KR100960052B1

KR100960052B1 - ＣａＳＩＧ4를 내재양성 대조 유전자로 하는 유전자 변형고추 검출 방법

Info

Publication number: KR100960052B1
Application number: KR1020070117318A
Authority: KR
Inventors: 김환묵; 정순천; 백인순; 육은수; 김창기; 윤원기; 이기훈
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-11-16
Filing date: 2007-11-16
Publication date: 2010-05-31
Also published as: KR20090050721A

Abstract

본 발명은 CaSIG4를 내재양성 대조 유전자로 하는 유전자 변형 고추 검출 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 CaSIG4 유전자가 고추에서 단일 카피(copy)로 존재하며 종 특이성으로 인하여 가장 적합한 내재양성 대조 유전자임을 밝히고 이를 이용하여 유전자 변형 고추를 정성 및 정량적으로 분석하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 고추 내재유전자 CaSIG4는 LM-고추와 non LM-고추에 존재하면서 여타 근연종에서는 PCR 증폭이 일어나지 않는 종 특이적 내재양성 대조 유전자로서 고추의 유전적 변형 여부를 확인하는 방법에서 대조구로 유용하게 사용될 수 있다.

유전자 변형 고추, 정성 분석, 실시간 PCR, CaSIG4

Description

ＣａＳＩＧ4를 내재양성 대조 유전자로 하는 유전자 변형 고추 검출 방법{The method for detecting a LM pepper using CaSIG4 as an endogenous positive control gene}

본 발명은 CaSIG4를 내재양성 대조 유전자(이하, '내재유전자')로 하여 유전자 변형 고추를 판별하는 방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 CaSIG4 내재유전자를 내부 양성 대조 유전자로 사용하여 유전자 변형 고추의 정성 및 정량 분석 방법에 관한 것이다.

유전자 변형 식물이란 유전공학기술을 이용하여 특정 생물로부터 유용한 유전자를 취해 이를 기존의 작물에 도입함으로써 그와 동일한 유전자 기능을 발휘하도록 조작된 식물을 의미한다. 유전자 변형 식물은 동식물 및 미생물 등 유전자 변형 생물체를 통칭하는 GMO(Genetically Modified Organisms) 또는 LMO(Living modified organism)에 속하며, 또한 형질 전환 작물(Transgenic Plants)로 통용되기도 한다. 특히 이런 유전자 변형 식물 중 농작물의 유전자 변형은 주로 제초제 에 대한 내성, 병해충에 대한 저항력, 생산력의 증가, 긴 유통기간에도 쉽게 상하지 않는 특성을 지니게 하거나, 영양가치가 높은 식물을 개발하는 등의 분야에 초점을 맞추어 개발되어 왔으며, 현재까지 여러 GMO 농작물들이 이미 상용화되었거나 준비 중에 있다.

유전자 변형 농산물에 대한 연구는 1970년대 수확량 향상을 가져온 녹색 혁명 이후 돌파구를 찾으려는 시도로부터 출발했다. 이러한 유전자 변형 농산물의 개발은 1994년 미국 칼젠(Calgene)사가 "Flavr Savr"라는 상품명의 잘 물러지지 않는 토마토의 개발로 결실을 맺었고, 1996년 몬산토사의 제초제에 내성을 지니는 대두 및 노바티스사의 병충해 내성을 지니는 옥수수 등이 개발되면서 농화학기업의 참여와 함께 광범한 상품화의 단계에 본격적으로 접어들기 시작하였다. 초기 유전자 변형 식물 재배는 유전자 변형식물을 개발한 회사가 일반 식물보다 농민의 입장에서는 제초제와 농약의 비용이 크게 줄고 병충해가 감소해 그 사용이 급격하게 증가하였다. 1994년부터 2006년까지 FDA의 검증을 마치고 시판이 허용된 유전자 재조합 식물은 옥수수, 토마토, 감자, 대두 등을 중심으로 80 여종에 이른다. 국가별로는 미국이 전 세계 재배면적의 60% 정도를 차지하고 있으며, 이밖에 중국, 캐나다, 멕시코, 아르헨티나, 브라질 등의 재배면적도 늘어가고 있는 추세이다.

한편, 유전자 변형 농산물의 상업화가 급진전되면서 유럽을 중심으로 이의 안전성에 대한 우려가 증가되고 있으며, 안전성 기준 또한 점차 강화되고 있다. 특히, 우리나라는 많은 곡물을 미국에서 수입하고 있으며, 국내 수요량의 90% 정도를 수입에 의존하고 있는 수입콩의 경우 GM 콩의 수치가 30%가 넘는 것으로 추정되 고 있다. 이에 따라, 소비자들의 GM 농산물에 대한 우려가 높아지자 정부는 2001년 3월부터 GM 농산물 구분 표시제를 시행하고 있으며, 또한 2002년 9월부터 바이오 안정성 의정서가 국제적으로 발효됨에 따라 국내에서 수입 및 유통되고 있는 유전자 변형 농산물에 대하여 안정성 심사에 의하여 승인된 농산물과 미승인 농산물의 판별이 요구되고 있다. 또한, 유전자 변형 농산물에 대한 수요의 급증과 더불어 유전자 변형 여부에 대한 확인 및 분석이 요구되어지는 현시점에 비추어 볼 때, GMO 식물에 대한 신뢰성 있고 효율적인 검사방법의 개발이 필수적으로 요구되고 있다.

현재, 유전자 변형 식물 또는 식품에 대한 검사방법에는 단백질 검출에 의한 검정 방법과 DNA 검출에 의한 검정 방법이 있다.

단백질을 이용한 검출방법은 유전자 변형 생물체 내에 새롭게 도입된 유전자가 생산하는 재조합 단백질을 항원 단백질로 인지하여 반응하도록 한 항체 단백질을 검사용 스트립(strip)에 결합시키는 항원-항체 반응을 이용한 검출방법이다.

구체적으로, EPSPS 유전자가 도입된 콩과 CryIA(b), Cry9C, PAT, EPSPS 및 cry1Fa2 유전자가 도입된 옥수수에 대하여 EPSPS 또는 Bt 단백질을 항원으로 인지하여 반응하도록 항체가 결합된 검출 스트립(lateral flow strip) 키트가 이미 상품화되어 있고, 효소면역학적 방법(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA)에 의한 EPSPS와 CryIA(b) 유전자 단백질의 정량용 분석 키트도 최근 상품화되었다. 그러나 단백질의 발현양은 유전자 변형 농산물에 따라 다르고, 개발회사에서 사용한 유전자 발현 조절부위(프로모터)에 따라 종자에서 발현되지 않는 경우도 있으 며, 보관상태 또는 가공식품의 경우에 가공과정에서 분해되는 경우도 있어 검정에 한계가 있다(백 등, GM 콩 DNA와 단백질의 안정성에 대한 열, 압력 및 산 처리의 영향. 한국식품과학회지 36(2004): 677-682).

상기의 단백질 검출방법에 비해 중합효소 연쇄반응(Polymerase Chain Reaction, PCR)을 통한 유전자 변형 농작물의 DNA 검출방법은 보다 신뢰성 있는 방법으로서 정성 및 정량 분석이 가능한 방법이다. DNA를 이용한 검출방법은 유전자 변형 식물에 많이 사용되는 도입유전자나 조절부위 염기서열에서 제작한 특이적 프라이머를 PCR에 이용함으로써 1차적인 검출이 가능하며, 보다 바람직하게는 유전자 변형 농산물의 도입유전자와 삽입 인접 부위에서 특이적인 프라이머를 제작하여 각각의 사상(event) 특이 검정을 할 수 있다.

현재 유전자 변형식물에 많이 사용되는 컬리플라워 모자이크 바이러스 프로모터(CaMV 35S promoter)에 대한 특이적인 PCR 프라이머로 유전자 변형 여부를 확인할 수 있다. 특히, 스위스, 독일 등 EU에서는 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 검정법이 유전자 변형식품을 검정하는 공인기술로 이용되고 있다(A. Jankiewicz 등, Eur. Food res. Technol. 209:77-82, 1999; Pietsch 등, DG JRC 보고서, 1999). 현재 상품화되고 있는 PCR 검정 키트(kit)도 역시 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이 프라이머를 이용한 것이다. 그러나 상기의 35S 프로모터 또는 Nos 터미네이터 특이 프라이머를 이용한 PCR 검출방법은 동일 프로모터나 터미네이터를 다른 도입 유전자와 함께 여타 작물에 도입하는 경우도 있으므로 의사 양성(false positive) 또는 의사 음성(false negative)이 나타날 가능성이 있으며(Lipp 등, J. AOAC International 82:923-928, 1999), 유전자 변형 농산물의 종류에 따라 이들 조절부위 유전자를 이용하고 있지 않는 경우도 있다. 따라서 스위스 등 EU에서는 이들 조절부위 특이적인 프라이머를 이용한 PCR은 유전자 변형 농산물의 1차적인 스크리닝에 이용하고 있으며, 유전자 변형 농산물의 사상 특이적인 프라이머를 이용한 PCR 검정을 2차 검정으로 확인하고 있다(Huber 등, Nat. Biotechnol. 17:1137-1138, 1999).

상기 PCR 검정을 통한 유전자 변형 농산물을 확인하는 방법에는 유전자 변형 농산물과 숙주 식물의 농산물에 존재하면서 여타 근연종에서는 PCR 증폭이 일어나지 않는 종 특이적 내재유전자 특이 프라이머를 고안하여 대조구로 사용하는 것이 필수적이다.

다시 말해, 만약 특정종의 존재를 알리는 양성대조구나 특정종의 비존재를 알리는 음성대조구로 작용하는 종특이적 내재유전자를 사용하지 않으면 도입유전자를 검출하는 것만으로 유전자 변형 농산물의 일반적인 검출에는 사용될 수 있으나 이러한 방법은 도입유전자가 여러 작물에 독립적으로 형질전환된 경우에는 특이성이 없다.

콩에서는 렉틴(lectin) 유전자, 옥수수에서는 제인(zein) 유전자 등이 내재유전자로 알려져 그 특성이 잘 규명되어 있으나, LM-고추의 유전자 분석에 사용될 수 있는 유전자는 많이 연구되어 있지 않은 실정이다.

이에 본 발명자는 CaSIG4 유전자가 고추에서 단일 카피(copy)로 존재하며 종 특이성으로 인하여 가장 적합한 내재유전자임을 밝힘고, CaSIG4 유전자가 형질전환 고추의 사상특이 정성 및 정량 검출 키트의 제작에 사용될 수 있음을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 CaSIG4 유전자를 내재유전자로 하여 유전자 변형 고추를 검출하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 고추 내재유전자인 CaSIG4 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍 및 이를 포함하는 유전자 변형 고추의 정성 분석용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 변형 고추의 정성 분석용 키트를 이용한 유전자 변형 고추의 사상 특이 정성 분석 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 CaSIG4 유전자 특이적 프라이머와 CaSIG4 유전자 특이 TaqMan 프로브를 포함하는 유전자 변형 고추의 정량 분석용 실시간 PCR 키트 및 이를 이용한 유전자 변형 고추의 혼입률 정량 분석 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 고추 내재유전자인 CaSIG4 유전자의 genomic DNA를 특이적으로 증 폭할 수 있는 프라이머쌍 및 이를 포함하는 유전자 변형 고추의 정성 분석용 키트를 제공한다.

CaSIG4 유전자는 살리실산(salicylic acid) 처리에 의해 유도되는 고추 유전자들 중 하나로서 CaSIG4라 명명되었고, acyl-CoA 합성효소와 아미노산 서열이 유사하나 정확한 기능은 밝혀지지 않았다(Lee 등, Molecular cloning of a novel pathogen-inducible cDNA encoding a putative acyl-CoA synthetase from Capsicum annuum L.. Plant Mol. Biol. (2001) 46: 661-671)

바람직하게는 서열번호 4와 서열번호 13으로 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 고추 내재유전자인 CaSIG4를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 함유하는 키트를 이용한 PCR을 통하여 유전자 변형 고추를 검출한다.

본 발명자는 CaSIG4 유전자가 단일 카피(copy)로 식물 게놈(genome)에 존재하며 종 특이성으로 인하여 적합한 내부 양성 대조 유전자임을 밝혔다.

구체적으로 PepEST 형질전환 고추, CMV-CP 형질전환 고추 및 이들의 wild type 고추의 gDNA(genomic DNA)를 Hind Ⅲ로 절단하여 CaSIG4 프로브로 써던 블롯팅한 결과, 품종에 관계없이 모두 단일 카피로 확인되었다(도 5 참조).

또한, GenBank 데이터베이스를 통해 얻은 CaSIG4의 염기서열을 바탕으로 프라이머를 제작하여 11개의 작물과 비교하면서 PCR을 수행한 결과 11개의 작물 중에서 토마토·감자·고추는 서열이 유사성을 가진다는 것을 알 수 있었다(도 1 참조). 좀 더 고추에 특이적인 영역(region)를 찾기 위하여 도 1의 PCR 산물을 시퀀싱 한 결과, 토마토와 고추의 3' 영역에는 비슷한 서열이 많이 분포되어 있지만 5' 영 역에서는 3개 작물에서 서열이 많이 다르다는 것을 알 수 있었다. 따라서 5' 영역에서 프라이머(14U와 644L 및 201U와 644L)를 더 제작하여 11개 작물에서 PCR 한 결과 고추외의 다른 작물에서는 PCR산물이 생기지 않았으나(도 2 참조), 201U와 644L 사이에 400 bp 이상의 size 차이가 났다. 따라서 고추는 5' 영역에 알려지지 않은 서열(unknown sequence)이 더 있다는 것을 예상할 수 있었다. 예상하지 못했던 280 bp 가량의 서열을 확인하기 위하여 도 2의 PCR 산물도 시퀀싱하였다.

상기와 같이 고추에서 CaSIG4의 전체 서열(full sequence)을 얻어냈으므로, 이 서열을 바탕으로 새로운 프라이머를 다시 제작하여(254U) 11개 작물에서 PCR한 결과 고추외의 다른 작물에서는 PCR 산물이 생기지 않았다(도 3 참조).

따라서 본 발명에 따른 고추의 CaSIG4 유전자는 고추에서 종 특이적으로 존재하는 유전자임을 확인하였고, 이러한 CaSIG4 유전자와 유전자 변형 과정에서 혼입된 도입유전자를 동시에 검출함으로써 다양한 작물의 gDNA로부터 유전자 변형이 일어난 고추를 종 특이적으로 확인가능하다.

또한, 본 발명은

1) 분석 시료의 DNA를 추출하는 단계;

2) CaSIG4 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 도입 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 상기 1)단계의 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및

3) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 증폭산물을 확인하는 단계를 포함하는 유전자 변형 고추의 사상 특이 정성 분석 방법을 제공한다.

바람직하게는 서열번호 4와 서열번호 13으로 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 CaSIG4 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 사용한다.

본 발명에서 사상(event)이라 함은 형질전환에 의해 외래 DNA를 유전체의 특정 위치에 결합한 경우를 말함인데, 일반적으로 상업화된 형질전환 사상을 엘리트 사상(elite event)으로 지칭할 수 있다.

DNA를 이용한 검출방법은 유전자 변형 식물에 많이 사용되는 도입유전자나 조절부위 염기서열에서 제작한 특이적 프라이머를 PCR에 이용함으로써 1차적인 검출이 가능하며, 보다 바람직하게는 유전자 변형 농산물의 도입유전자와 삽입 인접 부위에서 특이적인 프라이머를 제작하여 각각의 사상(event) 특이 검정을 할 수 있다. 본 발명에서는 도입유전자와 삽입 인접 부위의 염기서열을 탄저병 저항성 PepEST 유전자가 도입된 형진전환 고추의 사상을 이용하여 분석하였다. 그 결과, 68번 사상(event)은 1 카피의 도입유전자를 가지고 있으며, 삽입 인접 부위의 염기서열은 알려진 유전자의 서열과는 유의성이 없는 비암호화 부위임을 확인하고 68번 사상을 실례로 하여 본 발명의 유전자 변형 고추의 사상 특이 정성 및 정략 분석 키트 및 방법을 개발하였다.

또한, 본 발명은 고추 CaSIG4 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 고추 CaSIG4 유전자 특이적 프로브를 포함하는 유전자 변형 고추의 정량 분석용 실시간 PCR 키트를 제공한다.

전언한 바와 같이 고추 CaSIG4 유전자는 토마토와 감자의 3' 영역에는 비슷한 서열이 많이 분포되어 있지만 5' 영역에서는 3개 작물에서 서열이 많이 다르다는 것을 확인하였다. 그 결과 고추에 특이적인 영역을 바탕으로 새로운 프라이머를 제작하여 PCR한 결과 고추에서만 PCR산물을 얻을 수 있었다(도 3 참조). 따라서 고추에 특이적인 영역을 바탕으로 제작한 프라이머 및 프로브를 이용한 실시간 PCR을 통해 유전자 변형 고추를 정량 분석할 수 있다.

또한, 본 발명은 유전자 변형 고추의 혼입률을 분석하는 LM-고추의 정량 분석방법을 제공한다.

바람직하게는 LM-고추의 정량 분석방법은

1) 고추에 특이적인 CaSIG4를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍과 CaSIG4 유전자 특이적 프로브 및 도입유전자 특이적 프라이머쌍과 프로브를 준비하고 프로브를 라벨링하는 단계;

2) 분석시료 DNA를 주형으로 실시간 PCR을 수행하는 단계;

3) 각 사이클의 연장반응 시기에 분석시료의 형광값을 판독하고 도입유전자 역치 싸이클값(Ct값)/CaSIG4 유전자 Ct값을 측정하는 단계;

4) 표준시료의 도입유전자 Ct/CaSIG4 Ct값을 이용하여 얻은 정량곡선에 분석 시료의 도입유전자 Ct/CaSIG4 유전자 Ct값을 대입하여 유전자 변형 함량을 계산하는 단계를 포함한다.

바람직하게는 서열번호 40과 서열번호 41로 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성 된 CaSIG4 유전자 특이적 프라이머쌍과 서열번호 42로 기재된 폴리뉴클레오티드로 구성된 CaSIG4 유전자 특이적 TaqMan 프로브를 이용하여 LM-고추의 정량을 분석한다.

본 발명에서 "혼입률"이란 분석 시료(미지 시료)의 전체 양에서 유전자 변형 작물이 차지하는 양의 비율을 의미하는 것으로 백분율(%)로 나타낸다.

현재 유전자 변형 농산물에 대해 가장 널리 사용되는 정량분석중의 하나는 실시간 PCR법을 이용하는 것으로, PCR의 매 사이클마다 형광값을 측정하여 사이클 대비 형광값으로 그래프를 완성한 후 지수 증식기 (exponential phase) 범위 내에서 분석하여 표준시료의 Ct(threshold cycle; 역치 싸이클) 값을 이용하여 표준곡선을 구한 후 미지시료의 Ct값을 대입하여 LMO 혼입률을 측정하는 것이다.

현재까지 개발된 실시간 PCR을 이용한 정량분석 방법중 가장 널리 사용되는 방법은 프라이머에 형광 염료를 부착시킨 서열에 특이적인 프로브를 사용하는 TaqMan법이다.

본 발명은 신뢰성 있는 결과를 도출하기 위하여 내재 유전자인 CaSIG4 유전자를 내부 양성 대조구로 사용한 것을 특징으로 하고, 바람직하게는 고추에 특이적인 CaSIG4 유전자 염기서열을 바탕으로 제작한 CaSIG4 유전자 특이적 프라이머쌍과 프로브를 사용하는 것을 특징으로 한다.

따라서 LM-고추의 gDNA를 주형으로 하고, 본 발명에 따른 고추에 특이적인 CaSIG4 유전자 염기서열을 바탕으로 제작한 CaSIG4 유전자 특이적 프라이머쌍과 프로브 및 도입유전자 특이적 프라이머 쌍과 프로브를 이용한 실시간 PCR을 수행하여 각 사이클의 연장반응 시기에 분석시료의 형광값을 판독하여 도입유전자 Ct/CaSIG4 Ct값을 측정하고 이를 표준곡선에 대입하여 LM-고추의 혼입률을 정량적으로 분석한다.

본 발명에서, "표준곡선"이란 혼입률 또는 게놈 copy 수을 알고 있는 표준시료로부터 동일한 프라이머를 이용해서 도입유전자 Ct/CaSIG4 Ct값을 측정하고, 이 값을 회귀분석(regression analysis)하여 얻은 농도별 도입유전자 Ct/CaSIG4 Ct값의 선형의 관련성을 나타내는 함수식을 의미하며, 일반적인 프로그램을 통하여 얻을 수 있다. 즉, IRMM (Institute of Reference Materials and Measurements, Geel, Belgium) 같은 공인기관에서 표준시료 (certified reference materials)를 제공하는 경우에는 혼입률이 알려진 표준시료를 사용하여 표준곡선을 작성하나, 표준시료가 없는 경우에는 실험실에서 제작한 순도가 높은 gDNA를 순차적으로 묽혀서 표준시료를 제작하여 표준곡선을 작성한다.

상기 표준곡선은 단순회귀모형의 기울기와 절편은 n개의 자료 쌍을 통하여 최소제곱법(method of least square)으로 추정될 수 있으며, 이런 방법으로 얻은 적합된 회귀식(fitted regression equation)에 미지의(혼입률을 모르는) 분석시료의 도입유전자 Ct/CaSIG4 Ct값을 대입함으로써, 분석시료의 혼입률을 계산할 수 있다.

혼입률을 알고 있는 표준시료를 사용하는 정량 방법과는 달리, 최근에 채택되고 있는 검출한계(limit of detection, LOD)와 정량한계(limit of quantification, LOQ) 개념(Berdal and Holst-Jensen (2001) Eur. Food Res. Technol.213:432-438)을 채택하여 혼입률을 정량할 수 있다.

LOD 및 LOQ에 의하여 정량하는 방법은 우선 도입유전자의 카피수를 확인하고 다양한 카피수를 가진 기준시료로부터 PCR을 수행하여 도입유전자 Ct/CaSIG4 Ct값을 얻는다. 이로부터 LOD 및 LOQ를 확인하고 분석시료로부터 PCR을 수행하여 얻은 도입유전자 Ct/CaSIG4 Ct값이 LOD 및 LOQ에서 버림값이 아닌 경우 상기 기준시료의 도입유전자 Ct/CaSIG4 Ct값과 비교하여 도입유전자의 카피수를 계산하여 혼입률을 추정한다.

본 발명의 고추 내재유전자 CaSIG4는 LM-고추와 non LM-고추에 존재하면서 여타 근연종에서는 PCR 증폭이 일어나지 않는 종 특이적 내재유전자로서 고추의 유전적 변형 여부를 확인하는 방법에서 대조구로 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> CaSIG4 gDNA의 서열

<1-1> 프라이머 제작

고추 내재유전자 후보 CaSIG4 유전자의 cDNA 염기서열(GenBank accession # AF354454)을 GenBank 데이터베이스를 통해 얻었다. 유전자 변형 작물의 내재유전자로 사용되는 염기서열은 genomic DNA(이하, gDNA)이어야 하므로 CaSIG4 유전자의 cDNA를 암호화하는 고추 gDNA 염기서열을 확보하기 위하여 cDNA 염기서열에 기초하여 PCR 및 시퀀싱 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 Primer3 프로그램(Rozen and Skaletsky, Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In S. Krawets and S. Misener (Eds.), Bioinformatics methods and protocols: Methods in moleclar biology (pp. 365-386). Totowa, NJ: Humans Press)을 이용하여 PCR의 어닐링 온도 55^oC에 맞추어 디자인되었고(표 1), 바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.

CaSIG4 유전자에 특이적인 프라이머

서열 이름	방향	서열(5'->3')
14U, 서열번호 1	정방향	CTCTTATTCTTCGCCTATGGAG
201U, 서열번호 2	정방향	GTCGCTCTCACTTTCCCCAA
537U, 서열번호 3	정방향	CCATCAGATGTTGGACTTTT
644L, 서열번호 4	역방향	AGTAGAATCCGTGTCACTCAG
1323L, 서열번호 5	역방향	ACCAAATGCAAGTATCCATC
Actin F, 서열번호 6	역방향	TGGACTCTGGTGATGGTGTG
Actin R, 서열번호 7	역방향	CCTCCAATCCAAACACTGTA

> CaSIG4 서열(서열번호 8)

1 GTGGGTATTG AAT CTCTTAT TCTTCGCCTA TGGAG TGTTT GACGCTAACT

14U >>

51 GGATTCTTGA AACATGTGGC TGAAAAGTAC CCTAGTCATC GTGCGATTTC

101 CGTTTCCGGC AGGCTCGATA TCACTCATGC ACGCCTTCAA CAACTCGTTG

151 AACGTGCCGC TTCTCAGATT GTAGCTGCCG GTGTAAAGCC TGGCGATGTC

201 GTCGCTCTCA CTTTCCCCAA CACAATCGAG TTCGTGATCA TGTTTTTAGC

201U >>

251 TGTAATTCGA GCTCGAGCTA CAGCAGCGCC ACTGAATTCA GCGTACATGG

301 CAGAAGAATT CGAGTTTTAT TTATCTGATT CAGAATCGAA ACTCTTATTA

351 ACTGCAAAAG AAGGAAACGA AGCAGCTCAA GCTGCTGCCT CCAAGCTAAA

401 AATCCCTCGT ATTAGTGTAA CTCTCTCTCA ACCCGACTCT GATGTCGCTT

451 TCTCCCCAGC TCCACCCGAA TCGGACCTTG AATCGATGTC CAAAATCGTT

501 AACGAA CCAT CAGATGTTGG ACTTTT CCTT CATACATCAG GCACCACTAG

537U >>

551 CAGGCCAAAA GGTGTTCCTC TGGCTCAGCT GAATTTGTTG TCTTCAGTAA

601 ACAATATCAA ATCGGTGTAC AAA CTGAGTG ACACGGATTC T ACTGTGATT

<< 644L

651 GTGTTGCCGT TGTTTCACGT TCACGGGTTA ATTGCGGGGT TACTGAGCTC

701 ACTTGGAGCC GGAGCAGCCG TGACACTTCC AGCTGCAGGG AGATTTTCAG

751 CTTCGACTTT TTGGTCAGAC ATGAAAAAAT ACAACGCAAC ATGGTACACA

<< 815L

801 GCTGTGCCTA CTATTCACCA AATTCTATTG GATCGTCACC TCAGCAAACC

851 CGAATCGGAT TACCCAAAGC TTCGGTTCAT TCGGAGCTGT AGTGCAGCAC

901 TGGCTCCATC AGTGATGGCG CGGCTAGAAG AAGCATTCGC GGCTCCTGTT

951 TTGGAGGCGT ATGCAATGAC TGAGGCAACC CATTTGATGG CTTCGAACCC

1001 CTTACCCGAG GATGGCCCAC ATATTCCCGG GTCAGTTGGG AAACCCGTGG

1051 GTCAAGAGAT GGGCATTTTG AATGAGAATG GGGAGTTACA AGGGCCTAAT

1101 GCTAAAGGGG AAGT TTGTAT AAGGGGTCCA AATGT GACAA AGGGATACAA

1184U >>

1151 GAACAATCCA GAGGCAAATA AATCAGCTTT CCAGTTTGGT TGGTTTCACA

1201 CTGGAGATGT GGGGTATTTG GACTCT GATG GATACTTGCA TTTGGT TGGA

<< 1323L

1251 AGAATCAAGG AGTTGATCAA CCGCGGAGGG GAGAAAATAT CACCTATTGA

1301 ATTGGATGCA GTCCTAGTTT CTCATCCAGA AATTGCTCAG GCTGTTGCTT

1351 TTGGAGTCCC TGACGACAAG TATGGTGAAG AGATAAACTG TGCAGTTATT

1401 CCAAGAGAAG GGTCAAACAT CGATGAAGCA GAGGTGCTGA GATTTTGCAA

1451 GAAGAATTTG GCAGCCTTTA AGGTCCCAAA GAAGGTCTTC ATGACTGATT

1501 CTCTTCCAAA AACTGCATCA GGAAAAATTC AACGCCGACT CGTTGCAGAG

1551 CACTTCCTTG CACAGATTTC AACTGCTAAA GTCCCCAAGT TTGGAGCATA

1601 GAAAAATTGT TGGCTATCTA CGATTCCTTC TCCTATTAAC AATAATAAAA

1651 ATGTGCTTTT CGATATTACT TACGTACCAT ACTACTTGGT CAAGAAATCG

1701 GGACACGAGA ATATATCAGT GCCTCTAGAT TTTCAGTAAT GGCGCAAGTA

1751 TATTCTCTTA TAGTCTTTTC AGGGTAGATA TTTTGTATTT CTCTACTTAG

1801 TATTGCAAAG GTTCTTTTAT TTGTAAGTTG TGACAATGCC TTGGACAAAT

1851 GAATGAAAGT GCAGTTTGTA AGGCCCTTAT TTAAAAAAAA AAAAAAAAAA

<1-2> 토마토·감자·고추의 CaSIG4 유전자 서열 유사성

상기 프라이머의 조합은 고추와 10개 작물종(은칭백 다다기오이, 만주잎 들깨, 적치마 상추, 쌈노정 배추, 광주 토마토, Williams 82 콩, Bt Maize, 낙동벼, 보리, 대서 감자)과 비교하면서 고추에 특이적인 PCR 산물을 생성하는지를 시험하기 위하여 사용되었다. 이때 gDNA가 PCR을 위해 적합한지를 알아보기 위하여 대조구로서 actin 유전자의 PCR을 통하여 확인하였다.

PCR 조건은 100 내지 200 ng의 주형 DNA, 2.5 ㎕ 10×PCR buffer, 0.2 mM dNTP, 1.5 mM MgCl₂, 0.5 μM의 각 프라이머 쌍 및 1.25 units AmpliTaqGold 중합효소(ABI, USA)의 총 25 ㎕의 반응액을 수득한 후, 95℃ 1분 유지 후, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 2%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다.

537U 프라이머와 1323L 프라이머를 사용하여 상기와 같이 PCR을 수행한 결과 11개의 작물 중에서 토마토·감자·고추 genomic DNA에서 기대되는 크기와 유사한 DNA 절편의 강한 생성을 관찰하였다(도 1). 생성된 DNA 절편에서 고추에 특이적인 영역(region)을 찾기 위하여 도 1의 PCR 산물을 아가로즈 겔로부터 QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, USA)를 이용하여 각각의 PCR 산물을 정제하여, 537U 프라이머와 1323L 프라이머를 사용하여 (주)솔젠터(한국)에 의뢰하여 시퀀싱하였다. 그 결과 토마토, 감자 및 고추의 결정된 서열에서 3' 영역에는 비슷한 서열이 많이 분포되어 있지만 5' 영역에서는 3개 작물에서 서열이 많이 다르다는 것을 알 수 있었다.

>SIG4 pepper 537F-1323R contig(서열번호 9)

CCATCAGATGTTGGACTTTTCCTTCATACATCAGGCACCACTAGCAGGCCAAAAGGTGTTCCTCTGGCTCAGCTGAATTTGTTGTCTTCAGTAAACAATATCAAATCGGTGTACAAACTGAGTGACACGGATTCTACTGTGATTGTGTTGCCGTTGTTTCACGTTCACGGGTTAATTGCGGGGTTACTGAGCTCACTTGGAGCCGGAGCAGCCGTGACACTTCCAGCTGCAGGGAGATTTTCAGCTTCGACTTTTTGGTCAGACATGAAAAAATACAACGCAACATGGTACACAGCTGTGCCTACTATTCACCAAATTCTATTGGATCGTCACCTCAGCAAACCCGAATCGGATTACCCAAAGCTTCGGTTCATTCGGAGCTGTAGTGCAGCACTGGCTCCATCAGTGATGGCGCGGCTAGAAGAAGCATTCGCGGCTCCTGTTTTGGAGGCGTATGCAATGACTGAGGCAACCCATTTGATGGCTTCGAACCCCTTACCCGAGGATGGCCCACATATTCCCGGGTCAGTTGGGAAACCCGTGGGTCAAGAGATGGGCATTTTGAATGAGAATGGGGAGTTACAAGGGCCTAATGCTAAAGGGGAAGTTTGTATAAGGGGTCCAAATGTGACAAAGGGATACAAGAACAATCCAGAGGCAAATAAATCAGCTTTCCAGTTTGGTTGGTTTCACACTGGAGATGTGGGGTATTTGGACTCTGATGGATACTTGCATTTGGT

>SIG4 potato 537F-1323R contig(서열번호 10)

CCATCAGATGTTGGACTTTTCTACATACATCAGGCACCACCAGCAGACCAAAAGGCGTTCCCCTAACACAGCACAATTTAGTATCATCAGTGAACAATATTAAATCGGTTTACAAACTCACTGAATCGGACTCTACAGTGATCGTGTTGCCACTCTTTCATGTTCATGGATTGATTGCAGGTAAATATGACCAAATCGATCAATTAGTACTCGTAATTCATCCAATTCATTTTGACCTTAGCAAATTTTTGAACATTTTATTAATTTGACCGTCTAATTGCAGGATTACTAAGCTCGCTTGGTGCTGGAGGATCCGTAACGCTCCCTGCTTCCGGTAGATTCTCTGCTTCATCTTTCTGGTCTGACATGATCAAGTCCAACGCCACATGGTACACCGCGGTGCCTACCATTCACCAGATCCTATTGGACCGTCATTTCAGCAACCCAGAGTCTTCTTACCCGAGACTCCGGTTCATTAGGAGTTGCAGTGCTGCTCTTGCACCATCCGTATTGGCACGGTTAGAGGAAGCATTTGGTGCGTCTGTTTTAGAGGCATATGCAATGACAGAAGCAACACATTTGATGTGTTCAAATCCATTACCAGAAAATGGTCCACATTTGCCAGGGTCAGTAGGGAAGCCAGTGGGACAAGAATTGGGGATATTGAATGAGAATGGTGTGGTACAAGGGGCTGATGAAAAGGGAGAAATTTGCATTAGGGGTCCAAATGTTACAAAAGGGTATAAGAATAATCCTGAGGCTAATAAATCTGCTTTTCAATTTGGTTGGTTTCATACTGGAGATGTGGGATATTTGGACTCTGATGGATACTTGCATTTGGT

>SIG4 tomato 537F-1323R contig(서열번호 11)

CCATCAGATGTTGGACTTTTCTACATACATCAGGCACTACCAGCAGACCAAAAGGCGTTCCCATAACACAGCACAATTTAGTATCATCTGTGAACAATATTAAATCGGTTTACAAACTCACTGAATCGGACTCTACAGTAATCGTCTTGCCACTGTTTCATGTTCATGGGTTGATTGCGGGTGAATATTACCAAATTCAATCAATTAGTACTCGTAATTCATTTTGACCTAAGCAAAATTTTTGATACATTGCAGGATTACTGAGCTCGCTTGGTGCTGGAGGATCTGTAACGCTCCCTGCTTCTGGTAGATTCTCTGCTTCATCTTTCTGGTCTGATATGCTCAAGTCCAACGCCACTTGGTACACCGCGGTGCCTACCATTCACCAGATCCTATTAGACCGTCATTTCAGCAATCCAGAGTCTTCTTACCCGAGACTCCGGTTCATTAGGAGTTGTAGTGCTGCTCTTGCACCATCCGTATTGGCACGGTTAGAGGAAGCATTTGGTGCGTCTGTTTTAGAGGCATATGCAATGACAGAGGCAACACATTTGATGTGTTCAAATCCATTACCAGAAAATGGTCCACATTTGCCAGGGTCAGTAGGGAAGCCAGTGGGCCAAGAATTGGGGATATTGAATGAGAATGGTGTGGTACAAGGGGCTAATGAAAAAGGGGAAATTTGCATTAGGGGTCCAAATGTTACAAAAGGATATAAGAATAATCCTGAGGCTAATAAATCTGCTTTTCAATTTGGTTGGTTTCATACTGGAGATGTGGGATTTTTGGACTCTGATGGATACTTGCATTTGGT

CaSIG4 유전자에서 제작한 프라이머 537U와 1323L을 사용하여 고추, 감자 및 토마토에서 얻은 CaSIG4 genomic DNA의 서열을 하기와 같이 정렬하였다.

따라서 5' 영역에 해당하는 cDNA 염기서열에서 제작한 프라이머를 사용하여(14U, 201U, 644L) 상기 11개 작물에서 PCR을 통해 고추 특이적인 산물이 생성되는지를 확인하였다. 100 ng의 genomic DNA, 1×PCR 완충액(10 mM Tris-HCl, 40 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, pH 9.0), 0.2 mM dNTP, 1 μM 각 프라이머와 1.2 units의 Taq 중합효소(Bioneer, Korea)를 PTC DNA EngineTM System(MJ Research, USA)을 사용하여 94℃ 3분, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초를 36회 반복하고 마지막으로 72℃에서 5분간 연장 반응시켰다.

그 결과 14U와 644L 또는 201U와 644L 2쌍을 사용하여 PCR한 결과는 고추에서만 PCR 산물을 생성하였고, cDNA 염기서열에 기초하여 기대되는 산물보다 크기가 약 270 bp 이상 더 큰 산물을 생성하였다(도 2). 이 결과는 고추의 CaSIG4 유전자는 이 부위에서 인트론을 함유하고 있음을 제시한다. 통상적으로 유전자의 엑손 부위보다는 인트론 부위가 변이가 심하므로 종 특이성이 높을 것으로 예상되어, 이 PCR 산물을 아가로즈 겔로부터 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)를 이용하여 각각의 PCR 산물을 정제하여, (주)솔젠터(한국)에 의뢰하여 시퀀싱하였다.

CaSIG4 유전자에서 제작한 프라이머 14U와 644L을 사용하여 시퀀싱한 고추 CaSIG4 genomic DNA의 서열은 아래와 같다(서열번호 12). 서열번호 12번에 예상되는 인트론이 전사 시에 잘려나가는 부위의 보존된 염기인 GT-AG 염기를 굵은 글자체 및 밑줄로 표시하였고, 인트론 서열은 이탤릭으로 표시하였고, 고추 특이 염기서열을 확보하기 위해 제작된 프라이머의 위치를 하기와 같이 나타내었다.

(서열번호 12)

1 CTCTTATTCT TCGCCTATGG AGTGTTTGAC GCTAACTGGA TTCTTGAAAC

14U >>

51 ATGTGGCTGA AAAGTACCCT AGTCATCGTG CGATTTCCGT TTCCGGCAGG

151 CTCGATATCA CTCATGCACG CCTTCAACAA CTCGTTGAAC GTGCCGCTTC

201 TCAGATTGTA GCTGCCGGTG TAAAGCCTGG CGATGTCGTC GCTCTCACTT

251 TCCCCAACAC AATCGAG GT T CCATTTCTTT TTCCCCTTTG TTTCATACAA

201U >>

301 AATTAAAAAA GACAGTTCCG TGCATTTAAC TGATCAAGAA GGAGGCTGTT

351 TTCGCAACTT GAATCTCGTC ACATGTATGT GTTACAGAAT CTGAAAGAAA

254U >>

401 AAAGAAAACA GGATTTTTTT TTTTTTTTAT ATTATGTTAA TTCGGGAAAA

451 AAGGAGGAGT TTTACGGTAG TTTTGTGATA TAATCAGGAT TGTATTTTCA

501 CACTAGGCGA ATTAGTACTA ATTGTCTTTT GAATTTTGTT TTAC AG TTCG

551 TGATCATGTT TTTAGCTGTA ATTCGAGCTC GAGCTACCGC AGCGCCACTG

601 AATTCAGCGT ACATGACAGA AGAATTCGAG TTTTATTTAT CTGATTCAGA

651 ATCGAAACTC TTATTAACTG CAAAAGAAGG AAACGAAGCA GCTCAAGCTG

701 CTGCCTCCAA GCTAAAAATC CCTCGTATTA GTGTAACTCT CTCTCAACCC

751 GAGTCTGATG TCGCTTTCTC CCCTGCTCCA CCCGAATCGG ACCTTGAATC

801 GATGTCCAAA ATCGTTAACG AACCATCAGA TGTTGGACTT TTCCTTCATA

851 CATCAGGCAC CACTAGCAGG CCAAAAGGTG TTCCTCTGGC TCAGCTGAAT

901 TTGTTGTCTT CAGTAAACAA TATCAAATCG GTGTACAAAC TGAGTGACAC

<< 644L

911 GGATTCTACT GTGA

<1-3> 고추 CaSIG4 gDNA의 종간 특이성

서열번호 12를 바탕으로 다시 고추 특이적 프라이머 세트를 상기와 같이 Primer 3 프로그램을 이용하여 본 인트론 부위에서 254U (TTCGCAACTTGAATCTCGTC) 프라이머를 제작하여 644L과 PCR에서 고추특이 산물을 생성하는 프라이머쌍을 사용한 결과는 상기의 여타 작물에서 PCR 산물이 생성되지 않고 고추에서만 기대되는 산물이 생성됨을 확인하였다(도 3).

PCR 증폭을 위한 고추-특이적 프라이머 세트

유전자	프라이머	Sequence (5'-3')
CaSIG4	254U, 서열번호 13	TTCGCAACTTGAATCTCGTC
	644L, 서열번호 4	AGTAGAATCCGTGTCACTCAG

<실시예 2> 내재유전자 CaSIG4의 다형성(polymorphism) 분석

고추종내 품종간에 내재유전자 CaSIG4의 다형성이 나타나는지 확인하기 위하여 CaSIG4 내재유전자의 프라이머(254U, 644L)를 사용하여 상기에 기술한 PCR 시약을 사용하여 95℃ 1분, 94℃ 30초 54℃ 30초 72℃ 30초를 35회 반복하고, 72℃ 5분 조건에서 PCR을 실시하였다. 그 결과 분석한 5종의 다른 고추 품종에서 고추에서 다형성이 나타나지 않는 것을 확인하였다(도 4).

<실시예 3> CaSIG4 유전자의 카피(copy) 수 분석

CaSIG4의 고추 유전체상의 카피수는 기존의 보고에 따르면 1카피로 알려져 있다(Lee 등. Molecular cloning of a novel pathogen-inducible cDNA encoding a putative acyl-CoA synthetase from Capsicum annuum L.. Plant Mol. Biol. (2001) 46: 661-671). 본 발명은 내재유전자의 조건인 유전체 상의 1카피를 확인하는 정도에서 하기의 실험을 진행하였다. 상기 프라미어 254U와 644L를 사용하여 고추 gDNA에서 획득한 PCR 산물을 T-easy 벡터(Promega, USA)와 연결하였다. 상기 벡터를 대장균에 형질전환한 뒤 상기 형질전환된 대장균을 증식하여 플라스미드를 추출하였다. 상기 플라스미드를 주형 DNA로 하여 50 ng의 주형 DNA, 2.5 ㎕ 10×PCR 완충액, 0.2 mM Biotin-14-dCTP, 1.5 mM MgCl₂, 0.5 μM의 프라이머 254U와 644L 및 1.25 units AmpliTaqGold 중합효소(ABI, USA)의 총 25 ㎕의 반응액을 수득한 후, 95℃ 1분, 94℃ 30초, 56℃ 30초, 72℃ 30초, 35회 반복, 72℃ 5분의 조건으로 PCR을 수행하였다. 최종 반응산물은 1%(w/v) 아가로즈 겔 전기영동에서 확인하였다. 상기 아가로즈겔로부터 QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen, USA)을 이용하여 PCR 산물을 정제함으로써 프로브를 제작하였다.

고추근계 512의 두 점의 genomic DNA와 고추근계 915의 두 점의 genomic DNA를 각각 5 ㎍ 씩 EcoR I으로 절단하여 상기 CaSIG4 프로브로 사용하여 써던 블롯팅을 Jeong 등에 기술된 방법에 따라(Jeong 등, Molecular analysis and quantitative detection of a transgenic rice line expressing a bifunctional fusion TPSP. Food Control 18 (2007) 1434-1442) 블롯팅 분석을 한 결과, 품종에 관계없이 각각의 레인에서 하나의 밴드가 관찰되었는데, 이는 CaSIG4유전자는 고추 게놈에 1카피씩 존재함을 제시하는 것이다(도 5).

<실시예 4> 도입유전자의 게놈상의 위치

DNA를 이용한 검출방법은 유전자 변형 식물에 많이 사용되는 도입유전자나 조절부위 염기서열에서 제작한 특이적 프라이머를 PCR에 이용함으로써 1차적인 검출이 가능하며, 보다 바람직하게는 유전자 변형 농산물의 도입유전자와 삽입 인접 부위에서 특이적인 프라이머를 제작하여 각각의 사상(event) 특이 검정을 할 수 있다. 도입유전자와 삽입 인접 부위의 염기서열을 하기와 같이 탄저병 저항성 PepEST 유전자가 도입된 형질전환 고추의 사상을 이용하여 분석하였다.

<4-1> 도입유전자 카피수

PepEST 형질전환 고추의 개발자(금호생명환경연구소)는 사상의 제공시에 단일 도입유전자를 가진 것임을 제시하였으나, 개발자가 고추유전자인 PepEST를 사용하여 카피수 측정 써던 블롯팅 분석을 하였기 때문에 도입유전자 카세트(cassette) 특이 프로브를 사용한 분석이 필요하였다.

먼저, 고추 근계(inbred line) 512, PepEST 형질전환 사상 68-7, 69-3, 을 격리온실에서 재배한 후 고추 잎에서 CTAB 방법을 이용하여 DNA를 추출하여 형광정량법으로 정량하였다. pCAMBIA1300 의 hygromycin phosphotransferase 유전자(HPTII) 위치에서 서열번호 14(Hygromycin 3F GAAAAAGCCTGAACTCACC) 및 서열번호 15(Hygromycin 546R GTGTCGTCCATCACAGTTT)의 프라이머를 사용하여 PCR 증폭하여 프로브를 제작하였다(도 6). 프로브를 기준으로 한쪽 방향에만 제한효소 절단부위가 있는 EcoRI, HindIII 및 SspI 등의 제한효소를 선정하여 각 사상별 DNA 5 μg에 30 unit 처리하여 밤새 반응하였다. 이 고추 DNA를 1% Seakem 아가로즈 겔에 전기영동한 후 분리된 DNA를 모세관현상을 이용하여 멤브레인으로 트랜스퍼하여 써던 블롯팅을 수행하였다. 제작한 프라이머와 비오틴-14-dCTP를 이용하여 프로브 PCR 하였는데 그 과정은, 처음 95℃에서 1분간 반응하고, 94℃에서 30초간 변성화반응, 58℃에서 30초간 프라이머 결합반응, 72℃에서 30초간 연장 반응을 35회 반복하고 최종적으로 72℃에서 5분간 연장반응하였다. 이렇게 얻어진 PCR 산물을 겔 정제(gel purification) 방법으로 정제하여 95℃에서 변성화시키고 200~500 ng을 DNA와 혼성화(hybridization)시켰다. 다시 프로브에 Avidx-AP^TM Conjugate(ABI, USA)를 1:5,000 처리하고, CDP-Star^® (ABI, USA) 기질을 붙여 X-ray 필름에 노출시키고 현상하였다.

그 결과, PepEST 형질전환 고추 사상 68-3과 69-7의 써던 블롯팅 분석 결과는 1카피의 도입유전자를 가지는 것으로 예측되었고, 혼성화 패턴이 비슷하였다 (도 7).

<4-2> 도입위치 염기서열

도입유전자의 써던 블롯팅 분석 결과에 기초하여, 68-3과 69-7번 사상의 도입유전자의 도입부위 인접 염기서열을 인버스(inverse) PCR을 사용하여 해명하였다.

<4-2-1> 인버스 PCR

고추 2 μg의 gDNA를 right border의 인버스 PCR을 위해 NcoI 또는 EcoRI을 사용하여 절단하였고, left border의 인버스 PCR을 위해 도입 벡터의 말단 부위에 제한효소 절단부위가 없는 NdeI 또는 EcoRI을 사용하여 절단하였다. 제한효소로 절단된 DNA는 페놀-클로로포름(24:1) 용액으로 정제되었고, 이중 0.2 μg DNA는 T4 DNA 리가아제(Promega, USA)를 사용하여 16℃에서 16시간 이상 반응시켜 분자내 라이게이션(총 반응 부피 50 μl)을 수행하였다.

Right border의 인버스 PCR을 자세히 설명하면, 1차 PCR은 위의 라이게이션 혼합액 3 μl, 0.1 mM dNTPs, 1 unit Ex Tag(Takara, Japan), 1×Ex tag 완충액 및 R1과 F1(또는 RBL1과 RBU1) 프라이머를 50 pM 포함하도록 하여 50 μl로 반응시켰다. 1차 PCR 프로그램은 처음에 94℃에서 3분간 반응하였고, 94℃에서 30초간 변성화반응, 58℃에서 30초간 프라이머 결합반응, 72℃에서 5분간 연장 반응을 25회 수행하였다. 2차 PCR(nested PCR)은 1차 PCR 산물 1 μl, 10 mM dNTPs, 1 unit Ex tag(Takara, Japan), 10×Ex Tag 완충액 및 50 pmol R3와 F3(또는 RBL2와 RBU2) 프라이머로 구성된 혼합물로 수행하였다. 처음 94℃에서 3분간 반응하였고, 94℃에서 30초간 변성화 반응, 58℃에서 30초간 프라이머 결합반응을 35회 수행하고, 72℃에서 5분간 연장반응하였다.

일차 PCR 및 2차 PCR에 사용된 프라이머 세트의 염기서열은 하기 표 3에 나타낸 바와 같다. 2차 PCR 산물은 pCR2.1 Topo 벡터(Invitrogen, USA)에 클로닝하여 전체의 염기서열을 확인하였다.

PepEST 형질전환 고추의 PCR에 사용된 프라이머

인버스 PCR의 부위	프라이머	서열 (5'-3')
Right border	R1 (468), 서열번호 16	CTGTGTTCTTGATGCAGTTAGTCCTGAATC
	R3 (398), 서열번호 17	TTTCCTGGAGATTATTGCTCGGGTAGATCGTC
	F1 (2144), 서열번호 18	CCGATCGTTCAACATTTGGCAATAAAGTT
	F3 (2174), 서열번호 19	TCTTAAGATTGAATCCTGTTGCCGGTCTT
Left border	R2 (2638), 서열번호 20	GCTCTAGCCAATACGCAAACCGCCT
	R4 (2548), 서열번호 21	CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGT
	F2 (4427), 서열번호 22	GTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACC
	F4 (4536), 서열번호 23	TCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATA
Right border	RB 155L1(RBL1), 서열번호 24	GTAATAGCGAAGAGGCCC
	RB 105L2(RBL2), 서열번호 25	CTGAATGGCGAATGCTAG
	RB 254U1(RBU1), 서열번호 26	CAGTCACGACGTTGTAAAAC
	RB 301U2(RBU2), 서열번호 27	AGGTCCCCAGATTAGCCT
Left border	LB 4269U1(LBU1), 서열번호 28	GACTCCGGGCGTATATGC
	LB 4303U2(LBU2), 서열번호 29	TGACCAACTCTATCAGAGCTT
	LB 4181L1(LBL1), 서열번호 30	TCCATACAAGCCAACCAC
	LB 4155L2(LBL2), 서열번호 31	AGAAGAAGATGTTGGCGAC

<4-2-2> 염기서열의 분석

BioEdit 프로그램을 사용하여 인버스 PCR 산물의 염기서열의 제한효소 위치에서 각각의 역방향의 상보적 염기서열을 획득하여 gDNA 상의 염기서열로 환원하였다. 삽입체와 삽입체에 인접한 gDNA의 염기서열은 GenBank database (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)에 대한 블라스트 서치로 분석하였다.

<4-2-3> 도입위치 염기서열 확인

하기 Right border와 left border 인접 gDNA 염기서열(flanking gDNA 서열은 이탤릭체로 표기)은 인버스 PCR 결과를 도입유전자의 양쪽 끝과 인접 genomic DNA의 염기서열을 정방향으로 편집한 결과이다(서열번호 32과 33)

Right border(서열번호 32)

AATATTTAATAAATGCAATATTTATTTGATTAATTCAATATATAACAAATGTGATAGTTATTTACAGAGCAAATGATCGAGAATTTAATTTAATTGAAAAAAATAAAAAGTAGAAATACTATTTATGACATTCTGTGAGGATTAATCAATACAACAAATTCCTAAAAAATTACAAATATGGCTATGATGGTGTGAGTAAGAGGAGAGGAGGGATGAATGAGAACAAAAAAAAAGGAGCGATTAATAATATTTGACATATGTTAAGCTTTTTTCATATAAAAAATTAATATTTATGCACTTTATTAAAATGACGAAGAATTAAATGTGTGAATAACACAAATAGTTATTTAGAATTGGTATAACATGAAGATAGAATTGAAGTGGATTATGTCGTTTAACTTATATTAGTACTGCTAAAAAGATTCATTAGAAATATTAATTAACTCAGAGTGCAATCCTTTTCTTGAATTTGTAGATATATTTTCAAAAACATTATATATATACAGAAATCAATAAGATGGTGCATAATTTCTGTATTATTAATATTTACACTTCTCTTTATTCTATTCTTCTTTTTGAGAATTTTCATTTTATTGAGGTTTTTATTCATCCTAACCTACGGACTAATAGAAGTCTCAAAAATAAATAGAGTGCTTAAGCATAAATAGTCTTTGCATAAGCACGAACCAGCTACGA GCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCCTTTTCAATTTCAGAAAGAATGCTAACCCACAGATGGTTAGAGAGGCTTACGCAGCAGGTCTCATCAAGACGATCTACCCGAGCAATAATCTCCA

Left border(서열번호 33)

GTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGAAATAGAGTAGATGCCGACCGGGATCTGTCGATCGACAAGCTCGAGTTTCTCCATAATAATGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAGGGAATTAGGGTTCCTATAGGGTTTCGCTCATGTGTTGAGCATATAAGAAACCCTTAGTATGTATTTGTATTTGTAAAATACTTCTATCAATAAAAGTAATGAGTTTATATATGATGCAATATTTTTTTTCTTTTGGTAATAAAAATCCAATTCGTTTAAATTTGAGGACTAAAAAATTTTTAATTTATATATTCAATAAAAAAATACTATGTCATAATTAAATAAGAGTTCTGCGAACCAATTCACTAGTTTTTAATACATCAATTGTTTGATGATAAATACACATTACTAATTTCCTGAATTTCAATTTCTATGTTATTAATTCTTATATTACAATCATTATATTACTAATTAATGCACAACTTTGTTTATAAACCAATCGACACTATTGTATGTCCAAGTCGTAGGTGTTTTTTTTTCTCTTCTTATCCCATATACTTATATCGTATTTGTACCAAATAATTGATAGTACAATGGTTGATAGTTGTGGCAATAATTATTCCTTAATTTTTGTCGTTTTAACAAATTGGCAAAGTACCTTTTTTAGCAAAAAATAAATAAATTGAGAAAGTAACTTTTTTGAGAAAAAAAAGAAGTATTTCATTGGAATGATTAGAAACCTTTTCAAGGATGAAATTCTTTATTTTTCTTTTAAAAGAAGACAACAATATCAATGATCTAATAAGCTAATTTATTGGCTCTATAACCATTTGGATAATTTTGGACTTTTAATAAAATTAAAAATTCCATAAATGCAATCTCAAGATGGTTAATATTGGATCTGCCAAAGATATAATTATGATGAATAAGGAGTGCTCAACTTAATATATTAAATTATTTTTGATAAAAATTTTAATTTTACGATTGATATGTTGATAAAATTATTTCTGCTCAAAAATTTCCCTTTTATATACAACTATTCTTCCTACAAAAAAGTATTTAAAATCAAGTTAAAATATTCAACGGTTCTTCATCCTATCACCATGCTATTAAGGGAATAATTTGAACATATTATTATATAAATTGTTGGATTTTCTTAATATATGACAAGATTCTAATTTAGTATAAAAAGGTCC

서열번호 34(PepEST 68_cfm-2, 5'-ATTCATCCTAACCTACGGAC-3') 와 서열번호 29(RB 105L2(RBL2), CTGAATGGCGAATGCTAG) 또는 서열번호35(LB cfm 68L-2, 5'-CGAATTGGATTTTTATTACC-3')와 서열번호 28(LB 4269U1(LBU1), GACTCCGGGCGTATATGC)의 뉴클레오티드로 구성된 프라이머를 사용하여 확인 PCR한 결과, 68-7과 69-3을 포함하여 68-1, 69-6은 동일한 사상이었다(도 8). 본 결과에 바탕하여 이후 68+ 및 69+ 사상은 이후 68번 사상으로 칭하였다. NCBI 데이터베이스에 대한 블라스트 서치 결과는 68번 사상의 인접 gDNA 서열은 알려진 유전자의 서열과는 유의성있는 유사성이 없었다(noncoding 부위).

또한, 68번 사상의 도입유전자 카세트는 right border에서 106bp, left border에서 145bp의 결실이 일어나면서 삽입되었으므로 유전자 카세트내의 PepEST와 HPTII 유전자는 구조적으로 온전히 발현이 될 것으로 예측되었다.

상기 68번 사상의 도입유전자 카피수의 분석과 도입유전자의 도입 위치 분석 결과에 기초하여 68번 사상을 실례로 하여 하기 사상특이 정성 및 정량 분석 키트를 개발하였다.

<실시예 5> CaSIG4 유전자 특이적 프라이머와 도입위치 특이 프라이머를 이용한 Multiplex PCR에 의한 사상특이 정성 PCR 키트의 제작

상기 실시예 4의 68번 사상 특이 정성 PCR 검출을 위한 일군의 프라이머를 right border와 left border 내부와 인접 gDNA 염기서열(서열번호 32 및 33)에서 고안하여 본 발명에서 발굴한 고추 내부양성대조유전자 CaSIG4 특이적 프라이머 세트와 multiplex PCR을 수행하는 정성 PCR 검출 키트를 제작하였다(표 4).

주형	프라이머 서열
CaSIG4	254U, 서열번호 13 644L, 서열번호 4	TTCGCAACTTGAATCTCGTC AGTAGAATCCGTGTCACTCAG
Right end	정방향, 서열번호 36 역방향, 서열번호 37	CATAAGCACGAACCAGCTA GTTTTACAACGTCGTGACTG
Left end	정방향, 서열번호 38 역방향, 서열번호 39	TCAGAGTGCAATCCTTTTCT GTTACCCAACTTAATCGCCT

본 발명에 따른 프라이머 세트가 유효하게 LM-고추를 특이적으로 검출하는지 확인하기 위하여, CaSIG4 특이적 프라이머와 상기 68번 사상의 도입 유전자 인접 gDNA 염기서열에서 고안한 프라이머를 이용한 multiplex PCR을 Saghai Maroof의 논문(PNAS 81, 8014-8018, 1984)에 따라 내재유전자 프라이머를 각각 1.5μM, 도입유전자 프라이머를 각각 0.5μM 사용하여 상기 PCR 조건으로 수행하였다.

그 결과, LM-고추인 68번 사상에만 특이적인 PCR 산물이 확인하여 사상특이 정성 PCR 키트를 완성하였다(도 9).

<실시예 6> TaqMan 프로브를 사용한 정량 실시간 PCR

실시간 PCR용 프라이머 및 프로브는 68번 사상 삽입체 염기서열에 기초하여 PCR 산물의 크기, GC함량, 온도 등을 고려하여 도입유전자의 증폭을 위한 프라이머와 프로브 위치를 고안하였다. 또한 고추에 특이적인 내재유전자 CaSIG4 유전자의 염기서열을 확인한 후 내재유전자의 증폭을 위한 프라이머와 프로브 위치를 제작하였다. 프라이머와 프로브의 제작 및 합성은 Applied Biosystems (Foster City, CA)에 의뢰하였다. 이때 프로브의 5'말단과 3'말단에 각각 리포터 염료와 퀀처 염료를 결합시켰다.

68번 사상 잎 조직으로부터 순수하게 추출한 genomic DNA를 바이오니아사에서 구입한 BioQ-mini flourometer(한국)와 Molecular Probe사(미국)의 Picogreen dsDNA 정량 키트를 사용하여 정량한 후, 고추 genome의 14,000 copies/5 ul 기준 시료를 만든 후 연속적으로 2 배씩 희석하여 기준 시료를 만들었다. 상기 기준 시료로부터 실시간 PCR은 하기 표 5의 프로브/프라이머 쌍을 이용하고, DNA 5 μl, ABI master mix 1X, 프라이머 0.5 μM, 프로브 0.2 μM에 증류수(DW)를 첨가하여 총 25 μl의 반응 용액으로 4 회분(4 well) 이상의 반응액을 만들어 95℃에서 1분, 95℃에서 30초 및 60℃에서 30초로 50회 반복 수행하고 이를 반복하여 LOD 및 LOQ를 확인하였다. Limit of detection(LOD) 및 Limit of quantitation(LOQ) 확인은 기본적으로 Berdal과 Holst-Jensen(Berdal and Holst-Jensen(2001) European Food Research and Technology 213: 432-438)의 방법을 따랐다.

실시간 PCR을 위해 CaSIG4와 event 68의 도입유전자 카세트(cassette)의 right end-flanking DNA sequence 및 NOS terminator에서 제작한 프라이머와 프로브는 하기 표 5와 같고, 프로브의 5'말단은 FAM으로 3'말단은 MGBNFQ로 라벨링하였다.

도 10의 표준 곡선에서 확인할 수 있는 바와 같이, right end-flanking DNA의 PCR 효율값(efficiency, E)은 98%, 회기계수는 0.998로써 정량에 적합하였다.

PCR을 반복 수행함에 따라 정량 곡선의 변이(fluctuation)가 적은 카피수의 시료에서 나타나기 시작하였고, right end-flanking DNA의 경우 7과 14 copies 사이에서 Ct값의 표준편차의 측정치에 기초한 변이가 1이하로 나타나 LOQ를 7과 14 copies 사이로 결정하였고, 3.5 copies에서 검출시그널이 모두 나타나므로 LOD를 3.5 copies/5ul 이하로 결정하였다(도 11, 표 6).

초기 계산된 주형 카피수에 기초한 PepEST 형질전환 고추 68번 사상의 카피수별 기준시료에서 right end-flanking DNA의 Ct값

Estimated no. of template molecules	280	140	70	28	14	7	3.5
Signal rate (number of positives)	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4
Mean Ct-value (of positives)	30.43	31.28	32.38	33.96	34.78	35.40	37.57
SD of observed Ct-values	0.07	0.11	0.15	0.52	0.31	0.58	1.08
△Ct	NA	0.85	1.10	1.58	0.82	0.62

Right end-flanking DNA의 TaqMan 정량법의 개발 방법과 같은 방법으로 CaSIG4 및 NOS의 TaqMan 방법을 개발하였다. NOS의 경우 LOQ는 <7 copies/5ul 사이로, LOD는 7 이하로 결정되었다(표 7).

초기 계산된 주형 카피수에 기초한 PepEST 형질전환 고추 68번 사상의 카피수별 기준시료에서 NOS의 Ct값

Estimated no. of template molecules	280	140	70	28	14	7	3.5
Signal rate (number of positives)	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4	4/4
Mean Ct-value (of positives)	29.33	30.52	31.55	32.89	34.16	34.85	36.93
SD of observed Ct-values	0.05	0.13	0.25	0.13	0.36	0.23	0.7
△Ct	NA	1.19	1.03	1.34	1.27	0.69

CaSIG4의 경우 LOQ는 7과 3.5 copies/5ul 사이로, LOD는 3.5 이하로 결정되었다(표 8).

초기 계산된 주형 카피수에 기초한 PepEST 형질전환 고추 68번 사상의 카피수별 기준시료에서 CaSIG4의 Ct값

Estimated no. of template molecules	280	140	70	28	14	7	3.5
Signal rate (number of positives)	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3	3/3
Mean Ct-value (of positives)	30.96	31.93	33.02	34.68	35.79	36.53	38.58
SD of observed Ct-values	0.14	0.07	0.11	0.14	0.13	0.24	0.88
△Ct	NA	0.96	1.09	1.66	1.10	0.74

결론적으로 위와 같이 LOQ의 값이 7이하로 결과하는 TaqMan 정량 검출 키트는 한국, 일본, 유럽연합에서 각각 요구하는 LMO 혼입치인 3%, 5%, 0.9% 를 검출하는데 Jeong 등(Molecular analysis and quantitative detection of a transgenic rice line expressing a bifunctional fusion TPSP. Food Control 18 (2007) 1434-1442)이 벼를 사용하여 측정한 바에 따르면 형질전환 고추의 혼입률 분석에 충분히 적용할 수 있는 정량 검출 감도이다.

도 1은 537U 프라이머와 1323L 프라이머를 사용하여 11개 작물에서 PCR한 결과를 나타낸 도면이다.

도 2는 11개 작물에서 5' 영역을 PCR한 결과를 나타낸 도면이다.

도 3은 고추 CaSIG4 특이적 프라이머를 이용한 PCR 결과를 나타낸 도면이다.

도 4는 고추 내재유전자 CaSIG4의 종내 다형성 분석 결과를 나타낸 도면이다. 레인 1: 고추 근계 512, 레인 2: 고추 근계 915, 레인 3: 청풍명월 고추, 레인 4: 태산 고추, 레인 5: 마니따 고추, 레인 M, 100 bp ladder; 레인 NC, 음성대조군.

도 5는 CaSIG4 유전자의 카피수 분석을 위한 써던 블롯팅한 결과이다. 레인 1: 고추근계 512-1, 레인 2: 고추근계 512-2, 레인 3: 고추근계 915-1, 레인 4: 고추근계 915-2.

도 6은 PepEST/pCAM1300 벡터에서 프로브의 위치를 나타낸 도면이다.

도 7은 PepEST 형질전환 고추의 유전자 써던 블롯팅 분석 결과를 나타낸 도면이다.

도 8은 인버스 PCR에서 얻은 서열 정보를 바탕으로 68번 사상의 융합부위(incorporation site)를 확인한 결과이다.

도 9는 68번 사상 융합 부위의 오른쪽과 왼쪽 말단으로부터 제작된 프라이머쌍을 이용한 사상 특이적 multiplex PCR을 수행한 결과를 나타낸 도면이다.

도 10은 100 % PepEST 형질 전환 고추의 event 68에서 희석한 DNA에 기초한 right end-flanking DNA의 증폭 효율값(E)의 추정치 및 검정표준곡선(calibration curves)을 나타낸 도면이다.

도 11는 약 280, 140, 70, 28, 14, 7 및 3.5 초기 주형 카피(5 μl = PCR에 첨가되는 부피)를 포함한 68번 사상 고추의 7가지 희석액에 대한 four parallels에 기초한 절대적인 검출 및 정량 한계의 추정값을 나타낸 도면이다. Right end-flanking DNA는 평균적으로 3.5 초기 주형 카피 이하로 모든 희석액의 parallel에서 검출된다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> The method for detecting a LM pepper using CaSIG4 as an endogenous positive control gene <130> 7p-09-57 <160> 48 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 14U primer <400> 1 ctcttattct tcgcctatgg ag 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 201U primer <400> 2 gtcgctctca ctttccccaa 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 537U primer <400> 3 ccatcagatg ttggactttt 20 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 644L primer <400> 4 agtagaatcc gtgtcactca g 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1323L primer <400> 5 accaaatgca agtatccatc 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin F primer <400> 6 tggactctgg tgatggtgtg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Actin R primer <400> 7 cctccaatcc aaacactgta 20 <210> 8 <211> 1900 <212> DNA <213> CaSIG4 sequence <400> 8 gtgggtattg aatctcttat tcttcgccta tggagtgttt gacgctaact ggattcttga 60 aacatgtggc tgaaaagtac cctagtcatc gtgcgatttc cgtttccggc aggctcgata 120 tcactcatgc acgccttcaa caactcgttg aacgtgccgc ttctcagatt gtagctgccg 180 gtgtaaagcc tggcgatgtc gtcgctctca ctttccccaa cacaatcgag ttcgtgatca 240 tgtttttagc tgtaattcga gctcgagcta cagcagcgcc actgaattca gcgtacatgg 300 cagaagaatt cgagttttat ttatctgatt cagaatcgaa actcttatta actgcaaaag 360 aaggaaacga agcagctcaa gctgctgcct ccaagctaaa aatccctcgt attagtgtaa 420 ctctctctca acccgactct gatgtcgctt tctccccagc tccacccgaa tcggaccttg 480 aatcgatgtc caaaatcgtt aacgaaccat cagatgttgg acttttcctt catacatcag 540 gcaccactag caggccaaaa ggtgttcctc tggctcagct gaatttgttg tcttcagtaa 600 acaatatcaa atcggtgtac aaactgagtg acacggattc tactgtgatt gtgttgccgt 660 tgtttcacgt tcacgggtta attgcggggt tactgagctc acttggagcc ggagcagccg 720 tgacacttcc agctgcaggg agattttcag cttcgacttt ttggtcagac atgaaaaaat 780 acaacgcaac atggtacaca gctgtgccta ctattcacca aattctattg gatcgtcacc 840 tcagcaaacc cgaatcggat tacccaaagc ttcggttcat tcggagctgt agtgcagcac 900 tggctccatc agtgatggcg cggctagaag aagcattcgc ggctcctgtt ttggaggcgt 960 atgcaatgac tgaggcaacc catttgatgg cttcgaaccc cttacccgag gatggcccac 1020 atattcccgg gtcagttggg aaacccgtgg gtcaagagat gggcattttg aatgagaatg 1080 gggagttaca agggcctaat gctaaagggg aagtttgtat aaggggtcca aatgtgacaa 1140 agggatacaa gaacaatcca gaggcaaata aatcagcttt ccagtttggt tggtttcaca 1200 ctggagatgt ggggtatttg gactctgatg gatacttgca tttggttgga agaatcaagg 1260 agttgatcaa ccgcggaggg gagaaaatat cacctattga attggatgca gtcctagttt 1320 ctcatccaga aattgctcag gctgttgctt ttggagtccc tgacgacaag tatggtgaag 1380 agataaactg tgcagttatt ccaagagaag ggtcaaacat cgatgaagca gaggtgctga 1440 gattttgcaa gaagaatttg gcagccttta aggtcccaaa gaaggtcttc atgactgatt 1500 ctcttccaaa aactgcatca ggaaaaattc aacgccgact cgttgcagag cacttccttg 1560 cacagatttc aactgctaaa gtccccaagt ttggagcata gaaaaattgt tggctatcta 1620 cgattccttc tcctattaac aataataaaa atgtgctttt cgatattact tacgtaccat 1680 actacttggt caagaaatcg ggacacgaga atatatcagt gcctctagat tttcagtaat 1740 ggcgcaagta tattctctta tagtcttttc agggtagata ttttgtattt ctctacttag 1800 tattgcaaag gttcttttat ttgtaagttg tgacaatgcc ttggacaaat gaatgaaagt 1860 gcagtttgta aggcccttat ttaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1900 <210> 9 <211> 740 <212> DNA <213> CaSIG4 pepper 537F-1323R contig <400> 9 ccatcagatg ttggactttt ccttcataca tcaggcacca ctagcaggcc aaaaggtgtt 60 cctctggctc agctgaattt gttgtcttca gtaaacaata tcaaatcggt gtacaaactg 120 agtgacacgg attctactgt gattgtgttg ccgttgtttc acgttcacgg gttaattgcg 180 gggttactga gctcacttgg agccggagca gccgtgacac ttccagctgc agggagattt 240 tcagcttcga ctttttggtc agacatgaaa aaatacaacg caacatggta cacagctgtg 300 cctactattc accaaattct attggatcgt cacctcagca aacccgaatc ggattaccca 360 aagcttcggt tcattcggag ctgtagtgca gcactggctc catcagtgat ggcgcggcta 420 gaagaagcat tcgcggctcc tgttttggag gcgtatgcaa tgactgaggc aacccatttg 480 atggcttcga accccttacc cgaggatggc ccacatattc ccgggtcagt tgggaaaccc 540 gtgggtcaag agatgggcat tttgaatgag aatggggagt tacaagggcc taatgctaaa 600 ggggaagttt gtataagggg tccaaatgtg acaaagggat acaagaacaa tccagaggca 660 aataaatcag ctttccagtt tggttggttt cacactggag atgtggggta tttggactct 720 gatggatact tgcatttggt 740 <210> 10 <211> 842 <212> DNA <213> CaSIG4 potato 537F-1323R contig <400> 10 ccatcagatg ttggactttt ctacatacat caggcaccac cagcagacca aaaggcgttc 60 ccctaacaca gcacaattta gtatcatcag tgaacaatat taaatcggtt tacaaactca 120 ctgaatcgga ctctacagtg atcgtgttgc cactctttca tgttcatgga ttgattgcag 180 gtaaatatga ccaaatcgat caattagtac tcgtaattca tccaattcat tttgacctta 240 gcaaattttt gaacatttta ttaatttgac cgtctaattg caggattact aagctcgctt 300 ggtgctggag gatccgtaac gctccctgct tccggtagat tctctgcttc atctttctgg 360 tctgacatga tcaagtccaa cgccacatgg tacaccgcgg tgcctaccat tcaccagatc 420 ctattggacc gtcatttcag caacccagag tcttcttacc cgagactccg gttcattagg 480 agttgcagtg ctgctcttgc accatccgta ttggcacggt tagaggaagc atttggtgcg 540 tctgttttag aggcatatgc aatgacagaa gcaacacatt tgatgtgttc aaatccatta 600 ccagaaaatg gtccacattt gccagggtca gtagggaagc cagtgggaca agaattgggg 660 atattgaatg agaatggtgt ggtacaaggg gctgatgaaa agggagaaat ttgcattagg 720 ggtccaaatg ttacaaaagg gtataagaat aatcctgagg ctaataaatc tgcttttcaa 780 tttggttggt ttcatactgg agatgtggga tatttggact ctgatggata cttgcatttg 840 gt 842 <210> 11 <211> 814 <212> DNA <213> CaSIG4 tomato 537F-1323R contig <400> 11 ccatcagatg ttggactttt ctacatacat caggcactac cagcagacca aaaggcgttc 60 ccataacaca gcacaattta gtatcatctg tgaacaatat taaatcggtt tacaaactca 120 ctgaatcgga ctctacagta atcgtcttgc cactgtttca tgttcatggg ttgattgcgg 180 gtgaatatta ccaaattcaa tcaattagta ctcgtaattc attttgacct aagcaaaatt 240 tttgatacat tgcaggatta ctgagctcgc ttggtgctgg aggatctgta acgctccctg 300 cttctggtag attctctgct tcatctttct ggtctgatat gctcaagtcc aacgccactt 360 ggtacaccgc ggtgcctacc attcaccaga tcctattaga ccgtcatttc agcaatccag 420 agtcttctta cccgagactc cggttcatta ggagttgtag tgctgctctt gcaccatccg 480 tattggcacg gttagaggaa gcatttggtg cgtctgtttt agaggcatat gcaatgacag 540 aggcaacaca tttgatgtgt tcaaatccat taccagaaaa tggtccacat ttgccagggt 600 cagtagggaa gccagtgggc caagaattgg ggatattgaa tgagaatggt gtggtacaag 660 gggctaatga aaaaggggaa atttgcatta ggggtccaaa tgttacaaaa ggatataaga 720 ataatcctga ggctaataaa tctgcttttc aatttggttg gtttcatact ggagatgtgg 780 gatttttgga ctctgatgga tacttgcatt tggt 814 <210> 12 <211> 914 <212> DNA <213> CaSIG4 genomic DNA <400> 12 ctcttattct tcgcctatgg agtgtttgac gctaactgga ttcttgaaac atgtggctga 60 aaagtaccct agtcatcgtg cgatttccgt ttccggcagg ctcgatatca ctcatgcacg 120 ccttcaacaa ctcgttgaac gtgccgcttc tcagattgta gctgccggtg taaagcctgg 180 cgatgtcgtc gctctcactt tccccaacac aatcgaggtt ccatttcttt ttcccctttg 240 tttcatacaa aattaaaaaa gacagttccg tgcatttaac tgatcaagaa ggaggctgtt 300 ttcgcaactt gaatctcgtc acatgtatgt gttacagaat ctgaaagaaa aaagaaaaca 360 ggattttttt ttttttttat attatgttaa ttcgggaaaa aaggaggagt tttacggtag 420 ttttgtgata taatcaggat tgtattttca cactaggcga attagtacta attgtctttt 480 gaattttgtt ttacagttcg tgatcatgtt tttagctgta attcgagctc gagctaccgc 540 agcgccactg aattcagcgt acatgacaga agaattcgag ttttatttat ctgattcaga 600 atcgaaactc ttattaactg caaaagaagg aaacgaagca gctcaagctg ctgcctccaa 660 gctaaaaatc cctcgtatta gtgtaactct ctctcaaccc gagtctgatg tcgctttctc 720 ccctgctcca cccgaatcgg accttgaatc gatgtccaaa atcgttaacg aaccatcaga 780 tgttggactt ttccttcata catcaggcac cactagcagg ccaaaaggtg ttcctctggc 840 tcagctgaat ttgttgtctt cagtaaacaa tatcaaatcg gtgtacaaac tgagtgacac 900 ggattctact gtga 914 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 254U primer <400> 13 ttcgcaactt gaatctcgtc 20 <210> 14 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hygromycin 3F <400> 14 gaaaaagcct gaactcacc 19 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Hygromycin 546R <400> 15 gtgtcgtcca tcacagttt 19 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 (468) primer <400> 16 ctgtgttctt gatgcagtta gtcctgaatc 30 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R3 (398) primer <400> 17 tttcctggag attattgctc gggtagatcg tc 32 <210> 18 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 (2144) primer <400> 18 ccgatcgttc aacatttggc aataaagtt 29 <210> 19 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 (2174) primer <400> 19 tcttaagatt gaatcctgtt gccggtctt 29 <210> 20 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R2 (2638) primer <400> 20 gctctagcca atacgcaaac cgcct 25 <210> 21 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R4 (2548) primer <400> 21 cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagt 28 <210> 22 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 (4427) primer <400> 22 gtgtagaagt actcgccgat agtggaaacc 30 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4 (4536) primer <400> 23 tccataataa tgtgtgagta gttcccagat a 31 <210> 24 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RB 155L1(RBL1) primer <400> 24 gtaatagcga agaggccc 18 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RB 105L2(RBL2) <400> 25 ctgaatggcg aatgctag 18 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RB 254U1(RBU1) primer <400> 26 cagtcacgac gttgtaaaac 20 <210> 27 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RB 301U2(RBU2) primer <400> 27 aggtccccag attagcct 18 <210> 28 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB 4269U1(LBU1) primer <400> 28 gactccgggc gtatatgc 18 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB 4303U2(LBU2) primer <400> 29 tgaccaactc tatcagagct t 21 <210> 30 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB 4181L1(LBL1) primer <400> 30 tccatacaag ccaaccac 18 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB 4155L2(LBL2) primer <400> 31 agaagaagat gttggcgac 19 <210> 32 <211> 983 <212> DNA <213> Right border <400> 32 aatatttaat aaatgcaata tttatttgat taattcaata tataacaaat gtgatagtta 60 tttacagagc aaatgatcga gaatttaatt taattgaaaa aaataaaaag tagaaatact 120 atttatgaca ttctgtgagg attaatcaat acaacaaatt cctaaaaaat tacaaatatg 180 gctatgatgg tgtgagtaag aggagaggag ggatgaatga gaacaaaaaa aaaggagcga 240 ttaataatat ttgacatatg ttaagctttt ttcatataaa aaattaatat ttatgcactt 300 tattaaaatg acgaagaatt aaatgtgtga ataacacaaa tagttattta gaattggtat 360 aacatgaaga tagaattgaa gtggattatg tcgtttaact tatattagta ctgctaaaaa 420 gattcattag aaatattaat taactcagag tgcaatcctt ttcttgaatt tgtagatata 480 ttttcaaaaa cattatatat atacagaaat caataagatg gtgcataatt tctgtattat 540 taatatttac acttctcttt attctattct tctttttgag aattttcatt ttattgaggt 600 ttttattcat cctaacctac ggactaatag aagtctcaaa aataaataga gtgcttaagc 660 ataaatagtc tttgcataag cacgaaccag ctacgagcat tcgccattca ggctgcgcaa 720 ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cgaaaggggg 780 atgtgctgca aggcgattaa gttgggtaac gccagggttt tcccagtcac gacgttgtaa 840 aacgacggcc agtgccaagc ttgcatgcct gcaggtcccc agattagcct tttcaatttc 900 agaaagaatg ctaacccaca gatggttaga gaggcttacg cagcaggtct catcaagacg 960 atctacccga gcaataatct cca 983 <210> 33 <211> 1218 <212> DNA <213> Left border <400> 33 gtgtagaagt actcgccgat agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaaga 60 aatagagtag atgccgaccg ggatctgtcg atcgacaagc tcgagtttct ccataataat 120 gtgtgagtag ttcccagata agggaattag ggttcctata gggtttcgct catgtgttga 180 gcatataaga aacccttagt atgtatttgt atttgtaaaa tacttctatc aataaaagta 240 atgagtttat atatgatgca atattttttt tcttttggta ataaaaatcc aattcgttta 300 aatttgagga ctaaaaaatt tttaatttat atattcaata aaaaaatact atgtcataat 360 taaataagag ttctgcgaac caattcacta gtttttaata catcaattgt ttgatgataa 420 atacacatta ctaatttcct gaatttcaat ttctatgtta ttaattctta tattacaatc 480 attatattac taattaatgc acaactttgt ttataaacca atcgacacta ttgtatgtcc 540 aagtcgtagg tgtttttttt tctcttctta tcccatatac ttatatcgta tttgtaccaa 600 ataattgata gtacaatggt tgatagttgt ggcaataatt attccttaat ttttgtcgtt 660 ttaacaaatt ggcaaagtac cttttttagc aaaaaataaa taaattgaga aagtaacttt 720 tttgagaaaa aaaagaagta tttcattgga atgattagaa accttttcaa ggatgaaatt 780 ctttattttt cttttaaaag aagacaacaa tatcaatgat ctaataagct aatttattgg 840 ctctataacc atttggataa ttttggactt ttaataaaat taaaaattcc ataaatgcaa 900 tctcaagatg gttaatattg gatctgccaa agatataatt atgatgaata aggagtgctc 960 aacttaatat attaaattat ttttgataaa aattttaatt ttacgattga tatgttgata 1020 aaattatttc tgctcaaaaa tttccctttt atatacaact attcttccta caaaaaagta 1080 tttaaaatca agttaaaata ttcaacggtt cttcatccta tcaccatgct attaagggaa 1140 taatttgaac atattattat ataaattgtt ggattttctt aatatatgac aagattctaa 1200 tttagtataa aaaggtcc 1218 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PepEST 68_cfm-2 <400> 34 attcatccta acctacggac 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LB cfm 68L-2 <400> 35 cgaattggat ttttattacc 20 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Right end <400> 36 cataagcacg aaccagcta 19 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Right end <400> 37 gttttacaac gtcgtgactg 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Left end <400> 38 tcagagtgca atccttttct 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Left end <400> 39 gttacccaac ttaatcgcct 20 <210> 40 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for CaSIG4 <400> 40 ctgcaaaaga aggaaacgaa gca 23 <210> 41 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for CaSIG4 <400> 41 tcgggttgag agagagttac actaa 25 <210> 42 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for CaSIG4 <400> 42 ctcaagctgc tgcctcc 17 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for Right end-flanking DNA <400> 43 cataatagtc tttgcataag cacgaa 26 <210> 44 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for Right end-flanking DNA <400> 44 ttgcgcagcc tgaatgg 17 <210> 45 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for Right end-flanking DNA <400> 45 agctacgagc attcg 15 <210> 46 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer for NOS <400> 46 tttaattggc gccaccaaa 19 <210> 47 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer for NOS <400> 47 cgcaagaccg gcaacag 17 <210> 48 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for NOS <400> 48 ctactacaaa ttaaggatcc cccag 25

Claims

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서열번호 4로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 13으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍을 포함하는 것을 특징으로 하는 시료내 유전자 변형 고추의 혼입 여부 판정용 키트.
제 3항에 있어서, 도입 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
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1) 분석 시료의 게놈 DNA를 추출하는 단계;

2) 서열번호 4로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 13으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍, 및 도입 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머쌍을 이용하여 상기 1) 단계의 게놈 DNA로부터 중합연쇄반응(PCR)을 수행하는 단계; 및

3) 상기 PCR 산물을 전기영동으로 분리하여 PCR 증폭산물을 확인하여 판별하는 단계를 포함하는 시료내 유전자 변형 고추의 혼입 여부 판정 방법.
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서열번호 4로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 13으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍, 및 상기 프라이머쌍으로 증폭된 폴리뉴클레오티드 서열 내에서 선택되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 형광 프로브를 포함하는 유전자 변형 고추의 혼입률 분석용 실시간 PCR 키트.
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1) 분석시료 DNA를 주형으로 서열번호 4로 기재되는 핵산서열을 갖는 정방향 프라이머 및 서열번호 13으로 기재되는 핵산서열을 갖는 역방향 프라이머로 구성된 프라이머쌍, 및 상기 프라이머쌍으로 증폭된 폴리뉴클레오티드 서열 내에서 선택되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 형광 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계;

2) 단계 1)의 실시간 PCR 결과로부터 분석시료의 내재유전자의 역치 싸이클값(Ct값)을 구하는 단계;

3) 분석시료 DNA를 주형으로 도입 유전자를 증폭하기 위한 프라이머쌍 및 상기 프라이머쌍으로 증폭된 폴리뉴클레오티드 서열 내에서 선택되는 올리고뉴클레오티드로 구성되는 형광 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 수행하는 단계;

4) 단계 3)의 실시간 PCR 결과로부터 분석시료의 도입유전자의 역치 싸이클값(Ct값)을 구하는 단계;

5) 단계 2)의 내재유전자의 Ct값으로 단계 4)의 도입유전자의 Ct값을 나눈 비율값을 구하는 단계;

6) 농도별 표준시료의 내재유전자의 Ct값으로 도입유전자의 Ct값을 나눈 비율값을 구하여 정량곡선을 구하는 단계; 및,

7) 단계 5)의 비율값을 단계 6)의 정량곡선에 대입하여 분석시료내 도입유전자의 혼입률을 결정하는 단계를 포함하는, 유전자 변형 고추의 혼입률 정량분석방법.
제 12항에 있어서, 표준시료는 유전자 변형 고추의 혼입률을 알고 있거나 도입 유전자 카피수를 미리 알고 있는 시료인 것을 특징으로 하는 유전자 변형 고추의 혼입률 정량 분석 방법.
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