KR101288403B1 - 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검정 방법 - Google Patents

해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검정 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검정 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브는 해충 저항성 벼의 계통을 특이적으로 검출하는 것이 가능하고, 해충저항성 Bt 벼 및 이를 모본으로 하는 파생 품종에 대한 검정이 가능하므로 육종 모본 확인에 활용할 수 있으며, 특히 농산물 및 식품 중에서 해충 저항성 벼를 정성적, 정량적으로 검정함으로써 GMO 농작물 판별에 이용할 수 있다.

Description

해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검정 방법{Primers and probes for detecting insect resistance characteristic genetically modified organism and detecting method using the same}
본 발명은 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 프라이머, 프로브 및 이들을 이용하여 해충 저항성 유전자 변형 농작물을 검정하는 방법에 관한 것이다.
유전자 변형 농산물(GMO: Genetically Modified Organism)이란 기존의 작물육종에 의한 품종 개발과는 달리, 동식물 또는 미생물의 유용 유전자를 인공적으로 분리, 결합시켜 생산성이 증가 되도록 한 생물체를 총칭하는 것이다. 일반적으로 유전자 변형 농산물의 생산성을 증가시키기 위하여 제초제 저항성, 내충성, 내병성, 내한성 등에 관련된 유전자를 농산물에 도입하고 있다.
유전자 변형(GM, genetically modified) 작물은 1994년에 토마토가 처음으로 미국에서 상업화 되었고, 1996년부터는 GM 옥수수와 콩이 미국, 캐나다 및 아르헨티나에서 재배되기 시작하였다. 그 후 세계의 여러 나라들이 GM 농작물의 재배를 시작하여 2009년 기준, GM 농작물을 재배하는 나라는 25개국으로 증가하였고, 그 재배면적도 1억3,400만 헥타르로 전 세계 작물재배 면적의 9%를 차지하고 있다(James 2009). 한편, 유전자변형작물의 상업화를 위해서는 환경위해성, 인체 및 식품안정성평가가 요구되고 있고, 개발자는 유전자변형작물의 안전성 측면에서 다양한 검출 마커를 개발하고 있으며, 유전자변형 농산물을 수입하는 관련 국가에서는 유전자변형 농산물과 식품의 표시에 실질적으로 적용에 가능한 검사법을 개발하고 있다.
유전자변형 농산물을 확인 방법은 유전자변형체의 단백질을 검출하는 방법과 DNA를 검출하는 방법이 있다.
단백질을 이용한 검정방법은 도입유전자에 의해서 생산된 단백질에 특이적으로 인지하는 항체단백질을 이용하는 원리로, 검출지(strip) 키트와 효소면역학적 방법(Enzyme Linked Immunosobent Assay, ELISA) 등이 이에 속하고 있다. 그러나 단백질의 발현양은 유전자변형작물에 따라 다르고, 검사체의 상태, 즉 보관상태 또는 가공품의 경우 가공과정에서 가열 등의 처리에 의해 단백질이 파괴될 수 있어 검정에 한계가 있다.
DNA를 이용한 분석방법은 핵산중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)에 의한 검정법으로 현재 가장 보편화 되어 있으며, 유전자 변형체로부터 DNA를 분리하고 도입유전자에 대하여 상보적인 염기를 갖는 특이 프라이머를 이용하여 검출하는 원리이다.
한편, 세계적으로 다수의 유전자변형작물이 상업화되어 있고 유전자작물의 개발에 많은 노력이 이루어지고 있으나, 국내에서는 아직 상업화된 유전자변형작물은 없고, 최근에 국내 주요작물을 대상으로 실용화 추진을 진행하고 있다. 유전자변형작물의 상업화를 위해서는 유전자변형작물의 용도에 따라 환경 및 인체에 미치는 영향과 유전자변형에 관한 전문적이고 세부적인 내용을 포함하는 자료를 제출해야 한다. 환경 및 인체 안전성평가심사 자료에는 유전자변형작물의 안전성 확보 및 농산물 유통에 따른 이력추적을 위해서 검정할 수 있는 검출법의 제시가 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은 해충 저항성 농작물을 정성 및 정량적으로 검출할 수 있는 방법을 찾기 위해 연구를 거듭한 결과, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하면 해충 저항성 유전자 변형 농작물을 정성적으로 검정할 수 있을 뿐만 아니라, 정량적인 검정도 가능함을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정법을 개발하기 위한 것으로서, 유전자 변형 농작물의 내재유전자, 도입유전자 및 도입유전자의 게놈내 인접염기서열을 바탕으로 특이 프라이머 및 프로브를 제작하여 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 정성적, 정량적 분석에 활용 가능함을 확인함으로써 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 위와 같은 과제를 달성하기 위해 다음과 같은 과제 해결 수단을 제공한다.
1. 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 35sBr 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 TaCry2 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 CrRB 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물.
2. 위 1에 있어서 해충 저항성 유전자 변형 농작물은 해충 저항성 Bt 벼인 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 위 2에 있어서, 상기 해충 저항성 Bt 벼는 CryIAc1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 낙동벼인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 위 3에 있어서, 상기 해충 저항성 Bt 벼의 계통은 C7-1-9-1인 것을 특징으로 하는 조성물.
5. 위 1에 있어서, 상기 조성물은 내재유전자 검출용 프라이머를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 위 4에 있어서, 상기 내재유전자 검출용 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 RBEgh 프라이머 세트인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 DNA 단편을 주형으로 하여, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 35sBr 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 TaCry2 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 CrRB 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물 및 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 RBEgh 프라이머 세트로 증폭된 내재유전자 PCR 증폭 산물을 포함하는 플라스미드.
8. 위 7에 있어서, 상기 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 13의 염기서열, 서열번호 2의 염기서열과 상보적 염기서열, 서열번호 15의 SmaI/SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열, 서열번호 7의 염기서열, 서열번호 14의 염기서열, 및 서열번호 8의 염기서열과 상보적 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 플라스미드.
9. 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 35sBr 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 TaCry2 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 CrRB 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트와 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 표시되는 TaEsRB 프로브를 포함하는, 실시간(Real Time) PCR을 위한 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물.
10. 위 9에 있어서, 내재유전자 검출용 프라이머 세트 및 프로브로서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 RBEgh 프라이머 세트 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 TaRBE4 프로브를 추가로 포함하는 조성물.
11. 위 1 또는 위 9를 포함하는 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 키트.
12. 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 35sBr 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 TaCry2 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 CrRB 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 사용하여, 해충 저항성 유전자 변형 농작물을 검정하는 방법.
13. 위 12에 있어서, 상기 35sBr 프라이머 세트는 35S::bar 검출, 상기 TaCry2 프라이머 세트는 Cry1Ac1 유전자 검출, 상기 CrRB 프라이머 세트는 라잇 보더(right border, RB) 인접서열 부위 검출, 그리고 상기 CrLB2 프라이머 세트는 레프트 보더(left border, LB) 인접서열 부위 검출을 위한 것임을 특징으로 하는 방법.
14. 위 12에 있어서, 녹말분지효소(starch branching enzyme rbe4, RBE4) 검출을 위한 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 RBEgh 프라이머 세트를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
15. 위 12에 있어서, 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 표시되는 TaEsRB 프로브를 추가로 포함하여 실시간 PCR 방법에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
16. 위 15에 있어서, 내재유전자 검출용 프라이머 세트 및 프로브로서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 RBEgh 프라이머 세트 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 TaRBE4 프로브를 추가로 포함하여 실시간 PCR 방법에 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 방법.
17. (a) 위 7의 플라스미드를 카피수 별로 희석하여 DNA 표준물질로 하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 표준물질을 주형으로 위 10의 조성물을 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 유전자 카피수를 나타내는 표준곡선을 작성하는 단계;
(c) 해충 저항성 유전자 변형 농작물로부터 수득한 DNA를 주형으로 위 10의 조성물을 사용하여 실시간 PCR을 수행하고 그 반응 결과를 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 산출하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 산출한 유전자 카피수를 계산식 1에 대입하여 보정계수를 산출하는 단계;
(e) 대상 농작물 시료 또는 이의 가공품으로부터 수득한 DNA를 주형으로 위 10의 조성물을 사용하여 실시간 PCR을 수행하고 그 반응 결과를 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 산출하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 산출한 유전자 카피수를 계산식 2에 대입하여 유전자 혼입율을 측정하는 단계;를 포함하는 대상 농작물 시료 내 도입유전자의 혼입율 정량방법
(계산식 1)
보정계수 = 도입유전자 또는 도입유전자 삽입 인접서열 부위 카피수/내재유전자 카피수
(계산식 2)
도입유전자 도입율(%) =(도입유전자 또는 도입유전자 삽입 인접서열 부위 카피수/내재유전자 카피수)/보정계수 X 100
본 발명에 따른 프라이머 및 프로브는 해충 저항성 농작물을 특이적으로 검출하는 것이 가능하고, 특히 해충저항성 Bt 벼 및 이를 모본으로 하는 파생 품종에 대한 검정이 가능하므로 육종 모본 확인에 활용할 수 있다. 따라서, 농산물 및 식품 중에서 해충 저항성 유전자 변형 농작물을 정성적, 정량적으로 검정하여 GMO 농작물 검정에 이용할 수 있다.
(도 1)은 해충 저항성 유전자 변형 Bt 벼에 도입된 CryIAc1 유전자 및 발현 조절부를 나타낸 모식도이다.
(도 2)는 해충 저항성 Bt 벼, 천연형 벼 C7-1-9-1 계통 및 다양한 작물에 대한 프라이머의 특이성을 확인한 전기영동사진이다(사용한 프라이머 조합: RBEgh-1/2, 35sBr-1/2, TaCry2-1/2, CrRB-1/2 및 CrLB2-1/2). M: 100pb DNA ladder, N: no sample, 1. 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1, 2: 낙동벼, 3: 화영벼, 4: 배추, 5: 고추, 6: 감자, 7: 상추, 8: 콩, 9: 들깨, 10, 토마토, 11: 멜론, 12: 완두, 13: 피망, 14: 고구마
(도 3)은 해충 저항성 Bt 벼 및 71개의 천연형 벼 품종에 대한 프라이머의 특이성을 확인한 PCR 결과이다(사용한 프라이머 조합: RBEgh-1/RBEgh-2, 35sBr-1/35sBr-2, TaCry2-1/TaCry2-2, CrRB-1/CrRB-2 및 CrLB2-1/CrLB2-2). M: 100pb DNA ladder, N: no sample, Cr7-1: 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1, Rice Varieties: 순서대로, 간척벼, 계화벼, 그루벼, 금남벼, 금오벼, 금호1호, 금호2호, 낙동벼, 남감벼, 남원벼, 남천벼, 남평벼, 내풍벼, 농안벼, 다산벼, 대립1호, 대산벼, 대안벼, 대야벼, 대진벼, 대청벼, 동안벼, 동진벼, 동해벼, 둔내벼, 만금벼, 봉광벼, 삼백벼, 상산벼, 상주벼, 상주찰벼, 삼천벼, 서안벼, 서진벼, 소백벼, 신선찰벼, 신운봉벼, 장안벼, 조령벼, 주안벼, 중화벼, 진부벼, 진부올벼, 진부찰벼, 진미벼, 청명벼, 추청벼, 아랑향찰, 안산벼, 안중벼, 양조벼, 영남벼, 영해벼, 오대벼, 오봉벼, 운봉벼, 운장벼, 일미벼, 화남벼, 화동벼, 화서벼, 화선찰벼, 화성벼, 화신벼, 화영벼, 화중벼, 향남벼, 향미1호, 향미2호, 탐진벼, 팔공벼
(도 4)는 특이 프라이머를 이용하여 다양한 해충 저항성 벼 계통에서의 단일 PCR 및 다중 PCR 분석결과이다(사용한 프라이머 조합: RBEgh-1/RBEgh-2, 35sBr-1/35sBr-2, TaCry2-1/TaCry2-2, CrRB-1/CrRB-2, CrLB2-1/CrLB2-2, CrRB-1/CrRB-2와 RBEgh-1/RBEgh-2 및 CrLB2-1/CrLB2-2와 RBEgh-1/RBEgh-2). M: 100pb DNA ladder, B: no sample, N1: 낙동벼, N2: 화영벼, Cr7-1: 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1, 103: 해충 저항성 벼 103-1, 127: 해충 저항성 벼 127-1, HCr3-8: 해충 저항성 벼 HCr3-1, HCr4-1, HCr5-1, HCr6-1, HCr7-1 및 HCr8-1(상기 해충 저항성 벼들은 해충 저항성 Bt 벼와 동일한 도 1의 식물형질전환 운반체를 사용하여 낙동벼 및 화영벼에 형질전환하여 얻어진 계통)
(도 5)는 해충 저항성 Bt 벼의 후대에서의 유전자 특이 및 계통특이 프라이머를 이용하여 PCR한 결과로 후대에서도 도입유전자가 벼 식물체내에 안정적으로 유지되고 있음을 확인한 결과이다(사용한 프라이머 조합: TaCry2-1/TaCry2-2, CrRB-1/CrRB-2, CrLB2-1/CrLB2-2). M: 100pb DNA ladder, B: no sample, N: 낙동벼, T1: Cr7-1의 T1 세대의 개체, T2: C7-1의 T2 세대의 개체들, T3: C7-1의 T3 세대의 개체들, T4: C7-1의 T4 세대의 개체들, T5: C7-1의 T5 세대의 개체들
(도 6a)는 RBEgh-1과 RBEgh-2로 증폭된 PCR 산물의 염기서열 및 상동성 분석 결과이다.
(도 6b)는 35sBr-1과 35sBr-2로 증폭된 PCR 산물의 염기서열이다.
(도 6c)는 TaCry2-1과 TaCry2-2로 증폭된 PCR 산물의 염기서열 및 상동성 분석 결과이다.
(도 6d)는 CrRB-1과 CrRB-2로 증폭된 PCR 산물의 염기서열이다.
(도 6e)는 CrLB2-1과 CrLB2-로 증폭된 PCR 산물의 염기서열이다.
(도 7)은 RBEgh-1 및 RBEgh-2 프라이머로 증폭된 산물 및 CrRB-1 및 CrRB-2 프라이머로 증폭된 PCR 산물을 삽입하여 해충 저항성 Bt 벼의 정량분석용 표준플라스미드 pRBECrR을 제작하는 과정을 모식화한 그림이다.
(도 8)은 해충 저항성 Bt 벼의 정량분석용 표준플라스미드 pRBECrR의 상세 모식도(A)와 pRBECrR에 삽입한 DNA 단편의 염기서열, 상기 4종의 프라이머(RBEgh-1/RBEgh-2 및 CrRB-1/CrRB-2) 및 2종의 프로브(TaRBE4 및 TaEsRB)(B)를 나타낸 pRBECrR에 삽입된 DNA 단편의 염기서열이다.
(도 9a)는 RBEgh-1 및 RBEgh-2 프라이머와 TaRBE4 프로브로 실시간 PCR을 수행하여 벼 내재유전자 RBE4를 특이적으로 검정한 정량곡선을 나타낸 결과이다.
(도 9b)는 CrRB-1 및 CrRB-2 프라이머와 TaEsRB 프로브로 실시간 PCR을 수행하여 해충 저항성 Bt 벼의 도입유전자의 삽입 인접서열 부위를 특이적으로 검정한 정량곡선을 나타낸 결과이다.
본 발명은 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 프라이머, 프로브 및 이를 이용한 검정 방법에 관한 것으로서 보다 상세하게는 해충 저항성 벼의 검정을 위하여 벼 내재유전자, 외래 도입유전자 및 외래 도입유전자의 인접 염기서열을 특이적으로 검출할 수 있는 프라이머 및 프로브와 이들을 이용하여 해충 저항성 유전자 변형 농작물을 검정하는 방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다.
상기 본 발명의 프라이머는 RFLP(restriction fragment length polymerphism), RAPD(randomly amplified polymorphic DNA), DAF(DNA amplification fingerprinting), AP-PCR(arbitrarily primed PCR), STS(sequence tagged site), EST(expressed sequence tag), SCAR(sequence characterized amplified regions), ISSR(intersimple sequence repeat amplication), AFLP(amplified fragment length polymorphism), CAPS(cleaved amplified polymorphic sequence), PCR-SSCP(single-strand conformation polymorphism) 등과 같이 당업계에 공지된 다양한 DNA 분석에 적합하도록 디자인될 수 있다.
본 발명의 대상 농작물의 시료에서 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용하는 것이 가능하며, 예를 들면, wizard prep 키트(Promega)를 이용할 수 있다. 상기 분리된 DNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 프라이머 세트를 이용하여 증폭 반응을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 표적 핵산을 증폭하는 방법은 중합효소연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(ligase chain reaction), 핵산 서열 기재 증폭(nucleic acid sequence-based amplification), 전사 기재 증폭 시스템(transcription-based amplification system), 가닥 치환 증폭(strand displacement amplification) 또는 Qβ 복제효소(replicase)를 통한 증폭 또는 당업계에 알려진 핵산 분자를 증폭하기 위한 임의의 기타 적당한 방법이 가능하다.
이 중에서, '중합효소 연쇄반응(PCR)'이란 중합효소를 이용하여 표적 핵산에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍으로부터 표적 핵산을 증폭하는 방법이다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.
PCR 방법은 정성적인 방법과 정량적인 검출방법으로 나눌 수 있고, 정성적인 PCR 방법은 구체적으로 screening, 유전자 특이적(gene-specific), 구조 특이적(construct-specific) 및 계통 특이적(event-specific) PCR 검출법으로 구분된다. Screening PCR법은 유전자 변형 작물의 개발 시기부터 현재까지 보편적으로 이용되어진 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터와 같은 유전자를 검지하여 확인하는 방법이고, 유전자 특이적 및 구조 특이적 PCR 방법은 도입된 목적 유전자의 특정 부분을 증폭시켜 검지하는 PCR 방법이다. 유전자 특이적 및 구조 특이적 방법은 변형된 유전자 및 구조가 같은 형질전환 운반체가 이용됐을 때, 유전자 변형체의 계통 간의 구별에 어려움이 있다는 단점을 가지고 있다(Taverniers et al. 2005; Pan et al. 2006). 이러한 단점을 해결하기 위해 최근에는 계통 특이적인 PCR 방법이 이용되고 있으며, 이는 식물 게놈 내 도입유전자가 삽입된 부위의 인접 부위의 염기서열을 바탕으로 상보적인 프라이머를 작성하여 유전자 변형 작물을 동정하는 방법으로, 식물체 내 삽입된 인접서열의 분석 및 도입유전자의 카피수의 확인이 선행되어야 하는 번거러움이 있으나, 검사하고자 하는 계통의 특정 염기부위를 이용하기 때문에 동일한 형질전환 운반체를 갖는 계통이더라도 상보적 염기서열을 갖는 계통만을 특이적으로 구분하여 검출할 수 있다. 이는 동일 운반체로 형질전환이 이루어져도 식물체 게놈 내에 삽입되는 위치가 달라지기 때문에 특이 프라이머에 의한 비목적 계통은 PCR 증폭이 이루어지지 않는다는 점을 이용한 것이다. 따라서 이 방법은 유전자변형 개체의 후대 교배로 다형질을 갖는 개체에서 모본 계통을 쉽게 파악할 수 있고, 유전자변형 농산물을 비교적 안정적으로 검정할 수 있는 장점을 가지고 있다(Berdal and Holst-Jensen 2001; Pan et al. 2006). 상기 정성 PCR법은 단백질 검출방법과는 달리 도입유전자를 특이적으로 증폭하는 기술을 바탕으로 하기 때문에 원료 농산물뿐만 아니라 가공품에서도 안정적으로 검출이 가능하다.
유전자 변형 농산물의 정량분석법으로 최근 실질적으로 이용되고 있는 검출법은 실시간 PCR(real-time PCR)법을 들 수 있다. 실시간 PCR법은 특이 프라이머와 형광물질이 연결된 프로브를 이용하여 PCR 증폭시 프로브로부터 형광체가 해리되어 형광발색의 양을 측정하는 원리이다. 실시간 PCR법은 정성 PCR법과 같이 도입유전자의 특정 DNA를 검출하는 점은 동일하나, 식물의 내재유전자를 바탕으로 검출 유전자의 비를 측정하기 때문에 정량적으로 도입유전자의 양을 분석할 수 있는 장점이 있다. 실질적으로 실시간 PCR법은 유전자변형 농산물의 혼입률 및 식품 가공품의 유전자 변형체의 정량검정에 이용되고 있다.
본 발명에 있어서, 증폭된 표적 서열은 검출가능한 표지 물질로 표지될 수 있다. 일 구현예에서, 상기 표지 물질은 형광, 인광 또는 방사성을 발하는 물질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 방사성 물질을 이용한 표지는 PCR 수행시 32P 또는 35S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하면 증폭 산물이 합성되면서 방사성이 증폭 산물에 혼입되어 증폭 산물이 방사성으로 표지될 수 있다. 표적 서열을 증폭하기 위해 이용된 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트는 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 35sBr 프라이머 세트, 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 TaCry2 프라이머 세트, 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 CrRB 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 포함하는 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물에 관한 것이다.
또한, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 35sBr 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 TaCry2 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 CrRB 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트를 사용하여, 해충 저항성 유전자 변형 농작물을 검정하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열을 갖는 352Br 프라이머 세트는 35S::bar 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있으며, 서열번호 5 및 서열번호 6으로 표시되는 TaCry2 프라이머 세트는 mCry1Ac1 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있으며, 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 CrRB 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트는 해충 저항성 농작물의 경우에만 특이적으로 각각 right border (RB) 인접서열 부위와 left border (LB) 인접서열 부위를 특이적으로 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 프라이머 세트를 이용하여 PCR한 결과 도입유전자 비형질전환 식물체에서는 증폭 산물을 확인할 수 없었으며, 특히 서열번호 7 및 서열번호 8로 표시되는 CrRB 프라이머 세트 및 서열번호 9 및 서열번호 10으로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트를 이용하여 PCR한 결과 해충 저항성 Bt 벼 중에서도 C7-1-9-1에서만 증폭 산물을 확인할 수 있었다.
상기 해충 저항성 농작물은 해충에 저항성을 가질 수 있도록 유전자 변형된 작물로서 상기 해충 저항성 농작물은 혹명나방에 저항성을 가지는 벼가 가장 바람직하다. 상기 혹명나방에 저항성을 가지도록 도입되는 도입유전자는 가장 바람직하게는 CryIAc1 유전자이다. 또한, 상기 벼에는 예를 들어 간척벼, 계화벼, 그루벼, 금남벼, 금오벼, 금호1호, 금호2호, 낙동벼, 남감벼, 남원벼, 남천벼, 남평벼, 내풍벼, 농안벼, 다산벼, 대립1호, 대산벼, 대안벼, 대야벼, 대진벼, 대청벼, 동안벼, 동진벼, 동해벼, 둔내벼, 만금벼, 봉광벼, 삼백벼, 상산벼, 상주벼, 상주찰벼, 삼천벼, 서안벼, 서진벼, 소백벼, 신선찰벼, 신운봉벼, 장안벼, 조령벼, 주안벼, 중화벼, 진부벼, 진부올벼, 진부찰벼, 진미벼, 청명벼, 추청벼, 아랑향찰, 안산벼, 안중벼, 양조벼, 영남벼, 영해벼, 오대벼, 오봉벼, 운봉벼, 운장벼, 일미벼, 화남벼, 화동벼, 화서벼, 화선찰벼, 화성벼, 화신벼, 화영벼, 화중벼, 향남벼, 향미1호, 향미2호, 탐진벼 및 팔공벼가 있으나, 가장 바람직하게는 낙동벼이다. 본 발명의 구체적인 실시예에 따르면, 해충 저항성 농작물로써 CryIAc1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 낙동벼를 사용하였고, 보다 구체적으로 해충저항성 Bt 벼 C7-1-9-1를 사용하였다.
보다 바람직하게, 상기 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물에는 내재유전자 검출용 프라이머를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 내재유전자는 벼에 단일카피로 존재하는 녹말분지효소(starch branching enzyme rbe4, RBE4)이며, 상기 내재유전자 검출용 프라이머는 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 RBEgh 프라이머 세트로서 RBE4 유전자의 엑손(Exon)에 특이적으로 인식하고 증폭산물의 크기는 약 101bp이다.
Figure 112010085761372-pat00001
본 발명은 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 DNA 단편을 주형으로 하여, 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 35sBr 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 TaCry2 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 CrRB 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트로 증폭된 PCR 증폭 산물 및 서열번호 1 및 서열번호 2로 표시되는 RBEgh 프라이머 세트로 증폭된 내재유전자 PCR 증폭 산물을 포함하는 플라스미드에 관한 것이다.
더욱 바람직하게, 상기 플라스미드는 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 13의 염기서열, 서열번호 2의 염기서열과 상보적 염기서열, 서열번호 15의 SmaI/SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열, 서열번호 7의 염기서열, 서열번호 14의 염기서열, 및 서열번호 8의 염기서열과 상보적 염기서열을 포함한다.
가장 바람직하게, 상기 플라스미드는 5'에서 3' 방향으로 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 13의 염기서열, 3'에서 5' 방향으로 서열번호 2의 염기서열과 상보적 염기서열, 5'에서 3' 방향으로 서열번호 15의 SmaI/SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열, 5'에서 3' 방향으로 서열번호 7의 염기서열, 서열번호 14의 염기서열, 및 3'에서 5' 방향으로 서열번호 8의 염기서열과 상보적 염기서열을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 플라스미드는 해충 저항성 유전자 변형 농작물에 도입된 유전자 카피수를 이용한 정량분석을 위한 것으로서, 벼의 내재유전자인 RBE4 및 도입유전자의 RB 부위의 인접서열에 대한 PCR 산물을 연결하여 pGEM-T easy 벡터(Promega)에 삽입한 표준플라스미드 pRBECrR이다. 상기의 벼 내재유전자인 RBE4 유전자에 대한 PCR 산물은 RBEgh-1/ RBEgh-2 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 것이고, RB 부위의 인접서열에 대한 PCR 산물은 CrRB-1/ CrRB-2 프라이머 세트를 이용하여 증폭한 것이다. 상기 내재유전자인 RBE4 및 도입유전자의 RB 부위의 인접서열에 대한 PCR 산물 연결은 내재유전자 PCR 산물 및 도입유전자의 RB 부위의 인접서열에 대한 PCR 산물을 동일농도로 혼합하여 주형으로 하고, RBEgh-1과 SmaI / SrfI 제한효소 인식부위를 매개로한 SrRBE-2 연결 프라이머(linker)를 조합으로, SmaI / SrfI 제한효소 인식부위를 갖는 SrEsRB2-1과 CrRB-2 프라이머를 조합으로 하여 재PCR을 실시하여 각 증폭산물이 연결될 수 있는 PCR 증폭산물을 제조한 후 각각의 SmaI / SrfI 인식부위가 포함된 RBEgh와 CrRB의 PCR 중폭산물을 동일 농도로 혼합하고 RBEgh-1와 CrRB-2 프라이머를 조합으로 2번째 PCR을 실시하여 수행하였다.
표준플라스미드 제작에 사용한 연결 프라이머에 대한 염기서열을 표 2에 나타내었다.
서열번호 프라이머 프라이머 염기서열 비 고
11 SrRBE-2 5'-GCCCGGGCACAGTTGGTTCAT-3' 연결
프라이머
12 SrEsRB2-1 5'-GCCCGGGCGGGTCATAACGTGACT-3'
또한, 본 발명은 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 35sBr 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 TaCry2 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 CrRB 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트와 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 표시되는 TaEsRB 프로브를 포함하는, 실시간(Real Time) PCR을 위한 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물 및 이를 사용하여 실시간(Real Time) PCR을 통해 해충 저항성 유전자 변형 농작물을 검정하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 실시간(Real Time) PCR을 위한 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물 및 상기 해충 저항성 유전자 변형 농작물을 검정하는 방법에는 내재유전자 검출용 프라이머 세트 및 프로브로서, 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 RBEgh 프라이머 세트 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 TaRBE4 프로브를 추가로 포함할 수 있다.
상기 TaRBE4 프로브는 RBE4 유전자의 정량석 분석을 위하여 제작되었으며, 상기 TaEsRB 프로브는 TaEsRB 프라이머 조합의 정량적 분석을 위하여 제작되었으며, 본 발명의 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 프로브는 해충 저항성 벼의 검정용 프라이머 한 세트가 결합하는 부분 사이에 존재하는 DNA에 특이적으로 결합하는 것이 가능하다.
또한 본 발명은 상기 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물 또는 실시간(Real Time) PCR을 위한 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물을 포함하는 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 키트에 관한 것이다.
또한 본 발명은 (a) 상기 플라스미드를 카피수 별로 희석하여 DNA 표준물질로 하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 수득한 표준물질을 주형으로 상기 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물을 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 유전자 카피수를 나타내는 표준곡선을 작성하는 단계;
(c) 해충 저항성 유전자 변형 농작물로부터 수득한 DNA를 주형으로 상기 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물을 사용하여 실시간 PCR을 수행하고 그 반응 결과를 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 산출하는 단계;
(d) 상기 (c) 단계에서 산출한 유전자 카피수를 계산식 1에 대입하여 보정계수를 산출하는 단계;
(e) 대상 농작물 시료 또는 이의 가공품으로부터 수득한 DNA를 주형으로 상기 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물을 사용하여 실시간 PCR을 수행하고 그 반응 결과를 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 산출하는 단계; 및
(f) 상기 (e) 단계에서 산출한 유전자 카피수를 계산식 2에 대입하여 유전자 혼입율을 측정하는 단계;를 포함하는 대상 농작물 내 도입유전자의 혼입율 정량방법에 관한 것이다.
상기 (a) 단계에서는 상기 플라스미드를 카피수 별로 희석하여 DNA 표준물질을 만든다.
상기 (b) 단계에서는 실시간 PCR을 통하여 주형에 결합되어 있던 TaqMan® 프로브가 분해되어 형광색소가 유리되면서 나타내는 형광량을 검출하여 표준물질에 대한 표준곡선을 작성하였다.
상기 (c) 단계에서는 해충 저항성 유전자 변형 농작물을 상기 (b)와 동일한 방법으로 실시간 PCR하여 형광량을 검출하고, 이를 표준곡선에 대입하여 내재유전자 카피수 및 도입유전자 또는 도입유전자 삽입 인접서열 부위 카피수를 각각 산출한다.
상기 (d) 단계에서는 (c) 단계에서 해충 저항성 유전자 변형 농작물에서 산출한 내재유전자 카피수 및 도입유전자 또는 도입유전자 삽입 인접서열 부위 카피수를 하기 계산식 1에 대입하여 보정계수를 환산한다.
일반적으로 100% 유전자 변형 농산물 내에는 내재유전자 카피수와 도입유전자 또는 도입유전자 삽입 인접서열 부위 카피수가 동일하게 존재하지 않고, DNA 추출과정이나 PCR 과정 중 오차가 발생할 수 있어 이를 보정하기 위하여 보정계수를 사용한다.
상기 (e) 단계에서는 대상 농작물 시료 또는 이의 가공품으로부터 수득한 DNA를 주형으로 상기 (b)와 동일한 방법으로 PCR을 수행하고 그 반응 결과를 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 산출한다.
상기 (f) 단계에서는 상기 (e) 단계에서 산출한 유전자 카피수를 계산식 2에 대입하여 유전자 혼입율을 측정하여, 해충 저항성 유전자 변형 농작물과 비교하여 대상 농작물 내 내재유전자 대비 도입유전자의 혼입율을 정량할 수 있다.
계산식 1은 보정계수를 나타내며, 계산식 2는 도입유전자 도입율(%)을 나타낸다.
[계산식 1]
보정계수 = 도입유전자 또는 도입유전자 삽입 인접서열 부위 카피수/내재유전자 카피수
[계산식 2]
도입유전자 도입율(%) =(도입유전자 또는 도입유전자 삽입 인접서열 부위 카피수/내재유전자 카피수)/보정계수 X 100
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다.
[ 실시예 ]
이들 실시예는 단지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 의하여 제한되는 것으로 해석되는 것은 아니다.
실시예 1: 벼 내재유전자 및 해충 저항성 Bt 벼에 대한 특이 프라이머 / 프로브 제작
벼에 단일카피로 존재하는 녹말분지효소(starch branching enzyme rbe4, RBE4)는 유전자변형 벼의 유전자분석에서 내재유전자로 이용가능하기 때문에 벼 녹말분지효소 RBE4 유전자의 cDNA 염기서열(GenBank Accession No. AB023498)을 바탕으로 특이 프라이머 RBEgh-1과 RBEgh-2를 제조하였으며, 이들 RBEgh-1과 RBEgh-2 프라이머는 RBE4 유전자의 엑손(Exon)을 특이적으로 인식하고 증폭산물의 크기는 101bp로 예상된다. 또한 정량적 분석을 위하여 상기 2종의 프라이머가 동일하게 적용되었고, 1종의 TaRBE4 프로브를 제작하여 사용하였다.
해충 저항성 Bt 벼를 특이적으로 검정하기 위해서 도입유전자 및 게놈내의 도입유전자 삽입 인접 염기서열을 바탕으로 다양한 형태의 특이 프라이머를 제작하였다. 먼저 도입유전자를 바탕으로 구조 특이 프라이머 35sBr-1과 35sBr-2 조합을, 유전자 특이 프라이머로 CryIAc1 유전자 염기서열(GenBank Accession No. AY126450)을 바탕으로 TaCry2-1과 TaCry2-2 프라이머 조합을 제작하였다. 도입유전자 삽입 인접부위의 염기서열을 바탕으로 한 계통특이 프라이머로서 CrLB2-1과 CrLB2-2 조합 및 CrRB-1과 CrRB-2 조합을 제조하였으며, 상기 CrRB-1과 CrRB-2 조합의 정량적 분석을 위하여 TaEsRB 프로브를 제작하였다.
상기 기술한 프라이머/프로브 조합 및 증폭되는 산물의 예상크기는 상기 표 1에 나타내었다.
실시예 2: 제작 프라이머의 해충 저항성 Bt 벼 및 작물에 대한 특이성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 프라이머의 특이성을 해충 저항성 Bt 벼 및 각종 비형질전환 작물에 대하여 확인하였다.
식물의 게놈 DNA 분리: 해충 저항성 Bt 벼와 비형질전환 벼를 포함하여 각종 비형질전환 작물의 게놈 DNA를 분리하였다. 게놈 DNA 분리는 각 식물체의 신선한 잎을 유발에 액체질소를 넣고 미세하게 마쇄한 다음, 식물체 분쇄분 1g을 15 ml 튜브에 넣고 Qiagen DNeasy Plant Maxi Kit(Qiagen 68163)를 이용하여 분리 정제하였다. 추출된 DNA는 NanoDrop Spectrohotometer ND-1000(NanoDrop Technologies Inc., USA)를 이용하여 A260/A280 nm 값이 1.8～2.0 사이인 DNA액을 사용하였다. 또한 각 식물체 게놈 DNA는 20 ng 농도로 일정하게 희석하여 사용하였다.
PCR 분석: 상기에서 분리한 각 식물체의 게놈 DNA 20 ng을 주형으로 하여 PCR 반응을 실시하였다. 기본적인 PCR 반응은 한 시료 당 총 25 μL로 하여, 2.5 μL의 10×PCR buffer(Ampliqon, Herlev, Denmark) 2 μL의 dNTP(2.5 mM each, Ampliqon), 1.5 μL의 1.5 mM MgCl2(Ampliqon), 각각 10 μM의 forward와 reverse 프라이머, Taq DNA polymerase는 TEMPase Hot Start DNA polymerase(Ampliqon)를 1.25 unit 첨가하한 반응 조성액으로 하고, Dyad Peltier Thermal cycler(Bio-Rad, Hercules, USA) PCR기기를 이용하여 수행하였다. 상기 얻어진 증폭된 PCR 산물은 2% 아가로즈 젤로 전기영동하여 UV로 반응 양상을 분석하였다.
해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1, 비형질전환 낙동벼 및 비형질전환 화영벼, 각종 비형질전환 작물로 배추, 고추, 감자, 상추, 콩, 들깨, 토마토, 멜론, 완두, 피망, 고구마 등에 대한 식물체 게놈 DNA를 상기의 방법으로 분리하여, 상기 실시예 1에서 제조한 프라이머를 이용하여 특이성을 확인하고자 상기 PCR 분석법으로 하여 표 1에 나타낸 조건으로 PCR을 실시하였다. 도 2는 PCR 산물들에 대한 전기영동사진을 나타낸 것으로 RBEgh-1 프라이머/RBEgh-2 프라이머, 35sBr-1 프라이머/35sBr-2 프라이머, TaCry2-1 프라이머/TaCry2-2 프라이머, CrRB-1 프라이머/CrRB-2 프라이머, 및 CrLB2-1 프라이머/CrLB2-2 프라이머 조합으로 실시한 PCR 산물이다. 또한 레인 1은 해충 저항성 Bt 벼이고, 레인 2와 3은 각각 비형질전환 낙동벼, 비형질전환 화영벼, 레인 4～14는 상기에서 언급한 각종 비형질전환 작물의 DNA이다.
(1) RBEgh -1/ RBEgh -2 프라이머 조합의 PCR 분석
도 2의 PCR 결과, 벼의 게놈 DNA를 주형으로 한 해충 저항성 Bt 벼, 천연형 낙동벼, 천연형 화영벼의 경우에만 특이적인 PCR 산물이 나타났으며 증폭산물의 크기도 약 101 bp 정도로 확인되었다. 이의 결과에서 볼 수 있듯이 상기 벼 내재유전자 특이 프라이머는 벼에 대하여 특이적으로 증폭됨을 확인할 수 있었고, 이들 프라이머 조합을 벼의 유전자분석에 사용할 수 있음을 시사하고 있다.
(2) 35 sBr -1/35 sBr -2 프라이머 및 TaCry2 -1/ TaCry2 -2 프라이머의 PCR 분석
도 2의 PCR 결과, 도입유전자 구조 특이 프라이머(35sBr-1 및 35sBr-2)와 유전자 특이 프라이머(TaCry2-1 및 TaCry2-2)를 이용한 PCR 결과, 35S::bar 및 mCry1Ac1 유전자를 내포하고 있는 해충 저항성 Bt 벼에서만 각각 약 141 bp와 약101 bp 정도 크기의 특이적인 PCR 증폭밴드를 확인할 수 있었으며, 반면, 비형질전환 식물체에서는 어떠한 증폭산물을 확인할 수 없었다.
(3) CrRB -1/ CrRB -2 프라이머 및 CrLB2 -1/ CrLB2 -2 프라이머의 PCR 분석
도 2의 PCR 결과, 도입유전자 인접부위의 염기서열을 바탕으로 제조한 계통특이 프라이머 CrRB-1/CrRB-2 및 CrLB2-1/CrLB2-2 프라이머 조합의 PCR 반응은 해충 저항성 Bt 벼의 경우에만 특이적으로 각각 약 127 bp와 약 141 bp의 정도 크기의 증폭산물을 형성하였다. 이들 결과로부터 상기 계통특이 프라이머 조합이 각종 작물에 대하여 비특이적인 반응을 나타내지 않아 해충 저항성 벼의 특이적 검정에 이용할 수 있음을 나타내었다.
프라이머 조합에 대한 PCR 반응조건은 하기 표 3과 같다.
프라이머 조합 반응조건
RBEgh-1/
RBEgh-1		 95℃, 15분 → 95℃, 20초 → 60℃, 40초 → 72℃, 1분, 35회
→ 72℃, 5분
35sBr-1/
35sBr-2		 95℃, 15분 → 95℃, 20초 → 58, 40초 → 72℃, 1분, 35회
→ 72℃, 5분
TaCry2-1/
TaCry2-2		 95℃, 15분 → 95℃, 20초 → 60℃, 40초 → 72℃, 1분, 35회
→ 72℃, 5분
CrRB-1/
CrRB-2		 95℃, 15분 → 95℃, 20초 → 60℃, 40초 → 72℃, 1분, 35회
→ 72℃, 5분
CrLB2-1/
CrLB2-2		 95℃, 15분 → 95℃, 20초 → 59, 40초 → 72℃, 1분, 35회
→ 72℃, 5분
실시예 3: 제작 프라이머의 해충 저항성 Bt 벼 및 벼품종에 대한 특이성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 프라이머의 특이성을 해충 저항성 Bt 벼 및 국내 재배 천연형 벼품종에 대하여 확인하였다.
해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1 계통 및 국내 재배 71개 천연형 벼품종(순서대로, 간척벼, 계화벼, 그루벼, 금남벼, 금오벼, 금호1호, 금호2호, 낙동벼, 남감벼, 남원벼, 남천벼, 남평벼, 내풍벼, 농안벼, 다산벼, 대립1호, 대산벼, 대안벼, 대야벼, 대진벼, 대청벼, 동안벼, 동진벼, 동해벼, 둔내벼, 만금벼, 봉광벼, 삼백벼, 상산벼, 상주벼, 상주찰벼, 삼천벼, 서안벼, 서진벼, 소백벼, 신선찰벼, 신운봉벼, 장안벼, 조령벼, 주안벼, 중화벼, 진부벼, 진부올벼, 진부찰벼, 진미벼, 청명벼, 추청벼, 아랑향찰, 안산벼, 안중벼, 양조벼, 영남벼, 영해벼, 오대벼, 오봉벼, 운봉벼, 운장벼, 일미벼, 화남벼, 화동벼, 화서벼, 화선찰벼, 화성벼, 화신벼, 화영벼, 화중벼, 향남벼, 향미1호, 향미2호, 탐진벼, 팔공벼)에 대하여 상기 실시예 1에서 제조한 프라이머 조합을 이용하여 상기 실시예 2에 나타낸 게놈 DNA 분리 및 PCR 분석법으로 하여 표 1에 나타낸 조건으로 PCR을 실시하였다. 도 3은 각 특이 프라이머를 이용한 PCR 산물에 대한 전기영동 사진으로, 벼 내재유전자 특이 프라이머 RBEgh-1/RBEgh-2 프라이머의 경우, 71개 천연형 벼의 모든 품종에서 일정하게 뚜렷한 반응산물이 형성함을 보여주었다. 또한 구조 특이 프라이머(35sBr-1 및 35sBr-2), 유전자 특이 프라이머(TaCry2-1 및 TaCry2-2) 및 계통특이 프라이머 조합(CrRB-1 및 CrRB-2, CrLB2-1 및 CrLB2-2)의 PCR 반응 결과, 실시예 2의 각종 작물의 결과와 같이 해충 저항성 Bt 벼에서만 특이적으로 증폭산물이 형성되었다. 이들 결과는 상기 제조한 각 프라이머 조합이 국내 재배 벼품종에 대하여 비특이적으로 PCR 증폭산물을 형성하지 않음을 보여주고 있어, 어떠한 벼품종이 이용되어도 상기 프라이머를 이용한 검정에 영향을 미치지 않을 것으로 판단된다.
실시예 4: 프라이머의 해충 저항성 벼에 대한 특이성 확인
상기 실시예 1에서 제조한 프라이머를 이용하여 해충 저항성 벼 계통에 대하여 확인하였다.
해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1 ( KR 등록번호 10-0723070의 방법으로 제작된 형질전환체) 은 도 1에 나타낸 살충성유전자 CryIAc1 유전자를 포함하고 있는 식물 운반체벡터로 낙동벼에 형질전환하여 얻어진 계통이며, 이외 상기 도 1의 동일한 운반체벡터로 낙동벼에 형질전환하여 얻어진 103-1 및 127-1 계통이 있고, 상기 도 1의 동일한 벡터로 화영벼에 형질전환하여 얻어진 HCr3-1, HCr4-1, HCr5-1, HCr6-1, HCr7-1 및 HCr8-1 계통이 있다. 본 연구에 사용한 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1 계통이 우수계통으로 선발되었고, 상기 실시예 1의 프라이머가 이의 계통의 유전정보를 바탕으로 제조되었기 때문에 상기의 동일한 운반체벡터로 형질전환된 다양한 해충 저항성 벼 계통들에 대하여 PCR 반응을 실시함으로써 제조 프라이머의 특이성을 확인할 수 있다. 따라서 본 연구에서는 상기 실시예 1에서 제조한 프라이머 조합을 이용하여 상기 실시예 2에 나타낸 게놈 DNA 분리 및 PCR 분석법으로 하여 표 1에 나타낸 반응조건으로 PCR을 실시하였다. 또한 CrRB-1/CrRB-2 프라이머와 RBEgh-1/RBEgh-2 프라이머의 혼합, CrLB2-1/CrLB2-2 프라이머를 RBEgh-1/RBEgh-2 프라이머의 혼합하여 이중 PCR(duplex PCR)을 실시하였다.
(1) 35 sBr -1/35 sBr -2 및 TaCry2 -1/ TaCry2 -2 프라이머의 PCR 반응
도 4는 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1과 동일한 도 1의 식물 운반체벡터로 형질전환한 해충 저항성 벼 계통들에 대하여 구조 특이 프라이머(35sBr-1 및 35sBr-2) 및 유전자 특이 프라이머(TaCry2-1 및 TaCry2-2)로 PCR 반응을 실시한 결과로 동일한 특이 증폭산물을 확인할 수 있었다. 이는 동일한 도입유전자로 형질전환된 개체들에 대해서 상기 프라이머를 이용하여 특이적으로 검정할 수 있음을 나타내고 있다.
(2) 계통특이 프라이머 PCR 및 duplex PCR 반응
도 4에서 계통특이 프라이머(CrRB-1/ CrRB-2 및 CrLB2-1/ CrLB2-2)의 해충 저항성 벼 계통들에 대한 특이성을 확인한 결과, 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1의 경우에만 뚜렷한 증폭산물을 형성하였고, 그 외 해충 저항성 벼 계통들에 대해서는 어떠한 PCR 증폭산물을 형성하지 않음을 확인할 수 있었다. 이의 결과는 상기 계통특이 프라이머를 이용할 경우 식물체 게놈내의 도입유전자 삽입 인접서열의 특정부위를 바탕으로 프라이머가 제조되었기 때문에 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1 계통에만 특이적으로 검정할 수 있음을 보여주고 있다. 또한 도 4에서는 내재유전자 및 계통특이 프라이머의 혼합으로 CrRB-1/CrRB-2 프라이머와 RBEgh-1/RBEgh-2 프라이머의 혼합, CrLB2-1/CrLB2-2 프라이머와 RBEgh-1/RBEgh-2 프라이머의 혼합으로 duplex PCR을 실시하여 유전자벼형 벼의 검정이 가능한지 확인하였다. 내재유전자의 약 101 bp 증폭산물과 right border 부위의 인접서열에 대한 프라이머 CrRB-1/ CrRB-2의 약 127 bp의 증폭산물이 전기영동 밴드가 겹치지 않고 뚜렷하게 확인 가능하였으며, left border 인접서열에 대한 프라이머 CrLB2-1/CLRB2-2의 약 141 bp 증폭산물도 내재유전자의 산물과 명확히 구분되어 확인할 수 있었다.
실시예 5: 해충 저항성 Bt 벼 후대에서의 계통특이 프라이머의 적용가능성 확인
계통특이적 프라이머 CrRB-1/CrRB-2 및 CrLB2-1/CrLB2-2 조합이 해충 저항성 Bt 벼의 후대에서도 안정적으로 검정이 이루어지는지를 확인하기 위해서 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1의 T1, T2, T3, T4 및 T5 세대에 대하여 상기 실시예 2에 나타낸 게놈 DNA 분리 및 PCR 분석법으로 하여 표 1에 나타낸 반응조건으로 PCR을 실시하였다. 그 결과 실험을 실시한 모든 후대에서 CryIAc1 유전자를 검정할 수 있는 프라이머 TaCry2-1/TaCry2-2에 대하여 명확하게 증폭산물을 형성했을 뿐만 아니라 상기 계통특이 프라이머들에서도 뚜렷한 증폭산물을 형성함을 확인하였다(도 5). 따라서 개발된 계통특이 프라이머를 이용하여 형질전환체의 후대세대로 유전자 이동 및 안정적인 유전자 유지를 확인할 수 있었으며, 이들 프라이머를 이용한다면 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1과 교배된 개체들에서 신속하고 정확하게 파생계통임을 판단할 수 있는 방법으로 이용 가능할 것으로 판단된다.
실시예 6: 실시예 1의 프라이머의 PCR 증폭산물의 염기서열 분석
상기 실시예 1의 프라이머를 이용하여 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1의 게놈 DNA로부터 증폭된 PCR 산물이 각 도입유전자와 일치하는지 확인하기 위하여 염기서열 분석을 수행하였다. 염기서열 분석은 실시예 1의 각 프라이머로부터 증폭된 PCR산물을 QIAgen gel extraction kit(Qiagen)을 이용하여서 정제한 후 pGEM-T easy 벡터(Promega) 내로 cloning하여 분석하였다.
도 6의 서열 1은 본 발명의 RBEgh-1/RBEgh-2 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 101개의 염기로 구성되었으며, 1부터 101개의 염기서열이 벼 RBE4 내재유전자 염기서열(GenBank Accession No. AB023498)과 완전히 일치하였다.
도 6의 서열 2는 본 발명의 35sBr-1/35sBr-2 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 414개의 염기로 구성되어 있으며, 1부터 20번까지의 염기는 35sBr-1 프라이머와, 399부터 414번까지의 염기는 35sBr-2 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다.
도 6의 서열 3은 본 발명의 TaCry2-1/TaCry2-2 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, PCR 산물은 101개의 염기로 구성되었으며, 1부터 101개의 염기서열은 CryIAc1 살충성유전자(GenBank Accession No. AY126450)와 100% 상동성을 보였다.
도 6의 서열 4 는 본 발명의 CrRB-1/CrRB-2 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, 도입유전자의 right border (RB) 인접서열 부위의 PCR 산물로 127개의 염기로 구성되었으며, 1부터 20번까지의 염기는 CrRB-1 프라이머와, 108부터 127번까지의 염기는 CrRB-2 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다.
도 6의 서열 5는 본 발명의 CrLB2-1/CrLB2-2 프라이머에 의한 PCR 산물의 염기서열을 나타낸 것으로, 도입유전자의 left border (LB) 인접서열 부위의 PCR 산물로 141개의 염기로 구성되었으며, 1부터 21번까지의 염기는 CrLB2-1 프라이머와, 122부터 141번까지의 염기는 CrLB2-2 프라이머와 상보적인 염기서열을 가지고 있음이 확인되었다.
실시예 7: 정량분석용 표준플라스미드 pRBECrR 제작
해충 저항성 Bt 벼에 도입된 유전자 카피수를 이용한 정량분석을 위하여 벼의 내재유전자인 RBE4 및 도입유전자의 RB 부위의 인접서열에 대한 PCR 산물을 연결하여 pGEM-T easy 벡터(Promega)에 삽입한 표준플라스미드 pRBECrR을 제작하였다. 상기의 벼 내재유전자인 RBE4 유전자에 대한 PCR 산물은 RBEgh-1/ RBEgh-2 프라이머를 이용하여 증폭한 것이고, RB 부위의 인접서열에 대한 PCR 산물은 CrRB-1/ CrRB-2 프라이머를 이용하여 증폭한 것이다(도 7). 다음은 표준플라스미드 pRBECrR의 제작과정 및 구조를 보다 상세히 기술하고자 한다(도 7, 도 8).
(1) 표준플라스미드 pRBECrR 제조
표준플라스미드 pRBECrR는 1) RBEgh-1/RBEgh-2 프라이머 세트 및 2) CrRB-1/CrRB-2 프라이머 세트를 high fideliy PCR용 효소인 KOD plus DNA 중합효소(TOYOBO KOD-201)를 이용하여 각각의 첫번째 PCR 산물을 얻었다. 다음 첫번째 1)과 2)의 PCR 산물을 동일농도로 혼합하여 주형으로 하고, RBEgh-1과 SmaI/SrfI 제한효소 인식부위를 매개로한 SrRBE-2 연결 프라이머(linker)를 조합으로, SmaI / SrfI 제한효소 인식부위를 갖는 SrEsRB2-1과 CrRB-2 프라이머를 조합으로 하여 재PCR을 실시하여 각 증폭산물이 연결될 수 있는 PCR 증폭산물을 제조하였다. 이후 각각의 SmaI / SrfI 인식부위가 포함된 RBEgh와 CrRB의 PCR 중폭산물을 동일 농도로 혼합하고 RBEgh-1와 CrRB-2 프라이머를 조합으로 2번째 PCR을 실시하여 237개 염기로 구성된 RBE4::CrRB의 PCR 융합산물을 얻었다(도 7).
상기 얻어진 융합산물을 pGEM-T easy 벡터(Promega)에 삽입하여 표준플라스미드 pRBECrR을 제작하였다. 표준플라스미드 제작에 사용한 연결 프라이머에 대한 염기서열을 표 2에 나타내었다.
(2) 표준플라스미드 pRBECrR 의 구조
일반적으로 PCR 증폭산물은 A염기가 연장되어 있어 이를 바로 클로닝할 수 있도록 pGEM-T easy 벡터는 LacZ 부위에 T염기가 1개 연장된 사이트를 가지고 있어서 PCR 산물을 쉽게 벡터내로 삽입할 수 있다. 이러한 과정을 걸쳐 pRBECrR이 제작되었고, 삽입된 PCR 산물이 도입유전자와 일치하는지 염기서열을 재확인하였다.
제작한 플라스미드 pRBECrR은 도 8A와 같이 pGEM-T easy 벡터 유래의 대장균내 f1 origin과 대장균 형질전환 선발을 위한 암피실린 내성유전자가 포함된 약 3015 bp, RBE4::CrRB의 PCR 융합산물인 약 237 bp가 포함된 전체 약 3252 bp로 구성된 재조합 벡터이다. 상기 pRBECrR 벡터는 대장균 내에서 높은 복제능력을 가지고 있어 플라스미드 DNA를 다량으로 합성할 수 있고, RBE4와 CrRB 염기 사이에 SmaI / SrfI 제한효소 인식부위를 포함시켜 SmaI 또는 SrfI 제한효소 처리에 의해 linear 형태의 DNA를 얻을 수 있다. 또한 희석하여 다양한 카피수의 DNA를 수득할 수 있기 때문에 실시간 PCR을 위한 표준플라스미드로 제공될 수 있다.
도 8B는 pGEM-T easy 벡터에 삽입한 RBE4::CrRB의 융합산물의 염기서열 분석결과이다. 삽입된 PCR 산물은 237개의 염기로 구성되었으며, 1부터 20번까지의 염기는 RBEgh-1 프라이머의 염기서열, 52부터 75번까지의 염기는 TaRBE4 프로브의 염기서열, 82부터 101번까지의 염기는 RBEgh-2 프라이머 염기서열의 상보적 염기서열과 일치하였으며, 103부터 110번까지 SmaI/SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열이 있음을 확인하였다. 또한 111부터 130번까지의 염기는 CrRB-1 프라이머의 염기서열, 154번부터 176번까지의 염기는 TaEsRB 프로브의 염기서열, 218부터 237번까지의 염기는 CrRB-2 프라이머 염기서열의 상보적 염기서열과 일치하고 있음이 확인되었다.
실시예 8: 표준플라스미드 pRBECrR 을 이용한 정량성 확인
표준플라스미드 pRBECrR을 정량용 표준물질로 조제하여 DNA 주형으로 하고, 또한 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1의 게놈 DNA는 실시예 2의 게놈 DNA 분리 방법에 따라 분리하여 20 ng으로 일정하게 희석한 후, RBEgh-1와 RBEgh-2 프라이머 및 TaRBE4 프로브, CrRB-1과 CrRB-2 프로브 및 TaEsRB 프로브를 이용하여 실시간(Real Time)-PCR을 수행하여 정량성을 확인하였다.
표준플라스미드 조제: 표준플라스미드는 대장균(E. Coli DH5α)에 형질전환하여 정제한 후 10 ㎍의 제한효소 SmaI을 37℃에서 2시간 처리하여 절단한 후 1% 아가로스겔 전기영동하여 linear 형태의 플라스미드를 회수하고, NanoDrop Spectrohotometer ND-1000(NanoDrop Technologies Inc., USA)를 이용하여 A260/A280 값을 측정하여 정량한 후, 25, 300, 4,000, 80,000, 2,000,000 copies/2.5 ㎕의 5단계별로 희석하여 표준검량선 작성에 이용하였다.
실시간 PCR 분석: 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1 계통의 게놈 DNA 20 ng와 각 단계별 카피수로 희석한 표준물질 25, 300, 4,000, 80,000, 2,000,000 copies/2.5 ㎕을 주형으로 하여 1) RBEgh-1/RBEgh-2 프라이머를 각 1.25 μM와 TaRBE4 프로브를 0.5 μM 첨가, 2) CrRB-1/CrRB-2 프라이머를 각 1.25 μM와 TaEsRB 프로브를 0.5μM 첨가하여 Prism 7700 Sequence Detector(ABI) 기기를 이용하여 실시간 PCR을 실시하였다. 각 프라이머 및 프로브에 대한 실시간 PCR 조건은 표 4에 나타내었다.
프라이머 및 프로브의 실시간 반응 조건
프라이머 및 프로브명 반응조건
RBEgh-1/RBEgh-2 프라이머
TaRBE4 프로브		 50℃, 2분 → 95℃, 10분 → 95℃, 30초 → 60℃, 1분
(40회)
CrRB-1/CrRB-2 프라이머
TaEsRB 프로브		 50℃, 2분 → 95℃, 10분 → 95℃, 30초 → 60℃, 1분
(40회)
(1) 표준플라스미드를 이용한 정량성 확인
표준플라스미드 pRBECrR를 5단계의 카피수로 희석하여 DNA 표준물질로 하여, RBEgh-1/RBEgh-2 프라이머와 TaRBE4 프로브 및 CrRB-1/CrRB-2 프라이머와 TaEsRB 프로브로 하여 실시간 PCR을 실시한 결과, 상기의 pRBECrR 플라스미드의 카피수에 의한 증폭되는 실시간 PCR의 상관계수가 모든 반응에서 0.99 이상으로 나타났고(도 9), 이에 따라 본 발명의 플라스미드를 정량분석용 표준물질로 이용 가능함을 확인할 수 있다.
(2) 표준플라스미드를 이용한 해충 저항성 Bt 벼의 혼입율 분석
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머와 프로브의 특이성 및 표준플라스미드의 정량성을 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1 계통에 대하여 확인하였다.
상기에서 분리한 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1 계통의 게놈 DNA를 20 ng으로 희석하여 주형으로 하고, 각 5단계별 카피수로 희석한 표준플라스미드 25, 300, 4,000, 80,000, 2,000,000 copies/2.5 ㎕와 표준플라스미드를 첨가하지 않은 NTC(no template control)를 주형으로 하여 각 프라어머 세트(BEgh-1/RBEgh-2 및 CrRB-1/CrRB-2) 별로 각각의 프라이머를 1.25 μM로, 각 프로브(TaRBE4 및 TaEsRB)는 0.5 μM의 농도로 첨가하여 상기 표 4에 나타낸 반응조건으로 실시간 PCR을 실시하였다. 상기 대조군은 플라스미드를 넣지 않고 동일한 방법으로 실시간 PCR을 실시하였다.
상기 5단계별 카피수로 희석한 pRBECrR 표준물질의 실시간 PCR 분석치를 표준곡선으로 하여(도 9), 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1 계통에 대하여 내재유전자 RBE4에 대한 카피수 및 도입유전자 인접서열 부위(CrRB)의 카피수를 구하여 내재유전자 RBE4 유전자에 대한 CrRB의 카피수의 비를 구하여 보정계수를 산출하였다.
표 5에 해충 저항성 Bt 벼 계통에 대한 RBE4 유전자와 CrRB의 카피수 및 보정계수를 나타내었다. 표 5에 나타낸 바와 같이 CrRB/RBE4의 비는 1.02의 보정계수를 나타냈다. 따라서 본 발명에 의한 표준플라스미드를 활용하면 향후 해충 저항성 Bt 벼 C7-1-9-1 계통이 상업화하여 농산가공품 및 식품으로 사용되었을 때 해충 저항성 Bt 벼 계통에 대한 혼입률을 간편하고 정확하게 정성 및 정량분석 할 수 있다.
해충 저항성 벼의 증폭카피수 및 보정계수

증폭카피수 보정계수(Cf*)
RBE4 CrRB CrRB/RBE4
해충 저항성 벼 18055 18477 1.02
* Cf: conversion factor
RB: right border
Prbcs: Rice rbcS promoter
TP: Rice rbcS transit peptide
mCry1Ac1: 해충 저항성유전자(CryIAc1)
TpinII: potato rotease inhibitor II terminator
P35S: Cauliflower mosaic virus promoter 35
BAR: 제초제 저항성 유전자
Tnos: nopaline syntahses terminator
LB: left border
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  17. (a) 서열번호 1의 염기서열, 서열번호 13의 염기서열, 서열번호 2의 염기서열의 상보적 염기서열, 서열번호 15의 SmaI/SrfI 제한효소 절단부위의 염기서열, 서열번호 7의 염기서열, 서열번호 14의 염기서열, 및 서열번호 8의 염기서열의 상보적 염기서열을 포함하는 플라스미드를 카피수 별로 희석하여 DNA 표준물질로 하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 수득한 표준물질을 주형으로 서열번호 3 및 서열번호 4의 염기서열로 표시되는 35sBr 프라이머 세트; 서열번호 5 및 서열번호 6의 염기서열로 표시되는 TaCry2 프라이머 세트; 서열번호 7 및 서열번호 8의 염기서열로 표시되는 CrRB 프라이머 세트; 및 서열번호 9 및 서열번호 10의 염기서열로 표시되는 CrLB2 프라이머 세트로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 프라이머 세트와 서열번호 14로 표시되는 염기서열로 표시되는 TaEsRB 프로브, 및 서열번호 1 및 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 RBEgh 프라이머 세트 및 서열번호 13의 염기서열로 표시되는 TaRBE4 프로브를 포함하는, 실시간(Real Time) PCR을 위한 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물을 사용하여 실시간 PCR을 수행하여 유전자 카피수를 나타내는 표준곡선을 작성하는 단계;
    (c) 해충 저항성 유전자 변형 농작물로부터 수득한 DNA를 주형으로 상기 실시간(Real Time) PCR을 위한 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물을 사용하여 실시간 PCR을 수행하고 그 반응 결과를 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 산출하는 단계;
    (d) 상기 (c) 단계에서 산출한 유전자 카피수를 계산식 1에 대입하여 보정계수를 산출하는 단계;
    (e) 대상 농작물 시료 또는 이의 가공품으로부터 수득한 DNA를 주형으로 상기 실시간(Real Time) PCR을 위한 해충 저항성 유전자 변형 농작물의 검정용 조성물을 사용하여 실시간 PCR을 수행하고 그 반응 결과를 표준곡선에 대입하여 유전자 카피수를 산출하는 단계; 및
    (f) 상기 (e) 단계에서 산출한 유전자 카피수를 계산식 2에 대입하여 유전자 혼입율을 측정하는 단계를 포함하는 대상 농작물 시료 내 도입유전자의 혼입율 정량방법
    (계산식 1)
    보정계수 = (도입유전자 또는 도입유전자 삽입 인접서열 부위 카피수)/내재유전자 카피수
    (계산식 2)
    도입유전자 도입율(%) =(도입유전자 또는 도입유전자 삽입 인접서열 부위 카피수/내재유전자 카피수)/보정계수 X 100
  18. 제 17항에 있어서 해충 저항성 유전자 변형 농작물은 해충 저항성 Bt 벼인 것을 특징으로 하는, 대상 농작물 시료 내 도입유전자의 혼입율 정량방법.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 해충 저항성 Bt 벼는 CryIAc1 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 형질전환된 낙동벼인 것을 특징으로 하는, 대상 농작물 시료 내 도입유전자의 혼입율 정량방법.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 해충 저항성 Bt 벼의 계통은 C7-1-9-1인 것을 특징으로 하는, 대상 농작물 시료 내 도입유전자의 혼입율 정량방법.
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