JP2004154088A - Ｃｅａ検出のための核酸増幅用プライマーおよび該プライマーを用いた検査方法 - Google Patents
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Abstract
【課題】癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）を検出するための遺伝子増幅反応に用いる新規プライマーを提供すること。
【解決手段】癌胎児性抗原を検出するためのプライマーであって、その塩基配列の１９００番目から２２００番目およびその相補鎖の領域から選択され、またはその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド、また特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖等から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーを提供する。
【選択図】なし
【解決手段】癌胎児性抗原を検出するためのプライマーであって、その塩基配列の１９００番目から２２００番目およびその相補鎖の領域から選択され、またはその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド、また特定の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドまたはその相補鎖等から選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーを提供する。
【選択図】なし
Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）を検出するための核酸増幅用プライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌胎児性抗原（以下、本明細書中では「ＣＥＡ」と記載する）は、ヒトの大腸癌から取り出されたタンパク質で、その免疫学的な性質が胎児の組織と共通性を示すことから癌胎児性抗原あるいは癌胎児タンパクとよばれている。ＣＥＡは、癌の臨床において、最も有用な腫瘍マーカーといわれている。例えば、関連する疾患として大腸癌、すい臓、胆道、肺がん、胃癌、甲状腺癌、食道癌、子宮ガン、悪性卵巣腫瘍、尿路系癌などが挙げられる。大腸癌では、癌が進行するほど高値となり、肝移転を起こすとさらに著明に増加する。血中ＣＥＡは大腸癌、すい臓癌で５０〜６０％の陽性率であるが、陽性例は殆どが進行癌であり、手術後や化学療法後の観察に使用されている。
一方、肉腫、白血病、悪性リンパ腫などの陽性率は数％にすぎず、悪性腫瘍の大半でＣＥＡは陰性といわれている。
【０００３】
癌細胞は、原病巣部位を離れ、血流やリンパ系を経由して全身に転移する。癌の手術では、できるだけ確実に病巣を取り除くことが必要であるため、転移を正確に検出し、転移の度合に応じて適切な処置をすることが要求される。このため、術中のリンパ節への癌転移診断は極めて重要な意義を有している。例えば乳癌の場合には、ＱＯＬ（生活の質：Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）向上のために郭清範囲を縮小化する傾向であるが、術中のリンパ節癌転移診断は、最小限のリンパ節郭清範囲を決定するための重要な指針となりうる。食道癌においては、リンパ節転移の部位を検出することにより、開腹、閉胸、頚部切開のうち、いずれの術式を選択するかの決定するための指針となりうる。前立腺癌においては、リンパ節転移があれば摘出手術は中止し、ホルモン療法を行う等の意思決定の指標となり、さらに胃癌においても、術式および術後の治療方針の選択の指針となりうる。また、患者への負担を考えると、術中の癌転移診断は、迅速に行うことが必要である。
【０００４】
ＣＥＡの測定には、多数の測定キットが既に市販されている（臨床検査法提要、第３１版６７４−６７５頁、金原出版株式会杜、１９９８年９月２０日発行）。
【０００５】
近年の遺伝子解析技術の発展により、癌マーカー遺伝子の発現を検出することで、効果的に癌診断が行われるようになった。例えばＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の１本鎖への解離、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの結合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法であり（特開昭６１−２７４６９７号公報）、種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能である。例えば、動物体液や組織由来の試料中の核酸の分析が可能であるため、感染症や遺伝病や癌の診断などに有用である。
【０００６】
ＲＮＡの検出には、ＲＴ−ＰＣＲ法が利用できる。ＲＴ−ＰＣＲ法とは、例えば腫瘍組織からＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）またはランダムヘキサマーをプライマーにして逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、検出する方法である。この方法を用いた線維芽細胞腫の診断の例が報告されている（北海道医学雑誌、ｐ．１３５−１４１， Ｖｏｌ． ６６（２），（１９９１））。ＲＴ−ＰＣＲにより、切除した組織からのｍＲＮＡの検出が可能となり、癌転移の見落としの問題はある程度回避されるようになった。腫瘍や癌の診断分野では、このような核酸増幅方法が実用化されている（臨床検査法提要、第３１版１３１４頁、金原出版株式会杜、１９９８年９月２０日発行）。
しかし、ＰＣＲ法では、鋳型ＤＮＡの２本鎖から１本鎖への変性の操作を必要とし、増幅反応は複数の温度条件で繰り返し行う必要があった。また、一般に、検出可能な増幅産物を得るのに２時間程度かかり、迅速性を要求される術中に行う検査としては好ましいものではない。
【０００７】
ＰＣＲ法以外のＤＮＡ増幅方法として、ＬＡＭＰ法が報告されている（特許文献１）。ＬＡＭＰ法は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン構造を形成するプライマーを含む複数のプライマーによる遺伝子増幅法である。まず、初期反応において、２種類のインナープライマー（ＦＩＰ，ＲＩＰ）と２種類のアウタープライマー（Ｆ３プライマー、Ｒ３プライマー）および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより鋳型ＤＮＡから両端に一本鎖ループ部分をもつダンベル状の構造が合成される。この構造が増幅サイクルの起点構造となって、この構造の３’末端側から自己を鋳型としてＤＮＡの伸長・合成反応が進む。増幅産物は多数の繰り返し構造からなり、繰り返し構造の単位はプライマーに挟まれた被増幅領域を構成する２本の核酸の塩基配列が逆向きになった同一鎖内の相補性領域からなる。ＬＡＭＰ法は、鋳型ＤＮＡの２本鎖から１本鎖への熱変性の操作を必要とせず、増幅反応はすべて等温で連続的に進行することが特徴である（非特許文献１及び２）。鋳型がＲＮＡの場合には、鋳型がＤＮＡの場合の反応液組成にさらに逆転写酵素を添加することで同様に起点構造を合成することができ、増幅を進めることができる（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）。ＬＡＭＰ法では、３０分程度で検出に十分な増幅産物が得られる。したがって、核酸検出に要する時間が短縮されるため、例えば迅速に治療方針を決定することを目的としたリンパ節への癌転移の診断に適用できる。また、迅速に結果が得られることから、術中診断への適用も期待できる。
【０００８】
ヒトＣＥＡ検出用のＲＴ−ＰＣＲ用プライマーまたはプローブは既に報告されている（非特許文献３）。しかしながら、ＬＡＭＰ法に適用されるプライマーの報告はなく、その開発が望まれている。また、その他の核酸増幅手段に適用されるプライマーでも、公知のプライマーのほかに新たなプライマーまたは測定に有用なプライマーセットの構築が望まれている。
【０００９】
【特許文献１】
国際公開第ＷＯ ００／２８０８２号パンフレット
【非特許文献１】
Ｂｉｏベンチャー、日本、２００１年、Ｖｏｌ．１， Ｎｏ．１， ｐ．１０９−１１５
【非特許文献２】
ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ、日本、２００１年、Ｖｏｌ．１８， Ｎｏ．２， ｐ．１５−２９
【非特許文献３】
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年１１月、Ｖｏｌ．６， ｐ．４１７６−４１８５
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＣＥＡを検出するための核酸増幅反応に用いる新規プライマーを提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＬＡＭＰ法に効果的に適用されるＣＥＡを検出するための核酸増幅用プライマーを構築することができた。
【００１２】
即ち本発明は、
１．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号１で表される塩基配列の１９００から２２００番目およびその相補鎖の領域から選択され、配列番号１および／またはその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜２４のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
２．配列番号１１〜２４で表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマー、
３．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項１または２に記載の核酸増幅用プライマー、
４．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１で表される塩基配列の１９００から２２００番目およびその相補鎖の領域から選択され、配列番号１および／またはその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜２４のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
５．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項４に記載の核酸増幅用プライマーセット、
６．オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とするＣＥＡ検出のための前項５に記載のプライマーセット、
７．前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号１で表される塩基配列および／またはその相補鎖の各々２箇所の領域を認識することを特徴とする前項４から６のいずれか１に記載のプライマーセット。
８．前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号１で表される塩基配列および／またはその相補鎖の少なくとも６箇所の領域を認識することを特徴とする請求項５から７のいずれか１に記載のプライマーセット。
９．配列番号１８〜２４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーであって、 （ａ）配列番号１８〜２０および（ｂ）配列番号２２〜２４に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組み合わせを含むことを特徴とするプライマーセット。
１０．前項９のプライマーセットに配列番号１１および１２で表される配列のプライマーを選択した組み合わせのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット。
１１．前項９または１０のプライマーセットに、配列番号１３〜１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーであって、 （ｅ）配列番号１３〜１６および（ｆ）配列番号１７に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組み合わせのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット。
１２．次に示す１）〜１１）のいずれかからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１８、２２、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号１８、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号１８、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号１９、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号１９、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号２０、２２、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号２０、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号２０、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
９）配列番号２１、２２、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１０）配列番号２１、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１１）配列番号２１、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１３．次に示す１）〜２４）のいずれかからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１８、２２、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号１８、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号１８、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号１８、２４、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号１８、２４、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号１９、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号１９、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号２０、２２、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
９）配列番号２０、２２、１１、１２、１４および１７ で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１０）配列番号２０、２２、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１１）配列番号２０、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１２）配列番号２０、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１３）配列番号２０、２４、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１４）配列番号２０、２４、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１５）配列番号２０、２４、１１、１２、１６および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１６）配列番号２１、２２、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１７）配列番号２１、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１８）配列番号２１、２３、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１９）配列番号２１、２３、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２０）配列番号２１、２３、１１、１２、１６および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２１）配列番号２１、２４、１１、１２、１６および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２２）配列番号２１、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２３）配列番号２１、２４、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２４）配列番号２１、２４、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
１４．前項１若しくは２に記載のプライマーから必要なプライマーを選択し、または前項３〜１３いずれか１に記載のプライマーセットを選択して使用することによる核酸検出方法、
１５．核酸検出方法がＬＡＭＰ法である前項１４に記載の核酸検出方法、
１６．前項１４または１５記載の核酸検出方法に使用する試薬、
１７．前項１４または１５に記載の核酸検出方法に使用する試薬キット、
１８．前項１４または１５に記載の核酸検出方法を用いた核酸検出システム、
からなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（プライマーの設計）
本発明は、ヒトＣＥＡの核酸増幅法、好ましくはＬＡＭＰ法に適用可能な核酸増幅用のプライマーを提供するものである。該プライマーは、既知の配列番号１に表される塩基配列および／またはその相補的な配列から連続する塩基を少なくとも５以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。尚、配列番号１に記載の塩基配列はＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ１７３０３に基づく。
【００１４】
ＬＡＭＰ法で用いるプライマーの基本的な考え方は、特許文献１に記載の通りである。具体的には、増幅すべき標的ＤＮＡの、３’末端側から順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域を、５’末端側から順にＲ３、Ｒ２、Ｒ１という領域を規定し、少なくともこの６つの領域に対し、実質的に同一な塩基配列、または実質的に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖を選択し、少なくとも４種のプライマーを設計する。
【００１５】
実質的に同じ塩基配列とは、次のように定義される。すなわち、ある塩基配列を鋳型として合成された相補鎖が、目的の塩基配列に対してハイブリダイズし、相補鎖合成の起点を与えるとき、この配列は目的の塩基配列に対して実質的に同一である。例えば、Ｆ２に対して実質的に同一な塩基配列とは、Ｆ２と全く同一な塩基配列に加えて、Ｆ２にハイブリダイズして相補鎖合成の起点となりうる塩基配列を与える鋳型として機能する塩基配列を含む。
【００１６】
本発明に基づくオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列の特徴付けのために用いられる同一、あるいは相補的という用語はいずれも完全に同一、あるいは完全に相補的であることを要しない。すなわち、ある配列と同一とは、ある配列に対してハイブリダイズすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、相補鎖合成の起点となる３’末端を提供することができる配列を意味する。
【００１７】
本発明のプライマーは、以下に述べる各種の核酸合成反応において与えられた環境のもとで必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長をもつ。具体的には５〜２００塩基、より望ましくは１０〜５０塩基対とする。配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長は最低５塩基前後であることから、ハイブリダイズする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列としての特異性を維持するためには、１０塩基以上の長さを維持するのが望ましい。一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となることから、前記のような鎖長が望ましい範囲として例示される。
【００１８】
本発明において用いられる鋳型という用語は、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、鋳型にハイブリダイズしうる鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることができる。
【００１９】
本発明において、標的ＤＮＡの塩基配列から選択されるプライマーは、各々ＦＩＰ（ｆｏｒｗａｒｄ ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）、Ｆ３プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）、ＲＩＰ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）およびＲ３プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）のいずれかを構成する。
ＦＩＰは、標的ＤＮＡのＦ２ｃ領域と実質的に相補的なＦ２領域の塩基配列を３’末端にもち、５’末端に標的ＤＮＡのＦ１ｃ領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。この場合において、Ｆ２およびＦ１ｃの配列間に標的ＤＮＡに依存しない配列が介在していても良い。この標的ＤＮＡに依存しない配列の長さは０〜５０塩基、好ましくは０〜４０塩基であれば許容しうる。
Ｆ３プライマーは、標的ＤＮＡのＦ３ｃ領域と実質的に相補的なＦ３領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
ＲＩＰは、標的ＤＮＡのＲ２ｃ領域と実質的に相補的なＲ２領域の塩基配列を３’末端にもち、５’末端に標的ＤＮＡのＲ１ｃ領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。ＲＩＰもＦＩＰと同様に、Ｒ２およびＲ１ｃの配列の間に標的ＤＮＡに依存しない配列が介在していても良い。
Ｒ３プライマーは、標的ＤＮＡのＲ３ｃ領域と実質的に相補的なＲ３領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
【００２０】
また、ＬＡＭＰ法では、少なくとも１種以上のループプライマーを併用することで増幅時間を短縮することができる（国際公開ＷＯ ０２／２４９０２号公報）。ループプライマーとは、ダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分、具体的には例えばＲ１領域とＲ２領域の間、あるいはＦ１領域とＦ２領域の間に相補的な配列をもつプライマーをいう。ループプライマーを用いることによりＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となる。このループプライマーは、ＤＮＡ合成過程でできたＦＩＰまたはＲＩＰがハイブリダイズしないループ領域にハイブリダイズするように設計する。
【００２１】
本発明のプライマーも、上記の原理に従った領域を選択し、設計する。ヒトＣＥＡの構造遺伝子は、配列番号１に示す２５４１塩基よりなるＤＮＡ鎖およびその相補鎖によって形成される。
【００２２】
本発明のプライマーの領域は、塩基組成、ＧＣ含量、二次構造、Ｔｍ値などに注意し、ＤＮＡ領域を認識する塩基配列の長さは、塩基数が少なくとも５塩基以上、好ましくは１０から３０塩基、より好ましくは１７から２５塩基のものを選択することができる。Ｔｍ値は、一般的にＮｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法で求めることができる。ＤＮＡ領域は、Ｔｍ値が５５〜６５℃、好ましくは５８〜６４℃のものを選択し、ＧＣ含量が４０〜７０％、好ましくは５０〜６５％のものを選択することができる。
【００２３】
このような条件により、本発明で選択されたプライマーの領域は、配列番号１で表される塩基配列の１９００番目から２２００番目およびその相補鎖の領域およびその相補鎖の領域に含まれる。
【００２４】
本発明のプライマーは、１）配列番号１で表される塩基配列の１９００番目から２２００番目および／またはその相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも５以上のオリゴヌクレオチド、２）配列番号１１〜２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、または、５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドから選択され、設計される。
【００２５】
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９ ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ法を単独または適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ， ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
【００２６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができる。その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件があげられる。
【００２７】
本発明において増幅されるべき核酸の鋳型はヒトＣＥＡのｍＲＮＡであるから、使用するプライマーが、検体中に含まれるゲノムＤＮＡを増幅しないように設計することが必要とされる。具体的には、本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの少なくとも１つは、ヒトＣＥＡの遺伝子において複数のエクソンにまたがる領域を含むものであることが望ましい。このような工夫を行うことによって、ゲノムＤＮＡ由来の配列の増幅が排除され、ヒトＣＥＡのｍＲＮＡ由来の配列を選択的に増幅することが可能となる。
【００２８】
（プライマーセット）
本発明のプライマーを使用して核酸増幅を行う場合、少なくとも２種を組み合わせてプライマーセットとして使用する。ＬＡＭＰ法では、少なくとも４種のプライマー（ＦＩＰ、Ｆ３プライマー、ＲＩＰ、Ｒ３プライマー）を組み合わせてプライマーセットとして使用する。さらに、１種以上のループプライマーを組み合わせて、プライマーセットとして使用することもできる。
【００２９】
（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）
ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、ＲＮＡを鋳型とするＬＡＭＰ法であり、ＬＡＭＰ法の基本的な考え方は特許文献１に記載の通りである。ＲＴ−ＬＡＭＰ法では一つの溶液中で、鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを合成しながら、ＬＡＭＰ法の起点構造が合成される。具体的には次の１）のステップを経た後、２）〜５）ステップの繰り返しにより、ＤＮＡの伸長が繰り返され、標的ＤＮＡの増幅が行われる。
【００３０】
１）鋳型ＲＮＡ鎖にＦＩＰが結合し、鋳型ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長する。この反応は逆転写酵素、例えばＡＭＶ由来の逆転写酵素等を用いる。
２）上記１）で合成したＦＩＰからのＤＮＡ鎖を、Ｆ３プライマーが鋳型ＲＮＡから剥がしながら、鋳型ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長する。以降ＤＮＡ鎖の伸長はＤＮＡポリメラーゼによる。
３）上記２）で剥がされたＤＮＡ鎖に、ＲＩＰが結合してＤＮＡ鎖が伸長する。４）上記３）で伸長したＲＩＰからのＤＮＡ鎖をＲ３プライマーが剥がしながら、ＦＩＰからのＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長し、ＬＡＭＰ法の起点構造が合成される。
５）上記４）で剥がされたＤＮＡ鎖の両端の配列は、同じＤＮＡ鎖の配列中に相補的な配列を有するので、各々ハイブリダイズし、両端にループ構造を持つ。
なお、例えばＢｃａＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのように、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素があり、このような酵素を使用する場合は、上記の反応は１つの酵素で実施することができる。
【００３１】
（測定方法）
ＬＡＭＰ法では、合成されたＤＮＡ鎖は自己の配列に対して相補的な配列をもつので、その大部分が塩基対結合を形成している。この特徴を利用して、増幅生成物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、ＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ、あるいはＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎのような２本鎖インターカーレーターである蛍光色素の存在下で本発明のプライマーを用いて核酸増幅を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。これをモニターすれば、閉鎖系でＤＮＡの増幅と蛍光の増加が同時に追跡可能である（臨床検査法提要、３１版１３１８頁；特開２００１−２４２１６９号公報参照。以下単に「リアルタイム法」という。）。
【００３２】
（試薬、試薬キット、その他）
本発明のプライマーを用いて核酸の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化することができる。具体的には、本発明の相補鎖合成のプライマーとして、あるいは置換用のプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、逆転写活性を有する酵素、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、さらに必要に応じて反応生成物の検出のために必要な試薬類がキットとして提供される。
【００３３】
本発明は、核酸増幅用プライマーおよびプライマーセット、ならびにこれらのプライマーを用いた核酸検出方法、核酸検出方法に使用される検出試薬、核酸検出キットならびに核酸検出システム全体に及ぶ。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３５】
【実施例１】
（領域の選択）
配列番号１に記載するヒトＣＥＡの塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いてＬＡＭＰ法に適切な領域の位置を検討した。領域の選択は、Ｆ１ｃおよびＲ１ｃはＴｍ値が５８．５〜６３．５℃、Ｆ２およびＲ２はＴｍ値が６１．５〜６２．５℃、Ｆ３およびＲ３はＴｍ値が５８．５〜６２．５℃により領域を選択した結果、次に示すものが選択された。選択された領域は、配列番号１で表される塩基配列の１９００−２２００番目およびその相補鎖の領域に含まれる。
【００３６】
Ｆ１ｃ：配列番号１で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
２０５４−２０３４番目（配列番号２）
【００３７】
Ｆ２ ：配列番号１で表される配列上の塩基位置の領域
１９５１−１９６６番目（配列番号３）
１９５２−１９６８番目（配列番号４）
１９５０−１９６６番目（配列番号５）
１９５７−１９７３番目（配列番号６）
【００３８】
Ｒ１ｃ：配列番号１で表される配列上の塩基位置の領域
２０６２−２０８４番目（配列番号７）
【００３９】
Ｒ２ ：配列番号１で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
２１３４−２１１４番目（配列番号８）
２１３３−２１１４番目（配列番号９）
２１３８−２１２０番目（配列番号１０）
【００４０】
Ｆ３ ：配列番号１で表される配列上の塩基位置の領域
１９０６−１９２２番目（配列番号１１）
【００４１】
Ｒ３ ：配列番号１で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
２１８９−２１７２番目（配列番号１２）
【００４２】
ｌｏｏｐ Ｆ：配列番号１で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
１９９７−１９７８番目（配列番号１３）
１９９４−１９７５番目（配列番号１４）
１９９６−１９７８番目（配列番号１５）
１９９５−１９７６番目（配列番号１６）
【００４３】
ｌｏｏｐ Ｒ：配列番号１で表される配列上の塩基位置の領域
２０８６−２１０９番目（配列番号１７）
【００４４】
（プライマーの設計）
選択された領域の配列から、ＬＡＭＰ法に適用される次の核酸増幅用プライマーが得られた。
【００４５】
ＦＩＰ：領域Ｆ１ｃおよびＦ２を連結した塩基配列からなるプライマー
ＡＦＡ Ｉ ：（配列番号１８）配列番号２および３で表される配列を連結
ＡＦＡ ＩＩ ：（配列番号１９）配列番号２および４で表される配列を連結
ＡＦＡ ＩＩＩ：（配列番号２０）配列番号２および５で表される配列を連結
ＡＦＡ Ｖ ：（配列番号２１）配列番号２および６で表される配列を連結
【００４６】
ＲＩＰ：領域Ｒ１ｃおよびＲ２を連結した塩基配列からなるプライマー
ＡＲＡ Ｉ ：（配列番号２２）配列番号７および８で表される配列を連結
ＡＲＡ ＩＩ ：（配列番号２３）配列番号７および９で表される配列を連結
ＡＲＡ Ｖ ：（配列番号２４）配列番号７および１０で表される配列を連結
【００４７】
Ｆ３プライマー：各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー
ＡＦ３ ：（配列番号１１）
【００４８】
Ｒ３プライマー：各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー
ＡＲ３ ：（配列番号１２）
【００４９】
ループプライマーＦ：各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー
ＬＰＦ ：（配列番号１３）
ＬＰＦ ＩＩ ：（配列番号１４）
ＬＰＦ ＩＩＩ：（配列番号１５）
ＬＰＦ ＩＶ ：（配列番号１６）
▲６▼ループプライマーＲ：各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー
ＬＰＲ ：（配列番号１７）
【００５０】
【実験例１】
上記各種プライマーを次の組み合わせでＲＴ−ＬＡＭＰ法で測定した場合の、反応を開始してから増幅が確認できるまでに要する時間を各プライマーセットについて調べることを目的として実験を行った。
【００５１】
１）ヒトＣＥＡＲＮＡ試料の調製方法
ヒトＣＥＡの塩基配列を基に設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ＬＳ１８０（大腸癌細胞）由来トータルＲＮＡから、ヒトＣＥＡｃＤＮＡを単離した。ｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製プラスミド）にクローニングしたヒトＣＥＡｃＤＮＡから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写システム（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製））を用いて転写産物を合成した。得られた原液のＲＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸光度測定により算出し、その値をもとにヒトＣＥＡのＲＮＡコピー数が６０，０００、６，０００、６００、６０、６および０（対照）となるように５０ ｎｇ／ｍＬ
ｙｅａｓｔ ＲＮＡ（Ａｍｉｂｏｎ社製）で希釈調製し、鋳型とした。
【００５２】
２）プライマーセット
各種プライマーを（表１）の組み合わせで用いた。表中の番号は、配列番号を示し、各配列番号で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプライマーをセットで使用したことを示す。
【００５３】
【表１】
【００５４】
【００５５】
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
上記６種のプライマーを含む反応液２３μｌに、ヒトＣＥＡのＲＮＡ試料を２μｌとなるよう添加し、６５℃で１時間加温して行った。
【００５６】
５）増幅の確認
増幅産物は２本鎖構造をもつので、エチジウムブロマイドがインターカレートして蛍光を発する。その蛍光強度の増加をＡＢＩ社製ＰＲＩＳＭ７７００を用いてリアルタイム法により測定した。
【００５７】
６）結果
２２〜２４の各プライマーセットを用いた場合の結果を各々図１〜３に示した。その結果、各々についてＣＥＡの鋳型の量が多い場合のほうが、増幅が確認できるまでに要する時間は短かかった。プライマーセット１〜３では、６０コピーの場合でも２０分以内に増幅が確認され、６，０００コピーの場合に約１０分で増幅が確認された。
【００５８】
【発明の効果】
以上説明したように本発明のプライマーまたはプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法を行うと、効果的にヒトＣＥＡを特異的に増幅することがわかった。このことから、本発明のプライマーを用いると、２０分以内にヒトＣＥＡを検出することが可能となり、核酸増幅手段を用いたリンパ節への癌転移診断に要する時間の短縮化が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】プライマーセット２２を用いたときの感度を示す図である。（実験例１）
【図２】プライマーセット２３を用いたときの感度を示す図である。（実験例１）
【図３】プライマーセット２４を用いたときの感度を示す図である。（実験例１）
【符号の説明】
○ ヒトＣＥＡのＲＮＡの鋳型コピー数 ０ の場合
△ ヒトＣＥＡのＲＮＡの鋳型コピー数 ６０ の場合
× ヒトＣＥＡのＲＮＡの鋳型コピー数 ６００ の場合
◆ ヒトＣＥＡのＲＮＡの鋳型コピー数 ６，０００ の場合
● ヒトＣＥＡのＲＮＡの鋳型コピー数 ６０，０００ の場合
【配列表】
【発明が属する技術分野】
本発明は、癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）を検出するための核酸増幅用プライマーに関する。
【０００２】
【従来の技術】
癌胎児性抗原（以下、本明細書中では「ＣＥＡ」と記載する）は、ヒトの大腸癌から取り出されたタンパク質で、その免疫学的な性質が胎児の組織と共通性を示すことから癌胎児性抗原あるいは癌胎児タンパクとよばれている。ＣＥＡは、癌の臨床において、最も有用な腫瘍マーカーといわれている。例えば、関連する疾患として大腸癌、すい臓、胆道、肺がん、胃癌、甲状腺癌、食道癌、子宮ガン、悪性卵巣腫瘍、尿路系癌などが挙げられる。大腸癌では、癌が進行するほど高値となり、肝移転を起こすとさらに著明に増加する。血中ＣＥＡは大腸癌、すい臓癌で５０〜６０％の陽性率であるが、陽性例は殆どが進行癌であり、手術後や化学療法後の観察に使用されている。
一方、肉腫、白血病、悪性リンパ腫などの陽性率は数％にすぎず、悪性腫瘍の大半でＣＥＡは陰性といわれている。
【０００３】
癌細胞は、原病巣部位を離れ、血流やリンパ系を経由して全身に転移する。癌の手術では、できるだけ確実に病巣を取り除くことが必要であるため、転移を正確に検出し、転移の度合に応じて適切な処置をすることが要求される。このため、術中のリンパ節への癌転移診断は極めて重要な意義を有している。例えば乳癌の場合には、ＱＯＬ（生活の質：Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ ｌｉｆｅ）向上のために郭清範囲を縮小化する傾向であるが、術中のリンパ節癌転移診断は、最小限のリンパ節郭清範囲を決定するための重要な指針となりうる。食道癌においては、リンパ節転移の部位を検出することにより、開腹、閉胸、頚部切開のうち、いずれの術式を選択するかの決定するための指針となりうる。前立腺癌においては、リンパ節転移があれば摘出手術は中止し、ホルモン療法を行う等の意思決定の指標となり、さらに胃癌においても、術式および術後の治療方針の選択の指針となりうる。また、患者への負担を考えると、術中の癌転移診断は、迅速に行うことが必要である。
【０００４】
ＣＥＡの測定には、多数の測定キットが既に市販されている（臨床検査法提要、第３１版６７４−６７５頁、金原出版株式会杜、１９９８年９月２０日発行）。
【０００５】
近年の遺伝子解析技術の発展により、癌マーカー遺伝子の発現を検出することで、効果的に癌診断が行われるようになった。例えばＰＣＲ法は、ＤＮＡ鎖の１本鎖への解離、ＤＮＡ鎖の中の特定の領域をはさんだプライマーの結合、ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成反応を繰り返すことによって、目的のＤＮＡ断片を数十万倍にも増幅できる方法であり（特開昭６１−２７４６９７号公報）、種々の試料中の核酸の高感度分析法として使用可能である。例えば、動物体液や組織由来の試料中の核酸の分析が可能であるため、感染症や遺伝病や癌の診断などに有用である。
【０００６】
ＲＮＡの検出には、ＲＴ−ＰＣＲ法が利用できる。ＲＴ−ＰＣＲ法とは、例えば腫瘍組織からＲＮＡを抽出し、オリゴ（ｄＴ）またはランダムヘキサマーをプライマーにして逆転写酵素（ＲＴ）によりｃＤＮＡを合成し、このｃＤＮＡをＰＣＲ法で増幅し、検出する方法である。この方法を用いた線維芽細胞腫の診断の例が報告されている（北海道医学雑誌、ｐ．１３５−１４１， Ｖｏｌ． ６６（２），（１９９１））。ＲＴ−ＰＣＲにより、切除した組織からのｍＲＮＡの検出が可能となり、癌転移の見落としの問題はある程度回避されるようになった。腫瘍や癌の診断分野では、このような核酸増幅方法が実用化されている（臨床検査法提要、第３１版１３１４頁、金原出版株式会杜、１９９８年９月２０日発行）。
しかし、ＰＣＲ法では、鋳型ＤＮＡの２本鎖から１本鎖への変性の操作を必要とし、増幅反応は複数の温度条件で繰り返し行う必要があった。また、一般に、検出可能な増幅産物を得るのに２時間程度かかり、迅速性を要求される術中に行う検査としては好ましいものではない。
【０００７】
ＰＣＲ法以外のＤＮＡ増幅方法として、ＬＡＭＰ法が報告されている（特許文献１）。ＬＡＭＰ法は、鎖置換反応が進行すると増幅産物の末端にヘアピン構造を形成するプライマーを含む複数のプライマーによる遺伝子増幅法である。まず、初期反応において、２種類のインナープライマー（ＦＩＰ，ＲＩＰ）と２種類のアウタープライマー（Ｆ３プライマー、Ｒ３プライマー）および鎖置換型ＤＮＡポリメラーゼにより鋳型ＤＮＡから両端に一本鎖ループ部分をもつダンベル状の構造が合成される。この構造が増幅サイクルの起点構造となって、この構造の３’末端側から自己を鋳型としてＤＮＡの伸長・合成反応が進む。増幅産物は多数の繰り返し構造からなり、繰り返し構造の単位はプライマーに挟まれた被増幅領域を構成する２本の核酸の塩基配列が逆向きになった同一鎖内の相補性領域からなる。ＬＡＭＰ法は、鋳型ＤＮＡの２本鎖から１本鎖への熱変性の操作を必要とせず、増幅反応はすべて等温で連続的に進行することが特徴である（非特許文献１及び２）。鋳型がＲＮＡの場合には、鋳型がＤＮＡの場合の反応液組成にさらに逆転写酵素を添加することで同様に起点構造を合成することができ、増幅を進めることができる（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）。ＬＡＭＰ法では、３０分程度で検出に十分な増幅産物が得られる。したがって、核酸検出に要する時間が短縮されるため、例えば迅速に治療方針を決定することを目的としたリンパ節への癌転移の診断に適用できる。また、迅速に結果が得られることから、術中診断への適用も期待できる。
【０００８】
ヒトＣＥＡ検出用のＲＴ−ＰＣＲ用プライマーまたはプローブは既に報告されている（非特許文献３）。しかしながら、ＬＡＭＰ法に適用されるプライマーの報告はなく、その開発が望まれている。また、その他の核酸増幅手段に適用されるプライマーでも、公知のプライマーのほかに新たなプライマーまたは測定に有用なプライマーセットの構築が望まれている。
【０００９】
【特許文献１】
国際公開第ＷＯ ００／２８０８２号パンフレット
【非特許文献１】
Ｂｉｏベンチャー、日本、２００１年、Ｖｏｌ．１， Ｎｏ．１， ｐ．１０９−１１５
【非特許文献２】
ＢＩＯ ＩＮＤＵＳＴＲＹ、日本、２００１年、Ｖｏｌ．１８， Ｎｏ．２， ｐ．１５−２９
【非特許文献３】
Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０００年１１月、Ｖｏｌ．６， ｐ．４１７６−４１８５
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、ＣＥＡを検出するための核酸増幅反応に用いる新規プライマーを提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明者らは、上記課題を解決するために鋭意検討を重ねた結果、ＬＡＭＰ法に効果的に適用されるＣＥＡを検出するための核酸増幅用プライマーを構築することができた。
【００１２】
即ち本発明は、
１．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含むＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号１で表される塩基配列の１９００から２２００番目およびその相補鎖の領域から選択され、配列番号１および／またはその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜２４のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
２．配列番号１１〜２４で表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマー、
３．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項１または２に記載の核酸増幅用プライマー、
４．以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１で表される塩基配列の１９００から２２００番目およびその相補鎖の領域から選択され、配列番号１および／またはその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜２４のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド、
５．核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である前項４に記載の核酸増幅用プライマーセット、
６．オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とするＣＥＡ検出のための前項５に記載のプライマーセット、
７．前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号１で表される塩基配列および／またはその相補鎖の各々２箇所の領域を認識することを特徴とする前項４から６のいずれか１に記載のプライマーセット。
８．前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号１で表される塩基配列および／またはその相補鎖の少なくとも６箇所の領域を認識することを特徴とする請求項５から７のいずれか１に記載のプライマーセット。
９．配列番号１８〜２４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーであって、 （ａ）配列番号１８〜２０および（ｂ）配列番号２２〜２４に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組み合わせを含むことを特徴とするプライマーセット。
１０．前項９のプライマーセットに配列番号１１および１２で表される配列のプライマーを選択した組み合わせのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット。
１１．前項９または１０のプライマーセットに、配列番号１３〜１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーであって、 （ｅ）配列番号１３〜１６および（ｆ）配列番号１７に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組み合わせのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット。
１２．次に示す１）〜１１）のいずれかからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１８、２２、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号１８、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号１８、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号１９、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号１９、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号２０、２２、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号２０、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号２０、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
９）配列番号２１、２２、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１０）配列番号２１、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１１）配列番号２１、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１３．次に示す１）〜２４）のいずれかからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１８、２２、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号１８、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号１８、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号１８、２４、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号１８、２４、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号１９、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号１９、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号２０、２２、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
９）配列番号２０、２２、１１、１２、１４および１７ で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１０）配列番号２０、２２、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１１）配列番号２０、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１２）配列番号２０、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１３）配列番号２０、２４、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１４）配列番号２０、２４、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１５）配列番号２０、２４、１１、１２、１６および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１６）配列番号２１、２２、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１７）配列番号２１、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１８）配列番号２１、２３、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１９）配列番号２１、２３、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２０）配列番号２１、２３、１１、１２、１６および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２１）配列番号２１、２４、１１、１２、１６および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２２）配列番号２１、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２３）配列番号２１、２４、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２４）配列番号２１、２４、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット、
１４．前項１若しくは２に記載のプライマーから必要なプライマーを選択し、または前項３〜１３いずれか１に記載のプライマーセットを選択して使用することによる核酸検出方法、
１５．核酸検出方法がＬＡＭＰ法である前項１４に記載の核酸検出方法、
１６．前項１４または１５記載の核酸検出方法に使用する試薬、
１７．前項１４または１５に記載の核酸検出方法に使用する試薬キット、
１８．前項１４または１５に記載の核酸検出方法を用いた核酸検出システム、
からなる。
【００１３】
【発明の実施の形態】
（プライマーの設計）
本発明は、ヒトＣＥＡの核酸増幅法、好ましくはＬＡＭＰ法に適用可能な核酸増幅用のプライマーを提供するものである。該プライマーは、既知の配列番号１に表される塩基配列および／またはその相補的な配列から連続する塩基を少なくとも５以上含む適当なオリゴヌクレオチドを選択して設計される。尚、配列番号１に記載の塩基配列はＧｅｎｂａｎｋ ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｍ１７３０３に基づく。
【００１４】
ＬＡＭＰ法で用いるプライマーの基本的な考え方は、特許文献１に記載の通りである。具体的には、増幅すべき標的ＤＮＡの、３’末端側から順にＦ３ｃ、Ｆ２ｃ、Ｆ１ｃという領域を、５’末端側から順にＲ３、Ｒ２、Ｒ１という領域を規定し、少なくともこの６つの領域に対し、実質的に同一な塩基配列、または実質的に相補的な塩基配列を含むオリゴヌクレオチド鎖を選択し、少なくとも４種のプライマーを設計する。
【００１５】
実質的に同じ塩基配列とは、次のように定義される。すなわち、ある塩基配列を鋳型として合成された相補鎖が、目的の塩基配列に対してハイブリダイズし、相補鎖合成の起点を与えるとき、この配列は目的の塩基配列に対して実質的に同一である。例えば、Ｆ２に対して実質的に同一な塩基配列とは、Ｆ２と全く同一な塩基配列に加えて、Ｆ２にハイブリダイズして相補鎖合成の起点となりうる塩基配列を与える鋳型として機能する塩基配列を含む。
【００１６】
本発明に基づくオリゴヌクレオチドを構成する塩基配列の特徴付けのために用いられる同一、あるいは相補的という用語はいずれも完全に同一、あるいは完全に相補的であることを要しない。すなわち、ある配列と同一とは、ある配列に対してハイブリダイズすることができる塩基配列に対して相補的な配列をも含むことができる。他方、相補的とは、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができ、相補鎖合成の起点となる３’末端を提供することができる配列を意味する。
【００１７】
本発明のプライマーは、以下に述べる各種の核酸合成反応において与えられた環境のもとで必要な特異性を維持しながら相補鎖との塩基対結合を行うことができる程度の鎖長をもつ。具体的には５〜２００塩基、より望ましくは１０〜５０塩基対とする。配列依存的な核酸合成反応を触媒する公知のポリメラーゼが認識するプライマーの鎖長は最低５塩基前後であることから、ハイブリダイズする部分の鎖長はそれ以上である必要がある。加えて、塩基配列としての特異性を維持するためには、１０塩基以上の長さを維持するのが望ましい。一方、あまりにも長い塩基配列は化学合成によって調製することが困難となることから、前記のような鎖長が望ましい範囲として例示される。
【００１８】
本発明において用いられる鋳型という用語は、相補鎖合成の鋳型となる側の核酸を意味する。鋳型に相補的な塩基配列を持つ相補鎖は、鋳型にハイブリダイズしうる鎖としての意味を持つが、両者の関係はあくまでも相対的なものに過ぎない。すなわち、相補鎖として合成された鎖は、再び鋳型として機能することができる。つまり、相補鎖は鋳型になることができる。
【００１９】
本発明において、標的ＤＮＡの塩基配列から選択されるプライマーは、各々ＦＩＰ（ｆｏｒｗａｒｄ ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）、Ｆ３プライマー（ｆｏｒｗａｒｄ ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）、ＲＩＰ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｉｎｎｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）およびＲ３プライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ ｏｕｔｅｒ ｐｒｉｍｅｒ）のいずれかを構成する。
ＦＩＰは、標的ＤＮＡのＦ２ｃ領域と実質的に相補的なＦ２領域の塩基配列を３’末端にもち、５’末端に標的ＤＮＡのＦ１ｃ領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。この場合において、Ｆ２およびＦ１ｃの配列間に標的ＤＮＡに依存しない配列が介在していても良い。この標的ＤＮＡに依存しない配列の長さは０〜５０塩基、好ましくは０〜４０塩基であれば許容しうる。
Ｆ３プライマーは、標的ＤＮＡのＦ３ｃ領域と実質的に相補的なＦ３領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
ＲＩＰは、標的ＤＮＡのＲ２ｃ領域と実質的に相補的なＲ２領域の塩基配列を３’末端にもち、５’末端に標的ＤＮＡのＲ１ｃ領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。ＲＩＰもＦＩＰと同様に、Ｒ２およびＲ１ｃの配列の間に標的ＤＮＡに依存しない配列が介在していても良い。
Ｒ３プライマーは、標的ＤＮＡのＲ３ｃ領域と実質的に相補的なＲ３領域と実質的に同じ塩基配列をもつように設計する。
【００２０】
また、ＬＡＭＰ法では、少なくとも１種以上のループプライマーを併用することで増幅時間を短縮することができる（国際公開ＷＯ ０２／２４９０２号公報）。ループプライマーとは、ダンベル構造の５’末端側のループの１本鎖部分、具体的には例えばＲ１領域とＲ２領域の間、あるいはＦ１領域とＦ２領域の間に相補的な配列をもつプライマーをいう。ループプライマーを用いることによりＤＮＡ合成の起点を増やすことが可能となる。このループプライマーは、ＤＮＡ合成過程でできたＦＩＰまたはＲＩＰがハイブリダイズしないループ領域にハイブリダイズするように設計する。
【００２１】
本発明のプライマーも、上記の原理に従った領域を選択し、設計する。ヒトＣＥＡの構造遺伝子は、配列番号１に示す２５４１塩基よりなるＤＮＡ鎖およびその相補鎖によって形成される。
【００２２】
本発明のプライマーの領域は、塩基組成、ＧＣ含量、二次構造、Ｔｍ値などに注意し、ＤＮＡ領域を認識する塩基配列の長さは、塩基数が少なくとも５塩基以上、好ましくは１０から３０塩基、より好ましくは１７から２５塩基のものを選択することができる。Ｔｍ値は、一般的にＮｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ法で求めることができる。ＤＮＡ領域は、Ｔｍ値が５５〜６５℃、好ましくは５８〜６４℃のものを選択し、ＧＣ含量が４０〜７０％、好ましくは５０〜６５％のものを選択することができる。
【００２３】
このような条件により、本発明で選択されたプライマーの領域は、配列番号１で表される塩基配列の１９００番目から２２００番目およびその相補鎖の領域およびその相補鎖の領域に含まれる。
【００２４】
本発明のプライマーは、１）配列番号１で表される塩基配列の１９００番目から２２００番目および／またはその相補鎖の領域に含まれ、塩基数が少なくとも５以上のオリゴヌクレオチド、２）配列番号１１〜２４で表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド、３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖、４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド、または、５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含むオリゴヌクレオチドから選択され、設計される。
【００２５】
オリゴヌクレオチドは、自体公知の方法により製造することができ、例えば化学的に合成することができる。あるいは、天然の核酸を制限酵素などによって切断し、上記のような塩基配列で構成されるように改変し、あるいは連結することも可能である。具体的には、オリゴヌクレオチド合成装置（アプライドバイオシステムズ社製 Ｅｘｐｅｄｉｔｅ Ｍｏｄｅｌ ８９０９ ＤＮＡ合成機）等を用いて合成することができる。また、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異させたオリゴヌクレオチドの合成法も、自体公知の製法を使用することができる。例えば、部位特異的変異導入法、遺伝子相同組換え法、プライマー伸長法またはＰＣＲ法を単独または適宜組み合わせて、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、２版、Ｓａｍｂｒｏｏｋら編、コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー・プレス、コールド・スプリング・ハーバー、ニューヨーク、１９８９年；［ラボマニュアル遺伝子工学］、村松正實編、丸善株式会社、１９８８年；［ＰＣＲテクノロジー、ＤＮＡ増幅の原理と応用］、Ｅｈｒｌｉｃｈ， ＨＥ．編、ストックトンプレス、１９８９年等に記載の方法に準じて、あるいはそれらの方法を改変して実施することができ、例えばＵｌｍｅｒの技術（Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８３）２１９：６６６）を利用することができる。
【００２６】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は一般に知られたものを選択することができる。その一例としては、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ（１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１５ｍＭ クエン酸三ナトリウム）、５０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．６、５×デンハーツ溶液、１０％デキストラン硫酸、および２０μｇ／ｍｌのＤＮＡを含む溶液中、４２℃で一晩ハイブリダイゼーションした後、室温で２×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳ中で一次洗浄し、次いで、約６５℃において０．１×ＳＳＣ・０．１％ＳＤＳで二次洗浄といった条件があげられる。
【００２７】
本発明において増幅されるべき核酸の鋳型はヒトＣＥＡのｍＲＮＡであるから、使用するプライマーが、検体中に含まれるゲノムＤＮＡを増幅しないように設計することが必要とされる。具体的には、本発明のプライマーセットに含まれるプライマーの少なくとも１つは、ヒトＣＥＡの遺伝子において複数のエクソンにまたがる領域を含むものであることが望ましい。このような工夫を行うことによって、ゲノムＤＮＡ由来の配列の増幅が排除され、ヒトＣＥＡのｍＲＮＡ由来の配列を選択的に増幅することが可能となる。
【００２８】
（プライマーセット）
本発明のプライマーを使用して核酸増幅を行う場合、少なくとも２種を組み合わせてプライマーセットとして使用する。ＬＡＭＰ法では、少なくとも４種のプライマー（ＦＩＰ、Ｆ３プライマー、ＲＩＰ、Ｒ３プライマー）を組み合わせてプライマーセットとして使用する。さらに、１種以上のループプライマーを組み合わせて、プライマーセットとして使用することもできる。
【００２９】
（ＲＴ−ＬＡＭＰ法）
ＲＴ−ＬＡＭＰ法は、ＲＮＡを鋳型とするＬＡＭＰ法であり、ＬＡＭＰ法の基本的な考え方は特許文献１に記載の通りである。ＲＴ−ＬＡＭＰ法では一つの溶液中で、鋳型ＲＮＡからｃＤＮＡを合成しながら、ＬＡＭＰ法の起点構造が合成される。具体的には次の１）のステップを経た後、２）〜５）ステップの繰り返しにより、ＤＮＡの伸長が繰り返され、標的ＤＮＡの増幅が行われる。
【００３０】
１）鋳型ＲＮＡ鎖にＦＩＰが結合し、鋳型ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長する。この反応は逆転写酵素、例えばＡＭＶ由来の逆転写酵素等を用いる。
２）上記１）で合成したＦＩＰからのＤＮＡ鎖を、Ｆ３プライマーが鋳型ＲＮＡから剥がしながら、鋳型ＲＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長する。以降ＤＮＡ鎖の伸長はＤＮＡポリメラーゼによる。
３）上記２）で剥がされたＤＮＡ鎖に、ＲＩＰが結合してＤＮＡ鎖が伸長する。４）上記３）で伸長したＲＩＰからのＤＮＡ鎖をＲ３プライマーが剥がしながら、ＦＩＰからのＤＮＡ鎖に相補的なＤＮＡ鎖が伸長し、ＬＡＭＰ法の起点構造が合成される。
５）上記４）で剥がされたＤＮＡ鎖の両端の配列は、同じＤＮＡ鎖の配列中に相補的な配列を有するので、各々ハイブリダイズし、両端にループ構造を持つ。
なお、例えばＢｃａＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅのように、逆転写酵素活性とＤＮＡポリメラーゼ活性の両活性を有する酵素があり、このような酵素を使用する場合は、上記の反応は１つの酵素で実施することができる。
【００３１】
（測定方法）
ＬＡＭＰ法では、合成されたＤＮＡ鎖は自己の配列に対して相補的な配列をもつので、その大部分が塩基対結合を形成している。この特徴を利用して、増幅生成物の検出が可能である。エチジウムブロマイド、ＳＹＢＥＲ ＧＲＥＥＮ Ｉ、あるいはＰｉｃｏ Ｇｒｅｅｎのような２本鎖インターカーレーターである蛍光色素の存在下で本発明のプライマーを用いて核酸増幅を実施すれば、生成物の増加に伴って蛍光強度の増大が観察される。これをモニターすれば、閉鎖系でＤＮＡの増幅と蛍光の増加が同時に追跡可能である（臨床検査法提要、３１版１３１８頁；特開２００１−２４２１６９号公報参照。以下単に「リアルタイム法」という。）。
【００３２】
（試薬、試薬キット、その他）
本発明のプライマーを用いて核酸の検出を行う際に必要な各種の試薬類は、あらかじめパッケージングしてキット化することができる。具体的には、本発明の相補鎖合成のプライマーとして、あるいは置換用のプライマーとして必要な各種のオリゴヌクレオチド、逆転写活性を有する酵素、相補鎖合成の基質となるｄＮＴＰ、鎖置換型の相補鎖合成を行うＤＮＡポリメラーゼ、酵素反応に好適な条件を与える緩衝液、さらに必要に応じて反応生成物の検出のために必要な試薬類がキットとして提供される。
【００３３】
本発明は、核酸増幅用プライマーおよびプライマーセット、ならびにこれらのプライマーを用いた核酸検出方法、核酸検出方法に使用される検出試薬、核酸検出キットならびに核酸検出システム全体に及ぶ。
【００３４】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例に限定されるものではない。
【００３５】
【実施例１】
（領域の選択）
配列番号１に記載するヒトＣＥＡの塩基配列から、プローブ設計ソフトを用いてＬＡＭＰ法に適切な領域の位置を検討した。領域の選択は、Ｆ１ｃおよびＲ１ｃはＴｍ値が５８．５〜６３．５℃、Ｆ２およびＲ２はＴｍ値が６１．５〜６２．５℃、Ｆ３およびＲ３はＴｍ値が５８．５〜６２．５℃により領域を選択した結果、次に示すものが選択された。選択された領域は、配列番号１で表される塩基配列の１９００−２２００番目およびその相補鎖の領域に含まれる。
【００３６】
Ｆ１ｃ：配列番号１で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
２０５４−２０３４番目（配列番号２）
【００３７】
Ｆ２ ：配列番号１で表される配列上の塩基位置の領域
１９５１−１９６６番目（配列番号３）
１９５２−１９６８番目（配列番号４）
１９５０−１９６６番目（配列番号５）
１９５７−１９７３番目（配列番号６）
【００３８】
Ｒ１ｃ：配列番号１で表される配列上の塩基位置の領域
２０６２−２０８４番目（配列番号７）
【００３９】
Ｒ２ ：配列番号１で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
２１３４−２１１４番目（配列番号８）
２１３３−２１１４番目（配列番号９）
２１３８−２１２０番目（配列番号１０）
【００４０】
Ｆ３ ：配列番号１で表される配列上の塩基位置の領域
１９０６−１９２２番目（配列番号１１）
【００４１】
Ｒ３ ：配列番号１で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
２１８９−２１７２番目（配列番号１２）
【００４２】
ｌｏｏｐ Ｆ：配列番号１で表される配列上の塩基位置に対する相補鎖の領域
１９９７−１９７８番目（配列番号１３）
１９９４−１９７５番目（配列番号１４）
１９９６−１９７８番目（配列番号１５）
１９９５−１９７６番目（配列番号１６）
【００４３】
ｌｏｏｐ Ｒ：配列番号１で表される配列上の塩基位置の領域
２０８６−２１０９番目（配列番号１７）
【００４４】
（プライマーの設計）
選択された領域の配列から、ＬＡＭＰ法に適用される次の核酸増幅用プライマーが得られた。
【００４５】
ＦＩＰ：領域Ｆ１ｃおよびＦ２を連結した塩基配列からなるプライマー
ＡＦＡ Ｉ ：（配列番号１８）配列番号２および３で表される配列を連結
ＡＦＡ ＩＩ ：（配列番号１９）配列番号２および４で表される配列を連結
ＡＦＡ ＩＩＩ：（配列番号２０）配列番号２および５で表される配列を連結
ＡＦＡ Ｖ ：（配列番号２１）配列番号２および６で表される配列を連結
【００４６】
ＲＩＰ：領域Ｒ１ｃおよびＲ２を連結した塩基配列からなるプライマー
ＡＲＡ Ｉ ：（配列番号２２）配列番号７および８で表される配列を連結
ＡＲＡ ＩＩ ：（配列番号２３）配列番号７および９で表される配列を連結
ＡＲＡ Ｖ ：（配列番号２４）配列番号７および１０で表される配列を連結
【００４７】
Ｆ３プライマー：各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー
ＡＦ３ ：（配列番号１１）
【００４８】
Ｒ３プライマー：各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー
ＡＲ３ ：（配列番号１２）
【００４９】
ループプライマーＦ：各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー
ＬＰＦ ：（配列番号１３）
ＬＰＦ ＩＩ ：（配列番号１４）
ＬＰＦ ＩＩＩ：（配列番号１５）
ＬＰＦ ＩＶ ：（配列番号１６）
▲６▼ループプライマーＲ：各配列番号で表される塩基配列からなるプライマー
ＬＰＲ ：（配列番号１７）
【００５０】
【実験例１】
上記各種プライマーを次の組み合わせでＲＴ−ＬＡＭＰ法で測定した場合の、反応を開始してから増幅が確認できるまでに要する時間を各プライマーセットについて調べることを目的として実験を行った。
【００５１】
１）ヒトＣＥＡＲＮＡ試料の調製方法
ヒトＣＥＡの塩基配列を基に設計したプライマーを用いてＲＴ−ＰＣＲを行うことにより、ＬＳ１８０（大腸癌細胞）由来トータルＲＮＡから、ヒトＣＥＡｃＤＮＡを単離した。ｐＧＥＭ−３Ｚ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製プラスミド）にクローニングしたヒトＣＥＡｃＤＮＡから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写システム（Ｒｉｂｏｐｒｏｂｅ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社製））を用いて転写産物を合成した。得られた原液のＲＮＡ濃度を２６０ｎｍでの吸光度測定により算出し、その値をもとにヒトＣＥＡのＲＮＡコピー数が６０，０００、６，０００、６００、６０、６および０（対照）となるように５０ ｎｇ／ｍＬ
ｙｅａｓｔ ＲＮＡ（Ａｍｉｂｏｎ社製）で希釈調製し、鋳型とした。
【００５２】
２）プライマーセット
各種プライマーを（表１）の組み合わせで用いた。表中の番号は、配列番号を示し、各配列番号で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるプライマーをセットで使用したことを示す。
【００５３】
【表１】
４）ＲＴ−ＬＡＭＰ法
上記６種のプライマーを含む反応液２３μｌに、ヒトＣＥＡのＲＮＡ試料を２μｌとなるよう添加し、６５℃で１時間加温して行った。
【００５６】
５）増幅の確認
増幅産物は２本鎖構造をもつので、エチジウムブロマイドがインターカレートして蛍光を発する。その蛍光強度の増加をＡＢＩ社製ＰＲＩＳＭ７７００を用いてリアルタイム法により測定した。
【００５７】
６）結果
２２〜２４の各プライマーセットを用いた場合の結果を各々図１〜３に示した。その結果、各々についてＣＥＡの鋳型の量が多い場合のほうが、増幅が確認できるまでに要する時間は短かかった。プライマーセット１〜３では、６０コピーの場合でも２０分以内に増幅が確認され、６，０００コピーの場合に約１０分で増幅が確認された。
【００５８】
【発明の効果】
以上説明したように本発明のプライマーまたはプライマーセットを用いてＬＡＭＰ法を行うと、効果的にヒトＣＥＡを特異的に増幅することがわかった。このことから、本発明のプライマーを用いると、２０分以内にヒトＣＥＡを検出することが可能となり、核酸増幅手段を用いたリンパ節への癌転移診断に要する時間の短縮化が可能となった。
【図面の簡単な説明】
【図１】プライマーセット２２を用いたときの感度を示す図である。（実験例１）
【図２】プライマーセット２３を用いたときの感度を示す図である。（実験例１）
【図３】プライマーセット２４を用いたときの感度を示す図である。（実験例１）
【符号の説明】
○ ヒトＣＥＡのＲＮＡの鋳型コピー数 ０ の場合
△ ヒトＣＥＡのＲＮＡの鋳型コピー数 ６０ の場合
× ヒトＣＥＡのＲＮＡの鋳型コピー数 ６００ の場合
◆ ヒトＣＥＡのＲＮＡの鋳型コピー数 ６，０００ の場合
● ヒトＣＥＡのＲＮＡの鋳型コピー数 ６０，０００ の場合
【配列表】
Claims (18)
- 以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む癌胎児性抗原（Ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ：ＣＥＡ）検出のための核酸増幅用プライマー；
１）配列番号１で表される塩基配列の１９００から２２００番目およびその相補鎖の領域から選択され、配列番号１および／またはその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜２４のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。 - 配列番号１１〜２４で表される塩基配列のいずれかより選択されるオリゴヌクレオチドからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマー。
- 核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求項１または２に記載の核酸増幅用プライマー。
- 以下の群より選択される配列からなるオリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも２種を選択することを特徴とするＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１で表される塩基配列の１９００から２２００番目およびその相補鎖の領域から選択され、配列番号１および／またはその相補鎖の連続する塩基を少なくとも５以上含むオリゴヌクレオチド。
２）配列番号２〜２４のいずれかで表される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド。
３）前記１）または２）に記載のオリゴヌクレオチドの相補鎖。
４）前記１）〜３）のいずれか１に記載のオリゴヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズしうるオリゴヌクレオチド。
５）前記１）〜４）に記載のオリゴヌクレオチドのうち、１ないし数個の塩基が置換、欠失、挿入もしくは付加といった変異された塩基配列を含み、プライマー機能を有するオリゴヌクレオチド。 - 核酸増幅の手段がＬＡＭＰ法である請求項４に記載の核酸増幅用プライマーセット。
- オリゴヌクレオチドを含む核酸増幅用プライマーから少なくとも４種を選択することを特徴とするＣＥＡ検出のための請求項５に記載のプライマーセット。
- 前記プライマーセットに含まれるプライマーのうち少なくとも２種が、配列番号１で表される塩基配列および／またはその相補鎖の各々２箇所の領域を認識することを特徴とする請求項４から６のいずれか１に記載のプライマーセット。
- 前記プライマーセットに含まれるプライマーが、配列番号１で表される塩基配列および／またはその相補鎖の少なくとも６箇所の領域を認識することを特徴とする請求項５から７のいずれか１に記載のプライマーセット。
- 配列番号１８〜２４で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーであって、 （ａ）配列番号１８〜２０および（ｂ）配列番号２２〜２４に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組み合わせを含むことを特徴とするプライマーセット。
- 請求項９のプライマーセットに配列番号１１および１２で表される配列のプライマーを選択した組み合わせのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット。
- 請求項９または１０のプライマーセットに、配列番号１３〜１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーであって、 （ｅ）配列番号１３〜１６および（ｆ）配列番号１７に分類した場合の、各分類から１のプライマーを選択した組み合わせのプライマーをさらに含むことを特徴とするプライマーセット。
- 次に示す１）〜１１）のいずれかからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１８、２２、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号１８、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号１８、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号１９、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号１９、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号２０、２２、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号２０、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号２０、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
９）配列番号２１、２２、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１０）配列番号２１、２３、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１１）配列番号２１、２４、１１および１２で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。 - 次に示す１）〜２４）のいずれかからなるＣＥＡ検出のための核酸増幅用プライマーセット；
１）配列番号１８、２２、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２）配列番号１８、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
３）配列番号１８、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
４）配列番号１８、２４、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
５）配列番号１８、２４、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
６）配列番号１９、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
７）配列番号１９、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
８）配列番号２０、２２、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
９）配列番号２０、２２、１１、１２、１４および１７ で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１０）配列番号２０、２２、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１１）配列番号２０、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１２）配列番号２０、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１３）配列番号２０、２４、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１４）配列番号２０、２４、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１５）配列番号２０、２４、１１、１２、１６および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１６）配列番号２１、２２、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１７）配列番号２１、２３、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１８）配列番号２１、２３、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
１９）配列番号２１、２３、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２０）配列番号２１、２３、１１、１２、１６および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２１）配列番号２１、２４、１１、１２、１６および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２２）配列番号２１、２４、１１、１２、１３および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２３）配列番号２１、２４、１１、１２、１４および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。
２４）配列番号２１、２４、１１、１２、１５および１７で表される塩基配列のオリゴヌクレオチドをプライマーとして含むプライマーセット。 - 請求項１若しくは２に記載のプライマーから必要なプライマーを選択し、または請求項３〜１３いずれか１に記載のプライマーセットを選択して使用することによる核酸検出方法。
- 核酸検出方法がＬＡＭＰ法である請求項１４に記載の核酸検出方法。
- 請求項１４または１５記載の核酸検出方法に使用する試薬。
- 請求項１４または１５に記載の核酸検出方法に使用する試薬キット。
- 請求項１４または１５に記載の核酸検出方法を用いた核酸検出システム。
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