JP2019047794A - 動物における性成熟の制御 - Google Patents
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Abstract
【課題】性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物の作製方法の提供。【解決手段】性的に成熟できない、遺伝子編集された非ヒト家畜動物を作製する方法であって、家畜細胞又は家畜胚に、性成熟に関与するリガンドについての遺伝子を不活性化する薬剤を導入するステップを含む方法を提供する。さらに、対象遺伝子が、Kiss1、又はGnRH11であり、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、薬剤がCas9/CRISPR及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択されることを特徴とする。【選択図】なし
Description
関連出願の相互参照
本特許出願は、2012年10月30日に出願された米国仮特許出願第61/720,187号明細書及び2013年8月27日に出願された米国仮特許出願第61/870,510号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願の各々は、本明細書によって参照により本明細書に援用される。
本特許出願は、2012年10月30日に出願された米国仮特許出願第61/720,187号明細書及び2013年8月27日に出願された米国仮特許出願第61/870,510号明細書に対する優先権を主張するものであり、これらの仮特許出願の各々は、本明細書によって参照により本明細書に援用される。
連邦政府支援研究に関する記載事項
本明細書に記載される研究の諸側面は、国立衛生研究所の補助金交付第1R43RR033149−01A1号及び農務省(USDA)−国立食品・農業研究所のバイオテクノロジーリスク評価プログラム競争的補助金交付番号第2012−33522−19766号による支援を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有し得る。
本明細書に記載される研究の諸側面は、国立衛生研究所の補助金交付第1R43RR033149−01A1号及び農務省(USDA)−国立食品・農業研究所のバイオテクノロジーリスク評価プログラム競争的補助金交付番号第2012−33522−19766号による支援を受けた。米国政府は本発明に一定の権利を有し得る。
本技術分野は、家畜を含む動物を作製及び飼育する方法に関し、ここで家畜は、成熟するよう処理されない限り性的に未熟なままであるように遺伝子改変されている。
従来の畜産実践は、繁殖及び分娩を最適化する観点から家畜における性的成熟の役割に重点を置いている。例えば、乳牛の群れでは、性成熟期の雌子ウシの管理がその生涯生産性に大きく影響することが知られ、慎重に計画されなければならない。最適な性的発育プロセスは多くの研究の対象となっており、従来の見識は、雌子ウシがその1年目の初期に繁殖して出産すると生涯生産が良好になるとともに初回分娩までの全生産コストも低下するという考えである。
本明細書には、従来の実践とは対照的に、家畜の性的成熟を無期限に、永久に、又は性的に成熟するように処理される時点まで遅延させる方法が提供される。これらの方法で魚及びブタが処理されており、生きた動物、クローン動物、ファウンダー動物を含め、これらの処理の結果が本明細書に示される。特定の商業的に重要な遺伝子座における高効率の且つ正確な遺伝子編集が実現した。効率は、連結された選択マーカーなしにこれらの変化を生じさせることができる程十分に高い。
本発明の実施形態は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、遺伝子の不活性化により動物が性的に成熟することが阻止されている家畜動物である。
本発明の実施形態は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合であるゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であり、従って不活化遺伝子がホモ接合の子孫は性的に成熟することが阻止される。
本発明の実施形態は、家畜動物を作製する方法であり、この方法は、家畜細胞及び家畜胚からなる群から選択される生命体に対し、細胞の染色体標的部位に特異的に結合して二本鎖DNA切断を生じさせることにより性成熟選択的神経内分泌遺伝子を不活性化する薬剤であって、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される薬剤を導入するステップを含む。
本発明の実施形態は、家畜動物を飼育する方法であり、この方法は、動物の性成熟のため動物に薬剤を投与するステップであって、薬剤が動物の遺伝的性成熟不能を補償するステップを含む。
以下の特許出願は本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される;矛盾が生じた場合、本明細書が優先する:米国特許出願公開第2010/0146655号明細書、米国特許出願公開第2010/0105140号明細書、米国特許出願公開第2011/0059160号明細書、米国特許出願公開第2011/0197290号明細書、及び米国特許出願公開第2013/0117870号明細書。
環境及びエネルギー資源を保全する方法で家畜を生産することが望ましい。性的に未熟な動物は、概して成熟動物又は成熟中の動物と比べて体重1ポンド当たりに消費する食物が少ない。一般には、家畜は成熟するまで望ましいサイズに達しない。しかしながら、本明細書には、成熟前に望ましいサイズに成長することのできる動物が示される。
実際、本明細書には、動物が全く性的に成熟しない方法が記載される。この動物は春機発動期を経ることなしに通常の成熟年齢を超えて成長することができる。性的に未熟な動物は生殖不能である。それ故、有性生殖が費用対効果に優れ、また生殖補助技術(ART)さえも卵子及び精子の提供に成熟動物を必要とすることから、生殖不能動物の効率的な産生は大きな難題である。一部の実施形態では、家畜動物は春機発動期に入らず、動物を性的成熟期に入らせるよう特別に処理しない限り永久に性的に未熟なままである。かかる動物は、成熟を誘導する処理後に、ひいては繁殖させることができる。
成熟能を有しない家畜を作製する利点は、そうした家畜が生殖不可能なことにある。例えば、有性的に繁殖させた又は遺伝子改変された魚の場合、それが偶発的に野生に放たれる懸念が払拭される。同様に改変される他の動物もまた生殖不可能ということになるため、購入者によって動物が無制御に繁殖される懸念なしに価値のある遺伝形質を有する動物を販売することができる。さらに、多くの農業動物(例えば、乳牛、家禽、及び魚)において、不妊化により生産性とともに肉品質も増し、脂質含量、色素沈着及び肉質が改善し得る。乳牛という用語はウシの俗称である;ウシは大型の有蹄類であり、ウシ属(Bos)の中で最も広く普及している種である。乳牛又はウシは、オーロックス(Bos primigenius)のメンバーを指す。また、魚の場合、生殖不能の魚は生殖腺発育や性分化よりむしろ成長のためにエネルギーを温存することにより、培養下でより高いパフォーマンスを示すはずである。現在、倍数性の操作(特に三倍性、一組の余分な染色体を加えるもの)による不妊化が、水産養殖生産者に利用可能な唯一つの商業的拡張性のある技術である。しかしながら、結果に一貫性がなく、この技術の有効性に関しては疑問視されている。加えて、一般に三倍体の誘導は処理された集団の生存及び/又はパフォーマンスに悪影響を及ぼすことが多い。また、この技術の適用は労働集約的であり、物流が複雑で、且つ高コストである。
本発明の実施形態は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、この遺伝子の不活性化により動物が性的に成熟することが阻止されている家畜動物である。この遺伝子は性成熟プロセスを選択的に対象とし、動物がノックアウトされる場合、その動物は野生型動物と比べて、野生型動物が性成熟を経る時点まではサイズ及び体重で計測するときその生育の点で同等となる。遺伝子という用語は、遺伝の単位に対応した、位置を特定可能なゲノム配列領域であって、調節領域、転写領域、及び/又は他の機能性配列領域に関連するものを意味する。遺伝子という用語は、本明細書で使用されるとき、機能性配列領域及びタンパク質又は他の因子をコードする部分を含む。ノックアウトという用語は、本明細書で使用されるとき、得られるタンパク質の機能を不活性化するか、或いはタンパク質産物の産生をなくす直接的又は間接的な遺伝子破壊を指す。
遺伝子改変は特定の遺伝子又は遺伝子産物を標的とすることにより性成熟を阻止するものであるため、成熟に必要な因子は既知であり、概して供給することができる。
性成熟選択的神経内分泌遺伝子
動物の性的発育は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を遮断することにより阻止され得る。性的発育、加速成長、及び副腎成熟は、視床下部によりゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH1)が分泌され始めると惹起される。遺伝子GnRH1はGnRH11前駆体をコードする。哺乳動物では、概して92アミノ酸プレプロホルモンから線状デカペプチド最終産物が合成される。ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH1)は、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)及びルリベリンとしても知られ、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び黄体形成ホルモン(LH)の放出に関与する。GnRH1はゴナドトロピン放出ホルモンファミリーに属する。本発明の実施形態は、家畜動物においてGnRH1を不活性化することを含む。ゴナドトロピン放出ホルモン又は類似体を動物に投与することにより、動物を性的成熟に至らせ得る。複数の種にわたるGnRH1の配列が知られており、例えば、ウシ(Bos Taurus)は遺伝子ID768325、ニワトリ(Gallus gallus)は770134、又はイノシシ(sus scrofa)は397516である。GPR54は、キスペプチン受容体としても知られ(GpR54、KissR、Kiss1R、kissRなどとも称される)、ホルモンキスペプチン(旧称メタスチン)に結合する。キスペプチンは、KiSS1遺伝子(Kiss、Kiss1、KiSS、kiss1などとも称される)から生じる産物である。キスペプチン−GPR54シグナル伝達は、GnRH1分泌の惹起において役割を担う。キスペプチンは、複数の機能を有するRFアミドニューロペプチドであり、様々な全身生理系に関与し、且つ生殖軸−脳、下垂体、生殖腺(BPG)、及び副器官のあらゆるレベルで作用する。キスペプチンはGnRH放出を直接刺激することができ(Messagerら,2005)、ステロイドホルモンの負及び正のフィードバックシグナルをGnRHニューロンに中継し、春機発動開始のゲートキーパーとして働き、且つ光周情報を中継し得る。
動物の性的発育は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を遮断することにより阻止され得る。性的発育、加速成長、及び副腎成熟は、視床下部によりゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH1)が分泌され始めると惹起される。遺伝子GnRH1はGnRH11前駆体をコードする。哺乳動物では、概して92アミノ酸プレプロホルモンから線状デカペプチド最終産物が合成される。ゴナドトロピン放出ホルモン(GnRH1)は、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)及びルリベリンとしても知られ、卵胞刺激ホルモン(FSH)及び黄体形成ホルモン(LH)の放出に関与する。GnRH1はゴナドトロピン放出ホルモンファミリーに属する。本発明の実施形態は、家畜動物においてGnRH1を不活性化することを含む。ゴナドトロピン放出ホルモン又は類似体を動物に投与することにより、動物を性的成熟に至らせ得る。複数の種にわたるGnRH1の配列が知られており、例えば、ウシ(Bos Taurus)は遺伝子ID768325、ニワトリ(Gallus gallus)は770134、又はイノシシ(sus scrofa)は397516である。GPR54は、キスペプチン受容体としても知られ(GpR54、KissR、Kiss1R、kissRなどとも称される)、ホルモンキスペプチン(旧称メタスチン)に結合する。キスペプチンは、KiSS1遺伝子(Kiss、Kiss1、KiSS、kiss1などとも称される)から生じる産物である。キスペプチン−GPR54シグナル伝達は、GnRH1分泌の惹起において役割を担う。キスペプチンは、複数の機能を有するRFアミドニューロペプチドであり、様々な全身生理系に関与し、且つ生殖軸−脳、下垂体、生殖腺(BPG)、及び副器官のあらゆるレベルで作用する。キスペプチンはGnRH放出を直接刺激することができ(Messagerら,2005)、ステロイドホルモンの負及び正のフィードバックシグナルをGnRHニューロンに中継し、春機発動開始のゲートキーパーとして働き、且つ光周情報を中継し得る。
本発明の実施形態は、家畜動物において遺伝子GPR54及び/又はKiSS1を不活性化することを含む。キスペプチンを投与することによりKiSS1の欠損を補い、それにより性的成熟を達成し得る。或いは、KiSS1及び/又はGPR54は抑制され、ゴナドトロピン放出ホルモンを動物に投与することにより動物を性的成熟に至らせ得る。別の実施形態は、ドミナントネガティブGPR54を家畜動物のゲノムに挿入することによるキスペプチン−GPR54相互作用の不活性化である。ドミナントネガティブGPR54の発現が性成熟の惹起を阻止する。ドミナントネガティブGPR54の発現が受容体の下流のシグナル伝達を妨げ、シグナルの伝播及びGnRH1の放出を阻止する。GPR54の配列は複数の種にわたり知られており、例えば、ヒト(Homo sapiens)は84634、ゼブラフィッシュ(Danio rerio)は561898、又はイノシシ(Sus scrofa)は733704である。Kiss1の配列は複数の種にわたり知られており、例えば、ウシ(Bos taurus)は615613、イノシシ(Sus scrofa)は733704、又はヒツジ(Ovis aries)は100294562である。
Gpr54/Kiss経路は多くの脊椎動物種の間で高度に保存されており、ヒト及びマウスにおいて春機発動期のゲートキーパーであることが分かっている(Seminaraら,2003)。ヒト及びマウスにおけるGpr54及び/又はKiss遺伝子の不活性化に起因する不妊症が、異所性GnRH投与により回復している。マウス及びヒトにおける研究から、不活性化Gpr54が低ゴナドトロピン性性腺機能低下に起因して両性の不妊症を有効に引き起こすことが実証されている(d’Anglemont de Tassignyら,2007;de Rouxら,2003)。Kiss−Gpr54系は脊椎動物(Tena−Sempereら,2012)、特に哺乳動物で1つのKiss及びGpr54遺伝子のみが存在し、高度に保存されている。魚では複数の個別的なKiss遺伝子が同定されているが、受容体Gpr54は、調査された種の1つを除く全てにおいて1つの遺伝子によりコードされる。Gpr54突然変異を有するヒト及びマウスは正常レベルの視床下部GnRHを示したことから、Kiss/Gpr54シグナル伝達が血流中へのGnRHの放出に関与したことが示唆される(Seminaraら,2003)。これにより、Gpr54欠損対象にGnRH又はゴナドトロピンを直接注射することでKiss/Gpr54シグナル伝達を迂回できる可能性が提示された。実際、Gpr54欠損ヒトの両方がGnRH注射に反応しており(Seminaraら,2003)、下流の春機発動期シグナル伝達成分がインタクトなままであることを示している。
現在、生殖生物学文献に魚キスペプチンの役割の直接的なエビデンスはない。しかしながら、kissペプチドの投与が、性的に成熟した雌ゼブラフィッシュ(Kitahashiら2008)及びオレンジグルーパーの下垂体におけるゴナドトロピン遺伝子発現、又はヨーロピアンシーバス(Felipら,2008)及びキンギョにおけるLH及びFSHの分泌を刺激することが示されている。従って、理論上、GPR54及び/又はKiSS1のノックアウトを有する性的に未熟で生殖不能な魚の妊孕性は、キスペプチン類似体(例えばキスペプチン10)又はゴナドトロピン類似体(LH又はFSH)を外因的に送達することにより救出することができる。この考えによれば、ホモ接合kiss又はkiss受容体ノックアウト種親は矯正ホルモンを投与すれば飼育下で繁殖させることができ、妊孕性の可逆的な制御を確実にし得る。このKO種親からの子孫はこの改変を受け継ぐ。これは経済上及び環境上の利益を提供し得る。
性成熟選択的神経内分泌遺伝子は、いくつかの方法により不活性化することができる。遺伝子の不活性化は、タンパク質又はRNAなど、遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止する。ある種の不活性化には、性成熟因子をコードする配列及び/又は動物におけるその因子の発現に必要なプロモーター及び/又はオペレーターにおける1つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換が含まれる。不活性化は遺伝子のノックアウトであってもよい。遺伝子は、動物のゲノムからの遺伝子の少なくとも一部分の除去、その遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するような遺伝子の改変、干渉性RNA(動物のゲノム中又は動物の複数の細胞中の遺伝子により発現する)、又は外来遺伝子によるドミナントネガティブ因子の発現によって不活性化され得る。
回復可能な不妊の別の系はTac3/TacR3(Young,J.,Bouligand,J.,Francou,B.,Raffin−Sanson,M.L.,Gaillez,S.,Jeanpierre,M.,Grynberg,M.,Kamenicky,P.,Chanson,P.,Brailly−Tabard,S.,ら(2010)である。TAC3及びTACR3欠損は、ヒトにおいて視床下部先天性低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を引き起こす。J Clin Endocrinol Metab 95,2287−2295。Kiss/Gpr54と同様に、これらの遺伝子が欠損したヒトは低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を呈し、これは律動的GnRH治療により回復可能であった(Youngら,2010)。Tac及び/又はTac3は、本明細書に記載又は参照される方法を用いて不活性化し得る。
本発明の実施形態は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ニワトリ、シチメンチョウ、ヤギ、ヒツジ、魚、スイギュウ、エミュー、ウサギ、有蹄類、トリ、げっ歯類、及び家畜からなる群から選択される動物において、GnRH1、GPR54、KiSS1、Tac及びTac3からなる群から選択される1つ以上の遺伝子を不活性化する方法を含む。遺伝子は、細胞及び/又は胚において、及びそれから生じる動物において不活性化され得る。本明細書には、様々な方法、例えば、TALEN又はジンクフィンガーヌクレアーゼを使用した細胞又は胚における遺伝子のノックアウト、及び代理母に細胞/胚をクローニング及び/又は移植することによるファウンダー動物の作製が記載される。
図1は本発明の実施形態を示し、ここではウシ細胞がインビトロで改変され、それを使用して子ウシがクローニングされる。子ウシは屠殺に好適な体重まで飼育されるか、又は子ウシを成熟期に入らせる因子、例えばゴナドトロピン類似体又はノックアウトされた遺伝因子を直接供給する因子によって処理され得る。
実施例1は、TALENシステムによって細胞に変化を作り出すための技術を記載する。実施例2は、表1の結果に用いた希釈クローン技術を記載する。実施例3は、突然変異検出技法及びRFLP分析を記載する。実施例4(図2)は、ウシGDF8のエクソン−3に対する11塩基対欠失の遺伝子移入を記載する(ベルジャンブルー突然変異)。図3は、ある種から別の種に対立遺伝子を遺伝子移入した同様の手法の結果を示す。実施例5は、その試験並びにオリゴHDRを使用した雌ウシ細胞に対する対立遺伝子の遺伝子移入を示す。実施例5では、TALEN誘導性相同組換えにより、連結した選択マーカーの必要性がなくなった。単独でトランスフェクトしたとき、btGDF8.1 TALEN対は染色体の最大16%を標的遺伝子座で切断した。11bpの欠失を有するスーパーコイル相同DNA修復鋳型とのコトランスフェクションは、所望のイベントに関する選択なしに、3日目に0.5〜5%の遺伝子変換頻度(HDR)をもたらした。PCRによりスクリーニングした単離コロニーの1.4%に遺伝子変換が同定された(PCRは成功した改変を同定する迅速な方法であった)。実施例6(図4)は、ブタ及びウシ線維芽細胞における4つの意図した遺伝子座の改変を示す。実施例7(図5)は、遺伝子APC、LDLR、p53、p65、及びbtGDF8に対して行った改変の分析を示す。実施例8(表1)は10〜64%(平均45%)の意図したインデルの回復率を示し、コロニーの最大32%が改変に関してホモ接合である。実施例9(図6)は、改変された欠失させた無精子症様(DAZL)及び改変された大腸腺腫性ポリポーシス(APC)遺伝子を伴い作製したクローンブタを示す。実施例10(図7)は、指示する遺伝子ターゲティング戦略に従い作製したGPR54ノックアウトを示す;実施例11は、GPR54ノックアウトを有する改変動物の作製方法を詳説する。実施例12は、特注のCRISPR/Cas9エンドヌクレアーゼで行った改変を記載する。
これらの結果から、連結された選択マーカーの助けなしに意図した遺伝子に改変を有効に作製する技術が実証された。改変を有する細胞は、動物のクローニングに使用することができる。意図した遺伝子改変は、例えば対立遺伝子の遺伝子移入のため、又は遺伝子を改変するために、特異性をもって制御することができる。改変は、例えば、遺伝子を破壊し又はそれをノックアウトするか、又は遺伝子の一部を置き換えて非機能性の遺伝子産物又は代替的な産物を作り出す欠失又は挿入であってもよい。
KiSS1及びGpR54(GPR54、Kiss受容体、KissR、Kiss1Rとも称される)のノックアウトを有する魚(テラピア)が作製されている。図8及び図9はKISS及びGpR54の標的領域を示す。Kiss遺伝子の構造上の構成は保存されており、一方がシグナルペプチドとキスペプチン前駆体の一部との両方をコードし、他方がキスペプチン−10配列を含む前駆体の残りの部分をコードする2つのコードエクソンを含む。実施例14は、Kiss又はKissRノックアウトを有するファウンダー魚の作製に使用したステップを詳説する。TALENに基づく技術を用いて遺伝子をノックアウトし、融解分析を用いてインデルを検出した(図10)。9つの異なるヌクレオチド欠失、2つの挿入、及びヌクレオチド挿入と欠失との3つの組み合わせを含め、標的遺伝子の様々な改変が確認された(図11)。塩基配列決定から、ノックアウトがこれらの改変の少なくとも一部によって生じ得ることが示された。生殖系列突然変異が確認された(図12を参照)。Kiss又はKissRノックアウトを有するF1ヘテロ接合突然変異体を作出し、繁殖させた。現在、不活性化表現型を示すと予想されるF2世代を成長させているところである。
本明細書には、意図した部位にのみ変化を有するトランスジェニック動物を作製する方法が開示される。加えて、これらの方法は、意図した部位に特別に意図した変化を作り出すことができる。連結されたレポーター遺伝子の使用、又は連結されたポジティブ及びネガティブ選択遺伝子などの問題がもたらす他の変化を取り除く必要がなく、又はランダムな導入遺伝子の組込みが回避される。さらに、これらの方法をファウンダー世代で使用して、意図した部位に意図した変化のみを有する遺伝子改変動物を作製することができる。連結されていないマーカー遺伝子などが関わる他の方法もまた開示される。
標的ヌクレアーゼシステム
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)及びジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)などのゲノム編集ツールは、多くの生物におけるバイオテクノロジー、遺伝子療法及び機能ゲノム研究の分野に影響を与えてきた。最近では、RNA誘導型エンドヌクレアーゼ(RGEN)が、相補的RNA分子によってその標的部位に向けられている。Cas9/CRISPRシステムはREGENである。tracrRNAは別のかかるツールである。これらは標的ヌクレアーゼシステムの例である:これらのシステムは、ヌクレアーゼを標的部位に局在させるDNA結合メンバーを有する。次にこの部位がヌクレアーゼにより切断される。TALEN及びZFNは、DNA結合メンバーに融合したヌクレアーゼを有する。Cas9/CRISPRは標的DNA上で互いを見つけ出すコグネイトである。DNA結合メンバーは染色体DNAにコグネイト配列を有する。DNA結合メンバーは典型的には、意図したコグネイト配列を考慮して、意図した部位又はその近傍で核酸分解作用を達成するように設計される。特定の実施形態は、限定なしに、ヌクレアーゼ再切断を最小限に抑える実施形態、正確に意図した残基でインデルを作製するための実施形態、及びDNA結合部位に遺伝子移入される対立遺伝子を置くことを含め、あらゆるかかるシステムを適用することが可能である。
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)及びジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)などのゲノム編集ツールは、多くの生物におけるバイオテクノロジー、遺伝子療法及び機能ゲノム研究の分野に影響を与えてきた。最近では、RNA誘導型エンドヌクレアーゼ(RGEN)が、相補的RNA分子によってその標的部位に向けられている。Cas9/CRISPRシステムはREGENである。tracrRNAは別のかかるツールである。これらは標的ヌクレアーゼシステムの例である:これらのシステムは、ヌクレアーゼを標的部位に局在させるDNA結合メンバーを有する。次にこの部位がヌクレアーゼにより切断される。TALEN及びZFNは、DNA結合メンバーに融合したヌクレアーゼを有する。Cas9/CRISPRは標的DNA上で互いを見つけ出すコグネイトである。DNA結合メンバーは染色体DNAにコグネイト配列を有する。DNA結合メンバーは典型的には、意図したコグネイト配列を考慮して、意図した部位又はその近傍で核酸分解作用を達成するように設計される。特定の実施形態は、限定なしに、ヌクレアーゼ再切断を最小限に抑える実施形態、正確に意図した残基でインデルを作製するための実施形態、及びDNA結合部位に遺伝子移入される対立遺伝子を置くことを含め、あらゆるかかるシステムを適用することが可能である。
TALEN
TALENは遺伝子操作ツールである。遺伝子の不活性化は、TALENの多くの使用法のうちの一つである。用語TALENは、本明細書で使用されるとき、広義であり、別のTALENの助けを借りることなしに二本鎖DNAを切断することのできる単量体TALENを含む。用語TALENはまた、共同して同じ部位のDNAを切断する働きをするように操作される一対のTALENの一方又は両方のメンバーを指しても使用される。共同して働くTALENは、DNAの利き手を参照して、左TALEN(left−TALEN)及び右TALEN(right−TALEN)と称され得る。
TALENは遺伝子操作ツールである。遺伝子の不活性化は、TALENの多くの使用法のうちの一つである。用語TALENは、本明細書で使用されるとき、広義であり、別のTALENの助けを借りることなしに二本鎖DNAを切断することのできる単量体TALENを含む。用語TALENはまた、共同して同じ部位のDNAを切断する働きをするように操作される一対のTALENの一方又は両方のメンバーを指しても使用される。共同して働くTALENは、DNAの利き手を参照して、左TALEN(left−TALEN)及び右TALEN(right−TALEN)と称され得る。
TALEN改変家畜を作製することの障壁の一つは、動物細胞に対する改変の作製効率が従来の最良事例でも僅か数パーセントに過ぎないことである。意図した部位における欠失又は挿入の達成は、実際には、外因性タンパク質を発現する又は内因性タンパク質の発現を停止させるなどの意図した効果を生じないこともあるため、必ずしも成功を意味するわけではない。低い効率であっても、遺伝子改変された下等動物、例えばショウジョウバエ又はマウスなどの作出には有用となり得る、なぜなら、こうした下等動物は生殖周期が短く多産であり、何百匹もの動物を作出、試験、及びスクリーニングして改変が成功した数匹があるかどうかを判定することができるためである。しかしながら、従来法で達成されるこうした効率レベルは、妊娠期間がはるかに長く且つ妊娠当たりの子孫数が比較的少ない家畜偶蹄類には適さない。本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される2012年2月24日に出願された米国特許出願第13/404,662号明細書「Genetically modified animals and methods for making the same」(矛盾が生じた場合、本明細書が優先する)は、これらの従来法の制約に対処するある種の方法を提供している。
TALENを使用して家畜を改変することの別の障壁は、初代細胞でTALENの媒介によりDNAを改変することが、細胞の不安定性に起因して困難なことである。2011年2月11日に出願された米国特許出願公開第2011/0197290号明細書は、こうした細胞の改変に有用な方法を提供しており、本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される;矛盾が生じた場合、本明細書が優先する。初代細胞という用語は、生きている動物から単離された細胞であって、組織から単離されて以来0〜10回の複製を経た細胞を意味する。TALENを使用して遺伝子改変された偶蹄類初代細胞を作製し得る。このような改変は、クローニングによる遺伝子改変動物系統のファウンダーの作製に適している。本明細書にはまた、接合子又は胚の改変に用いられ得る直接的な胚注入も記載され、ここで改変された接合子又は胚は、ファウンダー動物系統の妊娠及び出産用代理母雌動物への移植に適している。
Millerら(Millerら(2011)Nature Biotechnol 29:143)は、TALトランケーション変異体をFokIヌクレアーゼの触媒ドメインに連結することによる部位特異的ヌクレアーゼ構成用のTALENの作製を報告した。得られたTALENは、不死化ヒト細胞において2つの主要な真核生物DNA修復経路である非相同末端結合(NHEJ)及び相同性指向型修復を介して遺伝子改変を誘導することが示された。TALENは特異的結合用に操作することができる。MillerらのTALENの改良が、2012年8月24日に出願された米国特許出願第13/594,694号明細書に記載されている。特異的結合とは、この用語が生物学の技術分野で一般に用いられるとおり、非標的と比べて比較的高親和性で標的に結合する分子であって、概して複数の非共有結合性の相互作用、例えば、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、水素結合などに関わる分子を指す。特異的結合相互作用は、抗体−抗原結合、酵素−基質結合、及び特異的に結合するタンパク質−受容体相互作用を特徴付ける。
TALの暗号が報告されており(国際公開第2011/072246号パンフレット)、ここでは各DNA結合リピートが標的DNA配列における1つの塩基対の認識に関与する。残基が組み合わさってDNA配列を標的化し得る:(a)C/Gの認識にはHD;(b)A/Tの認識にはNI;(c)T/Aの認識にはNG;(d)C/G又はA/T又はT/A又はG/Cの認識にはNS;(e)G/C又はA/Tの30認識にはNN;(f)T/Aの認識にはIG;(g)C/Gの認識にはN;(h)C/G又はT/Aの認識にはHG;(i)T/Aの認識にはH;及び(j)G/Cの認識にはNK。端的には、TALENが結合する標的部位が決定され、ヌクレアーゼと標的部位を認識する一連のRVDとを含む融合分子が作成される。結合すると、ヌクレアーゼがDNAを切断し、細胞修復機構が切断末端に遺伝子改変を作製するよう働くことができるようになる。用語TALENは、転写活性化因子様(TAL)エフェクター結合ドメインとヌクレアーゼドメインとを含むタンパク質を意味し、それ自体機能性である単量体TALEN並びに別の単量体TALENとの二量体化が必要なその他の単量体TALENが含まれる。二量体化は、両方の単量体TALENが同じであるときホモ二量体TALENをもたらすことができ、又は単量体TALENが異なるときヘテロ二量体TALENをもたらすことができる。
一部の実施形態では、単量体TALENが使用され得る。TALENは、典型的にはスペーサーを含む二分の認識部位にわたる二量体として機能し、ここでは2つのTALエフェクタードメインが各々FokI制限酵素の触媒ドメインに融合し、得られた各TALENに対するDNA認識部位はスペーサー配列によって分かれており、各TALEN単量体が認識部位に結合することによりFokIが二量体化し、スペーサー内に二本鎖切断を作り出すことが可能になる。しかしながら単量体TALENもまた構築することができ、ここでは単一のTALエフェクターが、機能するのに二量体化する必要のないヌクレアーゼと融合する。一つのかかるヌクレアーゼは、例えば、2つの単量体が単一のポリペプチドとして発現するFokIの単鎖変異体である。他の天然に存在する又は操作された単量体ヌクレアーゼもまた、この役割を果たすことができる。単量体TALENに使用されるDNA認識ドメインは、天然に存在するTALエフェクターに由来してもよい。或いは、DNA認識ドメインは、特定のDNA標的を認識するように操作されてもよい。操作された単鎖TALENは、操作されたDNA認識ドメインを1つしか必要としないため、構築及び展開がより容易であり得る。二量体DNA配列特異的ヌクレアーゼは、2つの異なるDNA結合ドメイン(例えば、1つがTALエフェクター結合ドメイン、及び1つが別の種類の分子に由来する結合ドメイン)を使用して生成することができる。TALENは、スペーサーを含む二分の認識部位にわたる二量体として機能し得る。このヌクレアーゼ構成もまた、例えば1つのTALEN単量体と1つのジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体とから生成された標的特異的ヌクレアーゼに用いることができる。そのような場合、TALEN及びジンクフィンガーヌクレアーゼ単量体のDNA認識部位は、適切な長さのスペーサーによって隔てられ得る。2つの単量体が結合することにより、FokIが二量体化し、スペーサー配列内に二本鎖切断を作り出すことが可能となり得る。ジンクフィンガー以外のDNA結合ドメイン、例えば、ホメオドメイン、mybリピート又はロイシンジッパーもまた、FokIと融合し、TALEN単量体と共に機能性ヌクレアーゼを作り出すパートナーとして働くことができる。
一部の実施形態では、TALエフェクターを使用して他のタンパク質ドメイン(例えば非ヌクレアーゼタンパク質ドメイン)を特定のヌクレオチド配列に標的化させることができる。例えば、TALエフェクターを、限定なしに、DNA20相互作用酵素(例えば、メチラーゼ、トポイソメラーゼ、インテグラーゼ、トランスポザーゼ、又はリガーゼ)、転写活性化因子若しくはリプレッサー、又はヒストンなどの他のタンパク質と相互作用するか若しくはそれを改変するタンパク質のタンパク質ドメインに連結することができる。かかるTALエフェクター融合物の応用には、例えば、エピジェネティック調節エレメントの作成又は改変、DNAにおける部位特異的挿入、欠失、又は修復の作製、遺伝子発現の制御、及びクロマチン構造の改変が含まれる。
標的配列のスペーサーを選択し、又は変化させて、TALENの特異性及び活性を調節することができる。スペーサー長さの柔軟性は、スペーサー長さを選択することにより特定の配列を高い特異性で標的化し得ることを示している。さらに、異なるスペーサー長さについて活性にばらつきがあることが観察されており、スペーサー長さを選択することにより所望のレベルのTALEN活性を達成し得ることが示される。
用語ヌクレアーゼには、エキソヌクレアーゼ及びエンドヌクレアーゼが含まれる。用語エンドヌクレアーゼは、DNA又はRNA分子、好ましくはDNA分子内の核酸間における結合の加水分解(切断)の触媒能を有する任意の野生型又は変異型酵素を指す。エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、FokI、HhaI、HindlII、NotI、BbvCl、EcoRI、BglII、及びAlwIなどのII型制限エンドヌクレアーゼが挙げられる。エンドヌクレアーゼは、長さ約12〜45塩基対(bp)、より好ましくは14〜45bpのポリヌクレオチド認識部位を典型的に有するとき、レアカットエンドヌクレアーゼもまた含む。レアカットエンドヌクレアーゼは規定の遺伝子座でDNA二本鎖切断(DSB)を誘導する。レアカットエンドヌクレアーゼは、例えば、ホーミングエンドヌクレアーゼ、操作されたジンクフィンガードメインとFokIなどの制限酵素の触媒ドメインとの融合により得られるキメラジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)又は化学的エンドヌクレアーゼであってもよい。化学的エンドヌクレアーゼでは、化学的な又はペプチド性の切断因子が核酸のポリマーか、或いは特定の標的配列を認識する別のDNAにコンジュゲートし、それにより切断活性を特定の配列に標的化する。化学的エンドヌクレアーゼには、特定のDNA配列と結合することが知られる、オルトフェナントロリン、DNA切断分子、及び三本鎖形成オリゴヌクレオチド(TFO)のコンジュゲートのような合成ヌクレアーゼも包含される。かかる化学的エンドヌクレアーゼは、本発明に係る用語「エンドヌクレアーゼ」に含まれる。かかるエンドヌクレアーゼの例としては、I−See I、I−Chu L I−Cre I、I−Csm I、PI−See L PI−Tti L PI−Mtu I、I−Ceu I、I−See IL 1−See III、HO、PI−Civ I、PI−Ctr L PI−Aae I、PI−Bsu I、PI−Dha I、PI−Dra L PI−Mav L PI−Meh I、PI−Mfu L PI−Mfl I、PI−Mga L PI−Mgo I、PI−Min L PI−Mka L PI−Mle I、PI−Mma I、PI−30 Msh L PI−Msm I、PI−Mth I、PI−Mtu I、PI−Mxe I、PI−Npu I、PI−Pfu L PI−Rma I、PI−Spb I、PI−Ssp L PI−Fae L PI−Mja I、PI−Pho L PI−Tag L PI−Thy I、PI−Tko I、PI−Tsp I、I−MsoIが挙げられる。
TALEN又は他のツールによって作製される遺伝子改変は、例えば、挿入、欠失、外来核酸断片の挿入、及び置換からなるリストから選択され得る。用語「挿入」は、染色体への文字通りの挿入又は修復用鋳型としての外来配列の使用のいずれも意味して広義に使用される。一般には、標的DNA部位が同定され、その部位に特異的に結合し得るTALEN対が作成される。TALENは細胞又は胚へと、例えばタンパク質、mRNAとして、又はTALENをコードするベクターにより送達される。TALENがDNAを切断して二本鎖切断が作製され、次にこれが修復されることで、多くの場合にインデルが作り出され、又は染色体に挿入されるか、或いは改変配列による切断の修復用鋳型として働く同伴する外来核酸に含まれる配列又は多型が組み込まれる。この鋳型駆動型の修復は染色体を変化させるのに有用なプロセスであり、細胞染色体に有効な変化をもたらす。
外来核酸という用語は、その核酸が天然で細胞中にある核酸配列と同じであるか、それとも異なるかに関わらず、細胞又は胚に加えられる核酸を意味する。核酸断片という用語は広義であり、染色体、発現カセット、遺伝子、DNA、RNA、mRNA、又はそれらの一部分が含まれる。細胞又は胚は、例えば、家畜、偶蹄類、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ウサギ、及び魚からなる群から選択され得る。家畜という用語は、食品又は生物学的材料用の商品として育てられる家畜化された動物を意味する。偶蹄類という用語は、各足に通常2本又は時に4本のこともある偶数の指を有する偶蹄目(Artiodactyla)の有蹄の哺乳動物を意味し、ウシ、シカ、ラクダ、カバ、ヒツジ、及びヤギが含まれる。
一部の実施形態は、遺伝子改変された家畜及び/又は偶蹄類を作製する組成物又は方法を含み、これは、家畜及び/又は偶蹄類の細胞又は胚にTALEN対を導入するステップであって、TALEN対により細胞又は胚のDNAに対しTALEN対が特異的に結合する部位に遺伝子改変が作製されるステップと、その細胞から家畜動物/偶蹄類を産生するステップとを含む。細胞又は胚に対しては、例えば接合子、胚盤胞、又は胚への直接注入が用いられ得る。或いは、タンパク質、RNA、mRNA、DNA、又はベクターを導入するための多くの公知の技法のいずれかを用いてTALEN及び/又は他の因子を細胞に導入してもよい。遺伝子改変動物は胚又は細胞から公知の方法、例えば妊娠宿主への胚の移植、又は様々なクローニング法によって作製され得る。語句「細胞のDNAに対する、TALENが特異的に結合する部位での遺伝子改変」などは、TALENがその標的部位に特異的に結合するときTALEN上のヌクレアーゼによって切断される部位に遺伝子改変が作製されることを意味する。ヌクレアーゼはTALEN対が結合するところを正確に切断するのでなく、むしろ2つの結合部位の間にある決められた部位で切断する。
一部の実施形態は、動物のクローニングに使用される細胞の組成物又は処理を含む。細胞は、家畜及び/又は偶蹄類細胞、培養細胞、初代細胞、初代体細胞、接合子、生殖細胞、始原生殖細胞、又は幹細胞であってもよい。例えば、実施形態は、遺伝子改変を生じさせる組成物又は方法であり、これは、培養物中の複数の初代細胞をTALENタンパク質又は1つ若しくは複数のTALENをコードする核酸に曝露するステップを含む。TALENはタンパク質として導入されるか、又は核酸断片として導入され、例えばベクター中のmRNA又はDNA配列によりコードされ得る。
細胞の遺伝子改変にはレポーターの挿入も含まれ得る。レポーターは、例えば、蛍光マーカー、例えば緑色蛍光タンパク質及び黄色蛍光タンパク質であってもよい。レポーターは、選択マーカー、例えば、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(neo、G418、APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ハイグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ、チミジンキナーゼ(TK)、又はキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)であってもよい。レポーター、選択マーカー、及び/又は1つ以上のTALEN用のベクターは、プラスミド、トランスポゾン、トランスポザーゼ、ウイルス、又は例えば本明細書に詳述されるとおりの、他のベクターであってもよい。
TALENは複数のDNA部位を指向し得る。これらの部位は、数千個又は何千個もの塩基対によって隔てられていることもあり得る。DNAは細胞機構により再結合することができ、それにより、それらの部位の間にある領域全体の欠失が生じ得る。実施形態は、例えば、1〜5メガベース又は染色体の50%〜80%、又は約100〜約1,000,000塩基対の距離を隔たっている部位を含む;当業者は、明示的に記載される範囲内にあるあらゆる範囲及び値、例えば、約1,000〜約10,000塩基対又は約500〜約500,000塩基対が企図されることを直ちに理解するであろう。或いは、外来性DNAの挿入のため、又は部位間のDNAの鋳型駆動型修復のため、外来性DNAが細胞又は胚に加えられてもよい。複数の部位における改変を用いて、遺伝子改変された細胞、胚、偶蹄類、及び家畜を作製し得る。性成熟遺伝子又はそのシス作用因子を含め、完全な又は少なくとも部分的な欠失用の1つ以上の遺伝子を選択し得る。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ
ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをDNA切断ドメインと融合することにより生成される人工的制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望のDNA配列を標的化するように操作することができ、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内にあるユニーク配列を標的化することが可能になる。内在性DNA修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを変化させることができる。ZFNは、遺伝子を不活性化させる方法において用いられ得る。
ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)は、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをDNA切断ドメインと融合することにより生成される人工的制限酵素である。ジンクフィンガードメインは、所望のDNA配列を標的化するように操作することができ、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼが複雑なゲノム内にあるユニーク配列を標的化することが可能になる。内在性DNA修復機構を利用することにより、これらの試薬を使用して高等生物のゲノムを変化させることができる。ZFNは、遺伝子を不活性化させる方法において用いられ得る。
ジンクフィンガーDNA結合ドメインは約30アミノ酸を有し、安定な構造に折り畳まれている。各フィンガーは主としてDNA基質内のトリプレットに結合する。鍵となる位置にあるアミノ酸残基が、DNA部位との配列特異的相互作用の大部分に寄与する。これらのアミノ酸を、残りのアミノ酸を維持して必要な構造を保ちながら変化させることができる。いくつかのドメインをタンデムに連結することにより、さらに長いDNA配列との結合が達成される。非特異的FokI切断ドメイン(N)、転写活性化因子ドメイン(A)、転写リプレッサードメイン(R)及びメチラーゼ(M)などの他の機能をZFPと融合させて、それぞれZFN、ジンクフィンガー転写活性化因子(ZFA)、ジンクフィンガー転写リプレッサー(ZFR、及びジンクフィンガーメチラーゼ(ZFM)を形成することができる。遺伝子改変動物の作製にジンクフィンガー及びジンクフィンガーヌクレアーゼを使用するための材料及び方法は、例えば、米国特許第8,106,255号明細書、米国特許出願公開第20120192298号明細書、米国特許出願公開第20110023159号明細書、及び米国特許出願公開第20110281306号明細書に記載される。
鋳型有り及び鋳型無し修復
TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Cas9/CRISPR及びリコンビナーゼ融合タンパク質は鋳型有り又は鋳型無しで用いられ得る。鋳型は、細胞修復機構のため細胞に付加される外来性DNAであり、DNAにおける二本鎖切断(DSB)を修復するためのガイド(鋳型)として使用される。このプロセスは、概してHDR相同性指向型修復(HDR)と称される。鋳型無しのプロセスには、DSBを作製し、且つ完全ではない修復を行う細胞機構を提供し、そのようにして挿入又は欠失(インデル)を作製することが関わる。非相同末端結合(NHEJ)と称される細胞経路は、典型的にはDSBの鋳型無し修復を媒介する。用語NHEJは、NHEJが関わるか、それとも代替的な細胞経路が関わるかを問わず、一般にあらゆるかかる鋳型無し修復を指して用いられている。
TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Cas9/CRISPR及びリコンビナーゼ融合タンパク質は鋳型有り又は鋳型無しで用いられ得る。鋳型は、細胞修復機構のため細胞に付加される外来性DNAであり、DNAにおける二本鎖切断(DSB)を修復するためのガイド(鋳型)として使用される。このプロセスは、概してHDR相同性指向型修復(HDR)と称される。鋳型無しのプロセスには、DSBを作製し、且つ完全ではない修復を行う細胞機構を提供し、そのようにして挿入又は欠失(インデル)を作製することが関わる。非相同末端結合(NHEJ)と称される細胞経路は、典型的にはDSBの鋳型無し修復を媒介する。用語NHEJは、NHEJが関わるか、それとも代替的な細胞経路が関わるかを問わず、一般にあらゆるかかる鋳型無し修復を指して用いられている。
ベクター及び核酸
ノックアウトを目的として、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、又は他の目的で、様々な核酸が偶蹄類細胞又は他の細胞に導入され得る。本明細書で使用されるとき、用語の核酸には、DNA、RNA、及び核酸類似体、及び二本鎖又は一本鎖(即ち、センス又はアンチセンス一本鎖)である核酸が含まれる。核酸類似体を塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で改変することにより、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、又は溶解度を向上させることができる。塩基部分の改変には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、並びにデオキシシチジンに対する5−メチル−2’−デオキシシチジン及び5−ブロモ−2’−デオキシシチジンが含まれる。糖部分の改変には、2’−O−メチル糖又は2’−O−アリル糖を形成するリボース糖の2’ヒドロキシルの改変が含まれる。デオキシリボースリン酸骨格は、各塩基部分が6員モルホリノ環に連結されているモルホリノ核酸か、又はデオキシリン酸骨格が擬ペプチド骨格によって置換されており、且つ4塩基が維持されているペプチド核酸を生じるように改変することができる。Summerton and Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7(3):187;及びHyrupら(1996)Bioorgan.Med.Chem.4:5を参照のこと。加えて、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、又はアルキルリン酸トリエステル骨格で置換することができる。
ノックアウトを目的として、遺伝子の不活性化のため、遺伝子の発現を得るため、又は他の目的で、様々な核酸が偶蹄類細胞又は他の細胞に導入され得る。本明細書で使用されるとき、用語の核酸には、DNA、RNA、及び核酸類似体、及び二本鎖又は一本鎖(即ち、センス又はアンチセンス一本鎖)である核酸が含まれる。核酸類似体を塩基部分、糖部分、又はリン酸骨格で改変することにより、例えば、核酸の安定性、ハイブリダイゼーション、又は溶解度を向上させることができる。塩基部分の改変には、デオキシチミジンに対するデオキシウリジン、並びにデオキシシチジンに対する5−メチル−2’−デオキシシチジン及び5−ブロモ−2’−デオキシシチジンが含まれる。糖部分の改変には、2’−O−メチル糖又は2’−O−アリル糖を形成するリボース糖の2’ヒドロキシルの改変が含まれる。デオキシリボースリン酸骨格は、各塩基部分が6員モルホリノ環に連結されているモルホリノ核酸か、又はデオキシリン酸骨格が擬ペプチド骨格によって置換されており、且つ4塩基が維持されているペプチド核酸を生じるように改変することができる。Summerton and Weller(1997)Antisense Nucleic Acid Drug Dev.7(3):187;及びHyrupら(1996)Bioorgan.Med.Chem.4:5を参照のこと。加えて、デオキシリン酸骨格は、例えば、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート骨格、ホスホロアミダイト、又はアルキルリン酸トリエステル骨格で置換することができる。
標的核酸配列は、プロモーターなどの調節領域に作動可能に連結され得る。調節領域はブタ調節領域であってもよく、又は他の種由来であってもよい。本明細書で使用されるとき、作動可能に連結されるとは、標的核酸の転写を可能にし又は促進するような形で調節領域を核酸配列に対して位置させることを指す。
任意の種類のプロモーターを標的核酸配列に作動可能に連結させることができる。プロモーターの例としては、限定なしに、組織特異的プロモーター、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、及び特定の刺激に応答性又は非応答性のプロモーターが挙げられる。好適な組織特異的プロモーターは、β細胞における核酸転写産物の選択的発現をもたらすことができ、例えばヒトインスリンプロモーターが挙げられる。他の組織特異的プロモーターは、例えば、肝実質細胞又は心臓組織における選択的発現をもたらすことができ、それぞれアルブミン又はαミオシン重鎖プロモーターを挙げることができる。他の実施形態では、顕著な組織特異性又は時間特異性のない核酸分子の発現を促進するプロモーターが用いられ得る(即ち、構成的プロモーター)。例えば、β−アクチンプロモーター、例えばニワトリβ−アクチン遺伝子プロモーター、ユビキチンプロモーター、ミニCAGプロモーター、グリセルアルデヒド−3−リン酸デヒドロゲナーゼ(GAPDH)プロモーター、又は3−ホスホグリセリン酸キナーゼ(PGK)プロモーター、並びにウイルスプロモーター、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ(HSV−TK)プロモーター、SV40プロモーター、又はサイトメガロウイルス(CMV)プロモーターも使用し得る。一部の実施形態では、ニワトリβアクチン遺伝子プロモーターとCMVエンハンサーとの融合物がプロモーターとして使用される。例えば、Xuら(2001)Hum.Gene Ther.12:563;及びKiwakiら(1996)Hum.Gene Ther.7:821を参照のこと。
核酸コンストラクトにおいて有用となり得るさらなる調節領域としては、限定はされないが、ポリアデニル化配列、翻訳制御配列(例えば、配列内リボソーム進入セグメント、IRES)、エンハンサー、誘導性エレメント、又はイントロンが挙げられる。かかる調節領域は必須ではないが、転写、mRNAの安定性、翻訳効率などに影響を及ぼすことにより発現を増加させ得る。かかる調節領域を必要に応じて核酸コンストラクトに含めることで、細胞における核酸の最適な発現を達成することができる。しかしながら、かかる追加的なエレメントなしに十分な発現が達成されることもある。
シグナルペプチド又は選択可能なマーカーをコードする核酸コンストラクトが用いられ得る。シグナルペプチドを使用して、コードされるポリペプチドを特定の細胞部位(例えば細胞表面)に仕向けることができる。選択可能なマーカーの非限定的な例としては、ピューロマイシン、ガンシクロビル、アデノシンデアミナーゼ(ADA)、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(neo、G418、APH)、ジヒドロ葉酸レダクターゼ(DHFR)、ハイグロマイシン−B−ホスホトランスフェラーゼ(phosphtransferase)、チミジンキナーゼ(TK)、及びキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(XGPRT)が挙げられる。かかるマーカーは、培養下で安定な形質転換体を選択するのに有用である。他の選択可能なマーカーとしては、蛍光ポリペプチド、例えば緑色蛍光タンパク質又は黄色蛍光タンパク質が挙げられる。
一部の実施形態では、選択可能なマーカーをコードする配列には、例えばCre又はFlpなどのリコンビナーゼ認識配列が隣接し得る。例えば、選択可能なマーカーにはloxP認識部位(Creリコンビナーゼによって認識される34−bpの認識部位)又はFRT認識部位が隣接してもよく、これによりコンストラクトからその選択可能なマーカーを切り出すことができる。Cre/lox技術のレビューに関するOrban,ら,Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89:6861、及びBrand and Dymecki,Dev.Cell(2004)6:7を参照のこと。選択可能なマーカー遺伝子によって分断されたCre又はFlp活性化が可能な導入遺伝子を含むトランスポゾンを使用して、導入遺伝子の条件付き発現を含むトランスジェニック動物を得ることもできる。例えば、マーカー/導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターは、遍在性であっても、或いは組織特異的であってもよく、これがF0動物(例えばブタ)においてマーカーの遍在的又は組織特異的発現をもたらし得る。導入遺伝子の組織特異的活性化は、例えば、マーカーで分断された導入遺伝子を遍在的に発現するブタを、Cre又はFlpを組織特異的な形で発現するブタと交配することによるか、又はマーカーで分断された導入遺伝子を組織特異的な形で発現するブタを、Cre又はFlpリコンビナーゼを遍在的に発現するブタと交配することにより達成され得る。導入遺伝子の制御された発現又はマーカーの制御された切り出しにより、導入遺伝子の発現が可能となる。
一部の実施形態では、外来核酸はポリペプチドをコードする。ポリペプチドをコードする核酸配列は、続くコードされたポリペプチドの操作を容易にするように(例えば位置特定又は検出を容易にするように)設計された「タグ」をコードするタグ配列を含み得る。タグ配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列において、コードされたタグがポリペプチドのカルボキシル末端又はアミノ末端のいずれかに位置するように挿入することができる。コードされるタグの非限定的な例としては、グルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)及びFLAG(商標)タグ(Kodak,New Haven,CT)が挙げられる。
核酸コンストラクトは、SssI CpGメチラーゼ(New England Biolabs,Ipswich,MA)を使用してメチル化することができる。一般には、核酸コンストラクトが緩衝液中37℃でS−アデノシルメチオニン及びSssI CpG−メチラーゼと共にインキュベートされ得る。コンストラクトを1単位のHinP1Iエンドヌクレアーゼと共に37℃で1時間インキュベートし、アガロースゲル電気泳動によってアッセイすることにより、過剰メチル化を確認することができる。
核酸コンストラクトは、例えば、卵母細胞又は卵などの生殖細胞、前駆細胞、成体又は胚性幹細胞、始原生殖細胞、PK−15細胞などの腎細胞、膵島細胞、β細胞、肝細胞、又は皮膚線維芽細胞などの線維芽細胞を含めた任意の種類の胚、胎仔、又は成体偶蹄類細胞に、様々な技術を使用して導入することができる。技術の非限定的な例としては、トランスポゾンシステム、細胞を感染させることのできる組換えウイルス、又はリポソームの使用、又は核酸を細胞に送達することが可能な他の非ウイルス性の方法、例えば、電気穿孔、マイクロインジェクション、若しくはリン酸カルシウム沈殿が挙げられる。
トランスポゾンシステムでは、核酸コンストラクトの転写単位、即ち外来核酸配列に作動可能に連結された調節領域に、トランスポゾンの逆向き反復配列が隣接する。いくつかのトランスポゾンシステム、例えば、スリーピングビューティー(Sleeping Beauty)(米国特許第6,613,752号明細書及び米国特許出願公開第2005/0003542号明細書を参照);フロッグプリンス(Frog Prince)(Miskeyら(2003)Nucleic Acids Res.31:6873);Tol2(Kawakami(2007)Genome Biology 8(Suppl.1):S7;ミノス(Minos)(Pavlopoulosら(2007)Genome Biology 8(Suppl.1):S2);Hsmar1(Miskeyら(2007))Mol Cell Biol.27:4589);及びパスポート(Passport)が、マウス、ヒト、及びブタ細胞を含め、細胞に核酸を導入するために開発されている。スリーピングビューティー(Sleeping Beauty)トランスポゾンは特に有用である。トランスポザーゼは、外来核酸と同じ核酸コンストラクトでコードされるタンパク質として送達されてもよく、別個の核酸コンストラクトで導入されてもよく、又はmRNA(例えば、インビトロで転写及びキャッピングされるmRNA)として提供されてもよい。
外来核酸の発現を維持し、且つ宿主遺伝子の望ましくない転写を阻害するため、インスレーターエレメントもまた核酸コンストラクトに含めることができる。例えば、米国特許出願公開第2004/0203158号明細書を参照のこと。典型的には、インスレーターエレメントは転写単位の両側に隣接し、トランスポゾンの逆向き反復配列に対して内側にある。インスレーターエレメントの非限定的な例としては、マトリクス付着領域(MAR)型インスレーターエレメント及び境界型インスレーターエレメントが挙げられる。例えば、米国特許第6,395,549号明細書、同第5,731,178号明細書、同第6,100,448号明細書、及び同第5,610,053号明細書、及び米国特許出願公開第2004/0203158号明細書を参照のこと。
核酸はベクターに組み込むことができる。ベクターは、担体から標的DNAに移動するように設計された任意の特定のDNAセグメントを含む広義の用語である。ベクターは、発現ベクター、又はベクターシステムと称されることもあり、これは、ゲノム又は他の標的とされるDNA配列、例えばエピソーム、プラスミド、又はさらにはウイルス/ファージDNAセグメントへのDNA挿入をもたらすのに必要な一組の構成要素である。動物における遺伝子デリバリーに使用されるベクターシステム、例えば、ウイルスベクター(例えば、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス及び組込みファージウイルス)、及び非ウイルスベクター(例えばトランスポゾン)は、2つの基本的な構成要素を有する:1)DNA(又はcDNAに逆転写されるRNA)を含むベクター、及び2)トランスポザーゼ、リコンビナーゼ、又はその他の、ベクター及びDNA標的配列の両方を認識し且つベクターを標的DNA配列に挿入するインテグラーゼ酵素。ベクターは、ほとんどの場合に、1つ以上の発現制御配列を含む1つ以上の発現カセットを含み、ここで発現制御配列は、別のDNA配列又はmRNAのそれぞれ転写及び/又は翻訳を制御及び調節するDNA配列である。
多くの異なる種類のベクターが知られている。例えば、プラスミド及びウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターが知られている。哺乳類発現プラスミドは、典型的には複製起点、好適なプロモーター及び任意選択のエンハンサーを有し、また任意の必要なリボソーム結合部位、ポリアデニル化部位、スプライス供与・受容部位、転写終結配列、及び5’フランキング非転写配列も有する。ベクターの例としては、プラスミド(これはまた、別の種類のベクターの担体にもなり得る)、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レンチウイルス(例えば、改変HIV−1、SIV又はFIV)、レトロウイルス(例えば、ASV、ALV又はMoMLV)、及びトランスポゾン(例えば、スリーピングビューティー(Sleeping Beauty)、P−エレメント、Tol−2、フロッグプリンス(Frog Prince)、ピギーバック(piggyBac))が挙げられる。
本明細書で使用されるとき、核酸という用語は、例えば、cDNA、ゲノムDNA、合成の(例えば、化学的に合成された)DNA、並びに天然に存在する及び化学的に改変された核酸、例えば、合成塩基又は代替的な骨格を含めた、RNA及びDNAの両方を指す。核酸分子は二本鎖又は一本鎖(即ち、センス又はアンチセンス一本鎖)であってよい。トランスジェニックという用語は、本明細書では広義に使用され、遺伝子操作技術を使用して遺伝物質が変化している遺伝子改変された生物又は遺伝子操作された生物を指す。従って、ノックアウト偶蹄類は、外来性の遺伝子又は核酸が動物又はその子孫で発現するか否かに関わらず、トランスジェニックである。
遺伝子改変動物
動物は、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は公知の種々のベクターを含む他の遺伝子操作ツールを使用して改変され得る。かかるツールによって作製された遺伝子改変には、遺伝子の不活性化が含まれ得る。遺伝子の不活性化という用語は、機能性遺伝子産物の形成を阻止することを指す。遺伝子産物は、それがその正常な(野生型の)機能を果たす場合に限り機能性である。動物を遺伝的に改変する材料及び方法は、2012年2月24日に出願された米国特許出願第13/404,662号明細書、2012年5月9日に出願された同第13/467,588号明細書、及び2009年11月10日に出願された同第12/622,886号明細書(これらは本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される;矛盾が生じた場合、本明細書が優先する)にさらに詳述される。トランス作用性という用語は、異なる分子から標的遺伝子に(即ち分子間で)作用する過程を指す。トランス作用エレメントは、通常、遺伝子を含むDNA配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において使用されるタンパク質(又はマイクロRNA又は他の拡散性分子)をコードする。トランス作用遺伝子は標的遺伝子と同じ染色体上にあってもよいが、活性は中間タンパク質又はそれをコードするRNAを介する。ドミナントネガティブを用いた遺伝子の不活性化に、概してトランス作用エレメントが関わる。シス調節又はシス作用という用語は、タンパク質又はRNAをコードしない作用を意味する;遺伝子不活性化との関連において、これは概して、遺伝子のコード部分、又は機能性遺伝子の発現に必要なプロモーター及び/又はオペレーターの不活性化を意味する。
動物は、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又は公知の種々のベクターを含む他の遺伝子操作ツールを使用して改変され得る。かかるツールによって作製された遺伝子改変には、遺伝子の不活性化が含まれ得る。遺伝子の不活性化という用語は、機能性遺伝子産物の形成を阻止することを指す。遺伝子産物は、それがその正常な(野生型の)機能を果たす場合に限り機能性である。動物を遺伝的に改変する材料及び方法は、2012年2月24日に出願された米国特許出願第13/404,662号明細書、2012年5月9日に出願された同第13/467,588号明細書、及び2009年11月10日に出願された同第12/622,886号明細書(これらは本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される;矛盾が生じた場合、本明細書が優先する)にさらに詳述される。トランス作用性という用語は、異なる分子から標的遺伝子に(即ち分子間で)作用する過程を指す。トランス作用エレメントは、通常、遺伝子を含むDNA配列である。この遺伝子は、標的遺伝子の調節において使用されるタンパク質(又はマイクロRNA又は他の拡散性分子)をコードする。トランス作用遺伝子は標的遺伝子と同じ染色体上にあってもよいが、活性は中間タンパク質又はそれをコードするRNAを介する。ドミナントネガティブを用いた遺伝子の不活性化に、概してトランス作用エレメントが関わる。シス調節又はシス作用という用語は、タンパク質又はRNAをコードしない作用を意味する;遺伝子不活性化との関連において、これは概して、遺伝子のコード部分、又は機能性遺伝子の発現に必要なプロモーター及び/又はオペレーターの不活性化を意味する。
当該技術分野において公知の様々な技法を用いて遺伝子を不活性化することでノックアウト動物を作製し及び/又は動物に核酸コンストラクトを導入することにより、ファウンダー動物を産生して動物系統を作製することができ、ここでノックアウト又は核酸コンストラクトはゲノムに組み込まれる。かかる技法には、限定なしに、前核マイクロインジェクション(米国特許第4,873,191号明細書)、生殖系列へのレトロウイルス媒介遺伝子導入(Van der Puttenら(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82,6148−1652)、胚性幹細胞への遺伝子ターゲティング(Thompsonら(1989)Cell 56,313−321)、胚の電気穿孔(Lo(1983)Mol.Cell.Biol.3,1803−1814)、精子媒介遺伝子導入(Lavitranoら(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 99,14230−14235;Lavitranoら(2006)Reprod.Fert.Develop.18,19−23)、及び体細胞、例えば卵丘若しくは乳腺細胞、又は成体、胎仔、若しくは胚性幹細胞のインビトロ形質転換と、続く核移植(Wilmutら(1997)Nature 385,810−813;及びWakayamaら(1998)Nature 394,369−374)が含まれる。前核マイクロインジェクション、精子媒介遺伝子導入、及び体細胞核移植が特に有用な技術である。ゲノム改変されている動物は、その生殖系列細胞を含め、その細胞の全てが遺伝子改変を有する動物である。その遺伝子改変がモザイクである動物を産生する方法が用いられる場合、動物は同系交配されてもよく、ゲノム改変されている子孫が選択され得る。例えば、その細胞が胚盤胞期に改変される場合、モザイク動物の作製にクローニングが用いられてもよく、又はゲノム改変は単一の細胞が改変されるときに起こり得る。改変されており、従って性的に成熟しない動物は、用いられる具体的な手法に応じて、改変に関してホモ接合又はヘテロ接合であってよい。特定の遺伝子がノックアウト改変により不活性化される場合、通常はホモ接合が必要となり得る。特定の遺伝子がRNA干渉又はドミナントネガティブ戦略により不活性化される場合、ヘテロ接合が適していることが多い。
典型的には、胚/接合子マイクロインジェクションでは、核酸コンストラクト又はmRNAが受精卵に導入される;精子頭部及び卵からの遺伝物質を含む前核が原形質内に見えることに伴い、1又は2細胞受精卵が使用される。前核期受精卵はインビトロ又はインビボで得る(即ち、ドナー動物の卵管から外科的に回収される)ことができる。インビトロ受精卵は、以下のとおり産生することができる。例えば、屠殺場でブタ卵巣を収集し、輸送中は22〜28℃に維持することができる。卵胞吸引のため卵巣を洗浄して単離することができ、4〜8mmの範囲の卵胞を、18ゲージ針を使用して真空下で50mLコニカル遠心管に吸引することができる。卵胞液及び吸引された卵母細胞を、市販のTL−HEPES(Minitube,Verona,WI)を含むプレフィルターに通してリンスすることができる。卵丘塊に取り囲まれた卵母細胞を選択し、0.1mg/mLシステイン、10ng/mL上皮成長因子、10%ブタ卵胞液、50μM 2−メルカプトエタノール、0.5mg/ml cAMP、各10IU/mLの妊馬血清性ゴナドトロピン(PMSG)及びヒト絨毛性ゴナドトロピン(hCG)を補足したTCM−199卵母細胞成熟培地(Minitube,Verona,WI)に、38.7℃及び5%CO2の加湿空気中約22時間置くことができる。続いて、卵母細胞を新鮮なTCM−199成熟培地に移し(この培地はcAMP、PMSG又はhCGを含まない)、さらに22時間インキュベートすることができる。0.1%ヒアルロニダーゼで1分間ボルテックスすることにより、成熟卵母細胞をその卵丘細胞から剥がし取ることができる。
ブタについては、成熟卵母細胞は、Minitube 5ウェル受精用ディッシュ中の500μl Minitube PORCPRO IVF培地システム(Minitube,Verona,WI)において受精させることができる。インビトロ受精(IVF)に備え、収集したばかりの又は凍結された雄ブタ精液を洗浄し、4×105精子となるようにPORCPRO IVF培地に再懸濁することができる。コンピュータ支援精液分析(SPERMVISION,Minitube,Verona,WI)によって精子濃度を分析することができる。最終的なインビトロ授精は、雄ブタに応じて、10μl容量において約40運動精子/卵母細胞の終濃度で実施することができる。全ての受精卵母細胞を5.0%CO2雰囲気下38.7℃で6時間インキュベートする。授精6時間後、予定接合子をNCSU−23中で2回洗浄し、0.5mLの同じ培地中に移すことができる。このシステムは、10〜30%の多精子受精率で、ほとんどの雄ブタにわたり常に20〜30%の胚盤胞を産生することができる。
線状化した核酸コンストラクト又はmRNAを前核の1つ又は細胞質に注入することができる。次に、注入された卵をレシピエント雌に(例えばレシピエント雌の卵管内に)移植し、そのレシピエント雌において発育させてトランスジェニック動物を産生することができる。詳細には、インビトロ受精胚を15,000×gで5分間遠心して脂質を沈降させ、前核の可視化を可能にすることができる。胚は、Eppendorf FEMTOJET注入器を使用して注入することができ、胚盤胞形成まで培養することができる。胚分割及び胚盤胞形成速度及び質を記録することができる。
胚は、非同期レシピエントの子宮に外科的に移植することができる。典型的には、100〜200個(例えば150〜200個)の胚を、5.5インチTOMCAT(登録商標)カテーテルを使用して卵管の膨大部−峡部接合部に置くことができる。手術後、妊娠のリアルタイム超音波検査を実施することができる。
体細胞核移植では、上記に記載する核酸コンストラクトを含むトランスジェニック偶蹄類細胞(例えば、トランスジェニックブタ細胞又はウシ細胞)、例えば、胚割球、胎仔線維芽細胞、成体耳線維芽細胞、又は顆粒膜細胞を除核卵母細胞に導入し、複合細胞を樹立することができる。卵母細胞は、極体近傍で部分的に透明帯を切開し、次に切開範囲で細胞質を押し出すことにより除核することができる。典型的には、鋭く面取りされた先端を有する注入ピペットを使用して、第2減数分裂で停止した除核卵母細胞にトランスジェニック細胞を注入する。ある種の慣例では、第2減数分裂で停止した卵母細胞が卵と呼ばれる。ブタ又はウシ胚を発生させた後(例えば、卵母細胞を融合して活性化させることによる)、活性化から約20〜24時間後、胚をレシピエント雌の卵管に移植する。例えば、Cibelliら(1998)Science 280,1256−1258及び米国特許第6,548,741号明細書を参照のこと。ブタについては、レシピエント雌は、胚移植後約20〜21日で妊娠を検査することができる。
標準的な繁殖技法を用いることにより、最初のヘテロ接合体ファウンダー動物から、外来核酸に関してホモ接合の動物を作出することができる。しかしながらホモ接合である必要はないこともある。本明細書に記載されるトランスジェニックブタを、目的の他のブタと繁殖させることができる。
一部の実施形態では、目的の核酸及び選択可能なマーカーを別個のトランスポゾンに提供し、胚又は細胞のいずれかに等量ではなしに提供することができ、ここで選択可能なマーカーを含むトランスポゾンの量は、目的の核酸を含むトランスポゾンよりはるかに過剰(5〜10倍過剰)である。目的の核酸を発現するトランスジェニック細胞又は動物は、選択可能なマーカーの存在及び発現に基づき単離することができる。トランスポゾンは正確な且つ関係付けのない形でゲノムに組み込まれるため(独立した転移イベント)、目的の核酸と選択可能なマーカーとが遺伝的に関係付けられることはなく、標準的な繁殖を通じた遺伝的分離によって容易に分けることができる。従って、公衆安全の観点からある種懸念される問題である、後続の世代における選択可能なマーカーの保持に制約されないトランスジェニック動物を産生することができる。
トランスジェニック動物の生成後、標準的な技法を用いて外来核酸の発現を評価することができる。初期スクリーニングは、サザンブロット解析によってコンストラクトの組込みが起こったかどうかを決定することにより達成できる。サザン解析の説明は、Sambrookら,1989,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Press,Plainview;NYの第9.37〜9.52節を参照のこと。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技法もまた初期スクリーニングに用いることができる。PCRは、標的核酸を増幅する手法又は技法を指す。一般には、目的の領域の末端又はその外側からの配列情報を用いることにより、増幅しようとする鋳型の逆ストランドと同一の又は類似した配列のオリゴヌクレオチドプライマーが設計される。PCRを使用すると、全ゲノムDNA又は全細胞RNAの配列を含め、DNA並びにRNAの特定の配列を増幅することができる。プライマーは、典型的には14〜40ヌクレオチド長であるが、10ヌクレオチド長から数百ヌクレオチド長の範囲に及び得る。PCRについては、例えばPCR Primer:A Laboratory Manual,ed.Dieffenbach and Dveksler,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1995に記載される。核酸はまた、リガーゼ連鎖反応、鎖置換増幅、自己持続配列複製法、又は核酸配列ベースの増幅によって増幅することもできる。例えば、Lewis(1992)Genetic Engineering News 12,1;Guatelliら(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87:1874;及びWeiss(1991)Science 254:1292を参照のこと。胚盤胞期には、PCR、サザンハイブリダイゼーション及びスプリンカレットPCRによる分析のため胚を個々に処理することができる(例えば、DupuyらProc Natl Acad Sci USA(2002)99:4495を参照のこと)。
トランスジェニックブタの組織においてポリペプチドをコードする核酸配列の発現は、例えば、動物から採取した組織試料のノーザンブロット解析、インサイチュハイブリダイゼーション分析、ウエスタン分析、酵素結合免疫吸着アッセイなどのイムノアッセイ、及び逆転写酵素PCR(RT−PCR)を含む技法を用いて評価することができる。
干渉性RNA
様々な干渉性RNA(RNAi)が公知である。二本鎖RNA(dsRNA)は相同遺伝子転写産物の配列特異的分解を誘導する。RNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)はdsRNAを小型の21〜23ヌクレオチドの低分子干渉RNA(siRNA)に代謝する。RISCは二本鎖RNアーゼ(dsRNアーゼ、例えばダイサー)及びssRNアーゼ(例えば、アルゴノート2又はAgo2)を含む。RISCはアンチセンス鎖をガイドとして利用して切断可能な標的を見つけ出す。siRNA及びマイクロRNA(miRNA)の両方が公知である。遺伝子改変動物において遺伝子を不活性化する方法は、標的遺伝子及び/又は核酸の発現が低下するような標的遺伝子及び/又は核酸に対するRNA干渉を誘導することを含む。
様々な干渉性RNA(RNAi)が公知である。二本鎖RNA(dsRNA)は相同遺伝子転写産物の配列特異的分解を誘導する。RNA誘導性サイレンシング複合体(RISC)はdsRNAを小型の21〜23ヌクレオチドの低分子干渉RNA(siRNA)に代謝する。RISCは二本鎖RNアーゼ(dsRNアーゼ、例えばダイサー)及びssRNアーゼ(例えば、アルゴノート2又はAgo2)を含む。RISCはアンチセンス鎖をガイドとして利用して切断可能な標的を見つけ出す。siRNA及びマイクロRNA(miRNA)の両方が公知である。遺伝子改変動物において遺伝子を不活性化する方法は、標的遺伝子及び/又は核酸の発現が低下するような標的遺伝子及び/又は核酸に対するRNA干渉を誘導することを含む。
例えば、外来核酸配列は、ポリペプチドをコードする核酸に対してRNA干渉を誘導することができる。例えば、標的DNAと相同な二本鎖低分子干渉RNA(siRNA)又は低分子ヘアピンRNA(shRNA)を使用して当該DNAの発現を低下させることができる。siRNA用のコンストラクトは、例えば、Fireら(1998)Nature 391:806;Romano and Masino(1992)Mol.Microbiol.6:3343;Cogoniら(1996)EMBO J.15:3153;Cogoni and Masino(1999)Nature 399:166;Misquitta and Paterson(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96:1451;及びKennerdell and Carthew(1998)Cell 95:1017に記載されるとおり作製することができる。shRNA用のコンストラクトは、McIntyre and Fanning(2006)BMC Biotechnology 6:1によって記載されるとおり作製することができる。一般に、shRNAは相補領域を含む一本鎖RNA分子として転写され、この相補領域がアニールして短鎖ヘアピンを形成し得る。
特定の遺伝子を標的とする単一の個々の機能性siRNA又はmiRNAが見つかる可能性は高い。例えば、siRNAの特定の配列の予測可能性は約50%であるが、多くの干渉性RNAを高い信頼性で作製することができ、そのうち少なくとも1つが有効であり得る。
実施形態は、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を標的とするRNAiを発現するインビトロ細胞、インビボ細胞、及び遺伝子改変動物、例えば家畜動物を含む。ある実施形態は、Gpr54、Kiss1、及びGnRH1からなる群における遺伝子を標的とするRNAiである。RNAiは、例えば、siRNA、shRNA、dsRNA、RISC及びmiRNAからなる群から選択され得る。
誘導性システム
誘導性システムを使用して性成熟遺伝子の発現を制御し得る。遺伝子の発現の時空間的制御を可能にする様々な誘導性システムが公知である。いくつかは、トランスジェニック動物においてインビボで機能性であることが分かっている。
誘導性システムを使用して性成熟遺伝子の発現を制御し得る。遺伝子の発現の時空間的制御を可能にする様々な誘導性システムが公知である。いくつかは、トランスジェニック動物においてインビボで機能性であることが分かっている。
誘導性システムの例は、核酸の転写調節に使用することのできるテトラサイクリン(tet)−オンプロモーターシステムである。このシステムでは、変異Tetリプレッサー(TetR)が単純ヘルペスウイルスVP16トランス活性化因子タンパク質の活性化ドメインと融合してテトラサイクリン制御性転写活性化因子(tTA)が作り出され、これはtet又はドキシサイクリン(dox)によって調節される。抗生物質の非存在下では転写は最小限である一方、tet又はdoxの存在下では転写が誘導される。代替的な誘導性システムとしては、エクジソン又はラパマイシンシステムが挙げられる。エクジソンは、エクジソン受容体とウルトラスピラクル遺伝子(USP)の産物とのヘテロ二量体により産生が制御される昆虫脱皮ホルモンである。発現は、エクジソン又はムリステロンAなどのエクジソン類似体で処理することにより誘導される。誘導性システムを惹起するために動物に投与される薬剤は、誘導剤と称される。
より一般的に用いられている誘導性システムの中には、テトラサイクリン誘導性システム及びCre/loxPリコンビナーゼシステム(構成的或いは誘導性)がある。テトラサイクリン誘導性システムには、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子(tTA)/逆tTA(rtTA)が関わる。これらのシステムをインビボで使用する方法には、2つの系統の遺伝子改変動物を作成することが関わる。一つの動物系統は、選択されたプロモーターの制御下で活性化因子(tTA、rtTA、又はCreリコンビナーゼ)を発現する。もう一組のトランスジェニック動物はアクセプターを発現し、ここでは目的の遺伝子(又は改変しようとする遺伝子)の発現がtTA/rtTAトランス活性化因子の標的配列の制御下にある(又はloxP配列が隣接している)。2つのマウス系を交配させると、遺伝子発現の制御が提供される。
テトラサイクリン依存性調節システム(tetシステム)は、2つの成分、即ちテトラサイクリン制御性トランス活性化因子(tTA又はrtTA)及び下流cDNAの発現を制御するtTA/rtTA依存性プロモーターにテトラサイクリン依存的に頼る。テトラサイクリン又はその誘導体(ドキシサイクリンなど)が存在しない場合、tTAはtetO配列に結合し、tTA依存性プロモーターの転写活性化を可能にする。しかしながら、ドキシサイクリンの存在下では、tTAはその標的と相互作用することができず、転写は起こらない。tTAを使用するtetシステムは、テトラサイクリン又はドキシサイクリンが転写下方制御を可能にするため、tet−OFFと呼ばれる。テトラサイクリン又はその誘導体の投与により、インビボで導入遺伝子発現を時間的に制御することが可能になる。rtTAは、ドキシサイクリンの非存在下では機能しないが、トランス活性化にリガンドの存在を必要とするtTAの変種である。従ってこのtetシステムはtet−ONと呼ばれる。tetシステムは、例えば、レポーター遺伝子、癌遺伝子、又はシグナル伝達カスケードに関与するタンパク質をコードするいくつかの導入遺伝子の誘導性発現にインビボで使用されている。
Cre/loxシステムはCreリコンビナーゼを使用し、Creリコンビナーゼは、2つの個別のCre認識配列、即ちloxP部位の間で入れ換わることによる部位特異的組換えを触媒する。2つのloxP配列の間に導入されたDNA配列(フロックスされたDNAと称される)がCre媒介組換えにより切り出される。空間的制御(組織特異的又は細胞特異的プロモーターによる)又は時間的制御(誘導性システムによる)のいずれかを使用したトランスジェニック動物におけるCre発現の制御により、2つのloxP部位間にあるDNAの切り出しの制御がもたらされる。一つの応用は、条件的遺伝子不活性化(条件的ノックアウト)である。別の応用はタンパク質過剰発現であり、ここではフロックスされた終止コドンがプロモーター配列と目的のDNAとの間に挿入される。遺伝子改変動物はCreが発現してフロックスされた終止コドンの切り出しが生じるまで導入遺伝子を発現しない。このシステムは組織特異的発癌及びBリンパ球における制御された抗原(antigene)受容体発現に応用されている。誘導性Creリコンビナーゼもまた開発されている。誘導性Creリコンビナーゼは外因性リガンドの投与によってのみ活性化される。誘導性Creリコンビナーゼは、元のCreリコンビナーゼと特異的リガンド結合ドメインとを含む融合タンパク質である。Creリコンビナーゼの機能的活性は、融合タンパク質においてこの特異的ドメインに結合することが可能な外部リガンドに依存する。
実施形態は、誘導性システムの制御下にある性成熟選択的神経内分泌遺伝子を含むインビトロ細胞、インビボ細胞、及び遺伝子改変動物、例えば家畜動物を含む。動物の遺伝子改変はゲノム的又はモザイク的であり得る。ある実施形態は、誘導性システムの制御下にあるGpr54、Kiss1、及びGnRH1からなる群の中の遺伝子である。誘導性システムは、例えば、Tet−On、Tet−Off、Cre−lox、及びHif1αからなる群から選択され得る。
ドミナントネガティブ
従って遺伝子は除去又はRNAi抑制により不活性化されるのみならず、ドミナントネガティブ表現型の作成によっても不活性化され得る。ドミナントネガティブバージョンの遺伝子産物は、野生型表現型の1つ以上の機能を欠いており、同じ細胞で発現する正常な遺伝子産物の機能を優勢に妨げ、その結果、ドミナントネガティブ表現型が、通常遺伝子の正常な機能によって誘発されると予想される生理学的結果を有効に低下させ又は不活性化させる。例えば、多くのタンパク質の機能が他のタンパク質とのその相互作用を必要とする。かかる相互作用は多くの場合に、適切なタンパク質局在化、リガンド結合、タンパク質活性化、又は上流シグナルの下流伝達に必要とされる。多タンパク質複合体の成分の1つ以上の突然変異が、一つのこれらのプロセスを妨げ得る。従って、突然変異体形態のタンパク質の発現は、正常な遺伝子産物の存在下であってもタンパク質の機能を妨げ、ポイズン「ピル」又はギヤボックスに投げ込まれる「モンキーレンチ」として働き得る。GPCRは7回膜貫通型(7TM)ドメイン受容体であり、これは、複数のステップ及びストリンジェントな品質管理システムで正しいGPCRの折り畳み及びターゲティングを確実にする厳密に調節された機構の中、生合成経路を通じて細胞表面に輸送される。GPCRとアクセサリータンパク質又はシャペロンとの会合が、小胞体(ER)及びゴルジを通じた順方向の輸送に重要なステップである。GPCRの生涯はERで始まり、そこでGPCRが合成され、折り畳まれ、及び構築される。細胞表面に移動する間にGPCRは翻訳後修飾を受けて成熟した状態に達する。ERは細胞の品質管理機構の一部を形成し、ここでは機能的に不活性な突然変異体GPCRが細胞表面での発現を阻止され得る。
従って遺伝子は除去又はRNAi抑制により不活性化されるのみならず、ドミナントネガティブ表現型の作成によっても不活性化され得る。ドミナントネガティブバージョンの遺伝子産物は、野生型表現型の1つ以上の機能を欠いており、同じ細胞で発現する正常な遺伝子産物の機能を優勢に妨げ、その結果、ドミナントネガティブ表現型が、通常遺伝子の正常な機能によって誘発されると予想される生理学的結果を有効に低下させ又は不活性化させる。例えば、多くのタンパク質の機能が他のタンパク質とのその相互作用を必要とする。かかる相互作用は多くの場合に、適切なタンパク質局在化、リガンド結合、タンパク質活性化、又は上流シグナルの下流伝達に必要とされる。多タンパク質複合体の成分の1つ以上の突然変異が、一つのこれらのプロセスを妨げ得る。従って、突然変異体形態のタンパク質の発現は、正常な遺伝子産物の存在下であってもタンパク質の機能を妨げ、ポイズン「ピル」又はギヤボックスに投げ込まれる「モンキーレンチ」として働き得る。GPCRは7回膜貫通型(7TM)ドメイン受容体であり、これは、複数のステップ及びストリンジェントな品質管理システムで正しいGPCRの折り畳み及びターゲティングを確実にする厳密に調節された機構の中、生合成経路を通じて細胞表面に輸送される。GPCRとアクセサリータンパク質又はシャペロンとの会合が、小胞体(ER)及びゴルジを通じた順方向の輸送に重要なステップである。GPCRの生涯はERで始まり、そこでGPCRが合成され、折り畳まれ、及び構築される。細胞表面に移動する間にGPCRは翻訳後修飾を受けて成熟した状態に達する。ERは細胞の品質管理機構の一部を形成し、ここでは機能的に不活性な突然変異体GPCRが細胞表面での発現を阻止され得る。
X連鎖性腎性尿崩症、家族性低カルシウム尿性高カルシウム血症、家族性グルココルチコイド欠損症又は低ゴナドトロピン性(hypogonadodotropic)性腺機能低下症などの病態は、ER又はゴルジ区画における細胞内貯留をもたらすGPCRの突然変異と関連付けられている。多くの場合に、細胞表面膜発現の欠損は、誤って折り畳まれた受容体がその野生型対応物に及ぼすドミナントネガティブ(DN)効果による、受容体の細胞内会合に起因する;このDN効果は正常な受容体の細胞膜発現を制限し、又はさらには抑止し、ひいては機能喪失型疾患を引き起こし得る(Ulloa−Aguirreら,2004a)。
GnRHRにおける機能喪失型突然変異は、部分的又は完全な低ゴナドトロピン性性腺機能低下症(HH)、GnRHに対する下垂体性腺刺激ホルモン産生細胞の応答不全(これは低下した又は無拍動性のゴナドトロピン放出をもたらす)及び生殖障害を引き起こし得る。受容体の誤った折り畳み及び結果として生じるゴナドトロピンホルモン放出ホルモン受容体(GnRHR)の誤った経路輸送をHH患者に引き起こす多数の突然変異が記載されている(Janovickら,2002;Leanos−Mirandaら,2002;Ulloa−Aguirreら,2004b)。これらの突然変異の多くはGnRHR機能のドミナントネガティブとして働く(Pask AJ et al,2005 Mol Endocrinol;Brothers SP et al,2004 Mol Endocrinol;Leanos−Miranda A et al,2003 J Clin Endocrinol Metab)。従って、DN GnRHR遺伝子の意図的な発現は、トランスジェニック動物に生殖不能を生じさせると予想される。
考察したとおり、GPR54は、春機発動期を惹起する生殖カスケードのゲートキーパーである。種々の動物試験から、キスペプチンと呼ばれる内因性ペプチドリガンドによるGPR54の会合が視床下部ニューロンからのゴナドトロピン放出ホルモン放出を強力に刺激し、視床下部−下垂体−性腺軸を活性化することが実証されている。さらに、特発性低ゴナドトロピン性性腺機能低下症のヒト病態を表現型模写するGPR54 KOマウスを特徴付けることにより、生殖機能に対するGPR54の重要な役割が確認された。現在GPCRは、発現、輸送、リガンド結合、及びシグナル伝達の正確な時空間的調節を付与するGPCR相互作用タンパク質(GIP)で構成される多タンパク質複合体として存在すると認識されている。GPR54はこれらのGIPと特異的に相互作用することが分かっている。トランケート型GPCRスプライス変異体の大部分はドミナントネガティブ突然変異として働くため(Wise 2012,J Mol Signal)、1つ以上の膜貫通ドメインが欠損したGPR54の発現は内因性GPR54のプロセシング/輸送を破壊し、ひいてはその機能を妨げるものと予想される。従って、DN GPR54遺伝子の意図的な発現は、トランスジェニック動物において生殖不能を生じさせるものと予想される。
ファウンダー動物、動物系統、形質、及び繁殖
ファウンダー動物は、クローニング及び本明細書に記載される他の方法により産生され得る。ファウンダーは、接合子又は初代細胞がホモ接合性の改変を受ける場合のように、遺伝子改変に関してホモ接合であり得る。同様に、ヘテロ接合のファウンダーもまた作製され得る。ファウンダーはゲノム改変されていてもよく、即ち、そのゲノムにおける細胞の全てが改変を受けていてもよい。ファウンダーは、ベクターが胚における複数の細胞のうちの1つに、典型的には胚盤胞期に導入されたときに起こり得るように、改変に関してモザイクであってもよい。モザイク動物の子孫を試験することにより、ゲノム改変されている子孫を同定し得る。有性生殖することができる、又は生殖補助技術により生殖できる動物であって、異種又はホモ接合体の子孫が一貫して改変を発現する動物のプールが作り出されたとき、動物系統が樹立される。
ファウンダー動物は、クローニング及び本明細書に記載される他の方法により産生され得る。ファウンダーは、接合子又は初代細胞がホモ接合性の改変を受ける場合のように、遺伝子改変に関してホモ接合であり得る。同様に、ヘテロ接合のファウンダーもまた作製され得る。ファウンダーはゲノム改変されていてもよく、即ち、そのゲノムにおける細胞の全てが改変を受けていてもよい。ファウンダーは、ベクターが胚における複数の細胞のうちの1つに、典型的には胚盤胞期に導入されたときに起こり得るように、改変に関してモザイクであってもよい。モザイク動物の子孫を試験することにより、ゲノム改変されている子孫を同定し得る。有性生殖することができる、又は生殖補助技術により生殖できる動物であって、異種又はホモ接合体の子孫が一貫して改変を発現する動物のプールが作り出されたとき、動物系統が樹立される。
家畜においては、多くの対立遺伝子が、生産形質、体型形質、作業性形質、及び他の機能的形質などの様々な形質に関係付けられることが知られている。当業者はこれらの形質を観察し及び定量化することに慣れている、例えば、Visscherら,Livestock Production Science,40(1994)123−137、米国特許第7,709,206号明細書、米国特許出願公開第2001/0016315号明細書、米国特許出願公開第2011/0023140号明細書、及び米国特許出願公開第2005/0153317号明細書。動物系統は、生産形質、体型形質、作業性形質、繁殖形質、母性形質、及び耐病性形質からなる群の形質から選択される形質を含み得る。さらなる形質には、組換え遺伝子産物の発現が含まれる。
所望の1つ又は複数の形質を有する動物を改変してその性成熟を阻止し得る。動物は成熟するまでは生殖不能であるため、動物の伝播を制御する手段として性的成熟を調節することが可能である。従って、1つ以上の形質を有するように繁殖又は改変されている動物を、被提供者がその動物を繁殖させるリスクを減じて被提供者に提供し、その形質の価値を独占することができる。本発明の実施形態は、不活性化された性成熟遺伝子を含む改変によって動物のゲノムを遺伝的に改変することを含み、ここで野生型動物におけるその性成熟遺伝子は、性成熟選択的因子を発現する。実施形態は、化合物を投与することにより、遺伝子発現の喪失に起因する欠損を修復して動物における性成熟を誘導するように動物を処理することを含む。
性的成熟を誘導するために化合物の投与を必要とする動物の繁殖は、有利には処理施設で達成され得る。処理施設は、一貫した動物を効率的に産生するため十分に管理されるストックに対し標準化されたプロトコルを実現し得る。動物子孫は複数の飼育場所に供給され得る。従って農場及び農家(牧場及び牧場主を含む用語)は、特定の範囲の年齢及び/又は体重及び/又は形質を有する所望の数の子孫を注文し、所望の時期及び/又は場所に届けてもらうことができる。被提供者、例えば農家は、次にその動物を飼育し、所望に応じて市場に出すことができる。
実施形態は、不活性化された性成熟選択的神経内分泌遺伝子を有する遺伝子改変家畜動物を(例えば、1つ以上の場所に、複数の農場に)供給することを含む。実施形態は、約1日齢〜約180日齢の動物を含む。動物は1つ以上の形質(例えば所望の形質又は高価値の形質又は新規形質又は組換え形質を発現するもの)を有し得る。実施形態は、前記動物を提供すること及び/又は前記動物を繁殖させることをさらに含む。
リコンビナーゼ
本発明の実施形態は、1つ又は複数のTALEN又はジンクフィンガーヌクレアーゼをリコンビナーゼ又はDNA組換えに関連する他のDNA結合タンパク質と共に投与することを含むリコンビナーゼは核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞DNAを探してその配列と実質的に相同なDNA配列を見つけ出す。TALEN−リコンビナーゼ実施形態の実施形態は、リコンビナーゼを、HDR鋳型として働く核酸配列と組み合わせることを含む。HDR鋳型配列は、TALEN/TALEN対による切断の標的となる部位と実質的な相同性を有する。本明細書に記載されるとおり、HDR鋳型は、対立遺伝子の配置、インデルの作成、外来性DNAの挿入によるか又は他の変化によって、天然DNAに変化をもたらす。TALENは細胞又は胚に、本明細書に記載される方法によってタンパク質、mRNAとして置かれるか、又はベクターを使用することにより置かれる。リコンビナーゼはHDR鋳型と組み合わさってフィラメントを形成し、細胞内に置かれる。リコンビナーゼ及び/又はリコンビナーゼと組み合わされるHDR鋳型は、細胞又は胚に、タンパク質、mRNAとして置かれても、又はリコンビナーゼをコードするベクターで置かれてもよい。米国特許出願公開第2011/0059160号明細書(米国特許出願第12/869,232号明細書)の開示が、本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される;矛盾が生じた場合、本明細書が優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞において、2つの比較的長いDNA鎖の間にある比較的短いDNA断片の接合を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼには、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、RecA、RAD51、Cre、及びFLPが含まれる。Creリコンビナーゼは、loxP部位間のDNAの部位特異的組換えを触媒するP1バクテリオファージ由来のI型トポイソメラーゼである。Hinリコンビナーゼは、細菌のサルモネラ属(Salmonella)に見出される198アミノ酸から構成される21kDのタンパク質である。Hinは、DNA切断及び組換えの惹起を活性部位セリンに頼るDNAインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。RAD51はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、DNA二本鎖切断の修復を助けるRAD51タンパク質ファミリーのメンバーである。RAD51ファミリーメンバーは、細菌RecA及び酵母Rad51遺伝子と相同である。Creリコンビナーゼは、loxP部位が隣接する特定の配列を欠失させるため実験で使用される酵素である。FLPは、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の2μプラスミドから誘導されるフリッパーゼ組換え酵素(FLP又はFlp)を指す。
本発明の実施形態は、1つ又は複数のTALEN又はジンクフィンガーヌクレアーゼをリコンビナーゼ又はDNA組換えに関連する他のDNA結合タンパク質と共に投与することを含むリコンビナーゼは核酸断片とフィラメントを形成し、事実上、細胞DNAを探してその配列と実質的に相同なDNA配列を見つけ出す。TALEN−リコンビナーゼ実施形態の実施形態は、リコンビナーゼを、HDR鋳型として働く核酸配列と組み合わせることを含む。HDR鋳型配列は、TALEN/TALEN対による切断の標的となる部位と実質的な相同性を有する。本明細書に記載されるとおり、HDR鋳型は、対立遺伝子の配置、インデルの作成、外来性DNAの挿入によるか又は他の変化によって、天然DNAに変化をもたらす。TALENは細胞又は胚に、本明細書に記載される方法によってタンパク質、mRNAとして置かれるか、又はベクターを使用することにより置かれる。リコンビナーゼはHDR鋳型と組み合わさってフィラメントを形成し、細胞内に置かれる。リコンビナーゼ及び/又はリコンビナーゼと組み合わされるHDR鋳型は、細胞又は胚に、タンパク質、mRNAとして置かれても、又はリコンビナーゼをコードするベクターで置かれてもよい。米国特許出願公開第2011/0059160号明細書(米国特許出願第12/869,232号明細書)の開示が、本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される;矛盾が生じた場合、本明細書が優先する。リコンビナーゼという用語は、細胞において、2つの比較的長いDNA鎖の間にある比較的短いDNA断片の接合を酵素的に触媒する遺伝子組換え酵素を指す。リコンビナーゼには、Creリコンビナーゼ、Hinリコンビナーゼ、RecA、RAD51、Cre、及びFLPが含まれる。Creリコンビナーゼは、loxP部位間のDNAの部位特異的組換えを触媒するP1バクテリオファージ由来のI型トポイソメラーゼである。Hinリコンビナーゼは、細菌のサルモネラ属(Salmonella)に見出される198アミノ酸から構成される21kDのタンパク質である。Hinは、DNA切断及び組換えの惹起を活性部位セリンに頼るDNAインベルターゼのセリンリコンビナーゼファミリーに属する。RAD51はヒト遺伝子である。この遺伝子によりコードされるタンパク質は、DNA二本鎖切断の修復を助けるRAD51タンパク質ファミリーのメンバーである。RAD51ファミリーメンバーは、細菌RecA及び酵母Rad51遺伝子と相同である。Creリコンビナーゼは、loxP部位が隣接する特定の配列を欠失させるため実験で使用される酵素である。FLPは、パン酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)の2μプラスミドから誘導されるフリッパーゼ組換え酵素(FLP又はFlp)を指す。
RecAは、相同組換えによる二本鎖切断の修復中に鎖交換を触媒するそのリコンビナーゼ活性で知られている(McGrew,2003)Raddingら,1981;Seitzら,1998)。RecAはまた、例えばLexA及びλリプレッサータンパク質のタンパク質分解を触媒し、且つDNA依存性ATPアーゼ活性を有することも示されている。電離放射線又は他の何らかの傷害により二本鎖切断が起こった後、エキソヌクレアーゼがDNA末端5’から3’にチューバックし、それによりDNAの一方の鎖が露出する(McGrew,2003;Cox,1999)。一本鎖DNAは一本鎖結合タンパク質(SSB)により安定した状態になる。SSBの結合後、RecAが一本鎖(ss)DNAを結合し、らせん状核タンパク質フィラメント(フィラメント又はシナプス前フィラメントと称される)を形成する。DNA修復中、RecAの相同性検索機能がフィラメントを相同DNAに向かわせ、相同塩基対合及び鎖交換を触媒する。この結果、DNAヘテロ二重鎖が形成される。鎖の侵入後、DNAポリメラーゼが相同DNA鋳型に基づきssDNAを伸長させてDNA切断を修復し、クロスオーバー構造又はホリデイジャンクションが形成される。RecAはまた、クロスオーバー構造の移動に関与する運動機能も示す(Campbell and Davis,1999)。
リコンビナーゼ活性は複数の異なる機能を含む。例えば、リコンビナーゼ活性を有するポリペプチド配列は、一本鎖DNAに非配列特異的に結合して核タンパク質フィラメントを形成することができる。かかるリコンビナーゼ結合核タンパク質フィラメントは、二本鎖DNA分子と非配列特異的な形で相互作用することができ、二本鎖分子においてフィラメントの配列と相同な配列を探し、かかる配列が見つかると、その二本鎖分子の一方の鎖を移動させてフィラメント内の配列と二本鎖分子の一方の鎖の相補配列との間の塩基対合を可能にする。かかるステップは、まとめて「シナプシス」と称される。
RecA及びRecA様タンパク質(多くの真核生物種でRad51と呼ばれる)は、様々な真核細胞系で遺伝子ターゲティング及び相同組換えを刺激することに関して研究されている。タバコ細胞では、核局在化シグナル(NLS)を含む細菌RecAの発現が相同組換え及び体細胞染色体内組換え(相同染色体間の組換え)によるマイトマイシンC誘発DNA損傷の修復を3〜10倍増加させる(Reiss,1996)。タバコにおけるNLSRecAの発現はまた、姉妹染色分体交換も野生型レベルと比べて2.4倍刺激することができる(Reiss,2000)。体細胞哺乳類細胞では、NLSRecAの過剰発現が相同組換えによる遺伝子ターゲティングを10倍刺激する(Shcherbakova,2000)。しかしながら、ヒト細胞では、RecAのヒト相同体hRAD51の過剰発現は、抗生物質選択下で組換えを野生型レベルと比べて2〜3倍刺激するに過ぎない(Yanez,1999)。ゼブラフィッシュでは、ssDNA−RecAフィラメントを直接注入することにより突然変異体形態の高感度緑色蛍光タンパク質(EGFP)が低頻度で修正された(Cui,2003)。Rad51エピスタシス群のメンバーであるRad52もまた、突然変異オリゴヌクレオチドを使用したゼブラフィッシュにおける一本鎖アニーリング及び低レベルの遺伝子不活性化を促進する(Takahashi,2005)。まとめると、これらの研究は、RecA又はRad51の異所性発現が相同組換えの中程度の刺激をもたらすが、遺伝子ターゲティングに有用となるのに十分にレベルを増加させるものではないことを示している。
従ってリコンビナーゼ活性としては、限定はされないが、一本鎖DNA結合、シナプシス、相同性検索、一本鎖DNAによる二重鎖侵入、ヘテロ二重鎖形成、ATP加水分解及びタンパク質分解が挙げられる。原型リコンビナーゼは大腸菌(E.coli)由来のRecAタンパク質である。例えば、米国特許第4,888,274号明細書を参照のこと。原核生物RecA様タンパク質もまた、サルモネラ属(Salmonella)、バチルス属(Bacillus)及びプロテウス属(Proteus)の種で記載されている。サーマス・アクアチカス(Thermus aquaticus)由来の耐熱性RecAタンパク質が、米国特許第5,510,473号明細書に記載されている。RecAのバクテリオファージT4相同体であるUvsXタンパク質が記載されている。変化したリコンビナーゼ活性を有するRecA突然変異体が、例えば米国特許第6,774,213号明細書;同第7,176,007号明細書及び同第7,294,494号明細書に記載されている。植物RecA相同体が、例えば米国特許第5,674,992号明細書;同第6,388,169号明細書及び同第6,809,183号明細書に記載されている。リコンビナーゼ活性を含むRecA断片が、例えば米国特許第5,731,411号明細書に記載されている。増強されたリコンビナーゼ活性を有する突然変異RecAタンパク質、例えばRecA803などが記載されている。例えば、Madirajuら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:6592−6596を参照のこと。
同様にリコンビナーゼ活性を有するRecAの真核生物相同体が、当初酵母サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)において同定されたRad51タンパク質である。Bishopら,(1992)Cell 69:439−56及びShinohara et al,(1992)Cell:457−70 Aboussekhraら,(1992)Mol.Cell.Biol.72,3224−3234. Basileら,(1992)Mol.Cell.Biol.12,3235−3246を参照のこと。植物Rad51配列については、米国特許第6,541,684号明細書;同第6,720,478号明細書;同第6,905,857号明細書及び同第7,034,117号明細書に記載される。RecAと相同な別の酵母タンパク質は、Dmc1タンパク質である。大腸菌(E.coli)及びS.セレビシエ(S.cerevisiae)以外の生物におけるRecA/Rad51相同体について記載されている。Moritaら(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6577−6580;Shinoharaら(1993)Nature Genet.4:239−243;Heyer(1994)Experientia 50:223−233;Maeshimaら(1995)Gene 160:195−200;米国特許第6,541,684号明細書及び同第6,905,857号明細書。
本明細書では、「RecA」又は「RecAタンパク質」は、同じ機能、特に:(i)続くDNAポリメラーゼによる伸長のため、オリゴヌクレオチド又はポリヌクレオチドをその相同標的上に適切に位置決めする能力;(ii)DNA合成のため、トポロジー的に二重鎖核酸を調製する能力;及び、(iii)RecA/オリゴヌクレオチド又はRecA/ポリヌクレオチド複合体が効率的に相補配列を見つけ出してそれと結合する能力のうち本質的に全て又はほとんどを有するRecA様組換えタンパク質のファミリーを指す。最も良く特徴付けられているRecAタンパク質は大腸菌(E.coli)由来のものである;このタンパク質の元の対立形質に加え、いくつかの変異RecA様タンパク質、例えばRecA803が同定されている。さらに、多くの生物が、例えば、酵母、ショウジョウバエ属(Drosophila)、ヒトを含む哺乳動物、及び植物を含め、RecA様鎖転移タンパク質を有する。これらのタンパク質には、例えば、Rec1、Rec2、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad51E、XRCC2及びDMC1が含まれる。組換えタンパク質の実施形態は、大腸菌(E.coli)のRecAタンパク質である。或いは、RecAタンパク質は、大腸菌(E.coli)の変異RecA−803タンパク質、別の細菌源由来のRecAタンパク質又は別の生物由来の相同組換えタンパク質であってもよい。
リコンビナーゼ活性を有するタンパク質のさらなる記載は、例えば、Fugisawaら(1985)Nucl.Acids Res.13:7473;Hsiehら(1986)Cell 44:885;Hsiehら(1989)J.Biol.Chem.264:5089;Fishelら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:3683;Cassutoら(1987)Mol.Gen.Genet.208:10;Ganeaら(1987)Mol.Cell Biol.7:3124;Mooreら(1990)J.Biol.Chem.:11108;Keeneら(1984)Nucl.Acids Res.12:3057;Kimiec(1984)Cold Spring Harbor Symp.48:675;Kimeic(1986)Cell 44:545;Kolodnerら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5560;Suginoら(1985)Proc.Natl.Acad,Sci.USA 85:3683;Halbrookら(1989)J.Biol.Chem.264:21403;Eisenら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:7481;McCarthyら(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:5854;及びLowenhauptら(1989)J.Biol.Chem.264:20568(これらは参照により本明細書に援用される)に見出される。Brendelら(1997)J.Mol.Evol.44:528もまた参照のこと。
リコンビナーゼ活性を有するタンパク質の例には、recA、recA803、uvsX、及び他のrecA突然変異体及びrecA様リコンビナーゼ(Roca(1990)Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.25:415)、(Kolodnerら(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84:5560;Tishkoffら(1991)Molec.Cell.Biol.11:2593)、RuvC(Dunderdaleら(1991)Nature 354:506)、DST2、KEM1及びXRN1(Dykstraら(1991)Molec.Cell.Biol.11:2583)、STPa/DST1(Clarkら(1991)Molec.Cell.Biol.11:2576)、HPP−1(Mooreら(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88:9067)、他の真核生物リコンビナーゼ(Bishopら(1992)Cell 69:439;及びShinoharaら(1992)Cell 69:457)(参照により本明細書に援用される)が含まれる。
リコンビナーゼ活性を有するインビトロ進化タンパク質が、米国特許第6,686,515号明細書に記載されている。リコンビナーゼに関するさらなる文献としては、例えば、米国特許第7,732,585号明細書、同第7,361,641号明細書、同第7,144,734号明細書が挙げられる。リコンビナーゼのレビューについては、Cox(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98:8173−8180を参照のこと。
核タンパク質フィラメント、又は「フィラメント」が形成されてもよい。フィラメントという用語は、リコンビナーゼとの構造の形成に関連して、これらの分野の当業者には知られている用語である。次にそのように形成された核タンパク質フィラメントを、例えば、別の核酸と接触させるか又は細胞に導入することができる。核タンパク質フィラメントであって、リコンビナーゼ活性を有するポリペプチド配列と核酸とを含むフィラメントの形成方法は、当該技術分野において周知されている。例えば、Cuiら(2003)Marine Biotechnol.5:174−184及び米国特許第4,888,274号明細書;同第5,763,240号明細書;同第5,948,653号明細書及び同第7,199,281号明細書を参照のこと(これらの開示は、リコンビナーゼを核酸と結合させて核タンパク質フィラメントを形成する例示的な技法を開示する目的から参照により援用される)。
一般に、リコンビナーゼ活性を有する分子を線状の一本鎖核酸に接触させる。線状の一本鎖核酸はプローブであってもよい。かかる一本鎖核酸の調製方法は公知である。反応混合物は、典型的にはマグネシウムイオンを含有する。場合により、反応混合物は緩衝され、場合によりまたATP、dATP又は非加水分解性ATP類似体、例えばγ−チオ−ATP(ATP−γ−S)又はγ−チオ−GTP(GTP−γ−S)も含有する。反応混合物はまた、場合によりATP生成系も含有する。二本鎖DNA分子を、フィラメント形成の前に、或いはその最中に、(例えば熱又はアルカリによって)変性させることができる。リコンビナーゼと核酸とのモル比の最適化は、当該分野の技術の範囲内である。例えば、種々のリコンビナーゼ濃度の系列を一定量の核酸に添加し、アガロース又はアクリルアミドゲルにおける移動度によってフィラメント形成をアッセイすることができる。結合したタンパク質がポリヌクレオチドの電気泳動移動度を減速させるため、核酸の移動度の減速によってフィラメント形成が明らかとなる。移動度の減速に伴う最大減速度、又は最大核酸移動量のいずれかを使用して、最適なリコンビナーゼ:核酸比を指示することができる。タンパク質−DNA会合はまた、ポリヌクレオチドがニトロセルロースに結合する能力を測定することによっても定量化できる。
本明細書に示される特許出願、特許、刊行物、及び学術論文は、本明細書によってあらゆる目的から参照により本明細書に援用される;矛盾が生じた場合、本明細書が優先する。
TALENの作製を含む一般的技法は、特に指示されない限り、概して米国特許出願公開第2013/0117870号明細書に記載される。これらの一般的技法の一部は本明細書にさらに記載される。また、実施例のうちのいくつかは詳細な実験データ及び結果を提供する。
実施例1
TALENの設計及び生成;一般的条件。候補TALEN標的DNA配列及びRVD配列を、オンラインツール「TALエフェクターヌクレオチドターゲッター(TAL EFFECTOR NUCLEOTIDE TARGETER)」を使用して同定した。次にTALEN DNAトランスフェクション又はインビトロTALEN mRNA転写用のプラスミドを、pCGOLDYTALEN(Addgene ID 38143)及びRCIscript−GOLDYTALEN(Addgene ID 38143)を最終送り先ベクターとして使用するゴールデンゲート(Golden Gate)構築プロトコルに従うことにより作製した(Carlson 2012)。最終的なpC−GoldyTALENベクターを、PureLink(登録商標)HIPURE PLASMID MIDIPREPキット(Life Technologies)を使用することにより調製し、使用前に配列決定した。QIAPREP SPIN MINIPREPキット(Qiagen)を使用して調製した構築されたRCIscriptベクターをSacIにより線状化し、先に示したとおりmMESSAGE mMACHINE(登録商標)T3キット(Ambion)を使用したインビトロTALEN mRNA転写の鋳型として使用した。以前記載されたとおりCarlson 2012)、3’−0−Mem7G(5’)ppp(5’)G RNAキャップ類似体(New England Biolabs)、5−メチルシチジン三リン酸 プソイドウリジン三リン酸(TriLink Biotechnologies,San Diego,CA)及びアデノシン三リン酸 グアノシン三リン酸からなるリボヌクレオチドカクテルを代用して改変mRNAをRCIScript−GOLDYTALENベクターから合成した。最終的なヌクレオチド反応濃度はキャップ類似体について6mM、グアノシン三リン酸について1.5mM、及び他のヌクレオチドについて7.5mMである。得られたmRNAはDNアーゼ処理した後、MEGACLEAR反応クリーンアップキット(Applied Biosciences)を使用して精製した。
TALENの設計及び生成;一般的条件。候補TALEN標的DNA配列及びRVD配列を、オンラインツール「TALエフェクターヌクレオチドターゲッター(TAL EFFECTOR NUCLEOTIDE TARGETER)」を使用して同定した。次にTALEN DNAトランスフェクション又はインビトロTALEN mRNA転写用のプラスミドを、pCGOLDYTALEN(Addgene ID 38143)及びRCIscript−GOLDYTALEN(Addgene ID 38143)を最終送り先ベクターとして使用するゴールデンゲート(Golden Gate)構築プロトコルに従うことにより作製した(Carlson 2012)。最終的なpC−GoldyTALENベクターを、PureLink(登録商標)HIPURE PLASMID MIDIPREPキット(Life Technologies)を使用することにより調製し、使用前に配列決定した。QIAPREP SPIN MINIPREPキット(Qiagen)を使用して調製した構築されたRCIscriptベクターをSacIにより線状化し、先に示したとおりmMESSAGE mMACHINE(登録商標)T3キット(Ambion)を使用したインビトロTALEN mRNA転写の鋳型として使用した。以前記載されたとおりCarlson 2012)、3’−0−Mem7G(5’)ppp(5’)G RNAキャップ類似体(New England Biolabs)、5−メチルシチジン三リン酸 プソイドウリジン三リン酸(TriLink Biotechnologies,San Diego,CA)及びアデノシン三リン酸 グアノシン三リン酸からなるリボヌクレオチドカクテルを代用して改変mRNAをRCIScript−GOLDYTALENベクターから合成した。最終的なヌクレオチド反応濃度はキャップ類似体について6mM、グアノシン三リン酸について1.5mM、及び他のヌクレオチドについて7.5mMである。得られたmRNAはDNアーゼ処理した後、MEGACLEAR反応クリーンアップキット(Applied Biosciences)を使用して精製した。
組織培養及びトランスフェクション;一般的条件。ブタ又はウシ線維芽細胞を、10%ウシ胎仔血清、100I.U./mlペニシリン及びストレプトマイシン、及び2mM L−グルタミンを補足したDMEM中に5%CO2において37℃又は30℃(指示するとおり)で維持した。トランスフェクションに関して、TALEN及びHDR鋳型は全て、特に指定されない限りNeonトランスフェクションシステム(Life Technologies)を使用したトランスフェクションによって送達した。簡潔に言えば、100%コンフルエンスに達した低継代オッサバウ、ランドレース、和牛、又はホルスタイン線維芽細胞を1:2に分け、翌日70〜80%コンフルエンスで回収した。各トランスフェクションには、プラスミドDNA又はmRNA及びオリゴと混合した緩衝液「R」に懸濁された500,000〜600,000細胞が含まれ、以下のパラメータに従うことにより100μlティップを使用して電気穿孔した:入力電圧;1800V;パルス幅;20ms;及びパルス数;1。典型的には、各トランスフェクションにおいて2〜4μgのTALEN発現プラスミド又は1〜2μgのTALEN mRNA及び目的の遺伝子に特異的な2〜3μMのオリゴをインキュベートした。それらの量からのずれは、図の脚注に示す。トランスフェクション後、細胞を60:40に分割して6ウェルディッシュの2つの別個のウェルに入れ、それぞれ30℃又は37℃のいずれかで3日間培養した。3日後、細胞集団を37℃で少なくとも10日目まで拡大し、編集の安定性を評価した。
実施例2 希釈クローニング
指示するとおり、ある場合には希釈クローニングを使用した。トランスフェクションの3日後、50〜250細胞を10cmディッシュに播種し、個々のコロニーが直径約5mmに達するまで培養した。達した時点で、PBS中に1:5(vol/vol)希釈した6mlのTrypLE(Life Technologies)を添加し、コロニーを吸引して24ウェルディッシュウェルのウェルに移し、同じ条件下で培養した。コンフルエンスに達したコロニーを収集し、凍結保存用及び遺伝子タイピング用に分割した。試料調製:6ウェルディッシュのウェルから3日目及び10日目のトランスフェクト細胞集団を収集し、10〜30%を、50μlの1×PCR適合溶解緩衝液:200μg/mlプロテイナーゼKを補足したばかりの10mM トリス−Cl pH8.0、2mM EDTA、0.45%Tryton X−100(vol/vol)、0.45%Tween−20(vol/vol)中に再懸濁した。ライセートをサーマルサイクラーで以下のプログラムを使用して処理した:55℃で60分、95℃で15分。希釈クローニングからのコロニー試料を、20〜30μlの溶解緩衝液を使用して上記のとおり処理した。
指示するとおり、ある場合には希釈クローニングを使用した。トランスフェクションの3日後、50〜250細胞を10cmディッシュに播種し、個々のコロニーが直径約5mmに達するまで培養した。達した時点で、PBS中に1:5(vol/vol)希釈した6mlのTrypLE(Life Technologies)を添加し、コロニーを吸引して24ウェルディッシュウェルのウェルに移し、同じ条件下で培養した。コンフルエンスに達したコロニーを収集し、凍結保存用及び遺伝子タイピング用に分割した。試料調製:6ウェルディッシュのウェルから3日目及び10日目のトランスフェクト細胞集団を収集し、10〜30%を、50μlの1×PCR適合溶解緩衝液:200μg/mlプロテイナーゼKを補足したばかりの10mM トリス−Cl pH8.0、2mM EDTA、0.45%Tryton X−100(vol/vol)、0.45%Tween−20(vol/vol)中に再懸濁した。ライセートをサーマルサイクラーで以下のプログラムを使用して処理した:55℃で60分、95℃で15分。希釈クローニングからのコロニー試料を、20〜30μlの溶解緩衝液を使用して上記のとおり処理した。
実施例3 突然変異検出及びRFLP分析
意図した部位に隣接したPCRを、製造者の推奨に従い1μlの細胞ライセートでPLATINUM TAQ DNAポリメラーゼHIFI(Life Technologies)を使用して実施した。集団における突然変異の頻度を、SURVEYOR突然変異検出キット(Transgenomic)で製造者の推奨に従い上記に記載したとおりのPCR産物10ulを使用して分析した。10μlの上記PCR反応物に対し、指示する制限酵素を使用してRFLP分析を実施した。SURVEYOR及びRFLP反応物を10%TBEポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。バンドのデンシトメトリー計測を、ImageJを使用して実施し;及びSURVEYOR反応物の突然変異率をGuschinら2010に記載されるとおり計算した。RFLP断片の合計強度を親バンド+RFLP断片の合計強度で除すことによりパーセントHDRを計算した。mloxP挿入の分析のため、挿入部位に跨る小さいPCR産物を10%ポリアクリルアミドゲル上で分離し、挿入と野生型対立遺伝子をサイズで区別することができ、定量化した。コロニーのRFLP分析も同様に処理し、但しPCR産物は1×MYTAQ RED Mix(Bioline)により増幅し、2.5%アガロースゲル上で分離させた。GDF8 G938Aのみの遺伝子移入についてクローンを分析するため(オリゴは新規RFLPを欠いていた)、初めにヘテロ接合性遺伝子移入とホモ接合性遺伝子移入とを区別することができる3プライマーアッセイによりコロニーをスクリーニングした;簡潔に言えば、以下のプライマー及びプログラムを使用して、ブタ又はウシコロニーからのライセートを1×MYTAQ RED MIX(Bioline)を使用したPCRにより分析した。ウシGDF8(外側F1:5’−CCTTGAGGTAGGAGAGTGTTTTGGG(配列番号3)、外側R1:5’−TTCACCAGAAGACAAGGAGAATTGC(配列番号1)、内側F1:5’−TAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGACTA(配列番号2);及び35サイクルの(95℃、20秒;62℃、20秒;72℃、60秒)。ブタGDF8:外側F1:5’−CCTTTTTAGAAGTCAAGGTAACAGACAC(配列番号4)、外側R1:5’−TTGATTGGAGACATCTTTGTGGGAG(配列番号5)、内側F1:5’−TAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGATTA(配列番号6);及び35サイクルの(95℃、20秒;58℃、20秒;72℃、60秒)。候補からのアンプリコンを直接配列決定し及び/又はTOPOクローニング(Life Technologies)してサンガー塩基配列決定法により配列決定した。TALEN媒介性HDRをBB−HDR鋳型で検出するため、1μl又は1:10希釈の1μlのいずれかのPCRライセート(1,000細胞/ul)をPCR反応物にPCRプライマーbt GDF8 BB 5−1(プライマー「c」)及びプライマー「c」(BB−検出3−1−5’−GCATCGAGATTCTGTCACAATCAA(配列番号7))と共に添加し、1×MYTAQ RED MIX(Bioline)を使用して40サイクル(9 459 5℃、20秒;66℃、20秒;72℃、60秒)のPCRに供した。上記のPCRにより同定されたコロニー中のHDRを確認するため、遺伝子座全体の増幅をプライマーbt GDF8 BB 5−1及びbt GDF8 BB 3−1で実施し、続いてTOPOクローニング(Life Technologies)及び塩基配列決定法を行った。
意図した部位に隣接したPCRを、製造者の推奨に従い1μlの細胞ライセートでPLATINUM TAQ DNAポリメラーゼHIFI(Life Technologies)を使用して実施した。集団における突然変異の頻度を、SURVEYOR突然変異検出キット(Transgenomic)で製造者の推奨に従い上記に記載したとおりのPCR産物10ulを使用して分析した。10μlの上記PCR反応物に対し、指示する制限酵素を使用してRFLP分析を実施した。SURVEYOR及びRFLP反応物を10%TBEポリアクリルアミドゲル上で分離し、臭化エチジウム染色により可視化した。バンドのデンシトメトリー計測を、ImageJを使用して実施し;及びSURVEYOR反応物の突然変異率をGuschinら2010に記載されるとおり計算した。RFLP断片の合計強度を親バンド+RFLP断片の合計強度で除すことによりパーセントHDRを計算した。mloxP挿入の分析のため、挿入部位に跨る小さいPCR産物を10%ポリアクリルアミドゲル上で分離し、挿入と野生型対立遺伝子をサイズで区別することができ、定量化した。コロニーのRFLP分析も同様に処理し、但しPCR産物は1×MYTAQ RED Mix(Bioline)により増幅し、2.5%アガロースゲル上で分離させた。GDF8 G938Aのみの遺伝子移入についてクローンを分析するため(オリゴは新規RFLPを欠いていた)、初めにヘテロ接合性遺伝子移入とホモ接合性遺伝子移入とを区別することができる3プライマーアッセイによりコロニーをスクリーニングした;簡潔に言えば、以下のプライマー及びプログラムを使用して、ブタ又はウシコロニーからのライセートを1×MYTAQ RED MIX(Bioline)を使用したPCRにより分析した。ウシGDF8(外側F1:5’−CCTTGAGGTAGGAGAGTGTTTTGGG(配列番号3)、外側R1:5’−TTCACCAGAAGACAAGGAGAATTGC(配列番号1)、内側F1:5’−TAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGACTA(配列番号2);及び35サイクルの(95℃、20秒;62℃、20秒;72℃、60秒)。ブタGDF8:外側F1:5’−CCTTTTTAGAAGTCAAGGTAACAGACAC(配列番号4)、外側R1:5’−TTGATTGGAGACATCTTTGTGGGAG(配列番号5)、内側F1:5’−TAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGATTA(配列番号6);及び35サイクルの(95℃、20秒;58℃、20秒;72℃、60秒)。候補からのアンプリコンを直接配列決定し及び/又はTOPOクローニング(Life Technologies)してサンガー塩基配列決定法により配列決定した。TALEN媒介性HDRをBB−HDR鋳型で検出するため、1μl又は1:10希釈の1μlのいずれかのPCRライセート(1,000細胞/ul)をPCR反応物にPCRプライマーbt GDF8 BB 5−1(プライマー「c」)及びプライマー「c」(BB−検出3−1−5’−GCATCGAGATTCTGTCACAATCAA(配列番号7))と共に添加し、1×MYTAQ RED MIX(Bioline)を使用して40サイクル(9 459 5℃、20秒;66℃、20秒;72℃、60秒)のPCRに供した。上記のPCRにより同定されたコロニー中のHDRを確認するため、遺伝子座全体の増幅をプライマーbt GDF8 BB 5−1及びbt GDF8 BB 3−1で実施し、続いてTOPOクローニング(Life Technologies)及び塩基配列決定法を行った。
実施例4 塩基配列決定法によるベルジャンブルー遺伝子移入の確認
和牛野生型GDF8及びベルジャンブルー鋳型(BB−HDR)の概略図を図2に示す。5つのPCR陽性コロニーに対して相同性アーム(c及びd)の外側に位置するプライマーを使用してPCRを実施し、続いてプライマーb’でクローニング及び塩基配列決定を行った。野生型配列との比較から、5つのコロニー中4つにおいてベルジャンブルー対立遺伝子(ヘテロ接合)に特有の予想された11塩基対欠失が明らかになる。TALEN(btGDF83.1)及びdsDNA鋳型(BB−HDR)を、11塩基対欠失が二本鎖切断誘導性相同組換えによりウシGDF8のエクソン−3に導入されるように設計した(ベルジャンブルー突然変異)。BB−HDR鋳型において左TALENの結合部位の半分は欠けており、従ってTALEN切断に抵抗するはずである。SURVEYORアッセイは、37℃及び30℃の両方でbtGDF83.1 TALENの活性を実証した。対立遺伝子特異的PCRから、HDR誘導がTALEN及びBB−HDR鋳型のコトランスフェクションに依存したことが実証された。プライマーc及びc’を使用してHDR改変GDF8対立遺伝子を特異的に検出するためPCRアッセイを開発した。プライマーc’の3’末端は11塩基対欠失にわたり、野生型対立遺伝子(wt)を増幅することができない。各PCR反応には、陽性対照を含め、500細胞当量を含めた。実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーによりパーセントHDRを決定した。
和牛野生型GDF8及びベルジャンブルー鋳型(BB−HDR)の概略図を図2に示す。5つのPCR陽性コロニーに対して相同性アーム(c及びd)の外側に位置するプライマーを使用してPCRを実施し、続いてプライマーb’でクローニング及び塩基配列決定を行った。野生型配列との比較から、5つのコロニー中4つにおいてベルジャンブルー対立遺伝子(ヘテロ接合)に特有の予想された11塩基対欠失が明らかになる。TALEN(btGDF83.1)及びdsDNA鋳型(BB−HDR)を、11塩基対欠失が二本鎖切断誘導性相同組換えによりウシGDF8のエクソン−3に導入されるように設計した(ベルジャンブルー突然変異)。BB−HDR鋳型において左TALENの結合部位の半分は欠けており、従ってTALEN切断に抵抗するはずである。SURVEYORアッセイは、37℃及び30℃の両方でbtGDF83.1 TALENの活性を実証した。対立遺伝子特異的PCRから、HDR誘導がTALEN及びBB−HDR鋳型のコトランスフェクションに依存したことが実証された。プライマーc及びc’を使用してHDR改変GDF8対立遺伝子を特異的に検出するためPCRアッセイを開発した。プライマーc’の3’末端は11塩基対欠失にわたり、野生型対立遺伝子(wt)を増幅することができない。各PCR反応には、陽性対照を含め、500細胞当量を含めた。実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーによりパーセントHDRを決定した。
実施例5 野生型和牛ウシにおける意図した遺伝子の正確な改変
野生型和牛ウシの遺伝子を、その遺伝子の標的領域に欠失を作製することにより改変した(11bp欠失)。この改変により、和牛ウシはベルジャンブルーウシの対立遺伝子を有するようになった。単独でトランスフェクトしたとき、btGDF8.1 TALEN対は染色体の最大16%を標的遺伝子座で切断した。TALEN(btGDF83.1)及びdsDNA鋳型(BB−HDR)を、DSB誘導性相同組換えによりウシGDF8のエクソン−3に11bp欠失が導入されるように設計した(ベルジャンブルー突然変異)。BB−HDR鋳型において左TALENの結合部位の半分は欠けており、それがBB−HDR鋳型をTALEN切断に対し抵抗性にした。SURVEYORアッセイから、37℃及び30℃の両方におけるbtGDF83.1 TALENの活性が実証された。このアッセイに使用したPCR産物は、プライマーb及びb’(図示せず)を使用して産生した。BB−HDR鋳型はbtGDF83.1活性の予想を混乱させ得るため、これらのレプリケートにBB−HDR鋳型は含めなかった。対立遺伝子特異的PCRから、HDR誘導がTALEN及びBB−HDR鋳型のコトランスフェクションに依存したことが実証された。プライマーc及びc’(図示せず)を使用してHDR改変GDF8対立遺伝子を特異的に検出するためPCRアッセイを開発した。プライマーc’の3’末端は11bp欠失に跨ったため野生型対立遺伝子「wt」を増幅することができなかった。各PCR反応には、陽性対照「C」を含め、500細胞当量を含めた。実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーによりパーセントHDRを決定した。ベルジャンブルーウシ由来の1623bpのDNA断片を有するスーパーコイルDNA鋳型とのコトランスフェクションは、所望イベントに関する選択なしに、3日目の半定量的PCRにより示唆されるとおり0.5%〜5%の遺伝子変換頻度(HDR)をもたらした。これらの結果から、TALENを使用して家畜に外来核酸配列を、対立遺伝子を含め−及びマーカーなしに−有効に置くことができることが実証された。個々のコロニーに置かれた頻度を評価するため、トランスポゾン共選択戦略を実施してDNA配列決定用の個々のコロニーを単離及び拡大した。ベルジャンブルーウシ由来の鋳型を使用した遺伝子変換が、PCRにより調べた366個中5個のコロニーで検出された。ベルジャンブルーHDR鋳型の外側のプライマーによる増幅及び塩基配列決定により、コロニーのうち4個で予想された11bp欠失の存在が確認された。
野生型和牛ウシの遺伝子を、その遺伝子の標的領域に欠失を作製することにより改変した(11bp欠失)。この改変により、和牛ウシはベルジャンブルーウシの対立遺伝子を有するようになった。単独でトランスフェクトしたとき、btGDF8.1 TALEN対は染色体の最大16%を標的遺伝子座で切断した。TALEN(btGDF83.1)及びdsDNA鋳型(BB−HDR)を、DSB誘導性相同組換えによりウシGDF8のエクソン−3に11bp欠失が導入されるように設計した(ベルジャンブルー突然変異)。BB−HDR鋳型において左TALENの結合部位の半分は欠けており、それがBB−HDR鋳型をTALEN切断に対し抵抗性にした。SURVEYORアッセイから、37℃及び30℃の両方におけるbtGDF83.1 TALENの活性が実証された。このアッセイに使用したPCR産物は、プライマーb及びb’(図示せず)を使用して産生した。BB−HDR鋳型はbtGDF83.1活性の予想を混乱させ得るため、これらのレプリケートにBB−HDR鋳型は含めなかった。対立遺伝子特異的PCRから、HDR誘導がTALEN及びBB−HDR鋳型のコトランスフェクションに依存したことが実証された。プライマーc及びc’(図示せず)を使用してHDR改変GDF8対立遺伝子を特異的に検出するためPCRアッセイを開発した。プライマーc’の3’末端は11bp欠失に跨ったため野生型対立遺伝子「wt」を増幅することができなかった。各PCR反応には、陽性対照「C」を含め、500細胞当量を含めた。実験反応と対照反応との比較デンシトメトリーによりパーセントHDRを決定した。ベルジャンブルーウシ由来の1623bpのDNA断片を有するスーパーコイルDNA鋳型とのコトランスフェクションは、所望イベントに関する選択なしに、3日目の半定量的PCRにより示唆されるとおり0.5%〜5%の遺伝子変換頻度(HDR)をもたらした。これらの結果から、TALENを使用して家畜に外来核酸配列を、対立遺伝子を含め−及びマーカーなしに−有効に置くことができることが実証された。個々のコロニーに置かれた頻度を評価するため、トランスポゾン共選択戦略を実施してDNA配列決定用の個々のコロニーを単離及び拡大した。ベルジャンブルーウシ由来の鋳型を使用した遺伝子変換が、PCRにより調べた366個中5個のコロニーで検出された。ベルジャンブルーHDR鋳型の外側のプライマーによる増幅及び塩基配列決定により、コロニーのうち4個で予想された11bp欠失の存在が確認された。
第2の反復実験を実施したところ一貫した結果となり、試験した全コロニーの約1%が二対立遺伝子変換に関して陽性であり、且つ試験した全コロニーの約0.5%〜約1%が対立遺伝子変換に関してヘテロ接合であった。
同様に、オリゴHDRを使用して対立遺伝子をブタ(オッサバウ)細胞にも導入した。mRNAによりコードされるTALENと一本鎖オリゴヌクレオチドとの組み合わせで細胞を改変し、ある種で天然に存在する対立遺伝子を別の種に置いた(種間移動)。ピエモンテーゼGDF8 SNP C313Yを例として選択し、オッサバウ(Ossabow)ブタ細胞に導入した。いずれの段階においても、これらの細胞にマーカーは使用しなかった。ブタ細胞とウシ細胞との間に0.4nmol ssODNでHDRの同様のピークが観察された(図示せず)が、しかしながらオッサバウ線維芽細胞では、より高濃度のssODNによってもHDRは消失しなかった。
実施例6 意図した標的における改変
一貫した標的遺伝子改変を作製した。図4を参照すると、各図が、プラスミドDNA又はmRNAとして送達されるオリゴドナー鋳型及びTALENを使用して線維芽細胞における特定の遺伝子座(例えば、ssIL2RG;「ss」はイノシシ(Sus scrofa)、及び「bt」はウシ(Bos taurus))を標的化した結果を示す。(挿入図)オリゴ鋳型の図、図中、陰影付きのボックスがTALEN結合部位を表し、スペーサーは白色で示す。各オリゴは、RFLP分析用の新規制限部位を導入する4bpの挿入(ins4)又は欠失(del4)のいずれかを含む。推定的な遮断突然変異(blocking mutation:BM)が、保存されている−1チミジン(TALEN結合部位に対して)を指示されるヌクレオチドに置換する。線維芽細胞にTALENコードプラスミド(3μg)又はmRNA(1μg)のいずれかを3μMのそのコグネイトオリゴ相同鋳型と共にトランスフェクトした。次に細胞を37℃又は30℃で3日間インキュベートした後、37℃で10日目まで拡大した。3日目にSurveyorアッセイによりTALEN活性を計測し(3日目Surveyor)、3日目及び10日目にRFLP分析によりHDRを計測した(3日目%HDR及び10日目%HDR)。各棒は3レプリケートの平均値及びSEMを表す。標的化した遺伝子座の各々は成功裏に改変された。
一貫した標的遺伝子改変を作製した。図4を参照すると、各図が、プラスミドDNA又はmRNAとして送達されるオリゴドナー鋳型及びTALENを使用して線維芽細胞における特定の遺伝子座(例えば、ssIL2RG;「ss」はイノシシ(Sus scrofa)、及び「bt」はウシ(Bos taurus))を標的化した結果を示す。(挿入図)オリゴ鋳型の図、図中、陰影付きのボックスがTALEN結合部位を表し、スペーサーは白色で示す。各オリゴは、RFLP分析用の新規制限部位を導入する4bpの挿入(ins4)又は欠失(del4)のいずれかを含む。推定的な遮断突然変異(blocking mutation:BM)が、保存されている−1チミジン(TALEN結合部位に対して)を指示されるヌクレオチドに置換する。線維芽細胞にTALENコードプラスミド(3μg)又はmRNA(1μg)のいずれかを3μMのそのコグネイトオリゴ相同鋳型と共にトランスフェクトした。次に細胞を37℃又は30℃で3日間インキュベートした後、37℃で10日目まで拡大した。3日目にSurveyorアッセイによりTALEN活性を計測し(3日目Surveyor)、3日目及び10日目にRFLP分析によりHDRを計測した(3日目%HDR及び10日目%HDR)。各棒は3レプリケートの平均値及びSEMを表す。標的化した遺伝子座の各々は成功裏に改変された。
実施例7 遺伝子に意図した変化を作製するための高い効率
図5は、遺伝子APC、LDLR、p53、p65、及びbtGDF8に作製された変化の分析を示す。ある場合には挿入が意図された一方、他の場合にはSNPが意図された。変化は、上記に記載したとおり、TALEN及びHDR鋳型で作製した。野生型リード数に対する意図した完全なHRリード数をプロットする:挿入(パネルa)及びSNP対立遺伝子(パネルb)。TALEN刺激性HDR対立遺伝子の配列分析を行った。TALEN mRNA及びオリゴをトランスフェクトした細胞集団から得られた標的部位に隣接するPCRアンプリコン(合計200〜250bp)をILLUMINAシーケンシングにより配列決定した。総リード数は試料当たり10,000〜400,000の範囲であった。標的遺伝子座、時間点及びオリゴにBMが含まれたか否かを下に示す。パネルcは、標的SNPの組み込みに関してソートし、次に意図したもの(iSNP)とさらなる突然変異を有するもの(iSNP+Mut)とに分類し、リード総数に対してプロットしたときの、btGDF8及びp65のリードを示す。従って、単一のSNPのみが意図された場合、指示するとおり、さらなる変化もまた存在した。
図5は、遺伝子APC、LDLR、p53、p65、及びbtGDF8に作製された変化の分析を示す。ある場合には挿入が意図された一方、他の場合にはSNPが意図された。変化は、上記に記載したとおり、TALEN及びHDR鋳型で作製した。野生型リード数に対する意図した完全なHRリード数をプロットする:挿入(パネルa)及びSNP対立遺伝子(パネルb)。TALEN刺激性HDR対立遺伝子の配列分析を行った。TALEN mRNA及びオリゴをトランスフェクトした細胞集団から得られた標的部位に隣接するPCRアンプリコン(合計200〜250bp)をILLUMINAシーケンシングにより配列決定した。総リード数は試料当たり10,000〜400,000の範囲であった。標的遺伝子座、時間点及びオリゴにBMが含まれたか否かを下に示す。パネルcは、標的SNPの組み込みに関してソートし、次に意図したもの(iSNP)とさらなる突然変異を有するもの(iSNP+Mut)とに分類し、リード総数に対してプロットしたときの、btGDF8及びp65のリードを示す。従って、単一のSNPのみが意図された場合、指示するとおり、さらなる変化もまた存在した。
実施例8 HDR対立遺伝子を有するコロニーの回復頻度
HDR対立遺伝子を有するコロニーの回復頻度と題される表1は、8個の別個の遺伝子座における意図したインデル対立遺伝子に関する細胞の約650個のコロニーの分析結果を掲載する。この分析から10〜64%(平均45%)の回復率が明らかとなり、最大32%のコロニーが編集に関してホモ接合であった。変化は、上記に記載したとおり、TALEN及びHDR鋳型で作製した。コロニーは薬物選択なしに希釈クローニングによって得た。
HDR対立遺伝子を有するコロニーの回復頻度と題される表1は、8個の別個の遺伝子座における意図したインデル対立遺伝子に関する細胞の約650個のコロニーの分析結果を掲載する。この分析から10〜64%(平均45%)の回復率が明らかとなり、最大32%のコロニーが編集に関してホモ接合であった。変化は、上記に記載したとおり、TALEN及びHDR鋳型で作製した。コロニーは薬物選択なしに希釈クローニングによって得た。
実施例9 DAZL及びAPCのHDR対立遺伝子を有するクローンブタ
図6は、クローン動物の遺伝子解析を示す。無精子症様(DAZL)及び大腸腺腫性ポリポーシス(APC)において欠失させた、ブタゲノムにおける2つの遺伝子編集された遺伝子座を選択した。DAZL又はAPCのHDR又はNHEJ編集対立遺伝子で処理した培養細胞のコロニーを、クロマチントランスファー(CT)によるクローニング用にプールした。各プールが3つのトランスファーから2つの妊娠を生じ、そのうち各1つの妊娠を出産に至らせた。DAZL改変細胞から合計8匹の子ブタが生まれ、その各々が、HDR対立遺伝子(ファウンダー1650、1651、及び1657)又はNHEJから生じた欠失のいずれか(図5A)と一致する選択コロニーの遺伝子型を反映した。DAZL子ブタ(ファウンダー1655〜1657)のうち3匹は死産であった。APC改変細胞からの6匹の子ブタのうち1匹は死産であり、3匹は1週間以内に死亡し、もう1匹は3週間以降に死亡し、ファウンダー1661のみが生き残った。遺伝子型と生存との間に相関がないことから、早期死亡が遺伝子編集よりむしろクローニングに関係したことが示唆される。6匹全てのAPC子ブタが意図したHDR編集対立遺伝子に関してヘテロ接合であり、1匹を除く全ての子ブタが第2の対立遺伝子に3bpのインフレーム挿入又は欠失のいずれかを有した(図6a及び図6b)。残りの動物は、精子形成停止(DAZL−/−ファウンダー)又は結腸癌の発生(APC+/−ファウンダー)の表現型分析のため飼育されている。図6を参照すると、(a)それぞれDAZL改変及びAPC改変ランドレース及びオッサバウ線維芽細胞から得られたクローン子ブタのRFLP分析。予想RFLP産物はDAZLファウンダーが312、242、及び70bpであり(白三角)、APCが310、221、及び89bpである(黒三角)。WTとDAZLファウンダーとの間の312bpバンドのサイズの違いが、予想された欠失対立遺伝子を反映している。(b)8匹中3匹のDAZLファウンダー、及び6匹中6匹のAPCファウンダーにおけるHDR対立遺伝子の存在を確認する配列分析。ドナー鋳型(HDR)におけるBMを矢印で示し、挿入された塩基を四角で囲んだ。最上部のWT配列中の太字テキストがTALEN結合部位を示す。
図6は、クローン動物の遺伝子解析を示す。無精子症様(DAZL)及び大腸腺腫性ポリポーシス(APC)において欠失させた、ブタゲノムにおける2つの遺伝子編集された遺伝子座を選択した。DAZL又はAPCのHDR又はNHEJ編集対立遺伝子で処理した培養細胞のコロニーを、クロマチントランスファー(CT)によるクローニング用にプールした。各プールが3つのトランスファーから2つの妊娠を生じ、そのうち各1つの妊娠を出産に至らせた。DAZL改変細胞から合計8匹の子ブタが生まれ、その各々が、HDR対立遺伝子(ファウンダー1650、1651、及び1657)又はNHEJから生じた欠失のいずれか(図5A)と一致する選択コロニーの遺伝子型を反映した。DAZL子ブタ(ファウンダー1655〜1657)のうち3匹は死産であった。APC改変細胞からの6匹の子ブタのうち1匹は死産であり、3匹は1週間以内に死亡し、もう1匹は3週間以降に死亡し、ファウンダー1661のみが生き残った。遺伝子型と生存との間に相関がないことから、早期死亡が遺伝子編集よりむしろクローニングに関係したことが示唆される。6匹全てのAPC子ブタが意図したHDR編集対立遺伝子に関してヘテロ接合であり、1匹を除く全ての子ブタが第2の対立遺伝子に3bpのインフレーム挿入又は欠失のいずれかを有した(図6a及び図6b)。残りの動物は、精子形成停止(DAZL−/−ファウンダー)又は結腸癌の発生(APC+/−ファウンダー)の表現型分析のため飼育されている。図6を参照すると、(a)それぞれDAZL改変及びAPC改変ランドレース及びオッサバウ線維芽細胞から得られたクローン子ブタのRFLP分析。予想RFLP産物はDAZLファウンダーが312、242、及び70bpであり(白三角)、APCが310、221、及び89bpである(黒三角)。WTとDAZLファウンダーとの間の312bpバンドのサイズの違いが、予想された欠失対立遺伝子を反映している。(b)8匹中3匹のDAZLファウンダー、及び6匹中6匹のAPCファウンダーにおけるHDR対立遺伝子の存在を確認する配列分析。ドナー鋳型(HDR)におけるBMを矢印で示し、挿入された塩基を四角で囲んだ。最上部のWT配列中の太字テキストがTALEN結合部位を示す。
実施例10 GPR54ノックアウト
図7は、指示される遺伝子ターゲティング戦略に従い作製されたGPR54ノックアウトを示す。ブタエクソン3を結合するように設計されたTALEN(下線テキスト)を、未成熟終止コドン(ボックス)及びHindIII制限部位を導入するように設計されたオリゴヌクレオチド相同性鋳型(HDR)とコトランスフェクトした。パネルbに示す実験結果について、2マイクログラムのTALENコードmRNA+0.2nMol(2uM)のHDR鋳型を、NEONヌクレオフェクションシステム(Life Technologies)を以下の設定で使用してブタ線維芽細胞500,000ブタ線維芽細胞にトランスフェクトした:1パルス、1800v;20ms幅及び100ulティップ。TALENに曝露した後、細胞を30℃で3日間成長させ、細胞を計数し、密度1〜20細胞/cm2の範囲で10cmディッシュに播いた。直径3〜4mmの個々のコロニーが観察できるようになるまで細胞を10〜15日間培養した。コロニーをp−200ピペッターで穏やかな吸引下に吸引し、500ulの成長培地を含む24ウェルプレートのウェルに吐き出した(Carlson,2011)。特徴がはっきりしたコロニー(約10〜30/プレート)を有するプレートをコロニー吸引に選択し、複数のコロニーから細胞を吸引する可能性を抑えた。コロニーが24ウェルディッシュにおいて70〜90パーセントコンフルエントに達した時点で、一部分をRFLP分析用に回収し、残りは凍結保存した。パネルb)合計96個のコロニーを、HindIII RFLPアッセイにより相同性依存性修復について分析した。各コロニーからのDNAを、標的部位に隣接するPCRプライマー;フォワード(5’−aaggatgtcagcacctctctggg(配列番号8))及びリバース(5’−ACCCACCCGGACTCTACTCCTACCA(配列番号9))を含むPCR反応物に加えた。PCR産物(389bp)をHindIII制限消化に加え、2.5%アガロースゲル上で分離した。各レーンが1つのコロニーを表す。231及び158bpの切断産物が相同性依存性修復を示している。HDR、ノックアウト対立遺伝子に関して、389bpの親バンドを有するコロニーがヘテロ接合に分類され(白三角)、それを有しないコロニーがホモ接合に分類される(黒三角)。こうした細胞、又はこの技術により調製された細胞は、従来技術を使用した動物のクローニングに使用され得る。
図7は、指示される遺伝子ターゲティング戦略に従い作製されたGPR54ノックアウトを示す。ブタエクソン3を結合するように設計されたTALEN(下線テキスト)を、未成熟終止コドン(ボックス)及びHindIII制限部位を導入するように設計されたオリゴヌクレオチド相同性鋳型(HDR)とコトランスフェクトした。パネルbに示す実験結果について、2マイクログラムのTALENコードmRNA+0.2nMol(2uM)のHDR鋳型を、NEONヌクレオフェクションシステム(Life Technologies)を以下の設定で使用してブタ線維芽細胞500,000ブタ線維芽細胞にトランスフェクトした:1パルス、1800v;20ms幅及び100ulティップ。TALENに曝露した後、細胞を30℃で3日間成長させ、細胞を計数し、密度1〜20細胞/cm2の範囲で10cmディッシュに播いた。直径3〜4mmの個々のコロニーが観察できるようになるまで細胞を10〜15日間培養した。コロニーをp−200ピペッターで穏やかな吸引下に吸引し、500ulの成長培地を含む24ウェルプレートのウェルに吐き出した(Carlson,2011)。特徴がはっきりしたコロニー(約10〜30/プレート)を有するプレートをコロニー吸引に選択し、複数のコロニーから細胞を吸引する可能性を抑えた。コロニーが24ウェルディッシュにおいて70〜90パーセントコンフルエントに達した時点で、一部分をRFLP分析用に回収し、残りは凍結保存した。パネルb)合計96個のコロニーを、HindIII RFLPアッセイにより相同性依存性修復について分析した。各コロニーからのDNAを、標的部位に隣接するPCRプライマー;フォワード(5’−aaggatgtcagcacctctctggg(配列番号8))及びリバース(5’−ACCCACCCGGACTCTACTCCTACCA(配列番号9))を含むPCR反応物に加えた。PCR産物(389bp)をHindIII制限消化に加え、2.5%アガロースゲル上で分離した。各レーンが1つのコロニーを表す。231及び158bpの切断産物が相同性依存性修復を示している。HDR、ノックアウト対立遺伝子に関して、389bpの親バンドを有するコロニーがヘテロ接合に分類され(白三角)、それを有しないコロニーがホモ接合に分類される(黒三角)。こうした細胞、又はこの技術により調製された細胞は、従来技術を使用した動物のクローニングに使用され得る。
実施例11 処理なしには成熟しない家畜の作出
ウシ、ブタ、及びニワトリを含め、1つ又は複数のGPR54ノックアウトを有する家畜を調製する。前述の例は、一つのかかる方法を詳述する。以下の具体的な方法はブタについて記載する;当業者は、本願を読んだ後、これらの実験を他の家畜に応用することができるであろう。Gpr54用のTALENを開発し、それを使用してヘテロ接合及びホモ接合ノックアウト細胞株を生成する。雄及び雌Gpr54−/−及び/又はGpr54+/−に関してヘテロ接合の細胞株を異種交配により生じたGpr54−/−動物と使用して妊娠を確立する。Gpr54−/−動物の発育及び妊孕性を評価する。Gpr54−/−動物が春機発動期に進まず、実際に生殖不能であることが確定した後、ゴナドトロピン又はGnRH1処理により妊孕性を復元する実験を実施する。効率的なTALENを生成し、突然変異体コロニーを単離し、細胞又は接合子からトランスジェニック動物を産生するという既に実証された能力は、本明細書において十分に裏付けられており、またTanら,PNAS,110(41):16526−16531,2013も参照されたい。
ウシ、ブタ、及びニワトリを含め、1つ又は複数のGPR54ノックアウトを有する家畜を調製する。前述の例は、一つのかかる方法を詳述する。以下の具体的な方法はブタについて記載する;当業者は、本願を読んだ後、これらの実験を他の家畜に応用することができるであろう。Gpr54用のTALENを開発し、それを使用してヘテロ接合及びホモ接合ノックアウト細胞株を生成する。雄及び雌Gpr54−/−及び/又はGpr54+/−に関してヘテロ接合の細胞株を異種交配により生じたGpr54−/−動物と使用して妊娠を確立する。Gpr54−/−動物の発育及び妊孕性を評価する。Gpr54−/−動物が春機発動期に進まず、実際に生殖不能であることが確定した後、ゴナドトロピン又はGnRH1処理により妊孕性を復元する実験を実施する。効率的なTALENを生成し、突然変異体コロニーを単離し、細胞又は接合子からトランスジェニック動物を産生するという既に実証された能力は、本明細書において十分に裏付けられており、またTanら,PNAS,110(41):16526−16531,2013も参照されたい。
Gpr54−/−雄及び雌ブタの生成。実施例11で生成したとおりの、両方の対立遺伝子のフレームシフト突然変異を有する10匹の二対立遺伝子KO雄及び雌クローンを、SCNTによるクローニング用にプールする。2ラウンドのクローニング(各3つのトランスファー)を実施する。第1ラウンドでGpr54−/−によって妊娠が確立されない場合、ラウンド2のクローニングをGpr54+/−細胞で実施する。Gpr54の標的領域の塩基配列を決定することにより、得られた動物の遺伝子型を特徴付ける。クローニングにGpr54+/−細胞が使用された場合、異種交配によってGpr54−/−動物を生成する。
Gpr54−/−ブタの表現型評価。テストステロン及びFSHの血清レベル(性別当たり≧3)を、Gpr54−/−動物及び年齢適合対照について5ヶ月齢から始めて9ヶ月齢まで、2週間毎に定量化する。雄は精巣サイズを計測し、体重及び年齢に対してプロットする。9ヶ月齢で、Gpr54−/−ブタが野生型対照動物から外れ、春機発動期を示す血清学又は挙動形質(即ちマウンティング)を示さない場合、適格な病理学者による生殖器の解剖学的及び組織学的評価のため少なくとも1匹の雄及び雌を犠牲にする。
Gpr54−/−ブタにおける妊孕性を回復するための手段としてのGnRH1注入の評価。ゴナドトロピン又は律動的GnRH1療法は、HHを有するヒトにおいて妊孕性を回復するのに有効な治療である(Buchter,D.,Behre,H.M.,Kliesch,S.,and Nieschlag,E.(1998).「低ゴナドトロピン性性腺機能低下症を有する男性に対する有効な治療としての律動的GnRH1又はヒト絨毛性ゴナドトロピン/ヒト閉経期ゴナドトロピン:42症例のレビュー(Pulsatile GnRH1 or human chorionic gonadotropin/human menopausal gonadotropin as effective treatment for men with hypogonadotropic hypogonadism:a review of 42 cases)」.Eur J Endocrinol 139,298−303。いずれの療法も、成功させるには、血清LH及びテストステロンのレベルに陽性反応が現れなければならない。従って、本発明者らは、不妊のGpr54−/−がGnRH1注入に応答してLH又はテストステロンに典型的なスパイクを示すかどうかを決定しようと試みる(Wise,T.,Zanella,E.L.,Lunstra,D.D.,and Ford,J.J.(2000).「高値及び低値の卵胞刺激ホルモンレベルに関して選択される雄ブタにおけるGnRH1及びGnRH1アンタゴニストに応答したゴナドトロピン、テストステロン、及びコルチゾールの関係(Relationships of gonadotropins,testosterone,and cortisol in response to GnRH1 and GnRH1 antagonist in boars selected for high and low follicle−stimulating hormone levels)」J Anim Sci 78,1577−1590)。繰り返し血液採取するため、対象の雄ブタ(n>3)に頸静脈カテーテルを留置する。試料は20分おきに採り、120分目にGnRH1(100ng/kg体重)の単一のボーラスを投与する。GnRH1注入後、試料採取頻度は10分おきに30分間行ってLHサージをモニタし、続いてさらに4時間、20分おきに試料採取する。
ドミナントネガティブによる遺伝子不活性化。同様のプロセスを用いて、遺伝子の1つ以上を不活性化させるドミナントネガティブを発現させ得る。また、例えば、ドミナントネガティブをコードするトランスポゾンが好適なトランスポザーゼにより染色体に挿入されてもよい。妊孕性を回復する処理は、例えば妊孕性救出のためのファーマコペロンによる食餌療法であってもよい。
実施例12
p65のT1591C部位に重複するCRISPR gRNAを作製し、遺伝子移入に関して評価した。意図した部位における二本鎖切断(DSB)の効率的な生成が観察された。CRISPR/Cas9媒介性HDRは3日目に<6%、10日目に検出限界未満であった。TALENはSNP部位から35bp離れたところを切断するにしても、改変クローンの回復はTALENによる場合と比べてCRISPR媒介性HDRで低かった(表1)。第2の遺伝子座sAPC14.2におけるCRISPR/Cas9誘導性ターゲティングはより効率的であったが、この部位でTALENにより誘導されるHDRレベルに達しなかった(60%に対して約30%)。Tanら,PNAS,110(41):16526−16531,2013)もまた参照のこと。CRISPR/Cas9エンドヌクレアーゼは、Church laboratoryシステム及び方法、Mali P,ら(2013)「Cas9によるRNA誘導ヒトゲノム操作(RNA−guided human genome engineering via Cas9)」.Science 339(6121):823−826に基づき産生した。
p65のT1591C部位に重複するCRISPR gRNAを作製し、遺伝子移入に関して評価した。意図した部位における二本鎖切断(DSB)の効率的な生成が観察された。CRISPR/Cas9媒介性HDRは3日目に<6%、10日目に検出限界未満であった。TALENはSNP部位から35bp離れたところを切断するにしても、改変クローンの回復はTALENによる場合と比べてCRISPR媒介性HDRで低かった(表1)。第2の遺伝子座sAPC14.2におけるCRISPR/Cas9誘導性ターゲティングはより効率的であったが、この部位でTALENにより誘導されるHDRレベルに達しなかった(60%に対して約30%)。Tanら,PNAS,110(41):16526−16531,2013)もまた参照のこと。CRISPR/Cas9エンドヌクレアーゼは、Church laboratoryシステム及び方法、Mali P,ら(2013)「Cas9によるRNA誘導ヒトゲノム操作(RNA−guided human genome engineering via Cas9)」.Science 339(6121):823−826に基づき産生した。
実施例13
図8に関連して、kiss遺伝子の構造上の構成は保存されており、一方がシグナルペプチドとキスペプチン前駆体の一部との両方をコードし、他方がキスペプチン−10配列を含む前駆体の残りの部分をコードする2つのコードエクソンを含む。テラピアKiss mRNA上のイントロンの位置は、三角形グリフで示される。標的領域(442bp)のPCR増幅用フォワード及びリバースプライマーの位置。2つの操作されたTALEN対、Kiss1.1a及びKiss1.1bに対する結合部位を黒色及び灰色のボックスで示す。パネルbはキスペプチン−10生物活性ペプチドの位置並びに各kiss1.1a及び1b TALEN認識部位を示す標的kissゲノム領域の概略図を示す。インデル分析用のPCR(442bp)及びqPCRプライマー対(138bpアンプリコン)も同様に示す。
図8に関連して、kiss遺伝子の構造上の構成は保存されており、一方がシグナルペプチドとキスペプチン前駆体の一部との両方をコードし、他方がキスペプチン−10配列を含む前駆体の残りの部分をコードする2つのコードエクソンを含む。テラピアKiss mRNA上のイントロンの位置は、三角形グリフで示される。標的領域(442bp)のPCR増幅用フォワード及びリバースプライマーの位置。2つの操作されたTALEN対、Kiss1.1a及びKiss1.1bに対する結合部位を黒色及び灰色のボックスで示す。パネルbはキスペプチン−10生物活性ペプチドの位置並びに各kiss1.1a及び1b TALEN認識部位を示す標的kissゲノム領域の概略図を示す。インデル分析用のPCR(442bp)及びqPCRプライマー対(138bpアンプリコン)も同様に示す。
実施例14 魚におけるKiss及びKissRノックアウト
A.TALEN発現ベクターの構築
A.TALEN発現ベクターの構築
B.TALEN mRNA合成
pT3Ts−TALENのMINIPREP DNAを200μL反応物において5〜10×単位のSacI−ハイフィデリティで2時間消化した。8μL RNAsecure(Ambion)で制限消化を処理し、60℃で10分間インキュベートした。RNAsecure処理したDNAを、QiagenからのMINIELUTE PCRクリーンアップキットを使用して精製し、10μLのRNアーゼ不含注射緩衝液(5mMトリスCl、pH7.5;0.1mM EDTA)に溶出した。mMESSAGE MACHINE T3キット(Ambion)を使用し、1ugの線状化した鋳型を使用して合成mRNAを産生し、37℃で1.5時間インキュベートした。Turbo DNアーゼで15分間処理した後、Ambion MEGACLEARキットを使用してmRNAを精製し、50μLの加熱H2Oで2回溶出した。
pT3Ts−TALENのMINIPREP DNAを200μL反応物において5〜10×単位のSacI−ハイフィデリティで2時間消化した。8μL RNAsecure(Ambion)で制限消化を処理し、60℃で10分間インキュベートした。RNAsecure処理したDNAを、QiagenからのMINIELUTE PCRクリーンアップキットを使用して精製し、10μLのRNアーゼ不含注射緩衝液(5mMトリスCl、pH7.5;0.1mM EDTA)に溶出した。mMESSAGE MACHINE T3キット(Ambion)を使用し、1ugの線状化した鋳型を使用して合成mRNAを産生し、37℃で1.5時間インキュベートした。Turbo DNアーゼで15分間処理した後、Ambion MEGACLEARキットを使用してmRNAを精製し、50μLの加熱H2Oで2回溶出した。
C.TALEN対のマイクロインジェクション
各TALENアームをコードするRNAを組み合わせ、10〜200ng/μLの濃度のヌクレアーゼ不含水に再懸濁した。5〜20pLを1細胞期のテラピア胚に注入した。受精後6日目に非注入対照群に対する注入胚の生存を計測した。50%生存率を与えるRNA濃度を反復/標準注入に使用してノックアウトを生成した。注入胚がTALENの導入による突然変異生成によって死亡したことを確認するため、変形した胚を収集し、標的部位の突然変異を、QPCR融解プロファイル解析を用いて調べた。
各TALENアームをコードするRNAを組み合わせ、10〜200ng/μLの濃度のヌクレアーゼ不含水に再懸濁した。5〜20pLを1細胞期のテラピア胚に注入した。受精後6日目に非注入対照群に対する注入胚の生存を計測した。50%生存率を与えるRNA濃度を反復/標準注入に使用してノックアウトを生成した。注入胚がTALENの導入による突然変異生成によって死亡したことを確認するため、変形した胚を収集し、標的部位の突然変異を、QPCR融解プロファイル解析を用いて調べた。
D.対照及びRNA処理テラピアの組織採取及びDNA抽出
6日齢のRNA処理胚(変形)を絨毛膜除去処理して麻酔し、カミソリの刃を使用して卵黄嚢を取り除いた。胚組織を溶解緩衝液(10mMトリス、10mM EDTA、200mM NaCl、0.5%SDS、100mg/mlプロテイナーゼK)中で一晩消化し、自動Research X−tractor、Corbettロボットシステムでwhatman(商標)ユニフィルター800、96ウェルプレート(GE Healthcare、英国)を使用して抽出した。マイクロインジェクションを生き残り且つ正常に発達した胚(約50%の生存率を有する群のもの)を1ヶ月齢まで育て、麻酔した;鰭を切り取って個別のジャーに入れ、一方でその鰭DNAを分析した(上記に記載したとおり溶解緩衝液中で一晩消化し、続いてDNA抽出)。kiss又はkissR遺伝子座に体細胞突然変異を有するG0雄から精子を搾出し、DNAzol試薬(Life Technolgies)を使用して標準的手順に従いgDNAを抽出した。抽出したDNAを30μlのMQ H2Oに再懸濁した。
6日齢のRNA処理胚(変形)を絨毛膜除去処理して麻酔し、カミソリの刃を使用して卵黄嚢を取り除いた。胚組織を溶解緩衝液(10mMトリス、10mM EDTA、200mM NaCl、0.5%SDS、100mg/mlプロテイナーゼK)中で一晩消化し、自動Research X−tractor、Corbettロボットシステムでwhatman(商標)ユニフィルター800、96ウェルプレート(GE Healthcare、英国)を使用して抽出した。マイクロインジェクションを生き残り且つ正常に発達した胚(約50%の生存率を有する群のもの)を1ヶ月齢まで育て、麻酔した;鰭を切り取って個別のジャーに入れ、一方でその鰭DNAを分析した(上記に記載したとおり溶解緩衝液中で一晩消化し、続いてDNA抽出)。kiss又はkissR遺伝子座に体細胞突然変異を有するG0雄から精子を搾出し、DNAzol試薬(Life Technolgies)を使用して標準的手順に従いgDNAを抽出した。抽出したDNAを30μlのMQ H2Oに再懸濁した。
E.QPCRによる突然変異の同定
ROTOR−GENE RG−3000リアルタイムPCRシステム(Corbett Research)でリアルタイムqPCRを実施した。各0.4μM濃度のフォワード及びリバースプライマー及び7.5μLの2×Brilliant II SYBR GREEN QPCRマスターミックス(Agilent Technologies)を含有する総容積15μL中、6μLのゲノムDNA(gDNA)鋳型(1ng/μlに希釈)を使用した。DNAstarソフトウェアを使用してqPCRプライマーを設計した(表1)。95℃で15秒、60℃で60秒の40サイクルを使用してqPCRを実施し、続いて融解曲線分析によりアッセイの特異性を確認した(67℃から97℃)。この手法では、標的とするkiss及びkissr遺伝子座におけるDNA多型の発生を検出するため、目的の領域を含む短いPCRアンプリコン(約100〜140bp)をgDNA試料から生成し、温度依存性解離に供する(融解曲線)。鋳型gDNAにTALEN誘導性多型が存在する場合、ヘテロ二重鎖並びに種々のホモ二重鎖分子が形成される。融解プロファイルにより複数の形態の二重鎖分子の存在が検出され、二重鎖の融解が単一種として働くのか、それとも2つ以上の種として働くのかが示される。概して、融解曲線及び融解温度の対称性からdsDNA配列の均質性及びその長さが推測される。例えば、NHEJによるTALEN誘導性DSBの修復で生じる小さい挿入又は欠失が生成される場合、その融解温度は、塩基間の水素結合を切断するのに要するエネルギーに比例して、欠失又は挿入の長さと正の相関を有する。複数の形態の二重鎖分子が存在する場合、温度依存的変性によって最も不安定なヘテロ二重鎖及び最も安定したホモ二重鎖が共に検出され、変化した(非対称な)融解プロファイルをもたらす。並行して同じマスターミックス反応物で増幅される基準DNA試料(非注入テラピア対照由来又は目的のゲノム領域を含有するプラスミド)との比較により、融解分析を実施する。簡単に言えば、融解プロファイルの差異によってTALEN誘導性突然変異を有する配列が野生型配列と区別され、従ってスクリーニングが促進される。
ROTOR−GENE RG−3000リアルタイムPCRシステム(Corbett Research)でリアルタイムqPCRを実施した。各0.4μM濃度のフォワード及びリバースプライマー及び7.5μLの2×Brilliant II SYBR GREEN QPCRマスターミックス(Agilent Technologies)を含有する総容積15μL中、6μLのゲノムDNA(gDNA)鋳型(1ng/μlに希釈)を使用した。DNAstarソフトウェアを使用してqPCRプライマーを設計した(表1)。95℃で15秒、60℃で60秒の40サイクルを使用してqPCRを実施し、続いて融解曲線分析によりアッセイの特異性を確認した(67℃から97℃)。この手法では、標的とするkiss及びkissr遺伝子座におけるDNA多型の発生を検出するため、目的の領域を含む短いPCRアンプリコン(約100〜140bp)をgDNA試料から生成し、温度依存性解離に供する(融解曲線)。鋳型gDNAにTALEN誘導性多型が存在する場合、ヘテロ二重鎖並びに種々のホモ二重鎖分子が形成される。融解プロファイルにより複数の形態の二重鎖分子の存在が検出され、二重鎖の融解が単一種として働くのか、それとも2つ以上の種として働くのかが示される。概して、融解曲線及び融解温度の対称性からdsDNA配列の均質性及びその長さが推測される。例えば、NHEJによるTALEN誘導性DSBの修復で生じる小さい挿入又は欠失が生成される場合、その融解温度は、塩基間の水素結合を切断するのに要するエネルギーに比例して、欠失又は挿入の長さと正の相関を有する。複数の形態の二重鎖分子が存在する場合、温度依存的変性によって最も不安定なヘテロ二重鎖及び最も安定したホモ二重鎖が共に検出され、変化した(非対称な)融解プロファイルをもたらす。並行して同じマスターミックス反応物で増幅される基準DNA試料(非注入テラピア対照由来又は目的のゲノム領域を含有するプラスミド)との比較により、融解分析を実施する。簡単に言えば、融解プロファイルの差異によってTALEN誘導性突然変異を有する配列が野生型配列と区別され、従ってスクリーニングが促進される。
F.マイクロインジェクションしたテラピアの体細胞又は生殖細胞における突然変異率の計算及びTALEN誘導性突然変異の特徴付け
体細胞又は生殖細胞gDNAが非対称のqPCR融解プロファイルを生じた魚(候補突然変異体)をさらに分析し、突然変異誘発頻度を計測した。標的部位(Kissについては442bp及びKissRについては720bp)を含有するゲノムPCR産物を鰭DNA又は精子DNAから得た。120〜180ngの鋳型gDNA、0.1μlのPlatinum Taq DNAポリメラーゼ、0.2mM dNTP、1×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液、2mM Mg2+、及び0.2μMの各プライマーを含有する25μL反応混合物でPCRを実行した。DNA増幅を以下の条件下で行った:95℃で5分、続いて94℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で45秒を35サイクルと、最終伸長72℃で2分。PCR産物をTOPO 2.1 TAベクター(Invitrogen)にクローニングし、コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(ONE SHOT、Top 10F’、Invitrogen)に形質転換した。滅菌ピペットの先端で形質転換体コロニーをランダムにピッキングし、個々のqPCR反応チューブに直接移した後、再び選択的寒天培地に播いた。目的のTALEN標的部位に跨るプライマーを使用してqPCRを実施した(100〜140bpアンプリコン)。特異的な産物増幅を示すQPCR反応物を基準DNA試料対照(野生型配列)と比較して融解プロファイル変異体を同定した(図10パネルc及びd)。DNA突然変異率を、突然変異配列の数(変異融解を有するコロニー)を分析した配列の総数で除して100を乗じたものとして計算した。標的遺伝子座に存在する突然変異を可視化するため、個々の体細胞又は精細胞を表すクローンを、Ct対融解温度の散布図に表示した(例えば図10パネルdを参照こと)。これらのグラフでは、各大腸菌(E.coli)コロニーがデータ点(x,y)によって表され、xがそのCtを表し、yがその融解を表す。同一の配列を有する個々のコロニーは同程度の融解温度を示すはずである。変異融解温度を示すコロニーを一晩成長させ、そのプラスミドを抽出して精製した(MINIPREPARATIONキット、QUIAGEN)。次にTALEN標的部位を含有する領域を、指示するとおり、kiss及びkissR領域用に選択したプライマーを使用して配列決定した。F1及びF2魚において突然変異を特徴付けるため、標的kiss1.1a及びKissRE3遺伝子座を含む442bp及び702bpアンプリコンをシリカ膜ベースのスピンカラム(QIAQUICK PCR精製キット、QIAGEN)で精製した。精製したPCRを、内部プライマー(KissRF)を使用して直接配列決定した。
体細胞又は生殖細胞gDNAが非対称のqPCR融解プロファイルを生じた魚(候補突然変異体)をさらに分析し、突然変異誘発頻度を計測した。標的部位(Kissについては442bp及びKissRについては720bp)を含有するゲノムPCR産物を鰭DNA又は精子DNAから得た。120〜180ngの鋳型gDNA、0.1μlのPlatinum Taq DNAポリメラーゼ、0.2mM dNTP、1×Taq DNAポリメラーゼ緩衝液、2mM Mg2+、及び0.2μMの各プライマーを含有する25μL反応混合物でPCRを実行した。DNA増幅を以下の条件下で行った:95℃で5分、続いて94℃で30秒、55℃で30秒、及び72℃で45秒を35サイクルと、最終伸長72℃で2分。PCR産物をTOPO 2.1 TAベクター(Invitrogen)にクローニングし、コンピテント大腸菌(E.coli)細胞(ONE SHOT、Top 10F’、Invitrogen)に形質転換した。滅菌ピペットの先端で形質転換体コロニーをランダムにピッキングし、個々のqPCR反応チューブに直接移した後、再び選択的寒天培地に播いた。目的のTALEN標的部位に跨るプライマーを使用してqPCRを実施した(100〜140bpアンプリコン)。特異的な産物増幅を示すQPCR反応物を基準DNA試料対照(野生型配列)と比較して融解プロファイル変異体を同定した(図10パネルc及びd)。DNA突然変異率を、突然変異配列の数(変異融解を有するコロニー)を分析した配列の総数で除して100を乗じたものとして計算した。標的遺伝子座に存在する突然変異を可視化するため、個々の体細胞又は精細胞を表すクローンを、Ct対融解温度の散布図に表示した(例えば図10パネルdを参照こと)。これらのグラフでは、各大腸菌(E.coli)コロニーがデータ点(x,y)によって表され、xがそのCtを表し、yがその融解を表す。同一の配列を有する個々のコロニーは同程度の融解温度を示すはずである。変異融解温度を示すコロニーを一晩成長させ、そのプラスミドを抽出して精製した(MINIPREPARATIONキット、QUIAGEN)。次にTALEN標的部位を含有する領域を、指示するとおり、kiss及びkissR領域用に選択したプライマーを使用して配列決定した。F1及びF2魚において突然変異を特徴付けるため、標的kiss1.1a及びKissRE3遺伝子座を含む442bp及び702bpアンプリコンをシリカ膜ベースのスピンカラム(QIAQUICK PCR精製キット、QIAGEN)で精製した。精製したPCRを、内部プライマー(KissRF)を使用して直接配列決定した。
G.ファウンダースクリーニング
全ての推定上のファウンダーから配偶子を搾出し、WTストックから回収した配偶子との体外受精からF1胚を産生した。受精3週間後、F1子孫の鰭を切り取り、個別のジャーに別々に保存した。先述のとおり鰭DNAを抽出し(上記の組織採取及びDNA抽出の節を参照)、分光光度計NANODROP ND1000)を使用して1ng/μlに調整した。一般に、各潜在的ファウンダーから10〜20匹の幼魚を、上記に記載した融解分析戦略を用いてQPCRによりスクリーニングした。配列の確認には、単一の胚/幼魚のゲノムDNAを増幅し、PCR産物を精製後に塩基配列決定にかけた。
全ての推定上のファウンダーから配偶子を搾出し、WTストックから回収した配偶子との体外受精からF1胚を産生した。受精3週間後、F1子孫の鰭を切り取り、個別のジャーに別々に保存した。先述のとおり鰭DNAを抽出し(上記の組織採取及びDNA抽出の節を参照)、分光光度計NANODROP ND1000)を使用して1ng/μlに調整した。一般に、各潜在的ファウンダーから10〜20匹の幼魚を、上記に記載した融解分析戦略を用いてQPCRによりスクリーニングした。配列の確認には、単一の胚/幼魚のゲノムDNAを増幅し、PCR産物を精製後に塩基配列決定にかけた。
2つの同時読み取りを示すPCRの塩基配列決定クロマトグラフィーは、インデルの存在を示す。欠失又は挿入の始端は、典型的には配列読み取りが一致しなくなるときに始まる。次に二重配列の慎重な分析によりユニークなヌクレオチドリードが検出される(図12パネルaを参照)。次に、ユニークなヌクレオチドリードのパターンを、野生型配列がそれ自体に対して増分的にシフトすることから生じる人工的な単一のリードパターンの連続に対して分析する。
H.操作されたTALENの突然変異誘発能
操作されたTALEN及び各ヘテロ二量体TALENをコードする合成のキャッピングされたmRNAを共に10〜250ng/μlの種々の濃度で1細胞期テラピア胚に注入した。次に本発明者らは、受精後6日目(dpf)に注入胚を観察した。10ng未満のTALENを注入した胚は正常に発育した一方、200ng(Kiss1a)及び100ng(KissRE3)の用量は最大50%の死亡又は変形胚を生じた。kiss1.1b及びkissRE2についての250ngの用量は30%未満の死亡率を生じた。5日目、注入胚を正常に発育したものと、形態学的変形を有するものとに分けた。突然変異のエビデンスを確かめるため、ゲノムDNAを各TALEN処理群については3つの変形胚のプールから、及び非注入対照群からは3つの正常胚から単離した。ゲノムDNAは標的遺伝子座のQPCR融解分析に使用した。kiss1.1a及びkissRE3遺伝子座(データは示さず)を標的化するTALENで処理した胚のプールにおいて非対称の融解プロファイルが認められたが、他の2つのTALEN対で処理した胚では認められなかった。
操作されたTALEN及び各ヘテロ二量体TALENをコードする合成のキャッピングされたmRNAを共に10〜250ng/μlの種々の濃度で1細胞期テラピア胚に注入した。次に本発明者らは、受精後6日目(dpf)に注入胚を観察した。10ng未満のTALENを注入した胚は正常に発育した一方、200ng(Kiss1a)及び100ng(KissRE3)の用量は最大50%の死亡又は変形胚を生じた。kiss1.1b及びkissRE2についての250ngの用量は30%未満の死亡率を生じた。5日目、注入胚を正常に発育したものと、形態学的変形を有するものとに分けた。突然変異のエビデンスを確かめるため、ゲノムDNAを各TALEN処理群については3つの変形胚のプールから、及び非注入対照群からは3つの正常胚から単離した。ゲノムDNAは標的遺伝子座のQPCR融解分析に使用した。kiss1.1a及びkissRE3遺伝子座(データは示さず)を標的化するTALENで処理した胚のプールにおいて非対称の融解プロファイルが認められたが、他の2つのTALEN対で処理した胚では認められなかった。
突然変異の存在を確認するため、各群20〜40匹の正常に発育した幼魚をQPCR融解分析によりアッセイした。TALEN KissR−E2及びKiss1.1b mRNAを注入した魚はいずれも変異融解を生じなかったことから、突然変異が作成されなかったか、或いは突然変異が検出可能な融解変異を生じなかったことが示唆される。それにも関わらず、kiss1.1a及びKissRE3遺伝子座の各々につき4匹ずつの、合計8匹の変異融解プロファイルを生じる魚が認められた(図10パネルa及びパネルb)。観察された融解変異が野生型と標的部位に微小挿入又は欠失を有するNHEJ産物との混合物から生じることを確認するため、各標的領域(Kissについては442bp及びKissRについては702bp)をPCR反応で増幅した。得られたPCR断片をTopo TAベクターにクローニングし、形質転換体コロニーをダイレクトリアルタイムPCRによりスクリーニングした。試験した各魚につき14〜21個の大腸菌(E.coli)形質転換体コロニーを(ランダムに)ハンドピッキングし、Q−PCR反応混合物に直接(DNA精製なしに)加えた。
突然変異対立遺伝子を有するコロニーを、野生型非改変配列と比較することにより同定した。変異融解プロファイルを有するコロニーが50〜91%の範囲の高頻度で検出された(図10パネルc及びd)。
これらの傷害の一部を特徴付けるため、変異アンプリコンを産生したクローン由来のプラスミドを抽出し、PCRインサートを配列決定した。各TALEN処理群につき4〜7個のクローンを配列決定し、1個を除く全てが変異対立遺伝子を有した。全8匹のTALEN処理魚からkiss及びkissr遺伝子における合計14個の異なる体細胞突然変異が検出された(Kiss1.1a遺伝子座に8個及びKissRE3遺伝子座に6個)。9個の異なるヌクレオチド欠失、2個の挿入、及び3個のヌクレオチド挿入と欠失との組み合わせが観察された(図11パネルa及びb)。RT−PCR融解分析により、3bp程の小さい欠失/挿入が検出可能であった。TALEN誘導性突然変異はRNA処理魚では複数回起こり、モザイク体細胞突然変異をもたらすことが観察された(下表参照)。
融解変異を示すコロニーからの配列の95%超が突然変異を有することが見出されたことから、変異融解を生じるクローンの頻度を計測することによりDNA突然変異率を近似し得ることが示される。従って、突然変異率は魚に応じて35%〜91%であると計算された。この結果は、予想したゲノム位置への標的インデルの極めて効率的な導入を示している。
表「体細胞突然変異スクリーニング結果の概要」は、TALEN注入テラピアに関する結果を示す。第2列は、インデルのサイズを含め、体細胞において同定された突然変異配列を示し(+、挿入;−、欠失)、得られたタンパク質配列改変を括弧内に示す。最終列に、変異融解温度を生じるコロニーの頻度から各魚の推定体細胞突然変異率を計算した。
I.TALEN突然変異の配列分析
異なるタイプのヌクレオチド突然変異のうち、5つ及び6つがフレームシフトを引き起こし、それぞれkiss及びkissr遺伝子における未成熟終止コドンの生成をもたらした。また、全4匹のTALEN処理魚で独立して起こったKiss1.1a遺伝子座における12nt欠失も高頻度にあった。この突然変異は4アミノ酸(AA)の欠損をもたらす。
異なるタイプのヌクレオチド突然変異のうち、5つ及び6つがフレームシフトを引き起こし、それぞれkiss及びkissr遺伝子における未成熟終止コドンの生成をもたらした。また、全4匹のTALEN処理魚で独立して起こったKiss1.1a遺伝子座における12nt欠失も高頻度にあった。この突然変異は4アミノ酸(AA)の欠損をもたらす。
F0 TALEN変異テラピアを性的に成熟するまで育て、その性別を決定した。TALEN処理魚が遺伝的突然変異を誘導し得ることを示すため;各排精動物の精液からゲノムDNAを抽出し、スクリーニングした。先述のとおり、変異融解プロファイルを示すクローンの頻度によって、突然変異を有する精子の頻度を決定した。精子に関連する傷害を特徴付けるため、変異融解を有するコロニーからプラスミドを抽出し、配列決定した。50%〜91%の範囲の生殖系列突然変異頻度が観察された。配列から、各魚生殖系列に複数のインデルが存在することが明らかになった。
J.kiss及びkissR遺伝子座における生殖系列突然変異の分析
Kiss及びkissR TALENが生殖系列に突然変異を有効に誘導したことをさらに実証するため、8匹のファウンダーを野生型ストックと異種交配させた。8匹のTALEN処理魚全てが繁殖能を有し、生存可能な胚のクラッチを産生した。これらの子孫を育て、変異対立遺伝子の存在についてスクリーニングした。8匹のファウンダー全てが遺伝的突然変異を伝達することができた。分析は初め、推定突然変異を有する子孫の割合が、F1鰭DNA抽出物のQPCR融解プロファイル分析によって測るとき、16%〜90%の範囲であったことを示した。予想どおり、TALEN処理親におけるモザイク現象の程度と突然変異を有する子孫の頻度との間には正の相関があった。変形融解プロファイルを生じる選択された遺伝子配列の分析は全て、種々の誘導されたインデル突然変異を明らかにし、その一部は以前ファウンダーの体細胞組織に認められたものであった(図12パネルb)。さらに、野生型融解を生じるF1魚の塩基配列決定は全て、野生型配列を明らかにした。単一のファウンダーから2種以上の遺伝的突然変異が多く観察されたことから、それらの突然変異が同じ動物内の異なる生殖細胞で独立して起こったことが示唆される。遺伝した突然変異には、サイズが3〜18bpの範囲の欠失が含まれた(図12パネルb)。全4匹のkiss突然変異体ファウンダーの子孫では、遺伝した突然変異は、4個及び6個のAAの欠損をもたらした12nt及び18ntの欠失のみであった。しかしながらこれらの欠失はフレームシフト突然変異をもたらしておらず、kiss−10ペプチドの最もC末端側の領域において1個又は3個のいずれかのAAを取り除く(図12パネルc)。このコア配列は脊椎動物全体にわたるkissRシグナル伝達経路の活性化に必須且つ十分であることが分かったため、それらの突然変異は機能喪失表現型を生じるものと思われた。また、これまでファウンダーでは単離されなかったkissRE3遺伝子座にフレームシフト突然変異が同定された。全てのフレームシフト突然変異が未成熟終止コドンをもたらし、KissRタンパク質のC末端部分から172AA〜最大215AA(Δ7nt、図12パネルc)が取り除かれた。タンパク質配列の実に57%を取り除くこれらの突然変異は遺伝子機能を不活性化し得る。幼魚F1子孫の間で同定された全てのkiss及びkissr突然変異が、ヘテロ接合状態で生存可能であった。
Kiss及びkissR TALENが生殖系列に突然変異を有効に誘導したことをさらに実証するため、8匹のファウンダーを野生型ストックと異種交配させた。8匹のTALEN処理魚全てが繁殖能を有し、生存可能な胚のクラッチを産生した。これらの子孫を育て、変異対立遺伝子の存在についてスクリーニングした。8匹のファウンダー全てが遺伝的突然変異を伝達することができた。分析は初め、推定突然変異を有する子孫の割合が、F1鰭DNA抽出物のQPCR融解プロファイル分析によって測るとき、16%〜90%の範囲であったことを示した。予想どおり、TALEN処理親におけるモザイク現象の程度と突然変異を有する子孫の頻度との間には正の相関があった。変形融解プロファイルを生じる選択された遺伝子配列の分析は全て、種々の誘導されたインデル突然変異を明らかにし、その一部は以前ファウンダーの体細胞組織に認められたものであった(図12パネルb)。さらに、野生型融解を生じるF1魚の塩基配列決定は全て、野生型配列を明らかにした。単一のファウンダーから2種以上の遺伝的突然変異が多く観察されたことから、それらの突然変異が同じ動物内の異なる生殖細胞で独立して起こったことが示唆される。遺伝した突然変異には、サイズが3〜18bpの範囲の欠失が含まれた(図12パネルb)。全4匹のkiss突然変異体ファウンダーの子孫では、遺伝した突然変異は、4個及び6個のAAの欠損をもたらした12nt及び18ntの欠失のみであった。しかしながらこれらの欠失はフレームシフト突然変異をもたらしておらず、kiss−10ペプチドの最もC末端側の領域において1個又は3個のいずれかのAAを取り除く(図12パネルc)。このコア配列は脊椎動物全体にわたるkissRシグナル伝達経路の活性化に必須且つ十分であることが分かったため、それらの突然変異は機能喪失表現型を生じるものと思われた。また、これまでファウンダーでは単離されなかったkissRE3遺伝子座にフレームシフト突然変異が同定された。全てのフレームシフト突然変異が未成熟終止コドンをもたらし、KissRタンパク質のC末端部分から172AA〜最大215AA(Δ7nt、図12パネルc)が取り除かれた。タンパク質配列の実に57%を取り除くこれらの突然変異は遺伝子機能を不活性化し得る。幼魚F1子孫の間で同定された全てのkiss及びkissr突然変異が、ヘテロ接合状態で生存可能であった。
K.F1及びF2世代
F1ヘテロ接合突然変異体は、発育させ続けたときにも形態異常を示さず、全て両性の繁殖能を有する成体に分化した。性的に成熟したF1世代に生殖表現型が存在しないことは、選択した突然変異体の全ての体細胞に各標的遺伝子の野生型対立遺伝子が存在することを考えれば予想外というわけではない。不活性化表現型の特徴付けは、ホモ接合状態(又は化合物ヘテロ接合状態)の関連する機能喪失型突然変異を有する魚ではF2世代においてのみ可能である。ホモ接合突然変異を生成するため、F1ヘテロ接合突然変異体から収集した精子及び卵を使用してF2世代を産生し、それらは成長させているところである;これらのF2世代は、出願時点では、通常予想される性的成熟時期以前の年齢である。
F1ヘテロ接合突然変異体は、発育させ続けたときにも形態異常を示さず、全て両性の繁殖能を有する成体に分化した。性的に成熟したF1世代に生殖表現型が存在しないことは、選択した突然変異体の全ての体細胞に各標的遺伝子の野生型対立遺伝子が存在することを考えれば予想外というわけではない。不活性化表現型の特徴付けは、ホモ接合状態(又は化合物ヘテロ接合状態)の関連する機能喪失型突然変異を有する魚ではF2世代においてのみ可能である。ホモ接合突然変異を生成するため、F1ヘテロ接合突然変異体から収集した精子及び卵を使用してF2世代を産生し、それらは成長させているところである;これらのF2世代は、出願時点では、通常予想される性的成熟時期以前の年齢である。
さらなる説明
1.性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、遺伝子の不活性化により動物が性的に成熟することが阻止されている遺伝子改変家畜動物。2.遺伝子の不活性化が、性成熟遺伝子をコードする配列及び/又はそのシス調節エレメントにおける1つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換を含む、1の家畜動物。3.不活化遺伝子が、動物のゲノムからのその遺伝子の少なくとも一部分の除去、その遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するような遺伝子の改変、又はトランス作用因子により不活性化される、1の家畜動物。4.遺伝子がトランス作用因子により不活性化され、前記トランス作用因子が干渉性RNA及びドミナントネガティブ因子からなる群から選択され、前記トランス作用因子が外来遺伝子又は内在性遺伝子により発現する、3の家畜動物。5.トランス作用因子がGPR54のドミナントネガティブを含む、4の家畜動物。6.遺伝子の不活性化が誘導性システムの制御下にある、1〜5の家畜動物。7.誘導性システムが、Tet−On、Tet−Off、Cre−lox、及びHif1αからなる群のメンバーを含む、6の家畜動物。8.動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、及び魚からなる群から選択される、1〜7の家畜動物。9.性成熟遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、1〜8の家畜動物。10.動物が組換えタンパク質の発現の結果としてある形質をさらに発現する、1〜9の家畜動物。10a.動物が外因性組換えタンパク質をさらに発現する、1〜10の家畜動物。11.形質が、生産形質、体型形質、及び作業性形質からなる群から選択される、10の家畜動物。12a.同じ種の野生型動物が性的に成熟する年齢で性的に未熟である、1〜11の家畜動物。12b.処理なしには遺伝的に成熟することができない、1〜11の家畜動物。
1.性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、遺伝子の不活性化により動物が性的に成熟することが阻止されている遺伝子改変家畜動物。2.遺伝子の不活性化が、性成熟遺伝子をコードする配列及び/又はそのシス調節エレメントにおける1つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換を含む、1の家畜動物。3.不活化遺伝子が、動物のゲノムからのその遺伝子の少なくとも一部分の除去、その遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するような遺伝子の改変、又はトランス作用因子により不活性化される、1の家畜動物。4.遺伝子がトランス作用因子により不活性化され、前記トランス作用因子が干渉性RNA及びドミナントネガティブ因子からなる群から選択され、前記トランス作用因子が外来遺伝子又は内在性遺伝子により発現する、3の家畜動物。5.トランス作用因子がGPR54のドミナントネガティブを含む、4の家畜動物。6.遺伝子の不活性化が誘導性システムの制御下にある、1〜5の家畜動物。7.誘導性システムが、Tet−On、Tet−Off、Cre−lox、及びHif1αからなる群のメンバーを含む、6の家畜動物。8.動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、及び魚からなる群から選択される、1〜7の家畜動物。9.性成熟遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、1〜8の家畜動物。10.動物が組換えタンパク質の発現の結果としてある形質をさらに発現する、1〜9の家畜動物。10a.動物が外因性組換えタンパク質をさらに発現する、1〜10の家畜動物。11.形質が、生産形質、体型形質、及び作業性形質からなる群から選択される、10の家畜動物。12a.同じ種の野生型動物が性的に成熟する年齢で性的に未熟である、1〜11の家畜動物。12b.処理なしには遺伝的に成熟することができない、1〜11の家畜動物。
13.性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合であるゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、従って不活化遺伝子がホモ接合の子孫は性的に成熟することが阻止される、動物。14.性成熟遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、13の動物。
15.細胞又は胚からなる群から選択されるインビトロ生命体であって、性成熟遺伝子の不活性化を含むゲノムを含むインビトロ生命体。16.ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び魚からなる群から選択される細胞又は胚である、15の生命体。17.不活性化が、Gpr54、KiSS1、及びGnRH11からなる群から選択される遺伝子にある、15〜16の生命体。
18.家畜細胞及び家畜胚からなる群から選択される生命体に、細胞の染色体標的部位に特異的に結合して二本鎖DNA切断を生じさせることにより性成熟選択的神経内分泌遺伝子を不活性化する薬剤であって、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Cas9/CRISPR及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される薬剤を導入するステップを含む、家畜動物を作製する方法。19.薬剤が、染色体標的部位に特異的に結合する配列を含むTALEN又はTALEN対であって、第2の二本鎖切断を生じさせるさらなるTALENと組み合わさって遺伝子に二本鎖切断を生じさせるか又は染色体に二本鎖切断を生じさせるTALEN又はTALEN対であり、遺伝子の少なくとも一部分が第1の切断と第2の切断との間に配置される、18の方法。20.生命体にリコンビナーゼを1つ又は複数のTALENと共導入するステップをさらに含む、18〜19の方法。21.薬剤を発現する導入遺伝子が生命体のゲノムに置かれる、19の方法。22.生命体に薬剤を導入するステップが、ペプチドとしての薬剤の直接注入、薬剤をコードするmRNAの注入、薬剤をコードするベクターへの生命体の曝露、及び薬剤をコードするプラスミドの生命体への導入からなる群から選択される方法を含む、18〜21の方法。23.薬剤がリコンビナーゼ融合タンパク質であり、方法が、標的化核酸配列を融合タンパク質と共に導入するステップを含み、標的化核酸配列が染色体部位に対する特異的結合のためリコンビナーゼとフィラメントを形成する、18〜22の方法。24.リコンビナーゼ融合タンパク質がリコンビナーゼ及びGal4を含む、18〜23の方法。25.生命体に核酸を導入するステップをさらに含む、18〜24の方法であって、核酸が生命体のゲノムにおいて二本鎖切断の部位又は第1の切断と第2の切断との間に挿入される、方法。25a.ある配列を有する外来核酸鋳型を生命体に導入するステップをさらに含む、18〜24の方法であって、生命体のゲノムが二本鎖切断の部位でその配列を受け取る、方法。外来鋳型がコピーされても又は実際にゲノムに挿入されてもよく、結果は、それに関する理論がいずれの機構であるかに関係なく同じとなる。この結果は、ゲノムが鋳型の配列を有するというものである。26.核酸が、終止コドン、レポーター遺伝子、及びレポーター遺伝子カセットからなる群のメンバーを含む、18〜25の方法。27.生命体から動物をクローニングするステップをさらに含む、18〜26の方法。28.動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び魚からなる群から選択される、18〜27の方法。29.性成熟遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、18〜28の方法。30.遺伝子の不活性化が誘導性システムの制御下にある、18〜29の家畜動物。
31.動物の性成熟のため動物に薬剤を投与するステップであって、薬剤が動物の遺伝的性成熟不能を補償する、ステップを含む、家畜動物を飼育する方法。32.薬剤がゴナドトロピン又はゴナドトロピン類似体を含む、31の方法。33.性的に成熟した動物を繁殖させて子孫を産生するステップをさらに含む、31〜32の方法。34.動物の遺伝的成熟不能が、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を遺伝的に不活性化した結果である、請求項31〜33の方法。35.不活化遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、34の方法。36.不活化遺伝子が、動物のゲノムからのその遺伝子の少なくとも一部分の除去、その遺伝子によりコードされる機能的因子の発現を阻止するような遺伝子の改変、又はトランス作用因子により不活性化される、34の方法。37.動物が、ウシ、ブタ、ニワトリ、ヒツジ、魚、ウサギ、及びヤギからなる群から選択され、動物への薬剤の投与が処理施設で行われ、及び子孫が処理施設から複数の飼育場所に供給される、31〜36の方法。
Claims (41)
- 家畜動物を作製する方法であって、
家畜細胞及び家畜胚からなる群から選択される生命体に、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を不活性化する薬剤を導入するステップ
を含む方法。 - 前記性成熟遺伝子に選択的な神経内分泌遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 前記薬剤が前記細胞の染色体標的部位に特異的に結合して二本鎖DNA切断を生じさせ、それにより前記性成熟選択的神経内分泌遺伝子が不活性化される、請求項1又は2に記載の方法。
- 前記薬剤が、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Cas9/CRISPR及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤がTALENを含み、前記方法が、前記生命体にリコンビナーゼを前記TALENと共導入するステップをさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤を発現する導入遺伝子が前記生命体のゲノムに置かれる、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記薬剤が前記リコンビナーゼ融合タンパク質であり、前記方法が、標的化核酸配列を前記融合タンパク質と共に導入するステップを含み、前記標的化核酸配列が前記染色体部位に対する特異的結合のため前記リコンビナーゼとフィラメントを形成する、請求項1に記載の方法。
- ある配列を有する核酸鋳型を前記生命体に導入するステップであって、前記生命体の前記ゲノムが前記二本鎖切断の部位で前記配列を受け取るステップをさらに含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記生命体から前記動物をクローニングするステップをさらに含む、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び魚からなる群から選択される、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子の前記不活性化が誘導性システムの制御下にある、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1〜11のいずれか一項に記載の方法により作製される遺伝子改変家畜動物。
- 性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化を含むゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、前記遺伝子の前記不活性化により前記動物が性的に成熟することが阻止されている、家畜動物。
- 前記遺伝子の前記不活性化が、
前記性成熟遺伝子をコードする配列及び/又はそのシス調節エレメント
における1つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換
を含む、請求項13に記載の家畜動物。 - 前記遺伝子がトランス作用因子により不活性化され、前記トランス作用因子が干渉性RNA及びドミナントネガティブ因子からなる群から選択され、前記トランス作用因子が外来遺伝子又は内在性遺伝子により発現する、請求項13又は14に記載の家畜動物。
- 前記遺伝子の前記不活性化が誘導性システムの制御下にある、請求項13〜15のいずれか一項に記載の家畜動物。
- 前記動物が、ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、及び魚からなる群から選択される、請求項13〜16のいずれか一項に記載の家畜動物。
- 前記性成熟遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、請求項13〜17のいずれか一項に記載の家畜動物。
- 前記動物が、外因性組換えタンパク質をさらに発現する、請求項13〜18のいずれか一項に記載の家畜動物。
- 処理なしには遺伝的に成熟不能である、請求項13〜19のいずれか一項に記載の家畜動物。
- 細胞、胚、胚盤胞、体細胞、初代細胞、及び始原生殖細胞からなる群から選択される生命体に神経内分泌遺伝子のノックアウトを調製するステップを含む、請求項13〜20のいずれか一項に記載の家畜動物を作製する方法。
- 性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合であるゲノムを含む遺伝子改変家畜動物であって、前記不活化遺伝子がホモ接合の子孫は性的に成熟することが阻止される、動物。
- 前記神経内分泌遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、請求項22に記載の動物。
- 動物の性成熟のため前記動物に薬剤を投与するステップであって、前記薬剤が前記動物の遺伝的性成熟不能を補償する、ステップ
を含む、家畜動物を飼育する方法。 - 前記薬剤がゴナドトロピン又はゴナドトロピン類似体を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記動物の前記遺伝的成熟不能が、性成熟選択的神経内分泌遺伝子を遺伝的に不活性化した結果である、請求項24又は25に記載の方法。
- 前記不活化遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、請求項24〜26のいずれか一項に記載の方法。
- 細胞又は動物胚盤胞からなる群から選択されるインビトロ生命体であって、性成熟遺伝子の不活性化を含むゲノムを含むインビトロ生命体。
- ウシ、ブタ、ヒツジ、ニワトリ、ヤギ、ウサギ、及び魚からなる群から選択される細胞又は胚である、請求項28に記載の生命体。
- 前記細胞が、体細胞、初代細胞、又は始原生殖細胞からなる群から選択される、請求項28又は29に記載の生命体。
- 性成熟選択的神経内分泌遺伝子の不活性化に関してヘテロ接合であるゲノムを有する、請求項28〜30のいずれか一項に記載の生命体。
- 前記神経内分泌遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、請求項28〜31のいずれか一項に記載の生命体。
- 前記遺伝子の前記不活性化が
前記性成熟遺伝子をコードする配列及び/又はそのシス調節エレメント
における1つ以上の塩基の挿入、欠失、又は置換
を含む、請求項28〜32のいずれか一項に記載の生命体。 - 前記遺伝子がトランス作用因子により不活性化され、前記トランス作用因子が干渉性RNA及びドミナントネガティブ因子からなる群から選択され、前記トランス作用因子が外来遺伝子又は内在性遺伝子により発現する、請求項28〜33のいずれか一項に記載の生命体。
- 家畜細胞及び家畜胚からなる群から選択される生命体に、前記細胞の染色体標的部位に特異的に結合する薬剤を導入するステップであって、それにより性成熟選択的神経内分泌遺伝子を不活性化するステップ
を含む、インビトロ生命体を作製する方法。 - 前記薬剤が、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、Cas9/CRISPR及びリコンビナーゼ融合タンパク質からなる群から選択され;及び場合により前記生命体にリコンビナーゼを共導入するステップを含む、請求項35に記載の方法。
- 前記薬剤を発現する導入遺伝子が前記生命体のゲノムに置かれる、請求項35又は36に記載の方法。
- 前記薬剤が前記リコンビナーゼ融合タンパク質であり、前記方法が、標的化核酸配列を前記融合タンパク質と共に導入するステップを含み、前記標的化核酸配列が前記染色体部位に対する特異的結合のため前記リコンビナーゼとフィラメントを形成する、請求項35〜37のいずれか一項に記載の方法。
- ある配列を有する核酸鋳型を前記生命体に導入するステップであって、前記生命体の前記ゲノムが前記二本鎖切断の部位で前記配列を受け取るステップをさらに含む、請求項35〜38のいずれか一項に記載の方法。
- 前記性成熟遺伝子が、Gpr54、Kiss1、及びGnRH11からなる群から選択される、請求項35〜39のいずれか一項に記載の方法。
- 前記遺伝子の前記不活性化が誘導性システムの制御下にある、請求項35〜40のいずれか一項に記載の方法。
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WO2016140353A1 (ja) * | 2015-03-04 | 2016-09-09 | 株式会社 医療実験用大動物供給事業準備会社 | 安定した表現型を示す疾患モデルブタおよびその作製方法 |
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WO2018229521A1 (en) * | 2016-06-16 | 2018-12-20 | Oslo Universitetssykehus Hf | Improved gene editing |
WO2018027078A1 (en) | 2016-08-03 | 2018-02-08 | President And Fellows Of Harard College | Adenosine nucleobase editors and uses thereof |
AU2017308889B2 (en) | 2016-08-09 | 2023-11-09 | President And Fellows Of Harvard College | Programmable Cas9-recombinase fusion proteins and uses thereof |
US11542509B2 (en) | 2016-08-24 | 2023-01-03 | President And Fellows Of Harvard College | Incorporation of unnatural amino acids into proteins using base editing |
WO2018057790A1 (en) | 2016-09-21 | 2018-03-29 | Recombinetics, Inc. | Animal models for cardiomyopathy |
KR20240007715A (ko) | 2016-10-14 | 2024-01-16 | 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 | 핵염기 에디터의 aav 전달 |
GB201617559D0 (en) | 2016-10-17 | 2016-11-30 | University Court Of The University Of Edinburgh The | Swine comprising modified cd163 and associated methods |
WO2018119359A1 (en) | 2016-12-23 | 2018-06-28 | President And Fellows Of Harvard College | Editing of ccr5 receptor gene to protect against hiv infection |
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WO2018165629A1 (en) | 2017-03-10 | 2018-09-13 | President And Fellows Of Harvard College | Cytosine to guanine base editor |
IL269458B2 (en) | 2017-03-23 | 2024-02-01 | Harvard College | Nucleic base editors that include nucleic acid programmable DNA binding proteins |
WO2018209320A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | President And Fellows Of Harvard College | Aptazyme-embedded guide rnas for use with crispr-cas9 in genome editing and transcriptional activation |
US11732274B2 (en) | 2017-07-28 | 2023-08-22 | President And Fellows Of Harvard College | Methods and compositions for evolving base editors using phage-assisted continuous evolution (PACE) |
US11319532B2 (en) | 2017-08-30 | 2022-05-03 | President And Fellows Of Harvard College | High efficiency base editors comprising Gam |
EP3697906A1 (en) | 2017-10-16 | 2020-08-26 | The Broad Institute, Inc. | Uses of adenosine base editors |
CN107760722B (zh) * | 2017-12-07 | 2020-11-06 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种鲟鱼显微注射的方法及应用 |
CN107974466B (zh) * | 2017-12-07 | 2020-09-29 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种鲟鱼CRISPR/Cas9基因编辑方法 |
CN108034675B (zh) * | 2017-12-07 | 2020-10-30 | 北京市水产科学研究所 | 一种鲟鱼talen基因编辑方法 |
MX2021011426A (es) | 2019-03-19 | 2022-03-11 | Broad Inst Inc | Metodos y composiciones para editar secuencias de nucleótidos. |
CN110452995B (zh) * | 2019-08-27 | 2021-06-15 | 浙江大学 | 影响嘉兴黑猪母猪繁殖性能的gpr54基因分子标记及其应用 |
US11203762B2 (en) | 2019-11-19 | 2021-12-21 | Inscripta, Inc. | Methods for increasing observed editing in bacteria |
JP2023525304A (ja) | 2020-05-08 | 2023-06-15 | ザ ブロード インスティテュート,インコーポレーテッド | 標的二本鎖ヌクレオチド配列の両鎖同時編集のための方法および組成物 |
CN111616830A (zh) * | 2020-07-03 | 2020-09-04 | 宁夏大学 | 一种新型icr小鼠超数排卵方法 |
CN113025723B (zh) * | 2021-01-08 | 2023-01-20 | 华中农业大学 | 一种提高绵羊产羔数的snp标记、检测方法及其应用 |
CN112790125B (zh) * | 2021-01-22 | 2022-09-06 | 中国科学院水生生物研究所 | 一种玉兔百褶裙泰狮金鱼的创制方法 |
GB202118058D0 (en) | 2021-12-14 | 2022-01-26 | Univ Warwick | Methods to increase yields in crops |
GB2621813A (en) | 2022-06-30 | 2024-02-28 | Univ Newcastle | Preventing disease recurrence in Mitochondrial replacement therapy |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011019385A1 (en) * | 2009-08-11 | 2011-02-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Organisms homozygous for targeted modification |
WO2011072246A2 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Tal effector-mediated dna modification |
WO2012116274A2 (en) * | 2011-02-25 | 2012-08-30 | Recombinetics, Inc. | Genetically modified animals and methods for making the same |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CA2081660C (en) * | 1991-03-01 | 2001-05-01 | Raymond Dufour | Method for improving the organoleptic qualities of the meat from uncastrated male domestic animals and vaccine set for use in this method |
AU2003262379A1 (en) * | 2002-04-16 | 2003-11-03 | Auburn University | TRANSIENT AND/OR PERMANENT MODIFICATION OF SEXUAL BEHAVIOR AND/OR FERTILITY USING RECOMBINANT CHIMERIC GnRH |
AU2003301569A1 (en) * | 2002-10-25 | 2004-05-13 | Paradigm Therapeutics Limited | Gpr54 knock-out mammals and screening methods using them |
JP2013500018A (ja) * | 2009-07-24 | 2013-01-07 | シグマ−アルドリッチ・カンパニー・リミテッド・ライアビリティ・カンパニー | ゲノム編集のための方法 |
WO2011017315A2 (en) * | 2009-08-03 | 2011-02-10 | Recombinetics, Inc. | Methods and compositions for targeted gene modification |
CA2886161A1 (en) * | 2012-09-29 | 2014-04-03 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Veterinary composition and methods for non-surgical neutering and castration |
-
2013
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2015
- 2015-04-29 PH PH12015500957A patent/PH12015500957A1/en unknown
-
2018
- 2018-10-25 JP JP2018200938A patent/JP2019047794A/ja active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2011019385A1 (en) * | 2009-08-11 | 2011-02-17 | Sangamo Biosciences, Inc. | Organisms homozygous for targeted modification |
WO2011072246A2 (en) * | 2009-12-10 | 2011-06-16 | Regents Of The University Of Minnesota | Tal effector-mediated dna modification |
WO2012116274A2 (en) * | 2011-02-25 | 2012-08-30 | Recombinetics, Inc. | Genetically modified animals and methods for making the same |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
J.MOL.ENDOCRINOL., 2000, VOL. 25, NO. 3, PP. 337-350, JPN6017031640, ISSN: 0004142053 * |
NEW ENGLAND JOURNAL OF MEDICINE, 2009, VOL. 360, NO. 26, PP. 2742-2748, JPN6019041581, ISSN: 0004142052 * |
PNAS, VOL.104(25), PP.10714-10719 (2007), JPN6019041580, ISSN: 0004142051 * |
Cited By (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2020146303A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146311A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146306A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146316A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146312A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146299A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
JP2020146309A (ja) * | 2019-03-14 | 2020-09-17 | 株式会社三洋物産 | 遊技機 |
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