CN105073981A - 动物中性成熟的控制 - Google Patents

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Abstract

一种包含基因组的遗传修饰的家畜动物，所述基因组包含性成熟选择性的神经内分泌基因的失活，所述基因的失活阻止动物性成熟。教导了动物的使用方法，以及生产方法。在优化育种和分娩方面，常规家畜饲养实践关注性成熟在家畜中的作用。

Description

动物中性成熟的控制
对相关申请的交叉引用
本专利申请要求于2012年10月30日提交的美国临时申请第61/720,187号和于2013年8月27日提交的美国临时申请第61/870,510号的优先权，其在此通过引入并入本文。
关于联邦政府支持的研究的声明
本文所记载的工作的方面由国立健康研究所拨款号1R43RR033149-01Al和USDA-国立食品和农业研究所生物技术风险评估项目竞争拨款号2012-33522-19766支持。美国政府可具有本发明的某些权利。
发明领域
技术领域涉及生产和饲养动物(包括家畜)的方法，其中家畜是遗传修饰的，从而它们保持性不成熟的，除非经过处理而变得成熟。
发明背景
在优化育种和分娩方面，常规家畜饲养实践关注性成熟在家畜中的作用。例如，对于牛群而言，已知在性成熟时期管理小母牛可以显著地影响其终生的生产能力且应该精心策划。性发育的最佳过程已经成为许多研究的对象，传统知识认为早于第一年繁殖和产犊的小母牛具有更佳的生存期产量，以及生产总花费的降低成本高达初始产犊。
发明概述
本文提供了一种与传统实践不同的方法，该方法无限期地、永久地延缓家畜(livestock)的性成熟，或直到当经过处理时才性成熟。已经用这些方法处理鱼和猪，这些处理的结果在本文中列出，包括活的克隆的建立者动物(founderanimals)。高效和精确的基因编辑在某些商业上重要的基因座中得以实现。编辑的效率足够高使得无需连锁的选择标记即可做出这些改变。
本发明的一个实施方式为一种含有基因组的遗传修饰的家畜动物，所述基因组包含性成熟选择性的神经内分泌基因的失活(inactivationofaneuroendocrinegeneselectiveforsexualmaturation)，该失活的基因阻止动物性成熟。
本发明的一个实施方式为一种含有基因组的遗传修饰的家畜动物，所述基因组在性成熟选择性的神经内分泌基因的失活上是杂合的，其中失活基因纯合的子代因而被阻止成为性成熟(whereinprogenyhomozygousfortheinacitivatedgenearetherebypreventedfrombecomingsexuallymature)。
本发明的一个实施方式为一种生产家畜动物的方法，包括向选自由家畜细胞和家畜胚胎组成的组的生物(orgainsm)中引入试剂(agent)，其特异结合细胞染色体靶位点并导致双链DNA断裂以失活性成熟选择性的神经内分泌基因，且所述试剂选自由TALEN、锌指核酶和重组酶融合蛋白组成的组。
本发明的一个实施方式为一种饲养家畜动物的方法，包括向动物施用药剂以使动物性成熟，该药剂补偿动物性成熟的遗传失能(withtheagentcompensatingforagenticinabilityoftheanimaltosexuallymature)。
下列专利申请在此通过引用以所有目的并入本文；发生冲突时，本说明书约束：US2010/0146655、US2010/0105140、US2011/0059160、US2011/0197290和US2013/0117870。
附图简述
图1.是生产和使用为了控制成熟而遗传修饰的动物的方法的示例图。
图2：通过测序确认BelgianBlue的基因渗入(introgression)。图示了Wagyu野生型GDF8和BelgianBlue模板(BB-HDR)。用位于同源臂外部的引物(c和d)对5个PCR阳性集落进行PCR，接着进行克隆及用引物b’测序。与野生型序列的比较证实了在5个集落的4个中，存在预期的BelgianBlue等位基因(杂合)特征性的11个碱基对的缺失。
图3：使用mRNA编码的TALENs和ssODN将天然存在的等位基因从一个物种(species)基因渗入到另一个物种。皮埃蒙特肌肉生长抑制素(PiedmonteseMyostatin)等位基因C313Y被基因渗入Ossabaw中。
图4：靶定基因(targetedgene)的修饰。每个图表(chart)展示了靶向成纤维细胞中特定基因座的结果(即，ssIL2RG；“ss”代表野猪(Susscrofa)，且“bt”代表普通牛(Bostaurus))。(插图)寡核酸(oligo)模板的图表(diagrams)，其中阴影框代表TALEN-结合位点且间隔子以白色示出。通过RFLP分析在第3天和第10天检测HDR(Day3％HDR和Day10％HDR)。每个棒展示了三次重复的平均值和SEM。
图5：TALEN刺激的HDR等位基因的序列分析。源于TALENmRNA和经寡核酸转染的细胞群的靶位点侧翼的PCR扩增子(共200-250bp)通过ILLUMINA测序仪测序。每样本的总读取计数从10,000到400,000。完美的预期的HR读数计数相对于野生型测序数据被绘制为插入(小图a)和SNP等位基因(小图b)。在下面表明靶基因座、时间点和是否BMs包括在寡核酸中。小图c)对btGDF8和p65的读数(reads)分选靶SNP的掺入，然后分类目的的(iSNP)与那些具有额外突变的(iSNP+Mut)，并针对总读数进行作图。
图6：具有DAZL和APC的HDR等位基因的克隆猪。(A)分别源于DAZL-和APC-修饰的landrace和Ossabaw成纤维细胞的克隆小猪的RFLP分析。DAZL建立者(founder)的预期RFLP产物为312、242和70bp(空心三角形)，以及对APC的预期RFLP产物为310、221和89bp(实心三角形)。WT和DAZL建立者之间312bp条带大小的差异反映了预期的缺失等位基因。(B)序列分析确定了HDR等位基因存在于8个DAZL建立者中的3个中，以及6个APC建立者中的6个中。供体模板(HDR)中的BMs以箭头表示，且插入的碱基封闭在块中。顶端WT序列中的粗体字表示TALEN结合位点。
图7：猪GPR54和用于敲除的基因靶向策略的图示描述于小图a中。经设计以结合外显子3的TALENs(下划线的文字)和经设计以引入提前终止密码子和HindIII限制位点的寡核酸同源模板(HDR)共转染。小图b：将2微克的TALENs编码mRNA加0.2nMol的HDR模板转染到作为克隆生长的猪成纤维细胞中，并通过HindIIIRFLP检测分析同源性依赖性修复。PCR结果显示：每个道代表一个集落。231和158bp的剪切产物代表同源性依赖性修复。具有389bp亲本条带的集落归类于HDR敲除等位基因杂合子(空心三角形)，不具有389bp亲本条带的的集落归类于HDR敲除等位基因的纯合子(实心三角形)。
图8：小图a：编码罗非鱼亲吻肽(tilapiakisspeptin)的mRNA的核苷酸和推导的翻译氨基酸序列。kiss基因的组织结构是保守的，且包含两个编码外显子，一个编码信号肽和亲吻肽前体的一部分，另一个编码包含亲吻肽10序列的前体剩余部分。用三角形符号表示内含子的位置。示出了用于靶区域(442bp)PCR扩增的正向和反向引物的位置。用黑色和灰色框表示两个修饰的TALEN对(即Kiss1.1a和Kiss1.1b)的结合位点。小图b显示了靶定的kiss基因组区域的图示，所述区域显示亲吻肽10生物活性肽以及每个kiss1.1a和1bTALENs识别位点的位置。也显示了用于插入缺失(indels)分析的PCR(442bp)和qPCR引物对(138bp扩增子)。
图9：小图a：编码罗非鱼GPR-24mRNA的核苷酸和mRNA的推导翻译的氨基酸序列。kissr基因的组织结构是保守的，并包含五个编码外显子。用三角形符号表示所有4个内含子的位置。KissRE2和KissRE3TALENs靶向的基因座分别位于编码外显子2(白色框)和3(灰色框)中。在框中显示了有义左和反义右TALENs识别位点的位置。小图b显示了罗非鱼GPR-24基因组区域的图示，其显示了内含子(Strokedgoalpost)、包含kissRE2和RE4基因座(白色框)的编码外显子2和3(黑色箭头)的位置。还显示了用于PCR和qPCR分析的引物位置以及相应的扩增子的大小。
图10：包含kiss和kissRE3基因座的100-120bpqPCR产物的解链分析。小图a和b显示了扩增子的解链曲线，所述扩增子产生自提取自用kiss1.1a和kissRE3TALENs对处理的鱼鳍的gDNA。普通箭头指示解链数据图表(profile)(小图a)或(小图b)，其显著不同于那些获得自未处理的鱼(虚线箭头)的，并对应于候选突变鱼kiss#41，RE3#1，4，6和11。小图c：从TALEN处理的鱼#41PCR扩增含有靶向Kiss基因座的442bp基因组片段。PCR产物克隆到TOPO2.1TA载体中，且手工挑选转化子集落用于直接QPCR分析。普通箭头指向挑选的来自于集落的解链曲线图形，所述集落含有在kiss基因座上的不同缺失。小图d：为了更好地观察所克隆的各种突变，我们对我们的QPCR集落进行作图，在Cts相对解链温度的散点图上进行筛选，其中每个克隆由数据点(x,y)表示，其中x表示其Ct以及y表示其解链温度。所述图表示包含扩增自鱼RE3#4的702bpPCR片段的集落。低于野生型序列的解链温度均含有kissRE3扩增子，所述扩增子在靶位点具有各种突变。Cts：循环阈值。
图11：由工程化的TALENs在kiss基因(位点kiss1.1a)(小图a)和kissR基因位点(KissRE3)(小图b)诱导的体细胞突变的描述。野生型序列示于每个小图的顶端，其中以粗体深灰色高亮显示有义左和反义右TALEN识别元件位点并以文本下划线高亮显示有义间隔子。缺失用破折号显示以及插入用浅灰高亮的小写字母显示。由每个插入缺失突变引起的长度的净变化在每个序列的右侧(+，插入；－，缺失)。一些改变具有序列的缺失和插入两种。分离每个突变的等位基因的次数显示于括号中。
图12：小图a：来自KissRE3#11系的两个同胞子代(siblingprogeny)的PCR产物的选择性的测序色谱。这些图表示同时阅读kissRE3突变和WT等位基因突变的存在。框表示与突变和WT等位基因匹配的核苷酸，以及箭头指示序列发生分歧并由此缺失在此开始的位置。为了表征突变，我们分析了序列中独特核苷酸阅读的模式(其中色谱显示上述背景非重复的核苷酸阅读)。通过移码(shift)WT序列和增加缺失序列的大小，我们发现7bp和5bp缺失在这些色谱上重现了单核苷酸阅读的模式。小图b：所有遗传插入缺失突变的描述，所述突变工程化的TALENs在kiss基因(kiss1.1a位点，顶部)和kissr基因(KissRE3位点，底部)诱导。野生型序列示于顶部，并用粗体字浅灰高亮显示有义左和反义右TALEN识别元件以及用下划线文字高亮显示有义间隔子。缺失用破折号显示。由每个插入缺失突变引起的长度上的净变化在每个序列的右侧(－，缺失)。分离每个突变的等位基因的次数示显示于括号内。小图c：在kiss和kissRE3位点处发现的最为严重的损伤的描述。位于kiss1.1a基因座上18nt的缺失导致6AA的缺失(下划线)，其中的3个来自亲吻肽10活性肽的核心序列(灰色高亮)。kissRE3基因座上的7nt的缺失(下划线)导致基因产物的显著改变，所述产物具有紧接着终止密码子的两个氨基酸的替换。获得的蛋白在C-末端由215氨基酸截断。
发明详述
期望以节约环境和能源来源的方式生产家畜。性未成熟的动物通常比成熟或正处于成熟的动物每磅重量消耗更少的食物。一般而言，在成熟前家畜并未达到期望的重量。然而文本所列出的是在成熟前能够生长到期望的大小的动物。
事实上，本文记载了方法，其中动物根本不能性成熟。其可以生长经过正常的成熟年龄而不经历青春期。性未成熟的动物是不育的。由于有性繁殖是成本有效的，并且即使是辅助的生殖技术(ATRs)也需要成熟的动物来提供卵子和精子，因此不育动物的有效率的生产是一项显著的挑战。在一些实施方式中，家畜动物不进入青春期并保持永久的性未成熟，除非特异地处理以使其进入性成熟。在处理诱导成熟后，这种动物可用于育种。
生产不能成熟的家畜的优势在于其不能繁殖。例如，在有性育种或遗传修饰的鱼中，消除了它们意外流入野外的担忧。类似修饰的其它动物也将不能繁殖，从而可以销售具有有价值的遗传性状的动物而不必担心买家对动物的不受控制的育种。此外，在很多农场动物(如牛、禽类和鱼)中，不育将增加产率和肉质，改善脂肪含量、色素和质地。术语母牛(cow)是牛(cattle)的口语术语；牛是大型有蹄类动物，是牛属(genusBos)中最广泛分布的物种。母牛(cow)或牛(cattle)指牛(Bosprimigenius)的成员。且在鱼的情况中，通过生长保存能量而不是性腺发育和性分化，不育的鱼在培养中应表现出更高的性能。目前，通过倍性操作(ploidymanipulation)(特别是三倍性，其添加了一套额外的染色体)不育是唯一的商业上可用于水产养殖者的可升级技术。然而不一致的结果引发了关于该技术效率的关注。另外，一般来说，三倍体诱导经常负面影响处理群体的存活和/或表现。且该技术的应用是高劳动强度的、逻辑上是复杂的和昂贵的。
本发明的一个实施方式为一种含有基因组的遗传修饰的家畜动物，所述基因组包含性成熟选择性的神经内分泌基因的失活，所述基因的失活阻止动物成为性成熟。所述基因选择地针对性成熟过程，如果动物基因敲除，该动物将与野生型动物在其发育上进行比较直到野生型动物经历性成熟的时间为止，所述的发育通过测量大小和体重。术语基因指基因组序列上可定位的区域，对应于遗传单元，其与调控区、转录区和或其它功能序列区域相关。本文所使用的术语基因包括功能序列区域以及那些编码蛋白或其它因子的部分。本文所使用的术语敲除，指直接或间接破坏基因，其失活所产生的蛋白的功能或消除蛋白产品的生产。
由于遗传修饰针对特定基因或基因产物以阻止性成熟，因此成熟所需的因素是已知的并且常规能提供的。
性成熟选择性的神经内分泌基因
可通过阻断性成熟选择性的神经内分泌基因来阻止动物的性发育。当下丘脑开始分泌促性腺激素释放激素(GnRH1)时，启动了性发育、生长加速和肾上腺成熟。基因GnRH1编码GnRH11前体。在哺乳动物中，线性的十肽终产物通常自92氨基酸的前激素原合成。促性腺激素释放激素(GnRH1)，也被称为促黄体生成激素-释放激素(LHRH)和luliberin而知晓，其负责促卵泡激素(FSH)和促黄体生成激素(LH)的释放。GnRH1属于促性腺激素释放激素家族。本发明的实施方式包括在家畜动物中失活GnRH1。可将促性腺激素释放激素或类似物施用给动物以使其性成熟。跨多个物种的GnRH1的序列是已知的，如普通牛(BosTaurus)的基因IDs768325、鸡(Gallusgallus)的770134或猪(Susscrofa)的397516。GPR54，也被称为亲吻肽受体(还被称为GpR54、KissR、KisslR、kissR等)，其结合至激素亲吻肽(之前称为metastin)。亲吻肽是来自KiSS1基因的产物(还称为Kiss、Kissl、KiSS、kissl等)。亲吻肽-GPR54信号(signaling)具有启动GnRH1分泌的作用。亲吻肽是一种具有多种功能的RFamide神经肽，包括各种全身生理系统并在所有水平的生殖轴—脑、垂体、性腺(BPG)和附属器官中起作用。亲吻肽可直接刺激GnRH释放(Messageretal.,2005)、传达类固醇激素正和负反馈信号至GnRH神经元、作为青春期起始的直接参与细胞生长调节(gatekeeper)，和传达光周期信息。
本发明的实施方式包括在家畜动物中失活基因GPR54和/或KiSS1。可施用亲吻肽以弥补KiSS1的丧失并由此实现性成熟。或，抑制KiSS1和/或GPR54，并将促性腺激素释放激素施用到动物中使其性成熟。另一实施方式为通过插入显性负调控GPR54到家畜动物的基因组中来失活亲吻肽-GPR54间的相互作用。显性负调控GPR54的表达干扰了受体的下游信号转导，阻止信号传播和GnRH1的释放。跨多个物种的GPR54的序列是已知的，如人(Homosapiens)的84634、斑马鱼(Daniorerio)的561898或猪(Susscrofa)的733704。跨多个物种的Kiss1的序列是已知的，如普通牛(BosTaurus)的615613、猪(Susscrofa)的733704或绵羊(Ovisaries)的100294562。
Gpr54/Kiss途径在绝大多数脊椎物种中是高度保守的且已知其在人和小鼠中是青春期的直接参与细胞生长调节(Seminaraetal.,2003)。由于人或小鼠中Gpr54和/或Kiss基因失活的不育已经通过异位GnRH施用而恢复。小鼠和人中的研究表明，失活Gpr54有效地导致由于性腺机能减退而产生的两性不育(d'AnglemontdeTassignyetal.,2007；deRouxetal.,2003)。Kiss-Gpr54系统在脊椎动物中是高度保守的(Tena-Sempereetal.,2012)特别是在仅存在一个Kiss和Gpr54基因的哺乳动物中。然而在鱼中确定了多种不同的Kiss基因，在调查的所有物种中除了一个物种外受体Gpr54均由一个基因编码。带有Gpr54突变的人和小鼠所表现出下丘脑GnRH的正常水平，这提示Kiss/Gpr54信号负责释放GnRH进入血流(Seminaraetal.,2003)。这代表了通过直接将GnRH或促性腺激素注射到Gpr54缺陷个体来绕过Kiss/Gpr54信号的机会。的确，Gpr54缺陷的人对GnRH有反应(Seminaraetal.,2003)，这表明青春期的下游信号组分保持完好无损。
在生殖生物学发表物中目前没有鱼亲吻肽作用的直接证据。然而，kiss肽的施用已经显示出刺激垂体促性腺激素基因在性成熟的雌性斑马鱼(Kitahashietal.2008)和石斑鱼中表达，或刺激LH和FSH在欧洲鲈鱼(Felipetal.,2008)和金鱼中的分泌。因此，理论上，可通过外源递送亲吻肽类似物(如亲吻肽10)或促性腺激素类似物(LH或FSH)拯救带有GPR54和/或KiSS敲除的性未成熟和不育鱼的生育。在该概念下，如果施用正确的激素，确保生育的可逆地控制，可以繁育纯合的kiss或kiss受体敲除的亲鱼(knockout-broodstock)。该KO亲鱼的子代继承了改变。这将提供经济和环境益处。
可通过一些方法失活性成熟选择性的神经内分泌基因。基因的失活阻止由该基因编码的功能因子，如蛋白或RNA的表达。一种失活包括在编码性成熟因子和/或启动子和/或操纵子的序列中插入、缺失或取代一个或多个碱基，所述的性成熟因子和/或启动子和/或操纵子在动物中因子的表达是必须的。失活可以是基因的敲除。基因可通过从动物基因组中去除基因的至少一部分、改变基因以阻止由基因编码的功能因子的表达、干扰RNA(由动物的基因组或动物的多个细胞中的基因表达)，或外源基因的显性负调控因子的表达而失活。
另一个可恢复的-不育系统为Tac3/TacR3(Young,J.,Bouligand,J.,Francou,B.,Raffin-Sanson,M.L.,Gaillez,S.,Jeanpierre,M.,Grynberg,M.,Kamenicky,P.,Chanson,P.,Brailly-Tabard,S.,etal.(2010)。TAC3和TACR3缺陷导致人类中下丘脑先天性性腺功能减退。JClinEndocrinolMetab95,2287-2295。对于Kiss/Gpr54，对这些基因缺陷的人表现出性腺机能减退，其通过脉动的(pulsatile)GnRH治疗是可恢复的(Youngetal.,2010)。可使用描述了的或本文参考了的方法失活Tac和/或Tac3。
本发明的实施方式包括在选自由牛、羊、猪、鸡、火鸡、山羊、羊、鱼、水牛、鸸鹋、兔、有蹄类动物、鸟类、鼠类和家畜组成的组的动物中失活一种或多种选自由GnRH1、GPR54、KiSS1、Tac和Tac3组成的组的基因。可在细胞和/或胚胎失活该基因和并且在动物中由此产生。本文中描述了各种方法，如使用TALENs或锌指核酸酶敲除细胞或胚胎中的基因，和克隆和/或在代孕者中植入细胞/胚胎以制备建立者动物。
图1描述了本发明的一种实施方式，在体外修饰牛细胞并用于克隆小牛。可饲养小牛到适合屠宰的重量或使用因素处理小牛以允许其进入成熟期，所述因素为例如促性腺激素类似物或直接提供敲除遗传因子的因素。
实施例1描述了用TALENs系统制造细胞改变的技术。实施例2描述了用于表1结果的稀释克隆(dilutioncloning)技术。实施例3描述了突变检测和RFLP分析技术。实施例4(图2)描述了将11个碱基对缺失基因渗入牛GDF8外显子3(BelgiumBlue突变)。图3描述了类似过程的结果，所述过程为将来自于一个物种的一个等位基因基因渗入另一个物种。实施例5描述了使用寡HDR测试相同以及将等位基因基因渗入牛细胞。在实施例5中，TALEN-诱导的同源重组消除了连锁的选择标记的需要。当单独转染时，btGDF8.1TALEN对在靶位点切割多达16％的染色体。共转染携超螺旋同源DNA修复带有11bp缺失的模板，其导致在期望的事件的未选择下，于第3天0.5到5％的基因转换频率(HDR)。在1.4％的经PCR筛选的分离克隆中鉴定了基因转换，所述PCR是鉴定成功转换的快速方法。实施例6(图4)描述了猪和牛成纤维细胞中4个目的位点的修饰。实施例7(图5)显示了对基因APC、LDLR、p53、p65和btGDF8修饰的分析。实施例8(表1)显示了10-64％(平均，45％)目的插入缺失的恢复率，高达32％的克隆纯合子用于修饰。实施例9(图6)描述了克隆猪，所述克隆猪是用修饰的在azoospermia-like(DAZL)中缺失的和修饰的大肠腺瘤息肉(APC)基因生产的。实施例10(图7)描述了根据指定的基因靶向策略所制备的GPR54敲除；实施例11详述了生产具有GPR54敲除的修饰动物的方法。实施例12描述了使用定制的CRISPR/Cas9核酸内切酶所生产的修饰。
这些结果证实了修饰目的基因而无需连锁的选择标记帮助的技术的有效性。可用带有修饰的细胞克隆动物。可以具有特异性地控制预期的遗传修饰，如基因渗入等位基因或修饰基因。修饰可以是，例如，缺失或插入以破坏基因或敲除它，或替换基因的一部分以生产无功能的基因产物或替代产物。
已经生产了具有KiSS1和GPR54(也称为GPR54、Kiss-受体、KissR、Kiss1R)敲除的鱼(罗非鱼)。图8和9描绘了KISS和GpR54的靶区域。Kiss基因的结构组织是保守的，并且包含2个编码外显子，一个编码信号肽和亲吻肽前体的一部分，另一个编码包含亲吻肽10序列的前体的剩余部分。实施例14详述了用于制备带有Kiss或KissR敲除的建立者鱼的步骤。使用基于TALENs的技术以敲除基因，和使用解链分析以检测插入缺失(图10)。证实了靶基因的各种修饰(图11)，包括9种不同的核苷酸缺失、两种插入和3种核酸插入和缺失的组合。测序表明至少这些修饰中的一些将导致敲除。证实了种系突变(参见图12)。创建和培育了具有Kiss或KissR敲除的F1杂合突变体。期望表现出失活的表型的F2代目前正在生长。
本文公开了生产转基因动物的方法，所述转基因动物仅在目的位点发生改变。此外，该方法可在目的位点产生特定的预期改变。不需要移除由问题所产生的其它变化，所述问题为例如绕过使用连锁的报告基因，或连锁的正和负选择基因，或随机转基因整合的使用。另外，可在建立者代(foundergeneration)中使用该方法以生产仅在目的位点具有预期改变的遗传修饰动物。还公开了其它包括非连锁标记基因以及等等类似的方法。
靶向核酸酶系统
诸如转录激活子样效应因子核酸酶(TALENs)和锌指核酸酶(ZFNs)的基因组编辑工具已经影响了生物技术、基因治疗和多种生物的功能基因组研究领域。最近，RNA引导的核酸内切酶(RGENs)通过互补的RNA分子直达其靶向位点。Cas9/CRISPR系统是REGEN。tracrRNA是另一个这样的工具。这些是靶向核酸酶系统的例子：这些系统具有将核酸酶定位到靶位点的DNA结合成员。然后核酸酶切割所述位点。TALENs和ZFNs具有融合到DNA结合成员的核酸酶。Cas9/CRISPR是在靶DNA上发现彼此的同族(cognates)。DNA结合成员具有在染色体DNA中的同族序列。DNA结合成员一般根据目的同族序列进行设计以在目的位点或附近获得溶核(nucleolytic)功能。某些实施方式无限制地适用于所有这些系统，包括最小化核酸酶再切割的实施方式、精确地在目的残基上制备插入缺失的实施方式，以及在DNA结合位点放置正被基因渗入的等位基因。
TALENs
TALENs是基因工程工具。基因的失活是TALENs多种用途中的一种。本文中使用的术语TALEN是宽泛的，并包括无需其它TALEN辅助即可切割双链DNA的单体TALEN。术语TALEN也指一对TALENs中的一个或全部两个成员，其被改造以在相同位点一起切割DNA。一起工作的TALENs参照DNA的手性(handedness)被称为左TALEN和右TALEN。
生产TALEN修饰的家畜的一个障碍在于，使用常规的最佳实践对动物细胞产生修饰的效率只有百分之几。在目的位点实现缺失或插入并不必然意味着成功，因为其可能不真正创造目的效果，如表达外源蛋白或停止内源蛋白的表达。即使低下的效率对制备遗传修饰的低等动物(如果蝇或小鼠)也可以是有用的，因为它们具有短而多产的繁殖周期，其提供了数百种动物的创造、测试和筛选的，以确定是否存在已经成功修饰的少数个体。然而，这些常规所实现的效率水平并不适合具有更长妊娠时间和每次怀孕相对较少后代的偶蹄动物家畜。于2012年2月24日提交的美国系列号第13/404,662号“遗传修饰的动物及其生成方法”，其在此出于所有目的通过全文引用并入本文(在冲突的情况中，以说明书为准)，提供了解决这些常规限制的方法。
使用TALENs修饰家畜的另一个障碍在于由于原代细胞是不稳定的，因此原代细胞中TALEN介导的DNA修饰是困难的。于2011年2月11日提交的美国公开第2011/0197290号提供了修饰这些细胞的有用的方法，并在出于所有目的通过引用并入本文；在冲突的情况中，以说明书为准。术语原代细胞指分离自活体动物的细胞，其中所述细胞自从组织中分离出已经历0到10次复制。可用TALENs生产遗传修饰的偶蹄类动物原代细胞。通过克隆，这些修饰适于生产遗传修饰的建立者动物。本文还描述了可用于修饰卵子或胚胎的直接胚胎注射，其中修饰的卵子或胚胎适于移植入雌性代孕者以孕育和传递建立者动物系。
Milleretal.(Milleretal.(2011)NatureBiotechnol29：143)报告了通过将TAL截短变体与FokI核酸酶催化结构域连接，生成TALENs，用于位点特异性核酸酶构造。显示了所得的TALEN依靠两种主要的真核DNA修复途径，即非同源末端连接(NHEJ)和同源性指导的修复在永生化人细胞中诱导遗传修饰。可以为了特异性结合而工程化改造TALEN。Milleretal.的TALENS的改进描述于2012年8月24日提交的美国序列号第13/594,694号中。特异性结合(如该术语在生物学领域中通常使用)指与非靶组织相比以相对较高的亲和力结合靶物的分子，并且一般牵涉多种非共价相互作用，诸如静电相互作用、范德华相互作用、氢键键合等。特异性结合相互作用表征抗体抗原结合、酶底物结合、和特异性结合蛋白质-受体相互作用。
己经报告了TAL的密码(PCT申请WO2011/072246)，其中每个DNA结合重复单元负责识别靶DNA序列中的一个碱基对。这些残基经过装配可以靶向DNA序列，其中：(a)HD用于识别C/G；(b)NI用于识别A/T；(c)NG用于识别T/A；(d)NS用于识别C/G或A/T或T/A或G/C；(e)NN用于30识别G/C或A/T；(f)IG用于识别T/A；(g)N用于识别C/G；(h)HG用于识别C/G或T/A；(i)H用于识别T/A；及(j)NK用于识别G/C。简言之，TALEN结合的靶位点是确定的，并且创建了融合分子，所述融合分子包含核酸酶和一系列识别靶位点的RVD。在结合后，核酸酶切割DNA，从而细胞修复机制可以运行以在切割末端产生遗传修饰。术语TALEN意指包含转录激活物样(TAL)效应器结合域和核酸酶域的蛋白质，并且包括本身功能性的单体TALEN及需要与另一单体TALEN二聚化的其它TALEN。二聚化可以在两个单体TALEN相同时生成同二聚体TALEN或者可以在单体TALEN不同时生成异二聚体TALEN。
在一些实施方式中，可以使用单体TALEN。TALEN通常作为具有间隔臂的跨两部分识别位点的二聚体来发挥功能，使得两个TAL效应域各自与FokI限制酶的催化域融合，所得每个TALEN的DNA识别位点被间隔臂序列分开，每个TALEN单体对该识别位点的结合允许FokI二聚化，并且在该间隔臂内创建双链断裂。然而，也可以构建单体TALEN，使得单一TAL效应器与不需要二聚化未发挥功能的核酸酶融合。例如，一种此类核酸酶是FokI的单链变体，其中以单一多肽表达两个单体。其它天然存在的或工程化改造的单体核酸酶也可以满足此作用。用于单体TALEN的DNA识别域可以源白天然存在的TAL效应器。或者，可以将DNA识别域工程化改造成识别特定DNA靶物。工程化的单链TALEN可以更容易构建并展开，因为它们仅需要一个工程化的DNA识别域。可以使用两种不同DNA结合域(例如，一个TAL效应器结合域和一个来自另一类分子的结合域)生成二聚体DNA序列特异性核酸酶。TALEN可以作为具有间隔臂的跨两部分识别位点的二聚体发挥功能。此核酸酶构造也可以用于靶物特异性核酸酶，其例如自一个TALEN单体和一个锌指核酸酶单体生成。在此类情况中，TALEN和锌指核酸酶单体的DNA识别位点可以被合适长度的间隔臂分开。两个单体的结合可以允许FokI二聚化，在该间隔臂序列内创建双链断裂。与锌指不同的DNA结合域，诸如同源结构域(homeodomain)、myb重复单元或亮氨酸拉链也可以与FokI融合，并且充当TALEN单体内的配偶体以创建功能性核酸酶。
在一些实施方案中，可以使用TAL效应器将其它蛋白质域(例如非核酸酶蛋白质域)靶向至特定的核苷酸序列。例如，TAL效应器可以与蛋白质域连接，所述蛋白质域来自但不限于DNA20相互作用酶(例如，甲基化酶、拓扑异构酶、整合酶、转座酶或连接酶)、转录激活物或阻抑物或与其它蛋白质诸如组氨酸相互作用或者修饰其它蛋白质诸如组氨酸的蛋白质。此类TAL效应器融合物的应用包括例如创建或修饰表观遗传调节元件，生成位点特异性插入、缺失或DNA中的修复，控制基因表达，并修饰染色质结构。
可以选择或改变靶序列的间隔臂以调控TALEN特异性和活性。间隔臂长度的柔性指示间隔臂长度可以选择为以高特异性靶向特定序列。此外，己经对不同间隔臂长度观察到活性的变化，指示间隔臂长度可以选择为实现期望水平的TALEN活性。
术语核酸酶包括外切核酸酶和内切核酸酶。术语内切核酸酶指能够水解(切割)在DNA或RNA分子，优选DNA分子内的核酸间的键的任何野生型或变体酶。内切核酸酶的非限制性例子包括II型限制性内切核酸酶诸如FokI、HhaI、HindIII、NotI、BbvCl、EcoRI、BglII和Alwl。内切核酸酶还包括罕见的切割内切核酸酶，其通常具有长度约12-45个碱基对(bp)，更优选14-45bp的多核苷酸识别位点。罕见的切割内切核酸酶在限定的基因座处诱导DNA双链断裂(DSB)。罕见的切割内切核酸酶可以例如是归巢内切核酸酶、来自工程化锌指域与限制酶诸如FokI催化域融合的嵌合锌指核酸酶(ZFN)或化学内切核酸酶。在化学内切核酸酶中，将化学或肽切割剂与核酸聚合物或与识别特定靶序列的另一DNA缀合，由此将切割活性靶向至特定序列。化学内切核酸酶还涵盖合成的核酸酶如邻二氮菲的缀合物、DNA切割分子、和三联体形成寡核苷酸(TFO)，己知其结合特定的DNA序列。依照本发明，术语内切核酸酶中包括此类化学内切核酸酶。此类内切核酸酶的例子包括I-SeeI、I-ChuL、I-CreI、I-CsmI、PI-SeeLPI-TtiLPI-MtuI、I-CeuI、I-SeeIL1-SeeIII、HO、Pi-CivI、PI-CtrLPI-AaeI、PI-BsuI、PI-DhaI、PI-DraLPI-MavLPI-MehI、PI-MfuLPI-MflI、PI-MgaLPI-MgoI、PI-MinLPI-MkaLPI-MleI、PI-MmaI、PI-30MshLPI-MsmI、PI-MthI、PI-MtuI、PI-MxeI、PI-NpuI、PI-PfuLPI-RmaI、PI-SpbI、PI-SspLPI-FaeLPI-MjaI、PI-PhoLPI-TagLPI-ThyI、PI-TkoI、PI-TspI、I-MSoI。
通过TALENs或其它工具制备的遗传修饰可以是，例如选自由插入、缺失、外源核酸片段的插入和取代构成的表。术语“插入”用于泛指字面意义上的插入到染色体或使用外源序列作为模板进行修复。一般来说，靶DNA位点被鉴定并且制备特异性地结合该位点的TALEN对。TALEN被递送到细胞或胚胎，如作为蛋白、mRNA或通过编码TALEN的载体递送。TALEN切割DNA以产生之后被修复的双链的断裂，其通常导致插入缺失的创造，或序列或多态性的合并，所述多态性包含在伴随的外源核酸中，该核酸插入染色体中或作为含有修饰序列的断裂修复的模板。该模板驱动的修饰对于改变染色体是有用的过程，并提供了对细胞染色体的有效改变。
术语外源核酸意指加入到细胞或胚胎的核酸，无论核酸是否与细胞中天然序列相同或不同。术语核酸片段是宽泛的且包括染色体、表达盒、基因、DNA、RNA、mRNA或其部分。细胞或胚胎可以是，例如，选自由家畜、偶蹄动物、牛、猪、羊、山羊、鸡、兔和鱼组成的组。术语家畜指作为食物或生物材料商品饲养的驯化的动物。术语偶蹄目(artiodactyl)指偶蹄目中的有蹄哺乳动物，其包括牛、鹿、河马、羊和山羊，其具有偶数脚趾，每个蹄上通常为两个或有时为四个。
一些实施方式包括生产遗传修饰的家畜和/或偶蹄目的组合物或方法，包括将TALEN对引入家畜和/或偶蹄目细胞或胚胎，生产对所述细胞或胚胎DNA中特异结合TALEN对的位点的遗传修饰，并从所述细胞生产家畜动物或偶蹄目。直接注射可用于细胞或胚胎，如注射入受精卵、囊胚或胚胎。可选地，可使用任何已知技术将TALEN和/或其它因子引入细胞以引入蛋白、RNA、mRNA、DNA或载体。可根据已知步骤从胚胎或细胞生产遗传修饰的动物，例如将胚胎植入怀孕的宿主，或各种克隆方法。术语“对细胞DNA在通过TALEN特异结合的位点的遗传修饰”或类似表述，意指当TALEN特异地结合到靶位点时，TALEN上的核酸酶切割该位点产生遗传修饰。核酸酶并不在TALEN对结合的位置切割，而是在两结合位点间定义的位点处切割。
一些实施方式包括组合物或用于克隆动物的细胞的处理。所述细胞可以是家畜和/或偶蹄目细胞、培养的细胞、原代细胞、原代体细胞、受精卵、生殖细胞、原始生殖细胞或干细胞。例如，一个实施方式为组合物或创建遗传修饰的方法，所述遗传修饰包括将培养物中的多个原代细胞暴露于TALEN蛋白或编码TALEN或TALENs的核酸中。可将TALENs作为蛋白或作为如由载体中的mRNA或DNA序列编码的核酸片段引入细胞。
细胞的遗传修饰还可包括插入报告子。报告子可以是，如荧光标记，如绿色荧光蛋白和黄色荧光蛋白。报告子可以是选择标记，如嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基糖苷磷酸转移酶(neo、G418、APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素B磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)或黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶(XGPRT)。报告子、选择标记和/或一个或多个TALEN的载体可以是质粒、转座子、转座酶、病毒或本文所详述的其它载体。
TALENs可针对多个DNA位点。这些位点可被数千或更多的碱基对分开。DNA可通过细胞机器重新连接从而导致位点间整个区域的缺失。实施方式包括，例如，位点可被距离在1-5百万碱基之间或染色体的50％到80％之间、或距离在约100到约1,000,000之间的碱基对分开。技术人员将立刻理解所有范围和前述明确定义的范围内的值是可预期的，例如从约1,000到约10,000碱基对或从约500到约500,000碱基对。可选地，外源DNA可以加入到细胞或胚胎中以插入外源DNA，或在位点间进行模板驱动的DNA修复。可将在多个位点的修饰用于生产遗传修饰的细胞、胚胎、偶蹄目和家畜。可选择一个或多个基因进行完全或至少部分缺失，所述基因包括性成熟基因或其顺式作用因子。
锌指核酸酶
锌指核酸酶(ZFNs)是通过将锌指DNA结合结构域与DNA切割结构域相融合而产生的人工限制性酶。可工程化锌指结构域以靶向需要的DNA序列，且这使得锌指核酸酶在复杂的基因组中靶向独特的序列。通过利用外源DNA修饰机器的优点，可用这些试剂改变高等生物的基因组。ZFNs可用于失活基因的方法中。
锌指DNA结合结构域具有约30个氨基酸，并折叠成稳定的结构。每一个指在DNA底物中结合成为三体。位于关键位置的氨基酸残基有助于大部分的与DNA位点的序列特异性相互作用。可以改变这些氨基酸，而保持剩下的氨基酸以保留必要的结构。可通过串联数个结构域实现结合到更长的DNA序列。其它诸如非特异的FokI切割结构域(N)、转录激活结构域(A)、转录抑制结构域(R)和甲基化酶(M)的功能域(functionalities)可与ZFPs融合以分别形成ZFNs、锌指转录激活因子(ZFA)、锌指转录抑制子(ZFR)，和锌指甲基化酶(ZFM)。使用锌指和锌指核酸酶用于生产遗传修饰的动物与的材料和方法描述于如US8,106,255US20120192298、US20110023159和US20110281306中。
模板的和非模板的修复
TALENs、锌指核酸酶、Cas9/CRISPR和重组酶融合蛋白可与模板或不与模板使用。模板是加入到用于细胞修复机器的细胞的外源DNA，以作为修复DNA中双链断裂(DSB)的指导(模板)使用。该过程一般称为HDR同源定向修复(HDR)。不需模板的过程包括生产DSBs以及提供给细胞机器进行修复，该过程是不完美的，由此产生插入或缺失(插入缺失)。称为非同源末端接合(NHEJ)的细胞通路通常介导DSBs的非模板修复。术语NHEJ通常用于指所有这类非模板的修复(不论NHEJ是否参与)或替代的细胞通路。
载体和核酸
可以将多种核酸导入偶蹄动物或其它细胞中(出于敲除目的)或者以为了其它目的获得基因表达。如本文所用，术语核酸包括DNA、RNA和核酸类似物，以及双链或单链(如有义或反义单链)核酸。可以在碱基部分、糖部分、或磷酸部分处修饰核酸类似物以改善例如核酸的稳定性、水解或溶解度。碱基部分处的修饰包括脱氧尿苷(于脱氧胸苷)、和5-甲基-2’-脱氧胞苷和5-溴代-2’-脱氧胞苷(对于脱氧胞苷)。糖部分的修饰包括核糖糖的2’羟基的修饰以形成2’-O-甲基或2'-O-烯丙基糖。可以将脱氧核糖磷酸主链修饰以生成吗啉代核酸(其中每个碱基模块与六个成员的吗啉代环连接)或肽核酸(其中脱氧磷酸酯主链用假肽(pseudopeptide)主链替换，并且保留四个碱基)。参见SummertonandWeller(1997)AntisenseNucleicAcidDrugDev.7(3)：187；及Hyrupetal.(1996)Bioorgan,Med.Chem.4：5。另外，可以用例如硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯主链、亚磷酰胺或烷基磷酸三酯主链替换脱氧磷酸酯主链。
靶核酸序列可以与调节区诸如启动子可操作连接。调节区可以是猪调节区或者可以来自其它物种。如本文中使用的，可操作连接指以如下的方式相对于核酸序列定位调节区，使得允许或促进靶核酸的转录。
任何类型的启动子可以与靶核酸序列可操作连接。启动子的例子包括但不限于组织特异性启动子、组成性启动子、和响应或不响应特定刺激物的启动子。合适的组织启动子可以导致在beta细胞中核酸转录物的优先表达，并且包括例如人胰岛素启动子。其它组织特异性启动子可以导致在例如干细胞或心脏组织中优先表达，并且分别可以包括清蛋白或alpha-肌球蛋白重链启动子。在其它实施方案中，可以使用不以显著组织或时间特异性促进核酸分子表达的启动子(即，组成性启动子)。例如，可以使用beta-肌动蛋白启动子诸如鸡beta-actin基因启动子、泛素启动子、miniCAG启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、或3-磷酸甘油酸激酶(PGK)启动子，以及病毒启动子诸如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)启动子、SV40启动子、或巨细胞病毒(CMV)启动子。在一些实施方案中，使用鸡beta肌动蛋白基因启动子和CMV增强子的融合作为启动子。参见例如Xuetal.(2001)Hum.GeneTher.12：563；和Kiwakietal.(1996)Hum.GeneTher.7：821。
可以用于核酸构建体的别的调节区包括但不限于多腺苷酸化序列、翻译控制序列(例如，内部核糖体进入区段，IRES)、增强子、可诱导元件、或内含子。此类调节区可以不是必要的，尽管它们可以通过影响转录、mRNA的稳定性、转录效率等等提高表达。可以在想要时在核酸构建体中纳入此类调节区以在细胞中获得核酸的最佳表达。然而，足够的表达有时可以在没有此类别的元件的情况下获得。
可以使用编码信号肽或选择标志物的核酸构建体。可以使用信号肽，使得将编码的多肽引导至特定的细胞位置(例如，细胞表面)。选择标志物的非限制性例子包括嘌呤霉素、更昔洛韦、腺苷脱氨酶(ADA)、氨基葡糖苷磷酸转移酶(neo,G418,APH)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、潮霉素-B-磷酸转移酶、胸苷激酶(TK)、和黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸转移酶(XGPRT)。此类标志物可用于选择培养物中的稳定转化体。其它选择标志物包括荧光多肽，诸如绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白。
在一些实施方式中，编码选择标志物的序列侧翼可以有重组酶诸如例如Cre或Flp的识别序列。例如，选择标志物侧翼可以有loxP识别位点(由Cre重组酶识别的34-bp识别位点)或FRT识别位点，使得可以从构建体切除选择标志物。参见Orban,etal,Proc.Natl.Acad.Sci.(1992)89：6861(关于Cre/lox技术的综述),及BrandandDymecki,Dev.Cell(2004)6：7。也可以使用含有以选择标志物基因中断的Cre或Flp可激活转基因的转座子来获得具有转基因的条件表达的转基因动物。例如，驱动标志物/转基因表达的启动子可以遍在的或组织特异性的，其会导致标志物在F0动物(例如猪)中的遍在或组织特异性表达。例如，可以如下实现转基因的组织特异性活化，即将遍在表达标志物中断转基因的猪与以组织特异性方式表达Cre或Flp的猪杂交，或者将以组织特异性方式表达标志物中断转基因的猪与遍在表达Cre或Flp重组酶的猪杂交。转基因的受控表达或标志物的受控表达允许转基因的表达。
在一些实施方式中，外源核酸编码多肽。编码多肽的核酸序列可以包含编码设计用于促进编码多肽的随后操作(例如以促进定位或检测)的“标签”的标签序列。可以在编码多肽的核酸序列中插入标签序列，使得编码的标签位于多肽的羧基或氨基端。编码标签的非限制性例子包括谷胱甘肽S-转移酶(GST)和FLAGTM标签(Kodak,NewHaven,CT)。
可以使用SssICpG甲基化酶(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA)使核酸构建体甲基化。一般地，可以将核酸构建体与缓冲液中的S-腺苷甲硫氨酸和SssICpG甲基化酶于37℃一起温育。可以通过将构建体与一个单位的HinP1I内切核酸酶于37℃一起温育1小时，并通过琼脂糖凝胶电泳测定来确认超甲基化。
可以使用多种技术将核酸构建体导入任何类型的胚胎、胎儿、或成年偶蹄动物细胞，包括例如生殖细胞诸如卵母细胞或卵、祖细胞、成年或胚胎干细胞、原始生殖细胞、肾细胞诸如PK-15细胞、胰岛细胞、beta细胞、肝细胞、或成纤维细胞诸如皮肤成纤维细胞中。技术的非限制性例子包括使用转座子系统、可以感染细胞的重组病毒、或者脂质体或其它非病毒方法诸如电穿孔、显微注射、或磷酸钙沉淀，其能够将核酸投递至细胞。
在转座子系统中，核酸构建体的转录单元，即可操作连接的调节区和靶核酸序列侧翼有转座子的反向重复。已经开发出几种转座子系统，包括例如SleepingBeauty(见美国专利第6,613,752号和美国公开文本第2005/0003542号)；FrogPrince(Miskeyetal.(2003)NucleicAcidsRes.31：6873)；Tol2(Kawakami(2007)GenomeBiology8(Suppl.l)：S7；Minos(Pavlopoulosetal.(2007)GenomeBiology8(Suppl.l)：S2)；Hsmar1(Miskeyetal.(2007))MolCellBiol.27：4589)；和Passport以将核酸导入细胞，包括小鼠、人和猪细胞中。SleepingBeauty转座子是特别有用的。转座子可以以蛋白质投递，在与靶核酸相同的核酸构建体上编码，可以在分开的核酸构建体上引入，或者以mRNA(例如，在体外转录的且加帽的mRNA)提供。
也可以在核酸构建体中纳入绝缘子元件以维持靶核酸的表达以及抑制宿主基因的不想要转录。参见例如美国公开文本第2004/0203158号。通常，绝缘子元件在转录单元的每侧侧翼，并且在转座子的反向重复内部。绝缘子元件的非限制性例子包括基质附着元件(MAR)型绝缘子元件和边界型绝缘子元件。参见例如美国专利第6,395,549、5,731,178、6,100,448和5,610,053号及美国公开文本第2004/0203158号。
可以将核酸引入载体中。载体是一个宽泛的术语，其包含设计用于从载体移入靶DNA中的任何特定DNA段。载体可以称为表达载体，或载体系统，其是引起DNA插入基因组或其它靶向DNA序列诸如中需要的组件集，诸如附加体、质粒、或甚至病毒/噬菌体DNA段。用于在动物中投递基因的载体系统诸如病毒载体(例如，逆转录病毒、腺伴随病毒和整合噬菌体病毒)、和非病毒载体(例如转座子)具有两种基本元件：1)由DNA(或逆转录成cDNA的RNA)组成的载体和2)转座酶、重组酶、或其它整合酶，其识别载体和DNA靶序列两者，并且将载体插入靶DNA序列中。载体最常含有一种或多种表达盒，其包含一种或多种表达控制序列，其中表达控制序列是分别控制和调节另一DNA序列或mRNA的转录和/或翻译的DNA序列。
许多不同类型的载体是已知的。例如质粒和病毒载体，例如逆转录病毒载体是已知的。哺乳动物表达载体通常具有复制起点、合适的启动子和任选的增强子，而且还有任何必要的核糖体结合位点、多聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受位点、转录终止序列、和5'侧翼非转录序列。载体的例子包括：质粒(其也可以是另一类载体的载体)、腺病毒、腺相关病毒(AAV)、慢病毒(例如，经修饰的HIV-1,SIV或FIV)、逆转录病毒(例如ASV,ALV或MoMLV)、和转座子(例如SleepingBeauty、P元件、Tol-2、FrogPrince、piggyBac)。
如本文中使用的，术语核酸指RNA和DNA两者，包括例如cDNA、基因组DNA、合成的(例如化学合成的)DNA、及天然存在的和经化学修饰的核酸，例如合成的碱基或备选主链。核酸分子可以是双链或单链(即，有义或反义单链)。术语转基因在本文中广泛使用，指经遗传修饰的生物体或经遗传工程化改造的生物体，其遗传物质已经使用遗传工程化技术改造。如此，无论外源基因或核酸是否在动物或其后代中表达，敲除偶蹄动物是转基因的。
遗传修饰的动物
可使用TALENs、锌指核酸酶或其它基因工程工具，包括各种已知的载体来修饰动物。由这些工具制备的遗传修饰可包含基因的失活。术语基因的失活指阻止形成有功能的基因产物。只有当其满足正常(野生型)功能时，基因产物才是有功能的。遗传修饰的动物的材料和方法进一步描述于2012年2月24日提交的美国序列号第13/404,662号、2012年5月9日提交的第13/467,588号，和2009年11月10日提交的第12/622,886号中，在此出于所有的目的通过全文引用并入本文；在冲突的情况中，以说明书为准。术语反式作用指从不同的分子(如分子间)作用于靶基因的过程。反式作用元件通常为包含基因的DNA序列。该基因编码用于调控靶基因的蛋白(或microRNA或其它可扩散的分子)。反式作用基因可能与靶基因位于相同的染色体上，但其活性是通过其编码的中介蛋白或RNA实现的。使用显性负调控来失活基因通常涉及反式作用元件。术语顺式调节或顺式作用意指无需编码蛋白或RNA的作用；在基因失活的语境中，这一般意指基因编码部分的失活，或对功能基因的表达是必须的启动子和/或操纵子的失活。
可以使用本领域中已知的多种技术来将核酸构建体导入非人动物中以生成建立者系，其中核酸构建体整合入基因组中。此类技术包括但不限于原核(pronuclear)显微注射(美国专利第4,873,191号)、逆转录病毒介导的到种系的基因转移(VanderPuttenetal.(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA82,6148-1652)、对胚胎干细胞的基因靶向(Thompsonetal.(1989)Cell56,313-321)、胚胎的电穿孔(Lo(1983)Mol.Cell.Biol.3,1803-1814)、精子介导的基因转移(Lavitranoetal.(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA99,14230-14235；Lavitranoetal.(2006)Reprod.Fert.Develop.18,19-23)、及体细胞诸如卵丘细胞或乳房细胞、或成年、胎儿、或胚胎干细胞的体外转化，接着进行核移植(Wilmutetal.(1997)Nature385,810-813；及Wakayamaetal.(1998)Nature394,369-374)。原核显微注射、精子介导的基因转移、和体细胞核转移是特别有用的技术。遗传修饰的动物是这样的一种动物，其中该动物的所有细胞包括其生殖系细胞均具有遗传修饰。当使用方法产生了遗传修饰杂合的动物时，可自交该动物从而筛选到遗传修饰的后代。例如，如果在囊胚状态时修饰动物的细胞，或遗传修饰发生在单细胞修饰时，可使用克隆来生产嵌合动物。修饰的从而不会性成熟的动物可以是用于修饰的纯合子或杂合子，这依赖于所使用的特定手段。如果特定的基因通过RNA干扰或显性负调控策略而失活，则通常杂合子就足够了。
通常，在原核显微注射中，将核酸构建体导入受精卵中；使用1或2个细胞受精卵作为含有来自精子头的遗传物质的原核，并且卵在原生质内是可见的。可以在体外或在体内(即，从供体动物输卵管用手术回收)获得原核阶段的受精卵。可以如下生成体外受精卵。例如，可以在屠宰场收集猪卵巢，并在运输期间于22-28℃维持。可以将卵巢清洗，并分离，用于卵泡吸出，并且可以使用18号针且在真空下将范围为4-8mm的卵泡吸入50mL圆锥离心管中。将卵泡液和吸出的卵母细胞用商业TL-HEPES(Minitube,Verona,WI)漂洗通过预滤器。可以将以紧密的卵丘块(cumulusmass)围绕的卵母细胞选择，并放入补充有0.1mg/mL半胱氨酸、10ng/mL表皮生长因子、10％猪卵泡液、50μM2-巯基乙醇、0.5mg/mlcAMP、10IU/mL每种孕马血清促性腺激素(pregnantmareserumgonadotropin，PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)的TCM-199卵母细胞成熟培养基(Minitube,Verona,WI)中，在湿润的空气中于38.7℃和5％CO2持续约22小时。随后，可以将卵母细胞移至新鲜的TCM-199成熟培养基，其不会含有cAMP、PMSG或hCG，并且再温育22小时。可以通过在0.1％透明质酸酶中涡旋振荡1分钟对成熟的卵母细胞剥离其卵丘细胞。
对于猪，可以在Minitube5孔受精盘中在500μlMinitubePORCPROIVF培养基系统(Minitube,Verona,WI)中使成熟的卵母细胞受精。在体外受精(IVF)的制备中，可以将新鲜收集的或冷冻的公猪精子清洗，并在PORCPROIVF培养基中重悬至4×105个精子。可以通过计算机辅助精子分析(SPERMVISION,Minitube,Verona,WI)分析精子浓度。可以在10μl体积中以终浓度约40个运动型精子/卵母细胞(这取决于公猪)实施最终的体外授精。于38.7℃在5.0％CO2气氛中将所有受精的卵母细胞温育6小时。授精后6小时，将假定的受精卵在NCSU-23中清洗两次，并移至0.5mL相同培养基。此系统可以在大多数公猪间以10-30％多精入卵授精率常规生成20-30％囊胚。
可以将线性化核酸构建体注射入原核之一中。然后，可以将注射的卵转移至接受体雌性(例如，转移至接受体雌性的输卵管中)，并且容许在接受体雌性中发育以生成转基因动物。具体地，将体外受精的胚胎以15,000×g离心5分钟以沉淀脂质，这容许显现原核。可以使用EppendorfFEMTOJET注射器注射胚胎，并且可以将其培养，直到囊胚形成。可以记录胚胎分裂率和囊胚形成和质量。
可以将胚胎用手术转移至非同步(asynchronous)接受体的子宫中。通常，可以使用5.5英寸导管将100-200(例如150-200)个胚胎放入输卵管的壶腹-峡部(ampulla-isthmus)连接中。在手术后，可以实施妊娠的实时超声检查。
在体细胞核转移中，可以将包含上文描述的核酸构建体的转基因偶蹄动物细胞(例如转基因猪细胞或牛细胞)诸如胚胎分裂球、胎儿成纤维细胞、成年耳成纤维细胞、或颗粒细胞导入去核的卵母细胞中以建立组合细胞。可以如下将卵母细胞去核，即在极体附近的部分带切开(partialzonadissection)，然后在切开区处压出细胞质。通常，使用具有锋利的有斜面的尖端的注射移液管来将转基因细胞注射到阻滞于减数分裂2的去核卵母细胞中。在一些实施方式中，阻滞于减数分裂2的卵母细胞称作“卵”。在生成猪或牛胚胎(例如通过融合并活化卵母细胞进行)后，在活化后约20至24小时，将胚胎转移至接受体雌性的输卵管。参见例如Cibellietal.(1998)Science280,1256-1258及美国专利第6,548,741号。对于猪，可以在转移胚胎后20-21天约对接受体雌性检查妊娠。
可以使用标准的育种技术来创建在来自初始杂合建立者动物的靶核酸方面纯合的动物。然而，可以不需要纯合性。可以将本文中描述的转基因猪与感兴趣的其它猪育种。
在一些实施方式中，可以以不相等的量在分开的转座子上提供并且对胚胎或细胞提供感兴趣的核酸和选择标志物，其中含有选择标志物的转座子的量远远超过(5-10倍过量)含有感兴趣核酸的转座子。可以基于选择标志物的存在和表达分离表达感兴趣核酸的转基因细胞或动物。由于转座子会以精确的且不相联的方式(独立转座事件)整合入基因组中，感兴趣的核酸和选择标志物不是遗传连锁的，并且可以容易地经由标准育种通过遗传分离分开。如此，可以生成转基因动物，其不受在后续世代中保留选择标志物(即一个从公共安全性观点看有些顾虑的问题)约束。
一旦生成了转基因动物，可以使用标准技术评估靶核酸的表达。可以通过Southern印迹分析实现初始筛选以测定构建体整合发生与否。关于Southern分析的描述，参见Sambrooketal.,1989,MolecularCloning,ALaboratoryManualsecondedition,ColdSpringHarborPress,Plainview；NY的9.37-9.52部分。也可以在初始筛选中使用聚合酶链式反应(PCR)技术。PCR指扩增靶核酸的规程或技术。一般地，采用来自感兴趣区域末端或超出的序列信息来设计与要扩增的模板的相反链在序列上相同或相似的寡核苷酸引物。可以使用PCR从DNA及RNA扩增特定序列，包括来自总基因组DNA或总细胞RNA的序列。引物的长度通常是14至40个核苷酸，但是长度范围可以是10个核苷酸至几百个核苷酸。PCR记载于例如PCRPrimer：ALaboratoryManual,ed.DieffenbachandDveksler,ColdSpringHarborLaboratoryPress,1995。也可以通过连接酶链式反应、链置换扩增、自身维持的序列复制、或基于核酸序列的扩增来扩增核酸。参见例如Lewi(1992)GeneticEngineeringNews12,1；Guatellietal.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：1874；和Weiss(1991)Science254：1292。在囊胚阶段，可逐个处理胚胎用于通过PCR、Southern杂交和splinkerettePCR的分析(参见例如Dupuyetal.ProcNatlAcadSciUSA(2002)99：4495)。
可以使用技术评估转基因猪的组织中编码多肽的核酸序列表达，所述技术包括例如对自动物获得的组织样品的Northern印迹分析、原位杂交分析、Western分析、免疫测定法诸如酶联免疫吸附测定法、和逆转录酶PCR(RT-PCR)。
干扰RNAs
各种干扰RNA(RNAi)是已知的。双链RNA(dsRNA)诱导同源基因转录体的序列特异性降解。RNA诱导的沉默复合体(RISC)将dsRNA代谢为小的21-23核苷酸的小干扰RNAs(siRNAs)。RISC包含双链RNAse(dsRNase，如Dicer)和ssRNase(如，Argonaut2或Ag02)。RISC利用反义链作为引导以找到切割靶。siRNAs和microRNA(miRNAs)两者都是已知的。在遗传修饰的动物中失活基因的方法包括诱导针对靶基因和/或靶核酸的RNA干扰，从而降低靶基因和/或靶核酸的表达。
例如，外源核酸序列可诱导针对编码多肽的核酸序列的RNA干扰。例如，与靶DNA同源的双链小干扰RNA(siRNA)或小发夹RNA(shRNA)可以用于降低该DNA的表达。可以生成用于siRNA的构建体，如记载于例如Fireetal.(1998)Nature391：806；RomanoandMasino(1992)Mol.Microbiol.6：3343；Cogonietal.(1996)EMBOJ.15：3153；CogoniandMasino(1999)Nature399：166；MisquittaandPaterson(1999)Proc.Natl.Acad.Sci.USA96：1451；及KennerdellandCarthew(1998)Cell95：1017。可以生成用于shRNA的构建体，如由MclntyreandFanning(2006)BMCBiotechnology6：1描述的。一般地，shRNA转录为含有互补区的单链RNA分子，其可以退火并形成短的发夹。
找到单个的、个别的有功能的针对特定基因的siRNA或miRNA的概率是高的。例如，siRNA的具体序列的预测率为50％，但有信心生产出的一些干扰RNAs中的至少一个是有功能的。
实施方式包括体外细胞、体内细胞和如家畜动物的遗传修饰动物，所述家畜动物表达针对性成熟选择性的内分泌基因的RNAi。一个实施方式为针对由Gpr54、Kiss1和GnRH1基因组成的组中的基因的RNAi。例如RNAi可以是选自由siRNA、shRNA、dsRNA、RISC和miRNA组成的组。
诱导系统
诱导系统可用于控制性成熟基因的表达。已知各种允许在时空上控制基因表达的诱导系统。数个已被证明在体内转基因动物中是有功能的。
诱导型启动子的例子是四环素(tet)-on启动子系统，其可以用于调节核酸的转录。在此系统中，突变的Tet阻抑物(TetR)与单纯疱疹病毒VP16反式激活物蛋白的激活域融合以创建四环素控制的转录激活物(tTA)，其受到tet或多西环素(dox)调节。在缺乏抗生素的情况中，转录是最小程度的，而在存在tet或dox的情况中，转录得到诱导。备选的诱导型系统包括蜕皮激素或雷怕霉素(rapamycin)系统。蜕皮激素是一种昆虫蜕皮激素，其生成受到蜕皮激素受体和超气门蛋白(ultraspiracle)基因(USP)产物的异二聚体控制。通过用蜕皮激素或蜕皮激素类似物诸如MuristeroneA处理诱导表达。对动物施用以触发诱导型系统的药剂称为诱导剂。
四环素诱导系统和Cre/loxP重组酶系统(组成型的或诱导的)是更为常用的诱导系统。四环素诱导系统包括四环素控制的反式激活子(tTA)/反向tTA(rtTA)。在体内使用这些系统的方法包括产生两个遗传修饰的动物系。一个动物系在选择的启动子的控制下表达激活子(tTA、rtTA或Cre重组酶)。另一组转基因动物表达接纳体(acceptor)，其中接受tTA/rtTA反式激活子(或侧翼为loxP序列)的靶基因控制感兴趣的基因(或要修饰的基因)的表达。将两个品系的小鼠相交配提供了基因表达的控制。
四环素依赖的调控系统(tet系统)依赖两个组分，即四环素控制的反式激活子(tTA或rtTA)和以四环素依赖方式控制下游cDNA表达的tTA/rtTA依赖的启动子。在缺乏四环素或其衍生物(如强力霉素)的情况下，tTA结合到tetO序列上，允许tTA依赖的启动子的转录激活。然而，当存在强力霉素时，tTA不能与其靶相互作用且不发生转录。使用tTA的系统被称为tet-off，因为四环素或强力霉素允许转录下调。四环素或其衍生物的施用允许暂时控制体内转基因表达。rtTA是tTA的变体，其在缺乏强力霉素时是无功能的，但需要配体存在用于反式激活。因此这种系统被称为tet-ON。已在体内将tet系统用于如编码报告基因、原癌基因或参与信号级联的蛋白的数个转基因的诱导表达。
Cre/lox系统使用Cre重组酶，其通过在两远端(distant)的Cre识别序列间，即loxP位点，发生交换而催化位点特异性重组。引入到两loxP序列间的DNA序列(称为floxedDNA)被Cre介导的重组所切除。使用空间控制(带有组织或细胞特异性启动子)或时间控制(带有诱导系统)在转基因动物中控制Cre的表达导致对两loxP位点间DNA切除的控制。一种应用是条件性基因失活(条件性敲除)。另一种方法用于蛋白过表达，其中将floxed终止子插入到启动子序列和感兴趣的DNA之间。直到Cre表达，遗传修饰的动物才表达转基因，导致切除floxed终止子。这一系统已经应用于组织特异性癌变和B淋巴细胞中受控的抗原受体的表达。还开发了诱导的Cre重组酶。只有当施用外源配体时诱导的Cre重组酶才被激活。诱导的Cre重组酶是融合蛋白，其含有原来的Cre重组酶和特异的配体结合结构域。Cre重组酶的功能活性依赖于能够结合到融合蛋白中该特异性结构域的外部配体。
实施方式包括体外细胞、体内细胞和如家畜动物的遗传修饰的动物，其包含受控于诱导系统的性成熟选择性的神经内分泌基因。动物的遗传修饰可以是基因组的或嵌合的。一个实施方式为受控于诱导系统的选自由Gpr54、Kiss1和GnRH1组成的组的基因。所述诱导系统例如可以是选自由Tet-On、Tet-Off、Cre-lox和Hif1alpha组成的组。
显性负调控(DominantNegatives)
因此不仅可以通过去除或RNAi抑制来失活基因，还可以通过创建显性负调控表型来失活基因。基因产物的显性负调控版本缺乏野生型表型的一种或多种功能，且显性地干扰表达于相同细胞中正常基因产物的功能，导致显性负调控表型有效地降低或失活通常期待为由基因的正常功能所引发的生理结果。例如，大多数蛋白的功能需要与其它蛋白相互作用。这种相互作用通常需要适当的蛋白定位、配体结合、蛋白激活或上游信号的下游转导。多蛋白复合物的一个或多个组件的突变能够干扰这些过程。因此甚至在正常基因产物存在的情况下，突变形式的蛋白的表达能够作为毒“药丸(pill)”或“猴子扳手(monkeywrench)”进入变速箱(gearbox)的方式干扰蛋白的功能。GPCRs是7次跨膜(7TM)结构域受体，其以多步骤的紧凑的调节机制和严格的质量控制体系来保证正确的GPCR折叠和靶向，通过生物合成途径被运输至细胞表面。GPCRs与辅助蛋白或伴侣的组合对于通过内质网(ER)和高尔基体的向前运输而言是一个关键步骤。GPCRs的寿命开始于ER中，它们在ER中合成、折叠和组装。在它们迁移到细胞表面期间，GPCRs经历翻译后修饰以达到成熟状态。由于ER构成了细胞质量控制机器的一部分，其中功能上失活的突变GPCRs在细胞表面表达。
诸如X-连锁的肾性尿崩症(X-linkednephrogenic-diabetesinsipidus)、家族性低钙高钙血症、家族性糖皮质激素缺乏(familialglucocorticoiddeficiency)或低促性腺激素性性腺功能减退(hypogonadodotropichypogonadism)的症状与GPCRs中的突变相关，该突变导致ER或高尔基体区室(compartment)中的细胞内滞留。在许多情况下，由于受体的细胞内结合，导致在细胞表面的膜表达缺陷，且错误折叠的受体以显性负调节(DN)的方式影响其所对应的野生型受体；这种DN影响可能限制，甚至废除正常受体的细胞膜表达，并因此招致功能丧失性疾病(Ulloa-AguirreetaI.,2004a)。
GnRHR中的功能丧失突变可导致部分或完全的促性腺激素性性腺功能减退(HH)、垂体性腺激素对GnRH的响应障碍而导致降低的或搏动性促性腺激素释放和繁殖障碍。已经描述了大量导致受体错误折叠的突变，以及患有HH的病人中促性腺激素释放激素受体(GnRHR)所导致的错误传递(misrouting)(Janovicketal.,2002；etal.,2002；Ulloa-Aguirreetal.,2004b)。这些突变中的许多作为GnRHR功能的显性负调节剂(Dominantnegatives)(PaskATetal,2005MolEndocrinol；BrothersSPetal,2004MolEndocrinol；Aetal,2003JClinEndocrinolMetab)。因此，DNGnRHR基因有目的的表达以导致转基因动物中的不育是可期待的。
如所讨论的，GPR54是启动青春期生殖级联的看守(gatekeeper)。无数的动物研究已经证明通过名为亲吻肽的内源性肽配体，GPR54的参与强力刺激了促性腺激素释放激素从下丘脑神经元中的释放，以激活下丘脑-垂体-性腺轴。此外，对GPR54基因敲除小鼠的表征(表型上模拟人特发性低促性腺激素性性腺功能减退症状)确认了GPR54对生殖功能的重要作用。现在认为GPCRs作为多蛋白复合物存在，所述复合物由GPCR相互作用蛋白(GIPs)组成，其影响精确的空间和时间表达调控、运输、配体结合和信号(signaling)。已经确定GPR54特异性地与这些GIPs相互作用。由于大多数截断的GPCR剪接变体作为显性负调节突变体(dominant-negativemutations)(Wise2012,JMolSignal)，因此期望表达缺乏一个或多个跨膜结构域的GPR54以破坏内源的GPR54的加工/运输，因而干扰其功能。因此期望有意表达DNGPR54基因以造成转基因动物的不育。
建立者动物、动物系、性状和繁殖
可通过克隆和其它本文中描述的方法生产建立者动物。建立者动物可以是用于遗传修饰的纯合子，如在合子或原代细胞经历纯合修饰的情况中。同样，也可将建立者生产为杂合子。建立者可以是基因组修饰的，这意味着它们基因组内的所有细胞都经历修饰。建立者可以是用于修饰的嵌合体，如可发生在当将载体引入到胚胎的多个细胞中，通常在囊胚期。可检测嵌合动物的子代以鉴定基因组修饰的后代。当建立了能够有性繁殖的或通过辅助生殖技术繁殖，具有持续表达修饰的纯合或杂合后代的动物池(poolofanimals)时，动物系被建立。
在家畜中，已知许多等位基因与多个性状诸如生产性状、类型性状、可加工性(workability)性状、和其它功能性状有联系。技术人员习惯于监测和量化这些性状，例如Visscheretal.,LivestockProductionScience,40(1994)123-137、US7,709,206、US2001/0016315、US2011/0023140和US2005/0153317。因而，转移的等位基因可以与性状有联系或选自下组中的性状：生产性状、类型性状、可加工性性状、生育力性状、育儿(mothering)性状和疾病抗性性状。进一步的性状包括表达重组基因产物。
可修饰具有一个或多个期望性状的动物以阻止性成熟。由于直到成熟时动物才是可育的，因而有可能调节性成熟作为控制动物繁殖(dissemination)的手段。由此能够将经培育或修饰以具有一个或多个性状的动物提供给具有降低风险的接收者(recipients)，其中所述接收者将繁殖所述动物并将所述性状的价值转移到自身。本发明的实施方式包括遗传修饰具有包含失活的性成熟基因的修饰的动物的基因组，其中野生型动物中的性成熟基因表达性成熟选择性的因子。实施方式包括通过施用化合物处理动物以补救由基因表达的损失所导致的缺陷，以诱导动物性成熟。
可在处理设施中有利地实现动物的繁殖，所述动物需要注射化合物以诱导性成熟。处理设施能够对良好控制的家畜实施标准化的方案(protocols)以有效地生产一致的动物。可将动物后代分布到多个地点进行饲养。农场和农场主(术语包括牧场和牧场主)因此可以订购期望数量的具有指定年龄和/或重量和/或性状范围的后代，并将它们在期望的时间和/或地点进行运送。然后接收者例如农场主可以饲养该动物并依照他们的要求将动物运送到市场。
实施方式包括运送(如到一个或多个地方，到多个农场)具有失活的性成熟选择性的神经内分泌基因的遗传修饰的家畜动物。实施方式包括运送具有约1天到约180天之间年龄的动物。所述动物可具有一个或多个性状(如表达期望的性状或高价值性状或新型性状或重组性状的性状)。实施方式进一步包括提供所述动物和/或饲养所述动物。
重组酶
本发明的实施方式包括与重组酶一起施用TALEN或TALEN或锌指核酸酶或施用其它与DNA重组相关的DNA结合蛋白。重组酶与核酸片段形成纤丝，并且实质上搜索细胞DNA以寻找与序列基本上同源的DNA序列。TALEN-重组酶实施方案的一个实施方案包括组合重组酶与核酸序列，该核酸序列充当HDR的模板。HDR模板序列与通过TALEN/TALEN对靶向切割的位点具有实质性同源性。如本文中描述的，HDR模板通过放置等位基因、创建indel、插入外源DNA提供向天然DNA的变化，或者提供其它变化。通过本文中描述的方法以蛋白质、mRNA、或者通过载体的使用在细胞或胚胎中放置TALEN。将重组酶与HDR组合以形成纤丝，并放入细胞中。可以将重组酶和/或与重组酶组合的HDR模板以蛋白质、mRNA或者用编码重组酶的载体置于细胞或胚胎中。美国公开文本2011/0059160(美国流水号第12/869,232号)的公开内容在此通过引用并入本文用于所有目的；在冲突的情况中，以说明书为准。术语重组酶指在细胞中酶促催化两个相对较长的DNA链间相对较短的DNA片的连接的遗传重组酶。重组酶包括Cre重组酶、Hin重组酶、RecA、RAD51、Cre、和FLP。Cre重组酶是来自P1噬菌体的I型拓扑异构酶，其催化loxP位点间DNA的位点特异性重组。Hin重组酶是一种在细菌沙门氏菌(Salmonella)中找到的由198个氨基酸组成的21kD蛋白质。Hin属于DNA转化酶的丝氨酸重组酶家族，其中它依赖于活性位点丝氨酸来启动DNA切割和重组。RAD51是一种人基因。由此基因编码的蛋白质是RAD51蛋白家族的成员，其帮助修复DNA双链断裂。RAD51家族成员与细菌RecA和酵母Rad51是同源的。Cre重组酶是一种实验用酶，其在实验室测试中已经成功除去由来自受感染细胞的HIV插入的DNA。所述酶是为了鉴定HIV标志物经由选择性突变自Cre重组酶衍生的，所述HIV标志物不以loxP位点为界，并且因此不容许尝试Cre-Lox重组。FLP指来自面包师用的酵母酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的2μ质粒的翻转酶重组酶(Flippaserecombinationenzyme，FLP或Flp)。
RecA以其重组酶活性以在双链断裂修复期间通过同源重组催化链交换而为人所知(McGrew，2003)Radding,etal.,1981；Seitzetal.,1998)。还已经显示了RecA催化蛋白水解，例如对LexA和λ阻抑物蛋白质的蛋白水解，以及加工DNA依赖性ATP酶活性。在通过电离辐射或一些其它攻击发生双链断裂后，外切核酸酶以5'至3'咀嚼回到DNA末端，由此暴露DNA的一条链(McGrew,2003；Cox,1999)。单链DNA通过单链结合蛋白(SSB)被稳定化。在结合SSB后，RecA结合单链(ss)DNA，并且形成螺旋核蛋白纤丝(称为纤丝或联会前纤丝)。在DNA修复期间，RecA的同源性搜索功能将纤丝引导至同源DNA，并催化同源碱基配对和链交换。这导致形成DNA异源双链体。在链侵入后，DNA聚合酶基于同源DNA模板延伸ssDNA以修复DNA断裂，并且形成交叉结构或霍利迪连接(Hollidayjunction)。RecA还显示发动机(motor)功能，其参与交叉结构的迁移(CampbellandDavis,1999)。
重组酶活性包含许多不同功能。例如，具有重组酶活性的多肽序列能够以非序列特异性方式结合单链DNA以形成核蛋白纤丝。此类重组酶结合的核蛋白纤丝能够以非序列特异性方式与双链DNA分子相互作用，搜索双链分子中与纤丝中的细菌同源的序列，并且在找到此类序列时，置换双链分子的一条链以容许纤丝中的序列与双链分子的一条链中的互补序列之间的碱基匹配。此类步骤统称为“联会”。
已经对RecA和RecA样蛋白(在许多真核物种中称作Rad51)检查在多种真核系统中刺激基因靶向和同源重组。在烟草细胞中，含有核定位信号(NLS)的细菌RecA的表达将通过同源重组和体细胞染色体内重组(同源染色体间的重组)的丝裂霉素C诱导的DNA损伤修复提高3至10倍(Reiss,1996)。烟草中NLSRecA的表达还可以相对于野生型水平将姐妹染色单体替换刺激2.4倍(Reiss,2000)。在哺乳动物体细胞中，NLSRecA的过表达将通过同源重组的基因靶向刺激10倍(Shcherbakova,2000)。然而，在人细胞中，RecA的人同源物hRAD51的过表达在抗生素选择下相对于野生型水平仅将重组刺激2至3倍(Yanez,1999)。在斑马鱼中，通过直接注射ssDNA-RecA纤丝以低频率校正增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的突变体形式(Cui,2003)。Rad52，即Rad51异位显性组的成员也在使用突变寡核苷酸的斑马鱼中促进单链退火和低水平基因破坏(Takahashi,2005)。总之，这些研究指示RecA或Rad51的异位表达导致同源重组的适度刺激，但是提高的水平不足以可用于基因靶向。
如此，重组酶活性包括但不限于单链DNA结合、联会、同源性搜索、单链DNA的双链体侵入、异源双链体形成、ATP水解和蛋白水解。原型重组酶是来自大肠杆菌(E.coli)的RecA蛋白。参见例如美国专利第4,888,274号。原核RecA样蛋白也已经记载于沙门氏菌、芽孢杆菌和变形菌(Proteus)物种。来自嗜热水生菌(Thermitsaquaticus)的热稳定性RecA蛋白已经记载于美国专利第5,510,473号。已经描述了RecA的噬菌体T4同源物UvsX蛋白。具有改变的重组酶活性的RecA突变体已经记载于例如美国专利第6,774,213；7,176,007和7,294,494号。植物RecA同源物记载于例如美国专利第5,674,992；6,388,169和6,809,183号。含有重组酶活性的RecA片段已经记载于美国专利第5,731,411号。已经描述了具有增强的重组酶活性的突变体RecA蛋白诸如例如RecA803。参见例如Madirajuetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：6592-6596。
RecA的真核同源物(其也拥有重组酶活性)是第一次在酵母酿酒酵母中鉴定的Rad51蛋白。参见Bishopetal.,(1992)Cell69：439-56及Shinoharaetal.,(1992)Cell：457-70Aboussekhraetal.,(1992)Mol.Cell.Biol.72,3224-3234.Basileetal.,(1992)Mol.Cell.Biol.12,3235-3246。植物Rad51序列记载于美国专利第6,541,684；6,720,478；6,905,857和7,034,117号。与RecA同源的另一种酵母蛋白是Dmc1蛋白。已经描述了在与大肠杆菌和酿酒酵母不同的生物体中的RecA/Rad51同源物。Moritaetal.(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6577-6580；Shinoharaetal.(1993)NatureGenet.4：239-243；Heyer(1994)Experientia50：223-233；Maeshimaetal.(1995)Gene160：195-200；美国专利第6,541,684和6,905,857号。
在本文中，“RecA”或“RecA蛋白”指具有基本上所有或大多数相同功能的RecA样重组蛋白家族，所述功能特别是：(i)能将寡核苷酸或多核苷酸正确定位在它们的同源靶物上以便用DNA聚合酶进行随后的延伸；(ii)拓扑性地制备双链核酸以进行DNA合成的能力；及(iii)RecA/寡核苷酸或RecA/多核苷酸复合物能有效寻找并结合互补序列。最佳表征的RecA蛋白来自大肠杆菌；在蛋白质的初始等位形式外，已经鉴定出许多突变体RecA样蛋白，例如RecA803。此外，许多生物体具有RecA样链转移蛋白，包括例如酵母、果蝇、哺乳动物，包括人，和植物。这些蛋白质包括例如Reel、Rec2、Rad51、Rad51B、Rad51C、Rad51D、Rad51E、XRCC2和DMCL。重组蛋白的一个实施方案是大肠杆菌的RecA蛋白。或者，RecA蛋白可以是大肠杆菌的突变体RecA-803蛋白、来自另一种细菌来源的RecA蛋白或来自另一种生物体的同源重组蛋白。
具有重组酶活性的蛋白质的别的描述参见例如Fugisawaetal.(1985)Nucl.AcidsRes.13：7473；Hsiehetal.(1986)Cell44：885；Hsiehetal.(1989)J.Biol.Chem.264：5089；Fisheletal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：3683；Cassutoetal.(1987)Mol.Gen.Genet.208：10；Ganeaetal.(1987)Mol.CellBiol.7：3124；Mooreetal.(1990)JBiol.Chem.：11108；Keeneetal.(1984)Nucl.AcidsRes.12：3057；Kimiec(1984)ColdSpringHarborSymp.48：675；Kimeic(1986)Cell44：545；Kolodnerelal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA84：5560；Suginoetal.(1985)Proc.Natl.Acad,Sci.USA85：3683；Flalbrooketal.(1989)JBiol.Chem,264：21403；Eisenetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：7481；McCarthyetal.(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：5854；及Lowenhauptetal.(1989)JBiol.Chem,264：20568，其通过提及并入本文。还可见Brendeletal.(1997)J.Mol.Evol.44：528。
具有重组酶活性的蛋白质的例子包括recA,recA803,uvsX,和其它recA突变体和recA样重组酶(Roca(1990)Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.25：415)，(Kolodneretal.(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84：5560；Tishkoffetal.(1991)Molec.Cell.Biol.11：2593)，RuvC(Dunderdaleetal.(1991)Nature354：506)，DST2，KEM1和XRN1(Dykstraetal.(1991)Molec.Cell.Biol.11：2583)，STPa/DST1(Clarketal.(1991)Molec.Cell.Biol.11：2576)，HPP-1(Mooreetal.(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：9067),其它真核重组酶(Bishopetal.(1992)Cell69：439；及Shinoharaetal.(1992)Cell69：457)；其通过提及并入本文。
具有重组酶活性的体外演化的蛋白质已经记载于美国专利No.6,686,515。涉及重组酶的别的出版物包括例如美国专利第7,732,585；7,361,641和7,144,734号。关于重组酶的综述，参见Cox(2001)Proc.Natl.Acad,Sci,USA98：8173-8180。
可以形成核蛋白纤丝，或纤丝。术语“纤丝(filament)”在与核酸酶形成结构的背景中是这些领域技术人员已知的术语。然后，可以使如此形成的核蛋白纤丝，例如与另一种核酸接触或者导入细胞中。用于形成核蛋白纤丝(其中该纤丝包含具有重组酶活性的多肽序列和核酸)的方法是本领域中公知的。参见例如Cuietal.(2003)MarineBiotechnol.5：174-184及美国专利第4,888,274；5,763,240；5,948,653和7,199,281号，其公开内容通过提及并入本文用于披露使重组酶结合核酸以形成核蛋白纤丝的例示性技术。
一般地，使具有重组酶活性的分子与线性单链核酸接触。线性单链核酸可以是探针。制备此类单链核酸的方法是已知的。反应混合物通常含有镁离子。任选地，反应混合物是缓冲的，并且任选地还含有ATP、dATP或不可水解的ATP类似物，诸如例如γ-硫代-ATP(ATP-γ-S)或γ-硫代-GTP(GTP-γ-S)。任选地，反应混合物还可以含有ATP生成系统。可以在纤丝形成之前或期间将双链DNA分子变性(例如通过加热或碱进行)。重组酶与核酸的摩尔比率的优化在本领域技术内。例如，可以将重组的不同浓度系列添加至恒定量的核酸，并且通过琼脂糖或丙烯酰胺凝胶中的迁移率测定纤丝形成。由于结合的蛋白质延迟多核苷酸的电泳迁移率，通过核酸的延迟迁移率证明纤丝形成。可以使用最大程度的延迟，或者最大量的以延迟迁移率迁移的核酸来指示最佳的重组酶：：核酸比率。也可以通过测量多核苷酸结合硝酸纤维素的能力来定量蛋白质-DNA联合。
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本文所列出的专利申请、专利、出版物和期刊文章等在此出于所有的目的通过引用并入本文；在冲突的情况中，以说明书为准。
实施例
除非另有说明，包括生产TALENs的常规技术一般描述于US2013/0117870中。这些常规技术中的一些技术进一步在本文中描述。以及特定实施例提供了详细的实验数据和结果。
实施例1
TALEN的设计和生产；一般条件。使用在线工具“TALEFFECTORNUCLEOTIDETARGETER”鉴定了靶向DNA序列和RVD序列的候选TALEN。之后按照金门组装方案(GoldenGateAssemblyprotocol)，使用pCGOLDYTALEN(AddgeneID38143)和RCIscript-GOLDYTALEN(AddgeneID38143)作为最终目标载体(Carlson2012)构建了用于TALENDNA转染或体外TALENmRNA转录的质粒。通过使用HIPUREPLASMIDMIDIPREP试剂盒(LifeTechnologies)制备该最终pC-GoldyTALEN载体，并在使用前测序。使用QIAPREPSPINMINIPREP试剂盒(Qiagen)制备的组装RCIscript载体被SacI线性化以用作体外TALENmRNA转录的模板，其中所述转录使用前面描述的mMESSAGET3试剂盒(Ambion)。修饰的mRNA合成自前面所描述的RCIScript-GOLDYTALEN载体(Carlson2012)，其取代了由3’-0-Mem7G(5’)ppp(5’)GRNA帽类似物(NewEnglandBiolabs)、5-甲基胞苷三磷酸三磷酸假尿嘧啶(TriLinkBiotechnologies,SanDiego,CA)和三磷酸腺苷三磷酸鸟苷所组成的核糖核苷酸混合物。对于帽类似物、三磷酸鸟苷和其它核苷酸的最终核苷酸反应浓度分别为6mM、1.5mM和7.5mM。所得的mRNA在使用MEGACLEARREACTIONCLEANUP试剂盒(AppliedBiosciences)纯化前，用DNAse进行处理。
组织培养和转染；一般条件。猪或牛的成纤维细胞维持在37或30℃(如所示)，5％CO2，补充有10％胎牛血清、100I.U./ml青霉素和链霉素以及2mML-谷氨酰胺的DMEM中。对于转染，除非另有说明，通过使用Neon转染系统(LifeTechnologies)在转染中递送所有TALENs和HDR模板。简而言之，接近100％汇合的低传代的Ossabaw、Landrace、Wagyu或Holstein成纤维细胞以1：2分离(split)并在达到70-80％汇合的那一天收获。每次转染包含重悬于混合有质粒DNA或mRNA和寡核酸(oligos)的缓冲液“R”中的500,000-600,000个细胞，并使用100μl的枪头通过下列参数进行电穿孔：输入电压：1800V；脉冲宽度；20ms；和脉冲数；1。通常，每次转染包括2-4μg的TALEN表达质粒或1-2μg的TALENmRNA和2-3μM的特异于感兴趣基因的寡核苷酸。图示中示出了这些量的偏差。转染后，细胞以60：40的比例分入6孔皿的两个独立的孔中，分别在30或37℃下培养3天。三天后，扩增细胞群并在37℃下直到至少10天以评估编辑(edits)的稳定性。
实施例2稀释克隆
在所示的一些情况下使用稀释的克隆。转染后3天，将50到250个细胞接种到10cm的培养皿上，并培养直到单个集落达到直径约5毫米。此时，加入6ml以1：5(vol/vol)稀释于PBS的TrypLE(LifeTechnologies)并吹打集落，将其转移到24-孔皿的孔中并在相同条件下培养。收集达到汇合的集落并分开用于冷冻保存和基因分型。样本制备：在第3天和第6天从6-孔皿的孔中收集转染的细胞群，且将10-30％的细胞重悬于50μl与1×PCR相匹配的裂解缓冲液(compatiblelysisbuffer)中：10mMTris-ClpH8.0，2mMEDTA，0.45％TrytonX-100(vol/vol)，0.45％Tween-20(vol/vol)新鲜补充200μg/ml蛋白酶K。使用下列程序在热循环仪中处理裂解物：55℃60分钟，95℃15分钟。使用20-30μl的裂解缓冲液以前述方法处理来自稀释克隆的集落样本。
实施例3突变检测和RFLP分析
根据生产厂商的推荐，使用具有1μl的细胞裂解物的PLATINUMTAQDNAPOLYMERASEHIFI(LifeTechnologies)进行目的位点侧翼PCR。根据生产厂商的推荐使用如上所述的10ul的PCR产物，用SURVEYORMUTATIONDETECTION试剂盒(Transgenomic)分析群体中的突变频率。使用指示的限制性内切酶在10μl的前述PCR反应中进行RFLP分析。在10％的TBE聚丙烯酰胺凝胶中分析SURVEYOR和RFLP反应，并用溴化乙锭染色观察。使用ImageJ进行条带的密度测量；且如Guschin等人，2010描述计算SURVEYOR反应的突变率。通过用RFLP片段的强度总和除以亲本条带+RFLP片段的强度总和来计算HDR百分率。为了分析mloxP插入，将跨越插入位点的小PCR产物溶解于10％的聚丙烯酰胺凝胶中，且插入比野生型等位基因可通过尺寸区分并量化。类似地处理克隆的RFLP分析，除了用1XMYTAQREDMix(Bioline)扩增PCR产物并溶解于2.5％琼脂糖凝胶中。为了分析仅GDF8G938A基因渗入(缺少新的RFLP的寡聚酸)的克隆，通过能够区分杂合子和纯合子基因渗入的三条引物实验初步筛选克隆；简单来说，通过使用下列引物和程序的1×MYTAQREDMIX(Bioline)的PCR分析猪或牛集落的裂解物。牛GDF8(外引物F1：5’-CCTTGAGGTAGGAGAGTGTTTTGGG(SEQIDNO：3)，外引物R1：5’-TTCACCAGAAGACAAGGAGAATTGC(SEQIDNO：1)，内引物F1：5’-TAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGACTA(SEQIDNO：2)；和35循环的(95℃，20s；62℃，20s；72℃，60s；)。猪GDF8：外引物F1：5’-CCTTTTTAGAAGTCAAGGTAACAGACAC(SEQIDNO：4)，外引物R1：5’-TTGATTGGAGACATCTTTGTGGGAG(SEQIDNO：5)，内引物F1：5’-TAAGGCCAATTACTGCTCTGGAGATTA(SEQIDNO：6)；和35循环的(95℃，20s；58℃，20s；72℃，60s；)。将候选物的扩增子进行直接测序和/或TOPO克隆(LifeTechnologies)和通过Sanger测序法进行测序。为了检测在有BB-HDR模板的TALEN介导HDR，将1μl的或1μl1：10稀释的PCR裂解物(1,000细胞/ul)添加到含有PCR引物btGDF8BB5-1(引物“c”)和引物“c”(BB-Detect3-1-5’-GCATCGAGATTCTGTCACAATCAA(SEQIDNO：7))的PCR反应中，并使用1XMYTAQREDMIX(Bioline)进行40循环(94595℃，20s；66℃，20s；72℃，60s)的PCR。为了确认由前述PCR所鉴定的集落中的HDR，使用引物btGDF8BB5-1和btGDF8BB3-1扩增整个基因座，然后进行TOPO克隆(LifeTeclmologies)和测序。
实施例4通过测序确认BelgianBlue基因渗入
Wagyu野生型GDF8和BelgianBlue模板(BB-HDR)的图示于图2。使用位于同源臂外部的引物(c和d)对五个PCR阳性集落进行PCR，接着进行克隆和用引物b’测序。与野生型序列的比较证明，在5个集落的4个中，有预期的11个碱基对缺失为特征的BelgianBlue等位基因(杂合)。设计TALENs(btGDF83.1)和dsDNA模板(BB-HDR)以将11碱基对缺失通过双链断裂诱导的同源重组引入牛GDF8(BelgiumBlue突变)的外显子3中。左TALEN结合位点的一半在BB-HDR模板中缺失，并因此应该抗TALEN切割。SURVEYOR分析证明btGDF83.1TALENS在37和30摄氏度下的活性。等位基因特异性PCR证明HDR诱导依赖于TALEN和BB-HDR模板的共转染。开发PCR分析以使用引物c和c’特异性检测经HDR修饰的GDF8等位基因。引物c’的3’端跨越11个碱基对的缺失，并且不能扩增野生型等位基因(wt)。包括阳性对照的每个PCR反应中包括500份细胞等同物。通过实验性反应和对照反应之间的比较性密度测定法来测定HDR百分比。
实施例5野生型Wagyu牛中目的基因的精确改变。
通过在基因的靶向区域产生缺失(11bp缺失)来改变野生型Wagyu牛的基因。这种改变产生了具有BeliganBlue牛的等位基因的Wagyu牛。当独自转染时，btGDF8.1TALEN对在靶基因座切割多至16％的染色体。设计TALENs(btGDF83.1)和dsDNA模板(BB-HDR)以将11bp缺失通过DSB诱导的同源重组引入牛GDF8(BelgiumBlue突变)的外显子3中。左TALEN结合位点的一半在BB-HDR模板中缺失，并使它抗TALEN切割。SURVEYOR分析证明btGDF83.1TALENS在37和30摄氏度下的活性。使用引物b和b’(未显示)生成用于该分析的PCR产物。这些复制子中不包含BB-HDR模板，因为这将混淆对btGDF83.1活性的估计。等位基因特异性PCR证明HDR诱导依赖于TALEN和BB-HDR模板的共转染。开发PCR分析以使用引物c和c’(未显示)特异性检测经HDR修饰的GDF8等位基因。引物c’的3’端跨越11个碱基对的缺失，因而其不能扩增野生型等位基因“wt”。包括阳性对照“C”的每个PCR反应中包括500份细胞等同物。通过实验性反应和对照反应之间的比较性密度测定法来测定HDR百分比。无预期事件的选择，如在第3天半定量PCR所暗示的，与带有来自BelgianBlue牛1623bpDNA片段的超螺旋DNA模板共转染导致0.5％到5％的基因转换频率(HDR)。这些结果证明TALENs能够用于有效地将外源核酸序列置入家畜中，包括等位基因-且无需标记。为了评价个体集落中置入的频率，实施转座子共选择策略以分离和扩大用于DNA测序的个体集落。通过PCR检测，在366个集落的5个中检测到使用来自BelgianBlue牛模板的基因转换。用BelgianBlueHDR模板外部的引物扩增和测序在4个集落中确认了预期11bp缺失的存在。
进行第二次重复试验得到相一致的结果，其中所有测试集落中约1％为双等位基因转换阳性，且所有测试集落中约0.5％到约1％为等位基因转换杂合的。
类似的，还使用寡HDR将等位基因引入猪(Ossabaw)细胞。所述细胞用编码TALENs的mRNA与单链寡核苷酸的组合进行修饰，以将在一个物种中天然发生的等位基因置入另一个物种中(种间迁移)。选择皮德蒙特牛(Piedmontese)GDF8SNPC313Y作为一个例子，并将其引入Ossabow猪细胞。在这些细胞的任何阶段均未使用标记。观察到在猪和牛细胞0.4nmolssODN处出现HDR的相似峰，(未显示)，然而Ossabaw成纤维细胞中通过更高浓度的ssODN未消灭HDR。
实施例6在目的的靶点修饰
生产了靶基因的连续修饰。参照图4，每个图表显示了使用寡核酸供体模板和作为质粒DNA或mRNA递送的TALENs靶向成纤维细胞中特异性基因座的结果(即，ssIL2RG；“ss”代表野猪和“bt”代表普通牛)。(插图)寡核酸模板的图表，其中阴影框代表TALEN结合位点且间隔子以白色示出。每个寡核酸包含4bp的插入(ins4)或缺失(del4)，其引入了用于RFLP分析的一个新的限制性位点。推定性阻断突变(BM)将保守的-1胸苷(相对于TALEN结合位点)替换为指示的核苷酸。用TALEN编码质粒(3μg)或mRNA(1μg)连同3μM同源寡核酸同源模板(cognateoligo-homologoustemplate)转染成纤维细胞。然后，在37℃扩增至第10天前，细胞在37℃或30℃孵育3天。在第3天时通过Surveyor分析来测量TALEN的活性，且在第3天和第10天通过RFLP分析检测HDR(第3天％HDR和第10天％HDR)。每个棒显示三次重复的平均与SEM。成功地修饰了每个靶向的基因座。
实施例7在基因中高效地生产预期的改变。
图5显示了对基因APC、LDLR、p53、p65和btGDF8产生改变的分析。在有些情况中，插入是有意的，而在其它情况中SNPs是有意的。如上所述，使用TALENs和HDR模板产生改变。对完美的、预期的HR读取相对野生型读取的计数作图：插入(小图a)和SNP等位基因(小图b)。进行了TALEN刺激的HDR等位基因的序列分析。通过ILLUMINA测序，对衍生自TALENmRNA的和转染细胞群的寡聚核酸的涵盖靶位点的PCR扩增子(共200-250bp)进行测序。每个样本的总读数的范围从10,000到400,000。靶基因座、时间点和是否寡核酸包含BMs如下所示。小图c显示了来自于btGDF8和p65的读数，其分类用于靶SNP的整合，然后对预期的(iSNP)相对这些些具有额外突变(iSNP+Mut)分类，并针对总读数作图。因此，在只有单个SNP是预期的情况中，也存在所示的额外变化。
实施例8带有HDR等位基因集落的恢复频率
表1，名为带有HDR等位基因集落的恢复频率，列出了约650个细胞集落在八个分离的基因座中预期的插入缺失等位基因分析的结果。分析显示了10-64％的恢复率(平均，45％)，以及多达32％的编辑纯合的集落。如上所述，使用TALENs和HDR模板生产变化。通过无需药物筛选的稀释克隆获得集落。
实施例9具有DAZL和APC的HDR等位基因的克隆猪
图6显示了克隆动物的遗传分析。选择猪基因组中两个基因编辑基因座：缺失无精样(DAZL)和腺瘤性结肠息肉(APC)。通过染色质转移(CT)，汇集(pooled)用HDR-或NHEJ编辑的DAZL或APC等位基因处理的培养的细胞集落，用于克隆。每个汇集从三个转移中产生两个妊娠(pregnancies)，每个妊娠均携带至足月。从DAZL修饰的细胞中出生了总共八只小猪，每头猪表现出与HDR等位基因(建立者1650、1651和1657)或由NHEJ导致的缺失(图5A)相一致的所选择集落的基因型。三只DAZL小猪(建立者1655-1657)胎死腹中。在来自APC修饰的细胞的六只小猪中，一只胎死腹中，三只在1周内死亡，另一只3周后死亡，只剩下建立者1661存活。基因型和存活之间相关性的缺乏暗示早期死亡与克隆而非基因编辑有关。所有六只APC小猪对于预期的HDR编辑的等位基因是杂合的，且除一只外其它所有小猪具有在第二等位基因上的3bp的框内插入或缺失(图6a和b)。饲养剩下的动物用于精子阻滞(DAZL－/－建立者)或结肠癌发育(APC+/－)表型分析。参照图6，(a)分别来自DAZL-和APC-修饰的landrace和Ossabaw成纤维细胞的克隆小猪的RFLP分析。对于DAZL建立者，期望的RFLP产物为312、242和70bp(空心三角形)，且那些对于APC的产物为310、221和89bp(实心三角形)。WT和DAZL建立者间312bp条带大小上的差异反映了预期的等位基因缺失。(b)序列分析确认了HDR等位基因存在于八个DAZL建立者的三个中，和六个APC建立者的六个中。用箭头指示供体模板(HDR)中的BMs，且插入的碱基包含于块(blocks)中。顶部WT序列中的粗体字指示TALEN结合位点。
实施例10GPR54敲除
图7描绘了根据指示的基因靶向策略制备的GPR54敲除。设计以结合猪外显子3(下划线文字)的TALENs与设计以引入提前终止密码子(框的)和HindIII限制位点的寡核苷酸同源模板(HDR)共转染。对于示于小图b中的实验结果，2微升的TALENs编码mRNA加0.2nMol(2uM)的HDR模板被转染入猪成纤维细胞，使用NEON核转染系统(LifeTeclmologies)和下述设定的500,000猪成纤维细胞：1脉冲，1800v；20ms宽度和100ul枪头。细胞在暴露TALENs后，在30℃下生长3天，且对细胞计数，并以1-20个细胞/cm2的密度范围铺在10cm的平皿中。细胞被培养10-15天直到可观察到3-4mm直径的个体集落。用p-200移液器轻柔吹打集落，并挤出到带有500ul生长培养基的24孔板中的孔中(Carlson，2011)。选择带有清晰明确的集落的板(～10-30/板)用于集落吸入(colonyaspiration)以限制吸入的细胞成为多集落的机会。一旦集落在24孔皿中的汇合度达到70-90％，收集一部分用于RFLP分析，并冷冻保存剩下的部分。小图b)通过HindIIIRFLP分析总共96个集落的同源依赖的修复。PCR反应中加入来自每个集落的DNA，所述反应含有靶位点侧翼的PCR引物；正向(5’-aaggatgtcagcacctctctggg(SEQIDNO：8))和反向(5’-ACCCACCCGGACTCTACTCCTACCA(SEQIDNO：9))。PCR产物(389bp)被加入到HindIII限制性消化并在2.5％琼脂糖凝胶上分析。每条道代表一个集落。231和158bp的切割产物代表同源依赖修复。带有389bp亲本条带的集落被归为HDR，敲除等位基因的杂合子(空心三角形)以及那些不带有的被归为HDR，敲除等位基因纯合子(实心三角)。细胞或通过该技术制备的细胞，将被用于使用常规技术克隆动物。
实施例11创建无处理不成熟的家畜
将制备带有GPR54敲除的家畜，包括牛、猪和鸡。下面的实施例详细说明一个这样的过程。以下描述针对猪的具体方法；本领域技术人员在阅读该申请后将能够将该实验改变以适合于其它家畜。开发Gpr54的TALENs，并用于产生杂合和纯合敲除细胞系。将使用雄性和雌性Gpr54-/-和/或杂合Gpr54+/-细胞系与由杂交产生的Gpr54-/-动物建立妊娠。将评估Gpr54+/-动物的发育和生育能力。在建立了不进展到青春期且确实不育的Gpr54-/-动物后，将通过促性腺激素或GnRH1处理进行恢复生育能力的实验。已证明的产生高效TALENs的能力、分离突变集落和从细胞或受精卵生产转基因动物的能力已很好地记录在本文中，还参见Tan等人,PNAS,110(41)：16526-16531,2013。
Gpr54-/-雄性和雌性猪的生产。如在实施例11中所产生的，携带有双等位基因移码突变的十个双等位基因敲除(KO)的雄性和雌性克隆，将通过SCNT汇总以用于克隆。将进行两轮克隆(每个3次转移(Transfer))。如果第一轮Gpr54-/-没有建立妊娠，则第2轮克隆将用Gpr54+/-细胞进行。通过Gpr54靶向区域的测序表征所获得动物的基因型。如果Gpr54+/-细胞被用于克隆，将通过杂交产生Gpr54-/-动物。
Gpr54-/-猪的表型评价。对于Gpr54-/-动物以及开始于5月龄并持续到9月龄的年龄匹配的对照，每两周定量睾丸酮和FSH血清水平的(≥3每性别)，。对于雄性，测量睾丸尺寸，并根据体重和年龄作图。在9月龄，如果Gpr54-/-猪偏离野生型对照动物且未能表现出血清学或指示青春期的行为表型(如跨骑)，将处死至少一头雄性和雌性用于由合格的病理学家进行的生殖器官的解剖和组织学评估。
GnRH1注射作为一种在Gpr54-/-猪中恢复生育能力的方式的评估。促性腺激素或脉冲式GnRH1疗法是一种对于HH病人中恢复生育能力的有效的治疗方法。(Buchter,D.,Behre,H.M.,Kliesch,S.,andNieschlag,E.(1998).PulsatileGnRH1orhumanchorionicgonadotropin/humanmenopausalgonadotropinaseffectivetreatmentformenwithhypogonadotropichypogonadism:areviewof42cases.EurJEndocrinol139,298-303)。对于任一将会成功的治疗，在血清LH和睾丸酮水平的阳性应答必须是明显的。因此，我们寻找以确定是否不育的Gpr54-/-表现出与GnRH1注射相应的LH或睾丸酮的典型峰(spike)(Wise,T.,Zanella,E.L.,Lunstra,D.D.,andFord,LT.(2000).Relationshipsofgonadotropins,testosterone,andcortisolinresponsetoGnRHlandGnRHlantagonistinboarsselectedforhighandlowfollicle-stimulatinghormonelevels.JAnimSci78,1577-1590.)静脉导管将置于受试者公猪(n>3)中用于重复血液采样。每20分钟进行采样，且在120分钟时将单次推注施用GnRH1(100ng/kg体重)。GnRH1注射后，以30分钟，每10分钟的取样频率监视LH波动，之后进行另外的每20分钟的四小时取样。
通过显性负调控(DominantNegatives)的基因失活。相似的方法也可用于表达失活一个或多个基因的显性负调控子。并且，例如，编码显性负调控的转座子可通过合适的转座酶插入基因组。如，恢复生育能力的治疗可以是具有用于繁殖力拯救的药物性伴护蛋白(pharmacoperones)的饮食治疗。
实施例12
生产了与p65的T1591C位点重叠的CRISPRgRNAs并用于评估基因渗入。观察到在预期位点处的双链断裂(DSBs)的有效产生。CRISPR/Cas9介导的HDR在第3天时为<6％且在第10天时低于检测限。由CRISPR介导的HDR的修饰克隆的恢复低于由TALENs介导，即使TALENs切割远离SNP位点35bp(表1)。CRISPR/Cas9诱导的靶向第二基因座(sAPC14.2)的分析更有效，尽管其并未达到在该位点由TALENs诱导的HDR的水平(～30％对比60％)。还参见，Tan等人,PNAS,110(41)：16526-16531,2013).RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science339(6121)：823-826。
实施例13
参照图8，kiss基因的结构组织是保守的，并包含两个编码外显子，一个编码信号肽和亲吻肽前体的部分，另一个编码包括亲吻肽10序列的前体的剩余部分。罗非鱼KissmRNA中内含子的位置用三角字形(triangleglyph)指示。用于靶区域(442bp)PCR扩增的正向和反向引物的位置和TALEN的两个工程化对，Kiss1.1a和Kiss1.1b的结合位点用黑盒和灰盒指示。小图b显示靶向的kiss基因组区域的图示，其显示了亲吻肽10生物活性肽以及每个kiss1.1a和1b的TALENs识别位点的位置。还显示了用于插入缺失分析的PCR(442bp)和qPCR引物对(138bp扩增子)。
实施例14鱼中Kiss和KissR敲除
A.TALEN表达载体的构建
显示构建的表
使用的引物的表
B.TALENmRNA合成。
用5-10x单位的SacI高保真酶在200μL反应中酶切pT3Ts-TALEN的MINIPREPDNA2小时。用8μLRNAsecure(Ambion)处理限制酶切物并在60℃下孵育十分钟。使用来自Qiagen的MINIELUTEPCRcleanup试剂盒纯化RNAsecure处理的DNA，并在10μL无RNA酶的注射缓冲液中洗脱(5mMTrisCl,pH7.5；0.1mMEDTA)。使用mMESSAGEMACHINET3试剂盒(Ambion)，用1ug线性化的模板并在37℃下孵育1.5小时来生产合成的mRNA。用TurboDNA酶处理15分钟后，使用AmbionMEGACLEAR试剂盒纯化mRNA，并用50μL加热的H2O洗脱。
C.TALENs对的显微注射
合并编码每个TALEN臂的RNA并以10-200ng/μL的浓度重悬于无核酸酶的水中。5-20pL被注射入单个细胞阶段(onecellstage)的罗非鱼胚胎。在受精后第6天测量相对于未注射的对照组的注射胚胎的存活。使用给与50％存活率的RNA浓度用于重复/标准注射以产生敲除。为了证实注射的胚胎死于TALENs诱导的突变，收集畸形的胚胎，并使用QPCR解链曲线分析研究靶位点上的突变。
D.组织收集以及对照和RNA处理罗非鱼的DNA抽提
将六天龄的RNA处理的胚胎(畸形的)去绒毛膜(dechorionated)麻醉且用刀片切除卵黄囊。在裂解缓冲液(10mMTris，10mMEDTA，200mMNaCl，0.5％SDS，100mg/ml蛋白酶K)中过夜消化胚胎组织；并用自动的ResearchX-tractor，使用whatmanTMunifilter800，96孔板的Corbettrobotic系统(GEHealthcare，UK)提取。将幸免于显微注射且正常发育的胚胎(来自具有～50％存活率的组)饲养到1个月大，麻醉；减掉鳍并放在单独的罐子中，而分析它们的鳍DNA(如上所述的在裂解缓冲液中过夜消化，然后DNA提取)。从在kiss或kissR基因座上携带有体细胞突变的G0雄性中剥离精子，并使用DNAzol试剂(LifeTechnolgies)按照标准流程提取gDNA。提取的DNA重悬于30μl的MQH2O中。
E.通过QPCR鉴定突变
用ROTOR-GENERG-3000REALTIMEPCRSYSTEM(CorbettResearch)进行实时qPCR。6μL基因组DNA(gDNA)模板(稀释到1ng/μl)被用在总体积为15μL的包含0.4μM浓度的各个正向和反向引物以及7.5μL2xBrilliantIISYBRGREENQPCRMASTERMIX(AgilentTechnologies)中。使用DNAstar软件设计qPCR引物(表1)。使用40循环的95℃15秒，60℃60秒进行qPCR，然后通过解链曲线分析以确定测定的特异性(67℃到97℃)。在该方法中，为了检测在靶kiss和kissR基因座发生的DNA多态性，从gDNA样本中生成包含感兴趣区域的短PCR扩增子(约100-140bp)，进行温度依赖的解离(解链曲线)。当TALEN诱导的多态性存在于模板gDNA时，将形成异源双链(heteroduplex)和不同的同源双链(homoduplex)分子。通过检测到存在多种形式的双链分子，这表示双链解链作为单一物种或作为多个物种。一般来说，解链曲线和解链温度的对称性暗示dsDNA序列和其长度的一致性。例如，如果产生小插入或缺失(其是由NHEJ的TALENs诱导的DSB的修饰所导致的)则该解链温度将与缺失或插入的长度正相关，与断裂碱基-碱基氢键所需的能量成比例。如果存在多种形式的双链分子，给定修饰的(不对称的)解链曲线，温度依赖的退火将一并检测最不稳定的异源双链和最稳定的同源双链。通过与相同的主混合物反应(mastermixreaction)并行扩增的参考DNA样品(来自未注射的罗非鱼对照或含有感兴趣的基因组区域的质粒)相比较，进行解链分析。简而言之，解链状况中的变化将区分带有TALEN诱导的突变的序列和野生型序列，由此易化筛选。
F.在体细胞或显微注射的罗非鱼生殖细胞中计算突变率以及TALEN诱导的突变的描述。
体细胞或生殖细胞gDNA产生不对称qPCR解链曲线的鱼被进一步分析以测量突变频率。包含靶位点的基因组PCR产物(442bp对于Kiss和720bp对于KissR)获得自鱼鳍DNA或精子DNA。在25μL的反应混合液中进行PCRs，其中所述混合液包含120-180ng模板gDNA，0.1μl的PlatinumTaqDNA聚合酶，0.2mMdNTPs，1×TaqDNA聚合酶缓冲液，2mMMg2+，和0.2μM的每个引物。下述条件下完成DNA扩增：95℃5min，接着35循环的94℃30s，55℃30s，和72℃45s，以及在72℃下最终延伸2min。将PCR产物克隆入TOPO2.1TA质粒(Invitrogen)，并转化感受态大肠杆菌细胞(ONESHOT，Top10F’，Invitrogen)。转化的菌落用无菌枪头随机挑取并在重新铺到选择性琼脂培养基之前直接转移到单独的qPCR反应管中。使用跨越感兴趣的TALENs靶位点的引物进行qPCR(100-140bp扩增子)。表现出特异性产物扩增的QPCR反应与参考DNA样品对照(野生型序列)相比较以鉴定解链曲线变体(图10小图c和d)。用突变序列的数目(带有变异解链解链的集落)除以序列分析的总数目再乘以100来计算DNA突变率。为了观察在靶基因座上的突变，代表单独的体细胞或精子细胞的克隆被展现在Ct与解链温度的散点图上(例如参见图10小图d)。在这些图表中，数据点(x,y)代表每个大肠杆菌菌落，其中x代表其Ct和y代表其解链温度。带有相同序列的单独的菌落应该显示出相似的解链温度。表现出变异的解链温度的菌落生长过夜，并提取和纯化它们的质粒(MINIPREPARATIONkit，QUIAGEN)。然后使用如所指的，选择的针对kiss和kissR区域的引物测序包含TALENs靶位点的区域。为了表征在F1和F2鱼中的突变，在基于硅膜的离心柱(QIAQUICKPCRPURIFICATIONKIT,QIAGEN)上纯化包含靶kiss1.1a和KissRE3基因座的442bp和702bp的扩增子。使用内引物(KissRF)直接测序纯化的PCR。
G.建立者筛选
从所有推定的建立者中剥离配子，且F1胚胎产生自与从WT家畜收集的配子的体外受精。受精后3周，切除F1子代的鱼鳍并分开保存在单独的罐子中。如前面所描述的方法提取鱼鳍DNA(参见上面的组织收集和DNA提取部分)，并使用分光光度计NANODROPND1000调整到1ng/μl)。大体上，通过使用如上所述的解链分析策略的QPCR筛选来自每个潜在建立者的10-20个雏鱼(juveniles)。为了确认序列，扩增了来自单个胚胎/雏鱼的基因组DNA，并在PCR产物纯化后进行测序。
两个同时读取的PCR测序层析代表插入缺失的存在。缺失或插入通常开始于序列读取产生分歧时。然后双序列被仔细分析以检测独特的核苷酸读取(参见图12小图a)。然后针对一系列产生自在野生型序列上逐渐移动的人工单个读取模式分析所述独特的核苷酸读取的模式。
H.工程化的TALENs的突变效力
工程化的TALENs和编码各个异二聚体TALENs的合成的加帽mRNA在从10到250ng/μl的各种浓度下一起注射入1-细胞期罗非鱼胚胎。然后我们在注射后第6天(dpf)观察注射的胚胎。注射了少于10ngTALENs的胚胎正常发育，而200ng(Kiss1a)和100ng(KissRE3)的剂量产生高达50％的死或畸形的胚胎。250ng剂量的kiss1.1b和kissRE2产生小于30％的致死率。第五天，将那些正常发育的胚胎和那些具有形态畸形的胚胎分离。为了检查突变的证据，从3个畸形胚胎池(每个来自TALENs处理组)中和从来自未注射对照组的3个正常胚胎中分离基因组DNA。基因组DNA被用于靶基因座的QPCR解链分析。在用靶向kiss1.1a和kissRE3基因座的TALENs处理的胚胎池中发现非对称解链曲线图形(Asymmetricmeltprofile)(数据未显示)，但未在用其它两TALENs对处理的胚胎中发现。
为了证实突变的存在，通过QPCR解链分析测定每组中的20-40条正常发育的雏鱼。注射了TALENKissR-E2和Kiss1.1bmRNA的鱼中未生变异的解链，这表明没有制备出突变或突变不产生可检测到的解链变异。然而，发现了产生变异解链曲线的共8条鱼，kiss1.1a和KissRE3基因座各4条(图10小图a和小图b)。为了确认观察到的解链变异产生于野生型和带有靶位点微插入或缺失的NHEJ产物，在PCR反应中扩增每个靶区域(442bp对于Kiss和702bp对于KissR)。将获得的PCR片段克隆入TopoTA载体，且通过直接realtime-PCR筛选转化的集落。对于每条测试的鱼，手工挑选(随机)14到21个之间的大肠杆菌转化子菌落，并直接加入(无DNA纯化)到Q-PCR反应混合液中。
通过与野生型未修饰的序列比较来鉴定带有突变的等位基因的集落。检测到了具有变异解链曲线范围在50-91％的高频集落(图10小图c和d)。
为了表征这些损伤中的一些，提取了来自产生变体扩增子的克隆的质粒，并对PCR插入测序。对于每个TALENs处理组，4到7个之间的克隆被测序，且除了一个克隆外，均带有突变的等位基因。从所有8个TALENs处理的鱼中检测到在kiss和kissr基因中的总共14个不同的体细胞突变(8个在Kiss1.1a基因座和六个在KissRE3基因座)。观察到9个不同的核苷酸缺失、两个插入，以及三个核苷酸插入和缺失的组合(图11小图a和b)。通过RT-PCR解链分析检测到仅3bp的缺失/插入。观察到TALENs诱导的突变在RNA处理的鱼中发生多次，导致嵌合的体细胞突变(参见下表)。
发现高于95％的来自表现出解链变异的克隆的序列带有突变，这表明DNA突变率可近似于通过测量产生变体解链克隆的频率。因此，计算的突变率为35％到91％之间，取决于鱼。这个结果表明在预期的基因组位置高效引入靶向的插入缺失。
所述表格，体细胞突变筛选结果的总结，显示了TALENs注射的罗非鱼的结果。第二栏描述了体细胞中鉴定的突变序列，包括插入缺失的大小(+，插入；-，缺失)并且在括号中显示了产生的蛋白序列修饰。在最后一栏，从产生变异解链温度的集落的频率中计算出每条鱼估计的体细胞突变率。
表：体细胞突变筛选的结果的总结
I.TALENs突变的序列分析
不同类型的核苷酸突变中，五和六产生移码，导致分别在kiss和kissr基因中产生提前终止密码子。也有在Kiss1.1a基因座处高频率的12nt缺失，其在所有4条TALENs处理的鱼中独立发生。这个突变导致4氨基酸(AA)的突变。
将F0TALENs突变的罗非鱼饲养至性成熟并确定它们的性别。为了显示TALENs处理的鱼能够诱导遗传突变；从每个排精动物(spermiatinganimals)的精液中提取基因组DNA并筛选。通过如前文描述的显示变体解链曲线的克隆的频率确定带有突变的精子的频率。为了表征与精子相关的损伤，从带有变体解链的克隆中提取质粒并测序。观察到50％到91％的种系突变频率。序列揭示每条鱼种系中存在多个插入缺失。
表：测序
J.分析在Kiss和KissR位点的生殖系突变。
为了进一步证明Kiss和kissRTALENs在生殖系中有效地诱导突变，将8条建立者与野生型鱼(stock)杂交。所有8条TALENs处理的鱼是可繁殖的，且产生了活的胚胎群(clutchesofembryos)。饲养这些子代并筛选突变等位基因的存在。所有8条建立者可以传递遗传突变。分析首先表明，如通过对F1代鱼鳍DNA提取物的QPCR解链曲线分析，带有推测突变的子代部分的范围在16％到90％之间。如预期地，TALENs处理的亲本中嵌合程度与带有突变的子代的频率呈正相关。对产生变形解链曲线的所选基因序列的分析均揭示了诱导的插入缺失突变的范围，其中的一些之前发现于建立者的体细胞组织中(图12小图b)。此外，对产生野生型解链的F1代鱼的测序均揭示了野生型序列。经常从单个建立者中发现多于一种类型的遗传突变，这暗示那些突变独立地发生于相同动物的不同生殖细胞中。遗传突变包括大小范围在3到18bp的缺失(图12小图b)。在所有kiss突变体建立者的子代中，唯一的遗传突变为12nt和18nt的缺失，这导致丢失4个和6个AA。尽管，那些突变并不导致移码突变，它们在Kiss-10肽的大多数C末端区域移除一个或三个AA(图12小图c)。因为在脊椎动物中发现这个核心序列对kissR信号通路的激活是必须和必要的，那些突变将产生功能丧失表型。还鉴定出了之前未在建立者中分离到的位于KissRE3基因座上的移码突变。所有移码突变导致一提前终止密码子，其移除了从KissR蛋白的C末端172AA到高达215AA之间(△7nt，图12小图c)的部分。这些移除了蛋白序列57％的突变，将失活基因功能。所有在雏鱼F1后代中所鉴定的kiss和kissr突变在杂合状态均是能够存活的。
表：建立者筛选结果的总结。每个表的最后一栏中，带有插入缺失突变的胚胎的数目示于圆括号外，且插入缺失的大小显示在圆括号内。+，插入；-，缺失。
K.F1和F2代
F1杂合突变体未表现出形态缺陷，它们继续发育，并且都分化为两种性别的可繁殖的成年。鉴于在选择的突变体的所有体细胞中存在每个靶基因的野生型等位基因，因此性成熟的F1代中生殖表型的缺乏不是意料之外的。失活表型的特征只可能存在于纯合(或复合纯合)状态下的带有与功能丧失突变相关的鱼的F2代中。为了产生纯合突变，收集自F1杂合突变体的精子和卵被用于产生F2代，其正在生长；这些F2代，在提交之时，处于正常期望性成熟的时间之前的年龄。
进一步描述
1.一种包含基因组的遗传修饰的家畜动物，所述基因组包含性成熟选择性的神经内分泌基因的失活，其中所述基因的失活阻止动物性成熟。2.1的家畜动物，其中所述基因的失活包括编码性成熟基因和/或其顺式调控元件序列中一个或多个碱基的插入、缺失或替换。3.1的家畜动物，其中失活的基因通过下述方式失活：从动物的基因组中去除至少所述基因的一部分、改变基因以阻止由该基因编码的功能因子的表达，或反式作用因子。4.3的家畜动物，其中所述基因被反式作用因子失活，所述反式作用因子选自由干扰DNA和显性负调控因子组成的组，其中所述反式作用因子由外源基因或内源基因表达。5.4的家畜动物，其中所述反式作用因子包含针对GPR54的显性负调控。6.1-5的家畜动物，其中基因的失活是在可诱导系统控制下的。7.6的家畜动物，其中所述可诱导系统包括由Tet-On、Tet-Off、Cre-lox和Hiflalpha组成的组的成员。8.1-7的家畜动物，其中所述动物选自由牛、猪、绵羊、鸡、山羊和鱼组成的组。9.1-8所述的家畜动物，其中所述性成熟基因选自由Gpr54、Kissl和GnRHll组成的组。10.1-9所述的家畜动物，其中所述动物由于重组蛋白的表达而进一步表达性状。10a.1-10的家畜动物，其中所述动物进一步表达外源重组蛋白。11.10的家畜动物，其中所述性状选自由生产性状、类型性状和可加工性状。12a.1-11的家畜动物，其中在相同物种的野生型动物性成熟的年龄时，该家畜动物是性未成熟的。12b.1-11的家畜动物，在不进行处理的情况下，该动物在遗传上是不能成熟的。
13.包含基因组的遗传修饰的家畜动物，其对于性成熟选择性的神经内分泌基因的失活是杂合的，其中所述失活基因纯合的后代因而被阻止成为性成熟。
14.13的动物，其中所述性成熟基因选自由Gpr54、Kiss1和GnRH11组成的组。
15.一种选自由细胞或胚胎组成的组的体外生物，所述体外生物包含含有性成熟基因失活的基因组。16.15的生物，其选自由牛、猪、绵羊、鸡、山羊和鱼组成的组的细胞或胚胎。17.15-16的生物，其中所述失活是在选自由Gpr54、KiSS1和GnRH11组成的组的基因中。
18.一种生产家畜动物的方法，包括将下述引入到选自由家畜细胞和家畜胚胎组成的组的生物中：一种特异结合到细胞染色体靶位点并导致双链DNA断裂以失活性成熟选择性的神经内分泌基因的试剂，其中所述试剂选自由TALEN、锌指核酸酶、Cas9/CRISPR和重组酶融合蛋白组成的组。19.18的方法，其中所述试剂是TALEN或TALEN对，其包含特异结合染色体靶位点的序列，并与另一TALEN组合在基因中创建双链断裂，或在染色体中产生双链断裂，所述另一TALEN产生了第二双链断裂，其中基因的至少一部分布署于(disposed)第一断裂和第二断裂之间。20.18-19的方法，其进一步包含将重组酶和TALEN或TALENs共引入所述生物中。21.19的方法，其中将表达转基因的试剂置于生物的基因组中。22.18-21的方法，其中所述将试剂引入生物包括选自由下述组成的组的方法：直接注射作为肽的试剂、注射编码所述试剂的mRNA、将所述生物暴露于编码所述试剂的载体，和将编码所述试剂的质粒引入生物中。23.18-22的方法，其中所述试剂是重组酶融合蛋白，其中所述方法包括引入靶核酸序列和所述融合蛋白，且所述靶核酸序列与重组酶形成纤丝以特异结合到染色体位点。24.18-23的方法，其中所述重组融合蛋白包含重组酶和Gal4。25.18-24的方法，进一步包括将核酸引入生物，其中所述核酸在双链断裂位点或第一断裂和第二断裂之间的位点插入所述生物的基因组。25a.18-24的方法进一步包括将具有序列的外源核酸模板引入所述生物，且所述生物的基因组在双链断裂位点接收所述序列。外源模板可拷贝或实际插入所述基因组，且结果相同，不论有关其是一个或其它机理的理论。结果是所述基因组具有该模板的序列。26.18-25的方法，其中所述核酸包含由终止密码子、报告基因和报告基因盒组成的组的一个成员。27.18-26的方法进一步包含从所述生物克隆动物。28.18-27的方法，其中所述动物选自由牛、猪、绵羊、鸡、山羊和鱼组成的组。29.18-28的方法，其中所述性成熟基因选自由Gpr54、Kiss1和GnRH11组成的组。30.18-29所述的家畜动物，其中在可诱导系统的控制下失活所述基因。
31.一种饲养家畜动物的方法，包括施用药剂到动物用于动物的性成熟，且所述药剂补偿了动物性成熟的遗传失能。32.31的方法，其中所述药剂包含促性腺激素或促性腺激素类似物。33.31-32的方法，进一步包含繁殖所述性成熟的动物以产生后代。34.权利要求31-33的方法，其中所述动物成熟的遗传失能是由于性成熟选择性的神经内分泌基因的遗传性失活导致。35.34的方法，其中所述失活的基因选自由Gpr54、Kiss1和GnRH11组成的组。36.34的方法，其中所述失活的基因通过以下方式失活：从动物的基因组中去除至少基因的一部分、改变基因以阻止由该基因编码的功能因子的表达，或反式作用因子。37.31-36的方法，其中所述动物选自由牛、猪、鸡、绵羊、鱼、兔、和山羊组成的组，所述施用试剂到动物在处理设施中进行，且所述后代从所述处理设施分布到多个地方进行饲养。
表1：带有HDR等位基因的集落的恢复频率

Claims (41)

1.一种生产家畜动物的方法，包括
将试剂引入到选自由家畜细胞和家畜胚胎组成的组的生物中，所述试剂失活性成熟选择性的神经内分泌基因。
2.权利要求1的方法，其中性成熟基因选择性的神经内分泌基因选自由Gpr54、KiSS1和GnRH11组成的组。
3.权利要求1或2的方法，其中所述试剂特异地结合到所述细胞的染色体靶位点并造成双链DNA断裂以失活性成熟选择性的神经内分泌基因。
4.权利要求1-3任一项的方法，其中所述试剂选自由TALEN、锌指核酸酶、Cas9/CRISPR和重组酶融合蛋白组成的组。
5.权利要求1-3任一项的方法，其中所述试剂包含TALEN，且所述方法进一步包含将重组酶和TALEN共引入所述生物中。
6.权利要求1-4任一项的方法，其中将表达所述试剂的转基因置于所述生物的基因组中。
7.权利要求1的方法，其中所述试剂是重组酶融合蛋白，且所述方法包括引入靶向核酸序列和所述融合蛋白，且所述靶向核酸序列与所述重组酶形成纤丝以特异性结合到染色体位点。
8.权利要求1-7任一项的方法，进一步包括将具有序列的核酸模板引入所述生物，且所述生物的基因组在双链断裂位点处接收所述序列。
9.权利要求1-8任一项的方法，进一步包括从所述生物克隆所述动物。
10.权利要求1-9任一项的方法，其中所述动物选自由牛、猪、棉羊、鸡、山羊、兔和鱼组成的组。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中在可诱导系统的控制下失活所述基因。
12.通过权利要求1-11任一项的方法制备的遗传修饰的家畜动物。
13.一种包含基因组的遗传修饰的家畜动物，所述基因组含有性成熟选择性的神经内分泌基因的失活，且所述基因的失活阻止所述动物成为性成熟。
14.权利要求13的家畜动物，其中所述基因的失活包括在编码性成熟基因和/或其顺式调控元件的序列中插入、缺失或取代一个或多个碱基。
15.权利要求13或14的家畜动物，其中通过反式作用因子失活所述基因，所述反式作用因子选自由干扰RNA和显性负调控因子组成的组，且由外源基因或内源基因表达所述反式作用因子。
16.权利要求13-15任一项的家畜动物，其中在可诱导系统的控制下失活所述基因。
17.权利要求13-16任一项的家畜动物，其中所述动物选自由牛、猪、棉羊、鸡、山羊和鱼组成的组。
18.权利要求13-17任一项的家畜动物，其中所述性成熟基因选自由Gpr54、Kiss1和GnRH11组成的组。
19.权利要求13-18任一项的家畜动物，其中所述动物进一步表达外源重组蛋白。
20.权利要求13-19任一项的家畜动物，其是在没有处理的情况下在遗传上不能成熟的。
21.一种生产权利要求13-20任一项的家畜动物的方法，包括制备在生物中神经内分泌基因的敲除，所述生物选自由细胞、胚胎、胚囊、体细胞、原代细胞和原始生殖细胞组成的组。
22.一种包含基因组的遗传修饰的家畜动物，所述基因组对于性成熟选择性的神经内分泌基因的失活是杂合的，其中对于所述失活的基因纯合的后代因而被阻止成为性成熟。
23.权利要求22所述的动物，其中所述神经内分泌基因选自由Gpr54、Kiss1和GnRH11组成的组。
24.一种饲养家畜动物的方法，包括施用试剂到动物用于动物的性成熟，且所述试剂补偿动物性成熟的遗传失能。
25.权利要求24的方法，其中所述试剂包含促性腺激素或促性腺激素类似物。
26.权利要求24或25的方法，其中所述动物成熟的遗传失能是遗传性失活的性成熟选择性神经内分泌基因的结果。
27.权利要求24-26任一项的方法，其中所述失活的基因选自由Gpr54、Kiss1和GnRH11组成的组。
28.一种选自由细胞或动物囊胚构成的组的体外生物，所述体外生物包含基因组，该基因组含有性成熟基因的失活。
29.权利要求28的生物，其为选自由牛、猪、棉羊、鸡、山羊、兔和鱼组成的组的细胞或胚胎。
30.权利要求28或29的生物，其中所述细胞选自由体细胞、原代细胞或原始生殖细胞组成的组。
31.权利要求28-30任一项的生物，其具有基因组，该基因组对于性成熟选择性的神经内分泌基因的失活是杂合的。
32.权利要求28-31任一项的生物，其中所述神经内分泌基因选自由Gpr54、Kiss1和GnRH11组成的组。
33.权利要求28-32任一项的生物，其中所述基因的失活包括
在编码性成熟基因和/或其顺式调控元件的序列中插入、缺失或取代一个或多个碱基。
34.权利要求28-33任一项的生物，其中通过反式作用因子失活所述基因，所述反式作用因子选自由干扰RNA和显性负调控因子组成的组，且由外源基因或内源基因表达所述反式作用因子。
35.一种生产体外生物的方法，包括向选自由家畜细胞和家畜胚胎组成的组的生物中引入试剂，该试剂特异性结合细胞的染色体靶位点以失活性成熟选择性的神经内分泌基因。
36.权利要求35的方法，其中所述试剂选自由TALEN、锌指核酸酶、Cas/CRISPR和重组酶融合蛋白组成的组；和任选地包含将重组酶共引入所述生物中。
37.权利要求35或36的方法，其中将表达所述试剂的转基因置于生物的基因组中。
38.权利要求35-37任一项的方法，其中所述试剂是重组酶融合蛋白，且所述方法包括引入靶向核酸序列和所述融合蛋白，且所述靶向核酸序列与重组酶形成纤丝以特异结合到染色体位点。
39.权利要求35-38任一项的方法，进一步包括将具有序列的核酸模板引入所述生物中，且所述生物的基因组在双链断裂位点处接收所述序列。
40.权利要求35-39任一项的方法，其中所述性成熟基因选自由Gpr54、Kiss1和GnRH11组成的组。
41.权利要求35-40任一项的方法，其中在可诱导系统的控制下失活所述基因。
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