JP4899180B2 - 核酸検査用プライマーセット及びこれらを用いた検査キット及び検査方法 - Google Patents

Description

本発明は、例えば遺伝子組換えトウモロコシの検知のための核酸検査用プライマー及びこのプライマーを用いた検査キットに関するものである。

遺伝子組換えは、生細胞のゲノムに外来遺伝子を導入することによって有用な生物体を創出する技術である。本技術は生物種の壁を越えて他の生物種に新たな遺伝形質を導入することを可能とした。この遺伝子組換え技術を農作物育種に応用することにより、従来の技術では容易に成し得なかった形質の付与が可能となった。

これらの技術は、現在トウモロコシやダイズに代表される主要穀物、ジャガイモ、アブラナのような主要作物を中心に実用化されている。具体的な例では、除草剤耐性タンパク質や、害虫抵抗性タンパク質を産生する性質を付与したものなどが挙げられ、それらは既に世界中で栽培されている。

このように遺伝子組換え技術は、育種学的には極めて画期的な技術であるが、ヒトや家畜及び環境に対する安全を確保する観点から、創出された遺伝子組換え作物の食品としての性質、家畜の飼料としての性質及び環境に与える影響を明らかにして、既存の栽培種と同等に安全であることを示す必要がある。

プラント・ジェネティック・システムズ社が開発した遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統（スターリンク：商標）は、既存の栽培種のトウモロコシにバチルス・チューリンジエンシス：Bacillus Thuringiensis subspecies Tolworthi 由来のＣｒｙ９Ｃタンパク質をコードする遺伝子を導入し、チョウ目害虫抵抗性及び除草剤グルホシネート耐性を獲得させている（例えば、特許文献１参照。）。米国における安全性審査の過程において、Ｃｒｙ９Ｃタンパク質はヒトの体内では消化が困難であり、ヒトに対してアレルゲン様物質として作用する可能性が懸念されていた。そこで、Ｃｒｙ９Ｃタンパク質の組換え体であるＣＢＨ３５１系統は、米国において家畜及び環境に対する安全性のみが先に認められ、飼料用としての商品化は認可された。その後、米国におけるＣＢＨ３５１系統の安全性審査の諮問が取り下げられたため、ヒトに対する安全性は未承認のままである。また、日本では飼料用としては１％までの混入が認められているが、食品用としては混入が認められていない。

一方、日本は、食品用及び飼料用トウモロコシ供給の大半を米国からの輸入に頼っているが、食品として消費されるトウモロコシは大半がデント種で、ＣＢＨ３５１系統もその種のトウモロコシである。ＣＢＨ３５１系統は、米国では安全性審査後、国内の飼料向けとして栽培が開始されたが、流通の過程で食品用トウモロコシに混入することが明らかとなったので、その後の栽培は中止された。

しかしながら、既にアメリカでの栽培実績がなくなったにもかかわらず、ＣＢＨ３５１系統は非遺伝子組換えトウモロコシや、安全性を承認済みの遺伝子組換えトウモロコシに混入して日本に輸出される場合がある。日本では、未承認品種の混入を防ぐ目的で厳密な検査を行っているが、このためには信頼性の高い検知技術の開発が望まれている。

遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統を感度良く検知するための方法としては、Ｃｒｙ９Ｃタンパク質を抗原抗体反応によって検出するイムノクロマトグラフィーや、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統に特異的なＤＮＡ配列を増幅し、増幅の有無で結果を判別することが一般的である。

このうち、イムノクロマトグラフィーによる遺伝子組換え作物の検知は、サンドイッチ法と呼ばれる検出原理を用いてＣｒｙ９Ｃタンパク質を検出するものである。サンドイッチ法とは、クロマトグラフィー上に固定された抗体及び標識抗体が抗原と複合体を形成すると、標識物質による陽性反応が確認される方法である。また、検出液中にＣｒｙ９Ｃタンパク質が存在しない場合や、あるいは検出限界値を下回る量しかＣｒｙ９Ｃタンパク質が含まれていない場合には、陽性反応として認識される量のサンドイッチが形成されないことにより、検査陰性と判定される方法である（例えば、特許文献２参照。）。

このようなイムノクロマトグラフィーによるＣｒｙ９Ｃタンパク質の検出は簡便且つ短時間で行える利点はあるが、検出感度が低いことや偽陽性反応を生じやすいなどの欠点がある。また、検知対象がタンパク質である場合には、ＤＮＡよりも分解や変性が生じやすいため、サンプルの状態により検査結果が安定しないことや、特性上、定量検査が難しいことが問題となる。

他方、核酸増幅法を用いる検査手段として最もよく知られているのがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）法によるものである。このＰＣＲ法は、１．二本鎖鋳型ＤＮＡの一本鎖化（加熱変性ステップ）、２．一本鎖化鋳型ＤＮＡとプライマーとのアニーリング（冷却再会合ステップ）、３．ＤＮＡポリメラーゼによる増幅（ＤＮＡポリメラーゼの至適反応温度での加熱ステップ）という工程を２５〜４０回程度繰り返し行うことにより二本のプライマーに挟まれた検知領域を特異的に増幅する方法である（例えば、特許文献３参照。）。しかしながら、このＰＣＲ法では、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統を感度良く検知することが可能であるが、精密な温度制御を行うための専用機器が必須であり、操作が煩雑であるという欠点を有する。

そこで、上記のような温度制御サイクルを回避することができる核酸増幅方法として、所謂ＬＡＭＰ（Loop-Mediated Isothermal Amplification）法が挙げられる。このＬＡＭＰ法は、栄研化学株式会社が開発した核酸増幅技術であり、ＰＣＲ法と異なり、４本乃至６本のプライマーを用いる。またこの方法は、等温反応で連続的に増幅したＤＮＡ鎖を引き剥がしながら鋳型ＤＮＡの増幅反応を行う方法であることから、鋭敏、簡便且つ安価な検査を可能にするものである（例えば、特許文献４参照。）。

このＬＡＭＰ法では、以下の手順で増幅反応が進むものである。即ち、図２（ａ）に示すように、まず、標的遺伝子（ターゲットＤＮＡ）について、５’末端側からＦ３、Ｆ２、Ｆ１という３領域を、３’末端側でＢ1c、Ｂ2c、Ｂ3cという３領域を規定し、この６領域に対して、ＦＩＰプライマー、Ｆ３プライマー、ＢＩＰプライマー、Ｂ３プライマーの４種のプライマーを設計する。

ＦＩＰプライマーは、ターゲットＤＮＡのＦ2c領域と相補的なＦ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側にターゲットＤＮＡのＦ1c領域と同じ配列を持つように設計される。Ｆ３プライマーは、ターゲットＤＮＡのＦ3c領域と相補的なＦ３領域を持つように設計される。ＢＩＰプライマーは、ターゲットＤＮＡのＢ2c領域と相補的なＢ２領域を３’末端側に持ち、５’末端側にターゲットＤＮＡのＢ1c領域と同じ配列を持つように設計される。またＢ３プライマーは、ターゲットＤＮＡのＢ3c領域と相補的なＢ３領域を持つように設計される。

ターゲットＤＮＡと全試薬を６５℃でインキュベートすると、動的平衡状態にある二本鎖ＤＮＡの相補的な箇所にいずれかのプライマーが会合し、伸長することでＤＮＡ鎖が引き剥がされて一本鎖になる。この一本鎖になったＤＮＡ鎖から、鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼの働きによってＦＩＰプライマーのＦ２領域の３’末端を起点として相補的なＤＮＡ鎖が合成され、さらにＦＩＰプライマーの外側にＦ３プライマーが会合してその３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼによって、先に合成されているＦＩＰプライマーからのＤＮＡ鎖を剥がしながらＤＮＡ鎖が伸長していく。

次に、Ｆ３プライマーから合成されたＤＮＡ鎖と鋳型ＤＮＡが二本鎖となり、一方、ＦＩＰプライマーから先に合成されたＤＮＡ鎖は、Ｆ３プライマーからの伸長したＤＮＡ鎖によって剥がされて一本鎖ＤＮＡとなるが、このＤＮＡ鎖は５’末端側の相補的な領域Ｆ1cとＦ１を持ち、自己アニーリング（会合）を起こしてループを形成する。

このループを形成したＤＮＡ鎖に対し、ＢＩＰプライマーが会合し、該ＢＩＰプライマーの３’末端を起点としてＤＮＡ合成が行われ、この過程でループは解消される。さらにＢＩＰプライマーの外側にＢ３プライマーが会合し、その３’末端を起点として鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼが働くことで先に合成されているＢＩＰプライマーからのＤＮＡ鎖を引き剥がしながらＤＮＡ鎖が伸長していく。この過程により二本鎖ＤＮＡが形成される。

またこの過程で引き剥がされたＢＩＰプライマーから合成されたＤＮＡ鎖は両端に相補的な配列を持つため、自己アニーリングし、ループを形成してダンベル状の構造となる。このダンベル構造がＬＡＭＰ法における増幅サイクルの起点構造となる。即ち、図２（ｂ）に示すように、ダンベル構造の５’末端側のループの一本鎖部分であるＢ１領域とＢ２領域の間、およびＦ１領域とＦ２領域の間にそれぞれ相補的な配列を持つループプライマーＢ（ＬＢ）、ループプライマーＦ（ＬＦ）を用いることにより、ＤＮＡ合成の起点が増やされ、ダンベル構造の様々な部分にプライマーが会合し、目的の配列を含んだ種々の二本鎖ＤＮＡが次々に作られていく。

ＷＯ ９９／００４０７ 特許第２８９０３８４号公報 特許第３５０２９０６号公報 特許第３３１３３５８号公報

上記の如く、ＬＡＭＰ法を用いれば、対象とする遺伝子組換え作物に特徴的なＤＮＡの特異的な増幅を、簡便かつ安価でありながらも精度良く行うことができる。しかしながら、このようなＬＡＭＰ法による遺伝子増幅には、専用のプライマーを用いる必要があり、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の検知においても、特異的増幅に用いるプライマーの設計が必要である。

本発明の目的は、上記問題点に鑑み、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統を特異的に検出するためのＬＡＭＰ法用プライマーおよびプライマーセット、またこれらを用いた検査キットを提供することにある。

上記目的を達成するため、請求項１に記載の発明に係るプライマーセットは、 遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の組換え遺伝子を検出するための、ＬＡＭＰ法によって予め定められた複数の特異的な核酸配列を検知するのに用いるオリゴヌクレオチドからなるプライマーのセットとして、上流側インナープライマー：ＦＩＰと、下流側インナープライマー：ＢＩＰと、インナープライマーで増幅するＤＮＡ配列の外側にインナープライマーにより増幅したＤＮＡを鋳型ＤＮＡから引き剥がす役割を有する上流側アウタープライマー：Ｆ３および下流側アウタープライマー：Ｂ３と、インナープライマーとアウタープライマーの間に反応を高速化する役割の上流側ループプライマー：ＬＦ及び下流側ループプライマー：ＬＢとの組み合わせからなる核酸検査用プライマーセットであって、
プライマー配列にトウモロコシＣＢＨ３５１系統の組換え遺伝子の塩基配列の一部を含むもので、配列番号１３：5'-agaggaaggg tcttgcgaat ctccactgac gtaagggat-3'、配列番号１４：5'-tcgagctcat ttctctatta cttcagcctc tgcaggtagt cagcca-3'、配列番号１５：5'-atagtgggat tgtgc-3'、配列番号１６：5'-agaactcttt tctcttc-3'、配列番号１７：5'-ccaaccacgt cttcaaagca-3'、配列番号１８：5'-gtgtagtcct cgtcggtca-3' 、及び配列番号１９：5'-tagcctcagt cctcctcggc tcgaccgcat cgagatc-3'、 配列番号２０：5'-ggacacgctg aaatcaccag tctatctggg aactactcac aca-3'、配列番号２１：5'-cgagctgggt tcacgg-3' 、配列番号２２：5'-ctctctacaa atctatctct ctct-3'、配列番号２３：5'-ggtggcgagt actaca-3' 、配列番号２４：5'-ctataggaac cctaattcc-3'、の各塩基配列からなるプライマーからそれぞれ選択して組み合わされたものであり
ＦＩＰに配列番号１３、ＢＩＰに配列番号１４、ＬＦに配列番号１５、ＬＢに配列番号１６、Ｆ３に配列番号１７、Ｂ３に配列番号１８、のプライマーを選択してなる組み合わせと、
ＦＩＰに配列番号１９、ＢＩＰに配列番号２０、ＬＦに配列番号２１、ＬＢに配列番号２２、Ｆ３に配列番号２３、Ｂ３に配列番号２４、のプライマーを選択してなる組み合わせと、を有するものである。

請求項２に記載の発明に係る遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統検知用の核酸検査キットは、請求項１に記載のＬＡＭＰ法用プライマーセットを備えたものである。

請求項３に記載の発明に係る核酸検査キットは、請求項２に記載の核酸検査キットにおいて、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の内在性遺伝子を検出するためのＬＡＭＰ法用プライマーセットをさらに備えたものである。

請求項４に記載の発明に係る核酸検査キットは、請求項３に記載の核酸検査キットにおいて、前記内在性遺伝子が、ゼイン又はスターチシンターゼＩＩｂをコードするＤＮＡの一部を含むものである。

請求項５に記載の発明に係る核酸検査キットは、請求項４に記載の核酸検査キットにおいて、前記プライマーセットが、ゼインをコードするＤＮＡ塩基配列の一部を含み、ＦＩＰに配列番号１：5'-tggtgagagg tatgggggaa gacgcnacca ttttcccnca at-3'、ＢＩＰに配列番号２：5'-acaggatcca acaggcaatc gcgacggttg ttggaggaac a-3'、ＬＦに配列番号３：5'-ggaagctata ggagcttgtg a-3'、ＬＢに配列番号４：5'-aggcatctta ccnttatcac cct-3' 、Ｆ３に配列番号５：5'-tctttctgca agtgntgcta-3'、Ｂ３に配列番号６：5'-tgnaccaaag gtaactgctg-3' 、の各塩基配列からなるプライマーをそれぞれ選択して組み合わせた内在性遺伝子ゼイン検出用プライマーセットであることを特徴とするものである。

請求項６に記載の発明に係る核酸検査キットは、請求項４に記載の核酸検査キットにおいて、前記プライマーセットが、スターチシンターゼＩＩｂをコードするＤＮＡ塩基配列の一部を含み、ＦＩＰに配列番号７：5'-atcagctttg ggtccggaca cgcaatgcaa aacggaacga g-3'、ＢＩＰに配列番号８：5'-agaaatcgat gccagtgcgg tggcgatgcc tatgctttcc a-3'、ＬＦに配列番号９：5'-gcgcggcggt gct-3'、ＬＢに配列番号１０：5'-aagccagagc ccgcagg-3'、Ｆ３に配列番号１１：5'-ccgaagcaaa gtcagagcg-3'、Ｂ３に配列番号１２：5'-gcatcagcct tagcatcca -3' 、の各塩基配列からなるプライマーをそれぞれ選択して組み合わせた内在性遺伝子スターチシンターゼＩＩｂ検出用プライマーセットあることを特徴とするものである。

請求項７の記載に係る核酸検査キットは、請求項５に記載の核酸検査キットにおいて、前記内在性遺伝子ゼイン検出用プライマーセットのプライマー配列のｎ部分が、イノシンで置換されたものである。

請求項８に記載の発明に係る核酸検査キットは、請求項５に記載の核酸検査キットにおいて、前記内在性遺伝子ゼイン検出用プライマーセットのプライマー配列のｎ部分が、アデニン、チミン、グアニン、シトシンの全部または一部で置換されたものである。

請求項９に記載の発明に係る遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の検査方法は、請求項１に記載のＬＡＭＰ法用プライマーセットあるいは請求項２〜請求項８のいずれか１項に記載の核酸検査キットを用いたものである。

本発明によれば、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統を特異的に検出するためのＬＡＭＰ法用プライマーと、それを用いた検査キット、及び検査方法を使用することにより、鋭敏で簡便且つ安価な検査を可能にするという効果がある。

トウモロコシは、大きく分類すると遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統を含むデント種と、スイート種、爆裂種の３種に分類できる。まず、上記３種全ての内在性遺伝子を増幅することのできるプライマーをデザインするため、それぞれの種について、トウモロコシの主要タンパク質であるゼイン（Zein）およびデンプン合成の中核を担う酵素であるスターチシンターゼＩＩｂ（ＳＳＩＩｂ）の遺伝子をクローニングし、その塩基配列を比較解析した。

その結果、ゼインの遺伝子は少なくとも種間で一部変異が生じていることが明らかとなった。そこで、変異のポイント（ｎ）をイノシン（ｉ）で合成することにより、３種全ての内在性遺伝子を増幅できる陽性対照プライマーをデザインした（配列番号１〜１２）。

当然ながら、これらｎまたはｉ部分はアデニン（ａ）、チミン（ｔ）、グアニン（ｇ）、シトシン（ｃ）の何れかまたは全てに置換することも可能である。従って、本法に使用するプライマーは、ＬＡＭＰ反応に支障が無ければ一部にイノシンを含んでいても良いし、何らかの修飾を行ったプライマーでも使用可能である。

次に、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統については、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、ペチュニア・ハイブリダ（：Petunia Hybrida ）由来のＣａｂ２２Ｌ（：chlorophyll a/b binding protein ）リーダー配列、バチルス・チューリンジエンシス（：Bacillus Thuringiensis Subspecies Tolworthi ）由来の害虫抵抗性タンパク質をコードするＣｒｙ９Ｃ遺伝子近傍の塩基配列及び近傍のトウモロコシゲノムＤＮＡの配列情報を明らかにした。

これらのうち、バチルス・チューリンジエンシス（：Bacillus Thuringiensis Subspecies Tolworthi ）由来のＣｒｙ９Ｃ遺伝子配列は既に開示されているが、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統ゲノムＤＮＡに保存されているＣｒｙ９Ｃ遺伝子の塩基配列と、上記既報の情報が一致しないことが明らかとなった。そこで、トウモロコシＣＢＨ３５１系統からゲノムＤＮＡを抽出してシークエンスすることにより、トウモロコシＣＢＨ３５１系統に導入されたＣｒｙ９Ｃ遺伝子近傍の塩基配列および近傍のトウモロコシゲノムＤＮＡの配列情報を明らかにした。

この解析結果を基にして、トウモロコシＣＢＨ３５１系統を特異的に検知するためのプライマーを設計した（配列番号１３〜２４）。このプライマー配列は、検査時の偽陽性を防止するために、特定の遺伝子組換え作物にのみ高い特異性を有する必要がある。このことから、本発明においては、トウモロコシＣＢＨ３５１系統を特異的に検出可能なプライマーとして、その増幅領域が前記Ｃｒｙ９Ｃ遺伝子配列とその近傍のトウモロコシゲノムＤＮＡに重複するような様々なプライマー配列を設計し、試行錯誤を重ねることにより、ＬＡＭＰ法による検出に最適な組合せとなるプライマーセットを見出した。

なお、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の検知は、ターゲットとしてＣｒｙ９Ｃ遺伝子に限らず、組換え遺伝子の一部であれば可能であるため、特異的な核酸検知用のプライマー配列としては、これら組換え遺伝子の一部を含むものであれば良い。この遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の組換え遺伝子は、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター、Ｃｒｙ９Ｃ遺伝子、カリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーターが連結されているため、例えばカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモーター部分とその上流のゲノム配列から設計したプライマーまたはプライマーセット、あるいはカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓターミネーター部分とその下流のゲノム配列から設計したプライマーまたはプライマーセットなどを、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の検出用にＬＡＭＰ法にて用いることが可能である。

以上のようなプライマーまたは該プライマーを組み合わせてなるプライマーセット、あるいはこれらを備えた検査キットをＬＡＭＰ法にて用いることによって、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統が存在している場合、それに特徴的なＤＮＡの増幅が、鋭敏、簡便、安価、且つ高精度に行われ、増幅の有無による遺伝子組換えトウモロコシの混入の有無を容易に判別することができる。

本発明に使用する対象としては、基本的にはＤＮＡを含む検体一般である。即ち、ＤＮＡを含む全ての抽出物が含まれる。また、検査に使用する材料は、例えば穀物粒やその粉砕物、生肉のような非加工状態のものから、スターチ、糖類、ハム等の加工品であってもＤＮＡが残存していれば特に限定されない。さらに、本発明による各種遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統検知用プライマーは、ＰＣＲ法での検知にも用いることが可能である。

本発明の一実施例として、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の特異的検出を行うためのＬＡＭＰ法による増幅に最適なプライマーの選択を行った場合を以下に示す。なお、本実施例におけるＬＡＭＰ法に使用されるプライマーの呼称は、図２に示したものと共通するものである。

本実施例におけるＬＡＭＰ反応は、鎖置換活性を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して、増幅対象とするＤＮＡ配列の内側を挟む上流側インナープライマー（以下、ＦＩＰプライマーと記す）及び下流側インナープライマー（以下、ＢＩＰプライマーと記す）と、インナープライマーで増幅するＤＮＡ配列の外側にインナープライマーにより増幅したＤＮＡを鋳型ＤＮＡから引き剥がす役割を有するアウタープライマーをそれぞれ設計した。これらのアウタープライマーは、上流側をＦ３、下流側をＢ３と称した。また、インナープライマーとアウタープライマーの間に反応を高速化する役割のプライマーを設計し、それぞれＬＦ（ループプライマーＦ）、ＬＢ（ループプライマーＢ）と称した。

デント種、スイート種、爆裂種、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統、ＮＫ６０３系統、Ｔ２５系統、Ｍｏｎ８６３系統、ＴＣ１５０７系統、Ｅｖｅｎｔ１７６系統、ＧＡ２１系統、Ｍｏｎ８１０系統、Ｂｔ１１系統のトウモロコシＤＮＡからそれぞれスターチシンターゼＩＩｂ（以下、ＳＳＩＩｂと記す）の遺伝子の一部をクローニングし、塩基配列を明らかにした。

これらの塩基配列情報を比較することにより相同性が高い領域を選択し、プライマーを各種設計した。その中から、非遺伝子組換えトウモロコシとしてデント種、スイート種、爆裂種の３種、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統、ＮＫ６０３系統、Ｔ２５系統、Ｍｏｎ８６３系統、ＴＣ１５０７系統、Ｅｖｅｎｔ１７６系統、ＧＡ２１系統、Ｍｏｎ８１０系統、Ｂｔ１１系統を検知可能で、且つトウモロコシ以外の穀物としてダイズ、イネ、コムギ、オオムギおよび遺伝子組換えダイズ（Roundup Ready Soybean；RRS）に反応しない、極めて特異性の高いプライマー６種（配列番号７〜１２）を選択することにより内在性遺伝子ＳＳＩＩｂ検出用プライマーセットとした。

ゼイン遺伝子は多型であり、各系統のシーケンスを調べることは困難であったため、既報の情報から配列の保存性が高いと思われる領域を選び、その配列を比較した。比較した結果から、塩基の置換が生じている部分をイノシンに置き換えることにより、非遺伝子組換えのトウモロコシとしてデント種、スイート種、爆裂種、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統、ＮＫ６０３系統、Ｔ２５系統、Ｍｏｎ８６３系統、ＴＣ１５０７系統、Ｅｖｅｎｔ１７６系統、ＧＡ２１系統、Ｍｏｎ８１０系統、Ｂｔ１１系統を検知可能で、且つトウモロコシ以外の穀物としてダイズ、イネ、コムギ、オオムギおよび遺伝子組換えダイズ（ＲＲＳ）に反応しない、極めて特異性の高いプライマー６種（配列番号１〜６）を選択することにより内在性遺伝子ゼイン検出用プライマーセットとした。

これら内在性遺伝子ＳＳＩＩｂ検出用プライマーセット、および内在性遺伝子ゼイン検出用プライマーセットは、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の検知検査における陽性対照プライマーとして用いることができる。

次に、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１の組換えカセットに含まれるＣｒｙ９Ｃ遺伝子の両末端近傍をクローニングし、その塩基配列を明らかにした。その結果から遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１検出用のＤＮＡ配列を２カ所選択して、それぞれＬＡＭＰ法で検知するためのプライマーを各種（配列番号１３〜２４）設計した。様々なプライマーの組合せのうち、偽陽性を生じることなく、且つ反応が特に鋭敏な組合せをスクリーニングした結果、ＬＡＭＰ法に最適と思われるプライマーセットを２組（配列番号１３〜１８、配列番号１９〜２４）選択した。

ＬＡＭＰ法に供する鋳型ＤＮＡの調製は、それぞれの穀物粒をロータースピードミルＰ１４（ドイツ、Fritsch社製）にて粉砕した。各混入レベルのサンプルを作製するために、遺伝子組換えと非遺伝子組換えのサンプルをそれぞれの重量比率で量り取って調製した。各調製サンプルの遺伝子組換えトウモロコシ混入割合は、サンプル１：擬似混入試料０％ＣＢＨ３５１、サンプル２：擬似混入試料０．０５％ＣＢＨ３５１、サンプル３：擬似混入試料０．１％ＣＢＨ３５１、サンプル４：擬似混入試料２％ＣＢＨ３５１、サンプル５：擬似混入試料１００％ＣＢＨ３５１、である。

ＤＮＡの抽出は、DNeasy Plant Maxi Kit （キアゲン社製）を使用した。各サンプル１ｇを、DNeasy Plant Maxi Kitに付属のリボヌクレアーゼ（RNase）Ａ １０μＬを含む５ｍＬのBuffer AP1に加えて混合し、６５℃、６０分間保温した。その後１．８ｍＬのBuffer AP2を加えて、１５分間氷上で静置した。それぞれ遠心分離を行い、上清をカラム（QIAshredder（商標）Maxi Spin Column）により濾過した。濾液４ｍＬにBuffer AP3／Ethanol ５．１ｍＬを加えて混合した。

これらの混合液をDNeasy Spin Columnに加えて遠心分離を行い、フィルターにＤＮＡを吸着させた。続いて１２ｍＬのBuffer AW を加えて遠心分離を行い、ＤＮＡが吸着したフィルターを洗浄した。その後、６５℃で保湿した滅菌水１ｍＬを加えて遠心分離することによりフィルターからＤＮＡを溶出した。溶出したＤＮＡを含む滅菌水に等量のイソプロパノールを添加し、混和後、遠心分離を行い、ＤＮＡを沈殿として回収した。各沈殿は、７０％エタノールでリンスした後に、ＴＥに再溶解後、保存した。

これらの各沈殿サンプルを鋳型ＤＮＡとして、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統のＣｒｙ９Ｃ遺伝子の一部を含むプライマーを用いたＬＡＭＰ法による定性検知を行うために、以下のＬＡＭＰ反応条件を使用した。即ち、各反応液組成；２０ｍＭ Tris-HCl（ｐＨ８．８)、１０ｍＭ KCl、１０ｍＭ (NH₄)₂SO₄、０．１％ TritonX-100、（以上はNew England Biolabs 社製10x ThermoPol Bufferに由来する）、１．６ｍＭ 各 dNTPs（dATP、dTTP、dGTP、dCTP）、６４０ｍＭベタイン（シグマアルドリッチ社製）、２ｍＭ MgSO₄、６００ｎＭ ＦＩＰ及びＢＩＰ８００ｎＭ ＬＦ及びＬＢ、２００ｎＭ Ｆ３及びＢ３を含む反応液に、１６UnitのBst ＤＮＡポリメラーゼラージフラグメント（New England Biolabs 社製）、及び各鋳型ＤＮＡを２５０ｎｇ加えて総量２５μＬとし、それぞれ、 Loopamp（登録商標）リアルタイム濁度測定装置LA-200（テラメックス株式会社製）で６５℃、１時間保温した。

ここで用いたプライマーは、トウモロコシＣＢＨ３５１系統を特異的に検知するためのプライマーとして、それぞれＦＩＰには配列番号１３、ＢＩＰには配列番号１４、ＬＦには配列番号１５、ＬＢには配列番号１６、Ｆ３には配列番号１７、Ｂ３には配列番号１８を用いる組合せ及びそれぞれＦＩＰに配列番号１９、ＢＩＰに配列番号２０、ＬＦに配列番号２１、ＬＢに配列番号２２、Ｆ３に配列番号２３、Ｂ３に配列番号２４の各プライマーを用いる組合せを用いた。また、陽性対照として内在性遺伝子ＳＳＩＩｂを特異的に検知するためのプライマーとして、それぞれＦＩＰに配列番号７、ＢＩＰに配列番号８、ＬＦに配列番号９、ＬＢに配列番号１０、Ｆ３に配列番号１１、Ｂ３に配列番号１２の各プライマーを用いる組合せを用いた。

検査陽性／陰性の判定は、ＬＡＭＰ反応が進行するに従って増加する反応液中のピロリン酸マグネシウムの析出による濁度をリアルタイム濁度測定装置で測定すること、および反応液を３％アガロースゲルにて電気泳動することにより行った。ＬＡＭＰ法に特有のラダー状増幅フラグメントの有無により陽性／陰性を判定した。電気泳動は、レーン１およびレーン７をマーカーとし、レーン２をサンプル１、レーン３をサンプル２、レーン４をサンプル３、レーン５をサンプル４、レーン６を鋳型ＤＮＡ無しのサンプル５とした。

図１（ａ）および（ｃ）の遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の検知用の電気泳動写真から明らかなように、サンプル１（レーン２）〜サンプル４（レーン５）のうち、試料のＣＢＨ３５１混入が０．０５％という低濃度のもの（レーン３：サンプル２）であっても前記ラダー状増幅断片が確認でき、陽性と判定した。またサンプル１（レーン２）〜サンプル４（レーン５）全てについて、内在性遺伝子ＳＳＩＩｂ検出用プライマーを用いたＬＡＭＰ反応により、反応液を３％アガロースゲルにて電気泳動を行った結果を図１（ｂ）に示す。これにより、サンプル２（レーン３）〜サンプル４（レーン５）の遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１がトウモロコシ由来であることが確認された。以上の判定結果から、本実施例によるプライマーを用いたＬＡＭＰ法においては、遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統が非遺伝子組換えトウモロコシに混入されていても、このＣＢＨ３５１系統を特異的に検知することが可能であることが明らかとなった。

なお、以上の実施例では、陽性対照プライマーとして内在性遺伝子ＳＳＩＩｂ検知用プライマーを用いた場合を示したが、内在性遺伝子ゼイン検知用プライマーを用いても良い。

さらに、上記サンプル５（擬似混入試料１００％ＣＢＨ３５１）からの沈殿サンプルを鋳型ＤＮＡとして、本発明による遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統のＣｒｙ９Ｃ遺伝子の一部を含むプライマーを用いたＰＣＲ法による定性検知の可能性を検討した。ここで用いたプライマーは、上記ＬＡＭＰ法による場合と同様に、トウモロコシＣＢＨ３５１系統を特異的に検知するためのプライマーとして、配列番号１３及び配列番号１４の各プライマーを用いる組合せ及び配列番号１９及び配列番号２０の各プライマーを用いる組合せを用いた。また、陽性対照として内在性遺伝子ＳＳＩＩｂを特異的に検知するためのプライマーとして、配列番号７及び配列番号８の各プライマーを用いる組合せを用いた。

このＰＣＲ法による定性検知には、厚生労働省通知法・組換えＤＮＡ技術応用食品の検査方法に従い、以下のＰＣＲ反応条件を使用した。即ち、各反応液組成； GeneAmp 1x ＰＣＲ Buffer II、３ｍＭ MgCl₂ Solution（以上アプライドバイオシステムズ社製）、０．２ｍＭ 各 dNTPs（dATP、dGTP、dTTP、dCTP）、２００ｎＭ ＦＩＰ及びＢＩＰを含む反応液に、０．６２５UnitのAmpliTaq Gold ＤＮＡポリメラーゼ（アプライドバイオシステムズ社製）、および各鋳型ＤＮＡを２５ｎｇ加えて総量２５μＬとし、それぞれ９５℃に１０分間保温して反応を開始させた後、９５℃に０．５分間、６０℃に０．５分間、７２℃に０．５分間を１サイクルとして４０サイクルのＰＣＲ増幅を行った。次に反応終了として７２℃に７分間保温した。

検査陽性／陰性の判定は、反応液を３％アガロースゲルにて電気泳動を行い、増幅断片の有無により行った。このとき、レーン１およびレーン５をマーカーとし、レーン２を陰性対象としてプライマー無しとした場合、レーン３を鋳型ＤＮＡ無しとした場合、レーン４を上記サンプル５からなる鋳型ＤＮＡを用いた場合とした。その結果、図３（ａ）の遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統検知の電気泳動写真（特異的増幅産物：２２６ｂｐ）、（ｃ）の遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統検知の電気泳動写真（特異的増幅産物：１５９ｂｐ）及び（ｂ）の内在性遺伝子ＳＳＩＩｂ検出の電気泳動写真（特異的増幅産物：２１６ｂｐ）から明らかなように、本発明によるプライマーは、ＰＣＲ法においてもトウモロコシＣＢＨ３５１系統を特異的に検知することが可能であることが確認できた。なお、以上のＰＣＲ法による定性検知には、陽性対照プライマーとして内在性遺伝子ＳＳＩＩｂ検出用プライマーを用いた場合を示したが、内在性遺伝子ゼイン検出用プライマーも陽性対照プライマーとして有効であることは言うまでもない。

本発明の一実施例における遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の検知を示す電気泳動の写真代用図面であり、（ａ）は配列番号１３〜１８をプライマーとして用いた場合のトウモロコシＣＢＨ３５１の陽性／陰性判定用、（ｃ）は配列番号１９〜２４を用いた場合のトウモロコシＣＢＨ３５１の陽性／陰性判定用、（ｂ）は陽性対照として内在性遺伝子ＳＳＩＩｂ検出用プライマーを用いた場合の電気泳動写真である。 本発明に用いるＬＡＭＰ法を説明するための概略模式図である。 本発明によるプライマーを用いたＰＣＲ法による遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の検知を検討した際の結果を示す電気泳動の写真代用図面であり、（ａ）は配列番号１３及び配列番号１４をプライマーとして用いた場合のトウモロコシＣＢＨ３５１の陽性／陰性判定用、（ｃ）は配列番号１９及び配列番号２０を用いた場合のトウモロコシＣＢＨ３５１の陽性／陰性判定用、（ｂ）は陽性対照として内在性遺伝子ＳＳＩＩｂ検出用プライマー、配列番号７及び配列番号８を用いた場合の電気泳動写真である。

Claims (9)

1. 遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の組換え遺伝子を検出するための、ＬＡＭＰ法によって予め定められた複数の特異的な核酸配列を検知するのに用いるオリゴヌクレオチドからなるプライマーのセットとして、上流側インナープライマー：ＦＩＰと、下流側インナープライマー：ＢＩＰと、インナープライマーで増幅するＤＮＡ配列の外側にインナープライマーにより増幅したＤＮＡを鋳型ＤＮＡから引き剥がす役割を有する上流側アウタープライマー：Ｆ３および下流側アウタープライマー：Ｂ３と、インナープライマーとアウタープライマーの間に反応を高速化する役割の上流側ループプライマー：ＬＦ及び下流側ループプライマー：ＬＢとの組み合わせからなる核酸検査用プライマーセットであって、
   プライマー配列にトウモロコシＣＢＨ３５１系統の組換え遺伝子の塩基配列の一部を含むもので、配列番号１３：5'-agaggaaggg tcttgcgaat ctccactgac gtaagggat-3'、配列番号１４：5'-tcgagctcat ttctctatta cttcagcctc tgcaggtagt cagcca-3'、配列番号１５：5'-atagtgggat tgtgc-3'、配列番号１６：5'-agaactcttt tctcttc-3'、配列番号１７：5'-ccaaccacgt cttcaaagca-3'、配列番号１８：5'-gtgtagtcct cgtcggtca-3' 、及び配列番号１９：5'-tagcctcagt cctcctcggc tcgaccgcat cgagatc-3'、 配列番号２０：5'-ggacacgctg aaatcaccag tctatctggg aactactcac aca-3'、配列番号２１：5'-cgagctgggt tcacgg-3' 、配列番号２２：5'-ctctctacaa atctatctct ctct-3'、配列番号２３：5'-ggtggcgagt actaca-3' 、配列番号２４：5'-ctataggaac cctaattcc-3'、の各塩基配列からなるプライマーからそれぞれ選択して組み合わされたものであり
   ＦＩＰに配列番号１３、ＢＩＰに配列番号１４、ＬＦに配列番号１５、ＬＢに配列番号１６、Ｆ３に配列番号１７、Ｂ３に配列番号１８、のプライマーを選択してなる組み合わせと、
   ＦＩＰに配列番号１９、ＢＩＰに配列番号２０、ＬＦに配列番号２１、ＬＢに配列番号２２、Ｆ３に配列番号２３、Ｂ３に配列番号２４、のプライマーを選択してなる組み合わせと、を有することを特徴とするプライマーセット。
2. 請求項１に記載のＬＡＭＰ法用プライマーセットを備えたことを特徴とする遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１検知用の核酸検査キット。
3. 遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の内在性遺伝子を検出するためのＬＡＭＰ法用プライマーセットをさらに備えたことを特徴とする請求項２に記載の核酸検査キット。
4. 前記内在性遺伝子が、ゼイン又はスターチシンターゼＩＩｂをコードするＤＮＡの一部を含むことを特徴とする請求項３に記載の核酸検査キット。
5. 前記プライマーセットが、ゼインをコードするＤＮＡ塩基配列の一部を含み、ＦＩＰに配列番号１：5'-tggtgagagg tatgggggaa gacgcnacca ttttcccnca at-3'、ＢＩＰに配列番号２：5'-acaggatcca acaggcaatc gcgacggttg ttggaggaac a-3'、ＬＦに配列番号３：5'-ggaagctata ggagcttgtg a-3'、ＬＢに配列番号４：5'-aggcatctta ccnttatcac cct-3' 、Ｆ３に配列番号５：5'-tctttctgca agtgntgcta-3'、Ｂ３に配列番号６：5'-tgnaccaaag gtaactgctg-3'、の各塩基配列からなるプライマーをそれぞれ選択して組み合わせた内在性遺伝子ゼイン検出用プライマーセットであることを特徴とする請求項４に記載の核酸検査キット。
6. 前記プライマーセットが、スターチシンターゼＩＩｂをコードするＤＮＡ塩基配列の一部を含み、ＦＩＰに配列番号７：5'-atcagctttg ggtccggaca cgcaatgcaa aacggaacga g-3'、ＢＩＰに配列番号８：5'-agaaatcgat gccagtgcgg tggcgatgcc tatgctttcc a-3'、ＬＦに配列番号９：5'-gcgcggcggt gct-3'、ＬＢに配列番号１０：5'-aagccagagc ccgcagg-3'、Ｆ３に配列番号１１：5'-ccgaagcaaa gtcagagcg-3'、Ｂ３に配列番号１２：5'-gcatcagcct tagcatcca -3' 、の各塩基配列からなるプライマーをそれぞれ選択して組み合わせた内在性遺伝子スターチシンターゼＩＩｂ検出用プライマーセットあることを特徴とする請求項４に記載の核酸検査キット。
7. 前記内在性遺伝子ゼイン検出用プライマーセットのプライマー配列のｎ部分が、イノシンで置換されたことを特徴とする請求項５に記載の核酸検査キット。
8. 前記内在性遺伝子ゼイン検出用プライマーセットのプライマー配列のｎ部分が、アデニン、チミン、グアニン、シトシンの全部または一部で置換されたことを特徴とする請求項５に記載の核酸検査キット。
9. 請求項１に記載のＬＡＭＰ法用プライマーセットあるいは請求項２〜請求項８のいずれか１項に記載の核酸検査キットを用いた遺伝子組換えトウモロコシＣＢＨ３５１系統の検査方法。