KR101906605B1 - Ａａｄ-12 이벤트 416, 관련된 트랜스제닉 대두 계통, 및 이의 이벤트-특이적 확인 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 본원에서 pDAB4468-0416으로 지칭되는, 대두 식물에서의 제초제 내성을 위한 신규 aad -12 형질전환 이벤트를 포함한다. 본 발명은 대두 세포의 게놈 내의 특정 부위 내로 삽입된 이종성 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 이벤트/폴리뉴클레오티드가 기타 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-억제 단백질이 예를 들어 포함되는 다른 형질과 "스태킹(stacking)"될 수 있다. 추가적으로, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 대두) 내의 당해 이벤트의 존재를 검출하기 위한 분석법을 제공한다. 이러한 분석법은 대두 게놈 내로 삽입된 재조합 구축물의 DNA 서열, 및 삽입 부위에 플랭킹(flanking)된 게놈 서열을 기초로 할 수 있다. 이러한 분석법을 수행하는데 유용한 키트 및 조건이 또한 제공된다.

Description

ＡＡＤ-12 이벤트 416, 관련된 트랜스제닉 대두 계통, 및 이의 이벤트-특이적 확인{AAD-12 EVENT 416, RELATED TRANSGENIC SOYBEAN LINES, AND EVENT-SPECIFIC IDENTIFICATION THEREOF}
발명의 배경
aad -12 유전자 (델프티아 아시도보란스(Delftia acidovorans)로부터 유래됨)는 아릴옥시알카노에이트 디옥시저네이스(dioxygenase) (AAD-12) 단백질을 코딩한다. 이러한 형질은 2,4-디클로로페녹시아세트산에 대한, 예를 들어, 피리딜옥시아세테이트 제초제에 대한 내성을 부여한다. 식물에서의 제초제 내성에 대한 aad -12 유전자 자체가 WO 2007/053482에 최초로 개시되었다.
식물에서의 이종성 또는 외래 유전자의 발현은 염색체에서 외래 유전자가 삽입되는 장소에 영향을 받는다. 이는, 예를 들어, 크로마틴 구조 (예를 들어, 헤테로크로마틴), 또는 통합 부위에 가까운 전사 조절 요소 (예를 들어, 인핸서)의 근접성에 기인할 수 있다 (문헌 [Weising et al., Ann. Rev. Genet 22:421-477, 1988]). 동일한 유형의 트랜스제닉(transgenic) 식물 (또는 기타 생물) 내의 동일한 유전자가 상이한 이벤트들 간에 발현 수준에서의 광범위한 변동을 나타낼 수 있다. 발현의 공간적 또는 시기적 패턴에서의 차이가 또한 있을 수 있다. 예를 들어, 다양한 식물 조직에서의 트랜스진(transgene)의 상대적인 발현에서의 차이가 도입된 유전자 구축물 내에 존재하는 전사 조절 요소로부터 예상되는 패턴에 상응하지 않을 수 있다.
따라서, 도입된 관심 유전자를 소정의 목적을 위해 만족스러운 수준으로 발현하는 이벤트를 확인하기 위하여 다수의 이벤트가 종종 생성되고 스크리닝된다. 상업적인 목적을 위해, 수백 개 내지 수천 개의 상이한 이벤트를 생산하고, 이러한 이벤트들을 원하는 트랜스진 발현 수준 및 패턴이 있는 단일 이벤트에 대해 스크리닝하는 것이 통상적이다. 원하는 수준 및/또는 패턴의 트랜스진 발현이 있는 이벤트는 통상적인 육종법을 사용하여 유성 이종교배(outcross)에 의해 트랜스진을 다른 유전학적 배경 내로 유전자이입(introgression)시키는데 유용하다. 이같은 교배의 자손은 원래의 형질전환체의 트랜스진 발현 특성을 유지한다. 이러한 전략은 지역적인 성장 조건에 대해 잘 개조된 다수의 품종에서의 신뢰할 수 있는 유전자 발현을 확실하게 하는데 사용된다.
미국 특허 출원 20090130071은 대두 이벤트 MON87701 및 검출 방법에 관한 것이다. 미국 특허 출원 20090036308 및 20080051288은 대두 이벤트 3560.4.3.5 및 검출 방법에 관한 것이다. 미국 특허 출원 20080312082는 대두 이벤트 DP-305423-1 및 및 검출 방법에 관한 것이다. 미국 특허 출원 20060282915는 대두 이벤트 MON89788 및 검출 방법에 관한 것이다.
본원에 개시된 특정 이벤트가 있는 AAD-12 대두는 기존에 개시되지 않았다.
발명의 개요
본 발명은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)에 등록 번호 PTA-10442로 종자가 기탁되어 있는, DAS-68416-4로 지정된 AAD-12 대두 (글리신 맥스(Glycine max)) 이벤트 및 이로부터 유래된 자손에 관한 것이다. 본 발명의 다른 측면은 대두 이벤트 DAS-68416-4의 식물 및 종자 및 자손의 자손 식물, 대두, 종자, 및/또는 재생가능한 일부분, 뿐만 아니라 이들 중 임의의 것으로부터 제조된 식품 또는 사료 제품을 포함한다. 본 발명은 꽃가루, 배주, 꽃, 출아물(shoot), 뿌리 및 잎, 및 식물 세포, 꽃가루 세포 및 난 세포의 핵을 포함하지만 이에 한정되지 않는, 대두 이벤트 DAS-68416-4의 식물 일부분을 또한 포함한다. 추가로 본 발명은 페녹시 옥신 및/또는 아릴옥시알카노에이트 제초제 (이러한 제초제들이 대두 식물의 상부에, 토양에 인접하게 또는 토양 근처에, 또는 잡초에 인접하게 또는 잡초 근처에 적용되는지 여부와 관계 없음)에 대한 내성이 있는 대두 식물, 대두 이벤트 DAS-68416-4의 신규 유전학적 조성, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4를 포함하는 대두 식물의 작물학적 성능의 측면에 관한 것이다.
본 발명은, 부분적으로, 식물 육종 및 제초제 내성 식물에 관한 것이다. 본 발명은 대두 세포 게놈 내의 특정 부위 내로 삽입된 본원에 기술된 바와 같은 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 대두 식물에서의 신규 aad -12 형질전환 이벤트를 포함한다.
일부 실시양태에서, 상기 이벤트/폴리뉴클레오티드 서열이 기타 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-억제 단백질이 예를 들어 포함되는 다른 형질과 "스태킹(stacking)"될 수 있다. 그러나, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 단일 이벤트가 있는 식물을 포함한다. 본 발명의 특정 실시양태에서, 하나 이상의 제초제 내성 형질이 다양한 제초제 저항성 잡초 (예를 들어, 글리포세이트 저항성 잡초)를 방제하기 위한 목적으로 대두 이벤트 DAS-68416-4와 스태킹된다.
추가적으로, 본 발명은 샘플 (예를 들어, 대두) 내의 당해 이벤트의 존재를 검출하기 위한 분석법을 제공한다. 이러한 분석법은 대두 게놈 내로 삽입된 재조합 구축물의 DNA 서열, 및 삽입 부위에 플랭킹(flanking)된 게놈 서열을 기초로 할 수 있다. 이러한 분석법을 수행하는데 유용한 키트 및 조건이 또한 제공된다.
따라서, 본 발명은, 부분적으로, 전체 aad -12 삽입물, 및 이의 경계 영역 (트랜스제닉 대두 계통 내)의 DNA 서열의 클로닝 및 분석에 관한 것이다. 이러한 서열들은 독특하다. 이러한 삽입물 및 경계 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머들이 생성되었다. 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘(amplicon)의 분석에 의해 이러한 이벤트를 확인할 수 있다는 것이 PCR 분석에서 실연되었다. 따라서, 이러한 절차 및 기타 관련 절차를 사용하여 본 발명의 이벤트를 포함하는 대두 계통을 독특하게 확인할 수 있다.
도면의 간단한 설명
도 1은 pDAB4468의 플라스미드 지도를 나타낸다.
도 2는 대두 이벤트의 게놈 DNA의 도식을 나타내고, 이때 DAS-68416-4가 EcoRV 또는 Pvu II로 소화되어, 상응하는 게놈워커(GENOMEWALKER)™ 라이브러리를 생성하는데 사용되었으며, 이는 표적 DNA 서열을 증폭시키기 위한 주형으로서 사용되었다.
도 3은 5' 경계에서 3' 경계까지의 대두 이벤트 DAS-68416-4의 전장 서열을 확인하기 위한 프라이머 위치를 도해한다.
도 4는 5' 경계에서 3' 경계까지의 대두 이벤트 DAS-68416-4의 전장 서열을 확인하기 위한 프라이머 위치를 도해한다.
도 5는 AAD-12 대두 이벤트 DAS-68416-4의 삽입 부위 서열을 확인하기 위한 프라이머 위치를 도해한다.
도 6은 식물 생활사에 걸친 발현 수준을 나타낸다.
표의 간단한 설명
표 1은 이벤트 DAS-68416-4에 대한 삽입물 및 플랭킹 서열의 서열 1과 관련된 잔기 번호매김을 제공한다.
표 2는 서던(Southern) 분석에서 사용된 프로브의 위치 및 길이를 제공한다.
표 3은 서던 블롯 분석에서의 예상 혼성화 단편 및 관찰된 혼성화 단편을 제공한다.
표 4는 플랭킹 경계 영역을 증폭시키기 위한 대두 이벤트 DAS-68416-4의 게놈 워킹(walking)을 위한 조건을 제공한다.
표 5는 대두 이벤트 DAS-68416-4 내의 경계 영역 및 이벤트-특이적 서열의 표준 PCR 증폭을 위한 조건을 제공한다.
표 6은 T-가닥 삽입물에 대한 앰플리콘 1-4에 대한 프라이머 설명을 제공한다.
표 7은 대두 이벤트 DAS-68416-4 내의 경계 영역 및 이벤트-특이적 서열의 표준 PCR 증폭을 위한 PCR 혼합물을 제공한다.
표 8은 2008년 동안 미국 및 캐나다에서 생산된 대두 이벤트 DAS-68416-4로부터 수집된 조직 내의 AAD-12 단백질 수준의 요약을 제공한다.
표 9는 서던 분석에서 사용된 프로브의 위치 및 길이를 제공한다.
표 10은 서던 블롯 분석에서의 예상 혼성화 단편 및 관찰된 혼성화 단편을 제공한다.
표 11은 실험 1에서 평가된 작물학 파라메터를 제공한다.
표 12는 실험 1로부터의 작물학 특성의 분석을 제공한다.
표 13은 2009년 작물학 및 수율 시험에서 수집된 데이터를 제공한다.
표 14는 여러 장소에 걸친 2009년 작물학 특성 결과의 요약을 제공한다.
표 15는 실험 1로부터의 질병 발생률 및 곤충 손상의 분석을 제공한다.
표 16은 DAS-68416-4 및 통상적인 대두의 시험에서 관찰된 질병 및 곤충 스트레스원(stressor)을 제공한다.
표 17은 온난 조건 및 저온 조건 하에서의 대두 이벤트 DAS-68416-4 종자의 발아를 제공한다.
표 18은 대두 사초(forage)의 일반성분(proximate), 섬유 및 미네랄 분석의 요약을 제공한다.
표 19는 대두 알곡의 일반성분 및 섬유 분석의 요약을 제공한다.
표 20은 대두 알곡의 미네랄 분석의 요약을 제공한다.
표 21은 대두 알곡의 아미노산 분석의 요약을 제공한다.
표 22는 대두 알곡의 지방산 분석의 요약을 제공한다.
표 23은 대두 알곡의 비타민 분석의 요약을 제공한다.
표 24는 대두 알곡의 이소플라본 분석의 요약을 제공한다.
표 25는 대두 알곡의 항-영양소 분석의 요약을 제공한다.
표 26은 2,4-D 발아전(preemergence) 내성 시험에 대한 장소 및 처리 정보를 제공한다.
표 27은 2,4-D의 발아전 적용에 대한 DAS-68416-4 대두 내성을 설명한다.
서열의 간단한 설명
서열 1은 당해 대두 이벤트 DAS-68416-4에 대한 삽입물 및 플랭킹 서열을 제공한다.
서열 2-28은 본원에 기술된 바와 같은 프라이머이다.
서열 29 및 30은 본원에 기술된 바와 같은 플랭킹 SNP 마커 BARC-019093-03299 및 BARC-044607-08736이다.
발명의 상세한 설명
본 발명은, 부분적으로, 식물 육종 및 제초제 내성 식물에 관한 것이다. 본 발명은 대두 세포 게놈 내의 특정 부위 내로 삽입된 본원에 기술된 바와 같은 당해 aad -12 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 대두 식물 (대두)의 신규 형질전환 이벤트를 포함한다. 일부 실시양태에서, 상기 폴리뉴클레오티드 서열이 다른 형질 (예컨대 기타 제초제 내성 유전자(들) 및/또는 곤충-억제 단백질을 코딩하는 유전자(들))과 "스태킹"될 수 있다. 그러나, 본 발명은 본원에 기술된 바와 같은 단일 이벤트가 있는 식물을 포함한다.
추가적으로, 본 발명은 샘플 내의 당해 이벤트의 존재를 검출하기 위한 분석법을 제공한다. 본 발명의 측면은 본원에서 예시 또는 제안된 임의의 진단적 핵산 분자, 특히 당해 플랭킹 서열을 전체적으로 또는 부분적으로 기초로 하는 것들을 디자인 및/또는 생산하는 방법을 포함한다.
더욱 구체적으로, 본 발명은, 부분적으로, 트랜스제닉 대두 이벤트 DAS-68416-4, 이러한 이벤트를 포함하는 식물 계통, 및 이러한 삽입물 및/또는 이의 경계 영역의 DNA 서열의 클로닝 및 분석에 관한 것이다. 본원에서 개시 및 제안된 서열들을 사용하여 본 발명의 식물 계통을 검출할 수 있다.
일부 실시양태에서, 본 발명은 제초제-내성 대두 계통, 및 이의 확인에 관한 것이다. 본 발명은, 부분적으로, 유성 교배의 자손이 관심 이벤트를 함유하는지 여부를 결정하기 위해 당해 이벤트의 존재를 검출하는 것에 관한 것이다. 또한, 예를 들어, 이벤트를 검출하는 방법은, 예를 들어, 재조합 농작물로부터 유래된 식품의 시판전 승인 및 표지를 필요로 하는 규정을 따르기 위해 포함되고 이에 유용하다. 임의의 주지된 핵산 검출 방법 예컨대 핵산 프로브를 사용하는 DNA 혼성화 또는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 당해 이벤트의 존재를 검출할 수 있다. 이벤트-특이적 PCR 분석법이, 예를 들어, 문헌 [Windels et al., Med. Fac. Landbouww, Univ. Gent 64/5b:459462, 1999]에 논의되어 있다. 이는 삽입물과 플랭킹 DNA 사이의 접합부에 스패닝(spanning)된 프라이머 세트를 사용하는 PCR에 의한 글리포세이트 내성 대두 이벤트 40-3-2의 확인에 관한 것이었다. 더욱 구체적으로, 1개의 프라이머는 삽입물로부터의 서열을 포함하였고, 제2 프라이머는 플랭킹 DNA로부터의 서열을 포함하였다.
아릴옥시알카노에이트 디옥시저네이스 (AAD-12) 단백질을 코딩하는, 델프티아 아시도보란스로부터 유래된 aad -12 유전자의 삽입에 의해 대두가 변형되었다. 이러한 형질은 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 피리딜옥시아세테이트 제초제에 대한 내성을 부여하고, 식물 형질전환 동안, 그리고 육종 배양소에서 선별성 마커로서 사용될 수 있다.
더욱 구체적으로, AAD12 이벤트 pDAB4468-0416, 및 세대에서 세대로의 전체 식물 및 분자 수준에서의 발현 및 안정성에 대한 이의 특성화 및 선별이 본원에서 기술된다.
본 발명에 따라 사용되는 당해 합성 유전자 (aad -12)는 델프티아 아시도보란스로부터 유래되었고, 페녹시 옥신 (예를 들어, 2,4-D, MCPA), 뿐만 아니라 피리딜옥시 옥신 (예를 들어, 플루록시피르, 트리클로피르)이 포함되는, 아릴옥시알카노에이트 모이어티(moiety)가 있는 여러 제초제를 비활성화시킬 수 있는 효소를 코딩한다. atUbi10 프로모터에 의해 구동되는 aad -12 유전자를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens) 기술을 사용하여 대두 계통 매버릭(Maverick) 내로 도입하였다. 트랜스제닉 T0 식물을 4-6 세대 동안 자가 수분시켰다. 병행하여, aad -12 유전자를 우량 대두 품종 내로 또한 유전자이입하였다. 모든 트랜스제닉 이벤트를 봉쇄 및 조절된 필드(field) 배양소 및 실험실 환경에서 4-5 세대 동안 특성화하였다.
이벤트 pDAB4468-0416 삽입의 양쪽 끝부분을 시퀀싱(sequencing) 및 특성화하였다. 이벤트 특이적 분석법이 개발되었다. 또한 대두 게놈 (대두 염색체 4) 상에서 이의 지도가 작성되었다; 플랭킹 SNP 마커가 본원에서 서열 29 및 30으로 기술된다. 이러한 이벤트가 추가적인 우량 계통 내로 유전자이입되고 있다. 이러한 이벤트는 2,4-D 및 글루포시네이트에 대한 내성을 제공한다.
atUbi10 프로모터에 의해 구동되면서, 100개를 초과하는 AAD12 T1 매버릭 대두 이벤트가 아그로박테리움 투메파시엔스 기술을 통해 생성되었다. 5세대의 자가 수분 세대 및 몇몇 역교배(backcross) 세대의 단일 가계 선별을 통해 이벤트 pDAB4468-0416을 선별하였다. 이는 형태학적으로 정상이었고, 모든 자가 수분 세대 동안 V3에서 2240 g ae/ha의 2,4-D 분무에 대해 내성이었다. 이벤트는 단일 우성 유전자로서 유전되었고, 자가 수분 세대 및 또한 역교배 세대에서 멘델 분리가 정상이었다.
이벤트 pDAB4468-0416은 전장 식물 전사 유닛 (PTU)으로의 단일 통합이 있는 것으로 발견되었다. 벡터 골격으로부터 항생제 저항성 유전자 서열이 발견되지 않았고, aad -12 유전자 동종접합 및 반접합 상태에서 여러 세대 동안 유전자 침묵이 검출되지 않았다. 2,4-D 내성 수준에 이르는 예상 수준으로 aad -12 유전자가 발현되었다. 이벤트가 세대들에 걸쳐, 그리고 소정의 세대 내의 동기(sibling) 가계들 간에 안정적적으로 aad -12 유전자를 발현하고 있었다.
상기에서 배경기술 섹션에서 시사된 바와 같이, 식물 게놈 내로의 트랜스진의 도입 및 통합은 일부 무작위 이벤트를 수반한다 (따라서 발현되는 소정의 삽입에 대한 명칭 "이벤트"). 즉, 다수의 형질전환 기술 예컨대 아그로박테리움 형질전환, "유전자 총", 및 위스커스(WHISKERS)로, 게놈 내의 어느 곳에 트랜스진이 사입될지가 예측불가능하다. 따라서, 삽입물의 양쪽 측면 상의 플랭킹된 식물 게놈 DNA를 확인하는 것이 소정의 삽입 이벤트가 있는 식물을 확인하는데 중요할 수 있다. 예를 들어, 삽입물과 숙주 게놈의 접합부 영역에 걸쳐 PCR 앰플리콘을 생성시키는 PCR 프라이머들을 디자인할 수 있다. 이러한 PCR 앰플리콘을 독특하거나 명료한 유형의 삽입 이벤트를 확인하는데 사용할 수 있다.
"이벤트"가 본래 무작위 이벤트임에 따라, 본 개시내용의 일부로서, 이러한 이벤트를 포함하는 대두 계통의 2500개 이상의 종자가 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (ATCC) (우편번호 20110 미국 버지니아주 머내서스 불러바드 유니버시티 10801)에 기탁되었고, 일반인이 제한 없이 (그러나 특허권에 따라) 이를 입수할 수 있다. 기탁물은 ATCC 기탁 번호 PTA-10442로 지정되었다. 2009년 10월 22일에 다우 아그로사이언시즈 엘엘씨(Dow AgroSciences LLC)를 위해 글리신 맥스 종자 (AAD-12 이벤트 pDAB4468-0416)의 바이알(vial) 25개가 기탁되었다. 기탁물을 2009년 11월 2일에 테스트하였고, 테스트한 날에 종자들이 생육성이었다. 이러한 기탁은 특허 절차를 위한 종자 기탁에 관한 부다페스트 조약에 따라 이러한 조약의 조항 하에 이루어졌고 유지될 것이다. 기탁물은 공공 기탁소인 ATCC 기탁소에 30년, 또는 가장 최근의 요청 후 5년의 기간 동안, 또는 특허 유효 기간 동안 (어느 쪽이든 더 긴 것), 제한 없이 유지될 것이고, 이러한 기간 동안 생육성이지 않게 되면 교체될 것이다.
기탁된 종자는 본 발명의 일부분이다. 명백하게, 대두 식물이 이러한 종자로부터 성장될 수 있고, 이같은 식물은 본 발명의 일부분이다. 또한 본 발명은 이러한 식물 및 이의 자손을 검출하는데 유용한 이러한 대두 식물 내에 함유된 DNA 서열에 관한 것이다. 본 발명의 검출 방법 및 키트는, 테스트의 궁극적인 목적에 따라, 이러한 이벤트들 중 임의의 하나, 2개, 또는 심지어 3개 모두를 확인하는 것에 지시될 수 있다.
본 발명을 기술하는 것을 돕고 본 발명을 실행하도록 당업자에게 지침이 되기 위해 정의 및 예가 본원에서 제공된다. 달리 언급되지 않는 한, 용어들은 관련 분야의 당업자에 의한 통상적인 용법에 따라 이해되어야 한다. 37 CFR §1.822에 기재된 바와 같은 DNA 염기에 대한 명명법이 사용된다.
본원에서 사용된 용어 "자손"은 AAD-12 대두 이벤트 DAS-68416-4를 포함하는 어버이 식물의 임의 세대의 후손을 의미한다.
트랜스제닉 "이벤트"는 이종성 DNA, 즉 관심 트랜스진을 포함하는 핵산 구축물로의 식물 세포의 형질전환, 식물 게놈 내로의 트랜스진의 삽입으로부터 초래되는 식물 집단의 재생, 및 특정 게놈 위치 내로의 삽입을 특징으로 하는 특정 식물의 선별에 의해 생산된다. 용어 "이벤트"는 이러한 이종성 DNA를 포함하는 본래의 형질전환체 및 형질전환체의 자손을 지칭한다. 용어 "이벤트"는 이러한 게놈/트랜스진 DNA를 포함하는 또 다른 품종과 형질전환체 간의 유성 이종교배에 의해 생산된 자손을 또한 지칭한다. 반복친(recurrent parent)으로의 반복된 역교배 후에도, 형질전환된 어버이로부터의 삽입된 트랜스진 DNA 및 플랭킹 게놈 DNA (게놈/트랜스진 DNA)가 동일한 염색체 위치에서 교배 자손 내에 존재한다. 용어 "이벤트"는 삽입된 DNA를 포함하는 한 어버이 계통 (예를 들어, 본래의 형질전환체 및 자가생식(selfing)으로부터 초래된 자손)과 삽입된 DNA를 함유하지 않는 어버이 계통의 유성 교배의 결과로서 관심 트랜스진을 포함하는 삽입된 DNA를 받는 자손으로 전달될 것으로 예상되는, 삽입된 DNA에 바로 인접하는 플랭킹 게놈 서열 및 삽입된 DNA를 포함하는 본래의 형질전환체 및 이의 자손으로부터의 DNA를 또한 지칭한다.
"접합부 서열"은 게놈 내로 삽입된 DNA가 삽입 지점에 플랭킹된 대두 천연 게놈으로부터의 DNA에 연결되는 지점에 스패닝되고, 식물의 유전 물질 내의 한 접합부 또는 다른 접합부 서열의 확인 또는 검출은 이벤트에 대해 진단적이기에 충분하다. 본원에 기술된 대두 이벤트에서의 삽입물 및 유사한 길이의 플랭킹 DNA에 스패닝되는 DNA 서열이 포함된다. 이같은 진단적 서열의 구체적인 예가 본원에서 제공된다; 그러나, 삽입물의 접합부, 또는 게놈 서열 및 삽입물의 접합부에 중첩되는 기타 서열이 또한 진단적이고, 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본 발명은 이같은 플랭킹된 접합부 및 삽입물 서열의 확인에 관한 것이다. 관련된 PCR 프라이머 및 앰플리콘이 본 발명에 포함된다. 본 발명에 따라, 삽입된 DNA 및 이의 경계에 걸쳐 스패닝되는 앰플리콘을 사용하는 PCR 분석 방법이 당해 독점 트랜스제닉 대두 계통으로부터 유래된 상업화된 트랜스제닉 대두 품종 또는 계통을 검출 또는 확인하는데 사용될 수 있다.
삽입물을 식물 세포의 게놈 내로 도입하는 과정 동안, 삽입물 및/또는 게놈의 플랭킹 서열의 일부 결실 또는 기타 변경이 일어나는 것이 드물지 않다. 따라서, 본원에서 제공되는 플라스미드 서열의 관련 절편은 약간의 미미한 변이를 변동을 포함할 수 있다. 이는 본원에서 제공되는 플랭킹 서열에 대해서도 그러하다. 따라서, 당해 플랭킹 및/또는 삽입물 서열과의 일부 범위의 동일성이 있는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 식물이 본 발명의 범주 내에 속한다. 본 발명의 서열에 대한 동일성은 본원에 예시 또는 기술된 서열과의 서열 동일성이 65％ 이상, 더욱 바람직하게는 70％ 이상, 더욱 바람직하게는 75％ 이상, 더욱 바람직하게는 80％ 이상, 더욱 바람직하게는 85％ 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 이상인 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 본원에서 제공된 바와 같은 혼성화 및 혼성화 조건은 본 발명의 이같은 식물 및 폴리뉴클레오티드 서열을 정의하는데 또한 사용될 수 있다. 기탁된 종자와 관련하여 플랭킹 서열들 + 삽입물 서열의 서열을 확인할 수 있다.
이러한 삽입물들 각각의 전체 서열이, 각각의 플랭킹 서열들의 부분과 함께, 본원에서 서열 1로서 제공된다. 서열 1 (총 10,212개의 염기쌍)과 관련된 이러한 이벤트에 대한 삽입물 및 플랭킹 서열의 좌표가 하기의 표 1에 인쇄된다. 이는, 예를 들어, 실시예 3에서 더욱 상세하게 논의된다.
Figure 112012049897969-pct00001
이러한 서열 (특히, 플랭킹 서열)은 독특하다. 이러한 삽입물 및 경계 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머가 생성되었다. 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 이러한 대두 계통들이 상이한 대두 유전자형들에서 확인될 수 있다는 것이 PCR 분석에서 실연되었다. 따라서, 이러한 절차 및 기타 관련 절차를 사용하여 이러한 대두 계통을 독특하게 확인할 수 있다. 본원에서 확인된 서열들은 독특하다.
본 발명의 검출 기술은, 식물 육종과 관련하여, 관심 이벤트를 포함하는 어버이 식물이 하나 이상의 추가적인 관심 형질을 자손 내에 부여하기 위한 시도로 또 다른 식물 계통과 교배된 후에 어떤 자손 식물이 소정의 이벤트를 포함하는지 여부를 결정하는데 특히 유용하다. 이러한 PCR 분석 방법은, 특히 상업화된 트랜스제닉 대두 종자에 대해, 대두 육종 프로그램, 뿐만 아니라 품질 제어에 이롭다. 이러한 트랜스제닉 대두 계통에 대한 PCR 검출 키트가 또한 이제 제조 및 사용될 수 있다. 이는 제품 등록 및 제품 책임관리에 또한 이로울 수 있다.
추가로, 플랭킹 대두/게놈 서열을 각각의 삽입물의 게놈 위치를 구체적으로 확인하는데 사용할 수 있다. 이러한 정보를 사용하여 각각의 이벤트에 대해 특이적인 분자 마커 시스템을 제조할 수 있다. 이는 가속 육종 전략에, 그리고 연관 데이터를 확립하는데 사용될 수 있다.
추가로, 플랭킹 서열 정보를 트랜스진 통합 프로세스, 게놈 통합 부위 특성, 이벤트 분류, 트랜스진 및 이의 플랭킹 서열의 안정성, 및 유전자 발현 (특히, 유전자 침묵, 트랜스진 메틸화 패턴, 위치 효과, 및 잠재적인 발현-관련 요소 예컨대 MARS [매트릭스 부착 영역] 등과 관련됨)을 연구 및 특성화하는데 사용할 수 있다.
모든 본 발명의 개시내용의 견지에서, 본 발명이 ATCC 기탁 번호 PTA-10442 하에 입수가능한 종자를 포함한다는 것이 명백하여야 한다. 본 발명은 접속 번호 PTA-10442 하에 ATCC에 기탁된 종자로부터 성장된 제초제-저항성 대두 식물을 또한 포함한다. 본 발명은 상기 식물의 일부분, 예컨대, 잎, 조직 샘플, 상기 식물에 의해 생산된 종자, 꽃가루 등을 추가로 포함한다.
추가로, 본 발명은 기탁된 종자로부터 성장된 식물의 후손 및/또는 자손 식물, 바람직하게는 제초제-저항성 대두 식물을 포함하고, 이때 상기 식물에는 본원에 기술된 바와 같은 검출가능한 야생형 게놈 DNA/삽입물 DNA 접합부 서열을 포함하는 게놈이 있다. 본원에서 사용된 용어 "대두"는 글리신 맥스를 의미하고, 대두 식물과 육종될 수 있는 이의 모든 품종을 포함한다.
추가로 본 발명은 본 발명의 식물을 하나 이상의 어버이로 사용하여 교배물을 제조하는 방법을 추가로 포함한다. 예를 들어, 본 발명은 본원에 예시된 식물들 중 임의의 것이 어버이 중 하나 또는 양쪽 어버이인 F1 잡종 식물을 포함한다. 이같은 본 발명의 F1 잡종에 의해 생산된 종자가 본 발명에 또한 속한다. 본 발명은 예시된 식물을 상이한 (예를 들어, 근교배(in-bred) 어버이) 식물과 교배시키고, 생성된 잡종 종자를 수확함으로써 F1 잡종 종자를 생산하는 방법을 포함한다. 본 발명은 모친 또는 부친인 예시된 식물을 포함한다. 생성된 식물의 특성이 어버이 식물들의 신중한 고려에 의해 개선될 수 있다.
먼저 본원에서 언급된 계통들 중 임의의 하나의 종자로부터 성장된 대두 식물로 구성되는 제1 어버이 대두 식물과 제2 어버이 대두 식물을 유성 교배시킴으로써 다수의 제1 자손 식물을 생산하는 단계; 그 후, 제초제에 대해 저항성인 (또는 본 발명의 이벤트 중 하나 이상을 보유하는) 제1 자손 식물을 선별하는 단계; 및 제1 자손 식물을 자가생식시킴으로써 다수의 제2 자손 식물을 생산하는 단계; 및 그 후, 제2 자손 식물로부터 제초제에 대해 저항성인 (또는 본 발명의 이벤트들 중 하나 이상을 보유하는) 식물을 선별하는 단계에 의해 제초제-내성 대두 식물이 육종될 수 있다. 이러한 단계들은 제1 자손 식물 또는 제2 자손 식물의 제2 어버이 대두 식물 또는 제3 어버이 대두 식물로의 역-교배를 추가로 포함할 수 있다. 그 후, 본 발명의 대두 종자를 포함하는 대두 작물, 또는 이의 자손을 재식할 수 있다.
독립적으로 분리되는 2개의 첨가된 외인성 유전자를 함유하는 후손을 생산하도록 2개의 상이한 트랜스제닉 식물이 또한 짝짓기될 수 있음을 또한 이해하여야 한다. 적합한 자손의 자가생식으로 첨가된 양쪽 외인성 유전자에 대해 동종접합성인 식물이 생산될 수 있다. 어버이 식물로의 역-교배 및 비-트랜스제닉 식물과의 이종-교배가 또한 구상되고, 무성 번식이 또한 구상된다. 상이한 형질 및 작물에 통상적으로 사용되는 기타 육종 방법들이 당업계에 공지되어 있다. 역교배 육종은 단순하게 유전되는 고도로 유전성인 형질에 대한 유전자를 반복친인 바람직한 동종 접합성 재배종 또는 근교배 계통 내로 전달하는데 사용되었다. 전달되는 형질의 공급원은 도너(donor) 어버이로 칭해진다. 생성된 식물은 반복친 (예를 들어, 재배종)의 속성 및 도너 어버이로부터 전달된 원하는 형질을 지닐 것으로 예상된다. 초기 교배 후, 도너 어버이의 표현형을 보유하는 개체를 선별하고, 반복적으로 반복친에 교배 (역교배)시킨다. 생성된 어버이는 반복친 (예를 들어, 재배종)의 속성 및 도너 어버이로부터 전달된 원하는 형질을 지닐 것으로 예상된다.
마커 보조 육종 (MAB) 방법에서 본 발명의 DNA 분자가 분자 마커로서 사용될 수 있다. 당업계에 공지된 바와 같은, 유전적으로 연관된 농학적으로 유용한 형질들을 확인하는 방법 (예컨대, AFLP 마커, RFLP 마커, RAPD 마커, SNP, 및 SSR)에서 본 발명의 DNA 분자가 사용될 수 있다. MAB 방법을 사용하여 본 발명의 대두 식물과의 교배의 자손 (또는 이의 자손 및 임의의 기타 대두 재배종 또는 품종)에서 제초제-저항성 형질을 추적할 수 있다. DNA 분자가 이러한 형질에 대한 마커이고, 당업계에 주지되어 있는 MAB 방법을 사용하여 하나 이상의 본 발명의 대두 계통, 또는 이의 자손이 어버이 또는 선조인 대두 식물에서 제초제-저항성 형질(들)을 추적할 수 있다. 당해 이벤트가 있는 임의의 대두 품종을 확인하는데 본 발명의 방법이 사용될 수 있다.
본 발명의 방법은 본 발명의 식물과의 육종을 포함하는, 제초제-내성 대두 식물을 생산하는 방법을 포함한다. 더욱 구체적으로, 상기 방법은 2개의 본 발명의 식물, 또는 1개의 본 발명의 식물과 임의의 다른 식물을 교배시키는 것을 포함할 수 있다. 바람직한 방법은 본 발명에 따라 검출가능한 이벤트에 대해 자손을 분석함으로써 상기 교배의 자손을 선별하는 단계를 추가로 포함한다. 예를 들어, 다른 바람직한 형질, 예컨대 본원에서 다양한 실시예에서 테스트된 것들과 같은 작물학적 형질을 포함하는 식물과의 육종 사이클 동안 당해 이벤트를 추적하는데 본 발명이 사용될 수 있다. 예를 들어, 당해 이벤트 및 원하는 형질을 포함하는 식물을 검출하고, 확인하고, 선별하여, 추가적인 육종 라운드에서 신속하게 사용할 수 있다. 당해 이벤트/형질이 또한 육종 동안 곤충 저항성 형질(들) 및/또는 추가적인 제초제 내성 형질과 조합될 수 있고, 이와 함께 본 발명에 따라 추적될 수 있다. 후자의 바람직한 실시양태는 제초제 디캄바에 대한 저항성을 코딩하는 유전자와 조합된 당해 이벤트를 포함하는 식물이다.
따라서, 본 발명이, 예를 들어, 글리포세이트 저항성 (예를 들어, 저항성 식물 또는 박테리아 EPSPS, GOX, GAT), 글루포시네이트 저항성 (예를 들어, Pat, bar), 아세토락테이트 신테이스(synthase) (ALS)-억제 제초제 저항성 (예를 들어, 이미다졸리논 [예컨대 이마제타피르], 술포닐우레아, 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드, 피리미디닐티오벤조에이트, 및 기타 화학물질 [Csr1, SurA 등]), 브로목시닐 저항성 (예를 들어, Bxn), HPPD (4-히드록시페닐-피루베이트-다이옥시저네이스(dioxygenase)) 효소의 억제제에 대한 저항성, 파이토엔 디새튜레이스(desaturase) (PDS)의 억제제에 대한 저항성, 광화학계 II 억제 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, psbA), 광화학계 I 억제 제초제에 대한 저항성, 프로토포르피리노겐 옥시데이스(oxidase) IX (PPO)-억제 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, PPO -1), 페닐우레아 제초제에 대한 저항성 (예를 들어, CYP76B1), 디캄바-분해 효소 (예를 들어, US 20030135879 참조) 등을 코딩하는 형질과 조합될 수 있고, 이들이 단독으로 또는 다중 조합으로 스태킹되어, 잡초 전환을 효과적으로 제어 또는 방지하는 능력 및/또는 상기 언급된 클래스의 임의의 제초제에 대한 저항성을 제공할 수 있다.
추가적인 제초제와 관련하여, 일부 추가적인 바람직한 ALS (AHAS로 또한 공지됨) 억제제에는 트리아졸로피리미딘 술폰아닐리드 (예컨대 클로란술람-메틸, 디클로술람, 플로라술람, 플루메트술람, 메토술람, 및 페녹스술람), 피리미디닐티오벤조에이트 (예컨대 비스피리박 및 피리티오박), 및 플루카르바존이 포함된다. 일부 바람직한 HPPD 억제제에는 메소트리온, 이속사플루톨, 및 술코트리온이 포함된다. 일부 바람직한 PPO 억제제에는 플루미클로락, 플루미옥사진, 플루펜피르, 피라플루펜, 플루티아셋, 부타페나실, 카르펜트라존, 술펜트라존, 및 디페닐에테르 (예컨대 아시플루오르펜, 포메사펜, 락토펜, 및 옥시플루오르펜)가 포함된다.
추가적으로, 단독 AAD-12 또는 하나 이상의 추가적인 HTC 형질과 조합된 AAD-12가 하나 이상의 추가적인 입력(input) 형질 (예를 들어, 곤충 저항성, 진균류 저항성, 또는 스트레스 내성 등) 또는 출력(output) 형질 (예를 들어, 증가된 수율, 개선된 오일 프로파일, 개선된 섬유 품질 등)과 스태킹될 수 있다. 따라서, 본 발명은 다양한 작물학 해충을 융통성 있게, 그리고 비용 효과적으로 방제하는 능력과 개선된 작물 품질의 완전한 작물학 패키지를 제공하는데 사용될 수 있다.
당해 AAD-12 효소는 거의 모든 활엽 및 풀 잡초를 방제할 제초제들의 조합물에 대한 내성을 초래하는 트랜스제닉 발현을 가능하게 한다. AAD-12는 우수한 제초제 내성 작물 (HTC) 형질로 작용하여, 예를 들어, 다른 HTC 형질 (예를 들어, 글리포세이트 저항성, 글루포시네이트 저항성, 이미다졸리논 저항성, 브로목시닐 저항성 등), 및 곤충 저항성 형질 (Cry1F, Cry1Ab, Cry 34/45 등)과 스태킹될 수 있다. 추가적으로, AAD-12는 제2 유전자 또는 유전자 군으로 유전자 조작된 식물의 1차 형질전환체의 선별을 보조하는 선별성 마커로서 작용할 수 있다.
본 발명의 AAD-12 유전자는 페녹시아세테이트 옥신 제초제로 전환되는 화합물 (예를 들어, 2,4-DB, MCPB 등)에 대한 저항성을 또한 제공한다. 2,4-DB 제초제 내에 존재하는 부티르산 모이어티가 β-산화를 통해 식물독성 2,4-디클로로페녹시아세트산으로 전환된다. 유사하게, MCPB가 β-산화를 통해 식물독성 MCPA로 전환된다. 부탄산 제초제 자체는 제초제가 아니다. 이는 감수성 식물 내에서 β-산화에 의해 각각의 산 형태로 전환되고, 아세트산 형태의 제초제가 식물독성이다. 신속한 β-산화가 불가능한 식물은 부탄산 제초제에 의해 손상되지 않는다. 그러나, 신속한 β-산화가 가능하고 부탄산 제초제를 아세트산 형태로 전환시킬 수 있는 식물이 이에 따라 AAD-12에 의해 보호된다.
제초제를 적용하는 방법이 당업계에 주지되어 있다. 이같은 적용은 1가지를 초과하는 제초제의 탱크 믹스(tank mix)를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 일부 바람직한 제초제에는 페녹시 옥신 제초제 예컨대 2,4-D; 2,4-DB; MCPA; MCPB가 포함된다. 이들은 하나 이상의 추가적인 제초제 내성 유전자(들) 및 상응하는 제초제 (예를 들어 글리포세이트 및/또는 글루포시네이트)와 스태킹될 수 있다. 1개, 2개, 3개 또는 이를 초과하는 개수의 제초제가 본 발명의 개시내용이 이로운 분야의 당업자에게 명백할 유리한 조합으로 사용될 수 있다. 당해 제초제들 중 하나 이상이 본 발명의 종자를 재식하기 전에 필드/구역에 적용될 수 있다. 예를 들어, 이같은 적용은 재식 14일 이내일 수 있다. 또한 당해 제초제들 중 하나 이상을 재식할 때 및/또는 재식 후, 발아 전에 적용할 수 있다. 또한 당해 제초제들 중 하나 이상을 땅에 (잡초를 방제하기 위해) 또는 잡초 및/또는 본 발명의 트랜스제닉 식물의 위에 적용할 수 있다. 당해 제초제들은, 예를 들어, 하나의 제초제에 대해 내성이지만 또 다른 제초제에 대해서는 그렇지 않을 수 있는 잡초를 방제 또는 방지하기 위해, 조합되어 사용될 수 있거나 순환될 수 있다. 3가지 유형의 당해 제초제에 대한 다양한 적용 시간이 당업계에 공지된 바와 같아 다양한 방식으로 사용될 수 있다. 본 발명은 AAD-12 자생식물을 방제하는 방법을 또한 제공한다. 함께 출원된, 발명의 영문 명칭이 "CONTROL OF AAD DICOT VOLUNTEERS IN MONOCOT CROPS"인 PCT 출원을 참조한다.
본 발명의 HTC 형질이 다른 HTC 형질 (글리포세이트 내성을 포함하지만 이에 한정되지 않음)과의 신규 조합으로 사용될 수 있다. 형질들의 이러한 조합은, 제초제 (예를 들어, 글리포세이트)에 대한 새롭게 취득된 저항성 또는 선천적 내성으로 인한, 잡초 (잡초 등) 종을 방제하는 신규 방법을 발생시킨다. 따라서, HTC 형질에 더하여, 트랜스제닉 작물 내에서 상기 효소에 의해 제초제 내성이 생성된 제초제를 사용하여 잡초를 방제하는 신규 방법이 본 발명의 범주 내에 속한다.
추가적으로, 세계적으로 재배된 글리포세이트 내성 작물이 널리 행해진다. 다른 글리포세이트 내성 작물과의 윤작에서의 다수의 경우에, 글리포세이트-저항성 자생식물의 방제가 윤작 작물에서 어려울 수 있다. 따라서, 작물 내로 스태킹되거나 개별적으로 형질전환된 당해 트랜스제닉 형질들의 사용은 다른 HTC 자생식물 작물을 방제하기 위한 도구를 제공한다.
본 발명의 바람직한 식물 또는 종자는 이의 게놈 내에 본원에서 확인되는 바와 같은 삽입물 서열을 본원에서 확인되는 바와 같은, 삽입물의 양쪽 측면 상의 적어도 20-500개 또는 이를 초과하는 개수의 연속적인 플랭킹 뉴클레오티드와 함께 포함한다. 달리 지시되지 않는 한, 플랭킹 서열에 대한 언급은 서열 1과 관련하여 확인된 것들을 지칭한다 (상기 표 1 참조). 다시 한번, 서열 1은 원래의 형질전환체 내에 삽입된 이종성 DNA 및 삽입된 DNA에 바로 인접한 예시적인 플랭킹 게놈 서열을 포함한다. 삽입된 DNA를 이벤트를 포함하는 어버이 계통의 유성 교배의 결과로서 받는 자손으로 이러한 플랭킹 서열 모두 또는 일부가 전달될 것으로 예상될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 식물의 재생가능한 세포의 조직 배양물을 포함한다. 이같은 조직 배양물로부터 재생된 식물이, 특히 상기 식물이 예시된 품종의 모든 형태학적 및 생리학적 성질을 나타낼 수 있는 경우에, 또한 포함된다. 바람직한 본 발명의 식물은 기탁된 종자로부터 성장된 식물의 모든 생리학적 및 형태학적 특성을 지닌다. 본 발명은 관심 대상인 품질 형질을 보유하는 이같은 종자 및 종자의 자손을 추가로 포함한다.
식물 또는 종자, 또는 이의 일부분의 조작 (예컨대 돌연변이, 추가적인 형질감염, 및 추가적인 육종)은 "본질적으로 유래된" 품종으로 칭해질 수 있는 것의 생성에 이를 수 있다. 국제 식물 신품종 보호 연맹 (UPOV: International Union for the Protection of New Varieties of Plants)은 품종이 보호 품종으로부터 본질적으로 유래되었는지를 결정하기 위한 하기의 지침을 제공하였다:
[A] 하기의 경우에, 품종이 다른 품종 ("원품종")으로부터 본질적으로 유래된 것으로 간주한다:
(i) 원품종의 유전자형 또는 유전자형 조합으로부터 초래되는 본질적인 특성의 발현을 유지하면서, 원품종으로부터, 또는 자체가 원품종으로부터 주로 유래된 품종으로부터 주로 유래되고;
(ii) 원품종과 명확하게 구별될 수 있으며;
(iii) 유도 작용으로부터 초래되는 차이를 제외하고는, 원품종의 유전자형 또는 유전자형 조합으로부터 초래되는 본질적인 특성의 발현에서 원품종과 일치함.
(1992년 10월 30일에 제네바에서 열린 UPOV의 6차 국제기구 회의; 사무국에 의해 제조된 문서).
본원에서 사용된 "계통"은 하나 이상의 형질에 대해 개체들 간에 유전적 변이를 거의 나타내지 않거나 나타내지 않는 일군의 식물이다. 이같은 계통은 여러 세대의 자가-수분 및 선별, 또는 조직 또는 세포 배양 기술을 사용한 편친(single parent)으로부터의 무성 번식에 의해 생성될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "재배종" 및 "품종"은 동의어이고, 상업적인 생산에 사용되는 계통을 지칭한다.
"안정성" 또는 "안정적"은 소정의 성분과 관련하여, 이러한 성분이 세대에서 세대로, 바람직하게는 3대 이상 동안, 실질적으로 동일한 수준, 예를 들어, 바람직하게는 ±15％, 더욱 바람직하게는 ±10％, 가장 바람직하게는 ±5％에서 유지되는 것을 의미한다. 안정성은 온도, 장소, 스트레스 및 재식 시기에 영향을 받을 수 있다. 필드 조건 하에서의 후속 세대들의 비교가 유사한 방식으로 이러한 성분을 생산하여야 한다.
"상업적 유용성"은 양호한 식물 활력 및 높은 번식력이 있어서, 통상적인 농업 설비를 사용하여 농부가 작물을 생산할 수 있고, 기술된 성분들이 있는 오일이 통상적인 분쇄 및 추출 설비를 사용하여 종자로부터 추출될 수 있는 것으로 정의된다. 상업적으로 유용하기 위해, 종자 중량, 오일 함량 및 에이커 당 생산된 총 오일에 의해 측정되는 바와 같은 수율은 동일한 영역에서 성장된, 다른 면에서는 유사하지만 프리미엄 가치의 형질이 없는 시판되는 캐놀라 품종의 평균 수율의 15％ 이내이다.
"작물학적으로 우량한(elite)"은 계통이, 당해 이벤트(들)에 기인하는 곤충 저항성에 더하여, 바람직한 작물학적 특성 예컨대 수율, 숙성도, 질병 저항성 등을 지니는 것을 의미한다. 본 발명의 이벤트를 포함하는 식물에서 하기 실시예에 기재된 바와 같이 개별적으로 또는 임의의 조합으로 취해진 작물학적 형질이 본 발명의 범주 내에 속한다. 임의의 모든 이러한 작물학적 특성 및 데이터 포인트가 포인트로서, 또는 이같은 식물을 정의하는데 사용되는 광범위한 특성들의 한쪽 끝부분 또는 양쪽 끝부분에서, 이같은 식물을 확인하는데 사용될 수 있다.
당업자가 본 개시내용의 견지에서 인지할 바와 같이, 검출 키트의 바람직한 실시양태는, 예를 들어, "접합부 서열" 또는 "전이 서열" (대두 게놈 플랭킹 서열이 삽입물 서열과 만나는 곳)에 대해 지시되고/되거나 이를 포함하는 프로브 및/또는 프라이머를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이는 상기 표 1에서 지시된 바와 같은 접합부 서열 (삽입물이 플랭킹 서열을 만나는 곳) 중 하나 또는 양쪽을 확인하도록 디자인된 폴리뉴클레오티드 프로브, 프라이머 및/또는 앰플리콘을 포함한다. 한 통상적인 디자인은 플랭킹 영역에서 혼성화하는 1개의 프라이머, 및 삽입물에서 혼성화하는 1개의 프라이머가 있는 것이다. 종종 이같은 프라이머들은 각각 잔기 약 15개 이상의 길이이다. 이러한 배열 내에서, 프라이머들이 본 발명의 이벤트의 존재를 지시하는 검출가능한 앰플리콘을 생성/증폭시키는데 사용될 수 있다. 상기 지시된 바와 같은 접합부 서열에 스패닝되는 (그리고 이를 포함하는) 앰플리콘을 생성시키는데 이러한 프라이머들이 사용될 수 있다.
플랭킹 서열에 "터치다운"한 프라이머(들)은, 전형적으로, 염기 약 200개를 넘어서 또는 접합부를 넘어서 혼성화하도록 디자인되지 않는다. 따라서, 전형적인 플랭킹 프라이머는 삽입물 시작부로부터 플랭킹 서열 내로의 염기 200개 이내의 어느 한 쪽 가닥의 15개 이상의 잔기를 포함하도록 디자인될 것이다. 즉, 서열 1의 잔기 ~2530-2730 및/또는 ~9122-9322로부터의 (또는 이러한 잔기에 혼성화하는) 적합한 크기의 서열을 포함하는 프라이머가 본 발명의 범주 내에 속한다. 삽입물 프라이머가 삽입물 상의 임의의 장소에서 유사하게 디자인될 수 있지만, 잔기 ~2731-2931 및 ~8921-9121이, 예를 들어, 이같은 프라이머 디자인에 비-배타적으로 사용될 수 있다.
당업자는 프라이머 및 프로브가 광범위한 표준 혼성화 및/또는 PCR 조건 하에 서열 1 (또는 이의 상보물)의 절편, 및 이의 상보물에 혼성화하도록 디자인될 수 있고, 이때 프라이머 또는 프로브가 예시된 서열에 대해 완벽하게 상보적이지 않다는 것을 또한 인지할 것이다. 즉, 어느 정도의 미스매치(mismatch)가 허용될 수 있다. 예를 들어, 뉴클레오티드 약 20개의 프라이머에 대해, 앰플리콘을 마주 보는 프라이머의 내부 또는 끝부분에 미스매치 염기가 있는 경우 전형적으로 1개 또는 2개 정도의 뉴클레오티드가 반대 가닥과 결합할 필요가 없다. 다양한 적합한 혼성화 조건이 하기에서 제공된다. 합성 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 이노신이 또한 프로브에서 사용될 수 있다. DNA 및 RNA 프로브뿐만 아니라, 펩티드 핵산 (PNA) 프로브가 또한 사용될 수 있다. 중요한 것은 이같은 프로브 및 프라이머가 본 발명의 이벤트의 존재에 대해 진단적이다 (이를 독특하게 확인 및 구별할 수 있다)는 것이다.
PCR 증폭에서의 오류가 발생할 수 있고, 이는 예를 들어 미미한 시퀀싱 오류를 초래할 수 있다는 것을 주지하여야 한다. 즉, 달리 지시되지 않는 한, 본원에서 열거된 서열은 대두 게놈 DNA로부터 긴 앰플리콘을 생성시킨 후 이러한 앰플리콘을 클로닝하고 시퀀싱함으로써 결정되었다. 게놈 DNA로부터 시퀀싱을 위한 충분한 앰플리콘을 생성시키기 위해 필요한 다수의 증폭 라운드를 고려하여, 이러한 방식으로 생성 및 결정된 서열들에서 약간의 차이 및 미미한 불일치를 발견하는 것은 드물지 않다. 당업자는 이러한 유형의 통상적인 시퀀싱 오류 또는 불일치로 인해 필요한 임의의 보정이 본 발명의 범주 내에 속한다는 것을 인지하여야 하고 이를 주의하여야 한다.
일부 게놈 서열이, 예를 들어, 서열이 이벤트 생성 동안 삽입될 때, 결실되는 것이 드물지 않다는 것을 또한 주지하여야 한다. 따라서, 예를 들어, 진뱅크(GENBANK)에 열거된 게놈 서열과 당해 플랭킹 서열 간에 약간의 차이가 또한 나타날 수 있다.
"삽입물"의 성분들이 도면에서 도해되고, 하기 실시예에서 더욱 상세하게 논의된다. 이러한 성분들의 DNA 폴리뉴클레오티드 서열, 또는 이의 단편이 본 발명의 방법에서 DNA 프라이머 또는 프로브로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 대두 식물로부터, 식물 및 종자 등 내의 트랜스진/게놈 삽입 영역의 존재를 검출하기 위한 조성물 및 방법이 제공된다. 본원에서 제공된 당해 트랜스진/게놈 삽입 영역 접합부 서열 (서열 1의 잔기 2730-2731과 9121-9122 사이)을 포함하는 DNA 서열, 이의 절편, 및 예시된 서열 및 이의 임의의 절편의 상보물이 제공된다. 삽입 영역 접합부 서열은 게놈 내로 삽입된 이종성 DNA와 삽입 부위에 플랭킹된 대두 세포로부터의 DNA 사이의 접합부에 스패닝된다. 이같은 서열은 소정의 이벤트에 대해 진단적일 수 있다.
삽입물 및 경계 서열을 기초로, 이벤트-특이적 프라이머가 생성될 수 있다. 이러한 이벤트-특이적 프라이머 세트로 생성된 PCR 앰플리콘의 분석에 의해 본 발명의 대두 계통들이 상이한 대두 유전자형들에서 확인될 수 있다는 것이 PCR 분석에서 실연되었다. 이러한 절차 및 기타 관련 절차를 사용하여 이러한 대두 계통을 독특하게 확인할 수 있다. 따라서, 이같은 프라이머 쌍으로부터 유래된 PCR 앰플리콘이 독특하고, 이러한 대두 계통을 확인하는데 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 신규 트랜스진/게놈 삽입 영역의 연속적인 단편을 포함하는 DNA 서열이 본 발명의 측면이다. 트랜스진 삽입물 서열의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드 및 3개의 상기 언급된 대두 식물들 중 하나 이상으로부터의 대두 게놈 서열의 충분한 길이의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열, 및/또는 이러한 대두 식물들 중 하나 이상에 대해 진단적인 앰플리콘 생성물의 생산을 위한 프라이머 서열로서 유용한 서열이 포함된다.
관련된 실시양태는 본원에서 확인된 DNA 서열(예를 들어 서열 1 및 그의 절편)의 트랜스진 부분의 적어도 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개 또는 이를 초과하는 개수의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는 DNA 서열, 또는 이의 상보물, 및 이러한 서열들로부터의 유사한 길이의 플랭킹 대두 DNA 서열, 또는 이의 상보물에 관한 것이다. DNA 증폭 방법에서 이같은 서열들이 DNA 프라이머로서 유용할 수 있다. 이러한 프라이머를 사용하여 생산된 앰플리콘은 본원에서 언급되는 대두 이벤트에 대해 진단적이다. 따라서, 본 발명은 이같은 DNA 프라이머 및 상동성 프라이머에 의해 생산된 앰플리콘을 또한 포함한다.
본 발명은 샘플 내의 본원에서 언급된 대두 이벤트에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 또한 포함한다. 이같은 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을 이러한 대두 이벤트들 중 하나 이상으로부터의 DNA와 함께 핵산 증폭 반응에서 사용되는 경우 상기 이벤트(들)에 대해 진단적인 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; (b) 핵산 증폭 반응을 수행함으로써, 앰플리콘을 생산하는 단계; 및 (c) 앰플리콘을 검출하는 단계를 포함할 수 있다.
추가적인 본 발명의 검출 방법은 (a) DNA를 포함하는 샘플을 엄격한 혼성화 조건 하에 상기 대두 이벤트들 중 하나 이상으로부터의 DNA와 혼성화하고 엄격한 혼성화 조건 하에 대조군 대두 식물 (비-관심 이벤트 DNA)과 혼성화하지 않는 프로브와 접촉시키는 단계; (b) 샘플 및 프로브를 엄격한 혼성화 조건에 적용하는 단계; 및 (c) DNA에 대한 프로브의 혼성화를 검출하는 단계를 포함하는, 샘플 내의 상기 이벤트들 중 하나 이상에 상응하는 DNA의 존재를 검출하는 방법을 포함한다.
추가적인 실시양태에서, 본 발명은 (a) 제1 어버이 대두 계통 (상기 제초제 저항성 형질을 상기 계통의 식물에게 부여하는 본 발명의 발현 카세트를 포함함) 및 제2 어버이 대두 계통 (이러한 제초제 내성 형질이 없음)을 유성 교배시켜, 다수의 자손 식물을 생산하는 단계; 및 (b) 분자 마커를 사용하여 자손 식물을 선별하는 단계를 포함하는, 본 발명의 aad -12 이벤트를 포함하는 대두 식물을 생산하는 방법을 포함한다. 이같은 방법은 자손 식물을 제2 어버이 대두 계통에 역-교배시켜 상기 곤충 내성 형질을 포함하는 순계(true-breeding) 대두 식물을 생산하는 추가적인 단계를 임의적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에 따르면, 상기 3개의 이벤트 중 임의의 하나 (또는 하나 이상)와의 교배의 자손의 접합성을 결정하는 방법이 제공된다. 상기 방법은 대두 DNA를 포함하는 샘플을 본 발명의 프라이머 세트와 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다. 상기 프라이머들은, 상기 대두 이벤트들 중 하나 이상으로부터의 게놈 DNA와 함께 핵산 증폭 반응에서 사용되는 경우 상기 대두 이벤트들 중 하나 이상에 대해 진단적인 제1 앰플리콘을 생산한다. 이같은 방법은 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제1 앰플리콘을 생산하는 단계; 제1 앰플리콘을 검출하는 단계; 및 대두 DNA를 포함하는 샘플을 대두 식물로부터의 게놈 DNA와 함께 핵산 증폭 반응에서 사용되는 경우 대두 게놈 영역에 대해 상동성인 천연 대두 게놈 DNA를 포함하는 제2 앰플리콘을 생산하는 프라이머 세트와 접촉시키는 단계; 및 핵산 증폭 반응을 수행함으로써 제2 앰플리콘을 생산하는 단계를 추가로 포함한다. 이러한 방법은 제2 앰플리콘을 검출하는 단계, 및 샘플 내의 제1 및 제2 앰플리콘을 비교하고, 이때 양쪽 앰플리콘의 존재는 샘플이 트랜스진 삽입에 대해 이종접합성이라는 것을 가리키는 단계를 추가로 포함한다.
본원에 개시된 조성물 및 DNA 검출 분야에 주지된 방법을 사용하여 DNA 검출 키트가 개발될 수 있다. 이러한 키트는 샘플 내의 당해 대두 이벤트 DNA의 확인에 유용하고, 이러한 DNA를 함유하는 대두 식물을 육종하는 방법에 적용될 수 있다. 이러한 키트는 앰플리콘 (예를 들어, 본원에 개시된 것)에 대해 상동성이거나 상보적인 DNA 서열, 또는 당해 이벤트의 트랜스진 유전 요소 내에 함유된 DNA에 대해 상동성이거나 상보적인 DNA 서열을 함유한다. 이러한 DNA 서열들은 DNA 증폭 반응에서 또는 프로브로서 DNA 혼성화 방법에서 사용될 수 있다. 키트는 검출 방법의 수행에 필요한 시약 및 물질을 또한 함유할 수 있다.
"프로브"는 통상적인 검출가능한 표지 또는 리포터 분자 (예컨대 방사성 동위원소, 리간드, 화학발광제 또는 효소)에 부착된 단리된 핵산 분자이다. 이같은 프로브는 표적 핵산의 가닥에 상보적이고, 본 발명의 경우에는 대두 식물로부터 유래되든 또는 이벤트로부터의 DNA를 포함하는 샘플로부터 유래되든 상기 대두 이벤트들 중 하나로부터의 게놈 DNA의 가닥에 상보적이다. 본 발명에 따른 프로브는 디옥시리보핵산 또는 리보핵산뿐만 아니라, 표적 DNA 서열에 특이적으로 결합하고 이러한 표적 DNA 서열의 존재를 검출하는데 사용될 수 있는 폴리아미드 및 기타 프로브 물질을 또한 포함한다.
"프라이머"는 상보적인 표적 DNA 가닥에 핵산 혼성화에 의해 어닐링(annealing)하여 프라이머와 표적 DNA 가닥 간의 하이브리드를 형성한 후, 표적 DNA 가닥을 따라 중합효소, 예를 들어, DNA 중합효소에 의해 확장되는 단리된/합성된 핵산이다. 본 발명의 프라이머 쌍은 표적 핵산 서열의 증폭, 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 또는 기타 통상적인 핵산 증폭 방법에 의한 증폭을 위한 이의 사용을 지칭한다.
프로브 및 프라이머의 길이는 일반적으로 폴리뉴클레오티드 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개, 118개, 119개, 120개, 121개, 122개, 123개, 124개, 125개, 126개, 127개, 128개, 129개, 130개, 131개, 132개, 133개, 134개, 135개, 136개, 137개, 138개, 139개, 140개, 141개, 142개, 143개, 144개, 145개, 146개, 147개, 148개, 149개, 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개, 161개, 162개, 163개, 164개, 165개, 166개, 167개, 168개, 169개, 170개, 171개, 172개, 173개, 174개, 175개, 176개, 177개, 178개, 179개, 180개, 181개, 182개, 183개, 184개, 185개, 186개, 187개, 188개, 189개, 190개, 191개, 192개, 193개, 194개, 195개, 196개, 197개, 198개, 199개, 200개, 201개, 202개, 203개, 204개, 205개, 206개, 207개, 208개, 209개, 210개, 211개, 212개, 213개, 214개, 215개, 216개, 217개, 218개, 219개, 220개, 221개, 222개, 223개, 224개, 225개, 226개, 227개, 228개, 229개, 230개, 231개, 232개, 233개, 234개, 235개, 236개, 237개, 238개, 239개, 240개, 241개, 242개, 243개, 244개, 245개, 246개, 247개, 248개, 249개, 250개, 251개, 252개, 253개, 254개, 255개, 256개, 257개, 258개, 259개, 260개, 261개, 262개, 263개, 264개, 265개, 266개, 267개, 268개, 269개, 270개, 271개, 272개, 273개, 274개, 275개, 276개, 277개, 278개, 279개, 280개, 281개, 282개, 283개, 284개, 285개, 286개, 287개, 288개, 289개, 290개, 291개, 292개, 293개, 294개, 295개, 296개, 297개, 298개, 299개, 300개, 301개, 302개, 303개, 304개, 305개, 306개, 307개, 308개, 309개, 310개, 311개, 312개, 313개, 314개, 315개, 316개, 317개, 318개, 319개, 320개, 321개, 322개, 323개, 324개, 325개, 326개, 327개, 328개, 329개, 330개, 331개, 332개, 333개, 334개, 335개, 336개, 337개, 338개, 339개, 340개, 341개, 342개, 343개, 344개, 345개, 346개, 347개, 348개, 349개, 350개, 351개, 352개, 353개, 354개, 355개, 356개, 357개, 358개, 359개, 360개, 361개, 362개, 363개, 364개, 365개, 366개, 367개, 368개, 369개, 370개, 371개, 372개, 373개, 374개, 375개, 376개, 377개, 378개, 379개, 380개, 381개, 382개, 383개, 384개, 385개, 386개, 387개, 388개, 389개, 390개, 391개, 392개, 393개, 394개, 395개, 396개, 397개, 398개, 399개, 400개, 401개, 402개, 403개, 404개, 405개, 406개, 407개, 408개, 409개, 410개, 411개, 412개, 413개, 414개, 415개, 416개, 417개, 418개, 419개, 420개, 421개, 422개, 423개, 424개, 425개, 426개, 427개, 428개, 429개, 430개, 431개, 432개, 433개, 434개, 435개, 436개, 437개, 438개, 439개, 440개, 441개, 442개, 443개, 444개, 445개, 446개, 447개, 448개, 449개, 450개, 451개, 452개, 453개, 454개, 455개, 456개, 457개, 458개, 459개, 460개, 461개, 462개, 463개, 464개, 465개, 466개, 467개, 468개, 469개, 470개, 471개, 472개, 473개, 474개, 475개, 476개, 477개, 478개, 479개, 480개, 481개, 482개, 483개, 484개, 485개, 486개, 487개, 488개, 489개, 490개, 491개, 492개, 493개, 494개, 495개, 496개, 497개, 498개, 499개, 또는 500개 또는 이를 초과하는 개수이다. 이같은 프로브 및 프라이머는 고-엄격성 혼성화 조건 하에 표적 서열에 특이적으로 혼성화한다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 프로브 및 프라이머는 표적 서열과의 완전한 서열 유사성을 지니지만, 표적 서열과 상이하고 표적 서열에 혼성화하는 능력을 유지하는 프로브가 통상적인 방법에 의해 디자인될 수 있다.
프로브 및 프라이머를 제조하고 사용하는 방법이, 예를 들어, 문헌 [Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., vol. 1-3, ed. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]에 기술되어 있다. PCR-프라이머 쌍이, 예를 들어, 이러한 목적에 의도된 컴퓨터 프로그램을 사용함으로써, 공지된 서열로부터 유래될 수 있다.
본원에 개시된 플랭킹 DNA 및 삽입물 서열을 기초로 하는 프라이머 및 프로브가 통상적인 방법에 의해, 예를 들어, 이같은 서열의 재-클로닝 및 시퀀싱에 의해 개시된 서열을 확인하는데 (그리고, 필요하다면 수정하는데) 사용될 수 있다.
본 발명의 핵산 프로브 및 프라이머는 엄격한 조건 하에 표적 DNA 서열에 혼성화한다. 임의의 통상적인 핵산 혼성화 또는 증폭 방법이 샘플 내의 트랜스제닉 이벤트로부터의 DNA의 존재를 확인하는데 사용될 수 있다. 핵산 분자 또는 이의 단편은 특정 환경 하에 다른 핵산 분자에 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 2개의 분자가 역-평행한 이중 가닥 핵산 구조를 형성할 수 있다면 2개의 핵산 분자가 서로 특이적으로 혼성화할 수 있는 것으로 언급된다. 2개의 분자가 완전한 상보성을 나타낸다면 핵산 분자는 또 다른 핵산 분자의 "상보물"인 것으로 언급된다. 본원에서 사용된 바와 같이, 분자들 중 하나의 모든 뉴클레오티드가 다른 분자의 뉴클레오티드에 상보적인 경우 분자들이 "완전한 상보성"을 나타내는 것으로 언급된다. 2개의 분자가 적어도 통상적인 "저-엄격성" 조건 하에 이들을 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 허용하는 충분한 안정성으로 혼성화할 수 있다면 2개의 분자가 "최소로 상보적"인 것으로 언급된다. 유사하게, 분자들이 통상적인 "고-엄격성" 조건 하에 이들을 서로 어닐링된 상태로 유지되도록 허용하는 충분한 안정성으로 혼성화할 수 있다면 분자들이 "상보적"인 것으로 언급된다. 통상적인 엄격성 조건이 문헌 [Sambrook et al., 1989]에 기술되어 있다. 따라서, 완전한 상보성으로부터 벗어나는 것이 이중 가닥 구조를 형성하는 분자들의 능력을 완전하게 방해하지 않는 한, 완전한 상보성으로부터 벗어나는 것이 허용된다. 핵산 분자가 프라이머 또는 프로브로서의 역할을 하기 위해, 사용된 특정 용매 및 염 농도 하에 안정적인 이중 가닥 구조를 형성할 수 있도록 서열 면에서 충분히 상보적인 것만이 필요하다.
본원에서 사용된 바와 같이, 실질적으로 상동성인 서열은 고-엄격성 조건 하에 자신이 비교되는 핵산 서열의 상보물에 특이적으로 혼성화할 핵산 서열이다. 용어 "엄격한 조건"은 문헌 [Sambrook et al., 1989]의 9.52-9.55에 논의된 특정 혼성화 절차에 의해 표적 핵산 (즉, 관심이 있는 특정 핵산 서열)에 대한 핵산 프로브의 혼성화와 관련하여 기능적으로 정의된다. 문헌 [Sambrook et al., 1989]의 9.47-9.52 및 9.56-9.58을 또한 참조한다. 따라서, DNA 단편의 상보적인 신장물(stretch)과 선택적으로 듀플렉스(duplex) 분자를 형성하는 능력에 대해 본 발명의 뉴클레오티드 서열이 사용될 수 있다.
구상되는 용도에 따라, 표적 서열에 대한 프로브의 다양한 정도의 선택도를 달성하기 위해 다양한 혼성화 조건을 사용할 수 있다. 높은 선택도를 필요로 하는 용도에 대해, 하이브리드를 형성하기 위해 비교적 엄격한 조건이 선택될 것이고, 예를 들어, 비교적 낮은 염 및/또는 높은 온도 조건, 예컨대 약 50℃ 내지 약 70℃의 온도에서 약 0.02 M 내지 약 0.15 M NaCl에 의해 제공되는 조건이 선택될 것이다. 엄격한 조건은, 예를 들어, 혼성화 필터를 고-엄격성 세정 완충제 (0.2× SSC, 0.1％ SDS, 65℃)로 2회 이상 세정하는 것을 수반할 수 있다. DNA 혼성화를 촉진하는 적합한 엄격성 조건, 예를 들어, 약 45℃에서의 6.0× 염화나트륨/시트르산나트륨 (SSC)에 이어지는 50℃에서의 2.0× SSC의 세정이 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 세정 단계에서의 염 농도가 50℃에서의 약 2.0× SSC의 저-엄격성 내지 50℃에서의 약 0.2× SSC의 고-엄격성에서 선택될 수 있다. 또한, 세정 단계에서의 온도가 약 22℃의 실온의 저-엄격성 조건에서 약 65℃의 고-엄격성 조건까지 증가될 수 있다. 온도 및 염 양쪽 모두가 변할 수 있거나, 또는 온도 또는 염 농도 중 하나가 변화되는 동안 다른 변수는 일정하게 유지될 수 있다. 이같은 선별 조건은 프로브와 주형 또는 표적 가닥 사이의 미스매치 (존재하는 경우)를 거의 허용하지 않는다. 혼성화를 통한 DNA 서열의 검출은 당업자에게 주지되어 있고, 미국 특허 번호 4,965,188 및 5,176,995의 교시 내용이 혼성화 분석 방법을 예시한다.
특히 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 핵산은 고-엄격성 조건 하에 본원에서 예시 또는 제안된 프라이머들 (또는 앰플리콘들 또는 기타 서열들) (이의 상보물 및 단편 포함) 중 하나 이상에 특이적으로 혼성화할 것이다. 본 발명의 한 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 예시된 서열들 중 하나에서 본원에 기재된 핵산 서열, 또는 이의 상보물 및/또는 단편을 지닌다.
본 발명의 또 다른 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 이같은 핵산 서열과 80％ 내지 100％ 또는 90％ 내지 100％의 서열 동일성을 공유한다. 본 발명의 추가적인 측면에서, 본 발명의 마커 핵산 분자는 이같은 서열과 95％ 내지 100％의 서열 동일성을 공유한다. 이같은 서열은 유전 교차의 자손을 확인하기 위해 식물 육종 방법에서 마커로서 사용될 수 있다. 표적 DNA 분자에 대한 프로브의 혼성화를 당업자에게 공지된 다수의 방법에 의해 검출할 수 있고, 이는 형광 태그(tag), 방사성 태그, 항체 기반 태그 및 화학발광 태그를 포함할 수 있지만, 이에 한정되지는 않는다.
특정한 증폭 프라이머 쌍을 사용하는 표적 핵산 서열의 증폭 (예를 들어, PCR에 의한 증폭)과 관련하여, "엄격한 조건"은 프라이머 쌍이 상응하는 야생형 서열 (또는 이의 상보물)을 지니는 프라이머가 결합할 표적 핵산 서열에만 혼성화하게 하고, 바람직하게는 독특한 증폭 생성물인 앰플리콘을 생산하게 하는 조건이다.
"(표적 서열)에 대해 특이적인"이라는 용어는 프로브 또는 프라이머가 엄격한 혼성화 조건 하에 표적 서열을 포함하는 샘플 내의 표적 서열에만 혼성화하는 것을 가리킨다.
본원에서 사용된 "증폭된 DNA" 또는 "앰플리콘"은 핵산 주형의 일부분인 표적 핵산 서열의 핵산 증폭 생성물을 지칭한다. 예를 들어, 유성 교배로부터 생성된 대두 식물이 본 발명의 대두 식물로부터의 트랜스제닉 이벤트 게놈 DNA를 함유하는지 여부를 결정하기 위해, 이벤트 DNA의 존재에 대해 진단적인 앰플리콘을 생산하도록, 대두 식물 조직 샘플로부터 추출된 DNA를 삽입된 이종성 DNA의 삽입 부위에 인접한 식물의 게놈 내의 플랭킹 서열로부터 유래된 프라이머 및 이러한 삽입된 이종성 DNA로부터 유래된 제2 프라이머를 포함하는 프라이머 쌍을 사용하여 핵산 증폭 방법에 적용할 수 있다. 앰플리콘의 길이 및 서열이 이벤트에 대해 또한 진단적이다. 앰플리콘의 길이는 프라이머 쌍 + 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍의 조합 길이, 및/또는 프라이머 쌍 + 약 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개, 118개, 119개, 120개, 121개, 122개, 123개, 124개, 125개, 126개, 127개, 128개, 129개, 130개, 131개, 132개, 133개, 134개, 135개, 136개, 137개, 138개, 139개, 140개, 141개, 142개, 143개, 144개, 145개, 146개, 147개, 148개, 149개, 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개, 161개, 162개, 163개, 164개, 165개, 166개, 167개, 168개, 169개, 170개, 171개, 172개, 173개, 174개, 175개, 176개, 177개, 178개, 179개, 180개, 181개, 182개, 183개, 184개, 185개, 186개, 187개, 188개, 189개, 190개, 191개, 192개, 193개, 194개, 195개, 196개, 197개, 198개, 199개, 200개, 201개, 202개, 203개, 204개, 205개, 206개, 207개, 208개, 209개, 210개, 211개, 212개, 213개, 214개, 215개, 216개, 217개, 218개, 219개, 220개, 221개, 222개, 223개, 224개, 225개, 226개, 227개, 228개, 229개, 230개, 231개, 232개, 233개, 234개, 235개, 236개, 237개, 238개, 239개, 240개, 241개, 242개, 243개, 244개, 245개, 246개, 247개, 248개, 249개, 250개, 251개, 252개, 253개, 254개, 255개, 256개, 257개, 258개, 259개, 260개, 261개, 262개, 263개, 264개, 265개, 266개, 267개, 268개, 269개, 270개, 271개, 272개, 273개, 274개, 275개, 276개, 277개, 278개, 279개, 280개, 281개, 282개, 283개, 284개, 285개, 286개, 287개, 288개, 289개, 290개, 291개, 292개, 293개, 294개, 295개, 296개, 297개, 298개, 299개, 300개, 301개, 302개, 303개, 304개, 305개, 306개, 307개, 308개, 309개, 310개, 311개, 312개, 313개, 314개, 315개, 316개, 317개, 318개, 319개, 320개, 321개, 322개, 323개, 324개, 325개, 326개, 327개, 328개, 329개, 330개, 331개, 332개, 333개, 334개, 335개, 336개, 337개, 338개, 339개, 340개, 341개, 342개, 343개, 344개, 345개, 346개, 347개, 348개, 349개, 350개, 351개, 352개, 353개, 354개, 355개, 356개, 357개, 358개, 359개, 360개, 361개, 362개, 363개, 364개, 365개, 366개, 367개, 368개, 369개, 370개, 371개, 372개, 373개, 374개, 375개, 376개, 377개, 378개, 379개, 380개, 381개, 382개, 383개, 384개, 385개, 386개, 387개, 388개, 389개, 390개, 391개, 392개, 393개, 394개, 395개, 396개, 397개, 398개, 399개, 400개, 401개, 402개, 403개, 404개, 405개, 406개, 407개, 408개, 409개, 410개, 411개, 412개, 413개, 414개, 415개, 416개, 417개, 418개, 419개, 420개, 421개, 422개, 423개, 424개, 425개, 426개, 427개, 428개, 429개, 430개, 431개, 432개, 433개, 434개, 435개, 436개, 437개, 438개, 439개, 440개, 441개, 442개, 443개, 444개, 445개, 446개, 447개, 448개, 449개, 450개, 451개, 452개, 453개, 454개, 455개, 456개, 457개, 458개, 459개, 460개, 461개, 462개, 463개, 464개, 465개, 466개, 467개, 468개, 469개, 470개, 471개, 472개, 473개, 474개, 475개, 476개, 477개, 478개, 479개, 480개, 481개, 482개, 483개, 484개, 485개, 486개, 487개, 488개, 489개, 490개, 491개, 492개, 493개, 494개, 495개, 496개, 497개, 498개, 499개, 또는 500개, 750개, 1000개, 1250개, 1500개, 1750개, 2000개, 또는 이를 초과하는 개수의 뉴클레오티드 염기 쌍의 조합 길이 (± 임의의 상기 열거된 증분) 범위일 수 있다. 별법적으로, 삽입된 DNA의 양쪽 측면 상의 플랭킹 서열로부터 프라이머 쌍이 유래되어, 삽입물 뉴클레오티드 서열 전체를 포함하는 앰플리콘이 생산될 수 있다. 식물 게놈 서열로부터 유래된 프라이머 쌍의 구성원은 삽입된 DNA 서열로부터 간격을 두고 위치할 수 있다. 이러한 거리는 1개의 뉴클레오티드 염기 쌍 내지 약 20000개의 뉴클레오티드 염기 쌍 범위일 수 있다. 용어 "앰플리콘"의 사용은 DNA 열 증폭 반응에서 형성될 수 있는 프라이머 이량체를 명확하게 배제한다.
핵산 증폭은 중합효소 연쇄 반응 (PCR)이 포함되는, 임의의 당업계에 공지된 다양한 핵산 증폭 방법에 의해 달성될 수 있다. 다양한 증폭 방법이 당업계에 공지되어 있고, 특히, 미국 특허 번호 4,683,195 및 미국 특허 번호 4,683,202에 기술되어 있다. 22 kb까지의 게놈 DNA를 증폭하도록 PCR 증폭 방법들이 개발되었다. 이러한 방법들, 뿐만 아니라 DNA 증폭 분야에 공지된 기타 방법들이 본 발명의 실행에서 사용될 수 있다. 당해 대두 이벤트로부터의 이종성 트랜스진 DNA 삽입물 또는 플랭킹 게놈 서열의 서열이 본원에서 제공된 서열로부터 유래된 프라이머를 사용하여 이벤트로부터 이같은 서열을 증폭시키는 것에 이어지는 PCR 앰플리콘 또는 클로닝된 DNA의 표준 DNA 시퀀싱에 의해 확인될 수 있다 (그리고, 필요하다면 수정될 수 있다).
이러한 방법에 의해 생산된 앰플리콘을 다수의 기술에 의해 검출할 수 있다. 아가로스 젤 전기영동 및 에티듐 브로마이드로의 염색은 통상적인 주지된 DNA 앰플리콘 검출 방법이다. 또 다른 이같은 방법은 제네틱 비트(Genetic Bit) 분석이고, 이때 인접한 플랭킹 게놈 DNA 서열과 삽입된 DNA 서열 양쪽 모두에 중첩되는 DNA 올리고뉴클레오티드가 디자인된다. 이러한 올리고뉴클레오티드가 마이크로웰 플레이트의 웰에 고정된다. 관심 영역의 PCR 후 (삽입된 서열에서의 프라이머 1개 및 인접한 플랭킹 게놈 서열에서의 프라이머 1개를 사용함), 단일 가닥 PCR 생성물이 이러한 고정된 올리고뉴클레오티드에 혼성화되고, DNA 중합효소 및 예상되는 다음 염기에 대해 특이적인 표지된 ddNTP를 사용하는 단일 염기 확장 반응을 위한 주형으로서의 역할을 할 수 있다. 판독은 형광 또는 ELISA-기반일 수 있다. 신호는 성공적인 증폭, 혼성화, 및 단일 염기 확장에 기인하는 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.
또 다른 방법은 문헌 [Winge, Innov. Pharma. Tech. 00:18-24, 2000]에 기술된 바와 같은 파이로시퀀싱(Pyrosequencing) 기술이다. 이러한 방법에서, 인접한 게놈 DNA와 삽입물 DNA 접합부에 중첩되는 올리고뉴클레오티드가 디자인된다. 이러한 올리고뉴클레오티드가 관심 영역으로부터의 단일 가닥 PCR 생성물 (삽입된 서열에서의 프라이머 1개 및 플랭킹 게놈 서열에서의 프라이머 1개)에 혼성화되고, DNA 중합효소, ATP, 술프릴레이스(sulfurylase), 루시퍼레이스(luciferase), 애피레이스(apyrase), 아데노신 5' 포스포술페이트 및 루시페린의 존재 하에 인큐베이션된다. DNTP들이 개별적으로 첨가되고, 혼입은 광 신호를 초래하며, 이를 측정한다. 광 신호는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 또는 다중-염기 확장에 기인하는 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.
형광 편광은 본 발명의 앰플리콘을 검출하는데 사용될 수 있는 또 다른 방법이다. 이러한 방법에 따라, 플랭킹 게놈 DNA와 삽입된 DNA 접합부에 중첩되는 올리고뉴클레오티드가 디자인된다. 이러한 올리고뉴클레오티드가 관심 영역으로부터의 단일 가닥 PCR 생성물 (삽입된 DNA에서의 프라이머 1개 및 플랭킹 게놈 DNA 서열에서의 프라이머 1개)에 혼성화되고, DNA 중합효소 및 형광-표지 ddNTP의 존재 하에 인큐베이션된다. 단일 염기 확장은 ddNTP의 혼입을 초래한다. 형광계를 사용하여 편광에서의 변화로서 혼입을 측정할 수 있다. 편광에서의 변화는 성공적인 증폭, 혼성화 및 단일 염기 확장에 기인하는 트랜스진 삽입물/플랭킹 서열의 존재를 가리킨다.
택맨(TAQMAN) (PE 어플라이드 바이오시스템즈(PE Applied Biosystems), 캘리포니아주 포스터 시티)은 DNA 서열의 존재를 검출 및 정량하는 방법이다. 간략하게, 플랭킹 게놈 DNA 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 디자인된다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열에서의 프라이머 1개 및 플랭킹 게놈 서열에서의 프라이머 1개)가 열안정적인 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 사이클링된다. 특이적인 증폭 동안, Taq DNA 중합효소가 FRET 프로브 상의 켄칭(quenching) 모이어티로부터 형광 모이어티를 손질하여 방출시킨다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 기인하는 플랭킹/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 가리킨다.
몰레큘라 비콘(Molecular Beacon)이 서열 검출에서의 사용에 대해 기술되었다. 간략하게, 플랭킹 게놈 DNA 및 삽입물 DNA 접합부에 중첩되는 FRET 올리고뉴클레오티드 프로브가 디자인된다. FRET 프로브의 독특한 구조는 형광 모이어티와 켄칭 모이어티를 근접하게 유지시키는 2차 구조를 프로브가 함유하는 것을 초래한다. FRET 프로브 및 PCR 프라이머 (삽입물 DNA 서열에서의 프라이머 1개 및 플랭킹 게놈 서열에서의 프라이머 1개)가 열안정적인 중합효소 및 dNTP의 존재 하에 사이클링된다. 성공적인 PCR 증폭 후, 표적 서열에 대한 FRET 프로브의 혼성화는 프로브 2차 구조의 제거 및 형광 모이어티와 켄칭 모이어티의 공간적인 분리를 초래한다. 형광 신호가 초래된다. 형광 신호는 성공적인 증폭 및 혼성화에 기인하는 플랭킹 게놈/트랜스진 삽입물 서열의 존재를 가리킨다.
삽입에 우수한 대두 게놈 내의 위치가 기술되었고, 본 발명은 이러한 게놈 위치에 일반적으로 근접한 하나 이상의 비-aad12 삽입물을 포함하는 대두 종자 및/또는 대두 식물을 또한 포함한다. 한 선택권은 본원에 예시된 aad -12 삽입물 대신에 상이한 삽입물로 치환하는 것이다. 일반적으로 이와 관련하여, 예를 들어, 표적화된 상동 재조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 이러한 유형의 기술은, 예를 들어, WO 03/080809 A2 및 상응하는 미국 출원 공개 (미국 2003/0232410)의 주제이다. 따라서, 본 발명은 본원에서 확인된 플랭킹 서열 (예를 들어, 서열 1의 잔기 1-2730 및 9122-10,212) 모두 또는 이의 인식가능한 일부분이 플랭킹된 이종성 삽입물을 (aad -12 대신 또는 aad -12의 다중 카피와 함께) 포함하는 식물 및 식물 세포를 포함한다. aad -12 유전자의 추가적인 카피 (또는 추가적인 카피들)이 이러한 방식/방식들로 삽입에 또한 표적화될 수 있다.
상동 재조합을 통해 폴리뉴클레오티드 서열을 식물 세포의 특정 염색체 부위 내로 통합시키는 방법들이 당업계에 개시되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 출원 공개 번호 2009/0111188 A1에 기술된 바와 같은 부위 특이적 통합은 염색체 표적 내로의 도너 폴리뉴클레오티드 서열의 통합을 매개하기 위한 재조합효소(recombinase) 또는 통합효소(integrase)의 사용을 기술한다. 또한, 국제 특허 출원 WO 2008/021207에는 하나 이상의 도너 폴리뉴클레오티드 서열을 게놈의 특정 위치 내로 통합시키기 위한 아연 손가락 매개-상동 재조합이 기술되어 있다. 재조합효소 예컨대 미국 특허 번호 6,720,475에 기술된 바와 같은 FLP/FRT 또는 미국 특허 번호 5,658,772에 기술된 바와 같은 CRE/LOX의 사용이 폴리뉴클레오티드 서열을 특정 염색체 부위 내로 통합시키는데 이용될 수 있다. 마지막으로, 도너 폴리뉴클레오티드를 특정 염색체 위치 내로 표적화하기 위한 메가뉴클리에이스(meganuclease)의 용도가 문헌 [Puchta et al., PNAS USA 93 (1996) pp. 5055-5060]에서 기술되었다.
식물 세포 내에서의 부위 특이적 통합을 위한 기타 다양한 방법들이 일반적으로 공지되어 있고 이용가능하다 (문헌 [Kumar et al., Trands in Plant Sci. 6(4) (2001) pp. 155-159]). 또한, 여러 원핵생물 및 저급 진핵생물에서 확인된 부위-특이적 재조합 시스템이 식물에서의 사용에 적용될 수 있다. 이같은 시스템의 예로는 효모 자이고사카로마이세스 로욱시이(Zygosaccharomyces rouxii)의 pSR1 플라스미드로부터의 R/RS 재조합효소 시스템 (문헌 [Araki et al. (1985) J. Mol. Biol. 182: 191-203]), 및 파지 뮤(Mu)의 Gin/gix 시스템 (문헌 [Maeser and Kahlmann (1991) Mol. Gen. Genet. 230: 170-176])이 포함되지만, 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 신규 트랜스진(들)을 기존의 트랜스제닉 이벤트에 근접하게 통합시키거나 스태킹하는 것이 바람직할 수 있다. 독특한 특성 예컨대 단일 삽입 부위, 정상적인 멘델 분리 및 안정적인 발현, 및 여러 환경학적 위치에 걸친 작물학적 성능 및 제초제 내성이 포함되는 효능의 우수한 조합을 기초로 선택된 트랜스제닉 이벤트가 바람직한 게놈 유전자좌로 고려될 수 있다. 새롭게 통합된 트랜스진은 기존의 형질전환체의 트랜스진 발현 특성을 유지하여야 한다. 또한, 새롭게 통합된 이벤트의 게놈 플랭킹 서열 및 염색체 위치가 이미 확인되어 있기 때문에 새롭게 통합된 이벤트의 검출 및 확인을 위한 분석법의 발달이 극복될 것이다. 마지막으로, 기존의 트랜스진에 연결된 특정 염색체 위치 내로의 새로운 트랜스진의 통합은 통상적인 육종 방법을 사용하는 유성 이종교배에 의한 다른 유전학적 배경 내로의 트랜스진들의 유전자이입을 촉진할 것이다.
본 발명의 일부 실시양태에서, 폴리뉴클레오티드 서열을 트랜스제닉 이벤트로부터 절제하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 가출원 번호 61/297,628에 기술된 바와 같은 트랜스진 절제는 염색체에 통합된 트랜스제닉 이벤트로부터 유전자 발현 카세트로 구성된 폴리뉴클레오티드 서열을 제거하기 위한 아연 손가락 뉴클리에이스(nuclease)의 사용을 기술한다. 제거되는 폴리뉴클레오티드 서열은 선별성 마커일 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 및 제거 시, 변형된 트랜스제닉 이벤트가 폴리뉴클레오티드 서열의 삽입에 의해 재표적화될 수 있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 절제 및 변형된 트랜스제닉 이벤트의 이어지는 재표적화는 선별성 마커의 재사용 또는 특정 유전자의 발현으로부터 초래되는 식물 트랜스크립톰(transcriptome)에 대한 의도하지 않은 변화를 극복하는 능력과 같은 장점을 제공한다.
본 발명은 이종성 핵산의 삽입용으로 우수한 대두 게놈 내의 염색체 4 상의 특정 부위를 본원에서 개시한다. 염색체 4 상의 표적 부위의 위치를 확인하는데 유용한 5' 분자 마커, 3' 분자 마커, 5' 플랭킹 서열, 및 3' 플랭킹 서열이 또한 개시된다. 따라서, 본 발명은 관심이 있는 이종성 핵산을 이러한 미리 확립된 표적 부위 내로 또는 이러한 표적 부위에 근접하게 도입하는 방법을 제공한다. 본 발명은 개시된 표적 부위에 또는 이같은 부위에 일반적으로 근접하게 삽입된 임의의 이종성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 대두 종자 및/또는 대두 식물을 또한 포함한다. 이같은 표적화된 통합을 달성하기 위한 한 선택권은 본원에 예시된 pat 발현 카세트를 절제하고/하거나 이러한 카세트 대신에 상이한 삽입물로 치환하는 것이다. 일반적으로 이와 관련하여, 예를 들어, 그리고 비제한적으로, 표적화된 상동 재조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 유전자, 이벤트 또는 형질 "스태킹"은 원하는 형질을 하나의 트랜스제닉 계통 내로 조합하는 것이다. 식물 육종자들은 원하는 형질을 각각 지니는 어버이들을 교배시킨 후 이러한 원하는 형질들 양쪽 모두를 지니는 후손을 확인함으로써 트랜스제닉 형질들을 스태킹시킨다. 유전자들을 스태킹시키는 또 다른 방식은 2개 이상의 유전자를 형질전환 동안 동시에 식물의 세포핵 내로 전달하는 것에 의한 것이다. 유전자들을 스태킹시키는 또 다른 방식은 트랜스제닉 식물을 또 다른 관심 유전자로 재-형질전환시키는 것에 의한 것이다. 예를 들어, 2개 이상의 상이한 곤충 형질, 곤충 저항성 형질(들) 및 질병 저항성 형질(들), 2개 이상의 제초제 저항성 형질, 및/또는 곤충 저항성 형질(들) 및 제초제 저항성 형질(들)이 예를 들어 포함되는 2개 이상의 상이한 형질을 조합하는데 유전자 스태킹이 사용될 수 있다. 관심 유전자에 더하여 선별성 마커를 사용하는 것이 또한 유전자 스태킹으로 간주될 수 있다.
"상동 재조합"은 새로운 재조합 DNA 서열을 형성하도록 2개의 뉴클레오티드 서열이 이를 통하여 상호작용할 수 있는 (재조합될 수 있는), 유사한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 상응하는 부위들이 있는 임의의 뉴클레오티드 서열 쌍 간의 반응을 지칭한다. 유사한 뉴클레오티드 서열의 부위들은 각각 본원에서 "상동성 서열"로 지칭된다. 일반적으로, 상동성 서열의 길이가 증가함에 따라 상동 재조합의 빈도가 증가한다. 따라서, 동일하다고는 할 수 없는 2개의 뉴클레오티드 서열 간에 상동 재조합이 발생할 수 있지만, 2개의 서열 간의 차이가 증가함에 따라 재조합 빈도 (또는 효율)가 감소한다. 도너 및 표적 분자 각각 상의 1개의 상동성 서열을 사용하여 재조합이 달성될 수 있고, 이에 의해 "단일 교차" 재조합 생성물이 생성된다. 별법적으로, 2개의 상동성 서열이 표적 및 도너 뉴클레오티드 서열 각각 상에 놓일 수 있다. 도너 상의 2개의 상동성 서열과 표적 상의 2개의 상동성 서열 간의 재조합으로 "이중 교차" 재조합 생성물이 생성된다. 도너 분자 상의 상동성 서열들이 조작하려는 서열 (예를 들어, 관심 서열)에 플랭킹되면, 표적 분자와의 이중 교차 재조합은 표적 분자 상의 상동성 서열들 사이에 원래 있었던 DNA 서열을 관심 서열이 교체한 재조합 생성물을 초래할 것이다. 이중 교차 재조합 이벤트를 통한 표적과 도너 간의 DNA 서열 교환은 "서열 교체"로 명명된다.
본원에서 언급 또는 인용된 모든 특허, 특허 출원, 가출원 및 간행물은 본 명세서의 명백한 교시 내용과 상반되지 않는 정도로 전문이 참고로 본원에 포함된다.
본 발명을 실행하기 위한 절차들을 설명하고 본 발명의 특정한 바람직한 실시양태들을 실연하기 위해 하기의 실시예들이 포함된다. 이러한 실시예들은 제한적인 것으로 해석되지 않아야 한다. 하기의 실시예에서 개시된 기술들이 이의 실행을 위한 바람직한 양식들을 설명하기 위해 사용된 특정한 접근법들을 나타낸다는 것이 당업자에게 이해될 것이다. 그러나, 당업자는, 본 개시내용의 견지에서, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 다수의 변화가 이러한 특정한 실시양태들에서 이루어지는 한편 비슷하거나 유사한 결과를 여전히 수득할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 달리 지시되지 않는 한, 모든 백분율은 중량 기준이고, 모든 용매 혼합물 비율은 달리 언급되지 않는 한 부피 기준이다.
달리 지시되지 않는 한 하기의 약어들이 사용된다.
AAD-12 아릴옥시알카노에이트 다이옥시저네이스-1
bp 염기쌍
℃ 섭씨 온도
DNA 디옥시리보핵산
DIG 디곡시제닌
EDTA 에틸렌디아민테트라아세트산
kb 킬로베이스
㎍ 마이크로그램
㎕ 마이크로리터
㎖ 밀리리터
M 몰 질량
OLP 중첩 프로브
PCR 중합효소 연쇄 반응
PTU 식물 전사 유닛
SDS 소듐 도데실 술페이트
SOP 표준 작업 절차
SSC 염화나트륨 및 시트르산나트륨의 혼합물을 함유하는 완충제 용액 (pH 7.0)
TBE 트리스(Tris) 염기, 붕산 및 EDTA의 혼합물를 함유하는 완충제 용액 (pH 8.3)
V 볼트
실시예
실시예 1. aad -12 대두 이벤트 DAS -68416-4의 형질전환 및 선별
대두 자엽절 외식편의 아그로박테리움-매개 형질전환을 통해 트랜스제닉 대두 (글리신 맥스) 이벤트 DAS-68416-4를 생성시켰다. T-가닥 DNA 영역 내에 선별성 마커 (pat) 및 관심 유전자 (aad -12)가 있는 이원성 벡터 pDAB4468 (도 1)을 보유하는 무장해제(disarmed) 아그로박테리움 균주 EHA101 (문헌 [Hood et al., 2006])이 형질전환을 개시시키는데 사용되었다.
아그로박테리움-매개 형질전환을 문헌 [Zeng et al., 2004]의 변형 절차를 사용하여 수행하였다. 간략하게, 대두 종자 (cv 매버릭)를 기본 배지 상에서 발아시키고, 자엽절을 단리하고, 아그로박테리움으로 감염시켰다. 출아 개시, 출아물 신장, 및 발근 배지에 아그로박테리움의 제거를 위해 세포탁심, 티멘틴, 및 반코마이신을 보충하였다. 글루포시네이트 선별을 사용하여 형질전환되지 않은 출아물의 성장을 억제하였다. 선별된 출아물을 뿌리 발달을 위한 발근 배지로 옮긴 후, 묘목의 순응을 위한 토양 혼합물로 옮겼다.
선별된 묘목의 말단 소엽에 추정 형질전환체에 대해 스크리닝하기 위해 글루포시네이트를 칠했다. 스크리닝된 묘목을 온실로 옮기고, 순응시킨 후, 글루포시네이트를 잎에 칠해 내성에 대해 재확인하고, 추정 형질전환체인 것으로 간주하였다. 스크리닝된 식물의 샘플을 취하고, 선별성 마커 유전자 및/또는 관심 유전자의 확인을 위한 분자적 분석을 수행하였다. T0 식물을 온실에서 자가 수정시켜, T1 종자를 생성시켰다.
T1 식물을 우량 생식세포질 (매버릭)로 역교배 및 유전자이입시켰다. 독립적인 형질전환 단리물로부터 이러한 이벤트인 대두 이벤트 DAS-68416-4가 생성되었다. 이벤트를 이의 독특한 특성 예컨대 단일 삽입 부위, 정상적인 멘델 분리 및 안정적인 발현, 및 광범위한 유전자형 배경에서의 여러 환경학적 위치에 걸친 작물학적 성능 및 제초제 내성이 포함되는 효능의 우수한 조합을 기초로 선별하였다. 하기의 실시예들은 대두 이벤트 DAS-68416-4를 특성화하는데 사용된 데이터를 함유한다.
실시예 2. 서던 블롯을 통한 대두 이벤트 DAS -68416-4 특성화
서던 블롯 분석을 사용하여 대두 이벤트 DAS-68418-4의 통합 패턴을 확립하였다. 이러한 실험들에서 대두 게놈 내의 aad-12 트랜스진의 통합 및 통합성을 실연하는 데이터가 생성되었다. 플라스미드 pDAB4468로부터의 aad-12 PTU의 단일 카피를 함유하는 전장 단일 통합 이벤트로서 대두 이벤트 DAS-68418-4가 특성화되었다.
서던 블롯 데이터는 pDAB4468 T-가닥 단편이 대두 이벤트 DAS-68418-4의 게놈 내로 삽입되었음을 시사하였다. pDAB4468의 T-가닥 통합 영역 내에 함유된, aad-12 유전자에 대해 특이적인 프로브, 및 플라스미드 내에 절단 부위가 위치하고, 플라스미드 또는 플라스미드와 대두 게놈 DNA의 접합부에 스패닝되는 단편 (경계 단편)에 대해 내부인 혼성화 단편을 생산하는 서술적인 제한 효소를 사용하여 상세한 서던 블롯 분석을 수행하였다. 제한 효소와 프로브의 조합에 대해 서던 혼성화로부터 지시되는 분자량은 이벤트에 대해 독특하였고, 이의 확인 패턴을 확립하였다. 이러한 분석들은 플라스미드 단편이 aad-12 PTU의 재배열 없이 대두 게놈 DNA 내로 삽입되었음을 또한 나타냈다.
실시예 2.1. 대두 잎 샘플 수집 및 게놈 DNA ( gDNA ) 단리
게놈 DNA를 대두 이벤트 DAS-68416-4를 함유하는 개별적인 대두 식물로부터 수확된 잎 조직으로부터 추출하였다. 또한, 통상적인 대두 식물인 매버릭으로부터 gDNA를 추출하였고, 이는 aad-12 유전자가 없는 물질 계통을 나타내는 유전학적 배경을 함유한다.
개별적인 게놈 DNA를 동결건조된 잎 조직으로부터 표준 CTAB 방법에 따라 추출하였다. 추출 후, DNA를 피코 그린(Pico Green) 시약 (인비트로젠(Invitrogen), 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 형광분광법으로 정량하였다. 그 후, DNA를 아가로스 젤 상에서 가시화하여, 피코 그린 분석으로부터의 값을 확인하고, DNA 품질을 결정하였다.
실시예 2.2. DNA 소화 및 분리
대두 이벤트 DAS-68416-4의 서던 블롯 분자적 특성화를 위해, 10 ㎍의 게놈 DNA를 소화시켰다. 대두 이벤트 DAS-68416-4 및 비-트랜스제닉 대두 계통 매버릭으로부터의 게놈 DNA를 DNA 1 ㎍ 당 약 5 유닛의 선택된 제한 효소 및 상응하는 반응 완충제를 각각의 DNA 샘플에 첨가함으로써 소화시켰다. 각각의 샘플을 약 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 제한 효소 SpeI, KpnI, 및 PacI를 개별적으로 소화에 사용하였다 (뉴 잉글랜드 바이오랩스(New England Biolabs), 매사추세츠주 입시치). 또한, 플라스미드 DNA인 pDAB4468을 비-트랜스제닉 대두 품종인 매버릭으로부터의 게놈 DNA와 조합함으로써 양성 혼성화 대조군 샘플을 제조하였다. 플라스미드 DNA/게놈 DNA 칵테일을 테스트 샘플과 동일한 절차 및 제한 효소를 사용하여 소화시켰다. 소화물을 하룻밤 동안 인큐베이션한 후, NaCl을 0.1 M의 최종 농도로 첨가하고, 소화된 DNA 샘플을 이소프로판올로 침전시켰다. 침전된 DNA 펠릿을 20 ㎕의 1× 로딩(loading) 완충제 (0.1％ 브로모페놀 블루, 100 mM EDTA, 50％ 글리세롤, 10 mM 트리스, pH 7.5)에 재현탁시켰다. 그 후, DNA 샘플 및 분자 크기 마커를 35 볼트에서 약 18-22시간 동안 0.85％ 아가로스 젤 + 0.4× TAE 완충제 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific), 펜실베이니아주 피츠버그)에서 전기영동하여, 단편을 분리시켰다. 젤을 에티듐 브로마이드 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)로 염색하고, 자외선 (UV) 하에 DNA를 가시화시켰다.
실시예 2.3. 서던 전달 및 막 처리
서던 블롯 분석을 문헌 [Severson et al. (1997)]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 전기영동 분리 및 자외선 하에서의 DNA 단편 가시화 후, 젤을 변성 용액 (150 mM NaOH, 3 mM EDTA)에 약 20분 동안 침지시킨 후, 20분 이상 동안 중화 용액 (150 mM NaPO4, pH 7.8)으로 옮겼다. 위킹(wicking) 시스템을 전달 완충제 (25 mM 피로인산나트륨, pH 10)와 함께 사용하여 나일론 막 (로슈 다이아그노스틱스(Roche Diagnostics), 인디애나주 인디애나폴리스)으로의 서던 전달을 하룻밤 동안 수행하였다. 전달 후, 막을 65℃에서 약 2시간 동안 소성시킴으로써 DNA가 막에 결합되었다. 이러한 공정으로 혼성화에 대해 준비된 서던 블롯 막이 초래되었다.
실시예 2.4. DNA 프로브 표지 및 혼성화
나일론 막에 결합된 DNA 단편을 표지된 프로브를 사용하여 검출하였다. 이러한 실험에 사용된 프로브는 플라스미드 pDAB4468의 특정 뉴클레오티드 영역에 대한 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해 생성되었다. 증폭된 PCR 단편을 아가로스 젤로부터 단리하고 정제하여, 혼성화 프로브에 대한 주형으로서 사용하였다. 서던 블롯 혼성화 프로브를 제조사의 설명서에 따라 GE 헬스케어 레디-투-고™ DNA 레이블링 비드(GE Healthcare READY-TO-GO™ DNA Labeling Beads) (GE 헬스케어, 뉴저지주 피츠카타웨이)를 사용하여 무작위 프라이밍(priming)에 의해 α32P-특이적 뉴클레오티드로 표지하고, 프로브퀀트(PROBEQUANT)™ G-50 마이크로칼럼 (아머샴/파마시아(Amersham/Pharmacia), 미국 뉴저지주 피츠카타웨이)에 의해 정제하였다. 이러한 실험에 사용된 프로브를 기술하는 표가 표 2에서 기술된다. 전-혼성화를 혼성화 완충제 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), 미주리주 세인트 루인스)를 사용하여 65℃에서 4시간 동안 수행하였다. 그 후, 전-혼성화 용액을 따라 내고, 물에서 5분 동안 비등시킴으로써 예비-변성된 원하는 양의 특이적 프로브를 함유하는 혼성화 용액으로 교체하였다. 혼성화/프로브 혼합물을 나일론 막과 함께 하룻밤 동안 65℃에서 인큐베이션하였다.
혼성화 후, 막을 65℃에서 세정 완충제 (10 mM 인산나트륨, 2.5 mM 피로인산나트륨, 0.5 mM EDTA, 0.1％ SDS, 인산으로 pH 7.8로 조정됨)에서 20분 동안 3회 세정하였다. 세정된 필터를 자가방사선술용 포스포이미저(Phosphorimager) 스크린에 노출시키고, 영상을 스캐닝하였다. 검출된 밴드의 개수 및 크기를 프로브에 대해 문서화하였다. 또한, 분자량 마커를 사용하여, 서던 블롯 상의 혼성화 단편 크기를 결정하였다.
Figure 112012049897969-pct00002
실시예 2.5 서던 블롯 결과
aad-12 PTU의 공지된 제한 효소 부위를 기초로 하는, 특정 소화물 및 프로브로의 예상 단편 크기 및 관찰된 단편 크기가 표 3에서 제공된다. 예상 단편 크기는 pDAB4468의 플라스미드 지도 (도 1)를 기초로 하고, 관찰된 단편 크기는 이러한 분석들로부터 개산되고, α32P-표지 DNA 분자량 마커 II 단편의 지시된 크기를 기초로 한다.
2가지 유형의 단편이 이러한 소화 및 혼성화로부터 확인되었다: 공지된 효소 부위들이 프로브 영역에 플랭킹되고, aad-12 PTU의 삽입 영역 내에 완전히 함유되는 경우의 내부 단편, 및 공지된 효소 부위가 프로브 영역의 한쪽 끝부분에 위치하고 제2 부위가 대두 게놈에서 예상되는 경우의 경계 단편. 경계 단편 크기는 이벤트에 따라 다른데, 이는 대부분의 경우에, DNA 단편 통합 부위들이 각각의 이벤트에 대해 독특하기 때문이다. 제한 효소 부위를 통합된 DNA에 관련하여 위치시키고 DNA 삽입 개수를 평가하기 위한 수단을 경계 단편이 제공한다. 이벤트 DAS-68416-4를 함유하는 대두의 3개의 세대에 대해 완료된 서던 블롯 분석에서, 플라스미드 pDAB4468로부터의 낮은 카피수의 무손상 aad-12 PTU가 대두 이벤트 DAS-68416-4의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 시사하는 데이터가 생성되었다.
Figure 112012049897969-pct00003
제한 효소 SpeI 및 KpnI은 플라스미드 pDAB4468 내에 독특한 제한 부위를 함유한다. 이에 따라, 이러한 효소들을 사용하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 내의 aad-12 유전자 삽입물을 특성화하였다. >5,436 bp 또는 >5,383 bp의 경계 단편이 각각 SpeI 및 KpnI 소화 후 aad-12 유전자 프로브와 혼성화할 것으로 예상되었다 (표 3). SpeI 및 KpnI이 사용되었을 때 각각 ~12,000 bp 및 ~16,000 bp의 단일 aad-12 혼성화 밴드가 관찰되었다. 이러한 크기의 밴드에 대한 프로브의 혼성화는 대두 이벤트 DAS-68416-4의 대두 게놈 내의 aad-12 유전자에 대한 단일 삽입 부위의 존재를 시사한다. aad-12 식물 전사 유닛 (PTU, 프로모터/유전자/종결인자)을 함유하는 2,904 bp의 단편을 방출시키도록 제한 효소 PacI이 선택되었다 (표 3). 예상된 2,904 bp 단편이 PacI 소화 후 aad-12 유전자 프로브로 관찰되었다. DAS-68416-4 샘플의 3개의 효소 모두로의 소화에 이어지는 aad-12 유전자 프로브 혼성화로 수득된 결과는 플라스미드 pDAB4468로부터의 무손상 aad-12 PTU의 단일 카피가 대두 이벤트 DAS-68416-4의 대두 게놈 내로 삽입되었음을 가리켰다.
실시예 2.6. 골격 서열의 부재
대두 이벤트 DAS-68416-4 내의 스펙티노마이신 저항성 유전자의 존재 또는 부재를 모니터링하기 위해, 다중 PCR 분석법을 수행하였다. 스펙티노마이신 저항성 유전자 코딩 서열의 5가지 상이한 영역 및 내부 대조군으로서의 내인성 대두 렉틴 유전자 (진뱅크(GenBank) ID 번호 K00821 M30884) 서열 내의 407 bp 영역의 검출을 위해 실험이 디자인되었다. 또한, 하기의 대조군이 포함되었다: (i) 형질전환되지 않은 대두 게놈 DNA에 스펙티노마이신 저항성 유전자를 보유하는 플라스미드 DNA가 첨가된 양성 대조군; (ii) 형질전환되지 않은 대두인 매버릭으로부터의 게놈 DNA를 사용하는 음성 대조군; 및 (iii) 게놈 DNA가 없는 블랭크(blank).
대두로부터의 게놈 DNA를 CTAB 방법을 사용하여 단리하고, 피코 그린을 사용하여 정량하였다. 각각의 샘플의 DNA 농도를 100 ng/㎕로 표준화시켰다. 스펙티노마이신 저항성 유전자 코딩 서열 및 렉틴 유전자 서열에 대해 특이적인 프라이머 서열들을 사용하여 PCR 반응을 수행하였다. 샘플 당 20 ㎕의 PCR 생성물을 2％ E-젤 상에 로딩함으로써 반응을 분석하였다.
E-젤 상의 다중 앰플리콘 (100 bp, 150 bp, 및 407 bp의 밴드)의 존재는 대두 이벤트 DAS-68416-4가 스펙티노마이신 저항성 유전자 코딩 서열을 함유하였음을 가리킬 것이다 (100 bp 및 150 bp의 증폭된 밴드가 스펙티노마이신 저항성 유전자 코딩 서열에 대해 예상된다). 내부 대조군인 렉틴 유전자 서열에 상응하는 407 bp 앰플리콘만 존재하면, 이는 대두 이벤트 DAS-68416-4가 스펙티노마이신 저항성 코딩 서열을 함유하지 않는 것을 가리킨다.
대두 이벤트 DAS-68416-4로부터의 DNA 샘플에서 100 bp 또는 150 bp의 단편이 증폭되지 않았다. 407 bp 단편만 증폭되었다. 그러나, 스펙티노마이신 저항성 유전자를 보유하는 플라스미드 DNA가 대두 게놈 DNA에 첨가된 양성 대조군에는 100 bp, 150 bp, 및 407 bp 증폭 단편이 존재하였다. 형질전환되지 않은 대두로부터의 DNA를 함유하는 음성 대조군에서는 단일 407 bp 단편이 증폭되었다. 마지막으로, 어떠한 게놈도 함유하지 않은 반응에서는 어떠한 증폭 단편도 생산되지 않았다. 따라서, 스펙티노마이신 저항성 코딩 서열이 대두 이벤트 DAS-68416-4에서 검출되지 않았다.
실시예 3. 대두 이벤트 DAS -68416-4의 삽입물 및 플랭킹 경계 영역 내의 DNA 서열의 클로닝 및 특성화
게놈 삽입 부위를 특성화하고 기술하기 위해, 대두 이벤트 DAS-68416-4의 T-가닥 DNA 삽입물 및 플랭킹 게놈 DNA 경계 영역의 서열을 결정하였다. 전체적으로, 2,730 bp의 5' 플랭킹 경계 서열, 1,091 bp의 3' 플랭킹 경계 서열, 및 6,391 bp의 T-가닥 삽입물을 포함하는 10,212 bp의 대두 이벤트 DAS-68416-4 게놈 서열이 확인되었다 (서열 1). 대두 이벤트 DAS-68416-4가 예상된 T-가닥 삽입물로부터의 서열 변이 없이 MAR 요소, aad-12 발현 카세트, 및 pat 발현 카세트를 함유하는 무손상 트랜스진의 단일 카피를 함유한다는 것이 서열 분석에서 증명되었다.
대두 이벤트 DAS-68416-4 삽입물 및 경계 서열을 기초로 하는 PCR 증폭에서, 경계 영역이 대두를 기원으로 한다는 것과 접합부 영역이 대두 이벤트 DAS-68416-4의 이벤트-특이적 확인에 사용될 수 있다는 것이 증명되었다. 플랭킹 경계 서열을 포함하는 접합부 영역에 스패닝된 서열의 분석에서 T-가닥 삽입으로부터 초래되는 어떠한 신규 오픈 리딩 프레임 (ORF >= 150 코돈)도 확인되지 않았다. 또한, 비-트랜스제닉 대두의 게놈으로부터의 확인된 플랭킹 경계 서열의 영역에 상응하는 게놈 단편의 클로닝에 의해 T-가닥 삽입 부위를 특성화하였다. 대두 이벤트 DAS-68416-4와 야생형 게놈 서열의 비교는 원래의 유전자좌로부터의 55 bp 결실 및 이벤트의 3' 통합 접합부에서의 9 bp 삽입을 드러냈다. 전체적으로, 대두 이벤트 DAS-68416-4의 삽입물 및 경계 서열의 특성화는 T 가닥의 무손상 단일 카피가 대두 게놈 내에 존재하였음을 가리켰다.
실시예 3.1. 게놈 DNA 추출 및 정량
게놈 DNA를 동결건조된 잎 조직 또는 신선하게 분쇄된 잎 조직으로부터 변형된 CTAB 방법을 사용하여 추출하였다. 게놈 DNA 추출 후, DNA 샘플을 1× TE (10 mM 트리스 pH 8.0, 1 mM EDTA) (플루카(Fluka), 시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루이스)에 용해시키고, 피코 그린 방법을 사용하여 제조사의 설명서 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes), 오리건주 유진)에 따라 정량하였다. PCR 분석을 위해, DNA 샘플을 10-100 ng/㎕의 농도로 분자 생물학 등급의 물 (5 프라임(5 PRIME), 메릴랜드주 게이더스버그)로 희석하였다.
실시예 3.2. PCR 프라이머
표 4는 대두 이벤트 DAS-68416-4의 DNA 삽입물 및 플랭킹 경계 영역을 클로닝 및 확인하기 위해 사용된 프라이머 서열들을 열거하고, 이때 위치 및 설명이 도 2에서 표시된다. 모든 프라이머는 인테그레이티드 DNA 테크놀러지즈 인코포레이티드(Integrated DNA Technologies, Inc.) (아이오와주 코랄빌)에 의해 합성되었다. 프라이머를 물 (5 프라임, 메릴랜드주 게이더스버그)에서 원액용으로 100 μM의 농도로 희석하였고, 작업 용액용으로 10 μM의 농도로 물로 희석하였다.
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실시예 3.3. 게놈 워킹
게놈워커™ 유니버설 키트(GENOMEWALKER™ Universal Kit) (클론텍 래버러토리즈 인코포레이티드(Clontech Laboratories, Inc.), 캘리포니아주 마운틴 뷰)를 사용하여 제조사의 설명서에 따라 대두 이벤트 DAS-68416-4에 대한 pDAB4468 T-가닥 삽입물의 5' 및 3' 플랭킹 경계 영역을 클로닝하였다. 약 2 ㎍의 대두 이벤트 DAS-68416-4로부터의 게놈 DNA를 하룻밤 동안 EcoRV 및 PvuII로 소화시켰다 (도 2). DNA 소화물을 DNA 클린 & 콘센트레이터(DNA CLEAN & CONCENTRATOR)™-25 (자이모 리서치(ZYMO Research), 캘리포니아주 오렌지)를 사용하여 정제한 후, 게놈워커™ 어댑터에 결찰시켜, 게놈워커™ 라이브러리를 구축하였다. 각각의 게놈워커™ 라이브러리를 어댑터 프라이머 AP1 (키트에서 제공됨) 및 구축물-특이적 프라이머 ES_LEnd03 또는 ES_PATEnd03으로의 1차 PCR 증폭을 위한 DNA 주형으로서 사용하였다 (표 4). 그 후, 1 ㎕의 1차 PCR 반응의 1:25 희석물을 키트에서 제공된 네스티드(nested) 어댑터 프라이머 AP2 및 네스티드 구축물-특이적 프라이머 ES_LEnd04 또는 ES_PATEnd04로의 2차 PCR 증폭을 위한 주형으로서 사용하였다 (표 4, 7, 및 도 2).
실시예 3.4. 통상적인 PCR
표준 PCR을 사용하여 대두 이벤트 DAS-68416-4의 삽입물 및 경계 서열을 클로닝 및 확인하였다. 다카라(TaKaRa) LA TAQ™ (다카라 바이오 인코포레이티드(Takara Bio Inc), 일본 시가), 핫스타택™ DNA 폴리머레이스(HOTSTARTAQ™ DNA Polymerase) (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아), 하이 피델리티™ PCR 키트(HIGH FIDELITY™ PCR Kit) (로슈 다이아그노스틱스 인코포레이티드), 또는 이지-A™ 하이 피델리티 폴리머레이스 키트(EASY-A™ High Fidelity Polymerase Kit) (스트라타진, 캘리포니아주 라욜라)를 제조사의 권장 절차에 따라 통상적인 PCR 증폭에 사용하였다. 구체적인 PCR 조건 및 앰플리콘 설명이 표 5, 6, 및 7에서 열거된다.
실시예 3.5. PCR 생성물 검출, 정제, PCR 생성물의 서브클로닝 , 및 시퀀싱
PCR 생성물을 제품 설명서에 따라 1.2％ 또는 2％ E-GEL® (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 전기영동에 의해 검사하였다. DNA 마커와의 비교에 의해 단편 크기를 추정하였다. 필요하면, 퀴아퀵 젤 익스트랙션 키트(QIAquick Gel Extraction Kit) (퀴아젠, 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 에티듐 브로마이드로 염색된 1× TBE (89 mM 트리스-보레이트, 2 mM EDTA, pH 8.3) 내의 1％ 아가로스 젤로부터 단편을 절제함으로써 PCR 단편을 정제하였다.
PCR 단편을 제품 설명서에 따라 시퀀싱용 TOPO TA 클로닝® 키트(TOPO TA CLONING® KIT for Sequencing) (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 PCR®4-TOPO® 벡터 내로 서브클로닝하였다. 구체적으로, 2 내지 5 ㎕의 TOPO® 클로닝 반응물을 제조사의 설명서에 따라 화학적으로 수용성인 원 샷(One Shot) TOP10 세포 내로 형질전환시켰다. 클로닝된 단편을 플라스미드 DNA의 미니프렙(minipreparation) (퀴아프렙 스핀 미니프렙 키트(QIAprep Spin Miniprep Kit), 퀴아젠 (캘리포니아주))에 이어지는 EcoRI으로의 제한 소화 또는 T3 및 T7 프라이머를 사용하는 직접적인 콜로니 PCR에 의해 확인하였다. 그 후, 선택된 콜로니의 글리세롤 스톡 또는 플라스미드 DNA의 시퀀싱을 외부에 의뢰하였다.
서브-클로닝 후, 추정 표적 PCR 생성물을 먼저 시퀀싱하여, 예상 DNA 단편이 클로닝되었음을 확인하였다. 예상 DNA 단편을 함유하는 콜로니를 선별하여, 프라이머 워킹에 의한 이중-가닥 전장 시퀀싱을 완료하였다. 모든 시퀀싱은 코제닉스(Cogenics) (텍사스주 휴스턴)에 의해 수행되었다.
시퀀처(SEQUENCHER)® 소프트웨어 (진 코드 코포레이션(Gene Codes Corporation), 미시간주 앤 아버)를 사용하여 삽입물 및 경계 서열의 최종 어셈블리를 완료하였다. 대두 이벤트 DAS-68416-4의 삽입물 및 이의 플랭킹 경계 서열의 주해를 벡터(Vector) NTI (버전 10 및 11, 인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 수행하였다.
상동성 검색을 진뱅크의 비-중복(non-redundant) 뉴클레오티드 데이터베이스에 대해 BLAST 프로그램을 사용하여 수행하였다. 벡터 NTI (버전 11, 인비트로젠)를 사용한 오픈 리딩 프레임 (ORF) 분석을 수행하여, 대두 이벤트 DAS-68416-4의 전체 삽입물 및 플랭킹 경계 서열 및 야생형 매버릭 대두 계통의 원래의 유전자좌에서 ORF (>= 150 코돈)를 확인하였다.
실시예 3.6. 5' 끝부분 경계 서열
트랜스진의 5' 끝부분에 대한 특이적 네스티드 프라이머 세트를 사용하여 각각의 대두 이벤트 DAS-68416-4 게놈워커™ 라이브러리로부터 DNA 단편을 증폭시켰다. EcoRV 게놈워커™ 라이브러리로부터의 ~1.8 kb 단편 및 PvuII 게놈워커™ 라이브러리로부터의 ~3 kb 단편이 관찰되었다. 이러한 단편들을 PCR®4-TOPO® 벡터 내로 클로닝하였다. 각각의 라이브러리에 대해 5개의 콜로니를 끝부분 시퀀싱을 위해 무작위로 채집하여, 뉴클레오티드 서열 데이터를 생성시켰다. 양쪽 PCR 프라이머의 서열을 함유하는 콜로니를 선별하여, 프라이머 워킹에 의해 전체 서열을 수득하였다. 서열 분석은 대두 이벤트 DAS-68416-4 EcoRV 게놈워커™ 라이브러리로부터 증폭된 클론이 1,744 bp DNA 단편을 함유하였고, 대두 이벤트 DAS-68416-4 PvuII 게놈워커™ 라이브러리로부터 증폭된 클론이 3,047 bp DNA 단편을 함유하였음을 드러냈다. 서열 분석은 EcoRV 게놈워커™ 라이브러리로부터 수득된 DNA 단편이 프라이머 ES_LEnd04와 EcoRV 부위 사이의 영역에서 PvuII 게놈워커™ 라이브러리 클론으로부터 수득된 DNA 단편과 중첩되었음을 드러냈다. 이러한 DNA 단편들은 모두 트랜스진 내의 T-가닥 경계 B의 5' 끝부분 접합부를 함유하였고, 이는 이들이 대두 이벤트 DAS-68416-4 내의 5' 끝부분 트랜스진 삽입물 및 이의 플랭킹 경계의 동일한 영역으로부터 증폭되었음을 가리킨다. 생성된 2,730 bp 대두 게놈 서열은 진뱅크 내의 서열들과의 유의한 상동성이 없는 것으로 확인되었다.
실시예 3.7. 3' 끝부분 경계 서열
트랜스진의 3' 끝부분에 대한 특이적 네스티드 프라이머 세트를 사용하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 EcoRV 게놈워커™ 라이브러리로부터 약 1.3 kb 크기의 DNA 단편이 증폭되었다. 그 후, 이러한 DNA 단편을 PCR®4-TOPO® 벡터 내로 클로닝하였다. 끝부분 시퀀싱을 위해 5개의 콜로니를 무작위로 채집하였다. 5개의 클론 모두 프라이머 AP2 및 프라이머 ES_PATEnd04 양쪽 모두의 서열을 함유하였다. 이러한 클론들의 완전한 시퀀싱으로 1,359 bp 컨센서스(consensus) DNA 단편이 초래되었다. 서열 분석은 1,359 bp 단편이 T-가닥 경계 A의 3' 끝부분 영역으로부터의 268 bp 단편 및 대두 게놈 DNA로부터의 1,091 bp 단편으로 구성되었음을 나타냈다. BLAST 검색에서 이러한 1,091 bp 대두 DNA 서열과 진뱅크 내의 서열들 간에 어떠한 유의한 상동성도 확인되지 않았다.
실시예 3.8. DNA 삽입물 및 접합부 서열
DNA 삽입물 및 플랭킹 경계 영역을 앞서 기술된 바와 같은 PCR 기반 방법을 사용하여 대두 이벤트 DAS-68416-4로부터 클로닝하였다. 5' 및 3' 플랭킹 경계 서열 및 예상 트랜스진 서열을 사용하여 표 6에 열거된 PCR 프라이머를 디자인하였다. 전체적으로, 4개의 중첩 DNA 단편 (978 bp의 앰플리콘 1, 2,414 bp의 앰플리콘 2, 1,834 bp의 앰플리콘 3, 및 1,705 bp의 앰플리콘 4)이 클로닝 및 시퀀싱되었다 (도 3). 전체 삽입물 및 플랭킹 경계 서열을 이러한 4개의 단편 사이에서 중첩 서열을 기초로 어셈블리하였다. 어셈블리된 최종 서열의 분석에서 pDAB4468의 트랜스진으로부터 유래된 6,391 bp 단편의 존재가 확인되었고, 플라스미드 pDAB4468로부터의 예상 서열과 비교했을 때 삽입된 DNA 서열의 염기 변화가 없었다.
실시예 3.9. 대두 게놈 서열의 확인
대두 게놈 내의 대두 이벤트 DAS-68416-4 트랜스진의 삽입 부위를 확인하기 위해, 상이한 프라이머 쌍을 사용하여 PCR을 수행하였다 (도 4 및 표 5). 대두 이벤트 DAS-68416-4 및 기타 트랜스제닉 또는 비-트랜스제닉 대두 계통으로부터의 게놈 DNA가 주형으로서 사용되었다. 따라서, 수득된 5' 끝부분 경계 서열이 정확한지를 확인하기 위해, 2개의 aad-12 특이적 프라이머, 예를 들어 AIILEnd05 및 AIILEnd06, 및 16LEndG01 및 16LEndG02로 명명된, 5' 끝부분 경계 서열에 따라 디자인된 2개의 프라이머를 aad-12 유전자 내지 5' 끝부분 경계 서열에 스패닝되는 DNA 절편을 증폭시키는데 사용하였다. 유사하게, 클로닝된 3' 끝부분 경계 서열의 확인을 위해, pat 특이적 프라이머, 예를 들어 PAT-End06, 및 16PATG01 및 16PATG02로 명명된, 3' 끝부분 경계 서열에 따라 디자인된 2개의 프라이머를 pat 유전자 내지 3' 끝부분 경계 서열에 스패닝되는 DNA 절편을 증폭시키는데 사용하였다. 예상 크기의 DNA 단편이 대두 이벤트 DAS-68416-4의 플랭킹 경계 상에 위치하는 1개의 프라이머 및 1개의 트랜스진 특이적 프라이머의 프라이머 쌍 각각으로 대두 이벤트 DAS-68416-4의 게놈 DNA로부터만 증폭되었고, 기타 트랜스제닉 대두 계통 또는 비-트랜스제닉 대조군으로부터의 디 샘플로부터는 증폭되지 않았다. 이러한 결과는 클로닝된 5' 및 3' 경계 서열이 대두 이벤트 DAS-68416-4 내의 T-가닥 삽입물의 플랭킹 경계 서열이라는 것을 가리킨다.
대두 게놈 내의 DNA 삽입을 추가로 확인하기 위해, 2개의 대두 서열에 스패닝되는 PCR 증폭을 완료하였다. 5' 끝부분 경계 서열에 따라 디자인된 2개의 프라이머인 16LEndG03 및 16LEndG04, 및 3' 끝부분 경계 서열에 대한 2개의 프라이머인 16PATG03 및 16PATG04를 사용하여 전체 트랜스진, 5' 끝부분 경계 서열, 및 3' 경계 서열을 함유하는 DNA 절편을 증폭시켰다. 예상대로, 16LEndG03 및 16PATG03의 프라이머 쌍으로의 PCR 증폭에서 대두 이벤트 DAS-68416-4의 게놈 DNA로부터의 약 9 kb DNA 단편 및 비-트랜스제닉 대두 대조군 및 기타 대두 트랜스제닉 계통으로부터의 2.7 kb DNA 단편이 증폭되었다. 유사하게, 16LEndG04 및 16PATG04의 프라이머 쌍으로 완료된 PCR 반응에서 대두 이벤트 DAS-68416-4의 샘플로부터의 약 9 kb DNA 단편 및 모든 다른 대두 대조군 계통으로부터의 2.8 kb DNA 단편이 상응하여 생산되었다. 양쪽 프라이머 쌍이 PCR에 사용되었을 때 대두 이벤트 DAS-68416-4를 제외한 모든 대두 샘플에서 약 6 kb 크기의 희미한 밴드가 가시적이었음이 주목되었고, 이는 이러한 희미한 밴드가 이러한 프라이머 쌍으로의 대두 게놈에서의 비-특이적 증폭으로부터 초래되었음을 시사한다.
실시예 3.10. 대두 게놈 서열의 확인
비-트랜스제닉 대두 계통 매버릭으로부터 16LEndG03 및 16PATG03의 프라이머 쌍 또는 16LEndG04 및 16PATG04의 프라이머 쌍을 사용하여 증폭된 2.7 kb 및 2.8 kb DNA 단편을 클로닝 및 시퀀싱하였다. 이들의 서열을 서로 매칭시켰고, 대두 이벤트 DAS-68416-4로부터의 클로닝된 5' 및 3' 경계 서열과 정렬하였다. 이는 클로닝된 DNA 서열이 pDAB4468의 T-가닥이 대두 이벤트 DAS-68416-4 내로 통합된 유전자좌를 함유하였음을 나타냈다. 정렬 분석은 원래의 유전자좌로부터의 55 bp 결실 및 3' 통합 접합부에서의 9 bp 삽입을 또한 드러냈다 (도 5). 클로닝된 원래의 유전자좌의 대두 게놈 영역에서 오픈 리딩 프레임 (>/=450 bp, 150 aa)이 확인되지 않았다.
실시예 4. 대두 이벤트 DAS -68416-4의 플랭킹 SNP 마커를 통한 게놈 특성화
게놈 삽입 부위를 특성화하고 기술하기 위해, 삽입물에 근접하여 위치하는 마커 서열을 결정하였다. 다형성 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP) 마커들의 패널을 사용하여 트랜스진 위치를 확인하고 이의 지도를 작성하였다. 대두 이벤트 DAS-68416-42는 염색체 4 상의 119.6 cM에 위치한다. 이러한 위치는 2개의 플랭킹 SNP 마커인 BARC-044607-08736와 BARC-019093-03299 사이이다. 더욱 구체적으로, 트랜스진의 위치가 SNP 마커 BARC-019093-03299로부터 1.3 cM (480 kb) 떨어진 곳에 있었다.
실시예 4.1. 플랭킹 경계 영역 서열의 BLAST
대두 이벤트 DAS-68416-4 (서열 1)에 대한 플랭킹 경계 영역 서열을 대두 전체 게놈 서열의 BLAST에 사용하였다. BLAST 결과는 대두 이벤트 DAS-68416-4의 양쪽 경계 서열이 연관 군 C1인 염색체 4 (Gm04) 상에 위치하였음을 나타냈다.
실시예 4.2. SNP 지도작성 및 BLAST 결과
경계 서열의 BLAST 및 지도작성 결과를 기초로, 이벤트가 염색체 4에 할당되었다. 따라서, 10개의 SNP 마커를 대두 유전자 연관 지도로부터 선택하였다. 크레건(Cregan) 박사, 벨츠빌 농업 연구 센터(Beltsville Agricultural Research Center), 및 USDA에 의해 개발된 SNP 마커들로부터 SNP 서열을 선택하였다. 이러한 SNP 마커들은 염색체 4에 상응하는 연관 군 C1과 관련된다. SNP 서열들을 대두 전체 게놈 서열의 BLAST에 사용하여, 대두 이벤트 DAS-68416-4에 대한 T-가닥 삽입물의 물리적 위치를 결정하였다.
실시예 4.3. SNP 마커 결과
대두 이벤트 DAS-68416-4가 염색체 4 상의 119.6 cM에 위치한다. 2개의 플랭킹 SNP 마커는 BARC-044607-08736 및 BARC-019093-03299이다. 이러한 트랜스진은, SNP 마커 BARC-044607-08736과 BARC-019093-03299 사이의 약 119.6 cM에서, SNP 마커 BARC-019093-03299로부터 1.3 cM (480 kb) 떨어져 있다.
실시예 5. 대두 이벤트 DAS -68416-4 내의 AAD -12 단백질의 특성화
트랜스제닉 대두 이벤트 DAS-68416-4로부터 유래된 재조합 AAD-12 단백질의 생화학적 특성을 특성화하였다. 정량적 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA), 소듐 도데실 술페이트 폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (SDS-PAGE, 쿠마시 블루(Coomassie blue) 및 당단백질 검출 방법으로 염색됨), 및 웨스턴(Western) 블롯 방법을 사용하여 단백질의 생화학적 성질을 특성화하고 AAD-12 단백질의 발현을 확인하였다.
실시예 5.1. 식물 조직에서의 AAD -12 단백질의 발현
대두 이벤트 DAS-68416-4에서 AAD-12 단백질의 수준을 결정하였다. 추출가능한 가용성 AAD-12 단백질을 대두 잎에서 정량적 효소 결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 방법을 사용하여 측정하였다.
대두 조직 샘플을 테스트 식물로부터 단리하고, 발현 분석에 대해 준비시켰다. AAD-12 단백질을 0.5％ 소 혈청 알부민 (BSA)을 함유하는, 세제 트윈(Tween)-20을 함유하는 포스페이트 완충 염수 용액 (PBST)으로 대두 식물 조직으로부터 추출하였다. 식물 조직을 원심분리하고, 수성 상등액을 수집하고, 필요하다면 적합한 완충제로 희석하고, 샌드위치 양식으로 AAD-12 ELISA 키트를 사용하여 분석하였다. 제조사가 제안한 프로토콜에 따라 키트를 사용하였다.
검출 분석을 수행하여 대두 이벤트 DAS-68416-4에서 발현 안정성 및 유전성을 수직적 (세대간) 및 수평적 (계통간) 양쪽 모두로 조사하였다. T5 세대에서 대두 이벤트 DAS-68416-4 발현이 안정적이었고 (분리되지 않음), 모든 계통에 걸쳐 일관적이었다 (도 6).
다양한 식물 단계에서의 필드 발현 수준 연구를 프리(pre) V3, 포스트(post) V3, 프리 R2, 및 포스트 R2에 대두 이벤트 DAS-68416-4 상에서 수행하였다. 모든 분무 처리에 대해, 뿐만 아니라 2,4-D 제초제가 분무된 플롯 및 분무되지 않은 플롯에 대해 발현 수준이 유사하였다. 2× 분무율 (2,240 gm ae/ha의 2,4-D)를 적용하였고, 어떠한 연구 시점에서도 식물에 대한 손상이 관찰되지 않았다. 프리 V3 식물 단계의 모든 계통에 걸친 평균 발현은 300 ㎍/㎠이었다. 2,4-D를 분무한 후, 계통들에 걸쳐 발현이 평균 400 ㎍/㎠으로 안정적으로 유지되었다. 대두가 프리 R2에 도달할 때까지, 평균 발현이 평균 200 ㎍/㎠으로 약간 감소하였다. 2,4-D를 분무한 후, 포스트 R2 발현이 400 ㎍/㎠의 이전 평균으로 되돌아왔다. 도 6 참조.
실시예 5.2. 식물 조직에서의 AAD -12 단백질의 발현
추가적인 필드 발현 연구를 2008년 동안 미국 및 캐나다 내의 6곳의 장소에서 수행하였다. 대두 이벤트 DAS-68416-4의 4가지 처리 (미분무, 2,4-D 분무, 글루포시네이트 분무, 또는 2,4-D 및 글루포시네이트 분무)를 테스트하였다. 샘플로 취해진 식물 조직에는 잎, 알곡, 뿌리, 및 사초가 포함되었다. 잎 조직은 V5 및 V10 단계에 수집하였고, 뿌리 및 사초는 R3 발달 단계에 수집하였다. 알곡은 R8 발달 단계에 수집하였다 (문헌 [Gaska, 2006]). 추출가능한 가용성 AAD-12 단백질을 실시예 5.1에 앞서 기술된 바와 같이 인가된 효소-결합 면역흡착 분석법 (ELISA) 방법을 사용하여 측정하였다. 모든 조직 유형에 대한 AAD-12 단백질 수준은 ng/mg 건량을 기준으로 계산되었다.
다양한 대두 매트릭스 내의 AAD-12 단백질 농도 (부위에 걸쳐 평균화됨)의 요약이 표 8에서 제시된다. 평균 발현 값은 R3 단계에서의 15.5 ng/mg 건량 내지 V5 단계 잎 조직에서의 66.1 ng/mg 범위였다. 모든 분무 처리에 대해, 뿐만 아니라 2,4-D 및 글루포시네이트 제초제가 분무된 플롯 및 분무되지 않은 플롯에 대해 발현 수준이 유사하였다. 6곳의 장소에 걸쳐 대조군 조직에서는 AAD-12 단백질이 검출되지 않았다.
Figure 112012049897969-pct00008
실시예 5.3. AAD -12 단백질의 SDS PAGE 및 웨스턴 블롯 분석
AAD-12 단백질을 대두 이벤트 DAS-68416-4의 동결건조된 잎 조직으로부터 안정화제가 첨가된 PBST (포스페이트 완충 염수 + 0.05％ 트윈 20, pH 7.4)를 기초로 하는 완충제에서 추출하고, 가용성 단백질을 원심분리에 의해 수집하였다. 상등액을 여과하고, 가용성 단백질을 페닐 세파로스(Phenyl Sepharose) (PS) 비드 (GE 헬스케어, 뉴저지주 피츠카타웨이)에 결합시켰다. 1시간 인큐베이션 후, PS 비드를 PBST로 세정하고, 결합된 단백질을 밀리-큐(Milli-Q) 물로 용출시켰다. 염화나트륨을 첨가하여 전도성을 증가시켰고, PS로 정제된 단백질을 AAD-12 특이적 폴리클로날 항체가 접합된 항-AAD-12 면역친화성 칼럼 상에 로딩하였다. 결합되지 않은 단백질을 칼럼으로부터 수집하였고, 칼럼을 미리 냉각된 PBS (포스페이트 완충 염수, pH 7.4)로 광범위하게 세정하였다. 결합된 단백질을 3.5 M NaSCN, 50 mM 트리스, pH 8.0 완충제로 칼럼으로부터 용출시키고, SDS-PAGE 및 웨스턴 블롯팅에 의해 시험하였다. 동일한 프로토콜을 사용하여 대조군 대두 계통 매버릭의 잎 조직으로부터 단백질을 단리하였다. 매버릭은 aad -12 유전자를 함유하지 않지만, 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물을 나타내는 유전학적 배경을 지닌다.
대두 이벤트 DAS-68416-4 및 매버릭으로부터의 동결건조된 잎 조직을 ~2.0％ 프로티에이스(protease) 억제제 칵테일 (시그마(Sigma), 미주리주 세인트 루인스)을 함유하는 PBST 완충제와 혼합하고, 제노-그라인더(Geno-Grinder)에서 볼 베어링으로 분쇄함으로써 단백질을 추출하였다. 샘플을 원심분리하고, 상등액을 램리(Laemmli) 샘플 완충제와 혼합하고, 가열하고, 간략하게 원심분리하였다. 샘플을 바이오-래드 크리테리온(Bio-Rad Criterion) SDS-PAGE 젤 상에 직접 로딩하였다. 양성 기준 표준물인 미생물-유래 AAD-12 단백질을 또한 샘플 완충제와 혼합하고, 젤 상에 로딩하였다. 트리스/글리신/SDS 완충제 (바이오-래드(Bio-Rad), 캘리포니아주 에르쿨레스)로 전기영동을 수행하였다. 전기영동 후, 젤을 반으로 자르고, 한쪽 절반은 피어스 젤코드 블루(Pierce GelCode Blue) 단백질 염색으로 염색하고, 다른 쪽 절반의 젤은 니트로셀룰로스 막 상에 전기-블롯팅하였다. 그 후, 니트로셀룰로스 막을 AAD-12 특이적 모노클로날 토끼 항체로 프로빙하였다. 화학발광 기질을 사용하여 면역반응성 밴드를 가시화시켰다. 미생물-유래 AAD-12에서, 쿠마시로 염색된 SDS-PAGE 젤 상에서 가시화되었을 때의 주요 단백질 밴드는 약 32 kDa이었다. 예상된 바와 같이, 상응하는 식물-유래 AAD-12 단백질이 미생물-유래 단백질과 크기가 동일하였다. 예상대로, 식물 정제 분획은 AAD-12 단백질에 더하여 미량의 비-면역반응성 불순물을 함유하였다. 공동-정제된 단백질은 칼럼 매트릭스와의 약한 상호작용에 의해 칼럼 상에서 유지되었을 것이다 (문헌 [Williams, et. al., 2006], [Kennedy and Barnes, 1983[ 및 [Holroyde et al., 1976]).
미생물-유래 AAD-12 및 DAS-68416-4 식물 조직 추출물이 항-AAD-12 폴리클로날 항체를 사용하는 웨스턴 블롯 상에서 예상 크기의 양성 신호를 나타냈다. AAD-12 웨스턴 블롯 분석에서, 대조군 매버릭 추출물에서 면역응답성 단백질이 관찰되지 않았고, 트랜스제닉 식물로부터의 샘플에서 별법적인 크기의 단백질 (응집물 또는 분해 생성물)이 나타나지 않았다. 모노클로날 항체로 미생물-유래 단백질에서 소량의 AAD-12 이량체가 검출되었다. 이러한 결과들은 AAD-12 단백질이 대두에서 발현된다는 증거를 추가한다.
실시예 6. 서던 블롯을 통한 대두 이벤트 DAS -68416-4의 메틸화 검출 분석
도입된 트랜스진에 식물 게놈 내로의 통합 후 침묵화가 진행될 수 있다. 트랜스진 발현이 전사 수준 및/또는 번역후 수준에서 억제될 수 있다. 전사 유전자 침묵화가 트랜스진, 이의 프로모터 및 기타 관련 서열의 메틸화와 관련되는 것으로 보고되었다 (문헌 [Stem et al., 1997]). 특정 서열에서의 메틸화를 검출하기 위해, 한 방법은 메틸화-민감성 제한 효소를 사용하여 DNA를 소화시킨 후, DNA 생성물을 서던 블롯으로 분석한다. 특이적 제한 효소 부위가 메틸화된 경우, 효소는 DNA를 절단하지 않을 것이다. 제한 부위의 메틸화는 서던 블롯 상에서 검출가능한 더 높은 분자량의 DNA 단편을 초래한다. 서던-블롯을 기초로 하는 메틸화 분석을 수행하여 대두 이벤트 DAS-68416-4에 대한 T-가닥 삽입물의 메틸화 상태를 결정하였다. aad-12 유전자 및 이의 프로모터에 대해 특이적인 프로브 및 2개의 메틸화-민감성 제한 효소를 사용하여 이러한 분석법을 수행하였다. aad-12 발현 카세트의 메틸화가 검출되지 않았다.
6.1. 대두 잎 샘플 수집 및 및 게놈 DNA ( gDNA ) 단리
게놈 DNA를 대두 이벤트 DAS-68416-4의 개별적인 식물 및 비-트랜스제닉 대두 계통 매버릭의 잎으로부터 제조하였다. 게놈 DNA를 동결건조된 잎 샘플로부터 전통적인 CTAB 방법을 사용하여 추출하였다. 추출 후, DNA를 피코 그린 시약 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)을 사용하여 정량하였다.
6.2. DNA 소화 및 분리
DNA의 분자적 특성화를 위해, 대두 이벤트 DAS-68416-4 및 비-트랜스제닉 대두 계통 매버릭으로부터의 게놈 DNA 10 ㎍을 DNA 1 ㎍ 당 약 5 유닛의 선택된 제한 효소 및 상응하는 반응 완충제를 각각의 DNA 샘플에 첨가함으로써 소화시켰다. 각각의 샘플을 약 37℃에서 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 제한 효소 AciI 및 Hyp188III을 소화에 사용하였다 (뉴 잉글랜드 바이오랩스, 매사추세츠주 입시치). 음성 대조군 역할을 하도록 비-트랜스제닉 대두 매버릭으로부터의 DNA를 테스트 샘플과 동일한 절차 및 제한 효소를 사용하여 소화시켰다. NaCl을 0.1 M의 최종 농도로 첨가한 후 소화된 DNA 샘플을 이소프로판올로 침전시키고, 20 ㎕의 1× 로딩 완충제 (0.1％ 브로모페놀블루, 100 mM EDTA, 50％ 글리세롤, 10 mM 트리스, pH 7.5)에 재현탁시켰다. 그 후, DNA 샘플 및 분자 크기 마커를 35 볼트에서 약 18-22시간 동안 0.85％ 아가로스 젤 + 0.4× TAE 완충제 (피셔 사이언티픽, 펜실베이니아주 피츠버그)에서 전기영동하여, 단편을 분리시켰다. 젤을 에티듐 브로마이드 (인비트로젠, 캘리포니아주 칼스배드)로 염색하고, 자외선 (UV) 하에 DNA를 가시화시켰다.
6.3. 서던 전달 및 막 처리
서던 블롯 분석을 문헌 [Severson et al., (1997)]에 기술된 바와 같이 수행하였다. 간략하게, 전기영동 분리 및 자외선 하에서의 DNA 단편 가시화 후, 젤을 변성 용액 (150 mM NaOH, 3 mM EDTA)에 약 20분 동안 노출시킨 후, 20분 이상 동안 중화 용액 (150 mM NaPO4, pH 7.8)에 노출시켰다. 위킹 시스템을 전달 완충제 (25 mM 피로인산나트륨, pH 10)와 함께 사용하여 나일론 막 (로슈 다이아그노스틱스, 인디애나주 인디애나폴리스)으로 서던 전달을 하룻밤 동안 수행하였다. 전달 후, 막을 65℃에서 약 2시간 동안 소성시켰다. 이러한 공정으로 혼성화에 대해 준비된 서던 블롯 막이 초래되었다.
6.4. DNA 프로브 표지 및 혼성화
나일론 막에 결합된 DNA 단편을 표지된 프로브를 사용하여 검출하였다. 프로브는 플라스미드 pDAB4468로부터 특이적 프라이머로 증폭된 PCR 단편으로서 생성되었다. 이러한 증폭된 PCR 단편을 아가로스 젤로부터 절제하고 정제하였다. 정제된 DNA 단편을 혼성화 프로브 제조용 주형으로서 사용하였다. 혼성화 프로브를 제조사의 설명서에 따라 GE 헬스케어 레디-투-고™ DNA 레이블링 비드 (GE 헬스케어, 뉴저지주 피츠카타웨이)를 사용하여 무작위 프라이밍에 의해 α32P-특이적 뉴클레오티드로 표지하고, 프로브퀀트™ G-50 마이크로칼럼 (아머샴/파마시아, 미국 뉴저지주 피츠카타웨이)에 의해 정제하였다. 연구에 사용된 프로브의 목록이 표 9에서 기술된다.
전-혼성화 및 혼성화를 혼성화 완충제 (시그마, 미주리주 세인트 루인스)를 사용하여 65℃에서 각각 4시간 동안 및 하룻밤 동안 수행하였다. 혼성화 후, 막을 65℃에서 세정 완충제 (10 mM 인산나트륨, 2.5 mM 피로인산나트륨, 0.5 mM EDTA, 0.1％ SDS, 인산으로 pH 7.8로 조정됨)에서 20분 동안 3회 세정하였다. 세정된 필터를 자가방사선술용 포스포이미저 스크린에 노출시키고, 영상을 스캐닝하였다.
Figure 112012049897969-pct00009
6.5 프로브 박리
서던 혼성화 데이터를 수득한 후 DNA 프로브를 막 블롯으로부터 박리하였고, 막 블롯을 상이한 DNA 프로브와의 혼성화에 재사용할 수 있었다. 간략하게, 노출 후, 막 블롯을 10분 동안 실온에서 재생 용액 1 (30 mM NaOH, 1 mM Na2EDTA)에서, 30분 동안 65℃에서 재생 용액 2 (5 mM NaPO4, 1 mM Na2EDTA, 0.1％ SDS)에서 세정하였다. 그 후, 막 블롯이 2× SSC에서 간략하게 세정되었고, 또 다른 DNA 프로브와 혼성화시킬 준비가 되었다. 막 블롯을 자가방사선술용 포스포이미저 스크린에 노출시켜 모든 DNA 프로브가 박리되었음을 확인한 후 다음 혼성화로 진행하였다.
6.6. 서던 블롯 결과
aad-12 유전자 및 이의 프로모터 AtUbi10의 메틸화 상태를 결정하기 위해 메틸화-민감성 제한 효소 AciI 및 Hyp188III을 이러한 분석에서 사용하였다. pDAB4468의 T-가닥 DNA의 공지된 제한 효소 부위를 기초로 하는, 특정 소화물 및 프로브로의 예상 단편 크기가 표 10에서 제공된다. 서던 블롯 상에서 분자량이 더 높은 단편이 검출되는 것은 AciI 및 Hyp188III 제한 효소 부위의 제한 서열 내의 사이토신의 메틸화를 가리킬 것이다. 따라서, 메틸화는 제한 효소가 게놈 DNA를 소화하지 못하는 것을 초래할 것이다.
제한 효소 AciI 및 Hyp188III을 사용하여 aad-12 유전자 메틸화 상태를 시험하였다. 예상 크기의 혼성화 밴드가 aad-12를 사용하여 관찰되었다. 이러한 데이터는 대두 이벤트 DAS-68416-4 내의 AciI 및 Hyp188III의 인식 부위 내에서 메틸화가 발생하지 않았음을 시사한다. 유사하게, 예상 분자량의 밴드가 AtUbi10 프로브를 사용하여 Hyp188III로 소화된 대두 이벤트 DAS-68416-4의 DNA 샘플에서 검출되었다. 이러한 데이터는 인식 부위가 aad-12 프로모터 서열에서 메틸화되지 않았음을 가리킨다.
Figure 112012049897969-pct00010
실시예 7. 작물학 데이터
미국 및 캐나다 내의 6곳의 장소에서의 2008년 조성 연구의 일부로서, 그리고 또한 미국 및 캐나다 내의 8곳의 장소에서 2009년에 수행된 별도의 연구에서, 작물학 실험을 대두 이벤트 DAS-68416-4로 수행하였다. 이러한 연구들은 이벤트 DAS-68416-4 대두 (2,4-D 및/또는 글루포시네이트 제초제 적용 및 미적용)를 이의 비-트랜스제닉 근-동종(near-isogenic) 대조군 (매버릭)과 비교하였다. 양쪽 연구에 걸친 결과는 작물학 파라메터가 통상적인 대두 계통에 대해 수득된 범위 내였음을 나타냈다.
실시예 7.1. 2008년 작물학 데이터의 생성
이벤트 DAS-68416-4 대두 및 비-트랜스제닉 대조군 (매버릭 품종)으로의 작물학 연구를 아이오와, 일리노이, 인디애나, 네브라스카 및 캐나다 온타리오 (2곳)에 위치하는 6곳의 장소에서 2008년에 수행하였다. 입목(stand)/개체수 카운트, 묘목/식물 활력, 초장(plant height), 도복(lodging), 질병 발생률, 곤충 손상, 및 개화 소요일수가 포함되는 작물학 결정인자를 평가하여 대조군 계통 매버릭과 비교했을 시의 대두 이벤트 DAS-68416-4 (제초제 처리 및 미처리)의 등가성을 연구하였다. 이러한 연구가 실험 1로 지칭된다.
테스트 및 대조군 대두 종자를 25 피트 열 당 종자 약 112개의 파종률로 재식하였고, 이때 열 간격은 약 30 인치 (75 cm)였다. 각각의 장소에서, 각각의 처리의 3개의 사본이 확립되었고, 이때 각각의 플롯은 2-25 피트 열로 구성되었다. 각각의 장소에서의 독특한 무작위화로 난괴법(randomized complete block (RCB) design)으로 플롯들이 배열되었다. 유사한 숙성도의 비-트랜스제닉 대두의 열 2개가 각각의 대두 플롯의 경계를 이루었다. 전체 실험 장소가 최소 10 피트의 유사한 상대적 숙성도의 비-트랜스제닉 대두로 둘러싸였다.
약 20 갤런/에이커 (187 ℓ/ha)의 분무 부피로 제초제 처리가 적용되었다. 이러한 적용은 최대 표지 비율 상업 실행을 모사하도록 디자인되었다. 3 lb ae/A의 시기별 총량에 대해 상부에 살포된 3회 적용으로서 2,4-D가 적용되었다. 1.0 lb ae A (1,120 g/ha)의 개별적인 적용이 발아전 및 대략적으로 V4 및 R2 성장 단계에 이루어졌다. 0.74 lb ai/A (828 g ai/ha)의 시기별 총량에 대해 상부에 살포된 2회 적용으로서 글루포시네이트가 적용되었다. 0.33 lb ai/A 및 0.41 lb ai/A (374 및 454 g ai/ha)의 개별적인 적용이 대략적으로 V6 및 R1 성장 단계에 이루어졌다.
혼합형 모델 (SAS 버전 8; SAS 인스티튜트(SAS Institute) 1999)을 사용하여 작물학적 데이터에 대해 필드 장소들에 걸쳐 분산 분석을 수행하였다. 엔트리(entry)는 고정 효과로 간주되었고, 위치, 위치 내의 블록, 위치×엔트리, 및 엔트리×위치 내의 블록은 무작위 효과로 지정되었다. F-테스트를 사용하여 전체적인 처리 효과의 유의성이 개산되었다. t-테스트를 사용하여 대조군과 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4 (미분무), 글루포시네이트가 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 (대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트), 2,4-D가 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 (대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4 D) 및 글루포시네이트 및 2,4-D 양쪽 모두가 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 (대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽) 트랜스제닉 엔트리 사이에서 대응(paired) 대조가 이루어졌다. 조정된 P-값을 다중성에 대해 제어하기 위한 거짓 발견율 (FDR)을 사용하여 또한 계산하였다 (문헌 [Benjamini and Hochberg, 1995]).
Figure 112012049897969-pct00011
대조군, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제로부터 수집된 작물학 데이터의 분석을 수행하였다. 입목 카운트, 초기 개체수, 묘목 활력, 적용 후 손상, 도복, 최종 입목 카운트 또는 개화 소요일수에 대해 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (표 12). 초장에 대해, 유의한 대응 t-테스트가 대조군과 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 분무 사이에 관찰되었다. 그러나, 유의한 전체적인 처리 효과가 관찰되지 않았고, 대두 이벤트 DAS-68416-4 처리와 대조군 사이에 차이가 매우 작았으며, 상이한 대두 이벤트 DAS-68416-4 처리들 사이에서 차이가 공유되지 않았다. 이러한 결과들을 기초로, 대두 이벤트 DAS-68416-4가 근-동종 비-트랜스제닉 대조군과 작물학적으로 등가였다.
Figure 112012049897969-pct00012
실시예 7.2. 2009년 작물학 데이터의 생성
대두 이벤트 DAS-68416-4 및 비-트랜스제닉 대조군 (매버릭 품종)으로의 작물학 연구를 아칸소, 아이오와, 일리노이, 인디애나, 미주리, 및 네브래스카에 위치하는 8곳의 장소에서 2009년에 수행하였다. 입목/개체수 카운트, 묘목/식물 활력, 초장, 질병 발생률, 곤충 손상, 및 개화 소요일수가 포함되는 작물학 결정인자를 평가하여 대조군에 대한 대두 이벤트 DAS-68416-4 (제초제 처리 및 미처리)의 등가성을 연구하였다(표 13).
Figure 112012049897969-pct00013
난괴법이 실험에 사용되었다. 엔트리는 대두 이벤트 DAS-68416-4, 매버릭 대조군 계통, 및 시판되는 비-트랜스제닉 대두 계통이었다. 테스트, 대조군 및 기준 대두 종자를 열 당 종자 약 112개의 파종률로 재식하였고, 이때 열 간격은 약 30 인치 (75 cm)였다. 각각의 장소에서, 각각의 처리의 4개의 사본이 확립되었고, 이때 각각의 플롯은 2-25 피트 열로 구성되었다. 비-트랜스제닉 대두 (매버릭)의 열 2개가 각각의 대두 플롯의 경계를 이루었다. 전체 실험 장소가 최소 4개의 열 (또는 10 피트)의 비-트랜스제닉 대두 (매버릭)로 둘러싸였다. 작물학적으로 허용가능한 작물이 생산되도록 적합한 곤충, 잡초, 및 질병 대조군 실행을 적용하였다.
최대 표지 비율 상업 실행을 모사하도록 제초제 처리가 적용되었다. 처리는 미분무 대조군 및 상술된 성장 단계에 적용된 2,4-D, 글루포시네이트, 2,4-D/글루포시네이트의 제초제 적용으로 구성되었다. 2,4-D 적용에 대해, V4 및 R2 성장 단계에 1.0 lb ae /A (1,120 g ae/ha)의 비율로 제초제가 적용되었다. 글루포시네이트 처리에 대해, V4 및 V6-R2 성장 단계의 식물에 대해 적용이 이루어졌다. 양쪽 적용에 대해, 글루포시네이트가 V4 및 V6-R2 적용에 대해 각각 0.33 lb ai/A (374 g ai/ha) 및 0.41 lb ai/A (454 g ai/ha)의 비율로 적용되었다. 양쪽 제초제 적용에 대한 엔트리는 대두 이벤트 DAS-68416-4 및 비-트랜스제닉 매버릭이 포함되는 대조군이었다. 매버릭 플롯은 제초제 적용 후 사망할 것으로 예상되었다.
혼합형 모델 (SAS 버전 8; SAS 인스티튜트(SAS Institute) 1999)을 사용하여 작물학적 데이터에 대해 들판 장소들에 걸쳐 분산 분석을 수행하였다. 엔트리는 고정 효과로 간주되었고, 위치, 위치 내의 블록, 위치×엔트리, 및 엔트리×위치 내의 블록은 무작위 효과로 지정되었다. 개별적인 장소에서의 분석을 고정 효과로서의 엔트리, 및 무작위 효과로서의 블록 및 엔트리×블록으로 유사한 방식으로 수행하였다. 통계적 분석을 위해 데이터가 반올림되지 않았다. 유의한 차이가 95％ 신뢰 수준에서 공표되었고, F-테스트를 사용하여 전체적인 처리 효과의 유의성이 개산되었다. T-테스트를 사용하여 미분무 AAD-12 (미분무), 글루포시네이트가 분무된 AAD-12 (AAD-12 + 글루포시네이트), 2,4-D가 분무된 AAD-12 (AAD-12 + 2,4-D) 및 글루포시네이트 및 2,4-D 양쪽 모두가 분무된 AAD-12 (AAD-12 + 2,4-D + 글루포시네이트) 트랜스제닉 엔트리와 대조군 엔트리 사이에서 대응 대조가 이루어졌다.
이러한 연구에서 이루어진 다수의 대조로 인해, 다중성이 문제였다. 다중성은 단일 연구에서 다수의 비교가 이루어져 예상 밖의 효과를 자초할 때의 문제이다. 이러한 조건 하에, 비교별(comparison-wise) p-값을 기초로 하는 거짓 공표 차이의 가능성이 매우 높다 (1-0.95비교 횟수). 이러한 연구에서, 분석물 (작물학에 대한 16개의 분석된 관찰 유형) 당 4개의 비교가 있어서, 작물학에 대한 64개의 비교가 초래되었다. 따라서, 미조정 p-값을 기초로 하나 이상의 거짓 차이를 공표할 가능성이 작물학에 대해 99％였다 (1-0.9564).
대조군, 미분무 AAD-12, AAD-12 + 글루포시네이트, AAD-12 + 2,4-D, 및 AAD-12 + 2,4-D + 글루포시네이트 엔트리로부터 수집된 작물학 데이터의 분석을 수행하였다. 여러 장소에 걸친 분석 (표 14)에 대해, 묘목 활력, 최종 개체수, 식물 활력/손상 (V4, R1), 도복, 질병 발생률, 곤충 손상, 개화 소요일수, 숙성 소요일수, 꼬투리의 수, 종자의 수, 수율, 및 초장에 대해 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 입목 카운트 및 초기 개체수에 대해, 유의한 대응 t-테스트가 대조군과 AAD-12 + 글루포시네이트 엔트리 사이에 관찰되었지만, 유의한 전체적인 처리 효과 또는 FDR 조정된 p-값이 동반되지 않았다. 식물 활력/손상 (R2)에 대해, 유의한 대응 t-테스트 및 유의한 전체적인 처리 효과가 대조군과 AAD-12 + 글루포시네이트 및 AAD-12 + 2,4-D + 글루포시네이트 엔트리 양쪽 사이에서 관찰되었지만, 이때 유의한 FDR 조정된 p-값이 동반되지 않았다. 이러한 변수 모두에 대한 평균 결과가 또한 이러한 연구에서 테스트된 기준 계통에 대해 발견된 범위 내였다.
Figure 112012049897969-pct00014
Figure 112012049897969-pct00015
실시예 7.3. 생태학적 평가
대두 이벤트 DAS-68416-4 필드 시험을 대두 경작 실행에 익숙한 직원 (육종가, 필드 스테이션 관리인, 필드 농학자, 필드 공동경영자)에 의해 모니터링 및 관찰하였다. 필드 테스트를 수행하는 직원은 동일한 시험에서 통상적인 대두 품종과 비교하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물 상에서의 식물 질병의 발생률 및 해충 을 모니터링하였다. 실시예 7.1에서 기술된 실험 1의 일부로서, 질병 및 곤충 손상을 0-100％의 수치 등급으로 평가하였고, 이때 0％는 질병 발생률 또는 곤충 저항성으로 인한 손상이 없음을 나타낸다. 표 15는 실험 1에서 기술된 장소 6곳에 걸친 결과를 나타낸다.
Figure 112012049897969-pct00016
질병 발생률에 대해 통계학적으로 유의한 차이가 관찰되지 않았다. 곤충 손상에 대해, 유의한 대응 t-테스트가 대조군과 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 사이에 관찰되었다. 그러나, 유의한 전체적인 처리 효과가 관찰되지 않았고, 대두 이벤트 DAS-68416-4 처리와 대조군 사이의 차이가 작았으며, 상이한 대두 이벤트 DAS-68416-4 처리들 사이에서 차이가 공유되지 않았다.
생태학적 관찰이 2006년-2008년에 수행된 모든 USDA APHIS 보고 필드 시험으로부터 또한 이루어졌다. 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물의 시험에서의 질환 발생률 및 곤충 존재를 기록하였고, 통상적인 대조군에 비교된 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물의 발생률 또는 응답에서의 차이를 조사하였다. 모든 경우에, 통상적인 대조군에 비교된 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물의 어떠한 시험에서도 차이가 나타나지 않았다. 대두 이벤트 DAS-68416-4 및 통상적인 대두의 시험에서 관찰된 질병 및 곤충 스트레스원이 표 16에서 기술된다. 이러한 관찰들은 생태학적 스트레스원에 대한 대두 이벤트 DAS-68416-4의 응답이 통상적인 대두의 응답과 다르지 않다는 결론을 지지한다.
Figure 112012049897969-pct00017
실시예 7.4. 발아 및 휴면 평가
온난 조건 및 저온 조건 하에서 근-동종 비교물에 비교된 대두 이벤트 DAS-68416-4 종자의 발아를 조사함으로써 종자 휴면 특성에서의 변화를 평가하였다.
온난 발아 테스트를 위해, 대두 이벤트 DAS-68416-4 및 대조군 대두 종자를 물로 포화된 발아 패드를 함유하는 페트리 접시 내로 25개/플레이트로 놓고, 과량의 물을 배출시켰다. 플레이트를 25℃에 놓고, 이러한 조건 하에 5일 동안 유지시켰다. 계통 당 16개의 플레이트 (종자 400개)를 제조하였다. 5일 후, 발아되지 않은 종자의 수를 기록하였다.
저온 발아 테스트를 위해, 종자를 화분용 영양토가 채워진 하프-플랫(half-flat) 당 100개의 종자로 재식하였다. 플랫의 아래쪽에서 물을 공급하였고, 10℃에서 7일 동안 유지시키고, 이어서 25℃에 5일 동안 노출시킨 후, 발아되지 않은 종자의 수를 기록하였다.
각각의 테스트로부터의 결과를 4개의 사본 (사본 당 100개의 종자)으로 완전 무작위화법(completely randomized design)을 사용하여 분산 분석 (ANOVA)에 의해 분석하였다. 통계학적 분석을 위해, 100으로 나눠진 발아된 종자의 수의 제곱근의 아크사인을 사용하여 데이터를 전환시켰다. 백분율 발아가 표 17에서 요약된다.
Figure 112012049897969-pct00018
온난 또는 저온 발아 실험 어느 쪽에서도 대두 이벤트 DAS-68416-4와 대조군 대두 종자 사이에 발아에서의 유의한 차이가 없었다 (각각, Pr > F = 1.0 및 0.13). 이러한 결과는 종자 휴면 특성이 대두 이벤트 DAS-68416-4에서 변화되지 않았음을 가리킨다.
실시예 7.5. 작물학적, 질병, 해충 및 발아 특성의 요약
성장기 전반에 걸친 식물 성장 특성을 평가하는 작물학적 데이터는 대두 이벤트 DAS-68416-4와 통상적인 비-트랜스제닉 대두의 등가성을 나타낸다. 식물 성장 및 표현형 특성, 질병 및 곤충 압력에 대한 감수성에 의해 지시되는 바와 같은 생태학적 스트레스원에 대한 응답, 및 발아 및 휴면 특성이 다양한 환경에 걸쳐 대두 이벤트 DAS-68416-4 식물과 통상적인 대구 사이에서 변하지 않았다. 따라서, 이러한 데이터는 대두 이벤트 DAS-68416-4의 작물학적, 질병, 및 해충 특성이 통상적인 대두의 특성과 유의하게 상이하지 않다는 것을 시사하고, 대두 이벤트 DAS-68416-4 대두가 증가된 식물 해충 위험을 공표할 것이라는 징후가 없다.
문헌 [Benjamini, Y., Hochberg, Y. (1995) Controlling the false discovery rate: A practical and powerful approach to multiple testing. J. Royal Statistical Soc. B, 57:289-300].
실시예 8. 알곡 및 사초 조성
대두 사초 및 알곡에 대해 조성 분석을 수행하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 (2,4-D, 글루포시네이트, 2,4-D + 글루포시네이트가 분무되었거나, 또는 2,4-D 또는 글루포시네이트가 분무되지 않음)와 통상적인 대두 간의 등가성을 연구하였다. 미국 및 캐나다의 주요 대두 생산 지역 내에 위치하는 6곳의 테스트 장소에서 대두 이벤트 DAS-68416-4가 있는 종자 계통 또는 없는 계통을 사용하여 시험을 수행하였다. 테스트 장소들은 다양한 작물학적 실행 및 환경 조건의 지역들을 나타내고, 단백질 발현 분석 및 실시예 7.1에 기술된 작물학 실험 1에 대해 사용된 곳과 동일한 장소였다. 아이오와, 일리노이, 인디애나, 네브라스카 및 캐나다 온타리오 (2곳)에 시험이 위치하였다.
대두 사초 및 알곡의 샘플을 영양소 함량에 대해 다양한 테스트로 분석하였다. 사초에 대해 수행된 분석은 단백질, 지방, 회분, 수분, 탄수화물, 산성 세제 불용성 섬유 (ADF), 중성 세제 불용성 섬유 (NDF), 칼슘 및 인을 포함하였다. 알곡에 대해 수행된 분석은 일반성분 (회분, 총 지방, 수분, 단백질, 콜레스테롤, 탄수화물), 섬유, 미네랄, 아미노산, 지방산, 비타민, 항-영양소를 포함하였다.
대두 사초 및 알곡에 대한 양양 분석 결과를 문헌에 보고된 값들과 비교하였다. 혼합형 모델을 사용하여 필드 장소에 걸쳐 분산 분석을 또한 수행하였다. 엔트리는 고정 효과로 간주되었고, 위치, 위치 내의 블록, 및 위치×엔트리는 무작위 효과로 지정되었다. F-테스트를 사용하여 전체적인 처리 효과의 유의성이 개산되었다. t-테스트를 사용하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 (미분무 AAD-12; 2,4-D 또는 글루포시네이트가 분무되지 않음), 글루포시네이트가 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 (대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트), 2,4-D가 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 (대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D), 및 글루포시네이트 및 2,4-D 트랜스제닉 양쪽 모두가 분무된 대두 이벤트 DAS-68416-4 (대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽) 엔트리와 대조군 엔트리 사이에서 대응 대조가 이루어졌다.
이러한 연구에서 이루어진 다수의 대조로 인해, 다중성이 문제였다. 다중성은 단일 연구에서 다수의 비교가 이루어져 예상 밖의 효과를 자초할 때의 문제이다. 이러한 조건 하에, 비교별 p-값을 기초로 하는 거짓 공표 차이의 가능성이 매우 높다 (1-0.95비교 횟수). 이러한 연구에서, 분석물 (75개의 정량된 분석물) 당 4개의 비교가 있어서, 장소에 걸친 조성 분석에서 300개의 비교가 초래되었다. 따라서, 미조정 p-값을 기초로 하나 이상의 거짓 차이를 공표할 가능성이 작물학에 대해 >99.99％였다.
다중성을 설명할 한 방법은 실험별 오류율 (모든 공표된 차이가 유의할 가능성)을 조절하도록 p-값을 조정하는 것이지만, 다수의 비교가 연구에서 이루어지는 경우, 특정 효과를 검출하는 능력이 유의하게 감소될 수 있다. 더욱 더 큰 능력의 대안은 각각의 공표된 차이가 유의할 가능성을 조절하도록 p-값을 조정하는 것이다. 이는 거짓 발견율 (FDR) 절차를 사용하여 달성될 수 있다 (문헌 [Benjamini and Hochberg, 1995]). 따라서, 무작위 효과 (거짓 양성)로부터 처리들 간의 진정한 차이를 구별하는 것을 개선하도록 FDR을 사용하여 p-값을 조정하였다.
실시예 8.1. 대두 사초의 조성 분석
대조군, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제로부터의 대두 사초 샘플 내의 단백질, 지방, 회분, 수분, 탄수화물, 산성 세제 불용성 섬유 (ADF), 중성 세제 불용성 섬유 (NDF), 칼슘 및 인의 분석을 수행하였다. 모든 장소에 걸친 결과의 요약이 표 18에서 제시된다.
단백질, 지방, 회분, 수분, 탄수화물, ADF, NDF, 칼슘 또는 인에 대해 여러 장소에 걸친 분석에서 대조군과 트랜스제닉 엔트리 사이에서 통계학적 차이가 관찰되지 않았다. 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제에 대한 여러 장소에 걸친 평균 회분 값이 문헌 범위 밖이었고, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D에 대한 NDF 값도 그러하였다. 비-트랜스제닉 대조군을 포함하는 모든 처리에 대한 ADF 값 또한 문헌 값 밖이었다. 사초 내의 임의의 일반성분, 섬유 유형, 또는 미네랄에 대해 비-트랜스제닉 대조군과 임의의 트랜스제닉 엔트리 사이에서 평균 값이 유의하게 상이하지 않았다. 이러한 구성 성분들을 기초로, 대두 이벤트 DAS-68416-4 대두로부터의 사초가 근-동종 비-트랜스제닉 대조군의 것과 실질적으로 등가였다.
Figure 112012049897969-pct00019
실시예 8.2. 대두 알곡의 조성 분석
실시예 8.2.1 일반성분 및 섬유
대조군, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제로부터의 대두 알곡 샘플 내의 단백질, 지방, 회분, 수분, 콜레스테롤, 탄수화물, ADF, NDF 및 전체 식이 섬유의 분석을 수행하였다. 모든 장소에 걸친 결과의 요약이 표 19에서 제시된다.
지방, ADF 또는 전체 식이 섬유에 대해 여러 장소에 걸친 분석에서 대조군과 트랜스제닉 엔트리 사이에서 통계학적 차이가 관찰되지 않았다. 그러나, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 엔트리에 대해 ADF가 문헌 범위보다 약간 더 높았다.
단백질 수준이 대조군과 비교하여 미분무, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제에 대해 미조정 p-값을 기초로 여러 장소에 걸친 분석에서 유의하게 상이하였다. 그러나, FDR 조정 후, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D에 대한 p-값만 유의하였고, 모든 처리에 대한 전체적인 평균 단백질 값이 보고된 문헌 값 내였으며, 이는 차이가 생물학적으로 의미가 있지 않았음을 가리킨다.
유의한 미조정 p-값이 회분의 여러 장소에 걸친 분석에서 대조군과 2,4-D 분무 대두 이벤트 DAS-68416-4 처리 사이에서 관찰되지만, 전체적인 처리 효과 또는 조정된 p-값이 관찰되지 않았다. 회분 값 또한 보고된 문헌 값 내였고, 이는 차이가 생물학적으로 의미가 있지 않았음을 가리킨다.
수분 수준이 대조군과 비교하여 미분무, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제에 대해 미조정 p-값을 기초로 여러 장소에 걸친 분석에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 전체적인 처리 효과가 수분에 대해 유의하지 않았고, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 처리에만 유의한 FDR-조정 p-값이 있었으며, 모든 처리에 대한 평균 수분 수준이 문헌 범위 내였다. 이는 차이들이 생물학적으로 의미가 있지 않았음을 가리켰다.
콜레스테롤 값은 모두 정량 한계 미만이었고 (<LOQ), 문헌 값이 보고되지 않았다.
탄수화물 수준이 대조군과 비교하여 미분무, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D에 대해 미조정 p-값을 기초로 여러 장소에 걸친 분석에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4 D 처리만 FDR-조정 p-값을 기초로 대조군과 유의하게 상이하였고, 모든 처리 평균이 보고된 문헌 값 내였으며, 이는 비-트랜스제닉 대두에 대한 등가성을 가리킨다.
NDF 수준이 대조군과 비교하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트에 대해 미조정 p-값을 기초로 여러 장소에 걸친 분석에서 유의하게 상이하였지만, 유의한 조정된 p-값 또는 전체적인 처리 효과가 이에 동반되지 않았다. 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 엔트리에 대해 여러 장소에 걸친 NDF 값이 보고된 문헌 값보다 약간 더 높았지만, 비-트랜스제닉 근-동종 대조군과 비교하여 차이가 <9％였다.
이러한 구성 성분들을 기초로, 대두 이벤트 DAS-68416-4로부터의 알곡이 비-트랜스제닉 대두의 것과 실질적으로 등가였다.
Figure 112012049897969-pct00020
실시예 8.2.2 미네랄
대조군, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제로부터의 대두 알곡 샘플 내의 칼슘, 크롬, 구리, 요오드, 철, 마그네슘, 망간, 몰리브덴, 인, 칼륨, 셀레늄, 나트륨 및 아연의 분석을 수행하였다. 모든 장소에 걸친 결과의 요약이 표 20에서 제시된다.
크롬, 구리, 요오드, 철, 망간, 몰리브덴, 인, 셀레늄 및 나트륨 (검출되지 않음)에 대해 미조정 p-값을 기초로 여러 장소에 걸친 분석에서 대조군과 트랜스제닉 엔트리 사이에서 통계학적 차이가 관찰되지 않았다.
칼슘은 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D에 대해 미조정 p-값을 기초로 여러 장소에 걸친 분석에서 유의한 차이가 있었지만, 유의한 FDR-조정 p-값 또는 전체적인 처리 효과가 이와 관련되지 않았으며, 모든 처리 평균이 문헌 범위 내에 속했고, 이는 차이가 생물학적으로 의미가 있지 않았음을 가리킨다.
마그네슘 수준이 미조정 p-값 및 조정된 p-값을 기초로 대조군과 비교하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트에 대해 여러 장소에 걸친 분석에서 유의하게 상이하였지만, 전체적인 처리 효과가 유의하지 않았다. 여러 장소에 걸친 마그네슘 평균 값이 보고된 문헌 값보다 약간 더 낮았지만, 대조군과 비교하여 차이가 작았고 (<3％), 모든 대두 이벤트 DAS-68416-4 엔트리가 대조군과 비교하여 문헌 값에 더 가까웠다.
모든 대두 이벤트 DAS-68416-4 엔트리가 여러 장소에 걸친 분석에서 대조군과 비교하여 칼륨 값이 유의하게 더 높았다. 그러나, 대조군과 비교하여 차이가 작았고 (<5％), 모든 대두 이벤트 DAS-68416-4 엔트리가 대조군과 비교하여 문헌 범위에 더 가까웠다.
아연 수준에서의 차이가 미조정 p-값을 기초로 여러 장소에 걸친 분석에서 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제에 대해 유의하였지만, 유의한 FDR-조정 p-값 또는 전체적인 처리 효과가 이에 동반되지 않았고, 차이가 작았다 (<4％).
이러한 구성 성분들을 기초로, 대두 이벤트 DAS-68416-4로부터의 알곡이 비-트랜스제닉 대두의 것과 실질적으로 등가였다.
Figure 112012049897969-pct00021
실시예 8.2.3 아미노산
대조군, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제로부터의 대두 알곡 샘플 내의 하기의 아미노산의 분석을 수행하였다: 알라닌, 아르기닌, 아스파르트산, 시스틴, 글루탐산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및 발린. 모든 장소에 걸친 결과의 요약이 표 21에서 제시된다.
시스테인, 메티오닌, 프롤린, 타이로신 또는 트립토판에 대해 대조군과 트랜스제닉 엔트리 사이에서 통계학적 차이가 관찰되지 않았다. 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D에 대한 이소류신 수준이 미조정 p-값을 기초로 대조군과 유의하게 상이하였지만, 유의한 FDR-조정 p-값 또는 유의한 전체적인 처리 효과가 이에 동반되지 않았다. 나머지 12개 아미노산의 수준이 대조군과 비교하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 엔트리 중 2개 이상에 대해 유의하게 더 낮았지만 (<7％), 모두 비-트랜스제닉 대두에 대한 문헌 범위 내에 속했다. 모든 엔트리에 대한 모든 아미노산이 문헌 범위 내였고, 이는 차이가 생물학적으로 의미가 있지 않았음을 가리킨다. 이러한 구성 성분들을 기초로, 대두 이벤트 DAS-68416-4로부터의 알곡이 비-트랜스제닉 대두의 것과 실질적으로 등가였다.
Figure 112012049897969-pct00022
Figure 112012049897969-pct00023
실시예 8.2.4 지방산
대조군, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제로부터의 대두 알곡 샘플 내의 22개의 지방산의 분석을 수행하였다. 모든 장소에 걸친 결과의 요약이 표 22에서 제시된다.
지방산인 10:0 카프르산, 15:0 펜타데칸산, 15:1 펜타데켄산, 20:3 에이코사트리엔산, 20:4 아라키돈산, 8:0 카프릴산, 12:0 라우르산, 14:0 미리스트산, 14:1 미리스톨레산, 17:1 헵타데켄산, 18:3 감마 리놀렌산, 및 20:2 에이코사디엔산을 분석하였고, 결과는 <LOQ였다. 지방산인 16:0 팔미트산, 17:0 헵타데칸산, 및 20:1 에이코센산은 대조군과 AAD-12 엔트리 사이에서 유의하게 상이하지 않았지만, AAD-12 + 글루포시네이트 및 AAD-12 + 양쪽 제초제에 대해 20:1 에이코센 값이 보고된 문헌 값보다 더 낮았다. 그러나, 대조군과 비교하여 차이가 작았다 (<5％).
16:1 팔미톨레산의 수준이 미조정 p-값을 기초로 대조군과 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 사이에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4 엔트리만 FDR-조정 p-값이 16:1 팔미톨레산에 대해 유의하였다. 여러 장소에 걸친 16:1 팔미톨레산 값이 보고된 문헌 값과 비교하여 이러한 처리에 대해 더 낮았지만, 근-동종 대조군과 비교하여 차이가 작았다 (<13％).
18:0 스테아르산의 수준이 미조정 p-값을 기초로 대조군과 미분무 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트 사이에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 조정된 p-값 또는 전체적인 처리 효과를 기초로 유의한 차이가 관찰되지 않았고, 모든 엔트리가 보고된 문헌 값 내였으며, 이는 비-트랜스제닉 대두에 대한 등가성을 가리킨다.
18:1 올레산의 수준이 대조군과 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 사이에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 모든 처리에 대해 18:1 올레산 수준이 보고된 문헌 값 내였고, 이는 비-트랜스제닉 대두에 대한 등가성을 가리킨다.
18:2 리놀레산의 수준이 미조정 p-값을 기초로 대조군과 미분무 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 사이에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 조정된 p-값 또는 전체적인 처리 효과에서 유의한 차이가 관찰되지 않았고, 모든 처리에 대해 18:2 리놀레산 수준이 보고된 문헌 값 내였으며, 이는 비-트랜스제닉 대두에 대한 등가성을 가리킨다.
18:3 리놀렌산의 수준이 미조정 p-값을 기초로 각각의 대두 이벤트 DAS-68416-4 엔트리와 대조군 사이에서 유의하게 상이하였고, 조정된 p-값이 대조군과 비교하여 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4와 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 처리 사이에서 또한 유의하였다. 18:3 리놀렌산에 대한 문헌 값이 입수가능하지 않지만, 대두 이벤트 DAS-68416-4와 대조군 처리 간의 차이가 작았다 (<6％).
20:0 아라키드산의 수준이 미조정 p-값을 기초로 대조군과 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 사이에서 유의하게 상이하였고, 또한 20:0 아라키드산은 조정된 p-값에서 미분무 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트 처리에 대해 여러 장소에 걸친 분석에서 유의한 차이가 있었다. 그러나, 모든 처리에 대해 20:0 아라키드산 수준이 보고된 문헌 값 내였고, 이는 비-트랜스제닉 대두에 대한 등가성을 가리킨다.
22:0 베헨산의 수준이 미조정 p-값을 기초로 대조군과 미분무, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D, 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 사이에서 유의하게 상이하였고, 또한 22:0 베헨산의 수준이 조정된 p-값에서 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트에 대해 여러 장소에 걸친 분석에서 유의한 차이가 있었다. 그러나, 유의한 전체적인 처리 효과가 없었고, 모든 처리에 대해 22:0 베헨산 수준이 보고된 문헌 값 내였고, 이는 비-트랜스제닉 대두에 대한 등가성을 가리킨다.
조사된 22개의 지방산 중에서, 4개의 대두 이벤트 DAS-68416-4 엔트리 모두가 21개의 지방산에 대해 대조군과 통계학적으로 구별할 수 없거나 또는 문헌 값 내였다. 한 경우에 (미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4; 16:1 팔미톨레산), 값이 최소 문헌 값보다 약간 아래였고, 통계학적으로 대조군과 상이하였지만 (<13％ 더 낮음), 3가지 분무 처리 모두는 문헌 범위 내였다. 이러한 구성 성분들을 기초로, 대두 이벤트 DAS-68416-4로부터의 알곡이 비-트랜스제닉 대두의 것과 실질적으로 등가였다.
Figure 112012049897969-pct00024
Figure 112012049897969-pct00025
실시예 8.2.5 비타민
대조군, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제로부터의 대두 알곡 샘플 내의 비타민의 분석을 수행하였다. 모든 장소에 걸친 결과의 요약이 표 23에서 제시된다.
대두 알곡 내의 베타-토코페롤, 델타-토코페롤, 감마-토코페롤, 비타민 A, 비타민 B5, 비타민 B6, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D 및 니아신에 대해 문헌 값이 확인되지 않았다. 베타 토코페롤, 비타민 A, 비타민 B12 및 비타민 D는 모두 <LOQ였다. 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 비타민 C, 비타민 E 또는 니아신에 대해 대조군, 미분무 AAD-12 및 처리된 AAD-12 사이에서 차이가 관찰되지 않았다. 문헌 범위가 입수가능한 비타민들에 대해, 근-동종 대조군을 포함하는 모든 처리에 대해 값들이 범위를 초과한 비타민 B2를 제외하고는, 모든 처리가 이러한 범위 내에 속했다.
델타-토코페롤 수준이 미조정 p-값을 기초로 대조군과 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 엔트리 사이에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 유의한 조정된 p-값 또는 전체적인 처리 효과가 이에 동반되지 않았다. 감마-토코페롤 수준이 미조정 p-값 및 조정된 p-값을 기초로 대조군과 미분무 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 엔트리 사이에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 감마 토포페롤이 근-동종 대조군과 비교하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 처리들에 대해 <11％ 더 높았다.
비타민 B5 수준이 조정된 p-값을 기초로 대조군과 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트 엔트리 사이에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 유의한 전체적인 처리 효과가 이에 동반되지 않았다.
엽산이 미조정 p-값을 기초로 대조군과 미분무, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 사이에서 유의하게 상이하였다. 또한 엽산은 대조군과 비교하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 엔트리 중 2개에 대해 조정된 p-값에서의 유의한 차이가 있었다. 그러나, 모든 처리에 대해 엽산 수준이 보고된 문헌 값 내였고, 대두 이벤트 DAS-68416-4 엔트리가 <9％ 만큼 근-동종 대조군과 상이하였으며, 이는 비-트랜스제닉 대두에 대한 등가성을 가리킨다.
이러한 구성 성분들을 기초로, 대두 이벤트 DAS-68416-4로부터의 알곡이 비-트랜스제닉 대두의 것과 실질적으로 등가였다.
Figure 112012049897969-pct00026
실시예 8.2.5 이소플라본
대조군, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제로부터의 대두 알곡 샘플 내의 이소플라본의 분석을 수행하였다. 모든 장소에 걸친 결과의 요약이 표 24에서 제시된다.
제니스테인 및 글리시테인 결과는 처리된 샘플들에 대해 LOQ 미만이었다. 다이드진 수준이 미조정 p-값 및 조정된 p-값을 기초로 대조군과 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 엔트리 사이에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 전체적인 처리 효과가 유의하지 않았다. 보고된 문헌 값이 없었지만, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 처리가 근-동종 대조군과 <9％ 상이하였다. 제니스틴 수준이 미조정 p-값 및 조정된 p-값을 기초로 대조군과 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 엔트리 사이에서 유의하게 상이하였다. 그러나, 전체적인 처리 효과가 유의하지 않았다. 모든 처리에 대한 제니스틴 값이 보고된 문헌 값보다 더 높았지만, 대두 이벤트 DAS-68416-4 처리가 근-동종 대조군과 비교하여 <9％ 상이하였다. 글리시틴 값이 미조정 p-값 및 조정된 p-값을 기초로 대조군과 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제 사이에서 유의하게 상이하였다. 글리시틴에 대해 보고된 문헌 값이 없었지만, 모든 대두 이벤트 DAS-68416-4 엔트리가 근-동종 엔트리와 비교하여 <13％ 상이하였다.
이러한 구성 성분들을 기초로, 대두 이벤트 DAS-68416-4 대두로부터의 알곡이 비-트랜스제닉 대두의 것과 실질적으로 등가였다.
Figure 112012049897969-pct00027
실시예 8.2.5 항-영양소
대조군, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제로부터의 대두 알곡 샘플 내의 항-영양소의 분석을 수행하였다. 모든 장소에 걸친 결과의 요약이 표 25에서 제시된다.
렉틴, 피트산, 또는 트립신 억제제에 대해 대조군과 트랜스제닉 엔트리 사이에서 통계학적 차이가 관찰되지 않았다. 또한 이러한 3개의 항-영양소가 모두 문헌 범위 내였고, 이는 비-트랜스제닉 대두에 대한 등가성을 가리킨다.
라피노스가 미조정 p-값을 기초로 대조군과 비교하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트 처리에 대해 유의하게 더 낮았다 (<10％). 조정된 p-값 또는 전체적인 처리 효과를 기초로 여러 장소에 걸친 분석에서 라피노스가 유의하게 상이하지 않았다. 또한 모든 처리에 대해 라피로스 수준이 보고된 문헌 값 내였고, 이는 비-트랜스제닉 대두에 대한 등가성을 가리킨다.
스타키오스가 미조정 p-값을 기초로 대조군과 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트 엔트리 사이에서 유의하게 상이하였다. 조정된 p-값 또는 전체적인 처리 효과를 기초로 여러 장소에 걸친 분석에서 스타키오스 수준이 유의하게 상이하지 않았다. 또한 모든 처리에 대해 스타키오스 수준이 보고된 문헌 값 내였고, 이는 비-트랜스제닉 대두에 대한 등가성을 가리킨다.
렉틴, 피트산, 라피노스, 스타키오스 및 트립신 억제제에 대한 항-영양소 분석이 모두 보고된 문헌 값 내였고, 미조정 p-값을 기초로 하는 2개의 유의한 차이가 대조군과 비교하여 대두 이벤트 DAS-68416-4 처리에 대해 항-영양소 수준이 더 낮았다.
이러한 구성 성분들을 기초로, 대두 이벤트 DAS-68416-4 대두로부터의 알곡이 비-트랜스제닉 대두의 것과 실질적으로 등가였다.
Figure 112012049897969-pct00028
실시예 8.3 알곡 및 사초 조성의 요약
대두 이벤트 DAS-68416-4의 조성이 근-동종 계통과 통계학적으로 구별할 수 없거나, 근-동종 계통과 <13％ 상이하거나, 또는 비-트랜스제닉 대두에 대한 문헌 범위 내였다. 따라서, 대두 이벤트 DAS-68416-4가 비-트랜스제닉 대두에 대해 실질적으로 등가인 것으로 확인되었다. 조성 결과의 플롯은 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 제초제와 대조군 대두 계통 사이의 어떠한 생물학적으로 의미가 있는 처리-관련 조성 차이도 가리키지 않는다. 결론적으로, 미분무 대두 이벤트 DAS-68416-4, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 글루포시네이트, 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 2,4-D 및 대두 이벤트 DAS-68416-4 + 양쪽 조성물 결과는 대두 이벤트 DAS-68416-4 및 통상적인 대두의 등가성을 확증한다.
실시예 9 - 재식전 ( preplant ) 전소( burndown ) 적용 및 발아전 시험
본 실시예는 본 발명에 의해 가능하게 된, 대두 작물을 재식하고 제초제를 사용하는 신규 방법을 기술한다.
재식전 전소 제초제 적용은 소정의 작물을 재식하기 전에 겨울 또는 초봄 동안 발아된 잡초를 죽이도록 의도된다. 전형적으로, 이러한 적용은 무경운 또는 감소 경운 관리 시스템으로 적용되고, 이때 재식 전에 잡초의 물리적 제거가 완결되지 않는다. 따라서, 무경운 또는 감소 경운 대두와 함께 사용되는 제초제 프로그램은 재식 시기 이전에 존재하는 광범위한 스펙트럼의 활엽 및 풀 잡초를 방제하여야 한다.
글리포세이트, 그라목손, 및 글루포시네이트는 재식전 전소 제초제 적용에 널리 사용되는 비-선택적, 비-잔류형 제초제의 예이다. 그러나, 일부 잡초는 하기의 이유들 중 하나 이상으로 인해 이같은 제초제로 방제하기가 어렵다: 이러한 제초제에 대한 잡초 종 또는 생물형의 선천적인 무감응, 동계일년성 잡초의 비교적 큰 크기, 및 제초제 흡수 및 활성을 제한하는 저온 날씨 조건. 이러한 비-선택적 제초제가 불충분한 경우에 잡초에 대한 스펙트럼 및 활성을 증가시키기 위해 여러 제초제 선택권이 이러한 제초제들과 탱크 믹스되는데 이용가능하다. 한 예는 코니자 카나덴시스(Conyza canadensis) (망초)의 방제를 돕기 위한 2,4-D + 글리포세이트 탱크 믹스 적용의 사용이다. 글리포세이트는 존재하는 대부분의 잡초의 재식전 전소 방제를 위해 420 내지 1680 g ae/ha, 더욱 전형적으로는 560 내지 840 g ae/ha로 사용될 수 있다; 그러나, 280 - 1120 g ae/ha의 2,4-D가 다수의 활엽 잡초 종 (예를 들어, 망초)의 방제를 돕도록 적용될 수 있다.
2,4-D는 최상의 재식전 제초제인데, 매우 넓은 범위의 활엽 잡초에 대해 효과적이고 (심지어 비교적 낮은 온도에서도), 매우 저렴하기 때문이다. 그러나, 전소 적용 후에 재식된 작물이 2,4-D에 대해 민감성이면 (예를 들어, 대부분의 쌍자엽 작물), 토양 내의 2,4-D 잔류물이 (비록 단기간일 수는 있지만) 작물을 손상시킬 수 있다. 대두와 함께 사용하기 위해, 다수의 2,4-D 에스테르 제초제 라벨은 1 lb ai/에이커의 전소 적용 후 15일 이상까지 새로운 작물의 재식을 제한한다. 2,4-D 저-휘발성 에스테르 제형의 경우, 전소를 위한 0.5 lb ai/에이커까지의 비율은 전형적으로 적용 7일 후의 재식을 요구하고, 1.0 lb ai/에이커의 비율은 전형적으로 적용 30일 후의 재식을 요구한다. 수용성인 2,4-D 아민 제품의 경우의 추가적인 우려는 제초제가 종자 구역 내로 여과될 수 있다는 것이다. 그러나, aad -12 유전자를 함유하는 작물은 2,4-D에 대해 내성이고, 토양 내의 2,4-D 잔류물에 의해 부정적으로 영향을 받지 않는다. 이러한 내성으로 인해, aad -12 유전자를 함유하는 식물은 aad -12 유전자를 함유하지 않는 식물보다 손상을 받지 않으면서 전소 후에 더 빨리 재식될 수 있다. 또한, 탱크믹스 (또는 상업적인 프리믹스(premix)) 파트너로의 2,4-D 제초제의 증가된 융통성 및 감소된 비용은 중요한 무경운 및 감소 경운 상황에서 잡초 방제 선택권을 개선시킬 것이고 전소 적용의 견실성(robustness)을 증가시킬 것이다.
aad -12 유전자를 함유하는 대두 (이벤트 DAS-68416-4) 및 대조군 대두를 재식하기 7일 전, 15일 전 또는 30일 전에 2,4-D 아민의 발아전 적용이 1120, 2240, 4480 g ae/ha의 비율로 적용된다. 당업계에 공인된 절차를 사용하여 발아전 적용이 지리적으로 상이한 장소들에 위치하는 필드 플롯에 적용된다. 발아 및 초기 성장의 정확한 평가를 제공하도록 제초제-처리 플롯이 미처리 플롯과 짝을 이룬다. 재식, 및 재식하기 7일 전, 15일 전 또는 30일 전의 2,4-D 적용 후, aad -12 유전자를 함유하는 대두 (이벤트 DAS-68416-4) 및 대조군 대두의 손상을 측정한다. 필드 테스트의 결과는 aad -12 유전자를 함유하는 대두 (이벤트 DAS-68416-4)가 재식하기 7일 전, 15일 전 또는 30일 전의 2,4-D 제초제의 발아전 처리에 대해 견실한 내성을 제공한다는 것을 가리킨다.
이러한 예는 이용가능한 다수의 선택권 중 일부이다. 잡초 방제 업계의 당업자는, 예를 들어, 연방 제초제 라벨 (CPR, 2003)에 기술된 제품 및 문헌 [Agriliance Crop Protection Guide (2003)]에 기술된 용도를 이용함으로써 그라목손 + 2,4-D 또는 글루포시네이트 + 2,4-D가 포함되는 다양한 기타 적용을 알게 될 것이다. 당업자는 안정적으로 형질전환된 경우 AAD-12 유전자에 의해 보호될 임의의 2,4-D-민감성 (또는 기타 페녹시 옥신 제초제) 작물에 상기의 예가 적용될 수 있음을 또한 인지할 것이다.
DAS-68416-4 대두는 제초제 2,4-D에 대해 내성이다. 본 실시예는 필드 조건 하에서의 DAS-68416-4 대두의 제초제 내성의 특성화를 보고한다. DAS-68416-4 대두를 미국에서 수행된 필드 시험에서 제초제 2,4-D에 대한 내성에 대해 평가하였다. DAS-68416-4 대두에 대해, 제안된 최대 적용률은 2,4-D에 대해 1120 g ae/ha일 것이다. 하기에서 논의된 데이터는 DAS-68416-4 대두가 이러한 제안된 최대 사용률의 4배 이상의 사용률에서 허용가능한 내성을 제공한다는 것을 가리킨다.
2,4-D의 해독 및 이어지는, 이러한 화합물에 의해 야기되는 손상으로부터의 보호를 위한 DAS-68416-4 대두의 효율을 필드 연구에서 특성화하였다. 2,4-D에 대한 발아전 내성을 평가하도록 시험을 디자인하였다. 발아전 시험을 난괴법으로서 수행하였다. 실험 단위는 약 3 m 길이의 발아전 시험을 위한 2열 플롯으로 구성되었고, 모든 시험은 3개의 사본을 함유하였다. 모든 제초제 적용은 약 140 - 190 ℓ/ha의 분무 부피를 전달하는 기체-가압식 소형-플롯 분무 장치로 이루어졌다. 사용된 2,4-D 제형은 456 g ae/리터 디메틸암모늄 염이었다. 작물 발아 약 7일 후에 시각적 손상을 평가하였다. 플롯 내의 모든 식물에 걸쳐 관찰된 모든 손상 징후의 시각적 복합물을 반영하는 0 내지 100 등급으로 평가하였고, 이때 0 = 미처리 플롯과 비교하여 손상 없음, 100 = 모든 식물이 사망함이었다.
발아전 시험은 재식 후, 작물 발아 전에 적용된 1120, 2240, 및 4480 g ae/ha로 구성되었다. 발아전 시험에 관한 정보가 표 26에서 제시된다.
Figure 112012049897969-pct00029
요약하면, 2,4-D 내성의 필드 평가를 수행하였다. 발아전 2,4-D 아민 적용에 대한 DAS-68416-4 대두 및 형질전환되지 않은 매버릭 대두의 응답을 시험하는 연구를 미시시피, 인디애나 및 미네소타 내의 장소에서 수행하였다. 3곳의 장소에 걸쳐 평균화되었을 때, DAS-68416-4에 대한 2,4-D 아민의 발아전 적용은 적용률과 관계 없이 ≤2％ 손상을 초래하였다 (표 27). 동일한 처리가 형질전환되지 않은 매버릭에 34 내지 60％ 손상을 야기하였다. 2,4-D의 발아전 적용으로부터의 손상은 입목 손실 및 성장 감소로 구성되었다.
Figure 112012049897969-pct00030
실시예 10 - 글리포세이트 내성 유전자 + 대두 이벤트 DAS -68416-4를 조합하여 사용하여 글리포세이트 -저항성 잡초를 방제하는 방법
매우 넓은 스펙트럼의 활엽 및 풀 잡초 종을 방제하기 때문에 글리포세이트가 널리 사용된다. 그러나, GTC 및 비-작물 용도에서의 글리포세이트의 반복 사용으로 천연적으로 더욱 내성인 종 또는 글리포세이트-저항성 생물형으로의 잡초 전환이 선택되었거나 또는 계속 선택될 것이다. 대부분의 제초제 저항성 관리 전략은 동일한 종의 방제를 제공하지만 작용 방식이 상이한, 효과적인 비율로 사용되는 탱크믹스 제초제 파트너를 저항성 잡초의 출현을 지연시키는 방법으로서 처방한다. 416 AAD -12 이벤트를 글리포세이트 내성 형질 (및/또는 기타 제초제-내성 형질)과 스태킹하는 것은 글리포세이트, 페녹시 옥신(들) (예를 들어, 2,4-D) 및 피리딜옥시아세테이트 옥신 제초제 (예를 들어, 트리클로피르)를 동일한 작물에서 선택적으로 사용하는 것을 가능하게 함으로써 GTC에서의 글리포세이트 저항성 쌍자엽 잡초 종의 방제를 허용하는 메커니즘을 제공할 수 있다. 이러한 제초제들은 상이한 작용 방식의 2가지 이상의 제초제를 포함하는 탱크 혼합물 내에서 동시에 적용될 수 있거나; 재식전, 발아전 또는 발아후 적용으로서의 순차적 적용 및 약 2시간 내지 약 3개월 범위의 적용 시기 분할로 단일 제초제 조성물이 개별적으로 적용될 수 있거나; 또는 별법적으로 각각의 화학적 클래스를 나타내는 임의의 개수의 제초제의 임의의 조합물이 작물 재식으로부터 약 7개월 이내에서 작물 수확까지의 임의의 시기 (또는 개별적인 제초제에 대한 수확전 간격 (어느 것이든 더 짧은 것))에 적용될 수 있다.
적용 시기, 개별적인 제초제들의 비율, 및 어렵거나 저항성인 잡초를 방제하는 능력의 관점에서 넓은 스펙트럼의 풀 및 활엽 잡초를 방제하는 것에서 융통성이 있는 것이 중요하다. 글리포세이트 저항성 유전자/AAD -12 416 이벤트 스택이 있는 작물에서의 글리포세이트 적용은 약 250-2500 g ae/ha 범위일 수 있고, 페녹시 옥신 제초제(들) (하나 이상)는 약 25-4000 g ae/ha로 적용될 수 있으며, 피리딜옥시아세테이트 옥신 제초제(들) (하나 이상)는 25-2000 g ae/ha로 적용될 수 있다. 최적의 조합물(들) 및 이러한 적용(들)의 시기는 특정 상황, 종, 및 환경에 좌우될 것이고, 잡초 방제 및 본 개시내용이 이로운 업계의 숙련가에 의해 최상으로 결정될 것이다.
북미에서 재식된 면, 캐놀라, 옥수수 및 대두 토지의 대부분은 글리포세이트 내성 (GT) 형질을 함유하고, GT 옥수수의 채택이 상승세이다. 추가적인 GT 작물 (예를 들어, 밀, 벼, 사탕무, 및 잔디)이 개발 중에 있지만, 현재 상업적으로 발매되지는 않았다. 다수의 기타 글리포세이트 저항성 종이 실험 내지 개발 단계에 있다 (예를 들어, 알팔파, 사탕수수, 해바라기, 비트, 완두콩, 당근, 오이, 양상추, 양파, 딸기, 토마토 및 담배; 포플러 및 스윗검(sweetgum)과 같은 산림 종; 및 천수국, 페투니아 및 베고니아와 같은 원예 종; 2005년 월드 와이드 웹 상의 isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm). GTC는 이러한 시스템에 의해 방제되는 잡초의 완전한 폭 및 이러한 시스템이 제공하는 편리 및 비용 효과로 인해 유용한 도구이다. 그러나, 현재 표준인 베이스 처리로서의 글리포세이트의 유용성은 글리포세이트 저항성 잡초를 선발하고 있다. 또한, 글리포세이트가 선천적으로 덜 효과적인 잡초가 글리포세이트-단독 화학적 프로그램이 실행 중인 필드에서 우세한 종으로 전환되고 있다. 통상적인 육종을 통해 또는 신규 형질전환 이벤트로서 함께 AAD-12 이벤트 416을 GT 형질과 스태킹시킴으로써, 잡초 방제 효능, 융통성, 및 잡초 전환 및 제초제 저항성을 관리하는 능력이 개선될 수 있다. 작물을 AAD -12 이벤트 416으로 형질전환시킴으로써, 단자엽 작물이 더 높은 페녹시 또는 피리딜옥시 옥신 안전성 한계를 지닐 것이고, 페녹시 옥신이 쌍자엽 작물에서 선택적으로 적용될 수 있다. AAD -12 이벤트 416 및 GT 형질이 임의의 단자엽 또는 쌍자엽 작물 종에서 스태킹되는 경우에 개선된 잡초 방제 선택권에 대한 여러 시나리오가 구상될 수 있다:
a) 대두분의 풀 및 활엽 잡초 종의 방제를 위해 표준 발아후 적용률 (420 내지 2160 g ae/ha, 바람직하게는 560 내지 840 g ae/ha)로 글리포세이트를 적용할 수 있다. 코니자 카나덴시스와 같은 글리포세이트 저항성 활엽 잡초 또는 글리포세이트로의 방제가 선천적으로 어려운 잡초 (예를 들어, 코멜리나(Commelina) 종, 이포모에아(Ipomoea) 종 등)의 방제를 위해, 280-2240 g ae/ha (바람직하게는 560-1120 g ae/ha)의 2,4-D를 순차적으로, 탱크 믹스로, 또는 글리포세이트와의 프리믹스로 적용하여 효과적인 방제를 제공할 수 있다. 트리클로피르에 대해, 적용률은 전형적으로 70-1120 g ae/ha, 더욱 전형적으로 140-420 g ae/ha 범위일 것이다. 플루록시피르에 대해, 적용률은 전형적으로 35-560 g ae/ha, 더욱 전형적으로는 70-280 ae/ha 범위일 것이다.
b) 현재, GTC에서 적용되는 글리포세이트 비율은 일반적으로 적용 시기 당 560 내지 2240 g ae/ha 범위이다. 글리포세이트는 활엽 잡초 종보다 풀 종에 대해 훨씬 더 효과적이다. AAD -12 이벤트 416 + GT가 스태킹된 형질은 글리포세이트의 풀-효과적 비율 (105-840 g ae/ha, 더욱 바람직하게는 210-420 g ae/ha)을 허용할 것이다. 그 후, 2,4-D (280-2240 g ae/ha, 더욱 바람직하게는 560-1120 g ae/ha)가 순차적으로, 탱크 믹스로 또는 풀-효과적 비율의 글리포세이트와의 프리믹스로 제공되어, 필요한 활엽 잡초 방제를 제공할 수 있다. 상기 언급된 비율의 트리클로피르 및 플루록시피르가 처리 계획에서 허용가능한 성분일 것이다. 낮은 비율의 글리포세이트가 활엽 잡초 방제에 약간의 이점을 또한 제공할 것이다; 그러나, 주요 방제는 2,4-D, 트리클로피르, 또는 플루록시피르로부터의 방제일 것이다.
잡초 방제 분야의 당업자는 하나 이상의 시판되는 아릴옥시 옥신 제초제를 단독으로 또는 조합하여 (순차적으로 또는 독립적으로) 사용하는 것이 작물 내로의 AAD-12 이벤트 416 형질전환에 의해 가능하게 된다는 것을 인지할 것이다. 이러한 화학물질들을 나타내는 기타 제초제의 구체적인 비율은 CPR (Crop Protection Reference) 도서 또는 유사 편집물에서 열거된 제초제 라벨, 온라인에서 열거된 라벨 (예를 들어, cdms.net/manuf/manuf.asp), 또는 임의의 상업적 또는 학문적 작물 보호 지침 예컨대 문헌 [Crop Protection Guide from Agriliance (2005)]에 의해 결정될 수 있다. 단독으로, 탱크 믹스로 또는 순차적으로 사용되는지와 관계없이, AAD-12 이벤트 416에 의해 HTC에서의 사용이 가능해진 별법적인 제초제가 본 발명의 범주 내인 것으로 간주된다.
참고 문헌
Figure 112012049897969-pct00031
SEQUENCE LISTING <110> Dow AgroSciences, LLC <120> AAD-12 EVENT 416, RELATED TRANSGENIC SOYBEAN LINES, AND EVENT-SPECIFIC IDENTIFICATION THEREOF <130> DAS-P0170-WO <150> US 61/263,950 <151> 2009-11-24 <160> 30 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10212 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Insert and flanking sequences for soybean Event DAS-68416-4 <400> 1 ctgtcgttgg attcacagaa cattgacgcc agttttcact tcgttatctt tgaattcatt 60 aaaatcgaat ctctcaccta taccccccca tttttctaat ccatcataat caaaattcat 120 aaatgaatca gttaccatta ccataatacc tttttgaaaa tgagtttgaa taatcagtat 180 ctttagaaaa ctaattaaga aattaaataa aaaatattta tcatgaagat gagtgtaaga 240 aaaattatga aaagtataac tttatacatt tctataaaat tattttttct tttaatttct 300 taattaatat cctaagtaaa tgagttaata tttatctttc aaaaattctt atagtcgcca 360 attaattttc ccatgcaatg acaacttgtc cgtattctac gtggtaggtt aggctacctg 420 ccgagacaaa ttgccttgag acaaattcaa tagagaaccc ttccaaggga ccattataaa 480 tagagaactt tcattaaccg ataagccaca ccctttcaat caaacacaaa cacttgaagt 540 actaagttag tgtgtttgag caaattaact atggcttcgt tttgttctag attgacaatt 600 tgtttggctc tgtttgtcct catatggggg agtgccaatg cacaactttc tacaaacttt 660 tactaccatt catgtccaaa cctcttctcc tctgtgaaat ccacagtgca atctgccata 720 tctaaggaga cccgcatggg tgcttctctc cttcgcttgt tcttccacga ttgctttgtc 780 aatgtaattt atttgcacct tctcccactt acatacaaat atgctaagct tacatatagc 840 tcctctttct accacttgca tgcatcatct aattttgttt gaaacaacac ttgttccttt 900 tattatacac atcatctttg ataaaatttt gtcgtgtgca actttttttt agtgtgttaa 960 tcagttctat gatgatacta ttagttaaga aattttaatg cacttaataa accattttaa 1020 gtactttaac cgttcaatga tattatatat ttaaagataa taaatatttc tgcttttgtt 1080 tctatattag tgtagttaag aaccttctta cttcttagct agctaaatat taatgagtaa 1140 acattaacaa atgcagggat gtgatggttc aattctattg gatgacacat caagcttcac 1200 cggagagaag aacgcaaacc ccaacaggaa ctctgctcgt ggattcgagg ttattgacaa 1260 cattaaatca gccgtggaga aagtgtgtcc aggagttgtt tcctgcgcag atatccttgc 1320 catcgctgcc agagactctg ttcagattgt aagtggtcaa acaaccaaca aaaacacatt 1380 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caagcaattt aattgtgttt aataagttgt taaaacatgt tttggttgta ttttggattc 2280 ctagtgtagt ttcggtgatc aatgccgtct actttagtgt gttctacttc cctttatttt 2340 tgtttctttt ttactttttc cttaactata ttgtaggaaa aaaaaaatcc tttatcaagc 2400 atttatcaag aacggagttt gctttttaat tttcccttca taacattcca tcagaattca 2460 gttttgcttt tgcttctaaa ttacgttcaa atcagggatg ataatcggtt aggtaatata 2520 tacagtaccc cttgcatagt cacgtttgaa aaatataatc atacttagtt cggtaacaat 2580 ttaaattatc attctcgtaa tcattagcta cttatgcact catatccgta tccgctactt 2640 gctcttgtcg taagtcaata aattaatata aaaaaatact taaaacttgt tacaactaaa 2700 ttaaaaattt atttttaaat cattcaagca ccagtcagca tcatcacacc aaaagttagg 2760 cccgaatagt ttgaaattag aaagctcgca attgaggtct acaggccaaa ttcgctctta 2820 gccgtacaat attactcacc ggatcctaac cggtgtgatc atgggccgcg attaaaaatc 2880 tcaattatat ttggtctaat ttagtttggt attgagtaaa acaaattcga accaaaccaa 2940 aatataaata tatagttttt atatatatgc ctttaagact ttttatagaa ttttctttaa 3000 aaaatatcta gaaatatttg cgactcttct ggcatgtaat atttcgttaa atatgaagtg 3060 ctccattttt attaacttta aataattggt tgtacgatca ctttcttatc aagtgttact 3120 aaaatgcgtc aatctctttg ttcttccata ttcatatgtc aaaacctatc aaaattctta 3180 tatatctttt tcgaatttga agtgaaattt cgataattta aaattaaata gaacatatca 3240 ttatttaggt atcatattga tttttatact taattactaa atttggttaa ctttgaaagt 3300 gtacatcaac gaaaaattag tcaaacgact aaaataaata aatatcatgt gttattaaga 3360 aaattctcct ataagaatat tttaatagat catatgtttg taaaaaaaat taatttttac 3420 taacacatat atttacttat caaaaatttg acaaagtaag attaaaataa tattcatcta 3480 acaaaaaaaa aaccagaaaa tgctgaaaac ccggcaaaac cgaaccaatc caaaccgata 3540 tagttggttt ggtttgattt tgatataaac cgaaccaact cggtccattt gcacccctaa 3600 tcataatagc tttaatattt caagatatta ttaagttaac gttgtcaata tcctggaaat 3660 tttgcaaaat gaatcaagcc tatatggctg taatatgaat ttaaaagcag ctcgatgtgg 3720 tggtaatatg taatttactt gattctaaaa aaatatccca agtattaata atttctgcta 3780 ggaagaaggt tagctacgat ttacagcaaa gccagaatac aatgaaccat aaagtgattg 3840 aagctcgaaa tatacgaagg aacaaatatt tttaaaaaaa tacgcaatga cttggaacaa 3900 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aatgctaaaa aaatataaat cgtaacgatc gttaaatctc aacggctgga tcttatgacg 4800 accgttagaa attgtggttg tcgacgagtc agtaataaac ggcgtcaaag tggttgcagc 4860 cggcacacac gagtcgtgtt tatcaactca aagcacaaat acttttcctc aacctaaaaa 4920 taaggcaatt agccaaaaac aactttgcgt gtaaacaacg ctcaatacac gtgtcatttt 4980 attattagct attgcttcac cgccttagct ttctcgtgac ctagtcgtcc tcgtcttttc 5040 ttcttcttct tctataaaac aatacccaaa gcttcttctt cacaattcag atttcaattt 5100 ctcaaaatct taaaaacttt ctctcaattc tctctaccgt gatcaaggta aatttctgtg 5160 ttccttattc tctcaaaatc ttcgattttg ttttcgttcg atcccaattt cgtatatgtt 5220 ctttggttta gattctgtta atcttagatc gaagacgatt ttctgggttt gatcgttaga 5280 tatcatctta attctcgatt agggtttcat aaatatcatc cgatttgttc aaataatttg 5340 agttttgtcg aataattact cttcgatttg tgatttctat ctagatctgg tgttagtttc 5400 tagtttgtgc gatcgaattt gtcgattaat ctgagttttt ctgattaaca gagatctcca 5460 tggctcagac cactctccaa atcacaccca ctggtgccac cttgggtgcc acagtcactg 5520 gtgttcacct tgccacactt gacgatgctg gtttcgctgc cctccatgca gcctggcttc 5580 aacatgcact cttgatcttc cctgggcaac acctcagcaa tgaccaacag attacctttg 5640 ctaaacgctt tggagcaatt gagaggattg gcggaggtga cattgttgcc atatccaatg 5700 tcaaggcaga tggcacagtg cgccagcact ctcctgctga gtgggatgac atgatgaagg 5760 tcattgtggg caacatggcc tggcacgccg actcaaccta catgccagtc atggctcaag 5820 gagctgtgtt cagcgcagaa gttgtcccag cagttggggg cagaacctgc tttgctgaca 5880 tgagggcagc ctacgatgcc cttgatgagg caacccgtgc tcttgttcac caaaggtctg 5940 ctcgtcactc ccttgtgtat tctcagagca agttgggaca tgtccaacag gccgggtcag 6000 cctacatagg ttatggcatg gacaccactg caactcctct cagaccattg gtcaaggtgc 6060 atcctgagac tggaaggccc agcctcttga tcggccgcca tgcccatgcc atccctggca 6120 tggatgcagc tgaatcagag cgcttccttg aaggacttgt tgactgggcc tgccaggctc 6180 ccagagtcca tgctcaccaa tgggctgctg gagatgtggt tgtgtgggac aaccgctgtt 6240 tgctccaccg tgctgagccc tgggatttca agttgccacg tgtgatgtgg cactccagac 6300 tcgctggacg cccagaaact gagggtgctg ccttggtttg agtagttagc ttaatcacct 6360 agagctcggt caccagcata atttttatta atgtactaaa ttactgtttt gttaaatgca 6420 attttgcttt ctcgggattt taatatcaaa atctatttag aaatacacaa tattttgttg 6480 caggcttgct ggagaatcga tctgctatca taaaaattac aaaaaaattt tatttgcctc 6540 aattatttta ggattggtat taaggacgct taaattattt gtcgggtcac tacgcatcat 6600 tgtgattgag aagatcagcg atacgaaata ttcgtagtac tatcgataat ttatttgaaa 6660 attcataaga aaagcaaacg ttacatgaat tgatgaaaca atacaaagac agataaagcc 6720 acgcacattt aggatattgg ccgagattac tgaatattga gtaagatcac ggaatttctg 6780 acaggagcat gtcttcaatt cagcccaaat ggcagttgaa atactcaaac cgccccatat 6840 gcaggagcgg atcattcatt gtttgtttgg ttgcctttgc caacatggga gtccaaggtt 6900 gcggccgcgc gccgacccag ctttcttgta caaagtggtt gcggccgctt aattaaattt 6960 aaatgcccgg gcgtttaaac gcggccgctt aattaaggcc ggcctgcagc aaacccagaa 7020 ggtaattatc caagatgtag catcaagaat ccaatgttta cgggaaaaac tatggaagta 7080 ttatgtaagc tcagcaagaa gcagatcaat atgcggcaca tatgcaacct atgttcaaaa 7140 atgaagaatg tacagataca agatcctata ctgccagaat acgaagaaga atacgtagaa 7200 attgaaaaag aagaaccagg cgaagaaaag aatcttgaag acgtaagcac tgacgacaac 7260 aatgaaaaga agaagataag gtcggtgatt gtgaaagaga catagaggac acatgtaagg 7320 tggaaaatgt aagggcggaa agtaacctta tcacaaagga atcttatccc ccactactta 7380 tccttttata tttttccgtg tcatttttgc ccttgagttt tcctatataa ggaaccaagt 7440 tcggcatttg tgaaaacaag aaaaaatttg gtgtaagcta ttttctttga agtactgagg 7500 atacaacttc agagaaattt gtaagtttgt agatctccat gtctccggag aggagaccag 7560 ttgagattag gccagctaca gcagctgata tggccgcggt ttgtgatatc gttaaccatt 7620 acattgagac gtctacagtg aactttagga cagagccaca aacaccacaa gagtggattg 7680 atgatctaga gaggttgcaa gatagatacc cttggttggt tgctgaggtt gagggtgttg 7740 tggctggtat tgcttacgct gggccctgga aggctaggaa cgcttacgat tggacagttg 7800 agagtactgt ttacgtgtca cataggcatc aaaggttggg cctaggatcc acattgtaca 7860 cacatttgct taagtctatg gaggcgcaag gttttaagtc tgtggttgct gttataggcc 7920 ttccaaacga tccatctgtt aggttgcatg aggctttggg atacacagcc cggggtacat 7980 tgcgcgcagc tggatacaag catggtggat ggcatgatgt tggtttttgg caaagggatt 8040 ttgagttgcc agctcctcca aggccagtta ggccagttac ccagatctga ggtaccctga 8100 gcttgagctt atgagcttat gagcttagag ctcggatcca ctagtaacgg ccgccagtgt 8160 gctggaattc gcccttgact agataggcgc ccagatcggc ggcaatagct tcttagcgcc 8220 atcccgggtt gatcctatct gtgttgaaat agttgcggtg ggcaaggctc tctttcagaa 8280 agacaggcgg ccaaaggaac ccaaggtgag gtgggctatg gctctcagtt ccttgtggaa 8340 gcgcttggtc taaggtgcag aggtgttagc gggatgaagc aaaagtgtcc gattgtaaca 8400 agatatgttg atcctacgta aggatattaa agtatgtatt catcactaat ataatcagtg 8460 tattccaata tgtactacga tttccaatgt ctttattgtc gccgtatgta atcggcgtca 8520 caaaataatc cccggtgact ttcttttaat ccaggatgaa ataatatgtt attataattt 8580 ttgcgatttg gtccgttata ggaattgaag tgtgcttgcg gtcgccacca ctcccatttc 8640 ataattttac atgtatttga aaaataaaaa tttatggtat tcaatttaaa cacgtatact 8700 tgtaaagaat gatatcttga aagaaatata gtttaaatat ttattgataa aataacaagt 8760 caggtattat agtccaagca aaaacataaa tttattgatg caagtttaaa ttcagaaata 8820 tttcaataac tgattatatc agctggtaca ttgccgtaga tgaaagactg agtgcgatat 8880 tatggtgtaa tacatagcgg ccgggtttct agtcaccggt taggatccgt ttaaactcga 8940 ggctagcgca tgcacataga cacacacatc atctcattga tgcttggtaa taattgtcat 9000 tagattgttt ttatgcatag atgcactcga aatcagccaa ttttagacaa gtatcaaacg 9060 gatgtgactt cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta ttaagttgtc taagcgtcaa 9120 tattttaatt cttaacaatc aatattttaa ttcttaaact ttattaaatc taacaataaa 9180 ctgtaagaac taattcttaa acttcaataa acaatactgc gttttagtaa ttaaattaat 9240 aatatataga tatagatata taatttgtca acatattctt acctattttt ccattgaaat 9300 atgttagcaa gttcaaaaaa agttttgaca aaaaactcta ctatcttttg tttcatttac 9360 tttatgtgag ggatataata gtaatataac atttagttta tttaaagaaa ataaaaaagt 9420 taatttctct ttctgccact gatactctat ggtggagaga tccgatgcag tggtggagcc 9480 tggcctcgac acataagtgt gacgacgcag ctgttgaaga gatctgattc gacggtgggg 9540 taatgcatgg tggttgacag gttgatgggt ggagaagacg taattgctac cgccgtcaac 9600 ggaggaagga gcaaagatgt ctcgtatgtg aaaattatgc ggttgagatg ccgtttcatt 9660 ccctttaaaa aaatcccttg atggttgcaa tgcaaattaa aaattgaaaa aataattaat 9720 tgttcaaatt aaagatttag catgaaaaaa aaaacactta attgtgccca tgactccatg 9780 acctgcgtaa cttgggaagg aaaggaattt ttttgctaaa ggaaggcatg ggaagatgag 9840 agaggagaga gaatcagtgg aagtgagaga aattaacttt ttgtttttta aaaactaaat 9900 attatattac tattatatat atatatatat atatataaaa gattttttag ctggattctt 9960 gatataaaaa atttctcacc atatttatta ttatatattt ttttggagat ctcaaaaaag 10020 gaagttggat ttcttctcaa taactctaaa aaattattcc tatttcaaaa aatatttttt 10080 atgtctttct ctaattgatg aataatatct atttaagtat attttattgt gaaatccaca 10140 aaagtgactg ataaatctaa tttaggatct accattagag aaaaataaat aaattcttat 10200 attatatgtg at 10212 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 tggaagaaca aagagattga cgca 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 gtaatacgac tcactatagg gc 22 <210> 4 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 acgaaatatt acatgccaga agagtcgc 28 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 actatagggc acgcgtggt 19 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 ccgtagatga aagactgagt gcga 24 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 ccgtagatga aagactgagt gcgatattat 30 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 cccttgcata gtcacgtttg 20 <210> 9 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gtgttgccca gggaaga 17 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 gctacttgct cttgtcgtaa gtca 24 <210> 11 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 atgttgaagc caggctgc 18 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 gggcctaact tttggtgtga tg 22 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 tacttgctct tgtcgtaagt caataaatt 29 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 gaacttgcta acatatttca atgga 25 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence 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Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 tcccaacttg ctctgagaat acac 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 gtgtattctc agagcaagtt ggga 24 <210> 26 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 caatcgtaag cgttcctagc cttc 24 <210> 27 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Squence <220> <223> Primer <400> 27 gaaggctagg aacgcttacg attg 24 <210> 28 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 ccactgcatc ggatctctcc acca 24 <210> 29 <211> 710 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flanking SNP Marker <220> <221> misc_feature <222> (59)..(59) <223> n is c or g <400> 29 tcatcgaagt tgagggcccc cgcggaaaat tggtgcgaga cttcaagcac ttgaatctng 60 attttcagct catcactgac gaaaacggta aaaggaagct gaaggtggag gcctggttcg 120 gttctcggaa aacatccgcc gccattcgca ccgccctgag ccacgtggag aatctgatca 180 ccggcgtcac caagggctac cgctacaaaa tgaggttcgt ttatgcccat tttcccatca 240 acgcaagcat cggcaacgac aacaagtcta ttgagatcag aaatttcctt ggcgaaaaga 300 aggtacttta ctctcttcat ctctatttct tttaattart ttatttattt tcttaatctt 360 ttgctactag gaaataaatt gtgrtattag gtttagtgat tgatttgstt attacgtgta 420 tcattaggtg agaaaagtgg accttcttaa cggtgtttcc gttgttcgat ctgaaaaagt 480 taaagatgaa ttgattttgg atgggaacga cattgaactt gtttctaggt cctgtgctct 540 cattaaccag gtttaatctt tctmcatgcr catgtttcca tacaattttt tctcaatttt 600 ggtattggtt tagggtttaa ttaattgttt atttatttgt ttgttacaga aatgccatgt 660 taaaaagaag gatatcagga aatttctcga tggcatttat gttagtgaga 710 <210> 30 <211> 786 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Flanking SNP Marker <220> <221> misc_feature <222> (116)..(116) <223> n is a or c <400> 30 acagaatttc tgatcacact agccttgatt ttcactatct aaaacacatt tctttgtcct 60 acattctttc ctttcttcta ctcctcatct tgggtactca aactctcttc cctaanaagg 120 attacaaaaa caaaagtata tcgagttgtt agaaaaagca agaaatagaa actccacctc 180 tacaacgttt tcttaattgc gtccatgagc atcacttcct gcagttttgc ggttcaggta 240 acgaatgaca gcatcctcaa ccctgaagat attacaaaaa agaacacaaa caaattagaa 300 aatattttga caaaaaatat tatataatat tgtttgccct acatgacaca tatatcaatt 360 aaggattggg atgaaggggg ggcatacagc ctacagggta tccatgtcat aacttataat 420 ttctctgtat gataaataat ctatccaaca atttcatagt gaagccctat ggtattgtat 480 tacaattcct accagttgcc acttaagaat ggacacgcct gacacatcaa aatctgaaat 540 gaaatgtctt ggtttttttc tgagtcacgt tgtgtctaac acaagtgtct ggtatagatg 600 cagcttcttt tttatgtgta tgattgtcaa catattaaac tcccaacttt agcaagtaaa 660 tactcacatt caggtcacaa ccgtactaaa caaacaagtg tattatggat atatatacct 720 aacaacaaaa agagaaaagg tcaagtgtca tcataatgct taccatggtt gatgaagaat 780 cagaac 786

Claims (37)

  1. 서열 1을 포함하는 게놈을 포함하는 트랜스제닉(transgenic) 대두 식물.
  2. 등록 번호 PTA-10442 하에 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection) (ATCC)에 기탁된 대표 종자에 존재하는 바와 같은 AAD-12 이벤트 pDAB4468-0416을 포함하는 게놈을 포함하는 대두 종자.
  3. 서열 1을 포함하는 게놈을 포함하는 대두 종자.
  4. 서열 1을 포함하는, 제2항의 종자를 성장시킴으로써 생산된 대두 식물.
  5. AAD-12 이벤트 pDAB4468-0416을 포함하는, 제4항의 대두 식물의 자손 식물.
  6. 서열 1을 포함하는, 제1항의 대두 식물의 제초제-내성 자손 식물.
  7. 꽃가루, 배주, 꽃, 발아물(shoot), 뿌리 및 잎으로 구성된 군으로부터 선택되고, 서열 1을 포함하는, 제4항의 식물의 일부분.
  8. 서열 1의 잔기 1-2730 및 서열 1의 잔기 9122-10,212로 구성된 군으로부터 선택된 게놈 서열 내의 또는 이러한 게놈 서열이 플랭킹된 트랜스진 삽입물을 포함하는 트랜스제닉 대두 식물.
  9. 서열 1의 잔기 2720 내지 2740, 서열 1의 잔기 9112 내지 9132, 및 이들의 상보물로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 폴리뉴클레오티드.
  10. 서열 1을 포함하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 서열 1을 포함하는 제1 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배시켜 게놈을 포함하는 제3 대두 식물을 생산하는 단계, 및 상기 제3 대두 식물을 상기 게놈 내의 서열 1의 존재에 대해 평가하는 단계를 포함하는, 대두 식물을 육종하는 방법.
  12. 서열 1을 포함하는 제1 대두 식물을 제2 대두 식물과 교배시켜 게놈을 포함하는 제3 대두 식물을 생산하는 단계, 및 상기 제3 대두 식물을 상기 게놈 내의 서열 1의 존재에 대해 평가하는 단계를 포함하는, 제초제 내성 형질을 대두 식물 내로 유전자이입(introgression)하는 방법.
  13. 아릴옥시 알카노에이트 제초제를 제1항의 식물을 포함하는 필드(field)에 적용하는 단계를 포함하는, 잡초를 방제하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 제초제가 2,4-D; 2,4-DB; MCPA; 및 MCPB로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 방법이 제2 제초제를 상기 필드에 적용하는 단계를 포함하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 제2 제초제가 글리포세이트 및 디캄바로 구성된 군으로부터 선택되는 방법.
  17. 아릴옥시 알카노에이트 제초제를 필드에 적용하는 단계, 및 제초제를 적용하고 나서 14일 이내에 제3항의 종자를 상기 필드에 재식하는 단계를 포함하는, 잡초를 방제하는 방법.
  18. 샘플을 서열 1의 잔기 2720 내지 2740, 서열 1의 잔기 9112 내지 9132, 및 이들의 상보물로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드와 접촉시키는 단계; 및 DNA에 대한 상기 폴리뉴클레오티드의 혼성화에 대해 상기 샘플을 분석하는 단계를 포함하는, 대두 DNA를 포함하는 샘플 내의 대두 이벤트를 검출하는 방법.
  19. 샘플을
    a. 서열 1의 잔기 1-2730, 서열 1의 잔기 9122-10,212, 및 이들의 상보물로 구성된 군으로부터 선택된 플랭킹 서열에 결합하는 제1 프라이머; 및
    b. 서열 1의 잔기 2731-9121 또는 이의 상보물을 포함하는 삽입물 서열에 결합하는 제2 프라이머
    와 접촉시키는 단계; 상기 샘플을 중합효소 연쇄 반응에 적용하는 단계; 및 상기 제1 및 제2 프라이머들 사이에서 생성된 앰플리콘에 대해 분석하는 단계를 포함하는, 대두 DNA를 포함하는 샘플 내의 대두 이벤트를 검출하는 방법.
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  22. 제18항의 방법을 수행하기 위한 DNA 검출 키트로서, 서열 1의 잔기 2720 내지 2740, 서열 1의 잔기 9112 내지 9132, 및 이들의 상보물로 구성된 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, DNA 검출 키트.
  23. 제13항에 있어서, 상기 방법이 제초제-저항성 잡초를 처리하거나 예방하는데 사용되는 방법.
  24. 제13항에 있어서, 상기 제초제가 상기 식물을 재식하기 전에 적용되는 방법.
  25. 하나 이상의 제1항의 식물을 포함하는 구역에서 글리포세이트-저항성 잡초를 방제하는 방법으로서, 아릴옥시알카노에이트 제초제를 상기 구역의 적어도 일부분에 적용하는 단계를 포함하며, 상기 식물이 글리포세이트 내성 형질을 추가로 포함하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 제초제가 페녹시 옥신인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 상기 제초제가 글리포세이트와의 탱크 믹스(tank mix)로부터 적용되는 방법.
  28. 제13항에 있어서, 상기 잡초 중 하나 이상이 상기 식물 이외의 상이한 종의 글리포세이트-저항성 자생식물인 방법.
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