF)蛋白、转录激活子样效应物(TALE)、大范围核酸酶、和CRISPR系统(例如CRISPR/Cas9系统)。

术语“抗性增加”和“易感性降低”在本文中是指，但不限于，与病原体感染相关的临床体征或临床症状的发生率和/或严重性的统计学显著降低。例如，“抗性增加”或“易感性降低”可指与具有未修饰染色体序列的对照动物相比，在ANP32基因中包括经修饰的染色体序列的动物中与甲型流感感染相关的临床体征或临床症状的发生率和/或严重性的统计学显著降低。术语“临床症状的统计学显著减少”是指但不限于，在用感染原攻击后，被修饰的受试者组中至少一种临床症状的发生频率比未被修饰的对照组低至少10％，优选至少20％，更优选至少30％，甚至更优选至少50％，甚至更优选至少70％。

“敲除”是指破坏基因的结构或调节机制。敲除可以通过打靶载体、置换载体、或打带跑载体的同源重组或导致基因功能完全、部分或条件性丧失的基因捕获载体的随机插入而产生。

本文中，“临床体征的发生率和/或严重性的降低”或“临床症状的减轻”是指但不限于，与野生型受试者的感染相比，减少组中受感染的受试者的数目、减少或消除表现出感染的临床体征的受试者的数目、或降低存在于一个或多个受试者中的任何临床体征的严重性。例如，这些术语包括感染、肺病、病毒血症、抗体产生、病原体负荷降低、病原体散发减少、病原体传播减少、或甲型流感症状的任何临床体征减少，的任何临床体征。优选地，与ANP32基因未修饰且已感染的对象相比，在本发明的一种或多种动物中这些临床体征减少至少10％。更优选地，本发明的受试者中的临床体征减少至少20％，优选至少30％，更优选至少40％，甚至更优选至少50％。

本文提及的核苷酸序列从核苷酸x到核苷酸y的缺失是指该范围内的所有核苷酸都已缺失，包含x和y。因此，例如，短语“与SEQ ID NO:X相比，从第1,000位核苷酸到第1,099位核苷酸有100个碱基对的缺失”是指第1,000–1,099位核苷酸中的每一个都被缺失，包含第1,000位和第1,099位核苷酸。

动物对疾病的“抗性”是动物的特征，其中动物避免了动物－病原体相互作用，例如猪类动物和甲型流感之间的相互作用，的结果的疾病症状。即，防止病原体引起动物疾病和相关的疾病症状，或者，降低临床体征的发生率和/或严重性或减少临床症状。本领域技术人员将理解，本文公开的方法可以与本领域可用的其它组合物和方法一起使用，用于保护动物免受病原体攻击。

“TALE DNA结合结构域”或“TALE”是包括一个或多个TALE重复结构域/单元的多肽。重复结构域参与TALE与其同源靶DNA序列的结合。单个“重复单元”(也称为“重复”)通常为33–35个氨基酸长，并且与天然存在的TALE蛋白内的其它TALE重复序列表现出至少一些序列同源性。锌指和TALE结合结构域可以被“工程化”以结合预定的核苷酸序列，例如通过工程化(改变一个或多个氨基酸)天然存在的锌指或TALE蛋白的识别螺旋区。因此，工程化的DNA结合蛋白(锌指或TALE)是非天然存在的蛋白。用于工程化DNA结合蛋白的方法的非限制性实例是设计和选择。设计的DNA结合蛋白是自然界中不存在的蛋白质，其设计/组成主要由合理的标准产生。设计的合理标准包含应用替代规则和计算机化算法，用于处理数据库中的信息，该数据库存储现有ZFP和/或TALE设计的信息以及结合数据。参见，例如，美国专利6,140,081；6,453,242；和6,534,261；也参见WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496和美国公开20110301073。

“锌指DNA结合蛋白”(或结合结构域)是通过一个或多个锌指以序列特异性方式结合DNA的蛋白质、或较大蛋白质内的结构域，锌指是结合结构域内的氨基酸序列的区域，其结构通过锌离子的配位而稳定。术语锌指DNA结合蛋白通常缩写为锌指蛋白或ZFP。

“选择的”锌指蛋白或TALE是自然界中不存在的蛋白，其产生主要由经验过程如噬菌体展示、相互作用陷阱或杂交选择产生。参见例如美国专利5,789,538；美国专利5,925,523；美国专利6,007,988；美国专利6,013,453；美国专利6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970、WO 01/88197、WO 02/099084和美国公开20110301073。

本文所用的术语“育种”是指包括选择用于产生下一代后代的优良雄性和优良雌性动物的过程。这过程还包括雄性和雌性配子的联合，以便发生受精。这种联合可以通过交配(交配)或通过体外或体内人工方法产生。这些人工方法可包含但不限于人工授精、手术辅助人工授精、体外受精、胞质内精子注射、透明层钻孔、受精卵母细胞的体外培养、卵巢转移、和卵巢分裂。本文所用的术语“繁殖”也可包含将受精卵母细胞转移到雌性动物的生殖道中，以便允许特定优良雌性的后代更多。

如本文所用，“ANP32”可以指ANP32A或ANP32B基因或蛋白。技术人员将能够确定基因或蛋白质是否在参考文献的上下文中提及。

各种其它术语在下文定义。

在编码ANP32蛋白的基因中具有经修饰的染色体序列的动物和细胞

本文描述了有蹄动物及其后代，以及在至少一个编码ANP32蛋白的基因中包括至少一个经修饰的染色体序列的有蹄动物细胞。例如，动物、后代、或细胞可具有插入或缺失(“INDEL”)，其赋予对病原体(例如，甲型流感病毒)感染的改善的或完全的抗性。

有蹄动物或后代可以选自由猪、牛、马、绵羊、山羊、水牛、野牛、羊驼、美洲驼、牦牛、鹿、麋鹿、和骆驼组成的组。同样，有蹄动物细胞可以来源于选自由猪、牛、马、绵羊、山羊、水牛、野牛、羊驼、美洲驼、牦牛、鹿、麋鹿、和骆驼组成的组的动物。

例如，有蹄动物或后代可以是猪或牛(例如，肉牛或乳牛)。有蹄动物细胞可以是猪细胞或牛细胞。

有蹄动物或后代可以是猪。有蹄动物细胞可以是猪细胞。

猪ANP32A具有二种同种型，其完整的核苷酸序列可在Ensembl数据库中以登录号ENSSSCT00000005475.4和ENSSSCT00000070641.1找到。二种猪ANP32A同种型均与人ANP32A匹配，但是由ENSSSCT00000005475.4编码的猪ANP32A同种型与人ANP32A匹配更紧密。ENSSSCT00000005475.4的完整核苷酸序列在本文提供为SEQ ID NO:1。SEQ ID NO:1是“顶”链的序列，ANP32A在互补“底”链上编码。因此，为了便于参考，产生“底”编码链的反向互补序列，使得序列可以从左到右读取。这反向互补序列以SEQ ID NO:2提供。此外，SEQ ID NO:2的部分版本以SEQ ID NO:3提供。SEQ ID NO:3用作本文的参考序列。SEQ ID NO:3包含SEQID NO:2第2,588–34,583位核苷酸，对应于ANP32A基因的外显子1、内含子1、外显子2、内含子2、外显子3、内含子3、和外显子4。表1提供了SEQ ID NO:2和3中ANP32A基因的外显子和内含子的位置。

表1ANP32A基因的外显子和内含子在SEQ ID NO:2和3中的位置

*ANP32A基因的外显子1在SEQ ID NO:2第2,588–2,731位核苷酸和SEQ ID NO:3第1–144位核苷酸上具有5′非翻译区(5′-UTR)。起始密码子在SEQ ID NO:2第2,732–2,734位核苷酸和SEQ ID NO:3第145–147位核苷酸上。

**ANP32A基因的外显子4包含编码天冬酰胺129(N129)和天冬氨酸130(D130)的核苷酸。这些氨基酸由SEQ ID NO:2第34,442–34,447位核苷酸和SEQ ID NO:3第31,855–31,860位核苷酸编码。

表2提供了SEQ ID NO:3的注释方案，显示了外显子1、2、3、和4的位置。外显子1、2、3、和4用下划线标出。编码序列带下划线和粗体，而作为外显子1的一部分的非翻译序列仅带下划线。编码天冬酰胺129(N129)和天冬氨酸130(D130)的密码子以大写字母显示。

表2参考序列SEQ ID NO:3(部分ANP32A基因序列)的注释形式SEQ ID NO:3

/>

猪ANP32B具有七种同种型，其完整的核苷酸序列可在Ensembl数据库中以登录号ENSSSCT00000005912.4、ENSSSCT00000054395.2、ENSSSCT00000068404.1、ENSSSCT00000062686.2、ENSSSCT00000045745.2、ENSSSCT00000044227.2、和ENSSSCT00000055524.2找到。在这七种同种型中，由ENSSSCT00000005912.4、ENSSSCT00000054395.2、和ENSSSCT00000068404.1编码的同种型与人ANP32B紧密匹配。ENSSSCT00000005912.4的完整核苷酸序列在本文提供为SEQ ID NO:4。另外，ENSSSCT00000005912.4的部分基因组序列如SEQ ID NO:5所示。SEQ ID NO:5用作本文的参考序列。SEQ ID NO:5包含SEQ ID NO:4第2至20,343位核苷酸，对应于外显子1、内含子1、外显子2、内含子2、外显子3、内含子3、和外显子4。表3提供了SEQ ID NO:4和5中ANP32B基因的外显子和内含子的位置。

表3ANP32B基因的外显子和内含子在SEQ ID NO:4和5中的位置

*ANP32B基因的外显子1在SEQ ID NO:4第2–356位核苷酸和SEQ ID NO:5第1–355位核苷酸具有5′非翻译区(5′-UTR)。起始密码子为SEQ ID NO:4第357–359位核苷酸和SEQID NO:5第356–358位核苷酸。

**ANP32B基因的外显子4包含编码天冬酰胺129(N129)和天冬氨酸130(D130)的核苷酸。这些氨基酸由SEQ ID NO:4第20,211–20,216位核苷酸和SEQ ID NO:5第20,210–20,215位核苷酸编码。

表4提供了SEQ ID NO:5的注释方案，显示了外显子1、2、3、和4的位置。外显子1、2、3、和4用下划线标出。编码序列带下划线和粗体，而作为外显子1的一部分的非翻译序列仅带下划线。编码天冬酰胺129(N129)和天冬氨酸130(D130)的密码子以大写字母显示。

表4参考序列SEQ ID NO:5(部分ANP32B基因序列)的注释形式

SEQ ID NO:5

/>

猪ANP32A和ANP32B蛋白的氨基酸序列提供在下表5中。在人和鸡ANP32蛋白中，第129位天冬酰胺(N)残基(N129)和第130位天冬氨酸残基(D130)已被鉴定为与甲型流感病毒聚合酶相互作用所需。猪ANP32氨基酸序列中相应的天冬酰胺和天冬氨酸残基的位置示于下表5中SEQ ID NO:6–10。

表5猪ANP32蛋白序列

/>

提供了在至少一个编码ANP32蛋白的基因中包括至少一个经修饰的染色体序列的有蹄动物及其后代。

还提供了在至少一个编码ANP32蛋白的基因中包括至少一个经修饰的染色体序列的有蹄动物细胞。

经修饰的染色体序列可以是改变的序列，使得ANP32蛋白功能在涉及甲型流感感染时受损、降低、或消除。因此，本文所述的动物和细胞可称为“敲除”动物或细胞。

与在编码ANP32蛋白的基因中不包括经修饰的染色体序列的动物、后代、或细胞对病原体感染的易感性相比，在编码ANP32蛋白的基因中的经修饰的染色体序列降低了动物、后代、或细胞对病原体感染的易感性。

该修饰优选基本上消除动物、后代、或细胞对病原体的易感性。该修饰更优选完全消除动物、后代、或细胞对病原体的易感性，使得动物在暴露于病原体后不显示任何疾病临床体征。

例如，当动物是猪类动物且病原体是甲型流感病毒时，具有该修饰的猪类动物在暴露于甲型流感病毒后不显示任何甲型流感病毒的临床体征(例如，发热、嗜睡、厌食、体重减轻、鼻和眼分泌物、咳嗽、打喷嚏、结膜炎、和/或呼吸困难)。此外，在具有该修饰的猪类动物中，不能在鼻腔分泌物、粪便或血清中检测到甲型流感核酸；在动物的组织(如肺组织)中不能检测到流感抗原，血清中的流感特异性抗体是阴性的。

类似地，暴露于病原体的具有修饰的细胞不会被病原体感染。

病原体可包括病毒。例如，病毒可包括正粘病毒科病毒。

病毒可包括流感病毒，优选包括甲型流感病毒。甲型流感病毒可包括H1N1亚型病毒、H1N2亚型病毒、或H3N2亚型甲型流感病毒。

对于本文所述的任何有蹄动物或后代，该动物或后代可以是胚胎、幼体、或成体。

类似地，细胞可包括胚胎细胞、来自幼年动物的细胞或来自成年动物的细胞。

例如，细胞可包括胚胎细胞。

细胞可包括源自幼年动物的细胞。

任何动物、后代、或细胞可以对于在编码ANP32蛋白的基因中经修饰的染色体序列是杂合的。对于在编码ANP32蛋白的基因中经修饰的染色体序列是杂合的动物、后代、和细胞，包含了在编码ANP32蛋白的基因的一个等位基因中具有经修饰的染色体序列而在编码ANP32蛋白的基因的另一个等位基因中没有经修饰的染色体序列的动物、后代、和细胞。对于在编码ANP32蛋白的基因中经修饰的染色体序列是杂合的动物、后代、和细胞，还包含了在编码ANP32蛋白的基因的一个等位基因中具有经修饰的染色体序列而在编码ANP32蛋白的基因的另一个等位基因中具有不同的经修饰的染色体序列的动物、后代、和细胞。

或者，动物、后代、或细胞可以对于在编码ANP32蛋白的基因中经修饰的染色体序列是纯合的。对于在编码ANP32蛋白的基因中经修饰的染色体序列纯合的动物、后代、或细胞，在该基因的两个等位基因中具有相同的经修饰的染色体序列。

经修饰的染色体序列可包括编码ANP32蛋白的基因的核苷酸序列中的任何改变。例如，经修饰的染色体序列可包括取代、插入、移码、缺失、倒位、易位、重复、剪接供体位点改变、或其任何组合。

因此，例如，在任何动物、后代、或细胞中，经修饰的染色体序列可包括编码ANP32蛋白的基因中的缺失、编码ANP32蛋白的基因中的插入、编码ANP32蛋白的基因中的取代、或其任何组合。

例如，经修饰的染色体序列可包括编码ANP32蛋白的基因中的缺失。

缺失可包括框内缺失。

缺失可以导致编码ANP32蛋白的基因的完整编码序列的缺失。

缺失可包括编码ANP32蛋白的基因的起始密码子的缺失。

经修饰的染色体序列可包括编码ANP32蛋白的基因中的插入。

经修饰的染色体序列可包括编码ANP32蛋白的基因中的取代。

缺失、插入、和/或取代可导致编码ANP32蛋白的基因的错误编码。

当有蹄动物、后代、或细胞包括在编码ANP32蛋白的基因中的缺失、在编码ANP32蛋白的基因中的插入、和/或在编码ANP32的基因中的取代时，该缺失、插入、和/或取代可导致在编码ANP32蛋白的基因中引入提前终止密码子。在一些配置中，产生提前终止密码子的经编辑位点可包括SEQ ID NO:7577或SEQ ID NO:7578。

在任何动物、后代、或细胞中，编码ANP32蛋白的基因中的经修饰的染色体序列可包括编码ANP32A蛋白的基因中的经修饰的染色体序列。

当动物、后代、或细胞在编码ANP32A蛋白的基因中包括经修饰的染色体序列时，ANP32A蛋白可包括与SEQ ID NO:6或7具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

例如，ANP32A蛋白可包括与SEQ ID NO:6或7具有至少85％序列同一性的氨基酸序列。

ANP32A蛋白可包括与SEQ ID NO:6或7具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

ANP32A蛋白可包括与SEQ ID NO:6或7具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

ANP32A蛋白可包括与SEQ ID NO:6或7具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。

ANP32A蛋白可包括与SEQ ID NO:6或7具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

ANP32A蛋白可包括与SEQ ID NO:6或7具有至少99.5％序列同一性的氨基酸序列。

例如，ANP32A蛋白可包括与SEQ ID NO:6具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列。

在任何动物、后代或细胞中，编码ANP32A蛋白的基因中经修饰的染色体序列可导致编码ANP32A蛋白的基因中引入提前终止密码子。提前终止密码子可以在编码SEQ ID NO:6的天冬酰胺129(N129)和天冬氨酸130(D130)或SEQ ID NO:7的天冬酰胺139(N139)和天冬氨酸130(D130)的ANP32A蛋白的基因中序列的上游。提前终止密码子可以是包括SEQ IDNO:7577的序列的一部分。

在任何动物、后代或细胞中，经修饰的染色体序列可包括编码ANP32A蛋白的基因的外显子1、外显子2、外显子3、或外显子4中的修饰。

或者或另外，经修饰的染色体序列可以在与编码ANP32A蛋白的基因的外显子1、外显子2、外显子3、或外显子4任一个邻接的内含子中包括修饰。

例如，经修饰的染色体序列可包括在编码ANP32A蛋白的基因的外显子2中的修饰、在编码ANP32A蛋白的基因的外显子3中的修饰、或跨越编码ANP32A蛋白的基因的内含子1和外显子2之间的内含子－外显子连接的序列中的修饰。

或者或另外，经修饰的染色体序列可以在编码ANP32A蛋白的基因的外显子4中包括修饰。

在任何动物、后代或细胞中，经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:3第29,400至31,996位核苷酸的区域内的修饰。

例如，经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:3第29,400至29,580位核苷酸的区域内的修饰。

经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:3第29,719至29,841位核苷酸的区域内的修饰。

经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:3第31,798至31,996位核苷酸的区域内的修饰。

经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:3第31,855至31,860位核苷酸的区域内的修饰。SEQ ID NO:3第31,855至31,860位核苷酸编码SEQ ID NO:6的ANP32A蛋白的N129和D130。

例如，经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:3第31,855至31,860位核苷酸的区域内的一个或多个核苷酸被不同核苷酸的取代，产生编码不同氨基酸的密码子。

或者或另外，修饰可导致包括SEQ ID NO:3第31,855至31,860位核苷酸的区域内密码子的框内缺失。

在任何动物、后代、或细胞中，修饰可导致SEQ ID NO:6的第129位天冬酰胺(N129)或SEQ ID NO:7的第139位天冬酰胺(N139)被不同的氨基酸取代。

例如，修饰可导致SEQ ID NO:6的第129位天冬酰胺(N129)或SEQ ID NO:7的第139位天冬酰胺(N139)被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、或精氨酸(R)残基取代。

修饰可导致SEQ ID NO:6的第129位天冬酰胺(N129)或SEQ ID NO:7的第139位天冬酰胺(N139)被甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、或精氨酸(R)残基取代。

例如，修饰可导致SEQ ID NO:6的第129位天冬酰胺(N129)或SEQ ID NO:7的第139位天冬酰胺(N139)被异亮氨酸(I)残基取代。

在任何动物、后代、或细胞中，修饰可导致SEQ ID NO:6的第130位天冬氨酸(D130)或SEQ ID NO:7的第140位天冬氨酸(D140)被不同的氨基酸取代。

例如，修饰可导致SEQ ID NO:6的第130位天冬氨酸(D130)或SEQ ID NO:7的第140位天冬氨酸(D140)被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、或精氨酸(R)残基取代。

修饰可导致SEQ ID NO:6的第130位天冬氨酸(D130)或SEQ ID NO:7的第140位天冬氨酸(D140)被丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、或精氨酸(R)残基取代。

例如，修饰可导致SEQ ID NO:6的第130位天冬氨酸(D130)或SEQ ID NO:7的第140位天冬氨酸(D140)被丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)残基取代。

在任何动物、后代、或细胞中，修饰可导致SEQ ID NO:6的第129位天冬酰胺(N129)或SEQ ID NO:7的第139位天冬酰胺(N139)被异亮氨酸(I)残基取代，以及SEQ ID NO:6的第130位天冬氨酸(D130)或SEQ ID NO:7的第140位天冬氨酸(D140)被丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)残基取代。

在任何动物、后代或细胞中，经修饰的染色体序列可包括外显子3中的修饰。

在任何动物、后代或细胞中，经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:3第29,830至29,832位核苷酸的区域内的修饰。SEQ ID NO:3第29,830至29,832位核苷酸编码SEQ ID NO:6的ANP32A蛋白的缬氨酸106(V106)。

例如，经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:3第29,830至29,832位核苷酸的区域内的一个或多个核苷酸被不同核苷酸的取代，产生编码不同氨基酸的密码子。

或者，修饰可导致SEQ ID NO:3第29,830至29,832位核苷酸的密码子缺失。

在任何动物、后代、或细胞中，修饰可导致SEQ ID NO:6的第106位缬氨酸(V106)或SEQ ID NO:7的第116位缬氨酸被不同的氨基酸取代。

例如，修饰可导致SEQ ID NO:6的第106位缬氨酸(V106)或SEQ ID NO:7的第116位缬氨酸被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、或精氨酸(R)残基取代。

修饰可导致SEQ ID NO:6的第106位缬氨酸(V106)或SEQ ID NO:7的第116位缬氨酸被异亮氨酸(I)残基取代。

在任何动物、后代、或细胞中，经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:3第31,936至31,938位核苷酸的区域内的修饰。SEQ ID NO:3第31,936至31,938位核苷酸编码SEQ ID NO:6的ANP32A蛋白的丝氨酸156(S156)。

例如，经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:3第31,936至31,938位核苷酸的区域内的一个或多个核苷酸被不同核苷酸的取代，产生编码不同氨基酸的密码子。

或者，修饰可导致SEQ ID NO:3第31,936至31,938位核苷酸的密码子缺失。

在任何动物、后代、或细胞中，修饰可导致SEQ ID NO:6的第156位丝氨酸(S156)或SEQ ID NO:7的第166位丝氨酸(S166)被不同的氨基酸取代。

例如，修饰可导致SEQ ID NO:6的第156位丝氨酸(S156)或SEQ ID NO:7的第166位丝氨酸(S166)被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、或精氨酸(R)残基取代。

修饰可导致SEQ ID NO:6的第156位丝氨酸(S156)或SEQ ID NO:7的第166位丝氨酸(S166)被脯氨酸(P)残基取代。

在任何动物、后代、或细胞中，编码ANP32蛋白的基因中的经修饰的染色体序列可包括编码ANP32B蛋白的基因中的经修饰的染色体序列。

当动物、后代、或细胞在编码ANP32B蛋白的基因中包括经修饰的染色体序列时，ANP32B蛋白可包括与SEQ ID NO:8–14任一个具有至少80％序列同一性的氨基酸序列。

例如，ANP32B蛋白可包括与SEQ ID NO:8–14任一个具有至少90％序列同一性的氨基酸序列。

ANP32B蛋白可包括与SEQ ID NO:8–14任一个具有至少95％序列同一性的氨基酸序列。

ANP32B蛋白可包括与SEQ ID NO:8–14任一个具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。

ANP32B蛋白可包括与SEQ ID NO:8–14任一个具有至少99％序列同一性的氨基酸序列。

ANP32B蛋白可包括与SEQ ID NO:8–14任一个具有至少99.5％序列同一性的氨基酸序列。

例如，ANP32B蛋白可包括与SEQ ID NO:8–10任一个具有至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、或至少99.5％序列同一性的氨基酸序列。

在任何动物、后代、或细胞中，编码ANP32B蛋白的基因中经修饰的染色体序列可导致编码ANP32B蛋白的基因中引入提前终止密码子。提前终止密码子可以在编码SEQ ID NO:8、9、或10的天冬酰胺129(N129)和天冬氨酸130(D130)的ANP32B蛋白的基因中序列的上游。提前终止密码子可以是包括SEQ ID NO:7578的序列的一部分。

在任何动物、后代、或细胞中，经修饰的染色体序列可包括编码ANP32B蛋白的基因的外显子1、外显子2、外显子3、或外显子4中的修饰。

或者或另外，经修饰的染色体序列可以在与编码ANP32B蛋白的基因的外显子1、外显子2、外显子3、或外显子4任一个邻接的内含子中包括修饰。

例如，经修饰的染色体序列可包括在编码ANP32B蛋白的基因的外显子2中的修饰、在编码ANP32B蛋白的基因的外显子3中的修饰、或跨越编码ANP32B蛋白的基因的外显子3和内含子3之间的内含子－外显子连接的序列中的修饰。

或者或另外，经修饰的染色体序列可包括外显子4中的修饰。

在任何动物、后代、或细胞中，经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:5第10,823至20,342位核苷酸的区域内的修饰。

例如，经修饰的染色体序列可以在包括SEQ ID NO:5第10,823–10,972位核苷酸的区域内包括修饰。

经修饰的染色体序列可以在包括SEQ ID NO:5第14,272–14,415位核苷酸的区域内包括修饰。

经修饰的染色体序列可以在包括SEQ ID NO:5第20,153–20,342位核苷酸的区域内包括修饰。

经修饰的染色体序列可以在包括SEQ ID NO:5第20,211–20,216位核苷酸的区域内包括修饰。SEQ ID NO:5第20,211至20,216位核苷酸编码SEQ ID NO:8的ANP32B蛋白的N129和D130。

例如，经修饰的染色体序列可包括在包括SEQ ID NO:5第20,211至20,216位核苷酸的区域内的一个或多个核苷酸被不同核苷酸的取代，产生编码不同氨基酸的密码子。

或者或另外，修饰可导致包括SEQ ID NO:5第20,211至20,216位核苷酸的区域内密码子的框内缺失。

在任何动物、后代、或细胞中，修饰可导致SEQ ID NO:8、9、或10的第129位天冬酰胺(N129)被不同的氨基酸取代。

例如，修饰可导致SEQ ID NO:8、9、或10的第129位天冬酰胺(N129)被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、或精氨酸(R)残基取代。

修饰可导致SEQ ID NO:8、9、或10的第129位天冬酰胺(N129)被甘氨酸(G)、异亮氨酸(I)、缬氨酸(V)、脯氨酸(P)、色氨酸(W)、天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、或精氨酸(R)残基取代。

修饰可导致SEQ ID NO:8、9、或10的第129位天冬酰胺(N129)被异亮氨酸(I)残基取代。

在任何动物、后代、或细胞中，修饰可导致SEQ ID NO:8、9、或10的第130位天冬氨酸(D130)被不同的氨基酸取代。

例如，修饰可导致SEQ ID NO:8、9、或10的第130位天冬氨酸(D130)被甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、半胱氨酸(C)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、或精氨酸(R)残基取代。

修饰可导致SEQ ID NO:8、9、或10的第130位天冬氨酸(D130)被丙氨酸(A)、天冬酰胺(N)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、甲硫氨酸(M)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W)、谷氨酰胺(Q)、组氨酸(H)、赖氨酸(K)、或精氨酸(R)残基取代。

修饰可导致SEQ ID NO:8、9、或10的第130位天冬氨酸(D130)被丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)残基取代。

在任何动物、后代、或细胞中，修饰可导致SEQ ID NO:8、9、或10的第129位天冬酰胺(N129)被异亮氨酸(I)取代以及SEQ ID NO:8、9、或10的第130位天冬氨酸(D130)被丙氨酸(A)或天冬酰胺(N)残基取代。

在任何动物、后代、或细胞中，该动物、后代、或细胞在编码ANP32A蛋白的基因和编码ANP32B蛋白的基因中均可具有经修饰的染色体序列。因此，编码ANP32蛋白的基因中的至少一个经修饰的染色体序列可包括编码ANP32A蛋白的基因中的经修饰的染色体序列和编码ANP32B蛋白的基因中的经修饰的染色体序列。经修饰的染色体序列可包括本文所述的任何经修饰的染色体序列。

在任何动物、后代、或细胞中，与在编码ANP32蛋白的基因中缺少经修饰的染色体序列的动物、后代、或细胞中的相同ANP32蛋白的产生或活性相比，在编码ANP32蛋白的基因中经修饰的染色体序列优选导致ANP32蛋白的产生或活性降低。

优选地，在编码ANP32蛋白的基因中经修饰的染色体序列导致动物、后代、或细胞基本上不产生功能性ANP32A和/或ANP32B蛋白。“基本上没有功能性ANP32A和/或ANP32B蛋白”是指动物、后代、或细胞中ANP32A和/或ANP32B蛋白的水平是无法检测的，或者如果可检测的话，比不包括经修饰的染色体序列的动物、后代、或细胞中观察到的水平低至少约90％，优选低至少约95％，更优选低至少约98％，甚至更优选低至少约99％。

对于本文所述的任何动物、后代、或细胞，该动物、后代、或细胞优选不产生ANP32A和/或ANP32B蛋白。

在本文所述的任何动物、后代、或细胞中，经修饰的染色体序列可以破坏内含子－外显子剪接区。内含子－外显子剪接区的破坏可导致外显子跳跃或内含子保留，因为在内含子－外显子剪接区的下游缺乏剪接，而且在所得mRNA中缺乏额外的下游外显子。

为了破坏内含子－外显子剪接区域，可以改变剪接所需的任何核苷酸。例如，大多数内含子以序列“AG”结束。如果这序列中的鸟嘌呤(G)残基被不同的碱基取代，则剪接将不发生在这位点，而是发生在下一个下游AG二核苷酸。

内含子－外显子剪接区也可以通过修饰内含子起始处的序列而被破坏。大多数内含子以共有序列RRGTRRRY开始，其中“R”是任何嘌呤，“Y”是任何嘧啶。如果这序列中的鸟嘌呤(G)残基被修饰和/或如果两个或多个其它碱基被修饰，则内含子可以成为非功能性的，并且不会剪接。

内含子－外显子剪接区也可通过本领域已知的任何其它方法破坏。

在本文所述的任何动物、后代、或细胞中，编码ANP32蛋白的基因中的经修饰的染色体序列可由编码ANP32蛋白的基因中的插入、缺失、或取代组成。

在本文所述的任何动物、后代、或细胞中，动物、后代、或细胞可以在插入、缺失、或取代以外的区域包括与SEQ ID NO:2、3、4或5具有至少80％序列同一性的染色体序列。

动物、后代或细胞可以在插入、缺失、或取代之外的区域包括与SEQ ID NO:2、3、4或5具有至少85％序列同一性的染色体序列。

动物、后代或细胞可以在插入、缺失、或取代之外的区域包括与SEQ ID NO:2、3、4或5具有至少90％序列同一性的染色体序列。

动物、后代或细胞可以在插入、缺失、或取代之外的区域包括与SEQ ID NO:2、3、4或5具有至少95％序列同一性的染色体序列。

动物、后代或细胞可以在插入、缺失、或取代之外的区域包括与SEQ ID NO:2、3、4或5具有至少98％序列同一性的染色体序列。

动物、后代或细胞可以在插入、缺失、或取代之外的区域包括与SEQ ID NO:2、3、4或5具有至少99％序列同一性的染色体序列。

动物、后代或细胞可以在插入、缺失、或取代之外的区域包括与SEQ ID NO:2、3、4或5具有至少99.9％序列同一性的染色体序列。

动物、后代或细胞可以在插入、缺失、或取代之外的区域包括与SEQ ID NO:2、3、4或5具有100％序列同一性的染色体序列。

遗传编辑的动物和细胞

本文所述的任何动物或后代可以是经遗传编辑的动物或后代。

同样，本文所述的任何细胞可以是经遗传编辑的细胞。

动物、后代、或细胞可以是已经使用归巢核酸内切酶进行遗传编辑的动物、后代、或细胞。归巢核酸内切酶可以是天然存在的核酸内切酶，但优选是合理设计的非天然存在的归巢核酸内切酶，其具有DNA识别序列，该序列已被设计成使核酸内切酶靶向编码ANP32蛋白的基因中的染色体序列。因此，归巢核酸内切酶可以是设计的归巢核酸内切酶。

归巢核酸内切酶可包括例如成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)系统、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶融合蛋白、大范围核酸酶、或其任何组合。

归巢核酸酶优选包括CRISPR系统。可以用于产生用于本文所述方法的雌性猪类动物的CRISPR系统的实例包含但不限于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas5、CRISPR/Cas6、和CRISPR/Cas12。

下文进一步讨论了使用各种归巢核酸内切酶，包含CRISPR系统和TALEN，来产生经遗传编辑的动物。

经编辑的染色体序列可以是(1)失活的、(2)经修饰的、或(3)包括整合的序列。当经编辑的染色体序列在ANP32基因中时，染色体序列被改变，使得ANP32蛋白功能在其涉及甲型流感感染时被削弱、减少、或消除。因此，包括失活染色体序列的经遗传编辑的动物可以被称为“敲除”或“条件性敲除”。类似地，包括整合序列的经遗传编辑的动物可以被称为“敲入”或“条件性敲入”。此外，包括经修饰的染色体序列的经遗传编辑的动物可包括一个或多个靶向碱基对改变或其他修饰，使得产生的蛋白质产物改变。简言之，该过程可包括将至少一种编码靶向锌指核酸酶的RNA分子和可选的至少一种辅助多核苷酸引入胚胎或细胞。所述过程还包括孵育胚胎或细胞以允许锌指核酸酶的表达，其中由锌指核酸酶引入到靶向染色体序列中的双链断裂通过易错非同源末端连接DNA修复过程或同源定向DNA修复过程修复。使用靶向锌指核酸酶技术编辑编码与种系发育相关的蛋白质的染色体序列的过程是快速、精确、和高效的。

或者，该方法可包括使用CRISPR系统(例如CRISPR/Cas9系统)修饰基因组序列。为了使用Cas9修饰基因组序列，可将蛋白质直接递送至细胞。或者，可将编码Cas9的mRNA递送至细胞、或可将提供编码Cas9的mRNA表达的基因递送至细胞。此外，靶特异性crRNA和tracrRNA可以直接递送至细胞，或者靶特异性sgRNA可以递送至细胞(这些RNA可以替代地从构建以编码RNA的质粒转录)。靶位点的选择和crRNA/gRNA的设计是本领域公知的。对gRNA的构建和克隆的讨论可以在http://www.genome-engineering.org/crispr/wp-content/uploads/2014/05/CRISPR-Reagent-Description-Rev20140509.pdf中找到。

至少一个ANP32基因座可用作位点特异性编辑的靶位点。位点特异性编辑可以包含外源核酸(例如，包括编码感兴趣多肽的核苷酸序列的核酸)的插入或核酸从基因座的缺失。例如，外源核酸的整合和/或部分基因组核酸的缺失可以修饰基因座以产生破坏的ANP32基因，导致ANP32蛋白的活性降低。

因此，例如，任何动物或细胞可以是已经使用成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统进行遗传编辑的动物或细胞。CRISPR/Cas系统可以合适地包括本文所述的任何向导RNA(gRNA)。

对于任何动物、后代、或细胞，经修饰的染色体序列可以是通过同源性定向修复(HDR)产生的经修饰的染色体序列。

或者，该经修饰的染色体序列可以是通过非同源末端连接(NEHJ)产生的经修饰的染色体序列。例如，鉴定和使用导致DNA序列缺失的向导对是有利的，使得连接的末端可以导致产生跨越连接的末端的框内翻译终止密码子；当两个向导序列的切割位点被NHEJ以端对端的方式修复时，这新的DNA序列在转录成mRNA并翻译成蛋白质时可以终止ANP32蛋白质的产生。

细胞类型

本文所述的任何细胞可包括生殖细胞或配子。

例如，本文所述的任何细胞可包括精细胞。

或者，本文所述的任何细胞可包括卵细胞(例如受精卵)。

本文所述的任何细胞可包括体细胞。

例如，本文所述的任何细胞可包括成纤维细胞(例如胎儿成纤维细胞)。

本文所述的任何细胞可包括胚胎细胞。

本文所述的任何细胞可包括源自幼年动物的细胞。

本文所述的任何细胞可包括源自成年动物的细胞。

生产动物的方法

提供了产生抗病原体有蹄动物和这类动物谱系的方法。

该方法可包括使用基因编辑方法，例如成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)/Cas系统、转录激活子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)、重组酶融合蛋白、或大范围核酸酶，将特异性结合至细胞的染色体靶位点并引起双链DNA断裂或以其它方式失活或降低其中ANP32基因或蛋白的活性的试剂引入动物细胞或卵母细胞或胚胎。

本文还描述了一个或多个特定ANP32基因座与多肽的串联使用，多肽能够实现一个或多个ANP32基因座内特定核酸序列的切割和/或整合。与能够实现ANP32基因座的切割和/或整合的多肽或RNA串联使用ANP32基因座的实例包含选自由锌指蛋白、大范围核酸酶、TAL结构域、TALEN、RNA引导的CRISPR/Cas重组酶、亮氨酸拉链、和本领域技术人员已知的其它多肽，组成的组，的多肽。具体的实例包含嵌合(“融合”)蛋白，其包括位点特异性DNA结合结构域多肽和切割结构域多肽(例如核酸酶)，例如包括锌指多肽和FokI核酸酶多肽的ZFN蛋白。本文描述了包括特异性结合ANP32基因的DNA结合结构域的多肽。这样的多肽还可包括核酸酶(切割)结构域或半结构域(例如归巢核酸内切酶，包含具有修饰的DNA结合结构域的归巢核酸内切酶)、和/或连接酶结构域，使得多肽可诱导靶向的双链断裂、和/或促进感兴趣核酸在断裂位点的重组。靶向ANP32基因座的DNA结合结构域可以是DNA切割功能结构域。前述多肽可用于将外源核酸引入宿主生物体(例如动物物种)的基因组中的一个或多个ANP32基因座。DNA结合结构域可包括具有一个或多个锌指(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多个锌指)的锌指蛋白，其经工程改造(非天然存在)以结合ANP32基因内的任何序列。本文所述的任何锌指蛋白可结合靶基因编码序列内或相邻序列(例如启动子或其它表达元件)内的靶位点。锌指蛋白可结合ANP32基因中的靶位点。

提供了一种产生对病原体感染的易感性降低的有蹄动物或有蹄动物谱系的方法。该方法包括修饰有蹄动物卵母细胞或有蹄动物精细胞以将编码ANP32蛋白的基因中的经修饰的染色体序列引入卵母细胞和精细胞中的至少一个，并用精细胞使卵母细胞受精以产生在编码ANP32蛋白的基因中含有经修饰的染色体序列的受精卵。该方法还包括将受精卵转移到代孕雌性有蹄动物中，其中妊娠和足月分娩产生后代动物。该方法还包括筛选后代动物对病原体的易感性，和选择与在编码ANP32蛋白的基因中不包括经修饰的染色体序列的动物相比对病原体的易感性降低的后代动物。

人工授精可用于使卵母细胞与精子细胞受精。

提供了另一种产生对病原体感染的易感性降低的有蹄动物或有蹄动物谱系的方法。该方法包括修饰有蹄动物受精卵，以将编码ANP32蛋白的基因中的经修饰的染色体序列引入受精卵。该方法还包括将受精卵转移到代孕雌性有蹄动物中，其中妊娠和足月分娩产生后代动物。该方法还包括筛选后代动物对病原体的易感性，和选择与在编码ANP32蛋白的基因中不包括经修饰的染色体序列的动物相比对病原体的易感性降低的后代动物。

提供了又另一种产生对病原体感染的易感性降低的有蹄动物或有蹄动物谱系的方法。该方法包括将有蹄动物卵母细胞去核，修饰供体有蹄动物体细胞以将经修饰的染色体序列引入编码ANP32蛋白的基因，将卵母细胞与经修饰的供体有蹄动物体细胞融合，以及活化卵母细胞以产生胚胎。该方法还包括将胚胎转移到代孕雌性有蹄动物中，其中妊娠和足月分娩产生后代动物。该方法还包括筛选后代动物对病原体的易感性，和选择与在编码ANP32蛋白的基因中不包括经修饰的染色体序列的动物相比对病原体的易感性降低的后代动物。

供体有蹄动物体细胞可包括成纤维细胞(例如胎儿成纤维细胞)。

提供了一种提高有蹄动物对病原体感染的抗性的方法。该方法包括修饰至少一个编码ANP32蛋白的基因中的至少一个染色体序列，使得与在编码ANP32蛋白的基因中不含经修饰的染色体序列的有蹄动物中相同ANP32蛋白的产生或活性相比，ANP32蛋白的产生或活性降低。

在任何方法中，卵母细胞、精细胞、受精卵、供体体细胞、或有蹄动物对于经修饰的染色体序列可以是杂合的。

或者，卵母细胞、精细胞、受精卵、供体体细胞、或有蹄动物对于经修饰的染色体序列可以是纯合的。

在任何方法中，修饰编码ANP32蛋白的基因中的至少一个染色体序列的步骤可包括染色体序列的遗传编辑。

遗传编辑可包括使用归巢核酸内切酶。归巢核酸内切酶可以是天然存在的核酸内切酶，但优选是合理设计的非天然存在的归巢核酸内切酶，其具有DNA识别序列，该序列已被设计成使核酸内切酶靶向编码ANP32蛋白的基因中的染色体序列。因此，归巢核酸内切酶可以是设计的归巢核酸内切酶。

该归巢核酸酶优选包括CRISPR/Cas系统。CRISPR系统的实例包含但不限于CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas5、CRISPR/Cas6、以及CRISPR/Cas12。

CRISPR/Cas系统可包括有包括与编码ANP32A蛋白的基因的序列互补的序列的gRNA。

例如，gRNA可包括与以下互补的序列：(1)编码ANP32A蛋白的基因的外显子1、外显子2、或外显子3、或外显子4内的序列；(2)与编码ANP32A蛋白的基因的外显子1、外显子2、外显子3、和外显子4中的任一个邻接的内含子内的序列；或(3)跨越外显子1、外显子2、外显子3、和外显子4中的任何一个与连续内含子之间的内含子－外显子接点的序列。

如下文在表6中提供的，gRNA的示例性核酸序列与编码ANP32A蛋白的基因的序列(SEQ ID NO:15–41)互补。与编码ANP32A蛋白的基因的序列互补的gRNA的其它核酸序列在序列表中提供为SEQ ID NO:61–5,109。

因此，当CRISPR/Cas9系统包括有包括与编码ANP32A蛋白的基因的序列互补的序列的gRNA时，gRNA的核酸序列可包括SEQ ID NO:15–41和61–5,109中的任一个。例如，gRNA的核酸序列可包括SEQ ID NO:15–41任一个。该序列也可包括靶向ANP32A的gRNA对。例如，SEQ ID NO:26和19、SEQ ID NO:33和36、SEQ ID NO:33和40、SEQ ID NO:15和22、SEQ IDNO:15和23、SEQ ID NO:16和24、以及SEQ ID NO:17和24。

CRISPR/Cas系统可包括有包括与编码ANP32B蛋白的基因的序列互补的序列的gRNA。

例如，gRNA可包括与以下互补的序列：(1)编码ANP32B蛋白的基因的外显子1、外显子2、或外显子3、或外显子4内的序列；(2)与编码ANP32B蛋白的基因的外显子1、外显子2、外显子3、和外显子4中的任一个邻接的内含子内的序列；或(3)跨越外显子1、外显子2、外显子3、和外显子4中的任何一个与连续内含子之间的内含子－外显子接点的序列。

如下文在表7中提供的，gRNA的示例性核酸序列与编码ANP32A蛋白的基因的序列(SEQ ID NO:42–60)互补。与编码ANP32B蛋白的基因的序列互补的gRNA的其它核酸序列在序列表中提供为SEQ ID NO:5,110–7,576。

因此，当CRISPR/Cas9系统包括有包括与编码ANP32B蛋白的基因的序列互补的序列的gRNA时，gRNA的核酸序列可包括SEQ ID NO:42–60和5,110–7,576。例如，gRNA的核酸序列可包括SEQ ID NO:42–60任一个。

或者或另外，CRISPR/Cas9系统可包括靶向ANP32B基因的gRNA对。例如，该gRNA对可包括SEQ ID NO:44和46、SEQ ID NO:55和58、或SEQ ID NO:55和59。

在任何涉及使用CRISPR/Cas系统的方法中，编码ANP32A蛋白的基因的序列或编码ANP32B蛋白的基因的序列合适地包括原型间隔区邻近基序(PAM)。PAM可包括序列nGG，其中n是任何核苷酸。

在任何涉及使用CRISPR/Cas系统的方法中，CRISPR/Cas系统可包括Cas9核酸酶(例如化脓性链球菌Cas9内切核酸酶)。

在本文所述的任何方法中，有蹄动物可包括猪类动物或牛类动物。例如，有蹄动物可包括猪类动物。

本文所述的任何方法可产生本文所述的任何动物或本文所述的任何有蹄动物细胞。

本文所述的任何方法可进一步包括使用动物作为起始动物(founder animal)。

动物群体

还提供了本文所述的动物群体。

提供了动物的另一个群体。该群体包括通过本文所述的任何方法制备的两个或更多个有蹄动物和/或其后代。

该动物群体抗病原体感染。

病原体可包括病毒。例如，病原体可包括流感病毒(例如，甲型流感病毒)。

向导RNA

提供了向导RNA(gRNA)。该gRNA具有与编码ANP32蛋白的基因的序列互补的核酸序列，并且可用于将染色体修饰引入编码ANP32蛋白的基因中。

下表6和7中提供了与编码ANP32A蛋白的基因或编码ANP32B蛋白的基因的序列互补的示例性gRNA序列。表6和7中提供的gRNA序列的编号和链性对应SEQ ID NO:3(对于表6中提供的ANP32A gRNA)和SEQ ID NO:5(对于表7中提供的ANP32B gRNA)的编号和链性。表6和7中“链”栏中的“1”表示gRNA的序列是与SEQ ID NO:3或5中提供的核酸序列所针对的链在相同链上发现的序列，而“链”栏中的“-1”表示gRNA的序列在相反链上。表6和7中列出的“位置”是根据SEQ ID NO:3和5的核苷酸编号的预测的核酸酶切割位点。

表6和7还提供了在编码ANP32蛋白的基因序列中发现的PAM序列。尽管表6和7中所示的序列与DNA核苷酸一起列出，但本领域普通技术人员理解该序列实际上是RNA序列，并能够容易地将DNA序列转化成RNA序列。

表6示例性ANP32A gRNA序列

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表7示例性ANP32B gRNA序列

gRNA可包括含有SEQ ID NO:15–7,576任一个的核苷酸序列。

为了靶向ANP32A基因，gRNA可包括有包括SEQ ID NO:15–41和61–5,109的任一个的核苷酸序列。例如，gRNA可包括SEQ ID NO:15–41任一个。或者，靶向分子可包括向导对，其选自SEQ ID NO:15–41和61–5,109中的任意两个。该向导对可以选自SEQ ID NO:15–41中的任意两个。该向导对可以是SEQ ID NO:26和19、SEQ ID NO:33和36、SEQ ID NO:33和40，SEQ ID NO:15和22，SEQ ID NO:15和23，SEQ ID NO:16和24，或SEQ ID NO:17和24。

为了靶向ANP32B基因，gRNA可包括有包括SEQ ID NO:42–60和5,110–7,576中的任一个的核苷酸序列。例如，gRNA可包括SEQ ID NO:42–60任一个。或者，靶向分子可包括向导对，其选自SEQ ID NO:42–60和5,110–7,576中的任意两个。该向导对可以选自SEQ ID NO:42–60中的任意两个。该向导对可以是SEQ ID NO:44和46、SEQ ID NO:55和58、或SEQ IDNO:55和59。

gRNA可以具有100个核苷酸或更少、90个核苷酸或更少、80个核苷酸或更少、70个核苷酸或更少、60个核苷酸或更少、50个核苷酸或更少、40个核苷酸或更少、30个核苷酸或更少、或20个核苷酸或更少的长度。例如，gRNA可具有20个核苷酸的长度。

示例性经编辑的ANP32A序列是gggaactggcaggcctcccgggcatagcccctcctgcgctctatttaccttcttaagtttgtttaactttggtaagtttgcgactgaggtgaggcctacacgagctctttcacctggaaagacaaggccggcgtgaatggggtgaggaatggggcccaagaccggggaggggacaggaggcagaccagaaggcacctcta(SEQ ID NO:7577)。这序列为SEQ ID NO:26和19提供了端到端的切割位点修复(NHEJ)；通过这种NHEJ修复产生外源终止密码子。在切割位点的任一端提供100bp。

示例性经编辑的ANP32B序列是ggttacttctaacaccttaatgatatgtgtttctttttgtgtttgtgtgccgtgtgcatttttccctttaacagcttgagctcagtgacaatagaatctaacctttggtaagtagttgagaatttggaaaacaggactttctggtcattttcattttcatatttctttatggtgagggaaataattgaaagttataatgg(SEQ ID NO:7578)。这序列为SEQ ID NO:55和59提供了提供了端到端的切割位点修复(NHEJ)；通过这种NHEJ修复产生外源终止密码子。在切割位点的任一端提供100bp。

亲和标签

“亲和标签”可以是肽亲和标签或核酸亲和标签。术语“亲和标签”通常指可与分子结合(例如，通过小分子、蛋白质、或共价键结合)的蛋白质或核酸序列。亲和标签可以是非天然序列。肽亲和标签可包括肽。肽亲和标签可以是能够成为分裂系统的一部分的标签(例如，两个无活性的肽片段可以反式组合在一起以形成活性亲和标签)。核酸亲和标签可包括核酸。核酸亲和标签可以是能够选择性结合(例如通过杂交)已知核酸序列的序列。核酸亲和标签可以是能够选择性结合蛋白质的序列。亲和标签可与天然蛋白质融合。亲和标签可与核苷酸序列融合。

有时，一个、两个、或多个亲和标签可与天然蛋白质或核苷酸序列融合。可以使用体外或体内转录方法将亲和标签引入到核酸靶向核酸中。核酸亲和标签可包含例如化学标签、RNA结合蛋白结合序列、DNA结合蛋白结合序列、可与亲和标签化的多核苷酸杂交的序列、合成的RNA适体、或合成的DNA适体。化学核酸亲和标签的实例可包含但不限于，含有生物素、荧光染料、和地高辛配基，的核糖核苷三磷酸。蛋白质结合核酸亲和标签的实例可包含但不限于MS2结合序列、U1A结合序列、茎环结合蛋白序列、boxB序列、eIF4A序列、或RNA结合蛋白识别的任何序列。核酸亲和标签的寡核苷酸的实例可包含但不限于生物素化的寡核苷酸、2,4-二硝基苯基寡核苷酸、荧光素寡核苷酸、和伯胺缀合的寡核苷酸。

核酸亲和标签可以是RNA适体。适体可包含结合茶碱、链霉抗生物素蛋白、葡聚糖B512、腺苷、鸟苷、鸟嘌呤/黄嘌呤、7-甲基-GTP，氨基酸适体例如结合精氨酸、瓜氨酸、缬氨酸、色氨酸、氰钴胺素、N-甲基卟啉IX、黄素、NAD，以及抗生素适体例如结合妥布霉素、新霉素、利托霉素、卡那霉素、链霉素、紫霉素、和氯霉素的适体。

核酸亲和标签可包括可被定点多肽结合的RNA序列。定点多肽可以是有条件地酶促失活的。RNA序列可包括可以被I型、II型、和/或III型CRISPR系统的成员结合的序列。RNA序列可以与RAMP家族成员蛋白结合。RNA序列可与Cas9家族成员蛋白、Cas6家族成员蛋白(例如Csy4、Cas6)结合。RNA序列可与Cas5家族成员蛋白(例如Cas5)结合。例如，Csy4可以以高亲和力(Kd～50pM)结合特定RNA发夹序列，并可以在发夹3′位点切割RNA。

核酸亲和标签可包括可被定点多肽结合的DNA序列。定点多肽可以是有条件地酶促失活的。DNA序列可包括可以被I型、II型、和/或III型CRISPR系统的成员结合的序列。DNA序列可以与Argonaut蛋白结合。DNA序列可以被含有锌指结构域、TALE结构域、或任何其它DNA结合结构域的蛋白质结合。

核酸亲和标签可包括核酶序列。合适的核酶可包含肽基转移酶23SrRNA、RnaseP、I组内含子、II组内含子、GIR1分支核酶、引导酶、发夹核酶、锤头核酶、HDV核酶、CPEB3核酶、VS核酶、glmS核酶、CoTC核酶、和合成核酶。

肽亲和标签可包括可用于追踪或纯化的标签(例如，荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)、YFP、RFP、CFP、mCherry、tdTomato；His标签(例如，6×His标签)；血凝素(HA)标签；FLAG标签；Myc标签；GST标签；MBP标签；壳多糖结合蛋白标签；钙调蛋白标签；V5标签；链霉抗生物素蛋白结合标签等)。

核酸和肽亲和标签都可包括小分子标签，例如生物素、或洋地黄毒苷，和荧光标记标签，例如荧光素、若丹明、Alexa Fluor染料、花青3染料、花青5染料。

核酸亲和标签可位于核酸(例如，靶向核酸的核酸)的5′。核酸亲和标签可位于核酸的3′。核酸亲和标签可位于核酸的5′和3′。核酸亲和标签可位于核酸内。肽亲和标签可位于多肽序列的N端。肽亲和标签可位于多肽序列的C端。肽亲和标签可位于多肽序列的N端和C端。多个亲和标签可与核酸和/或多肽序列融合。

捕获剂

如本文所用，“捕获剂”通常可以指可以纯化多肽和/或核酸的试剂。捕获剂可以是生物活性分子或材料(例如，在自然界或合成中发现的任何生物物质，包含但不限于细胞、病毒、亚细胞颗粒、蛋白质，包含更具体地抗体、免疫球蛋白、抗原、脂蛋白、糖蛋白、肽、多肽、蛋白质复合物、(链霉)抗生物素蛋白－生物素复合物、配体、受体、或小分子、适体、核酸、DNA、RNA、肽核酸、寡糖、多糖、脂多糖、细胞代谢物、半抗原、药理学活性物质、生物碱、类固醇、维生素、氨基酸、和糖)。在一些实施方式中，捕获剂可包括亲和标签。在一些实施方式中，捕获剂可优先结合目标靶多肽或核酸。捕获剂可以自由漂浮在混合物中。捕获剂可以结合到颗粒(例如，珠、微珠、纳米颗粒)上。捕获剂可以结合到固体或半固体表面。在一些情况下，捕获剂不可逆地结合到靶标。在其它情况下，捕获剂可逆地结合到靶标(例如，如果靶可以被洗脱、或通过使用化学品如咪唑)。

核酸在ANP32基因座的靶向整合

外源核酸在ANP32基因座的位点特异性整合可通过本领域技术人员已知的任何技术完成。例如，外源核酸在ANP32基因座的整合可包括使细胞(例如分离的细胞或组织或生物体中的细胞)与包括外源核酸的核酸分子接触。这种核酸分子可包括侧接外源核酸的核苷酸序列，其促进核酸分子和至少一个ANP32基因座之间的同源重组。促进同源重组的侧接外源核酸的核苷酸序列可以与ANP32基因座的内源核苷酸互补。或者，促进同源重组的侧接外源核酸的核苷酸序列可以与先前整合的外源核苷酸互补。多个外源核酸可整合在一个ANP32基因座上，例如在基因堆叠中。

核酸在ANP32基因座的整合可通过宿主细胞的内源细胞机器，例如但不限于内源DNA和内源重组酶，来促进(例如催化)。或者，提供给宿主细胞的一种或多种因子(例如多肽)可促进核酸在ANP32基因座的整合。例如，通过使多肽与宿主细胞接触、或通过在宿主细胞内表达多肽，可以提供核酸酶、重组酶、和/或连接酶多肽(独立地或作为嵌合多肽的一部分)。因此，可将包含编码至少一种核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽的核苷酸序列的核酸导入宿主细胞中，该核酸序列可与要在ANP32基因座上进行位点特异性整合的核酸同时或依次导入，其中至少一种核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽由宿主细胞中的核苷酸序列表达。

DNA结合多肽

位点特异性整合可以通过使用能够识别和结合例如宿主生物体基因组中的特定核苷酸序列的因子来实现。例如，许多蛋白质包括能够以位点特异性方式识别并结合DNA的多肽结构域。被DNA结合多肽识别的DNA序列可以被称为“靶”序列。能够以位点特异性方式识别并结合DNA的多肽结构域通常正确折叠并且独立地发挥功能以位点特异性方式结合DNA，即使当在与最初分离该结构域的蛋白质不同的多肽中表达时也是如此。类似地，用于DNA结合多肽识别和结合的靶序列通常能够被这些多肽识别和结合，即使当存在于大的DNA结构(例如染色体)中时，特别是当靶序列所处的位点是已知的可溶性细胞蛋白(例如基因)可接近的位点时。

虽然从天然存在的蛋白质中鉴定的DNA结合多肽通常结合离散的核苷酸序列或基序(例如共有识别序列)，但是存在修饰许多这样的DNA结合多肽以识别不同的核苷酸序列或基序的方法，并且是本领域已知的。DNA结合多肽包含，例如但不限于：锌指DNA结合结构域；亮氨酸拉链；UPA DNA结合结构域；GAL4；TAL；LexA；Tet阻遏物；LacI；和类固醇激素受体。

例如，DNA结合多肽可以是锌指。可以设计单个锌指基序以靶向和特异性结合任何大范围的DNA位点。典型的Cys₂His₂(以及非典型的Cys₃His)锌指多肽通过将α螺旋插入靶DNA双螺旋的大沟中而结合DNA。锌指对DNA的识别是模块化的；每个指主要接触靶中的三个连续碱基对，并且多肽中的几个关键残基介导识别。通过在靶向核酸内切酶中包含多个锌指DNA结合结构域，靶向核酸内切酶的DNA结合特异性可进一步提高(因此由此赋予的任何基因调节作用的特异性也可提高)。参见，例如Urnov et al.(2005)Nature 435:646-51。因此，可以工程化和利用一种或多种锌指DNA结合多肽，使得引入宿主细胞的靶向内切核酸酶与宿主细胞基因组内独特的DNA序列相互作用。

优选地，锌指蛋白是非天然存在的，因为它被工程化以结合选择的靶位点。参见，例如，Beerli et al.(2002)Nature Biotechnol.20:135–141；Pabo et al.(2001)Ann.Rev.Biochem.70:313–340；Isalan et al.(2001)Nature Biotechnol.19:656–660；Segal et al.(2001)Curr.Opin.Biotechnol.12:632–637；Choo et al.(2000)Curr.Opin.Struct.Biol.10:411–416；美国专利6,453,242；6,534,261；6,599,692；6,503,717；6,689,558；7,030,215；6,794,136；7,067,317；7,262,054；7,070,934；7,361,635；7,253,273；和美国专利公开2005/0064474；2007/0218528；2005/0267061。

与天然存在的锌指蛋白相比，工程化的锌指结合结构域可以具有新的结合特异性。工程方法包含但不限于合理设计和各种类型的选择。合理设计包含例如使用包括三联体(或四联体)核苷酸序列和单独的锌指氨基酸序列的数据库，其中每个三联体或四联体核苷酸序列与结合特定三联体或四联体序列的锌指的一个或多个氨基酸序列相关联。参见，例如，美国专利6,453,242和6,534,261。

示例性的选择方法，包含噬菌体展示和双杂交系统，公开于美国专利5,789,538；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,410,248；6,140,466；6,200,759；6,242,568；以及WO98/37186；WO 98/53057；WO 00/27878；WO 01/88197和GB 2,338,237。此外，例如在WO 02/077227中已经描述了对锌指结合结构域的结合特异性的增强。

此外，如这些和其他参考文献中所公开的，锌指结构域和/或多指锌指蛋白可使用任何合适的接头序列连接在一起，包含例如长度为5个或更多个氨基酸的接头。还参见美国专利6,479,626；6,903,185；7,153,949表示长度为6个或更多氨基酸的示例性接头序列。本文所述的蛋白质可以包含蛋白质的单个锌指之间的合适接头的任何组合。

靶位点的选择：ZFP以及设计和构建融合蛋白(和编码其的多核苷酸)的方法是本领域技术人员已知的，并详细描述于美国专利6,140,081；5,789,538；6,453,242；6,534,261；5,925,523；6,007,988；6,013,453；6,200,759；WO 95/19431；WO 96/06166；WO 98/53057；WO 98/54311；WO 00/27878；WO 01/60970WO 01/88197；WO 02/099084；WO 98/53058；WO 98/53059；WO 98/53060；WO 02/016536和WO 03/016496。

当已经使用锌指核酸酶对本文所述的动物或细胞进行遗传编辑时，可以使用包括将编码靶向锌指核酸酶的至少一种RNA分子和可选地至少一种辅助多核苷酸引入胚胎或细胞的方法来产生动物或细胞。该方法还包括孵育胚胎或细胞以允许锌指核酸酶的表达，其中由锌指核酸酶引入到靶向染色体序列中的双链断裂通过易错非同源末端连接DNA修复过程或同源定向DNA修复过程修复。使用靶向锌指核酸酶技术编辑编码与种系发育相关的蛋白质的染色体序列的方法是快速、精确、和高效的。

或者，DNA结合多肽是GAL4的DNA结合结构域。GAL4在酿酒酵母中是模块化转录因子，但在许多其它生物体中也作为转录因子起作用。参见，例如Sadowski et al.(1988)Nature 335:563–4。在这调节系统中，编码酿酒酵母半乳糖代谢通路酶的基因的表达受可利用的碳源严格调节。Johnston(1987)Microbiol.Rev.51:458–76。这些代谢酶的转录控制是由正调节蛋白GAL4、与GAL4特异性结合的17bp对称DNA序列(上游激活序列(UAS))之间的相互作用介导的。

天然GAL4由881个氨基酸残基组成，分子量为99kDa。GAL4包括功能性自主结构域，其组合活性说明GAL4的体内活性。Ma and Ptashne(1987)Cell 48:847–53)；Brent andPtashne(1985)Cell 43(3Pt 2):729–36。GAL4的N端65个氨基酸包括GAL4 DNA结合结构域。Keegan et al.(1986)Science 231:699–704；Johnston(1987)Nature328:353–5。序列特异性结合需要存在由DNA结合结构域中存在的六个Cys残基配位的二价阳离子。含有配位阳离子的结构域通过与DNA螺旋的大沟直接接触而与位于17bp UAS的每个末端的保守CCG三联体相互作用并识别该三联体。Marmorstein et al.(1992)Nature 356:408–14。蛋白质的DNA结合功能将转录激活结构域定位在启动子附近的C端，使得激活结构域可以指导转录。

可使用的其它DNA结合多肽包含，例如但不限于，来自AVRBS3诱导型基因的结合序列；来自AVRBS3诱导型基因的共有结合序列或由其工程改造的合成结合序列(例如UPA DNA结合结构域)；TAL；LexA(参见，例如，Brent&Ptashne(1985)，同上)；LacR(参见，例如，Labowet al.(1990)Mol.Cell.Biol.10:3343–56；Baim etal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA88(12):5072–6)；类固醇激素受体(Elliston et al.(1990)J.Biol.Chem.265:11517–121)；Tet阻遏物(美国专利6,271,341)和在四环素(Tc)存在但不存在时结合tet操纵子序列的Tet阻遏物变体；NF-κB的DNA结合结构域；和Wang et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91(17):8180–4中所述的调节系统的组成部分，其利用GAL4、激素受体、和VP16的融合。

本文所述的方法和组合物中使用的一种或多种核酸酶的DNA结合结构域可包括天然存在的或工程化的(非天然存在的)TAL效应物DNA结合结构域。参见例如美国专利公开2011/0301073。

或者，核酸酶可包括CRISPR系统。例如，核酸酶可包括CRISPR/Cas系统。

CRISPR相关系统在细菌和古细菌中进化为适应性免疫系统以防御病毒攻击。在暴露于病毒时，病毒DNA的短片段被整合到CRISPR基因座中。RNA从CRISPR基因座的包含病毒序列的部分转录。那RNA，其包含与病毒基因组互补的序列，介导Cas蛋白(例如Cas9蛋白)靶向病毒基因组中的序列。Cas蛋白切割并由此沉默病毒靶标。最近，CRISPR/Cas系统已经适应于真核细胞中的基因组编辑。位点特异性双链断裂(DSB)的引入使得能够通过二种内源DNA修复机制，非同源末端连接(NHEJ)或同源定向修复(HDR)，其中之一改变靶序列。CRISPR/Cas系统也已经用于基因调节，包含转录阻遏和激活而不改变靶序列。基于CRISPR/Cas系统的靶向基因调控可以例如使用无酶活性的Cas9(也称为催化失活的Cas9)。

CRISPR/Cas系统包含CRISPR(成簇规律间隔短回文重复序列)基因座，其编码系统的RNA组分，和Cas(CRISPR相关的)基因座，其编码蛋白质(Jansen et al.,2002.Mol.Microbiol.43:1565–1575；Makarova et al.,2002.Nucleic Acids Res.30:482–496；Makarova et al.,2006.Biol.Direct 1:7；Haft et al.,2005.PLoSComput.Biol.1:e60)。微生物宿主中的CRISPR基因座含有Cas基因以及能够编程CRISPR介导的核酸切割的特异性的非编码RNA元件的组合。

II型CRISPR是最充分表征的系统之一，并且在四个连续步骤中进行天然的靶向DNA双链断裂。首先，从CRISPR基因座转录二种非编码RNA，前crRNA阵列和tracrRNA。其次，tracrRNA与pre-crRNA的重复区域杂交，介导将pre-crRNA加工成含有单个间隔序列的成熟crRNA。第三，成熟crRNA:tracrRNA复合物通过crRNA上的间隔区和与原型间隔区相邻基序(PAM)相邻的靶DNA上的原型间隔区之间的Watson-Crick碱基配对将Cas9引导至靶DNA，这是靶识别的额外要求。最后，Cas9介导靶DNA的切割以在原型间隔子内产生双链断裂。

为了使用CRISPR/Cas系统来产生靶向插入和缺失，可以用称为向导RNA(gRNA)的单一RNA代替两个非编码RNA(crRNA和TracrRNA)。CRISPR/Cas系统的活性包括三个步骤：在称为“适应”的过程中，将外源DNA序列插入CRISPR阵列中以防止未来的攻击，(ii)表达相关蛋白质、以及表达和加工阵列，然后(iii)RNA介导的对外源核酸的干扰。在细菌细胞中，几种Cas蛋白涉及CRISPR/Cas系统的天然功能，并且在诸如外源DNA的插入等功能中起作用。

Cas蛋白可以是天然存在的Cas蛋白的“功能衍生物”。天然序列多肽的“功能衍生物”是具有与天然序列多肽相同的定性生物学特性的化合物。“功能衍生物”包含但不限于天然序列的片段和天然序列多肽及其片段的衍生物，条件是它们具有与相应的天然序列多肽相同的生物活性。本文所考虑的生物活性是功能性衍生物将DNA底物水解成片段的能力。术语“衍生物”包括多肽的氨基酸序列变体、共价修饰及其融合。Cas多肽或其片段的合适衍生物包含但不限于Cas蛋白或其片段的突变体、融合物、共价修饰。Cas蛋白，其包含Cas蛋白或其片段，以及Cas蛋白或其片段的衍生物，可以从细胞获得或化学合成或通过这二种流程的组合获得。细胞可以是天然产生Cas蛋白的细胞，或天然产生Cas蛋白并经遗传工程改造以在较高表达水平下产生内源Cas蛋白、或从外源引入的核酸产生Cas蛋白的细胞，该核酸编码与内源Cas相同或不同的Cas。在一些情况下，该细胞不天然产生Cas蛋白，并且经遗传工程改造以产生Cas蛋白。

当使用CRISPR系统对本文所述的动物或细胞进行遗传编辑时，CRISPR/Cas9系统可以用于产生动物或细胞。为了使用Cas9编辑基因组序列，可以将蛋白质直接递送至细胞。或者，可将编码Cas9的mRNA递送至细胞、或可将提供编码Cas9的mRNA表达的基因递送至细胞。此外，靶标特异性crRNA和tracrRNA可以直接递送至细胞，或者靶标特异性gRNA可以递送至细胞(这些RNA可以替代地由构建为表达这些RNA的基因产生)。靶位点的选择和crRNA/gRNA的设计是本领域公知的。对gRNA的构建和克隆的讨论可以在http://www.genome-engineering.org/crispr/wp-content/uploads/2014/05/CRISPR-Reagent-Description-Rev20140509.pdf.中找到。

CRISPR/Cas系统的向导RNA或DNA结合多肽可以特异性识别并结合包括在宿主生物体的基因组核酸内的靶核苷酸序列。在一些实例中，可以在宿主基因组中发现靶核苷酸序列的任何数目的离散实例。靶核苷酸序列在生物体基因组中可以是罕见的(例如，基因组中可以存在少于约10、约9、约8、约7、约6、约5、约4、约3、约2、或约1个拷贝的靶序列)。例如，靶核苷酸序列可以位于生物体基因组内的独特位点。靶核苷酸序列可以是，例如但不限于，相对于彼此随机地分散在基因组中；位于基因组中的不同连锁群中；位于相同的连锁群中；位于不同的染色体上；位于相同染色体上；位于基因组中在生物体中相似条件下表达的位点(例如，在相同、或基本上功能相同的调控因子的控制下)；以及在基因组中彼此靠近(例如，靶序列可包括在作为连环体整合在基因组基因座处的核酸内)。

靶向内切核酸酶

特异性识别并结合靶核苷酸序列的DNA结合多肽可包括在嵌合多肽中，以便赋予嵌合多肽对靶序列的特异性结合。在实例中，这样的嵌合多肽可包括，例如但不限于，核酸酶、重组酶、和/或连接酶多肽，如上文所述的这些多肽。包括DNA结合多肽和核酸酶、重组酶和/或连接酶多肽的嵌合多肽还可包括其它功能性多肽基序和/或结构域，例如但不限于：位于嵌合蛋白中的功能性多肽之间的间隔区序列；前导肽；将融合蛋白靶向细胞器(例如，细胞核)的肽；被细胞酶切割的多肽；肽标签(例如Myc、His等)；和不干扰嵌合多肽功能的其它氨基酸序列。

嵌合多肽中的功能性多肽(例如，DNA结合多肽和核酸酶多肽)可以可操作地连接。嵌合多肽的功能多肽可以通过它们从编码至少彼此框内连接的功能多肽的单个多核苷酸的表达而可操作地连接，以便产生编码嵌合蛋白的嵌合基因。或者，嵌合多肽的功能多肽可以通过其它手段可操作地连接，例如通过独立表达的多肽的交联。

特异性识别并结合靶核苷酸序列的DNA结合多肽、或向导RNA可包括在天然分离的蛋白质(或其变体)内，其中天然分离的蛋白质或其变体还包括核酸酶多肽(并且还可包括重组酶和/或连接酶多肽)。这种分离的蛋白质的实例包含TALEN、重组酶(例如Cre、Hin、Tre和FLP重组酶)、RNA引导的CRISPR/Cas9、和大范围核酸酶。

如本文所用，术语“靶向核酸内切酶”是指天然的或工程化的分离的蛋白质及其变体，其包括DNA结合多肽或向导RNA和核酸酶多肽，以及指包括DNA结合多肽或向导RNA和核酸酶的嵌合多肽。可以使用任何包括特异性识别并结合ANP32基因座内包括的靶核苷酸序列的DNA结合多肽或向导RNA的靶向内切核酸酶(例如，因为靶序列包括在基因座处的天然序列内，或因为靶序列已引入基因座中，例如通过重组)。

合适的嵌合多肽的一些实例包含但不限于以下多肽的组合：锌指DNA结合多肽；FokI核酸酶多肽；TALE结构域；亮氨酸拉链；转录因子DNA结合基序；以及从例如但不限于TALEN、重组酶(例如Cre、Hin、RecA、Tre、和FLP重组酶)、RNA引导的CRISPR/Cas9、大范围核酸酶分离的DNA识别和/或切割结构域；以及本领域技术人员已知的其它材料。具体的实例包含包含位点特异性DNA结合多肽和核酸酶多肽的嵌合蛋白。嵌合多肽可以通过本领域技术人员已知的方法进行工程改造，以改变包括在嵌合多肽中的DNA结合多肽的识别序列，从而使嵌合多肽靶向特定的感兴趣核苷酸序列。

嵌合多肽可包括DNA结合结构域(例如，锌指、TAL效应物结构域等)和核酸酶(切割)结构域。切割结构域可以是与DNA结合结构域异源的，例如锌指DNA结合结构域和来自核酸酶的切割结构域或TALEN DNA结合结构域和切割结构域，或大范围核酸酶DNA结合结构域和来自不同核酸酶的切割结构域。异源切割结构域可以从任何内切核酸酶或外切核酸酶获得。可衍生出切割结构域的示例性内切核酸酶包含但不限于限制性内切核酸酶和归巢内切核酸酶。参见，例如2002–2003Catalogue,New England Biolabs,Beverly,Mass.；andBelfort et al.(1997)Nucleic Acids Res.25:3379–3388。切割DNA的其它酶是已知的(例如51核酸酶；绿豆核酸酶；胰腺脱氧核糖核酸酶I；微球菌核酸酶；酵母HO核酸内切酶；也参见Linn et al.(eds.)Nucleases,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1993)。这些酶(或其功能片段)中的一种或多种可用作切割结构域和切割半结构域的来源。

类似地，切割半结构域可以衍生自如上所述的任何核酸酶或其部分，其需要二聚化以获得切割活性。通常，如果融合蛋白包括切割半结构域，则切割需要两个融合蛋白。或者，可以使用包括两个切割半结构域的单一蛋白质。两个切割半结构域可以衍生自相同的内切核酸酶(或其功能性片段)，或每个切割半结构域可以衍生自不同的内切核酸酶(或其功能性片段)。此外，两个融合蛋白的靶位点优选相对于彼此安置，使得两个融合蛋白与其各自靶位点的结合将切割半结构域置于彼此空间取向，这允许切割半结构域例如通过二聚化形成功能性切割域。因此，靶位点的近边可以被5–8个核苷酸或15–18个核苷酸分开。然而，任何整数的核苷酸、或核苷酸对，可以介于两个靶位点之间(例如，2至50个核苷酸对或更多)。通常，切割位点位于靶位点之间。

限制性内切核酸酶(限制酶)存在于许多物种中且能够序列特异性结合DNA(在识别位点)，并且在结合位点或结合位点附近切割DNA，例如，使得一个或多个外源序列(供体/转基因)整合在结合(靶)位点处或结合(靶)位点附近。某些限制酶(例如，IIS型)在从识别位点去除的位点切割DNA，并具有可分离的结合和切割结构域。例如，IIS型酶Fok I在一条链上从其识别位点的9个核苷酸处和在另一条链上从其识别位点的13个核苷酸处催化DNA的双链切割。参见，例如，美国专利5,356,802；5,436,150和5,487,994；以及Li et al.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4275–4279；Li et al.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2764–2768；Kim et al.(1994a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91:883–887；Kim et al.(1994b)J.Biol.Chem.269:31,978–31,982。因此，融合蛋白可包括来自至少一种IIS型限制酶的切割结构域(或切割半结构域)和一个或多个锌指结合结构域，其可以是工程化的或未工程化的。

一种示例性的IIS型限制酶是Fok I，其切割结构域与结合结构域为可分离。这特殊的酶作为二聚体是有活性的。Bitinaite et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95:10,570–10,575。因此，为了本公开的目的，在公开的融合蛋白中使用的Fok I酶的部分被认为是切割半结构域。因此，对于使用锌指－Fok I融合体的细胞序列的靶向双链切割和/或靶向置换，可以使用各自包括Fok I切割半结构域的两个融合蛋白来重构催化活性的切割结构域。或者，也可以使用含有DNA结合结构域和两个Fok I切割半结构域的单个多肽分子。

切割结构域或切割半结构域可以是蛋白质的任何部分，其保留切割活性、或保留多聚化(例如二聚化)以形成功能性切割结构域的能力。

示例性的IIS型限制酶描述于美国专利公开2007/0134796。另外的限制酶也含有可分离的结合和切割结构域，并且这些结构域是本公开内容所考虑的。参见，例如，Robertset al.(2003)Nucleic Acids Res.31:418–420。

切割结构域可包括一个或多个工程化切割半结构域(也称为二聚化结构域变体)，其最小化或防止同二聚化，如例如在美国专利公开2005/0064474；2006/0188987和2008/0131962。

或者，核酸酶可以使用所谓的“裂解酶”技术在核酸靶位点体内组装(参见例如美国专利公开20090068164)。这种裂解酶的组分可以在单独的表达构建体上表达，或者可以在一个开放阅读框中连接，其中单个组分例如通过自裂解2A肽或IRES序列分开。组分可以是单独的锌指结合结构域或大范围核酸酶核酸结合结构域的结构域。

锌指核酸酶

嵌合多肽可包括定制设计的锌指核酸酶(ZFN)，其可设计成递送靶位点特异性双链DNA断裂，外源核酸或供体DNA可整合到该断裂中(参见美国专利公开2010/0257638)。ZFN是嵌合多肽，其含有来自限制性内切核酸酶(例如FokI)的非特异性切割结构域和锌指DNA结合结构域多肽。参见，例如Huang et al.(1996)J.Protein Chem.15:481–9；Kim et al.(1997a)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:3616–20；Kim et al.(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:1156–60；Kim et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:883–7；Kim et al.(1997b)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:12875–9；Kim et al.(1997c)Gene 203:43–9；Kim et al.(1998)Biol.Chem.379:489–95；Nahon and Raveh(1998)Nucleic Acids Res.26:1233–9；Smith et al.(1999)Nucleic Acids Res.27:674–81。ZFN可包括非常规锌指DNA结合结构域(参见美国专利公开2008/0182332)。FokI限制性内切核酸酶必须通过核酸酶结构域二聚化以切割DNA并引入双链断裂。因此，含有来自这种核酸内切酶的核酸酶结构域的ZFN也需要核酸酶结构域的二聚化以切割靶DNA。Mani et al.(2005)Biochem.Biophys.Res.Commun.334:1191–7；Smith et al.(2000)Nucleic AcidsRes.28:3361–9。两个相邻的、方向相反的DNA结合位点可促进ZFN的二聚化。Id.

用于将外源核酸位点特异性整合到宿主的至少一个ANP32基因座中的方法可包括将ZFN引入宿主细胞中，其中ZFN识别靶核苷酸序列并与其结合，其中靶核苷酸序列包括在宿主的至少一个ANP32基因座内。在某些实例中，靶核苷酸序列不包括在宿主基因组中除至少一个ANP32基因座以外的任何其它位置。例如，可对ZFN的DNA结合多肽进行工程改造，以识别并结合在至少一个ANP32基因座内鉴定的靶核苷酸序列(例如通过对ANP32基因座进行测序)。用于将外源核酸位点特异性整合到宿主的至少一个ANP32性能基因座中的方法包括将ZFN引入宿主细胞中，还可包括将外源核酸引入细胞中，其中通过位点特异性识别和ZFN与靶序列的结合(和随后的包括ANP32基因座的核酸的裂解)促进外源核酸重组到包括至少一个ANP32基因座的宿主的核酸中。

用于在ANP32基因座整合的可选外源核酸

用于在ANP32基因座整合的外源核酸包含：用于在至少一个ANP32基因座中位点特异性整合的外源核酸，例如但不限于ORF；包括编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列的核酸；和包括上述中的一种或二种中的至少一种的载体。因此，特定的核酸包含编码多肽的核苷酸序列、结构核苷酸序列、和/或DNA结合多肽识别和结合位点。

用于位点特异性整合的可选外源核酸分子

如上所述，提供了外源序列(也称为“供体序列”或“供体”或“转基因”)的插入，例如用于多肽的表达、突变基因的校正、或野生型基因的增加的表达。显而易见的是，供体序列通常与其所处的基因组序列不相同。供体序列可以含有被两个同源区侧接的非同源序列，以允许在感兴趣位置处进行有效的同源定向修复(HDR)。另外，供体序列可包括含有与细胞染色质中的感兴趣区域不同源的序列的载体分子。供体分子可以含有几个不连续的与细胞染色质同源的区域。例如，对于通常不存在于感兴趣区域中的序列的靶向插入，所述序列可以存在于供体核酸分子中并且被与感兴趣区域中的序列同源的区域侧接。

供体多核苷酸可以是单链或双链的DNA或RNA，并且可以以线性或环状形式引入细胞。参见例如美国专利公开2010/0047805、2011/0281361、2011/0207221、和2013/0326645。如果以线性形式引入，则供体序列的末端可通过本领域技术人员已知的方法保护(例如，免受核酸外切降解)。例如，将一个或多个双脱氧核苷酸残基添加至线性分子的3′末端和/或将自身互补寡核苷酸连接至一个或两个末端。参见，例如Chang et al.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:4959–4963；Nehls et al.(1996)Science 272:886–889。保护外源多核苷酸免于降解的其它方法包含但不限于添加末端氨基和使用修饰的核苷酸间键，例如硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、和O-甲基核糖或脱氧核糖残基。

多核苷酸可以作为具有例如是复制起点、启动子和编码抗生素抗性的基因的另外的序列的载体分子的一部分被引入细胞。此外，供体多核苷酸可以作为裸核酸、作为与诸如脂质体或泊洛沙姆的试剂复合的核酸引入，或者可以通过病毒(例如，腺病毒、AAV、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒和整合酶缺陷慢病毒(IDLV))递送。

供体通常被整合，使得其表达由整合位点的内源启动子驱动，即驱动供体整合入其中的内源基因(例如ANP32)表达的启动子。然而，显然供体可包括启动子和/或增强子，例如组成型启动子或诱导型或组织特异性启动子。

此外，尽管不是表达所必需的，外源序列也可包含转录或翻译调节序列，例如启动子、增强子、绝缘子、内部核糖体进入位点、编码2A肽和/或聚腺苷酸化信号的序列。

可以位点特异性方式整合到至少一个ANP32基因座中以修饰ANP32基因座的外源核酸包含，例如但不限于，包括编码感兴趣多肽的核苷酸序列的核酸；包括农艺基因的核酸；包括编码RNAi分子的核苷酸序列的核酸；或破坏ANP32基因的核酸。

外源核酸可以整合在ANP32基因座，以修饰ANP32基因座，其中该核酸包括编码感兴趣多肽的核苷酸序列，使得该核苷酸序列在宿主中从ANP32基因座表达。在一些实例中，从编码感兴趣多肽的核苷酸序列以商业量表达感兴趣多肽(例如，外源蛋白)。在这样的实例中，可以从宿主细胞、组织、或生物质提取感兴趣多肽。

包括编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列的核酸分子

编码靶向核酸内切酶的核苷酸序列可通过操作(例如连接)编码包括在靶向核酸内切酶内的多肽的天然核苷酸序列而工程化。例如，可以检查编码包括DNA结合多肽的蛋白质的基因的核苷酸序列，以鉴定对应于DNA结合多肽的基因的核苷酸序列，并且该核苷酸序列可以用作编码包括DNA结合多肽的靶向内切核酸酶的核苷酸序列的元件。或者，靶向内切核酸酶的氨基酸序列可用于例如根据遗传密码的简并性推断编码靶向内切核酸酶的核苷酸序列。

在包括编码靶向内切核酸酶的核苷酸序列的示例性核酸分子中，编码核酸酶多肽的第一多核苷酸序列的最后密码子、和编码DNA结合多肽的第二多核苷酸序列的第一密码子，可以被任何数目的核苷酸三联体分开，例如，不编码内含子或“STOP”。“同样，编码DNA结合多肽的第一多核苷酸序列的核苷酸序列的最后密码子、和编码核酸酶多肽的第二多核苷酸序列的第一密码子，可以被任何数目的核苷酸三联体分开。编码核酸酶多肽的第一多核苷酸序列、和编码DNA结合多肽的第二多核苷酸序列的最后密码子(即，核酸序列中的最3′端)，可以与直接与其邻接的另一多核苷酸编码序列的第一密码子相位对齐地融合，或与其分开不超过短肽序列，例如由合成的核苷酸接头(例如，可以用于实现融合的核苷酸接头)编码的序列。这些其它多核苷酸序列的实例包含，例如但不限于，标签、靶向肽、和酶切割位点。同样，第一和第二多核苷酸序列的最5′(在核酸序列中)的第一密码子可以与直接邻接的另一多核苷酸编码序列的最后密码子相位对齐地融合，或通过不多于短肽序列与其分开。

分离编码靶向核酸内切酶中功能性多肽(例如，DNA结合多肽和核酸酶多肽)的多核苷酸序列的序列可以例如由任何序列组成，使得编码的氨基酸序列不可能显著改变靶向核酸内切酶的翻译。由于已知核酸酶多肽和已知DNA结合多肽的自主性质，间插序列将不干扰这些结构的各自功能。

其他敲除方法

本领域已知的各种其它技术可用于使基因失活以制备敲除动物和/或将核酸构建体引入动物中以产生起始动物和制备动物系，其中敲除或核酸构建体整合到基因组中。这些技术包含但不限于原核微注射(美国专利4,873,191)，逆转录病毒介导的基因转移至生殖系(Van der Putten et al.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,6148-1652)，基因靶向到胚胎干细胞中(Thompson et al.(1989)Cell 56,313-321)，胚胎电穿孔(Lo(1983)Mol.Cell.Biol.3,1803-1814)，精子介导的基因转移(Lavitrano et al.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,14230-14235；Lavitrano et al.(2006)Reprod.Fert.Develop.18,19-23)，以及体细胞，例如卵丘或乳腺细胞、或成体、胎儿、或胚胎干细胞，的体外转化，随后进行核移植(Wilmut et al.(1997)Nature 385,810-813；andWakayama et al.(1998)Nature 394,369-374)。前核显微注射、精子介导的基因转移、和体细胞核转移是特别有用的技术。经基因组编辑的动物是其中其所有细胞，包含其生殖系细胞，都具有编辑的动物。当使用产生其修饰为嵌合的动物的方法时，动物可以是近交的，并且可以选择经基因组编辑的后代。例如，如果在胚泡状态下修饰其细胞，克隆可用于制备嵌合动物，或者基因组编辑可在编辑单个细胞时进行。经编辑以致它们不是性成熟的动物对于编辑可以是纯合的或杂合的，这取决于所使用的具体方法。如果特定基因通过敲除编辑失活，则通常需要纯合性。如果特定基因通过RNA干扰或显性阴性策略失活，那么杂合性通常是足够的。

通常，在胚胎/合子显微注射中，将核酸构建体或mRNA引入受精卵；一个或两个细胞受精卵被用作含有来自精子头的遗传物质的核结构，并且卵在原生质中是可见的。前核阶段受精卵可以在体外或体内获得(即，从供体动物的输卵管手术提取)。体外受精卵可以如下所述生产。例如，猪卵巢可以在屠宰场收集，并在运输期间维持在22–28℃。可以洗涤并分离卵巢用于卵泡抽吸，并且可以使用18号针头并在真空下将4–8mm范围内的卵泡抽吸到50mL圆锥形离心管中。卵泡液和吸出的卵母细胞可以用市售的TL-HEPES(威斯康辛州维罗纳的Minitube)通过预过滤器冲洗。可以选择被致密卵丘团包围的卵母细胞，并放入补充了0.1mg/mL半胱氨酸、10ng/mL表皮生长因子、10％猪卵泡液、50μM 2-巯基乙醇、0.5mg/mLcAMP、妊娠马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)各10IU/mL的TCM-199卵母细胞成熟培养基(威斯康辛州维罗纳的MiniTube)中，在38.7℃和5％CO₂的潮湿空气中保持约22小时。随后，可以将卵母细胞移至不含cAMP、PMSG或hCG的新鲜TCM-199成熟培养基中，并再孵育22小时。成熟的卵母细胞可以通过在0.1％透明质酸酶中涡旋1分钟而剥离其卵丘细胞。

对于猪，成熟的卵母细胞可以在于微管5孔受精皿中的500μl Minitube PORCPROIVF培养基体系(威斯康辛州维罗纳的Minitube)中受精。在体外受精(IVF)的制备中，可以将新鲜收集的或冷冻的公猪精液洗涤并重悬于PORCPRO IVF培养基中至400,000个精子。精子浓度可以通过计算机辅助精液分析(威斯康辛州维罗纳的Minitube的SPERMVISION)进行分析。最终的体外授精可以在10μl体积中以约40个活动精子/卵母细胞的终浓度进行，这取决于公猪。所有受精卵母细胞可以在38.7℃、5.0％CO₂气氛下孵育六小时。授精后六小时，可以在NCSU-23中洗涤推定合子二次，并将其移至0.5mL的相同培养基中。这体系可以以10–30％的多精子数授精率在大多数公猪上常规地产生20–30％的胚泡。

线性化的核酸构建体或mRNA可以被注射到一个原核或细胞质中。然后，可以将注射的卵转移至受体雌性(例如，进入受体雌性的输卵管)并允许在受体雌性中发育以产生经基因编辑的动物。特别地，体外受精的胚胎可以15,000×g离心5分钟以沉淀脂质，使得原核可视化。可使用Eppendorf FEMTOJET注射器注射胚胎，并可培养胚胎直至胚泡形成。可记录胚胎分裂和胚泡形成的速率和质量。

胚胎可通过手术转移到异步受体的子宫中。通常，可以使用5.5英寸导管将100–200(例如150–200)个胚胎放置在输卵管的壶腹－峡部连接处。手术后，可以进行怀孕的实时超声检查。

在体细胞核移植中，可以将包含上述核酸构建体的转基因或经基因编辑的细胞，例如胚胎卵裂球、胎儿成纤维细胞、成体耳成纤维细胞、或颗粒细胞，引入去核卵母细胞中以建立组合细胞。卵母细胞可以通过靠近极体的部分区带解剖然后在解剖区域压出细胞质来去核。通常，使用具有锋利斜面尖端的注射吸管将转基因或经基因编辑的细胞注射到停滞在减数第二次分裂的去核卵母细胞中。在一些情况下，停留在减数第二次分裂的卵母细胞被称为卵。在产生猪或牛胚胎(例如，通过融合和激活卵母细胞)后，在激活后约20至24小时，将胚胎转移至受体雌性的输卵管。参见，例如，Cibelli et al.(1998)Science 280,1256–1258和美国专利6,548,741、7,547,816、7,989,657、或6,211,429。对于猪，可以在胚胎移植后大约20–21天检查受体雌性的妊娠。

可以使用标准育种技术从最初的杂合起始动物中产生失活基因纯合的动物。然而，可能不需要纯合性。本文所述的经基因编辑的猪可以与其它感兴趣的猪进行繁殖。

一旦产生了经基因编辑的动物，就可以使用标准技术评估内源核酸的失活。最初的筛选可以通过Southern印迹分析来确定是否发生了失活。关于Southern分析的描述，参见Sambrook et al.,1989,Molecular Cloning,ALaboratory Manual,second edition,Cold Spring Harbor Press,Plainview；N.Y.的第9.37–9.52节。聚合酶链式反应(PCR)技术也可用于初始筛选。PCR是指扩增靶核酸的流程或技术。通常，使用来自感兴趣区域末端或以外的序列信息来设计与待扩增模板的相反链序列相同或相似的寡核苷酸引物。PCR可用于扩增来自DNA以及RNA的特定序列，包含来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。引物通常长度为14至40个核苷酸，但长度范围可从10个核苷酸至数百个核苷酸。PCR描述于，例如PCR引物:A Laboratory Manual,ed.Dieffenbach and Dveksler,Cold Spring HarborLaboratory Press,1995。核酸还可以通过连接酶链式反应、链置换扩增、自持序列复制、或基于核酸序列的扩增，来扩增。参见，例如Lewis(1992)Genetic Engineering News 12,1；Guatelli et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874；Weiss(1991)Science 254:1292。在胚泡期，可单独处理胚胎以通过PCR、Southern杂交和splinkerette PCR进行分析(参见例如Dupuy et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA(2002)99:4495)。

干扰RNA

已知多种干扰RNA(RNAi)系统。双链RNA(dsRNA)诱导同源基因转录物的序列特异性降解。RNA诱导的沉默复合物(RISC)将dsRNA代谢为小的21–23个核苷酸的小干扰RNA(siRNA)。RISC包含双链RNA酶(dsRNA酶，例如Dicer)和ssRNA酶(例如Argonaut 2或Ago2)。RISC利用反义链作为向导来发现可切割的靶标。siRNA和微小RNA(miRNA)都是已知的。灭活经遗传编辑的动物中的基因的方法包括诱导针对靶基因和/或核酸的RNA干扰从而降低靶基因和/或核酸的表达。

例如，外源核酸序列可以诱导针对编码多肽的核酸的RNA干扰。例如，与靶DNA同源的双链小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)可以用于减少该DNA的表达。siRNA的构建体可以按照所述方法生产，例如Fire et al.(1998)Nature 391:806；Romano and Masino(1992)Mol.Microbiol.6:3343；Cogoni et al.(1996)EMBO J.15:3153；Cogoni andMasino(1999)Nature 399:166；Misquitta and Paterson(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96:1451；以及Kennerdell and Carthew(1998)Cell 95:1017。shRNA的构建体可以如McIntyre and Fanning(2006)BMC Biotechnology 6:1所述产生。通常，shRNA转录为含有互补区域的单链RNA分子，其可以退火并形成短发夹。

发现针对特定基因的单个、单独的功能性siRNA或miRNA的可能性高。siRNA的特定序列的可预测性例如是约50％，但是可以以良好的置信度制备许多干扰RNA，其中至少一种是有效的。

可以使用表达针对编码ANP32蛋白的基因的RNAi的体外细胞、体内细胞、或经遗传编辑的动物，例如有蹄动物。RNAi可以例如选自由siRNA、shRNA、dsRNA、RISC和miRNA组成的组。

诱导型系统

可以使用诱导型系统来失活ANP32基因。已知多种诱导型系统允许对基因失活进行空间和时间控制。已经证明一些在猪类动物体内是有功能的。

诱导型系统的一个实例是四环素(Tet)-on启动子系统，其可用于调节核酸的转录。在这系统中，突变的Tet阻遏物(TetR)融合到单纯疱疹病毒VP 16转录因子的激活结构域，以产生四环素控制的转录激活因子(tTA)，其由tet或强力霉素(Dox)调节。在不存在抗生素时，转录是最小的，而在Tet或Dox存在时，转录被诱导。替代的诱导系统包含蜕皮激素或雷帕霉素系统。蜕皮激素是一种昆虫蜕皮激素，其产生受蜕皮激素受体和超螺旋基因(USP)产物的异源二聚体的控制。用蜕皮激素或蜕皮激素类似物如米乐甾酮A治疗诱导表达。给动物施用以触发诱导系统的试剂被称为诱导剂。

四环素诱导系统和Cre/loxP重组酶系统(组成型或诱导型)是更常用的诱导系统之一。四环素诱导系统包括四环素控制的转录因子/逆转录因子tTA(rtTA)。体内使用这些系统的方法包括产生两个经遗传编辑的动物品系。一个动物系表达在选定启动子控制下的激活剂(tTA、rtTA、或Cre重组酶)。另一品系的动物表达受体，其中感兴趣基因(或待改变的基因)的表达受tTA/rtTA转录因子的靶序列的控制(或被loxP序列侧接)。将两个动物交配提供了对基因表达的控制。

四环素依赖性调节系统(tet系统)依赖于两个组件，即四环素控制的转录因子(tTA或rtTA)和以四环素依赖性方式控制下游cDNA表达的tTA/rtTA依赖性启动子。在不存在四环素或其衍生物(如强力霉素)时，tTA结合tetO序列，允许tTA依赖性启动子的转录激活。然而，在强力霉素存在下，tTA不能与其靶标相互作用，转录不发生。使用tTA的tet系统被称为tet-OFF，因为四环素或强力霉素允许转录下调。四环素或其衍生物的给药允许转基因在体内表达的时间控制。rtTA是tTA的变体，其在不存在强力霉素时是无功能的，但需要存在配体以进行转录激活。因此这种tet系统被称为tet-ON。TET系统已经用于体内几种转基因的诱导型表达，编码例如报告基因、癌基因、或参与信号级联的蛋白质。

Cre/lox系统使用Cre重组酶，通过两个远处的Cre识别序列(即loxP位点)之间的交换，该重组酶催化位点特异性重组。通过Cre介导的重组切除引入到两个loxP序列之间的DNA序列(称为floxed DNA)。在转基因和/或经基因编辑动物中，使用空间控制(用组织或细胞特异性启动子)、或时间控制(用诱导系统)控制Cre表达，导致控制两个loxP位点之间的DNA切除。一种应用是条件性基因失活(条件性敲除)。另一种方法是用于蛋白质过表达，其中将floxed终止密码子插入启动子序列和感兴趣DNA之间。经遗传编辑的动物不表达转基因，直到Cre表达，导致floxed终止密码子切除。这系统已经应用于组织特异性肿瘤发生和B淋巴细胞中受控的抗基因受体表达。还开发了可诱导的Cre重组酶。诱导型Cre重组酶仅通过施用外源配体激活。可诱导的Cre重组酶是含有原始Cre重组酶和特异性配体结合结构域的融合蛋白。Cre重组酶的功能活性依赖于能够结合融合蛋白中的这个特异性结构域的外部配体。

可以使用包括在诱导系统控制下的ANP32基因的体外细胞、体内细胞、或经遗传编辑的动物，例如有蹄动物。动物的染色体修饰可以是基因组的或嵌合的。诱导型系统可以例如选自由Tet-on、Tet-off、Cre-lox、和Hif1α组成的组。

载体和核酸

为了敲除目的、为了基因失活、为了获得基因表达、或为了其它目的，可以将多种核酸导入细胞。如本文所用，术语核酸包含DNA、RNA、和核酸类似物，以及双链或单链(即，正义或反义单链)的核酸。核酸类似物可以在碱基部分、糖部分、或磷酸骨架处被修饰，以改善例如核酸的稳定性、杂交、或溶解性。碱基部分的修饰包含脱氧尿苷代替脱氧胸苷，以及5-甲基-2′-脱氧胞苷和5-溴-2′-脱氧胞苷代替脱氧胞苷。糖部分的修饰包含核糖的2′-羟基的修饰，以形成2′-O-甲基或2′-O-烯丙基糖。可以修饰脱氧核糖磷酸骨架以产生吗啉代核酸，其中每个碱基部分与六元吗啉代环、或肽核酸连接，其中脱氧磷酸骨架被伪肽骨架代替，并且保留四个碱基。参见Summerton and Weller(1997)Antisense Nucleic Acid DrugDev.7(3):187；和Hyrup et al.(1996)Bioorgan.Med.Chem.4:5。此外，脱氧磷酸骨架可以被例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯骨架、氨基磷酸酯、或烷基磷酸三酯骨架取代。

靶核酸序列可以可操作地连接至调控区，例如启动子。调控区可以是猪的调控区，或者可以来自其它物种。如本文所用，可操作地连接是指调节区相对于核酸序列的定位，其方式使得允许或促进靶核酸的转录。

任何类型的启动子都可以与靶核酸序列可操作地连接。启动子的实例包含但不限于组织特异性启动子、组成型启动子、诱导型启动子、和对特定刺激物响应或不响应的启动子。合适的组织特异性启动子可以导致核酸转录物在β细胞中的优先表达，并且包含例如人胰岛素启动子。其它组织特异性启动子可以导致在例如肝细胞或心脏组织中的优先表达，并且可以分别包含白蛋白或α-肌球蛋白重链启动子。可以使用促进核酸分子表达而没有显著的组织或时间特异性的启动子(即组成型启动子)。例如，可以使用β-actin启动子如鸡β-actin基因启动子、泛素启动子、miniCAGs启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、或3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，以及病毒启动子如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子、SV40启动子、或巨细胞病毒(CMV)启动子。例如，鸡β-actin基因启动子和CMV增强子的融合体可以用作启动子。参见，例如Xu et al.(2001)Hum.Gene Ther.12:563；和Kiwaki etal.(1996)Hum.Gene Ther.7:821。

可用于核酸构建体的其它调节区包含但不限于聚腺苷酸化序列、翻译控制序列(例如内部核糖体进入片段IRES)、增强子、诱导型元件、或内含子。这样的调节区可能不是必需的，尽管它们可以通过影响转录、mRNA的稳定性、翻译效率等来增加表达。这样的调控区可以根据期望包含在核酸构建体中，以获得核酸在细胞中的最佳表达。然而，有时可以在没有这些额外元件的情况下获得充分的表达。

可以使用编码信号肽或选择性标志物的核酸构建体。可使用信号肽，使得编码的多肽被导向特定的细胞位置(例如，细胞表面)。选择性标志物的非限制性实例包含嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)和黄质－鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(XGRT)。这些标志物可用于在培养物中选择稳定的转化体。其它选择性标志物包含荧光多肽，例如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。

编码选择性标志物的序列可以被重组酶(例如Cre或Flp)的识别序列侧接。例如，选择标志物可以被loxP识别位点(由Cre重组酶识别的34bp识别位点)或FRT识别位点侧接，以便选择标志物可以从构建体中切除。参见Orban,et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89:6861，用于Cre/lox技术的综述，以及Brand and Dymecki,Dev.Cell(2004)6:7。含有被选择标志物基因中断的Cre或Flp可激活转基因的转座子也可用于获得转基因条件性表达的动物。例如，驱动标志物/转基因表达的启动子可以是遍在的或组织特异性的，这将导致标志物在F0动物(例如猪)中遍在或组织特异性表达。转基因的组织特异性激活可通过例如将遍在表达标志物物中断的转基因的猪与以组织特异性方式表达Cre或Flp的猪杂交，或通过将以组织特异性方式表达标志物物中断的转基因的猪与遍在表达Cre或Flp重组酶的猪杂交来完成。转基因的受控表达或标志物的受控切除允许转基因的表达。

外源核酸可编码多肽。编码多肽的核酸序列可以包含编码“标签”的标签序列，该标签被设计成促进对所编码多肽的后续操作(例如，促进定位或检测)。标签序列可以插入编码多肽的核酸序列中，使得编码的标签位于多肽的羧基或氨基末端。编码的标签的非限制性实例包含谷胱甘肽S-转移酶(GST)和FLAG^TM标签(康涅狄格州纽黑文的Kodak)。

核酸构建体可以使用SssI CpG甲基化酶(马萨诸塞州伊普斯威奇的New EnglandBiolabs)甲基化。通常，核酸构建体可以在37℃下与S-腺苷甲硫氨酸和SssI CpG甲基化酶在缓冲液中温育。超甲基化可以通过将构建体与一个单位的HinP1I内切核酸酶在37℃温育1小时并通过琼脂糖凝胶电泳测定来确认。

核酸构建体可以使用多种技术引入任何类型的胚胎、胎儿、或成年动物细胞中，包含例如生殖细胞如卵母细胞或卵、祖细胞、成年或胚胎干细胞、原生殖细胞、肾细胞如PK-15细胞、胰岛细胞、β细胞、肝细胞、或成纤维细胞如皮肤成纤维细胞。技术的非限制性实例包含使用转座子系统、可感染细胞的重组病毒、或脂质体或能够将核酸递送至细胞的其它非病毒方法，例如电穿孔、显微注射、或磷酸钙沉淀。

在转座子系统中，核酸构建体的转录单元，即与外源核酸序列有效连接的调节区，被转座子的反向重复序列侧接。几种转座子系统，包含，例如，睡美人(参见，美国专利6,613,752和美国公开2005/0003542)、青蛙王子(Miskey et al.(2003)Nucleic AcidsRes.31:6873)、Tol2(Kawakami(2007)Genome Biology 8(Suppl.1):S7)、Minos(Pavlopoulos et al.(2007)Genome Biology 8(Suppl.1):S2)、Hsmar1(Miskey et al.(2007))Mol.Cell Biol.27:4589)；和Passport，已经被开发出来，用于将核酸引入细胞，包含小鼠、人和猪细胞。睡美人转座子特别有用。转座酶可以作为蛋白质递送，在与外源核酸相同的核酸构建体上编码，可以在分离的核酸构建体上引入，或作为mRNA(例如，体外转录的加帽的mRNA)提供。

在核酸构建体中还可以包含绝缘子元件，以维持外源核酸的表达并抑制宿主基因的不需要的转录。参见例如美国公开2004/0203158。通常，绝缘子元件侧接转录单元的每一侧且位于转座子的反向重复序列内部。绝缘子元件的非限制性实例包含基质附着区(MAR)型绝缘子元件和边界型绝缘子元件。参见例如美国专利6,395,549、5,731,178、6,100,448、和5,610,053、和美国公开2004/0203158。

核酸可以整合到载体中。载体是广义的术语，其包含被设计成从载体移动到靶DNA中的任何特定DNA片段。载体可以称为表达载体、或载体系统，其是使DNA插入基因组或其它靶向DNA序列如附加体、质粒、或甚至病毒/噬菌体DNA片段所需的一组组件。用于动物基因递送的载体系统如病毒载体(例如逆转录病毒、腺相关病毒和整合噬菌体病毒)、和非病毒载体(例如转座子)具有两个基本组分：1)由DNA(或逆转录成cDNA的RNA)组成的载体，和2)转座酶、重组酶、或其它整合酶，其识别载体和DNA靶序列并将载体插入靶DNA序列。载体最常含有一个或多个表达盒，其包括一个或多个表达控制序列，其中表达控制序列是分别控制和调节另一DNA序列或mRNA的转录和/或翻译的DNA序列。

已知许多不同类型的载体。例如，质粒和病毒载体，例如逆转录病毒载体是已知的。哺乳动物表达质粒通常具有复制起点、合适的启动子和可选的增强子、必需的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和受体位点、转录终止序列、和5′侧接非转录序列。载体的实例包含：质粒(其也可以是另一种类型载体的载体)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒(例如修饰的HIV-1、SIV或FIV)、逆转录病毒(例如ASV、ALV或MoMLV)、和转座子(例如睡美人、P因子、Tol-2、青蛙王子、piggyBac)。

如本文所用，术语核酸指RNA和DNA，包含例如cDNA、基因组DNA、合成(例如化学合成)DNA、以及天然存在的和化学修饰的核酸，例如合成碱基或替代主链。核酸分子可以是双链或单链的(即，正义或反义单链)。

起始动物、动物品系、性状、和繁殖

通过克隆和本文所述的其它方法可以产生起始动物。对于基因编辑，起始者可以是纯合的，如在其中合子或原代细胞经历纯合修饰的情况下。类似地，也可以制备杂合的起始者。在动物在编码ANP32蛋白的基因中包括至少一种经修饰的染色体序列的情况下，起始者优选是杂合的。起始者可以是经基因组编辑的，这意味着其基因组中的所有细胞都经历了修饰。起始者可以对于修饰是嵌合的，如当载体导入胚胎(通常在胚泡期)的多个细胞之一时可能发生的。可以测试嵌合动物的后代以鉴定经基因组编辑的后代。当建立了一群动物时，建立了动物品系，其可以有性繁殖或通过辅助繁殖技术繁殖具有一致表达修饰的异质或纯合后代。

已知家畜中，很多等位基因与生产性状、类型性状、可加工性状、和其他功能性状相关联。技术人员习惯于监测和定量这些性状，例如Visscher et al.,LivestockProduction Science,40(1994)123-137、美国专利7,709,206、US 2001/0016315、US 2011/0023140、和US 2005/0153317。动物品系可以包含选自由生产性状、类型性状、加工性状、生育性状、母系性状、和疾病抗性性状组成的组中的性状。其它性状包含重组基因产物的表达。

除了监测性状，技术人员可以整体上观察动物的遗传背景。基因组编辑如本教导的那些可以在优良遗传背景中进行。Elite PIC^TM(英国贝辛斯托克的猪改良有限公司)品系2、3、15、19、27、62和65是选择为优良商业表型的品系。成纤维细胞系生长自胶原酶处理过的耳缺(ear notch)样品，该样品提取自美国典型培养物保藏中心保藏的这些细胞系的动物。/>地址为10801University Boulevard,Manassas,VA 20110-2209。PIC^TM品系2的代表性样品于2019年4月3日保藏在ATCC，并分配/>专利保藏号PTA-125814。PIC^TM品系3的代表性样品于2019年4月3日保藏在ATCC，并分配/>专利保藏号PTA-125815。PIC^TM品系15的代表性样品于2019年4月3日保藏在ATCC，并分配/>专利保藏号PTA-125816。PIC^TM品系65的代表性样品于2019年4月3日保藏在/>并分配/>专利保藏号PTA-125813。PIC^TM品系19的代表性样品于2019年4月3日保藏在/>并分配/>专利保藏号PTA-125811。PIC^TM品系27的代表性样品于2019年4月3日保藏在ATCC，并分配/>专利保藏号PTA-125907。PIC^TM品系62的代表性样品于2019年4月3日保藏在ATCC，并分配/>专利保藏号PTA-125812。每种保藏物根据布达佩斯条约进行。在发布后，与布达佩斯条约和37C.F.R.§1.801–1.809的所有要求一致，对保藏物的公众可获得性的所有限制将被不可撤回地去除。申请人不放弃对本专利所授予的权利的任何侵犯。

其它潜在的猪品系包含可以是PIC^TM品系15、PIC^TM品系17、PIC^TM品系27、PIC^TM品系65、PIC^TM品系14、PIC^TM品系62、PIC337、PIC800、PIC280、PIC327、PIC408、PIC^TM399、PIC410、PIC415、PIC359、PIC380、PIC837、PIC260、PIC265、PIC210、PIC^TM品系2、PIC^TM品系3、PIC^TM品系4、PIC^TM品系5、PIC^TM品系18、PIC^TM品系19、PIC^TM品系92、PIC95、PIC^TM (英国贝辛斯托克的猪改良有限公司)、PIC1070、PIC^TM/>40、PIC^TM/> 22、PIC1050、PIC^TM/>29、PIC^TM/>48、或PIC^TM/>x54的品系。/>

在各个方面，PIC^TM品系65以商品名PIC337出售。在各个方面，PIC^TM品系62以商品名PIC408出售。在各个方面，由PIC^TM品系15与17杂交制成的杂交猪以商品名PIC800或PIC280出售。在各个方面，PIC^TM品系27以商品名PIC327出售。在各个方面，由PIC^TM品系65与PIC^TM品系62杂交产生的杂交种以商品名PIC399、PIC410、或PIC415出售。在各个方面，由PIC^TM品系65与PIC品系27杂交产生的杂交种以商品名PIC359出售。在各个方面，由PIC^TM品系800猪(其为PIC^TM品系15猪和PIC^TM品系17猪的杂交种)与PIC^TM品系65猪杂交得到的杂交种以商品名PIC380或PIC837出售。在各个方面，PIC^TM品系14以商品名PIC260出售。在各个方面，由PIC^TM品系14与PIC^TM品系65杂交产生的杂交种以商品名PIC265出售。在各个方面，由PIC^TM品系2与PIC^TM品系3杂交产生的杂交种以商品名PIC210、PIC^TM 和PIC1050出售。在各个方面，PIC^TM品系3与PIC^TM品系92的杂交种以商品名PIC95出售。在各种配置中，由PIC^TM品系19与PIC^TM品系3杂交制成的杂交种以商品名PIC1070出售。在各个方面，由PIC^TM品系18与PIC^TM品系3杂交产生的杂种以商品名PIC^TM/>40出售。在各个方面，由PIC^TM品系19与PIC1050(其本身是PIC^TM品系2和3的杂交种)杂交产生的杂交种以商品名PIC^TM/>22出售。在各个方面，从PIC^TM品系2和PIC1070(其本身是PIC^TM品系19和3的杂交种)的交叉产生的杂交种以商品名PIC^TM/>29出售。在各个方面，由PIC^TM品系18与PIC1050(其本身是PIC^TM品系2和3的杂交种)杂交产生的杂交种以商品名PIC^TM/>48出售。在各个方面，由PIC^TM品系4与PIC^TM品系5杂交产生的杂交种以商品名PIC^TM/>x54出售。

可以修饰具有期望性状的动物以阻止它们的性成熟。由于动物直到成熟都是无菌的，因此可以调节性成熟作为控制动物传播的手段。因此，可以将已经繁殖或修饰为具有一种或多种性状的动物提供给接受者，同时降低接受者繁殖动物的风险，并使性状的价值适合于它们自己。例如，可以修饰动物的基因组，其中该修饰包括性成熟基因的失活，其中野生型动物中的性成熟基因表达性成熟选择性因子。可以通过施用化合物治疗由动物中诱导性成熟的基因表达丧失引起的缺陷来治疗动物。

需要给予化合物以诱导性成熟的动物的饲养可以有利地在治疗设施中完成。治疗设施可以对良好控制的家畜实施标准化方案以有效地生产一致的动物。动物后代可以分布到多个饲养地点。农场和农场主(术语包含牧场和牧场主)可因此订购具有指定年龄和/或体重和/或性状范围的期望数量的后代，并使它们在期望的时间和/或地点递送。然后，接受者，例如农场主，可以饲养动物并将它们按他们的需要送至市场。

可将具有失活的性成熟基因的经遗传编辑的有蹄动物送递(例如，送递到一个或多个场所，送递到多个农场)。动物可以具有约1天至约180天的年龄。动物可以具有一种或多种性状(例如表达期望的性状或高价值性状或新性状或重组性状的性状)。

经编辑的猪的检测

检测期望的编辑的一种有用方法是使用实时PCR。设计了侧接感兴趣区域的PCR引物和对感兴趣区域特异性退火的探针。探针用荧光团和淬灭剂标记。探针可以与期望的序列具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％同源性。在PCR反应中，引物和探针以序列依赖性方式与感兴趣区域的互补DNA链杂交。因为探针是完整的，荧光团和猝灭剂紧密接近，并且猝灭剂吸收由荧光团发射的荧光。聚合酶从引物延伸并开始DNA合成。当聚合酶到达探针时，聚合酶的外切核酸酶活性切割杂交的探针。作为切割的结果，荧光团与猝灭剂分离并发荧光。这荧光由实时仪器检测。这些步骤在每个PCR循环中重复，并允许检测特定产物。

例如，可以设计三组独立的引物和探针用于二种测定。每个测定可具有二组引物。第一组引物可以侧接编辑中使用的gRNA的未编辑的基因组序列(ANP32A的SEQ ID NO:26或19或ANP32B的SEQ ID NO:55和59)以及在引物之间结合未编辑基因组DNA的探针。探针可以与引物之间的未编辑基因组序列50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％同源。对于编辑中使用的每个向导RNA，可以有单独的集合。最后的引物组可以侧接通过切除向导序列的切割位点之间的序列而产生的期望的外源终止密码子。可以设计探针以与这些引物之间的期望的编辑结合，与期望的编辑具有50％、60％、70％、80％、90％、95％、或100％同源性。然后可以使用商业化的实时PCR试剂盒来探测各种动物以获得期望的编辑。存在多种商业化的实时PCR试剂盒，包含但不限于来自IDT的来自Applied Biosystems的(加州普莱森顿的Roche Molecular Systems,Inc)、和来自Qiagen和Bio-Rad的多种试剂盒。技术人员将认识到，任何这样的试剂盒可以与本教导的引物和方法一起使用以实现类似的结果。

已经详细描述了本发明，显然在不背离所附权利要求中限定的本发明的范围的情况下，可以进行修改和变化。

实施例

提供以下非限制性实施例以进一步说明本发明。

实施例1经编辑ANP32基因的猪的产生。

为了产生具有经编辑的ANP32基因的猪，设计了编辑策略以将终止密码子引入猪ANP32A和ANP32B基因中编码N129和D130的编码区上游的保守外显子序列中。评估表6和7中列出的ANP32A和ANP32B向导RNA在猪成纤维细胞中的靶向和脱靶活性。

ANP32A具有两个转录本：ENSSSCT00000070641.1和ENSSSCT00000005475.4。测试外显子2(chr1:166,671,648–166,671,797)和外显子3(chr1:166,671,387–166,671,509)保守区域中的向导的靶向活性。

ANP32B(NANS)具有七个转录本：ENSSSCT00000062686.2、ENSSSCT00000055524.2、ENSSSCT00000068404.1、ENSSSCT00000045745.2、ENSSSCT00000005912.4、ENSSSCT00000054395.2、和ENSSSCT00000044227.2。测试外显子2(chr1:239,852,885–239,853,034)和外显子3(chr1:239,856,334–239,856,456)中的向导的靶向活性。

然后将这些数据用于选择CRISPR试剂以通过合子显微注射和胚胎转移产生敲除动物。

将产生仅敲除ANP32A、仅敲除ANP32B、或同时敲除ANP32A和ANP32B的猪。对这些动物进行评估以证实它们具有期望的基因编辑，然后评价对IAV感染的抗性。使用从动物和活动物获得的成纤维细胞在体外评估对IAV感染的抗性。将细胞和动物暴露于各种IAV以评估抗性。

实施例2使用gRNA对将提前终止密码子引入ANP32A和ANP32B的编码区。

本实施例说明了使用gRNA对将提前终止密码子引入ANP32A和ANP32B的编码区。在ANP32A和ANP32B中引入提前终止密码子将产生截短的和无功能的蛋白质，或者可以引发无义介导的mRNA衰变，导致ANP32A和ANP32B mRNA转录本的消除。终止密码子可通过在编辑实验中引入单链DNA模板经由同源性指导的修复(HDR)通路引入。然而，单链DNA可以随机整合到基因组中。因此，鉴定产生框内的终止密码子、而不引入非野生型氨基酸的gRNA对，是有利的。为了实现这点，可以使用二种gRNA来指导核酸酶切割位点，然后通过NHEJ以端对端方式修复位点。

计算测试ANP32A和ANP32B中的向导在配对时产生框内终止密码子的能力。随后在猪胎儿成纤维细胞中测试计算预测，如下所述。下表8中所列的gRNA通过体外转录产生并与SpyCas9在水中复合，使用总体积为2.23μl的3.2μg Cas9蛋白和2.2μg gRNA。然后将所得核糖核蛋白(RNP)复合物的一半体积(1.115μl)以2.23μl的总体积1∶1合并，以产生如表8所示的配对，并使用Lonza电穿孔仪将其核转染入猪胎儿成纤维细胞(PFF)中。在准备核转染时，使用TRYPLE EXPRESS^TM(马萨诸塞州沃尔瑟姆的ThermoFisher Scientific，重组胰蛋白酶)收获PFF细胞。具体地，从细胞中除去培养基，用Hank’s平衡盐溶液(HBSS)或Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)洗涤细胞一次，并在存在TrypLE的条件下于38.5℃温育3–5分钟。然后用完全培养基收获细胞。通过离心(300g×室温下5分钟)使细胞沉淀，弃去上清液，然后将细胞重悬于10mL PBS中以获得单细胞悬浮液，以允许使用台盼蓝染色进行细胞计数。计数后，离心沉淀细胞，弃去上清液，将细胞以7.5×10⁶细胞/ml的终浓度重悬于核转染缓冲液P3中。将20μl细胞悬浮液加入到含有RNP混合物的核转染池的每个孔中，然后轻轻混合以重悬细胞。然后用CM138程序对RNP/细胞混合物进行核感染。核转染后，向每个孔中加入80μL温的胚胎成纤维细胞培养基(EFM)[Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基(DMEM)，含有2.77mM葡萄糖、1.99mM L-谷氨酰胺、和0.5mM丙酮酸钠，补充有100μM 2-巯基乙醇、1×Eagle’s最低必需培养基非必需氨基酸(MEM NEAA)、100μg/mL青霉素－链霉素、和12％胎牛血清]。通过移液轻轻混合悬浮液，然后将100μl转移至含有900μl EFM的12孔板中，在38.5℃预温育。然后将板在38.5℃、5％CO₂下温育48小时。核转染后四十八小时，从转染的和对照的PFF细胞制备基因组DNA。具体地，将15μl QUICKEXTRACT^TMDNA提取溶液(LucigenCorporation，Middleton，WI)加入沉淀的细胞中，然后通过在37℃下温育10分钟、在65℃下温育8分钟、并在95℃下温育5分钟，来裂解细胞。将裂解物保持在4℃下直到用于DNA测序。

为了评价由向导RNA/Cas内切核酸酶系统介导的ANP32A和ANP32B靶位点的NHEJ修复结果，通过PCR扩增靶位点周围的基因组DNA的约250bp的区域，然后通过扩增子深度测序检查PCR产物的修复的存在和性质。在转染三次后，提取PFF基因组DNA，并使用NEB Q5聚合酶对预期靶位点周围的区域进行PCR扩增，添加扩增子特异性条形码所需的序列，并分别通过两轮PCR使用“带尾”引物进行Illumina测序。在Illumina MiSeq个人测序仪上对得到的PCR扩增进行深度测序。通过与对照实验比较或通过与参考基因组比较，检查所得读数在预期切割位点处修复的存在和性质，在对照实验中，从转染中省略Cas9蛋白和向导RNA。为了计算靶位点/Cas9蛋白/向导RNA组合的NHEJ突变频率，将突变读段(当与来自对照处理或参照基因组的DNA序列比较时，含有插入或缺失的扩增子序列)的总数除以含有与条形码和正向引物完全匹配的合适长度的总读段数目(野生型加突变读段)。在表8中，总读数平均为每个样品约7000个，并且NHEJ活性表示为突变体级分的平均值(n＝3)。

另外测试了在猪胎儿成纤维细胞中筛选的gRNA对亚组在猪胚胎的ANP32A和ANP32B编码区中引入提前终止密码子的能力。基于在猪成纤维细胞中产生提前终止密码子的功效，选择在猪胚胎中测试的向导子集。如下所述产生经编辑的猪胚胎。简言之，从屠宰场卵巢提取的卵母细胞在体外受精。在受精后16–17小时，通过使用来自FemtoJet 4i微注射器(德国汉堡Eppendorf)的单脉冲将sgRNP溶液注射到推定合子的细胞质中，其中pi＝200hPa，ti＝0.25s，pc＝15hPa。将外径为1.2mm、内径为0.94mm的玻璃毛细管移液管拉至<0.5μm的非常细的点(美国加州诺瓦托的Sutter Instrument)。在装有Narishige(纽约州阿米蒂维尔的Narishige International USA)显微操作器的倒置显微镜的加热平台上，在补充了3mg/ml BSA(Proliat)的TL-Hepes(ABT360,LLC)中进行显微注射。注射后，在5％CO₂、5％O₂、90％N₂的培养箱环境中，在BO-IVC(英国康沃尔法尔茅斯的IVF Bioscience)中培养推定合子7天。胚泡的突变频率通过上面描述的胎儿成纤维细胞的Illumina测序来确定。表8显示了导致ANP32A和ANP32B中提前终止密码子的端到端NHEJ修复的频率。

本实施例证明猪ANP32A和ANP32B基因核苷酸序列可以通过用成对的向导RNA转染Cas9蛋白以产生新的框内的终止密码子介导刺激双链断裂来编辑。

表8使用gRNA对将提前终止密码子引入ANP32A和ANP32B的编码区

基因	向导1	向导2	期望编辑PFF频率(％)	期望编辑胚胎频率(％)
					ANP32A	SEQ ID NO:33	SEQ ID NO:36	0	未测试
ANP32A	SEQ ID NO:33	SEQ ID NO:40	63.7	6.2
					ANP32A	SEQ ID NO:15	SEQ ID NO:22	42.7	未测试
ANP32A	SEQ ID NO:15	SEQ ID NO:23	22.3	未测试
					ANP32A	SEQ ID NO:16	SEQ ID NO:24	11.7	未测试
ANP32A	SEQ ID NO:17	SEQ ID NO:24	14.3	未测试
					ANP32A	SEQ ID NO:19	SEQ ID NO:26	54	48.5
ANP32B	SEQ ID NO:44	SEQ ID NO:46	17	8.0
					ANP32B	SEQ ID NO:55	SEQ ID NO:58	65	29.3
ANP32B	SEQ ID NO:55	SEQ ID NO:59	71.7	36.8

实施例3编辑猪以引入提前终止密码子

分离猪卵母细胞，使其受精，然后编辑所得合子以产生经基因编辑的猪。

将RNP复合物微注射到体内或体外受精的猪单细胞合子的细胞质中。然后将这些合子孵育以产生经编辑的多细胞胚胎，并通过标准方法转移到代孕小母猪中以生产经基因编辑的猪。为了制备胚胎供体和代孕者，通过用0.22％的alternogest溶液(20–36mg/动物)处理14天，使来自PIC^TM品系2、品系3、品系15、和品系65的青春期小母猪发情期同步化。在最后一次给予基质后36小时给予PMSG诱导卵泡生长，而在给予PMSG后82小时给予hCG诱导排卵。为了产生体内受精合子，然后用来自相应PIC^TM品系的公猪精液人工授精(AI)处于发情旺期的雌性。AI后12–24小时，通过用补加0.3％BSA(w/v)的无菌TL-HEPES培养基逆行冲洗输卵管，手术提取体内衍生的合子。受精合子用Cas9蛋白和靶向ANP32的向导RNA复合物(25–50ng/μl和12.5–35ng/μl)的单次2–50皮升细胞质注射，并在PZM5培养基(Yoshioka,K.,et al.,Biol.Reprod.,2002,60:112-119；Suzuki,C.,et al.,Reprod.Fertil.Dev.,2006 18,789-795；Yoshioka,K.,J.Reprod.Dev.2008,54,208-213)中培养。在全身麻醉下通过中线剖腹术将注射的合子手术植入发情期同步的未交配的代孕雌鼠的输卵管中(每个代孕雌鼠接受20–60个注射的胚胎)。

用于基因编辑的体外受精胚胎来源于未受精的PIC^TM卵母细胞。从中等大小(3–6mm)卵泡中收集发情期同步化PIC^TM小母猪的未成熟卵母细胞。然后选择具有均匀黑色细胞质和完整的周围丘细胞的卵母细胞进行成熟。将卵丘卵母细胞复合体，在38.5℃和5％CO₂的潮湿空气中，置于装有含有3.05mM葡萄糖、0.91mM丙酮酸钠、0.57mM半胱氨酸、10ng/mlEGF、0.5μg/ml促黄体激素(LH)、0.5μg/ml FSH、10ng/ml庆大霉素(Sigma)、和10％卵泡液的500μl成熟培养基TCM-199(Invitrogen)的孔中，42–44小时。成熟结束时，在0.1％透明质酸酶存在下，通过涡旋3分钟从卵母细胞中除去周围的卵丘细胞。然后，将体外成熟的卵母细胞以25–30个卵母细胞的组置于100μl IVF培养基(含有113.1mM NaCl、3mM KCl、7.5mMCaCl₂、11mM葡萄糖、20mM Tris、2mM咖啡因、5mM丙酮酸钠、和2mg/ml牛血清白蛋白(BSA)的改良Tris缓冲培养基)液滴中，并使用保鲜的稀释的公猪精液按照已建立的方案(Abeydeera,Biol.Reprod.,57:729–734,1997)受精。将1ml的保鲜精液与含有1mg/ml BSA的Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)混合至10ml的最终体积，并在1000g、25℃离心4分钟，精子在DPBS中洗涤三次。最后一次洗涤后，将精子重新悬浮在mTBM培养基中并以1×10⁵精子/ml的终浓度加入卵母细胞中，并在38.5℃和5％CO₂共孵育4–5小时。在IVF后5小时显微注射推定合子，并在18–42小时(1–4细胞期)后将其转移给代孕雌性动物。每个代孕者接受20–60个注射的胚胎。通过在胚胎移植后28天未恢复发情期(21天)和超声来证实妊娠。

为了确定在猪胚胎中Cas9向导RNA靶基因编辑的频率，将未注射的对照合子和通过体外受精产生的注射的过剩合子在PZM3或PZM5培养基中在38.5℃培养5–7天。在培养后第7天收获胚泡，分离基因组DNA用于下一代测序。

实施例4经基因编辑的猪的分子表征

本实施例说明经编辑的动物基因组的分子表征。

组织样品取自其基因组已经根据本文实施例编辑的动物。尾巴、耳缺、或血液样品是合适的组织类型。在-20℃下在1小时内取样冷冻组织样品以保持组织样品中DNA的完整性。

在裂解缓冲液中蛋白酶K消化后从组织样品中提取DNA。在二种不同的序列平台上进行表征，短序列读段使用平台(加州圣地牙哥的/>)上进行，而长序列读段在Oxford NANOPORE^TM平台(英国牛津的Oxford NANOPORE^TMTechnologies)上进行。

对于短序列读段，使用二步PCR来扩增和测序感兴趣区域。第一步是基因座特异性PCR，其使用组合的基因座特异性引物和供应商特异性引物从DNA样品扩增感兴趣的基因座。第二步将测序索引和接头序列与第一步的扩增子连接，从而可进行测序。

选择用于第一步PCR的基因座特异性引物，使得它们扩增<300bp的区域，使得配对末端测序读段可以跨越扩增的片段。如果缺失或天然存在的点突变阻止引物正确结合，则优选多个扩增子以提供冗余。使用/>测序平台(加州圣地牙哥的的/>)产生扩增子的序列数据。分析序列读段以表征编辑过程的结果。

对于长序列读段，使用二步PCR来扩增和测序感兴趣区域。第一步是基因座特异性PCR，其使用组合的基因座特异性引物和供应商特异性衔接子从DNA样品扩增感兴趣基因座。第二步PCR将测序索引与来自第一步PCR的扩增子连接，使得DNA准备好用于制备测序文库。第二步PCR产物经过供应商试剂盒的一组化学反应以平滑化DNA的末端，并连接在含有动力蛋白的衔接子上以允许进入用于基于DNA链的测序的孔。

设计用于第一步PCR范围的基因座特异性引物以扩增ANP32基因的不同区域和不同的扩增区域长度。然后将标准化的DNA与供应商的上样缓冲液混合，并上样到NANOPORE^TM流通池中。

长序列读段虽然具有比短读段更低的每碱基准确度，但对于观察靶位点周围的序列的长程背景非常有用。

实施例5用流感病毒攻击经ANP32A基因编辑的猪

本实施例说明用流感病毒攻击经ANP32A编辑的猪。

如实施例3所述，使用向导RNA SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:19编辑PIC^TM猪，以产生具有包括SEQ ID NO:7577的经编辑的ANP32A基因的猪。编辑如实施例4所述进行确认。将经编辑过的猪杂交以产生编辑纯合的猪。这些纯合的经编辑的猪将用流感病毒接种，肌内和鼻内给药。在第0天(在那天接种前)、第3天、第5天、第10天、第14天、和第21天获得血清样品。使用标准试剂盒进行实时PCR，以根据制造商的指示确定血清样品中病毒的存在。

实施例6用流感病毒攻击经ANP32B基因编辑的猪

本实施例说明用流感病毒攻击经ANP32B编辑的猪。

如实施例3所述，使用向导RNA SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:59编辑PIC^TM猪，以产生具有包括SEQ ID NO:7578的经编辑的ANP32B基因的猪。编辑如实施例4所述进行确认。将经编辑过的猪杂交以产生编辑纯合的猪。这些纯合的经编辑的猪将用流感病毒接种，肌内和鼻内给药。在第0天(在那天接种前)、第3天、第5天、第10天、第14天、和第21天获得血清样品。使用标准试剂盒进行实时PCR，以根据制造商的指示确定血清样品中病毒的存在。

实施例7用于实时PCR验证期望的ANP32A编辑的测定

创建二种测定用于使用实时PCR(rtPCR)的ANP32编辑检测。对于第一种测定，设计二组引物和二种探针。一组引物侧接SEQ ID NO:26中所示的间隔序列。用荧光部分标记的探针将被设计成与未编辑形式的间隔序列退火。另一组引物设计成侧接期望的编辑序列(SEQ ID NO:7577)。用不同荧光部分标记的探针将被设计成与跨越编辑的连接区的核苷酸退火。为了验证，使用从测序证实状态的猪中分离的DNA，使用商业试剂盒进行实时PCR，并绘制荧光图。如所预期的，如果纯合子接近y轴(代表探针退火至SEQ ID NO:7577的荧光部分)、杂合子组接近图表中心、而野生型猪组接近X轴(代表探针退火至SEQ ID NO:26的荧光部分)，则发生验证。

对于第二种测定，也设计二组引物和二种探针。一组引物侧接SEQ ID NO:19中所示的间隔序列。用荧光部分标记的探针将被设计成与未编辑形式的间隔序列退火。另一组引物设计成侧接期望的编辑序列(SEQ ID NO:7577)——这些可以是用于第一测定的相同引物和探针。用不同荧光部分标记的探针将被设计成与跨越编辑的连接区的核苷酸退火。为了验证，使用从测序证实状态的猪中分离的DNA，使用商业试剂盒进行实时PCR，并绘制荧光图。如所预期的，如果纯合子接近y轴(代表探针退火至SEQ ID NO:7577的荧光部分)、杂合子组接近图表中心、而野生型猪组接近X轴(代表探针退火至SEQ ID NO:19的荧光部分)，则发生验证。

实施例8用于实时PCR验证期望的ANP32B编辑的测定

创建有二种测定用于使用实时PCR(rtPCR)的ANP32B编辑检测。对于第一种测定，设计二组引物和二种探针。一组引物侧接SEQ ID NO:55中所示的间隔序列。用荧光部分标记的探针将被设计成与未编辑形式的间隔序列退火。另一组引物设计成位于期望的编辑序列(SEQ ID NO:7578)。用不同荧光部分标记的探针将被设计成与跨越编辑的连接区的核苷酸退火。为了验证，使用从测序证实状态的猪中分离的DNA，使用商业试剂盒进行实时PCR，并绘制荧光图。如所预期的，如果纯合子接近y轴(代表探针退火至SEQ ID NO:7578的荧光部分)、杂合子组接近图表中心、而野生型猪组接近X轴(代表探针退火至SEQ ID NO:55的荧光部分)，则发生验证。

对于第二种测定，设计二组引物和二种探针。一组引物侧接SEQ ID NO:59中所示的间隔序列。用荧光部分标记的探针将被设计成与未编辑形式的间隔序列退火。另一组引物设计成侧接期望的编辑序列(SEQ ID NO:7578)——这些可以是用于第一ANP32B测定的相同引物和探针。用不同荧光部分标记的探针将被设计成与跨越编辑的连接区的核苷酸退火。为了验证，使用从测序证实状态的猪中分离的DNA，使用商业试剂盒进行实时PCR，并绘制荧光图。如所预期的，如果纯合子接近y轴(代表探针退火至SEQ ID NO:7578的荧光部分)、杂合子组接近图表中心、而野生型猪组接近X轴(代表探针退火至SEQ ID NO:59的荧光部分)，则发生验证。

鉴于上述内容，可以看出，实现了本发明的几个目的，并且获得了其它有利的结果。

由于在不背离本发明范围的情况下可以对上述产品和方法进行各种改变，因此，包含在上述说明中和在附图中示出的所有内容都应当被解释为示例性的而不是限制性的。

参考文献

Baker et al.,ANP32B,or not to be,that is the question for influenzavirus,ELIFE 8:e48084(2019).

Centers for Disease Control and Prevention(CDC),CDC Estimates of2009H1N1 Cases and Related Hospitalizations and Deaths from April 2009throughMarch 13,2010,By Age Group,https://www.cdc.gov/h1n1flu/pdf/graph_March％202010.pdf(2010).

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本文引用的所有出版物均全文通过引用并入本文作为参考。

Claims

1.一种Sus scrofa，其具有包括经遗传编辑的内源ANP32基因的基因组，包括ANP32A基因或ANP32B基因，其中所述ANP32基因相对于野生型基因包括提前终止密码子。

2.根据权利要求1所述的Sus scrofa，其中所述提前终止密码子在N129和D130的上游。

3.根据权利要求1所述的Sus scrofa，其中所述经遗传编辑的内源ANP32基因包括SEQID NO:7577或SEQ ID NO:7578。

4.根据权利要求1所述的Sus scrofa，其中所述外源终止密码子赋予对流感病毒的抗性。

5.根据权利要求4所述的Sus scrofa，其中所述流感病毒包括甲型流感病毒。

6.根据权利要求5所述的Sus scrofa，其中所述甲型流感病毒包括H1N1亚型病毒、H1N2亚型病毒、或H3N2亚型病毒。

7.根据权利要求1所述的Sus scrofa，其中所述动物、后代、或细胞对于所述经遗传编辑的内源ANP32基因是杂合的。

8.根据权利要求1所述的Sus scrofa，其中所述动物、后代、或细胞对于所述经遗传编辑的内源ANP32基因是纯合的。

9.一种从权利要求1所述的Sus scrofa分离的细胞。

10.一种从权利要求1所述的Sus scrofa获得的分离的细胞系。

11.根据权利要求10所述的分离的细胞系，其中所述分离的细胞系是分离的成纤维细胞系。

12.一种用于编辑Sus scrofa ANP32基因的向导RNA(gRNA)对，所述Sus scrofa ANP32基因选自由SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:58；以及SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:59，组成的组。

13.根据权利要求12所述的gRNA对，其中所述gRNA是SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:59。

14.一种制备抗流感病毒的Sus scrofa的方法，其包括：

将CAS蛋白质和将提前终止密码子引入内源ANP32基因的gRNA对引入Sus scrofa MII卵母细胞或合子，其中终止密码子被引入所述卵母细胞或合子的内源ANP32基因；

将从所述卵母细胞或合子获得的胚胎植入受体雌性，使得从植入的所述胚胎获得Susscrofa，其中获得的所述Sus scrofa对于包括提前终止密码子的所述ANP32基因是杂合的；

将所述杂合的Sus scrofa与在所述ANP32基因中也含有提前终止密码子的异性Susscrofa进行育种；

从所述育种中选择对于所述ANP32基因中所述提前终止密码子纯合的后代，其中所述纯合的后代抗流感。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述gRNA对包括由SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:59组成的序列。

16.根据权利要求14所述的方法，其中所述CAS蛋白和所述gRNA作为预先形成的核糖核蛋白(RNP)复合物引入。

17.根据权利要求14所述的方法，其中所述提前终止密码子包括由SEQ ID NO:7577或SEQ ID NO:7578组成的核酸序列。

18.一种为了在Sus scrofa中赋予流感抗性而经编辑的ANP32基因，其中所述编辑引入外源终止密码子，并且所述经编辑的ANP32基因包括SEQ ID NO:7577或SEQ ID NO:7578。

19.根据权利要求18所述的经编辑的ANP32基因，其中所述编辑使用SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:55和SEQ ID NO:59产生。

20.一种非生殖Sus scrofa基因，其包括权利要求18所述的ANP32基因。

21.一种细胞系，其包括多个权利要求20所述的细胞。

22.根据权利要求21所述的细胞系，其中所述细胞系是成纤维细胞系。