CN112375838A - 一种转基因甘蔗scag2的t-dna侧翼序列及其转化事件特异性鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转基因甘蔗SCAG2的T‑DNA侧翼序列及其转化事件特异性鉴定方法。所述的转基因甘蔗SCAG2的T‑DNA侧翼序列，其包含核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示的左侧翼序列和/或核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示的右侧翼序列。本发明首次扩增得到转基因甘蔗SCAG2外源基因插入位点的左右侧翼序列，以此序列为基础，建立了转基因甘蔗SCAG2的事件特异性检测方法，该方法特异性好，灵敏度高，转基因成分相对含量0.1％及以上时利用常规定性PCR方法即可检测，灵敏度远高于欧盟对转基因植物衍生的食品及饲料标识的0.9％的最低限量，为转基因甘蔗SCAG2的利用及产品检测提供关键技术基础。

Description

一种转基因甘蔗SCAG2的T-DNA侧翼序列及其转化事件特异性 鉴定方法

技术领域

本发明涉及转基因甘蔗领域，具体涉及一种转基因甘蔗SCAG2的T-DNA侧翼序列及其转化事件特异性鉴定方法。

背景技术

甘蔗(Saccharum spp.)是全球第五大宗农作物，是世界上最重要糖料和生物燃料作物。中国糖业协会数据显示：2020年全国种植甘蔗119.1万公顷，产糖量为841.9万吨，农业直接年产值约480亿人民币，因此甘蔗产业对国民经济经济具有重要的意义。然而甘蔗各种螟虫的为害，严重影响甘蔗的产量和质量，仅以湘桂蔗区为例，2018-2019年，该区的甘蔗虫害发生极为严重，平均螟害株率高达46.54％，平均产量损失为14.87％，平均蔗糖分损失高达1.12个百分点，农业损失4.67亿元，工业损失8.56亿元，国家财政损失0.51亿元。因此培育抗虫甘蔗新种质一直是甘蔗育种的一个重要目标，然而甘蔗是高度杂合的无性繁殖作物，其庞大的基因组、复杂的高多倍体以及同源异源杂交品种等复杂的遗传背景，给育种工作带来很大的盲目性。基因工程可以定向改变作物的某些性状，通过转基因技术提高甘蔗抗虫性将是甘蔗抗虫育种的重要新途径。

然而在转基因作物中，T-DNA在受体植物基因组中的整合位置都是随机的，每个转基因事件的T-DNA左右端序列与受体基因组序列拼接而成的T-DNA插入位点侧翼序列是唯一的，是该转基因事件身份的特异性标识。因此，分离转基因植物的T-DNA侧翼序列，以及依据该侧翼序列而建立的特异性检测方法，是准确识别不同转基因作物，实现转基因作物及其产品产权保护、检测和有效监督管理的一个重要依据。

目前分离外源T-DNA侧翼序列主要以PCR技术为基础，包括反向PCR、外源接头介导PCR、半随机引物PCR、全基因组重测序技术等，其中半随机引物PCR中的热不对称交错PCR(TAIL-PCR)、高效热不对称PCR(hiTAIL-PCR)或染色体步移法(Genome Walking)是当前使用最广泛的方法。利用此类技术已经成功分离了转基因水稻、大豆、棉花、玉米、小麦、马铃薯、油菜和木瓜等T-DNA侧翼序列，并建立其相应的转化事件特异性检测技术；全基因组重测序是近年发展起来的新技术，是对已知基因组序列的物种进行不同个体的基因组测序，该技术也成功应用到分离转基因作物大豆、水稻的T-DNA侧翼序列上，并建立其相应的转化事件特异性检测技术。转基因作物转化事件特异性检测技术是以其转基因T-DNA侧翼序列的部分序列为靶标进行扩增，扩增产物是T-DNA 5’端或3’端序列与受体基因组的拼接序列，因此具有高度特异性，可准确识别不同的转基因作物品系。

本研究组前期通过农杆菌介导把Cry1Ac-2A-gna抗虫融合基因转入甘蔗新台糖22号，经过2个无性繁殖世代的抗虫性和遗传稳定性的评价和深入农艺性状鉴定，已获得抗虫性好农艺性状优良的SCAG2株系，正准备进行下一阶段的环境释放试验。为了明确转基因甘蔗SCAG2的分子特征及便于其检测，推进其的生物安全性评价工作，本实验以其无性繁殖T2代为植物材料，首先利用Southern杂交检测外源T-DNA在SCAG2中的插入拷贝数；然后利用染色体步移技术分离其T-DNA侧翼序列，并根据T-DNA左右端序列和左右侧翼序列设计检测引物，建立转基因甘蔗SCAG2的转化事件特异性检测方法，同时检验该方法的特异性与灵敏度，为该转基因甘蔗及其衍生产品的检测和身份识别提供技术依据。

发明内容

本发明的目的是提供一种转基因甘蔗SCAG2的T-DNA侧翼序列及其转化事件特异性鉴定方法，所述T-DNA侧翼序列能够特异性地鉴定或辅助鉴定待测甘蔗是否为转基因甘蔗SCAG2。

本发明的第一个方面是提供一种转基因甘蔗SCAG2的T-DNA侧翼序列，其包含左侧翼序列和/或右侧翼序列，所述左侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述右侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的T-DNA侧翼序列在鉴定转基因甘蔗SCAG2中的应用。

优选地，根据本发明的第一个方面所述的T-DNA侧翼序列设计用于检测所述转基因甘蔗SCAG2的PCR引物。

本发明的第三个方面是提供根据本发明的第一个方面所述的T-DNA侧翼序列设计的PCR引物对，其含有根据左侧翼序列设计的引物对和/或根据右侧翼序列设计的引物对，其中，根据左侧翼序列设计的引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，根据右侧翼序列设计的引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

本发明第四个方面是提供一种PCR检测试剂盒，所述PCR检测试剂盒包括本发明的第三个方面所述的PCR引物对。

本发明第五个方面是提供如本发明的第三个方面所述的PCR引物对或本发明第四个方面所述的PCR检测试剂盒在鉴定转基因甘蔗SCAG2中的应用。

本发明的第六个方面是提供一种转基因甘蔗SCAG2的转化事件特异性鉴定方法，包括以下步骤：

(1)以待测甘蔗样品的DNA为模板，使用本发明的第三个方面所述的引物对或本发明第四个方面所述的PCR检测试剂盒进行PCR扩增；

(2)当本发明的第三个方面所述的引物对或本发明的第四个方面所述试剂盒含有根据左侧翼序列设计的引物对且获得440bp的PCR扩增产物，和/或

本发明的第三个方面所述的引物对或本发明的第四个方面所述的PCR检测试剂盒含有根据右侧翼序列设计的引物对且获得428bp的PCR扩增产物时，说明待测样品为转基因甘蔗SCAG2。

本发明利用southern杂交确定了转基因甘蔗SCAG2的外源基因的插入拷贝为单拷贝，利用染色体步移方法，首次扩增得到转基因甘蔗SCAG2外源基因插入位点的左右侧翼序列，以此序列为基础，建立了转基因甘蔗SCAG2的事件特异性检测方法，该方法特异性好，灵敏度高，转基因成分相对含量0.1％及以上时利用常规定性PCR方法即可检测，这一检测灵敏度远高于欧盟对转基因植物衍生的食品及饲料标识的0.9％的最低限量，为转基因甘蔗SCAG2的利用及产品检测提供关键技术基础。

附图说明

图1为pNUBG表达载体酶切位点及探针位置。

图2为pNUBG表达载体的T-DNA结构和特异性引物的位置。

图3为转基因甘蔗SCAG2 Southern Blot分析结果，其中，A：BG探针杂交；B：bar探针杂交；C：sta探针杂交；D：kan探针杂交；M：Marker；P：Kpn I酶切质粒；N：HindⅢ酶切非转基因甘蔗基因组；1：BamH I酶切；2：Nde I酶切；3：EcoRⅤ酶切；4：HindⅢ酶切。

图4为转基因甘蔗SCAG2左右侧翼序列的巢式PCR扩增结果，其中，A：左侧翼序列扩增；B：右侧翼序列扩增。M：DNA Marker；1：1st产物；2：2nd产物3：3rd产物。

图5为SCAG2左侧翼序列及拼接位置特征，其中，A：SCAG2左旁侧序列；下划直线(大写字母)：T-DNA载体序列(839～984bp)，其余：甘蔗基因组序列。B：T-DNA拼接位置特征；pUNBG：包括T-DNA左边界在内的载体序列；箭头：T-DNA转入甘蔗基因组时的断裂位置(小写字母)，箭头左边为载体非T-DNA区；椭圆框：T-DNA左边界核心序列；下划波浪线：T-DNA转入甘蔗基因组时缺失序列；SCAG2：左侧翼序列，小写字母为甘蔗基因组；方框：SCAG2与pUNBG的重叠载体序列。

图6为SCAG2右侧翼序列及拼接位置特征，其中，A：SCAG2右旁侧序列；下划直线(大写字母)：T-DNA载体序列(1～139bp)，其余(小写字母)：甘蔗基因组序列。B：T-DNA拼接位置特征；pUNBG：包括T-DNA右边界在内的载体序列；箭头：T-DNA转入甘蔗基因组时的断裂位置，箭头右边为载体非T-DNA区；椭圆框：T-DNA右边界核心序列；下划波浪线：T-DNA转入甘蔗基因组时缺失序列；SCAG2：右侧翼序列，小写字母为甘蔗基因组；方框：SCAG2与pUNBG的重叠载体序列。

图7为甘蔗SCAG2转化事件特异性PCR检测结果，其中，A：左、右侧翼特异性引物筛选，M：DNA Marker；1-3：右侧引物RS160/RA477、RS129/RA477、RS160/RA588扩增的PCR产物；4-5：左侧引物LS060/LA451、LS011/LA451、LS060/LA585扩增的PCR产物。B：转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗bar基因PCR检测；C：转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗左侧翼事件特异性PCR检测(引物LS011/LA451)；D：转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗右侧翼事件特异性PCR检测(引物RS160/RA588)，其中M：DNA Marker；1：表达载体质粒pUNBG；2：非转基因甘蔗ROC22；3-10：分别为转Cry1Ac-2A-gna基因甘蔗SCAG1、SCAG2、SCAG4、SCAG5、SCAG32、SCAG35、SCAG36和SCAG41。

图8为左、右侧翼特异性引物对PCR检测限度的测定结果，A：左边界特异性引物LS011/LA451对检测限度的测定，B：右侧翼特异性引物RS160/RA588对检测限度的测定；M：DNA Marker；1～8：转基因甘蔗SCAG2的DNA相对含量分别为100％、50％、10％、1％、0.5％、0.1％、0.05％和0％(非转基因甘蔗ROC22)。

具体实施方式

下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

1 材料与方法

1.1试验材料与试剂

植物材料为转Cry1Ac-2A-gna融合抗虫基因和bar抗除草剂基因的甘蔗SCAG2株系以及SCAG1、SCAG4、SCAG5、SCAG32、SCAG35、SCAG36和SCAG41，是针对甘蔗生产中鳞翅目、同翅目两大类主要害虫，利用具有自我剪切功能的连接多肽FMDV 2A序列将cry1Ac和gna两个不同抗虫机制的基因融合，得到cry1Ac-2A-gna抗虫融合基因，在玉米Ubi强表达启动子驱动下构建成植物表达载体pNUBG，再以bar基因为选择标记基因，通过农杆菌介导把cry1Ac-2A-gna基因转入甘蔗新台糖22号(ROC22)，而获得的甘蔗新品种，能抗螟虫绵蚜以及蛴螬等多种害虫。SCAG2、SCAG5株系已在海南省儋州进行中间试验，并已完成，现在海南省文昌市迈号镇乌鸡塘村农业部转基因植物及植物用微生物环境安全监督检验测试中心(海口)试验基地保存，为下一步的环境释放试验做准备。

植物表达载体以pCambia3300为骨架。PCR DIG Probe Synthesis Kit、Dignucleic acid detection kit购于德国罗氏公司；HyboodTM-N+尼龙膜购自美国GEAmersham；试剂LA Taq酶、Genome Walking Kit、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、T4 DNALigase、部分Marker购于TaKaRa公司；质粒提取、胶回收试剂盒及纯化试剂盒购于Axygen公司；氨苄青霉素，琼脂糖购于Sigma公司；2×Taq plus MasterMix购于Biosharp公司。PCR引物合成及基因测序由上海生工生物工程技术服务有限公司完成。其他试剂均为进口或国产分析纯。

1.2方法

1.2.1甘蔗SCAG2基因组DNA的提取

选择转基因甘蔗SCAG2的无性繁殖T2代植株的幼嫩叶片，采用改良CTAB法大量提取并纯化基因组总DNA，同时提取非转基因甘蔗ROC22基因组总DNA作为对照。取2μl于Thermo Scientific Nano Drop One生物核酸定量检测仪测定DNA的浓度和纯度，另取2μl于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。

1.2.2 Southern杂交检测

以转化质粒pNUBG为模板，利用高效PCR地高辛标记法分别制备BG(包括Cry1Ac-2a-gna中Cry1Ac基因下游355bp，2a和gna全长)、bar、sta、kan四种不同的探针，扩增引物、退货温度、产物长度等详见表1。通过分析T-DNA区的酶切位点，结合各探针在T-DNA上的位置(见图1)，分别选择两种限制性内切酶对30μg基因组DNA进行酶切后(不同探针对应的内切酶详见表1)，转移至HyboodTM-N+尼龙膜，再利用相应的探针，进行Southern杂交检测，具体步骤参照试剂盒说明书。杂交温度40℃，预杂交时间2小时，杂交时间16小时，室温黑暗条件下用BCIP/NBT进行化学显色，待杂交信号带清晰后终止显色，拍照并分析。

表1 PCR DIG探针制备所用引物和探针长度

1.2.3转基因甘蔗SCAG2的T-DNA左右侧翼序列的获取

按照Genome Walking Kit中的要求，在表达载体pNUBG的T-DNA左右端序列分别设计3条退火温度约为65℃的嵌套特异性引物，分别命名为Lsp1、Lsp2、Lsp3和Rsp1、Rsp2、Rsp3，位置见图2，序列见表2。按试剂盒的操作说明，分别选取试剂盒中提供的随机简并引物AP1、AP2、AP3、AP4其中之一，与嵌套特异性引物组合配对，进行三轮巢式PCR扩增分离该株系的T-DNA左右侧翼序列。第一轮反应体系中，SCAG2基因组DNA模板为200ng，特异性引物为Lsp1或Rsp1，简并引物为AP1-AP4其中之一。第二PCR反应的扩增模板为稀释50倍的上一轮PCR产物，特异性引物为Lsp2或Rsp2，简并引物为第一轮所用的AP引物，第三轮同第二轮，特异引物换成Lsp3或Rsp3，每一轮反应的退火温度详见表2，扩增程序参照试剂盒说明书。三轮扩增产物于用1.0％琼脂糖凝胶电泳分离，第三轮特异扩增片段利用DNA胶回收试剂盒回收。连接T载体，转化大肠杆菌DH5α，送阳性菌株至上海生工测序。

表2巢式PCR反应所需要的特异性引物

1.2.4转基因甘蔗SCAG2事件特异性PCR检测及其灵敏度

SCAG2事件特异性PCR检测的建立：根据T-DNA左、右两侧翼序列的测序结果以及已知的T-DNA左右端载体序列分别设计三对左、右侧特异性检测引物：LS060/LA451、LS011/LA451、LS060/LA585和RS160/RA477、RS129/RA477、RS160/RA588，对转基因甘蔗SCAG2进行扩增，分别筛选一组左、右特异性检测扩增效率最好的，并回收纯化特异性片段及测序，比对是否与预期序列完全一致，最终建立事件特异性检测方法。特异性检测引物的一条引物位于甘蔗基因组序列，另一条引物则位于T-DNA左、右端载体序列，引物序列详见表3。分别利用上述筛选的两对引物和bar基因引物，以包括SCAG2在内的转Cry1Ac-2a-gna基因的不同甘蔗株系和非转基因甘蔗DNA为模板，表达载体pUNBG质粒为对照，进行转化事件特异性PCR检测。DNA模板量为200ng，反应循环数35，退火温度见表3。PCR产物取5μL于1.0％琼脂糖凝胶电泳检测扩增效率和扩增特异性。

表3 SCAG2事件特异性PCR检测引物

检测转化事件特异性PCR的灵敏度：转基因甘蔗SCAG2与受体甘蔗ROC22(新台糖22号)的基因组DNA分别稀释至100ng/μL，根据不同的比例配制SCAG2的DNA相对含量为100％、50％、10％、1％、0.5％、0.1％、0.05％和0％(V/V)的样品。混合样品取各1μL作为PCR模板，分别利用上述已筛选出来的扩增效率最高的左、右特异性引物对，进行PCR扩增。取5μL PCR产物，用1.0％琼脂糖凝胶电泳，检查各浓度DNA模板下的扩增效果，检测各引物对的事件特异性PCR的特异性和灵敏度。

2结果与分析

2.1抗虫转基因甘蔗SCAG2外源T-DNA插入拷贝数检测

转基因甘蔗SCAG2基因组DNA分别用BamHI、Nde I、EcoRV限制性内切酶进行酶切、电泳和转膜后，利用地高辛标记的外源基因BG和bar片段的探针分别进行Southern杂交检测，结果表明，不同的限制性内切酶后的甘蔗基因组DNA经BG和bar探针杂交后，均只显示一条杂交带，并且杂交带的大小与预测理论大小一致，而对照非转基因植株中无杂交信号，说明外源基因已整合到甘蔗SCAG2基因组中并以单拷贝的方式整合(图3)；用载体骨架序列制备的sta和kan探针进行Southern杂交，结果表明转基因甘蔗基因组中没有来源于转化载体的其他元件以及骨架序列。

表4 SCAG2 Southern Blot杂交带大小的理论值

2.2 T-DNA左、右侧翼序列的获得及分析

三条左侧巢式特异性Lsp引物分别与试剂盒中AP1-AP4四条简并引物组合，经过三轮热不对称巢式PCR反应后，电泳结果显示，特异性引物与简并引物AP3扩增出的片段更长且特异性更好，如图4-A。回收3rd产物，送上海生工测序，获得984bp的序列，如图5-A，其中838bp属于甘蔗基因组序列，此部分GC百分含量为48.69％；剩余146bp与T-DNA左边载体序列重合，并发现最左边缺失了包括LB border在内115bp，见图5-B。

三条右侧巢式特异性Rsp引物同样分别与试剂盒中AP1-AP4四条简并引物组合扩增右侧翼序列，结果显示，简并引物AP1扩增出的片段特异性更好，如图4-B。测序获得705bp的序列，如图6-A。其中566bp为甘蔗基因组序列，GC百分含量为50.71％，余下139bp属于T-DNA右边界载体序列，T-DNA插入SCAG2株系基因组时，右边比较完整，仅缺失了2个碱基，见图6-B。由此可见，T-DNA序列插入时，左右两侧的都有不同程度的缺失，整体而言左边相对容易缺失。

2.3建立转基因甘蔗SCAG2事件特异性检测方法

使用左、右端三对特异性检测引物LS060/LA451、LS011/LA451、LS060/LA585和RS160/RA477、RS129/RA477、RS160/RA588，对转基因甘蔗SCAG2进行扩增，扩增效率最好的左、右特异性检测引物对分别是LS011/LA451和RS160/RA588，见图7-A。以转相同基因的转基因甘蔗株系和非转基因甘蔗为模板，分别利用上述两对扩增效率最好引物和bar基因引物进行事件特异性检测。结果显示，使用特异性检测引物的扩增产物中，只在转基因甘蔗SCAG2可以扩增到大小为440bp(左侧翼)和428bp(右侧翼)的特异性条带，其他转基因株系和非转基因材料扩增均为阴性(图7-C、D)；而使用bar基因引物的扩增产物中，表达载体质粒和转基因各株系都能扩增到约423bp的特异性片段，只有非转基因甘蔗扩增结果为阴性(图7-B)。SCAG2扩增到的440bp和428bp的特异性片段回收后，测序，经比对证实与预期序列完全一致。证明LS011/LA451和RS160/RA588这对引物可以特异的识别转基因甘蔗事件SCAG2。

2.4事件特异性PCR检测的灵敏度

利用LS011/LA451和RS160/RA588这两对引物检测事件特异性PCR在不同SCAG2DNA含量混合样品中的扩增限度。结果发现，以左侧引物LS011/LA451扩增时，当SCAG2的DNA相对含量降低至0.1％时，仍然可以特异地扩增到目的片段(图8-A)；以右侧引物RS160/RA588扩增时，当SCAG2的DNA相对含量降低至10％、1％和0.5％时，除了目的片段，还出现了非特异片段的扩增；当SCAG2的DNA相对含量降低至0.1％及更低时，只有非特异片段的扩增(图8-B)。以上结果表明以右侧引物RS160/RA588为引物的事件特异性PCR检测的特异性和灵敏度较差，而以左侧引物LS011/LA451为引物的事件特异性PCR检测的特异性好和灵敏度高，最低检出值达100ng/ul DNA模板浓度的0.1％，按甘蔗基因组为10Gb计算，相当于9个单倍体基因组拷贝数，该灵敏度可满足事件特异性检测的要求。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种转基因甘蔗SCAG2的T-DNA侧翼序列及其转化事件特异性鉴定方法

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 984

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 1

acgggattcg aagcctggga taggacacaa gacaatgatg acgtcaaaat tcactgaaat 60

gattcaggga tcaatgcggg caatgcgatg ctgggcagcg tccaatcatc gtatgttcca 120

ccaatcaaaa gcaagcaaac aagacatcta caacacaatg catgtctgat gacgcaagaa 180

gctagttgag aatttatatg tacagagtac atcaacacca ggagcatact tgatctccac 240

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ctacttggct gcggtcaccg actactcaac cgtattgatc aagtactcgc cgcagtttcg 360

actactcggt cgtggtgtcc gactactcgg aaacgaagct caagctgatg ctcgggggct 420

cctaatcgta aaagcgccag gatcacatgc caatcggcca tgaatcaagc taagtcaagc 480

attcatattt tttctaaata ttctttaata tttatatatc tccggatgtt atttatgtgc 540

ctccgcggac ataccatatg cttgtgacta cttacagctc cgcgcttgaa gtcggaacag 600

ttttcgagta ctcgacgaca cgtttcgggt actcgacaac tttcgggtac tcgacgacgg 660

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gacttccgga tgttcgacga tgactttcgg gtactcgatg atgacttccg gttgctcgac 780

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ggattttggt tttaggaatt agaaatttta ttgatagaag tattttacaa atacaaatac 900

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cttatctggg aactactcac acat 984

<210> 2

<211> 705

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 2

tcgccagctg gcgtatggcg aagaggcccg cagcgatggc ccttcccaac agtggcgcag 60

cctgaatggc gaaggctaga gcagcttgag cttggatcag attgtcgttt cccgccttga 120

gtttaaacta tcagtgtttc gacatcaagc tagccaaaat attgaaatat tacggcttga 180

cttacttgta catgctgatg acgcaaggaa acaattctgg tcaagagtca agcatgtaca 240

tggttacgta tcagccaaca agcaagcaac gaagaaaccc gcacaagcta atcggatgct 300

ttcccatact actcgtctca gccaggaact actcagaacg cgtcctccag agcgaccgac 360

tacttggaaa gcagttctga caactcggtc acggcggctg acccctctgc tgcggtgtcc 420

gattactcgg ccgtggtgac caactactcg aatacaacac cagctactca ggctccatag 480

caactcagac atgaagatta ttgactacta ctcggatcag cactcggtgg ataggattcc 540

agccgggctc ccgaccccga tgcgtcctca tagagcattc gactacaagc taacaaatga 600

ccagtacaaa cgacgagagg accctatact cgtacagagc caagatacat gcaagacaac 660

accaaactcg acagagccag ggtttcctcg agggacaggg agggg 705

<210> 3

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 3

tatgtgtgag tagttcccag ataagg 26

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 4

gcggacatac catatgcttg tgac 24

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 5

gtgactggga aaaccctggc gtt 23

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<400> 6

gtgaccgagt tgtcagaact gctt 24

Claims (7)

1.一种转基因甘蔗SCAG2的T-DNA侧翼序列，其特征在于，其包含左侧翼序列和/或右侧翼序列，所述左侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，所述右侧翼序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

2.权利要求1所述的T-DNA侧翼序列在鉴定转基因甘蔗SCAG2中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，根据权利要求1所述的T-DNA侧翼序列设计用于检测所述转基因甘蔗SCAG2的PCR引物。

4.根据权利要求1所述的T-DNA侧翼序列设计的PCR引物对，其特征在于，其含有根据左侧翼序列设计的引物对和/或根据右侧翼序列设计的引物对，其中，根据左侧翼序列设计的引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示，根据右侧翼序列设计的引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。

5.一种PCR检测试剂盒，其特征在于，所述PCR检测试剂盒包括权利要求4所述的PCR引物对。

6.如权利要求4所述的PCR引物对或权利要求5所述的PCR检测试剂盒在鉴定转基因甘蔗SCAG2中的应用。

7.一种转基因甘蔗SCAG2的转化事件特异性鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)以待测甘蔗样品的DNA为模板，使用权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的PCR检测试剂盒进行PCR扩增；

(2)当权利要求4所述的引物对或权利要求5所述的PCR检测试剂盒含有根据左侧翼序列设计的引物对且获得440bp的PCR扩增产物，和/或

权利要求4所述的引物对或权利要求5所述试剂盒含有根据右侧翼序列设计的引物对且获得428bp的PCR扩增产物时，说明待测样品为转基因甘蔗SCAG2。

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