ES2367108T3 - Cebadores de amplificación de ácidos nucléicos para detectar citoqueratinas y método de examen con uso de los cebadores. - Google Patents

Abstract

Un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos para detectar citoqueratina 19 humana por el método LAMP que comprende al menos cuatro tipos de cebadores, en el que dicho conjunto de cebadores comprende un oligonucleótido de acuerdo con la SEC ID Nº: 419, o una cadena complementaria de la SEC ID Nº: 419; o un cebador capaz de hibridar con el cebador de acuerdo con la SEC ID Nº: 419 o el complemento del mismo en condiciones rigurosas.

Description

Campo técnico

La presente invención se refiere a un conjunto de cebadores de amplificación de ácidos nucleicos para la detección de la citoqueratina 19 humana por el método LAMP.

Técnica antecedente
Las citoqueratinas (denominadas en lo sucesivo “CK”) son proteínas que forman el esqueleto fibroso de una célula y forman una familia de al menos 20 genes. Como dichas citoqueratinas se conocen la CK18 humana, CK19 humana, CK20 humana y similares. Las CK se expresan en células epiteliales.
Por ejemplo, ciertos informes previos describieron que la CK18 humana se expresa no solo en tejidos normales tales como glándula mamaria, pulmón, intestino delgado y estómago, sino también en tejidos cancerosos, mientras que la CK18 humana no se expresa en ganglios linfáticos que no son tejidos epiteliales. En cuanto a la CK19 humana, ciertos informes previos describieron que se expresa en cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de mama, cáncer pancreático, cáncer de próstata y similares, y se observó una diferencia en el nivel de expresión de la CK19 humana entre tejidos normales y tejidos cancerosos. En cuanto a la CK20 humana, diversos informes describieron que se expresa en cáncer de colon, cáncer de estómago, cáncer de células Merkel, cáncer mucoso ginecológico, cáncer de células de transición, cáncer pancreático y cáncer de conductos biliares, y también en este caso se observa una diferencia en el nivel de expresión de CK20 humana entre tejidos normales y tejidos cancerosos.
En relación con los hechos anteriores, es posible conocer la presencia/ausencia de metástasis de cáncer mediante el examen de la presencia/ausencia de expresión de CK18 humana, CK19 humana y/o CK20 humana en tejidos tales como ganglios linfáticos. También es posible conocer la presencia/ausencia de metástasis de cáncer buscando los que presentan diferencias en el nivel de expresión entre tejidos normales y tejidos cancerosos.
Una célula cancerosa que deja el sitio primario de la lesión mestastizará en el cuerpo a través del torrente sanguíneo y el sistema linfático. En una operación quirúrgica de cáncer, se necesita una detección precisa de la metástasis y un tratamiento apropiado basado en el grado de metástasis para eliminar las lesiones de una forma tan fiable como sea posible. Por esta razón, tiene una gran importancia el diagnóstico intraoperatorio de metástasis de cáncer en ganglios linfáticos. Por ejemplo, en el caso del cáncer de mama, la zona a eliminar se está volviendo más pequeña para mejorar la CDV, y el diagnóstico de metástasis en ganglios linfáticos durante la cirugía puede ser una pauta importante para determinar el mínimo de disección de ganglios linfáticos. En caso de cáncer esofágico, la detección de un sitio en el que se produce metástasis de ganglios linfáticos puede proporcionar directrices para la selección y determinación de procedimientos operatorios incluyendo ventrotomía, toracotomía e incisión en collar. En caso de cáncer de próstata, la presencia de metástasis en ganglios linfáticos proporcionará directrices para decidir aplicar una terapia hormonal mientras se detiene la prostatectomía. También en caso de cáncer de estómago, dará directrices para seleccionar un procedimiento operatorio y una estrategia terapéutica después de la cirugía. Teniendo en cuenta la carga sobre el paciente, debe realizarse rápidamente el diagnóstico intraoperatorio de metástasis de cáncer.
Un procedimiento para diagnosticar metástasis de cáncer en ganglios linfáticos es detectar proteínas CK que son marcadores tumorales. Por ejemplo, esto se consigue congelando un ganglio linfático reseccionado y tiñendo una sección del tejido congelado. Sin embargo, este procedimiento va acompañado del riesgo de que se pasen por alto micrometástasis porque solo se basa en la información sobre la sección.
Un desarrollo reciente en técnicas de análisis de genes ha permitido diagnósticos eficaces de cáncer mediante la detección de la expresión de genes de marcadores tumorales. Por ejemplo, la técnica PCR permite amplificar un fragmento de ADN diana varios cientos de veces por repetición de la disociación de cadenas de ADN en un ADN monocatenario, unión de cebadores que intercalan una región específica en la cadena de ADN y síntesis de ADN por la ADN polimerasa (véase el documento JP-A 61-274697), y puede usarse como técnica de análisis muy sensible para ácidos nucleicos en diversos tipos de muestras. Por ejemplo, como la técnica PCR puede analizar ácidos nucleicos en muestras obtenidas a partir de fluidos o tejidos del cuerpo de un animal, es útil para el diagnóstico de enfermedades infecciosas, enfermedades genéticas, cánceres y similares.
Para la detección del ARN, puede usarse la técnica RT-PCR. La técnica RT-PCR implica extraer ARN, por ejemplo, a partir de tejidos tumorales; sintetizar ADNc con la ayuda de la transcriptasa inversa (RT) usando oligo (dT) o un hexámero aleatorio como cebador; y amplificar el ADNc usando la técnica PCR para la detección. Se ha notificado el caso ejemplar del diagnóstico de tumor de fibroblastos usando la técnica RT-PCR (Hokkaido Igaku Zasshi p.135141, Vol.66 (2), (1991)). La RT-PCR hace posible detectar la expresión de ARNm de CK a partir de tejidos extirpados, de forma que puede evitarse el problema, en alguna medida, de que se pasen por alto metástasis de cáncer. En el campo de diagnóstico de tumores o cánceres, se han puesto en uso práctico dichos métodos de amplificación de ácidos nucleicos ("Kanai's manual of clinical laboratory medicine", 31ª ed., págs. 1314, KANEHARA&Co., LTD., publicado el 20 de septiembre de 1998).
Sin embargo, la técnica PCR necesita una operación para desnaturalizar un ADN molde a partir de un ADN bicatenario en una sola cadena, y además requiere reacciones de amplificación repetitivas en varias condiciones de temperatura. Además, en general, se tardan aproximadamente dos horas en obtener un producto amplificado detectable, de forma que no era deseable como ensayo intraoperatorio que requiere rapidez.
Como método de amplificación de ADN distinto de la técnica PCR, se ha presentado el método LAMP (véase la Publicación Internacional WO 00/28082). El método LAMP es un método de amplificación génica que usa una pluralidad de cebadores incluyendo un cebador que forma una estructura de horquilla en un extremo del producto amplificado según avanza la reacción de desplazamiento de cadena. En una reacción inicial, usando dos tipos de cebadores internos (FIP, RIP) y dos tipos de cebadores externos (cebador F3, cebador R3) y una ADN polimerasa de desplazamiento de cadena, se sintetiza una estructura de tipo pesa que tiene un bucle monocatenario en cada extremo a partir de un ADN molde. Partiendo de esta estructura, se realiza el ciclo de amplificación de forma que la extensión y síntesis del ADN continúan en el propio ADN como molde, desde el extremo 3’ de esta estructura. El producto amplificado comprende una estructura repetida de múltiples unidades, y cada unidad comprende un conjunto de regiones complementarias en la misma cadena que forman una región a amplificar intercalada entre los cebadores donde dos ácidos nucleicos tienen secuencias de bases invertidas. El método LAMP no requiere la operación de desnaturalización de un ADN molde desde una doble cadena a una sola cadena por calentamiento, y se caracteriza por un proceso de amplificación continuo a una temperatura constante (véase Bio Venture, Vol. 1, p. 109-115 (2001) y BIO INDUSTRY, Vol.18, No.2, p.15-29 (2001)). Cuando el molde es ARN, es posible sintetizar la estructura de partida de una manera similar añadiendo una transcriptasa inversa a la composición de la mezcla de reacción, con lo que puede realizarse la amplificación (método RT-LAMP). De acuerdo con el método LAMP, puede obtenerse una cantidad suficiente de producto amplificado para la detección en aproximadamente 30 minutos. Por lo tanto, el tiempo necesario para la detección se reduce, de manera que puede aplicarse para el diagnóstico de metástasis de cáncer en ganglios linfáticos con el objetivo, por ejemplo, de una determinación rápida de la estrategia terapéutica. Además, como puede conseguirse un resultado rápidamente, también es de esperar la aplicación al diagnóstico intraoperatorio.
El concepto básico de cebadores aplicados al método LAMP puede encontrarse en la Publicación Internacional nº WO 00/28082 y en la Publicación Internacional nº WO 02/24902.
Ya se han presentado cebadores y sondas a usar en PCR para la detección de CK18 humana (véase Gene, 159(1),
p. 43-47 (1995)). De forma similar, también se han presentado cebadores o sondas a usar en PCR para la detección de CK19 humana (véase el documento USP Nº 6.203.992 y Breast Cancer Research and Treatment 60, p. 143-151 (2000)). También se han presentado cebadores o sondas a usar en PCR para la detección de CK20 humana (véase British J. of Cancer, 77(8), p. 1327-1332(1998) y British J. of Cancer, 82(1), p157-160 (2000)).
El documento WO 96/17080 describe un método para determinar si un paciente humano tiene un tumor o si el tumor ha mestastatizado, que comprende determinar si está presente un producto génico de citoqueratina 20 en una muestra de tejido. El documento también analiza la posibilidad de determinar el ARNm de citoqueratina 20 por RTPCR.
El documento US 6.057.105 describe métodos para detectar metástasis de melanoma y células de cáncer de mama mediante la detección de ácidos nucleicos de genes marcadores. Se menciona CK20 en el contexto de un método para detectar células de cáncer de mama metastásico en un paciente. El documento presenta datos sobre RT-PCR de genes específicos tales como Mart1, Mage3 y tirosinasa en muestras de pacientes.
El documento WO 01/39784 describe cebadores de RT-PCR para la queratina 19 de rata.
El campo técnico de ese documento está relacionado con células madre pancreáticas y su uso en transplantes.
El documento WO 01/98539 presenta métodos para el diagnóstico e identificación de cáncer de pulmón que pueden incluir la identificación de la citoqueratina 19. El documento también hace referencia a la detección por RT-PCR de CK19.
El documento WO 01/29264 presenta un método de amplificación de una secuencia diana de CK19 por PCR. Los documentos notifican que pueden emplearse cebadores y sondas en métodos basados en la amplificación para detectar la presencia de secuencias de CK19 en una muestra de ensayo.
Sin embargo, nadie ha presentado cebadores para aplicar al método LAMP destinado a la detección de CK humanas, y existe la necesidad de desarrollar dichos cebadores. Además, en cuanto a la aplicación de los cebadores a otros medios de amplificación de ácidos nucleicos, existe la necesidad de construir un nuevo cebador o un conjunto de cebadores que sea útil para la detección además de los cebadores conocidos.
(Documento de la técnica convencional)
Documento de Patente 1: Publicación Internacional Nº W0 00/28082 Documento de Patente 2: Publicación Internacional Nº W0 02/2490 Documento de Patente 3: USP Nº 6.203.992 Documento no relacionado con patente 1: Bio Venture, Vol. 1, p. 109-115 (2001) Documento no relacionado con patente 2: BIO INDUSTRY, Vol.18, No. 2, p.15-29 (2001) Documento no relacionado con patente 3: Gene, 159(1), p.43-47(1995) Documento no relacionado con patente 4: Breast Cancer Research and Treatment 60, p.143-151 (2000) Documento no relacionado con patente 5: British J. of Cancer, 77(8), p.1327-1332(1998) Documento no relacionado con patente 6: British J. of Cancer, 82(1), p157-160 (2000)
Descripción de la invención
(Problemas a solucionar por la invención)
Es un objeto de la presente invención proporcionar nuevos cebadores para uso en una reacción de amplificación de ácidos nucleicos para detectar CK humanas. Más específicamente, la presente invención se refiere a la disposición de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos de acuerdo con el método LAMP.
(Medios para solucionar los problemas)
Los inventores han investigado diligentemente para solucionar los problemas anteriores, y finalmente construyeron cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos que pueden aplicarse eficazmente al método LAMP y usarse para detectar CK19 humana.
Es decir, la presente invención incluye:

1.

Un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos para detectar citoqueratina 19 humana por el método LAMP, que comprende al menos cuatro tipos de cebadores, donde dicho primer conjunto comprende un oligonucleótido de acuerdo con la SEC ID Nº: 419 o una cadena complementaria de la SEC ID Nº: 419; o un cebador capaz de hibridar con el cebador de acuerdo con la SEC ID Nº: 419 o el complemento del mismo en condiciones rigurosas.

2.

Un método para detectar citoqueratina 19 humana por el método LAMP usando el conjunto de cebadores de acuerdo con el punto 1.

3.

Uso del conjunto de cebadores de acuerdo con el punto 1 para la detección de un ácido nucleico de citoqueratina 19 en una muestra usando el método LAMP

Breve descripción de los dibujos
La FIG. 1 es una vista que muestra los resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores I de CK18 humana (Ejemplo de ensayo 1-1); La FIG. 2 es una vista que muestra los resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores II de CK18 humana (Ejemplo de ensayo 1-1); La FIG. 3 es una vista que muestra los resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores III de CK18 humana (Ejemplo de ensayo 1-1); La FIG. 4 es una vista que muestra los resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores IV de CK18 humana (Ejemplo de ensayo 1-1); La FIG. 5 es una vista que muestra los resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores I (con cebadores de bucle) de CK18 humana (Ejemplo de ensayo 1-2); La FIG. 6 es una vista que muestra los resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores I (sin cebadores de bucle) de CK18 humana (Ejemplo de ensayo 1-2); La FIG. 7 muestra la especificidad de amplificación cuando el LAMP se realiza usando el conjunto de cebadores I de CK18 humana (Ejemplo de ensayo 1-3); La FIG. 8 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores A (sin cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-1); La FIG. 9 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores A (sin cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-1); La FIG. 10 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores A (con cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-1); La FIG. 11 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores A (con cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-1); La FIG. 12 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores A (con cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-1);
La FIG. 13 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores C (sin cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-2); La FIG. 14 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores C (con cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-2); La FIG. 15 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores C (con cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-2); La FIG. 16 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores C (con cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-2); La FIG. 17 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores C (con cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-2); La FIG. 18 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores C (con cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-2); La FIG. 19 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores C (con cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-2); La FIG. 20 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores D (sin cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-3); La FIG. 21 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores D (con cebadores de bucle) de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-3); La FIG. 22 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores A de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-4); La FIG. 23 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores B de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-4); La FIG. 24 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores C de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-4); La FIG. 25 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores D de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-4); La FIG. 26 muestra la especificidad de amplificación cuando el LAMP se realiza usando el conjunto de cebadores A de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-5); La FIG. 27 muestra la especificidad de amplificación cuando el LAMP se realiza usando el conjunto de cebadores B de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-5); La FIG. 28 muestra la especificidad de amplificación cuando el LAMP se realiza usando el conjunto de cebadores C de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-5); La FIG. 29 muestra la especificidad de amplificación cuando el LAMP se realiza usando el conjunto de cebadores D de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-5); La FIG. 30 es una vista que muestra los resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores C de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-6); La FIG. 31 es una vista que muestra los resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores C de CK19 humana (Ejemplo de ensayo 2-7); La FIG. 32 es una vista que muestra los resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores 1 de CK20 humana (Ejemplo de ensayo 3-2); La FIG. 33 muestra la especificidad de amplificación cuando el LAMP se realiza usando el conjunto de cebadores 1 de CK20 humana (Ejemplo de ensayo 3-3); La FIG. 34 es una vista que muestra resultados de LAMP realizado usando el conjunto de cebadores 3 de CK20 humana (Ejemplo de ensayo 3-4); La FIG. 35 muestra la especificidad de amplificación cuando el LAMP se realiza usando el conjunto de cebadores 3 de CK20 humana (Ejemplo de ensayo 3-5);
Mejor Modo para Realizar la Invención
(Diseño del cebador)
La presente invención proporciona un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos aplicable al método LAMP para amplificar ácidos nucleicos de CK humanas. Por ejemplo, el cebador puede diseñarse seleccionando un oligonucleótido apropiado que comprenda al menos 5 o más bases sucesivas en secuencias de bases de CK conocidas representadas, por ejemplo, por las SEC ID Nº: 1, 342, 435 y/o secuencias complementarias de las mismas.
El concepto básico de los cebadores usados en el método LAMP es como se describe en el documento de Patente
1. Concretamente, se definen tres regiones F3c, F2c, F1c en este orden desde el extremo 3' y tres regiones R3, R2, R1 en este orden desde el extremo 5’ de un ADN diana a amplificar, y se diseñan al menos cuatro cebadores seleccionado cadenas oligonucleotídicas que comprenden secuencias de bases que son sustancialmente idénticas y/o sustancialmente complementarias a las de al menos las seis regiones anteriores.
La expresión “secuencias de bases sustancialmente idénticas” se define como se indica a continuación. Cuando una cadena complementaria que se ha sintetizado a partir de un molde que tiene una cierta secuencia de bases hibrida con una secuencia de bases diana y proporciona un punto de partida de síntesis de una cadena complementaria, se dice que la secuencia de bases es sustancialmente idéntica a la secuencia de bases diana. Por ejemplo, la expresión “secuencia de bases sustancialmente idéntica a F2” incluye no sólo la secuencia de bases que es perfectamente idéntica a F2, sino también las secuencias de bases que sirven como moldes que hibridan con F2 y proporcionan una secuencia de bases que sirve como punto de partida para la síntesis de una cadena complementaria.
Los términos “idéntico” y “complementario” usados en el presente documento para caracterizar una secuencia de bases que constituye un oligonucleótido de acuerdo con la presente invención, no significa necesariamente “perfectamente idéntico” o “perfectamente complementario”. En otras palabras, cuando se hace referencia a “idéntico a una cierta secuencia”, también se incluyen secuencias que son complementarias a las que son capaces de hibridar con la mencionada secuencia. Por otra parte, el término “complementario” significa una secuencia que es capaz de hibridar en condiciones rigurosas y que proporciona un extremo 3’ que sirve como punto de partida para la síntesis de una cadena complementaria.
Los cebadores de la presente invención tienen una longitud de cadena tal que permite la unión mediante la formación de pares de bases con una cadena complementaria mientras que se mantiene la especificidad necesaria en un entorno dado en una diversidad de reacciones de síntesis de ácidos nucleicos como se describirá más adelante. Concretamente, tienen una longitud de 5 a 200 bases, más preferiblemente de 10 a 50 bases. Como la longitud de la cadena de un cebador que puede reconocerse por una reacción de síntesis de ácidos nucleicos dependiente de secuencia con catálisis por polimerasa conocida es de al menos aproximadamente 5 bases, la longitud de la parte de hibridación debe ser mayor que ésta. Además, desde el punto de vista de mantener la especificidad de una secuencia de bases particular, la secuencia de bases preferiblemente tiene una longitud no menor de 10 bases. Las secuencias de bases demasiado largas son difíciles de preparar por síntesis química, de forma que las longitudes de cadena mencionadas anteriormente se ejemplifican como un intervalo preferido.
El término “molde” usado en el presente documento significa un ácido nucleico que sirve como molde para la síntesis de una cadena complementaria. Una cadena complementaria cuya secuencia de bases es complementaria a un molde también se interpreta como una cadena capaz de hibridar con un molde, sin embargo, la relación entre molde y cadena complementaria es relativa. En otras palabras, una cadena complementaria puede convertirse en un molde.
En la presente invención, los cebadores seleccionados a partir de una secuencia de bases de un ADN diana constituyen, cada uno, el cebador FIP (cebador interno directo), el cebador F3 (cebador externo directo), el cebador RIP (cebador interno inverso) y el cebador R3 (cebador externo inverso).
FIP se diseña para tener una secuencia de bases de la región F2 que es sustancialmente complementaria a la región F2c de un ADN diana en su extremo 3’, y una secuencia de bases que es sustancialmente idéntica a la región F1c del ADN diana en su extremo 5’. En este caso, una secuencia que no depende del ADN diana puede existir entre las secuencias de F2 y F1c. La secuencia que no depende del ADN diana puede tener una longitud de 0 a 50 bases, preferiblemente de 0 a 40 bases.
El cebador F3 está diseñado para tener una secuencia de bases sustancialmente idéntica a la región F3 que es sustancialmente complementaria a la región de F3c de un ADN diana.
RIP está diseñado para tener una secuencia de bases de la región de R2 que es sustancialmente complementaria a la región R2c de un ADN diana en su extremo 3’, y una secuencia de bases que es sustancialmente idéntica a la región R1c del ADN diana en su extremo 5’. De forma similar, puede estar presente FIP, una secuencia que no depende del ADN diana, entre las secuencias de R2 y R1c en RIP.
El cebador R3 está diseñado para tener una secuencia de bases sustancialmente idéntica a la región R3 que es sustancialmente complementaria a la región R3c de un ADN diana.
En el método LAMP, además usando al menos un tipo de cebador de bucle, es posible reducir el tiempo para la amplificación (véase la Publicación Internacional Nº WO 02/24902). La expresión “cebador de bucle” se refiere a un cebador que tiene una secuencia complementaria en una parte monocatenaria del bucle de extremo 5’ de la estructura de pesa, más concretamente, entre la región R1 y la región R2 o entre la región F1 y la región F2, por ejemplo. El uso de un cebador de bucle hace que sea posible aumentar los puntos de partida de la síntesis de ADN. Este cebador de bucle está diseñado para permitir la hibridación en una región de bucle en la que FIP o RIP que se generan en el transcurso de la síntesis de ADN no hibridarán.
(Diseño de cebador para detectar CK19 humana)
Prestando atención a la composición de bases, el contenido de GC, la estructura secundaria, el valor de Tm y similares, se selecciona la región de un cebador para detectar CK19 humana de forma que la secuencia de bases que reconozca una región de ADN tenga una longitud de al menos 5 bases, preferiblemente de 10 a 30 bases, y más preferiblemente de 17 a 25 bases. El valor de Tm puede determinarse generalmente por el método del vecino más próximo. La región de ADN puede seleccionarse de manera que el valor de Tm sea de 55 a 65ºC, preferiblemente de 58 a 64ºC, y el contenido de GC sea del 40 al 70%, preferiblemente del 50 al 65%.
Los oligonucleótidos pueden producirse por un método bien conocido, por ejemplo por síntesis química. Como alternativa, el ácido nucleico natural puede digerirse con una enzima de restricción o similar, seguido de modificación
o acoplamiento, formando de esta manera la secuencia de bases descrita anteriormente. Concretamente, pueden sintetizarse usando un sintetizador de oligonucleótidos (sintetizador de ADN Expedite modelo 8909, fabricado por Applied Biosystems) o similar. También pueden sintetizarse oligonucleótidos en los que una o varias bases se han reemplazado, insertado, añadido o mutado de otra manera por un proceso bien conocido. Por ejemplo, la síntesis de dicho oligonucleótido puede conseguirse usando mutagénesis dirigida, recombinación homóloga de genes, extensión de cebadores o técnicas de PCR de forma individual o en combinaciones apropiadas, de acuerdo con el método descrito, por ejemplo, en Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª edición, 1989) editado por Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor NY; Labomanual Genetic Engineering editado por Masaki Muramatsu, Maruzen, 1988; y tecnología de PCR -Principal and application of DNA amplification editado por EhrlichmHE., Stockton Press, 1989, o métodos modificados de los anteriores usando, por ejemplo, la técnica de Ulmer (Science (1983) 219:666).
Como condiciones de hibridación rigurosas pueden seleccionarse condiciones conocidas generalmente. Una condición ejemplar incluye: hibridación durante una noche a 42ºC en una solución que contiene formamida al 50%, SSC 5X (NaCl 150 mM, citrato trisódico 150 mM), fosfato sódico 50 mM, pH 7,6, solución de Denhart 5x, sulfato de dextrano al 10% y 20 µg/ml de ADN; lavado primario en SSC 2X-SDS al 0,1% a temperatura ambiente; y lavado secundario en SSC 0,1X-SDS al 0,1% a 65ºC.
En este caso, como el molde de ácido nucleico a amplificar es ARNm de CK19 humana, los cebadores a usar deben diseñarse de tal forma que no amplifiquen el ADN genómico contenido en la muestra de ensayo. Concretamente, al menos uno de los cebadores incluidos en un conjunto de cebadores de la presente invención preferiblemente incluye una región que abarca una pluralidad de exones del gen de CK19 humana. Dicha medida hace que sea posible amplificar selectivamente secuencias a partir de ARNm de CK19 humana mientras que se excluye la amplificación de secuencias de ADN genómico.
Un conjunto para detectar CK19 humana se diseña seleccionando un oligonucleótido apropiado que comprende al menos 5 o más bases sucesivas de una secuencia de bases conocida de 1360 bases representada por la SEC ID Nº: 342 y/o una secuencia complementaria de la misma. La secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342 está basada en el número de acceso del Genbank 4504916.
Además, también se diseña un cebador para detectar CK19 humana por la selección de una región de acuerdo con el principio del cebador mencionado anteriormente.
La región del cebador para detectar CK19 humana se incluye en una región de posiciones de bases 270-930 de la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342 y/o una región de cadena complementaria de la misma, y preferiblemente en una región de posiciones de bases 270-560, 370-585, 625-854 o 655-930 y/o una región de una cadena complementaria de la misma.
Un cebador para detectar CK19 humana se diseña por selección entre los siguientes grupos 1) a 5); 1) un oligonucleótido incluido en una región de posiciones de bases 270-930 en una secuencia de bases de la SEC ID Nº: 342 y una región de cadena complementaria de la misma, preferiblemente incluido en una región de posiciones de bases 270-560, 370-585, 625-854 o 655-930 y/o una región de cadena complementaria de la misma, que contiene al menos 5 bases; 2) un oligonucleótido que tiene una secuencia de bases representada por una cualquiera de las SEC ID Nº: 343 a 382; 3) una cadena complementaria del oligonucleótido de acuerdo con los puntos 1) o 2) anteriores; 4) un oligonucleótido capaz de hibridar con el oligonucleótido de acuerdo con uno cualquiera de los puntos 1) a 3) anteriores en condiciones rigurosas, y 5) un oligonucleótido que comprende una secuencia de bases que puede obtenerse a partir de los oligonucleótidos de acuerdo con los puntos 1) a 4) en el que se han reemplazado, insertado, añadido o mutado de otra manera de una a varias bases.
(Conjunto de cebadores)
Para realizar la amplificación de un ácido nucleico usando un cebador de la presente invención, como conjunto de cebadores se usa una combinación de dos o más tipos de cebadores. En el método LAMP, se usa una combinación de al menos cuatro tipos de cebadores (FIP, cebador F3, RIP, cebador R3) como conjunto de cebadores. Además, en el conjunto de cebadores pueden combinarse uno o más tipos de cebadores de bucle.
(Método RT-LAMP)
El método RT-LAMP es un tipo de método LAMP que usa ARN como molde. El concepto básico del método LAMP es como se describe en la Publicación Internacional Nº WO 00/28082. En el método RT-LAMP, se sintetiza una estructura de punto de partida del método LAMP mientras se sintetiza ADNc a partir de un ARNm molde en la misma solución. Más específicamente, después de la siguiente etapa 1), se repiten las etapas 2) a 5) para la extensión del ADN, con lo que se consigue la amplificación del ADN diana.
1) FIP se une a una cadena de ARN molde, y se extiende una cadena de ADN complementaria a la cadena de ARN molde. Para esta reacción, se usa una transcriptasa inversa tal como la transcriptasa inversa de AMV. 2) Se extiende un ADN complementario a la cadena de ARN molde mientras que la cadena de ADN de FIP sintetizada en la etapa 1) se desprende del ADN molde por el cebador F3. La extensión de la cadena de ADN después de este momento continúa gracias a la ADN polimerasa. 3) RIP se une a la cadena de ADN desprendida en la etapa 2) y se extiende una cadena de ADN. 4) Se extiende una cadena de ADN complementaria al ADN de FIP, mientras que el cebador R3 desprende la cadena de ADN de RIP extendido en la etapa 3), con lo que se sintetiza una estructura de punto de partida del método LAMP. 5) Como los dos extremos de la cadena de ADN desprendida en la etapa 4) tienen secuencias que son complementarias entre sí en la misma cadena de ADN, estas secuencias hibridan entre sí proporcionando estructuras de bucle en los dos extremos.
También se conocen enzimas que tienen tanto actividad transcriptasa inversa como actividad ADN polimerasa, tales como la Bca ADN polimerasa. Usando dicha enzima, la reacción anterior puede realizarse con una enzima.
(Método de detección)
Una cadena de ADN sintetizada en el método LAMP tiene una secuencia que es complementaria a la secuencia propia, de forma que la mayor parte de la cadena de ADN forma uniones por pares de bases. Usando esta característica, es posible detectar un producto amplificado. Al realizar la amplificación de ácidos nucleicos usando cebadores de la presente invención en presencia de fluorocromos tales como bromuro de etidio, SYBER GREEN I y Pico Green, que son intercalantes de doble cadena, se observa un aumento en la intensidad de fluorescencia según aumenta el producto. Supervisando esto, es posible rastrear simultáneamente la amplificación del ADN y el aumento de fluorescencia en un sistema cerrado (véase Kanai's manual of clinical laboratory medicine", 31ª ed., pág. 1318; documento JP-A 2001-242169, al que se hace referencia simplemente en lo sucesivo como "método de tiempo real").
Además, en el método LAMP, se genera pirofosfato de magnesio insoluble como subproducto durante la reacción de amplificación, dando como resultado una turbidez blanca. Por lo tanto, al detectar la turbidez comprobando la turbidez de la solución reacción a simple vista o midiendo la absorbancia o la intensidad de luz dispersada de la solución de reacción, o examinando el residuo en un filtro de color después de la filtración de la solución de reacción a través del filtro, es posible determinar la presencia/ausencia del producto amplificado (véase la Publicación Internacional WO 01/83817).
(Reactivos, kit de reactivos, etc.)
Una diversidad de reactivos necesarios para detectar ácidos nucleicos usando cebadores de la presente invención pueden envasarse en un formato de kit con antelación. Concretamente, se proporcionan en forma de un kit una diversidad de oligonucleótidos necesarios como cebadores para la síntesis de cadenas complementarias o cebadores para el reemplazo de la presente invención; una enzima que tiene actividad transcriptasa inversa; dNTP que sirven como sustratos para la síntesis de cadenas complementarias; una ADN polimerasa para realizar la síntesis de desplazamiento de cadena de una cadena complementaria; un tampón para proporcionar condiciones deseadas para la reacción enzimática; agentes para retirar sustancias que inhiben la reacción de amplificación tales como inhibidor de RNasa cuando sea necesario; y reactivos adicionales necesarios para detectar el producto de reacción cuando sea necesario.
La presente invención describe un cebador y un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos; un método de detección de ácidos nucleicos usando estos cebadores; un reactivo de detección usado en el método de detección de ácidos nucleicos; un kit de detección de ácidos nucleicos; y un sistema de detección de ácidos nucleicos completo.
EJEMPLOS
A continuación la presente invención se describirá con más detalle por medio de ejemplos, sin embargo debe tenerse en cuenta que la presente invención no se limita a estos ejemplos.
(Ejemplo 1-1) (Referencia) Selección de región de secuencia de bases de CK18 humana
Se investigó la secuencia de bases de la CK18 humana representada por la SEC ID Nº: 1 con respecto a las posiciones de regiones apropiadas para el método LAMP usando un software de diseño de sondas. Como resultado de la selección de regiones de acuerdo con los criterios de Tm 58,5-63,5ºC para F1c y R1c, Tm 61,5-62,5ºC para F2 y R2, y Tm 58,5-62,5ºC para F3 y R3, se seleccionan las regiones indicadas a continuación. Las regiones
seleccionadas se incluyen en una región de posiciones de bases 340-1050 se la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 1 y una región de cadena complementaria de la misma. F1c: Región de cadena complementaria para posiciones de bases en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 1 442-420 tgaagtaatggctccagtctctg (SEC ID Nº: 2) 439-418 agtaatggctccagtctctgac (SEC ID Nº: 3) 443-421 ttgaagtaatggctccagtctct (SEC ID Nº: 4) 419-403 acctggggtcccttctt (SEC ID Nº: 5) 414-396 gggtcccttcttctccaag (SEC ID Nº: 6) 413-394 ggtcccttcttctccaagtg (SEC ID Nº: 7) 412-393 gtcccttcttctccaagtgc (SEC ID Nº: 8) 411-392 tcccttcttctccaagtgct (SEC ID Nº: 9) 410-392 cccttcttctccaagtgctc (SEC ID Nº:10) 409-390 ccttcttctccaagtgctcc (SEC ID Nº:11) 584-568 acagactggcgcatggc (SEC ID Nº:12) 620-602 tcaatgaccttgcggagcc (SEC ID Nº:13) 621-602 atcaatgaccttgcggagcc (SEC ID Nº:14) 622-603 catcaatgaccttgcggagc (SEC ID Nº:15) 623-603 tcatcaatgaccttgcggagc (SEC ID Nº:16) 666-648 agcctcgatctctgtctcc (SEC ID Nº:17) 743-726 gagctggcaatctgggct (SEC ID Nº:18) 742-725 agctggcaatctgggctt (SEC ID Nº:19) 741-724 gctggcaatctgggcttg (SEC ID Nº: 20) 740-720 ctggcaatctgggcttgtagg (SEC ID Nº: 21) 739-720 tggcaatctgggcttgtagg (SEC ID Nº: 22) 738-719 ggcaatctgggcttgtaggc (SEC ID Nº: 23) 756-740 cacggtcaacccagagc (SEC ID Nº: 24) 795-777 gatcttggcgaggtcctga (SEC ID Nº: 25) 809-789 cggatgtctgccatgatcttg (SEC ID Nº: 26) 829-810 ccagctcgtcatattgggcc (SEC ID Nº: 27) 913-894 cagcagactgtgtggtgacc (SEC ID Nº: 28) 941-924 gtgagcgtcgtctcagca (SEC ID Nº: 29) 1008-987 gctggccttcagatttctcatg (SEC ID Nº: 30) 355-335 ccaggctcctcactctgtcca (SEC ID Nº: 31) 930-410 tccagtctctgacctggggtc (SEC ID Nº: 32) 588-569 ctccacagactggcgcatgg (SEC ID Nº: 33) 769-748 gggcatctacctccacggtcaa (SEC ID Nº: 34) 897-877 gaccactgtggtgctctcctc (SEC ID Nº: 35) 925-904 cagctccaacctcagcagactg (SEC ID Nº: 36) 1263-1242 ggtttgcatggagttgctgctg (SEC ID Nº: 37)
F2: Región de posición de bases en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº 1
376-392 gagagcaaaatccggga (SEC ID Nº: 38) 377-393 agagcaaaatccgggag (SEC ID Nº: 39) 378-394 gagcaaaatccgggagc (SEC ID Nº: 40) 384-400 aatccgggagcacttgg (SEC ID Nº: 41) 369-385 gaggctggagagcaaaa (SEC ID Nº: 42) 523-540 cgtcttgctgctgatgac (SEC ID Nº: 43) 524-542 gtcttgctgctgatgactt (SEC ID Nº: 44) 543-565 tagagtcaagtatgagacagagc (SEC ID Nº: 45) 544-565 agagtcaagtatgagacagagc (SEC ID Nº: 46) 546-566 agtcaagtatgagacagagct (SEC ID Nº: 47) 588-604 gaacgacatccatgggc (SEC ID Nº: 48) 660-676 cgaggctctcaaggagg (SEC ID Nº: 49) 661-677 gaggctctcaaggagga (SEC ID Nº: 50) 662-678 aggctctcaaggaggag (SEC ID Nº: 51) 687-706 catgaagaagaaccacgaag (SEC ID Nº: 52) 719-736 gcctacaagcccagattg (SEC ID Nº: 53) 747-763 gttgaccgtggaggtag (SEC ID Nº: 54) 768-784 ccccaaatctcaggacc (SEC ID Nº: 55) 839-855 accgagaggagctagac (SEC ID Nº: 56) 878-894 aggagagcaccacagtg (SEC ID Nº: 57) 943-960 gagctgagacgtacagtc (SEC ID Nº: 58) 295-314 gagaccatgcaaagcctgaa (SEC ID Nº: 59) 369-388 gaggctggagagcaaaatcc (SEC ID Nº: 60) 523-542 cgtcttgctgctgatgactt (SEC ID Nº: 61) 708-729 ggaagtaaaaggcctacaagcc (SEC ID Nº: 62) 837-857 gaaccgagaggagctagacaa (SEC ID Nº: 63) 864-884 gtctcagcagattgaggagag (SEC ID Nº: 64) 1202-1221 tggaagatggcgaggacttt (SEC ID Nº: 65)
F3: Región de posición de bases en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 1
322-338 ctggcctcttacctgga (SEC ID Nº: 66) 293-309 aggagaccatgcaaagc (SEC ID Nº: 67) 470-489 tcttcgcaaatactgtggac (SEC ID Nº: 68) 466-486 cagatcttcgcaaatactgtg (SEC ID Nº: 69) 473-491 tcgcaaatactgtggacaa (SEC ID Nº: 70) 476-495 caaatactgtggacaatgcc (SEC ID Nº: 71) 523-540 cgtcttgctgctgatgac (SEC ID Nº: 72) 546-566 agtcaagtat.gagacagagct (SEC ID Nº: 73) 624-643 caccaatatcacacgactgc (SEC ID Nº: 74) 687-706 catgaagaagaaccacgaag (SEC ID Nº: 75) 695-712 agaaccacgaagaggaag (SEC ID Nº: 76) 747-763 gttgaccgtggaggtag (SEC ID Nº: 77) 812-829 cccaatatgacgagctgg (SEC ID Nº: 78) 845-864 aggagctagacaagtactgg (SEC ID Nº: 79) 855-873 caagtactggtctcagcag (SEC ID Nº: 80) 907-923 tctgctgaggttggagc (SEC ID Nº: 81) 275-294 gaggcatccagaacgagaag (SEC ID Nº: 82) 349-366 agcctggagaccgagaac (SEC ID Nº: 83) 490-507 aatgcccgcatcgttctg (SEC ID Nº: 84) 672-690 ggaggagctgctcttcatg (SEC ID Nº: 85) 807-824 ccgggcccaatatgacga (SEC ID Nº: 86) 840-859 ccgagaggagctagacaagt (SEC ID Nº: 87) 1176-1193 tgagatcgccacctaccg (SEC ID Nº: 88)
R1c: Región de posición de bases en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 1
444-463 gatcatcgaggacctgaggg (SEC ID Nº: 89) 420-442 cagagactggagccattacttca (SEC ID Nº: 90) 424-447 gactggagccattacttcaagatc (SEC ID Nº: 91) 425-448 actggagccattacttcaagatca (SEC ID Nº: 92) 426-450 ctggagccattacttcaagatcatc (SEC ID Nº: 93) 427-451 tggagccattacttcaagatcatcg (SEC ID Nº: 94) 428-451 ggagccattacttcaagatcatcg (SEC ID Nº: 95) 429-453 gagccattacttcaagatcatcgag (SEC ID Nº: 96) 430-454 agccattacttcaagatcatcgagg (SEC ID Nº: 97) 431-454 gccattacttcaagatcatcgagg (SEC ID Nº: 98) 432-456 ccattacttcaagatcatcgaggac (SEC ID Nº: 99) 433-457 cattacttcaagatcatcgaggacc (SEC ID Nº: 100) 587-605 agaacgacatccatgggct (SEC ID Nº: 101) 588-606 gaacgacatccatgggctc (SEC ID Nº: 102) 589-607 aacgacatccatgggctcc (SEC ID Nº: 103) 590-607 acgacatccatgggctcc (SEC ID Nº: 104) 598-614 catgggctccgcaaggt (SEC ID Nº: 105) 632-649 tcacacgactgcagctgg (SEC ID Nº: 106) 624-645 caccaatatcacacgactgcag (SEC ID Nº: 107) 630-649 tatcacacgactgcagctgg (SEC ID Nº: 108) 631-649 atcacacgactgcagctgg (SEC ID Nº: 109) 685-708 ttcatgaagaagaaccacgaagag (SEC ID Nº: 110) 739-756 agctctgggttgaccgtg (SEC ID Nº: 111) 740-756 gctctgggttgaccgtg (SEC ID Nº: 112) 741-757 ctctgggttgaccgtgg (SEC ID Nº: 113) 742-758 tctgggttgaccgtgga (SEC ID Nº: 114) 743-759 ctgggttgaccgtggag (SEC ID Nº: 115) 744-760 tgggttgaccgtggagg (SEC ID Nº: 116) 746-764 ggttgaccgtggaggtaga (SEC ID Nº: 117) 747-767 gttgaccgtggaggtagatgc (SEC ID Nº: 118) 748-767 ttgaccgtggaggtagatgc (SEC ID Nº: 119) 749-767 tgaccgtggaggtagatgc (SEC ID Nº: 120) 750-768 gaccgtggaggtagatgcc (SEC ID Nº: 121) 751-768 accgtggaggtagatgcc (SEC ID Nº: 122) 766-783 gcccccaaatctcaggac (SEC ID Nº: 123) 812-831 cccaatatgacgagctggct (SEC ID Nº: 124) 855-877 caagtactggtctcagcagattg (SEC ID Nº: 125) 924-941 tgctgagacgacgctcac (SEC ID Nº: 126) 947-966 tgagacgtacagtccagtcc (SEC ID Nº: 127) 1016-1032 acagcctgagggaggtg (SEC ID Nº: 128) 360-379 cgagaaccggaggctggaga (SEC ID Nº: 129) 443-464 agatcatcgaggacctgagggc (SEC ID Nº: 130) 592-611 gacatccatgggctccgcaa (SEC ID Nº: 131) 778-799 caggacctcgccaagatcatgg (SEC ID Nº: 132) 900-921 cacacagtctgctgaggttgga (SEC ID Nº: 133) 928-948 gagacgacgctcacagagctg (SEC ID Nº: 134) 1277-1296 ccacccgccggatagtggat (SEC ID Nº: 135)
R2: Región de cadena complementaria para posición de bases en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 1
540-523 gtcatcagcagcaagacg (SEC ID Nº: 136) 541-523 agtcatcagcagcaagacg (SEC ID Nº: 137) 494-475 gcattgtccacagtatttgc (SEC ID Nº: 138) 493-474 cattgtccacagtatttgcg (SEC ID Nº: 139) 492-473 attgtccacagtatttgcga (SEC ID Nº: 140) 491-473 ttgtccacagtatttgcga (SEC ID Nº: 141) 490-472 tgtccacagtatttgcgaa (SEC ID Nº: 142) 489-470 gtccacagtatttgcgaaga (SEC ID Nº: 143) 488-468 tccacagtatttgcgaagatc (SEC ID Nº: 144) 487-467 ccacagtatttgcgaagatct (SEC ID Nº: 145) 486-466 cacagtatttgcgaagatctg (SEC ID Nº: 146) 678-662 ctcctccttgagagcct (SEC ID Nº: 147) 677-661 tcctccttgagagcctc (SEC ID Nº: 148) 676-660 cctccttgagagcctcg (SEC ID Nº: 149) 675-659 ctccttgagagcctcga (SEC ID Nº: 150) 673-657 ccttgagagcctcgatc (SEC ID Nº: 151) 672-655 cttgagagcctcgatctc (SEC ID Nº: 152) 667-651 gagcctcgatctctgtc (SEC ID Nº: 153) 666-649 agcctcgatctctgtctc (SEC ID Nº: 154) 665-649 gcctcgatctctgtctc (SEC ID Nº: 155) 713-696 acttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 156) 721-702 ggccttttacttcctcttcg (SEC ID Nº: 157) 714-696 tacttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 158) 762-746 tacctccacggtcaacc (SEC ID Nº: 159) 809-792 cggatgtctgccatgatc (SEC ID Nº: 160) 808-790 ggatgtctgccatgatctt (SEC ID Nº: 161) 829-812 ccagctcgtcatattggg (SEC ID Nº: 162) 877-858 caatctgctgagaccagtac (SEC ID Nº: 163) 874-856 tctgctgagaccagtactt (SEC ID Nº: 164) 922-906 ctccaacctcagcagac (SEC ID Nº: 165) 985-969 agtccaggtcgatctcc (SEC ID Nº: 166) 1006-987 tggccttcagatttctcatg (SEC ID Nº: 167) 1011-994 caagctggccttcagatt (SEC ID Nº: 168) 1086-1070 aaggtgcagcaggatcc (SEC ID Nº: 169) 437-417 taatggctccagtctctgacc (SEC ID Nº: 170) 515-496 tcaatctgcagaacgatgcg (SEC ID Nº: 171) 669-649 gagagcctcgatctctgtctc (SEC ID Nº: 172) 669-650 gagagcctcgatctctgtct (SEC ID Nº: 173) 857-837 ttgtctagctcctctcggttc (SEC ID Nº: 174) 857-838 ttgtctagctcctctcggtt (SEC ID Nº: 175) 981-962 caggtcgatctccaaggact (SEC ID Nº: 176) 1008-989 gctggccttcagatttctca (SEC ID Nº: 177) 1350-1331 gctggcttaatgcctcagaa (SEC ID Nº: 178)
R3: Región de cadena complementaria para la posición de bases en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 1 566-546 agctctgtctcatacttgact (SEC ID Nº: 179) 541-523 agtcatcagcagcaagacg (SEC ID Nº: 180) 540-5239 gtcatcagcagcaagacg (SEC ID Nº: 181) 721-702 ggccttttacttcctcttcg (SEC ID Nº: 182) 713-696 acttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 183) 740-724 ctgg.caatctgggcttg (SEC ID Nº: 184) 786-769 gaggtcctgagatttggg (SEC ID Nº: 185) 854-837 tctagctcctctcggttc (SEC ID Nº: 186) 877-858 caatctgctgagaccagtac (SEC ID Nº: 187) 922-906 ctccaacctcagcagac (SEC ID Nº: 188) 910-894 cagactgtgtggtgacc (SEC ID Nº: 189) 893-877 actgtggtgctctcctc (SEC ID Nº: 190) 960-943 gactgtacgtctcagctc (SEC ID Nº: 191) 1021-1005 ggctgttctccaagctg (SEC ID Nº: 192) 1056-1039 catctgtagggcgtagcg (SEC ID Nº: 193) 1141-1125 catactcctgggcctgg (SEC ID Nº: 194) 476-458 gcgaagatctgagccctca (SEC ID Nº: 195) 538-521 catcagcagcaagacggg (SEC ID Nº: 196) 688-670 tgaagagcagctcctcctt (SEC ID Nº: 197) 885-866 gctctcctcaatctgctgag (SEC ID Nº: 198) 1008-989 gctggccttcagatttctca (SEC ID Nº: 199) 1030-1012 cctccctcaggctgttctc (SEC ID Nº: 200) 1370-1352 ccaaagggtaccctgcttc (SEC ID Nº: 201)
Bucle F: Región de cadena complementaria para la posición de bases en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 1 419-403 acctggggtcccttctt (SEC ID Nº: 202) 414-396 gggtcccttcttctccaag (SEC ID Nº: 203) 413-394 ggtcccttcttctccaagtg (SEC ID Nº: 204) 399-380 caagtgctcccggattttgc (SEC ID Nº: 205)
398-380 aagtgctcccggattttgc (SEC ID Nº: 206) 397-379 agtgctcccggattttgct (SEC ID Nº: 207) 396-378 gtgctcccggattttgctc (SEC ID Nº: 208) 395-377 tgctcccggattttgctct (SEC ID Nº: 209) 394-376 gctcccggattttgctctc (SEC ID Nº: 210) 567-544 cagctctgtctcatacttgactct (SEC ID Nº:211) 584-568 acagactggcgcatggc (SEC ID Nº: 212) 709-688 cctcttcgtggttcttcttcat (SEC ID Nº: 213) 916-898 cctcagcagactgtgtggt (SEC ID Nº: 214) 913-894 cagcagactgtgtggtgacc (SEC ID Nº: 215) 567-544 cagctctgtctcatacttgactct (SEC ID Nº: 216) 743-726 gagctggcaatctgggct (SEC ID Nº: 217) 1243-1224 tgtccaaggcatcaccaaga (SEC ID Nº: 218) 1242-1222 gtccaaggcatcaccaagatt (SEC ID Nº: 219)
Bucle R: Región de posición de bases en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 1
474-495 cgcaaatactgtggacaatgcc (SEC ID Nº: 220) 466-489 cagatcttcgcaaatactgtggac (SEC ID Nº: 221) 444-463 gatcatcgaggacctgaggg (SEC ID Nº: 222) 626-646 ccaatatcacacgactgcagc (SEC ID Nº: 223) 617-640 ttgatgacaccaatatcacacgac (SEC ID Nº: 224) 632-649 tcacacgactgcagctgg (SEC ID Nº: 225) 659-676 tcgaggctctcaaggagg (SEC ID Nº: 226) 767-784 cccccaaatctcaggacc (SEC ID Nº: 227) 970-986 gagatcgacctggactc (SEC ID Nº: 228) 622-643 gacaccaatatcacacgactgc (SEC ID Nº: 229) 621-643 tgacaccaatatcacacgactgc (SEC ID Nº: 230) 623-644 acaccaatatcacacgactgca (SEC ID Nº: 231) 810-829 Ggcccaatatgacgagctgg (SEC ID Nº: 232) 1296-1315 tggcaaagtggtgtctgaga, (SEC ID Nº: 233)
5 (Ejemplo 1-2) (Referencia) Diseño de Cebador para Detectar CK18
A partir de las secuencias de las regiones seleccionadas en el Ejemplo 1-1, se obtuvieron los siguientes cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos a aplicar al método LAMP. FIP: Cebador que tiene la secuencia de bases en la que están acopladas secuencias de bases de las regiones F1c
10 y F2
09FA971-376 tgaagtaatggctccagtctctggagagcaaaatccggga (SEC ID Nº: 234) 09FA971-377 tgaagtaatggctccagtctctgagagcaaaatccgggag (SEC ID Nº: 235) 09FA971-378 tgaagtaatggctccagtctctggagcaaaatccgggagc (SEC ID Nº: 236)
15 09FA971-384 tgaagtaatggctccagtctctgaatccgggagcacttgg (SEC ID Nº: 237) 09FA974-376 agtaatggctccagtctctgacgagagcaaaatccggga (SEC ID Nº: 238) 09FA974-377 agtaatggctccagtctctgacagagcaaaatccgggag (SEC ID Nº: 239) 09FA974-378 agtaatggctccagtctctgacgagcaaaatccgggagc (SEC ID Nº: 240) 09FA974-384 agtaatggctccagtctctgacaatccgggagcacttgg (SEC ID Nº: 241)
20 09FA970-376 ttgaagtaatggctccagtctctgagagcaaaatccggga (SEC ID Nº: 242) 09FA970-377 ttgaagtaatggctccagtctctagagcaaaatccgggag (SEC ID Nº: 243) 09FA970-378 ttgaagtaatggctccagtctctgagcaaaatccgggagc (SEC ID Nº: 244) 09FA970-384 ttgaagtaatggctccagtctctaatccgggagcacttgg (SEC ID Nº: 245) 09FA999-369 gggtcccttcttctccaaggaggctggagagcaaaa (SEC ID Nº: 246)
25 09FA994-369 acctggggtcccttcttgaggctggagagcaaaa (SEC ID Nº: 247) 09FA1000-369 ggtcccttcttctccaagtggaggctggagagcaaaa (SEC ID Nº: 248) 09FA1002-369 tcccttcttctccaagtgctgaggctggagagcaaaa (SEC ID Nº: 249) 09FA1004-369 ccttcttctccaagtgctccgaggctggagagcaaaa (SEC ID Nº: 250) 12FA829-523 acagactggcgcatggccgtcttgctgctgatgac (SEC ID Nº: 251)
30 12FA829-524 acagactggcgcatggcgtcttgctgctgatgactt (SEC ID Nº: 252)
13FA793-543 tcaatgaccttgcggagcctagagtcaagtatgagacagagc (SEC ID Nº: 253) 13FA793-544 tcaatgaccttgcggagccagagtcaagtatgagacagagc (SEC ID Nº: 254) 13FA793-546 tcaatgaccttgcggagccagtcaagtatgagacagagct (SEC ID Nº: 255) 13FA792-593 atcaatgaccttgcggagcctagagtcaagtatgagacagagc (SEC ID Nº: 256) 13FA792-544 atcaatgaccttgcggagccagagtcaagtatgagacagagc (SEC ID Nº: 257) 13FA792-546 atcaatgaccttgcggagccagtcaagtatgagacagagct (SEC ID Nº: 258) 13FA791-543 catcaatgaccttgcggagctagagtcaagtatgagacagagc (SEC ID Nº: 259) 13FA791-544 catcaatgaccttgcggagcagagtcaagtatgagacagagc (SEC ID Nº: 260) 13FA791-546 catcaatgaccttgcggagcagtcaagtatgagacagagct (SEC ID Nº: 261) 13FA790-543 tcatcaatgaccttgcggagctagagtcaagtatgagacagagc (SEC ID Nº: 262) 13FA790-544 tcatcaatgaccttgcggagcagagtcaagtatgagacagagc (SEC ID Nº: 263) 13FA790-546 tcatcaatgaccttgcggagcagtcaagtatgagacagagct (SEC ID Nº: 264) 14FA747-588 agcctcgatctctgtctccgaacgacatccatgggc (SEC ID Nº: 265) 18FA675-660 ggcaatctgggcttgtaggccgaggctctcaaggagg (SEC ID Nº: 266) 18FA670-660 gagctggcaatctgggctcgaggctctcaaggagg (SEC ID Nº: 267) 18FA670-662 gagctggcaatctgggctaggctctcaaggaggag (SEC ID Nº: 268) 18FA674-660 tggcaatctgggcttgtaggcgaggctctcaaggagg (SEC ID Nº: 269) 18FA674-662 tggqaatctgggcttgtaggaggctctcaaggaggag (SEC ID Nº: 270) 18FA675-661 ggcaatctgggcttgtaggcgaggctctcaaggagga (SEC ID Nº: 271) 18FA675-662 ggcaatctgggcttgtaggcaggctctcaaggaggag (SEC ID Nº: 272) 19FA657-687 cacggtcaacccagagccatgaagaagaaccacgaag (SEC ID Nº: 273) 21FA618-719 gatcttggcgaggtcctgagcctacaagcccagattg (SEC ID Nº: 274) 21FA604-747 cggatgtctgccatgatcttggttgaccgtggaggtag (SEC ID Nº: 275) 23FA584-768 ccagctcgtcatattgggccccccaaatctcaggacc (SEC ID Nº: 276) 27FA500-839 cagcagactgtgtggtgaccaccgagaggagctagac (SEC ID Nº: 277) 29FA472-878 gtgagcgtcgtctcagcaaggagagcaccacagtg (SEC ID Nº: 278) 32FA405-943 gctggccttcagatttctcatggagctgagacgtacagtc (SEC ID Nº: 279) ek 335-295 ccaggctcctcactctgtccagagaccatgcaaagcctgaa (SEC ID Nº: 280) ek 410-369 tccagtctctgacctggggtcgaggctggagagcaaaa (SEC ID Nº: 281) ek 569-523 ctccacagactggcgcatggcgtcttgctgctgatgac (SEC ID Nº: 282) ek 748-708 gggcatctacctccacggtcaaggaagtaaaaggcctacaagcc (SEC ID Nº: 283) ek 877-837 gaccactgtggtgctctcctcgaaccgagaggagctagacaa (SEC ID Nº: 284) ek 904-864 cagctccaacctcagcagactggtctcagcagattgaggagag (SEC ID Nº: 285) ek 1242-1202 ggtttgcatggagttgctgctgtggaagatggcgaggacttt (SEC ID Nº: 286)
RIP: Cebador que tiene la secuencia de bases en la que están acopladas secuencias de bases de las regiones R1c y R2
09RA444-873 gatcatcgaggacctgaggggtcatcagcagcaagacg (SEC ID Nº: 287) 09RA444-872 gatcatcgaggacctgagggagtcatcagcagcaagacg (SEC ID Nº: 288) 09RA420-927 cagagactggagccattacttcacacagtatttgcgaagatctg (SEC ID Nº: 289) 09RA420-925 cagagactggagccattacttcatccacagtatttgcgaagatc (SEC ID Nº: 290) 09RA420-923 cagagactggagccattacttcatgtccacagtatttgcgaa (SEC ID Nº: 291) 09RA420-921 cagagactggagccattacttcaattgtccacagtatttgcga (SEC ID Nº: 292) 09RA420-919 cagagactggagccattacttcagcattgtccacagtatttgc (SEC ID Nº: 293) 09RA424-927 gactggagccattacttcaagatccac.agtatttgcgaagatctg (SEC ID Nº: 294) 09RA424-923 gactggagccattacttcaagatctgtccacagtatttgcgaa (SEC ID Nº: 295) 09RA424-921 gactggagccattacttcaagatcattgtccacagtatttgcga (SEC ID Nº: 296) 12RA598-737 catgggctccgcaaggtcctccttgagagcctcg (SEC ID Nº: 297) 12RA587-746 agaacgacatccatgggctgagcctcgatctctgtc (SEC ID Nº: 298) 12RA588-737 gaacgacatccatgggctccctccttgagagcctcg (SEC ID Nº: 299) 12RA588-746 gaacgacatccatgggctcgagcctcgatctctgtc (SEC ID Nº: 300) 12RA588-748 gaacgacatccatgggctcgcctcgatctctgtctc (SEC ID Nº: 301) 12RA590-737 acgacatccatgggctcccctccttgagagcctcg (SEC ID Nº: 302) 12RA590-746 acgacatccatgggctccgagcctcgatctctgtc (SEC ID Nº: 303) 12RA590-748 acgacatccatgggctccgcctcgatctctgtctc (SEC ID Nº: 304) 12RA598-740 catgggctccgcaaggtccttgagagcctcgatc (SEC ID Nº: 305) 12RA598-746 catgggctccgcaaggtgagcctcgatctctgtc (SEC ID Nº: 306) 13RA632-700 tcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 307) 13RA632-692 tcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg (SEC ID Nº: 308)
13RA632-699 tcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 309) 13RA624-700 caccaatatcacacgactgcagacttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 310) 13RA624-699 caccaatatcacacgactgcagtacttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 311) 13RA624-692 caccaatatcacacgactgcagggccttttacttcctcttcg (SEC ID Nº: 312) 13RA631-700 atcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 313) 13RA631-699 atcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 314) 13RA631-692 atcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg (SEC ID Nº: 315) 13RA630-700 tatcacacgactgcagctggacttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 316) 13RA630-699 tatcacacgactgcagctggtacttcctcttcgtggttc (SEC ID Nº: 317) 13RA630-692 tatcacacgactgcagctggggccttttacttcctcttcg (SEC ID Nº: 318) 14RA685-651 ttcatgaagaagaaccacgaagagtacctccacggtcaacc (SEC ID Nº: 319) 18RA743-604 ctgggttgaccgtggagcggatgtctgccatgatc (SEC ID Nº: 320) 18RA743-605 ctgggttgaccgtggagggatgtctgccatgatctt (SEC ID Nº: 321) 18RA747-604 gttgaccgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatc (SEC ID Nº: 322) 18RNA749-604 tgaccgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatc (SEC ID Nº: 323) 18RA751-604 accgtggaggtagatgcccggatgtctgccatgatc (SEC ID Nº: 324) 18RA749-605 tgaccgtggaggtagatgcggatgtctgccatgatctt (SEC ID Nº: 325) 18RA751-605 accgtggaggtagatgccggatgtctgccatgatctt (SEC ID Nº: 326) 19RA766-584 gcccccaaatctcaggacccagctcgtcatattggg (SEC ID Nº: 327) 21RA812-536 cccaatatgacgagctggctcaatctgctgagaccagtac (SEC ID Nº: 328) 23RA855-491 caagtactggtctcagcagattgctccaacctcagcagac (SEC ID Nº: 329) 27RA924-428 tgctgagacgacgctcacagtccaggtcgatctcc (SEC ID Nº: 330) 29RA947-402 tgagacgtacagtccagtcccaagctggccttcagatt (SEC ID Nº: 331) 29RA947-407 tgagacgtacagtccagtcctggccttcagatttctcatg (SEC ID Nº: 332) 32RA1016-327 acagcctgagggaggtgaaggtgcagcaggatcc (SEC ID Nº: 333) ek 360-417 cgagaaccggaggctggagataatggctccagtctctgacc (SEC ID Nº: 334) ek 443-496 agatcatcgaggacctgagggctcaatctgcagaacgatgcg (SEC ID Nº: 335) ek 592-649 gacatccatgggctccgcaagagagcctcgatctctgtctc (SEC ID Nº: 336) ek 592-650 gacatccatgggctccgcaagagagcctcgatctctgtct (SEC ID Nº: 337) ek 778-837 caggacctcgccaagatcatgggaaccgagaggagctagacaa (SEC ID Nº: 338) ek 900-962 cacacagtctgctgaggttggacaggtcgatctccaaggact (SEC ID Nº: 339) ek 928-989 gagacgacgctcacagagctggctggccttcagatttctca (SEC ID Nº: 340) ek 1277-1331 ccacccgccggatagtggatgctggcttaatgcctcagaa (SEC ID Nº: 341)
Cebador F3: (cebador que comprende la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº respectiva)
F309-322 (SEC ID Nº: 66), F309-293 (SEC ID Nº: 67) F312-470 (SEC ID Nº: 68), F312-466 (SEC ID Nº: 69) F312-473 (SEC ID Nº: 70), F312-476 (SEC ID Nº: 71) F313-523 (SEC ID Nº: 72), F314-546 (SEC ID Nº: 73) F319-624 (SEC ID Nº: 74), F321-687 (SEC ID Nº: 75) F321-695 (SEC ID Nº: 76), F323-747 (SEC ID Nº: 77) F327-812 (SEC ID Nº: 78), F329-845 (SEC ID Nº: 79) F329-855 (SEC ID Nº: 80), F332-907 (SEC ID Nº: 81) F3 8 (SEC ID Nº: 82), F3 13 (SEC ID Nº: 83), F3 14 (SEC ID Nº: 84), F3 16 (SEC ID Nº: 85), F3 23 (SEC ID Nº: 86), F3 29 (SEC ID Nº: 87) F3 37 (SEC ID Nº: 88)
Cebador R3: (cebador que comprende la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº respectiva)
R309-847 (SEC ID Nº: 179), R309-872 (SEC ID Nº: 180), R309-873 (SEC ID Nº: 181), R312-692 (SEC ID Nº: 182), R312-700 (SEC ID Nº: 183), R313-673(SEC ID Nº: 184), R314-627 (SEC ID Nº: 185), R318-559(SEC ID Nº: 186), R319-536 (SEC ID Nº: 187), R321-491(SEC ID Nº: 188), R321-503 (SEC ID Nº: 189), R321-520(SEC ID Nº: 190), R323-453 (SEC ID Nº: 191), R327-392(SEC ID Nº: 192), R329-357 (SEC ID Nº: 193), R332-272(SEC ID Nº: 194), B3 8 (SEC ID Nº: 195), B3 13 (SEC ID Nº: 196),
B3 14 (SEC ID Nº: 197), B3 19 (SEC ID Nº: 198), B3 21 (SEC ID Nº: 199), B3 35 (SEC ID Nº: 200), B3 37 (SEC ID Nº: 201)
Cebador de bucle: (cebador que comprende la secuencia de bases representada por SEC ID Nº respectiva)
LF09-994 (SEC ID Nº: 202), LF09-999 (SEC ID Nº: 203), LF09-1000 (SEC ID Nº: 204), LF09-1014(SEC ID Nº: 205), LF09-1015 (SEC ID Nº: 206), LF09-1016(SEC ID Nº: 207),
10 LF09-1017 (SEC ID Nº: 208), LF09-1018(SEC ID Nº: 209), LF09-1019 (SEC ID Nº: 210), LF12-846 (SEC ID Nº: 211), LF13-829 (SEC ID Nº: 212), LF18-704 (SEC ID Nº: 213), LF29-497 (SEC ID Nº: 214), LF29-500 (SEC ID Nº: 215), LF 14 (SEC ID Nº: 216), LF 20 (SEC ID Nº: 217),
15 LF 371 (SEC ID Nº: 218), LF 372 (SEC ID Nº: 219) LR09-474 (SEC ID Nº: 220), LR09-466 (SEC ID Nº: 221), LR09-444 (SEC ID Nº: 222), LR12-626 (SEC ID Nº: 223), LR12-617 (SEC ID Nº: 224), LR12-632 (SEC ID Nº: 225), LR13-659 (SEC ID Nº: 226), LR18-767 (SEC ID Nº: 227),
20 LR29-970 (SEC ID Nº: 228), LB 14 (SEC ID Nº: 229), LB 151 (SEC ID Nº: 230), LB 152 (SEC ID Nº: 231), LB 371 (SEC ID Nº: 232), LB 372 (SEC ID Nº: 233)
(Ejemplo 2-1) Selección de región a partir de la secuencia de bases de CK19 humana
25 Se investigó la secuencia de bases de CK19 humana representada por la SEC ID Nº: 342 con respecto a posiciones de regiones apropiadas para el método LAMP usando un software de diseño de sondas. Como resultado de la selección de regiones de acuerdo con el criterio de que Tm 58,5-63,5ºC para F1c y R1c, Tm 61,562,5ºC para F2 y R2, y Tm 58,5-62,5ºC para F3 y R3, se seleccionan las regiones indicadas a continuación. Las
30 regiones seleccionadas se incluyen en una región de posiciones de bases 270-930 de la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342 y una región de cadena complementaria de la misma.
F1c: Regiones en cadena complementaria de secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342
426-405 5'-tgtagtagtggctgtagtcgcg-3' (SEC ID Nº: 343) 429-407 5'-tcgtgtagtagtggctgtagtcg-3' (SEC ID Nº: 344) 479-458 5'-ggagttctcaatggtggcacca-3' (SEC ID Nº: 345) 716-700 5'-ttggcccctcagcgtac-3' (SEC ID Nº: 346) 752-735 5'-agcggaatccacctccac-3' (SEC ID Nº: 347) 747-728 5'-aatccacctccacactgacc-3' (SEC ID Nº: 348) 746-728 5'-atccacctccacactgacc-3' (SEC ID Nº: 349) 745-728 5'-tccacctccacactgacc-3' (SEC ID Nº: 350) 35 F2: Regiones en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342
352-370 5'-agctagaggtgaagatccg-3' (SEC ID Nº: 351) 364-380 5'-agatccgcgactggtac-3' (SEC ID Nº: 352) 360-376 5'-gtgaagatccgcgactg-3' (SEC ID Nº: 353) 417-437 5'-actactacacgaccatccagg-3' (SEC ID Nº: 354) 658-679 5'-aagagctggcctacctg-3' (SEC ID Nº: 355) 690-709 5'-gaggaaatcagtacgctgag-3' (SEC ID Nº: 356)
F3: Regiones en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342
40 275-293 5'-gctaaccatgcagaacctc-3' (SEC ID Nº: 357) 375-392 5'-tggtaccagaagcagggg-3' (SEC ID Nº: 358) 628-645 5'-acctggagatgcagatcg-3' (SEC ID Nº: 359) 658-674 5'-aagagctggcctacctg-3' (SEC ID Nº: 360)
661-677 5'-agctggcctacctgaag-3' (SEC ID Nº: 361) R1c: Regiones en la secuencia de bases SEC ID Nº: 342 representada por 533-516 5'-gtgccaccattgagaactcc-3' (SEC ID Nº: 362)
485-505 5'-tgtcctgcagatcgacaacgc-3' (SEC ID Nº: 363) 486-506 5'-gtcctgcagatcgacaacgcc-3' (SEC ID Nº: 364) 727-744 5'-aggtcagtgtggaggtgg-3' (SEC ID Nº: 365) 764-783 5'-tctcgccaagatcctgagtg-3' (SEC ID Nº: 366) 766-785 5'-tcgccaagatcctgagtgac-3' (SEC ID Nº: 367) 772-793 5'-agatcctgagtgacatgcgaag-3' (SEC ID Nº: 368)
R2: Regiones en cadena complementaria de la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342
533-516 5'-ggttcggaagtcatctgc-3' (SEC ID Nº: 369) 545-526 5'-cgtctcaaacttggttcgga-3' (SEC ID Nº: 370) 547-528 5'-tccgtctcaaacttggttcg-3' (SEC ID Nº: 371) 790-773 5'-cgcatgtcactcaggatc-3' (SEC ID Nº: 372) 841-824 5'-caggcttcagcatccttc-3' (SEC ID Nº: 373) 848-832 5'-ggtgaaccaggcttcag-3' (SEC ID Nº: 374) 847-831 5'-gtgaaccaggcttcagc-3' (SEC ID Nº: 375) 845-828 5'-gaaccaggcttcagcatc-3' (SEC ID Nº: 376) 843-827 5'-accaggcttcagcatcc-3' (SEC ID Nº: 377)
5 R3: Regiones en cadena complementaria de la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342
556-540 5'-agagcctgttccgtctc-3' (SEC ID Nº: 378) 567-584 5'.-gtggaggccgacatcaac-3' (SEC ID Nº 379) 841-824 5'-caggcttcagcatccttc-3' (SEC ID Nº: 380) 916-900 5'-tcggacctgctcatctg-3' (SEC ID Nº: 381) 925-908 5'-tcagtaacctcggacctg-3' (SEC ID Nº: 382) 923-907 5'-agtaacctcggacctgc-3' (SEC ID Nº: 383) 921-905 5'-taacctcggacctgctc-3' (SEC ID Nº: 384)
Bucle F: Regiones en cadena complementaria de la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342
395-381 5'-aggcccctgcttctg-3' (SEC ID Nº: 385) 393-379 5'-gcccctgcttctggt-3' (SEC ID Nº: 386) 392-376 5'-cccctgcttctggtacc-3' (SEC ID Nº: 387) 392-375 5'-cccctgcttctggtacca-3' (SEC ID Nº: 388) 393-376 5'-gcccctgcttctggtacc-3' (SEC ID Nº: 389) 395-380 5'-aggcccctgcttctgg-3' (SEC ID Nº: 390) 394-379 5'-ggcccctgcttctggt-3' (SEC ID Nº: 391) 457-440 5'-agaatcttgtcccgcagg-3' (SEC ID Nº: 392) 456-440 5'-gaatcttgtcccgcagg-3' (SEC ID Nº: 393) 699-680 5'-tgatttcctcctcatggttc-3' (SEC ID Nº: 394) 698-679 5'-gatttcctcctcatggttct-3' (SEC ID Nº: 395) 694-676 5'-tcctcctcatggttcttct-.3' (SEC ID Nº: 396) 734-318 5'-actgacctggcctccca-3' (SEC ID Nº: 397) 724-710 5'-cctcccacttggccc-3' (SEC ID Nº: 398)
10
Bucle R: Regiones en cadena complementaria de la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342
493-510 5'-agatcgacaacgcccgtc-3' (SEC ID Nº: 399) 495-512 5'-atcgacaacgcccgtctg-3' (SEC ID Nº: 400) 495-509 5'-atcgacaacgcccgt-3' (SEC ID Nº: 401)
496-509 5'-tcgacaacgcccgt-3' (SEC ID Nº: 402) 506-520 5'-ccgtctggctgcaga-3' (SEC ID Nº: 403) 507-520 5'-cgtctggctgcagatga-3' (SEC ID Nº: 404) 508-525 5'-gtctggctgcagatgact-3' (SEC ID Nº: 405) 509-526 5'-tctggctgcagatgactt-3' (SEC ID Nº: 406) 752-767 5'-tccgggcaccgatctc-3' (SEC ID Nº: 407) 756-771 5'-ggcaccgatctcgcca-3' (SEC ID Nº: 408) 755-769 5'-gggcaccgatctcgc-3' (SEC ID Nº: 409) 757-771 5'-gcaccgatctcgcca-3' (SEC ID Nº: 410) 805-822 5'-tcatggccgagcagaacc-3' (SEC ID Nº:411) 806-821 5'-catggccgagcagaac-3' (SEC ID Nº:412)
(Ejemplo 2-2) Diseño de cebador para detectar CK19
A partir de las secuencias de las regiones seleccionadas en el Ejemplo 2-1, se obtuvieron los siguientes 5 cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos a aplicar al método LAMP.
Cada cebador se muestra en un conjunto de cebadores a usar en el método RT-LAMP y se clasificó en cuatro Grupos A a D dependiendo de la región. Cada cebador perteneciente al Grupo A se selecciona a partir de una región de posiciones de bases 270-560 en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 342 y una
10 región de cadena complementaria de la misma; de forma similar, cada cebador perteneciente al Grupo B se selecciona de una región de posiciones de bases 370-585 y una región de cadena complementaria de la misma; de forma similar, cada cebador perteneciente al Grupo C se selecciona a partir de una región de posiciones de bases 625-854 en una región de cadena complementaria de la misma; y de forma similar cada cebador perteneciente al Grupo D se selecciona a partir de una región de posiciones de bases 655-930 y una región de
15 cadena complementaria de la misma.
(Grupo A)
FIP: Secuencias de Bases de Regiones F1c y F2 Acopladas
20 FA-401 5'-tgtagtagtggctgtagtcgcgagctagaggtgaagatccg-3' (SEC ID Nº: 413) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 343 y la SEC ID Nº: 351 están acopladas) FA-403 5'-tgtagtagtggctgtagtcgcgagatccgcgactggtac-3' (SEC ID Nº: 414) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 343 y la SEC ID Nº: 352 están acopladas) FA-404 5'-tcgtgtagtagtggctgtagtcgagctagaggtgaagatccg-3' (SEC ID Nº: 415) (Las secuencias de bases de la SEC ID
25 Nº: 344 y la SEC ID Nº: 351 están acopladas) FA-4055'-tcgtgtagtagtggctgtagtcggtgaagatccgcgactg-3' (SEC ID Nº: 416) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 344 y la SEC ID Nº: 353 están acopladas) FA-4065'-tcgtgtagtagtggctgtagtcgagatccgcgactggtac-3' (SEC ID Nº: 917) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 344 y SEC ID Nº: 352 están acopladas)
30 RIP: Secuencias de Bases de las Regiones R1c y R2 Acopladas RA-401 5'-gtgccaccattgagaactccggttcggaagtcatctgc-3' (SEC ID Nº: 418) (Las secuencias de las bases de la SEC ID Nº: 362 y la SEC ID Nº: 369 están acopladas)
Cebador F3: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región F3)
35 F3-401 5'-gctaaccatgcagaacctc-3' (SEC ID Nº: 357) Cebador R3: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la Región R3) R3-401 5'-agagcctgttccgtctc-3' (SEC ID Nº: 378)
Cebador de bucle: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región del bucle F o del bucle R)
LPF-401 5'-aggcccctgcttctg-3' (SEC ID Nº: 385) LPF-402 5'-gcccctgcttctggt-3' (SEC ID Nº: 386) LPF-403 5'-cccctgcttctggtacc-3' (SEC ID Nº: 387) LPF-404 5'-cccctgcttctggtacca-3' (SEC ID Nº: 388) LPF-405 5'-gcccctgcttctggtacc-3' (SEC ID Nº: 389) LPF-406 5'-aggcccctgcttctgg-3' (SEC ID Nº: 390) LPF-407 5'-ggcccctgcttctggt-3' (SEC ID Nº: 391) LPR-401 5'-agatcgacaacgcccgtc-3' (SEC ID Nº: 399) LPR-402 5'-afcgacaacgcccgtctg-3' (SEC ID Nº: 400)
LPR-403 5'-atcgacaacgcccgt-3' (SEC ID Nº: 401) LPR-404 5'-tcgacaacgcccgt-3' (SEC ID Nº: 402) (Grupo B)
FIP: Secuencias de Bases de Regiones F1c y F2 Acopladas FA1 -EK 5'-ggagttctcaatggtggcaccaactactacacgaccatccagg-3' (SEC ID Nº: 419) (Las secuencias de bases de la SEC 5 ID Nº: 346 y de SEC ID Nº: 354 están acopladas) RIP: Secuencias de Bases de Regiones R1c y R2 Acopladas RA2-EK5'-tgtcctgcagatcgacaacgccgtctcaaacttggttcgga-3' (SEC ID Nº: 420) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 363 y la SEC ID Nº: 370 están acopladas) RA6-EK 5'-gtcctgcagatcgacaacgcctccgtctcaaacttggttcg-3' (SEC ID Nº: 421) (Las secuencias de bases de la SEC ID 10 Nº: 364 y la SEC ID Nº: 371 están acopladas)
Cebador F3: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región F3)
F3-EK 5'-tggtaccagaagcagggg-3' (SEC ID Nº: 358)
Cebador R3: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región R3) 15 R3-EK 5'-gtggaggccgacatcaac-3' (SEC ID Nº: 379)
Cebador de bucle: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región de bucle F o bucle R)
LPF1-EK 5'-agaatcttgtcccgcagg-3' (SEC ID Nº: 392)
LPF2-EK 5'-gaatcttgtcccgcagg-3' (SEC ID Nº: 393) LPR1-EK 5'-ccgtctggctgcaga-3' (SEC ID Nº: 403) LPR2-EK 5'-cgtctggctgcagatga-3' (SEC ID Nº: 404) LPR3-EK 5'-gtctggctgcagatgact-3' (SEC ID Nº: 405) LPR4-EK 5'-tctggctgcagatgactt-3' (SEC ID Nº: 406)
20 (Grupo C)
FIP: Secuencias de Bases de Regiones F1c y F2 Acopladas FA-1101 5'-ttggcccctcagcgtacaagagctggcctacctg-3' (SEC ID Nº: 422) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 346 y la SEC ID Nº: 355 están acopladas) 25 RIP: Secuencias de Bases de las Regiones R1c y R2 Acopladas RA-11015'-aggtcagtgtggaggtggcgcatgtcactcaggatc-3' (SEC ID Nº: 423) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 365 y la SEC ID Nº: 372 están acopladas) Cebador F3: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región F3)
F3-1101 5'-acctggagatgcagatcg-3' (SEC ID Nº: 359)
30 Cebador R3: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región R3)
R3-1101 5'-caggcttcagcatccttc-3' (SEC ID Nº: 380)
Cebador de bucle: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región del bucle F o bucle R)
LPF-1101 5'-tgatttcctcctcatggttc-3' (SEC ID Nº: 394) LPF-1102 5'-gatttcctcctcatggttct-3' (SEC ID Nº: 395) LPF-1103 5'-tcctcctcatggttcttct-3' (SEC ID Nº: 396) LPR-1101 5'-tccgggcaccgatctc-3' (SEC ID Nº: 407) LPR-1102 5'-ggcaccgatctcgcca-3' (SEC ID Nº: 408) LPR-1103 5'-gggcaccgatctcgc-3' (SEC ID Nº: 409) LPR-1104 5'-gcaccgatctcgcca-3' (SEC ID Nº: 410) 35 (Grupo D)
FIP: Secuencias de Bases de Regiones F1c y F2 Acopladas FA-601 5'-agcggaatccacctccacgaggaaatcagtacgctgag-3' (SEC ID Nº: 424) (Las secuencias de bases de la SEC ID 40 Nº: 347 y la SEC ID Nº: 356 están acopladas)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
FA-602 5'-aatccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3' (SEC ID Nº: 425) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 348 y la SEC ID Nº: 356 están acopladas) FA-603 5'-atccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3' (SEC ID Nº: 426) Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 349 y la SEC ID Nº: 359 están acopladas) FA-604 5'-tccacctccacactgaccgaggaaatcagtacgctgag-3' (SEC ID Nº: 427) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 350 y la SEC ID Nº: 356 están acopladas) RIP: Secuencias de Bases de Regiones R1c y R2 Acopladas RA-6015'-tctcgccaagatcctgagtgcaggcttcagcatccttc-3' (SEC ID Nº: 428) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 366 y la SEC ID Nº: 373 están acopladas) RA-602 5'-tctcgccaagatcctgagtgggtgaaccaggcttcag-3' (SEC ID Nº: 429) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 366 y la SEC ID Nº: 374 están acopladas) RA-603 5'-tctcgccaagatcctgagtggtgaaccaggcttcagc-3' (SEC ID Nº: 430) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 366 y la SEC ID Nº: 375 están acopladas) RA-6045'-tctcgccaagatcctgagtggaaccaggcttcagcatc-3' (SEC ID Nº: 431) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 366 y la SEC ID Nº: 376 están acopladas) RA-605 5'-tctcgccaagatcctgagtgaccaggcttcagcatcc-3' (SEC ID Nº: 432) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 366 y la SEC ID Nº: 377 están acopladas) RA-606 5'-tcgccaagatcctgagtgaccaggcttcagcatccttc-3'(SEC ID Nº: 433) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 367 y la SEC ID Nº: 373 están acopladas) RA-607 5'-agatcctgagtgacatgcgaagcaggcttcagcatccttc-3' (SEC ID Nº: 434) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 368 y la SEC ID Nº: 373 están acopladas)
Cebador F3: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región F3)
F3-601 5'-aagagctggcctacctg-3' (SEC ID Nº: 360) F3-602 5'-agctggcctacctgaag-3' (SEC ID Nº: 361)
Cebador R3: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región R3)
R3-601 5'-tcggacctgctcatctg-3' (SEC ID Nº: 381) R3-602 5'-tcagtaacctcggacctg-3' (SEC ID Nº: 382) R3-603 5'-agtaacctcggacctgc-3' (SEC ID Nº: 383) R3-604 5'-taacctcggacctgctc-3' (SEC ID Nº: 384)
Cebador de bucle: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región del bucle F o bucle R)
LPF-601 5'-actgacctggcctccca-3' (SEC ID Nº: 397)
LPF-602 5'-cctcccacttggccc-3' (SEC ID Nº: 398) LPR-601 5'-tcatggccgagcagaacc-3' (SEC ID Nº: 411) LPR-602 5'-catggccgagcagaac-3' (SEC ID Nº: 412)
(Ejemplo 3-1) (Referencia) Selección de región a partir de la secuencia de bases de CK20 humana
La secuencia de bases de CK20 humana representada por la SEC ID Nº: 435 se investigó por respecto a las posiciones de regiones apropiadas para el método LAMP usando un software de diseño de sondas. Como resultado de la selección de regiones de acuerdo con el criterio de que Tm 58,5-63,5ºC para F1c y R1c, Tm 61,5-62,5ºC para F2 y R2, y Tm 58,5-62,5ºC para F3 y R3, se seleccionan las regiones indicadas a continuación. Las regiones seleccionadas se incluyen en una región de posición de bases 340-1050 de la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 435 y una región de cadena complementaria de la misma. F1c: Regiones en cadena complementaria de secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 435.
920-900 5'-ttcatgctgagatgggactgg-3' (SEC ID Nº: 436) 915-895 5'-gctgagatgggactggagttc-3' (SEC ID Nº: 437) 436-416 5'-caatttgcaggacacaccga g-3' (SEC ID Nº: 438)
F2: Regiones en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 435

847-865

5'-gaggttcaactaacggagc-3' (SEC ID Nº: 439)

850-869

5'-gttcaactaacggagctgag-3' (SEC ID Nº: 440)

855-872

5'-actaacggagctgagacg-3' (SEC ID Nº: 441)

370-388

5'-attgaagagctgcgaagtc-3' (SEC ID Nº: 442)

F3: Regiones en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 435 5
10
15
20
25
30
35
40 345-367 5'-cgactacagtgcatattacagac-3' (SEC ID Nº: 443) 805-822 5'-caacaacaggtcacagtg-3' (SEC ID Nº: 444)
R1c: Regiones en la secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 435
940-958 5'-ctagaggagaccaaggccc-3' (SEC ID Nº: 445) 939-958 5'-tctagaggagaccaaggccc-3-(SEC ID Nº: 446) 947-966 5'-agaccaaggcccgttacagc-3' (SEC ID Nº: 447) 452-972 5'-ctgctgaggacttcagactga-3' (SEC ID Nº: 448)
R2: Regiones en cadena complementaria de secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 935.
1004-987 5'-agagagctcaacagcgac-3' (SEC ID Nº: 449) 1007-990 5'-tccagagagctcaacagc-3' (SEC ID Nº: 950) 994-978 5'-acagcgactggaggttg-3' (SEC ID Nº: 451) 1000-984 5'-agctcaacagcgactgg-3' (SEC ID Nº: 452) 523-505 5'-cttggagatcagcttccac-3' (SEC ID Nº: 453)
R3: Regiones en cadena complementaria de secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 435
556-535 5'-gtagggttaggtcatcaaagac-3' (SEC ID Nº: 454) 1044-1027 5'-gcgttccatgttactccg-3' (SEC ID Nº: 455)
Bucle F: Regiones en cadena complementaria de secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 435
409-389 5'-gcagttgagcatccttaatct-3' (SEC ID Nº: 456) 891-875 5'-ctcaaggctctgggagg-3' (SEC ID Nº: 457) Bucle R: Regiones en secuencia de bases representada por la SEC ID Nº: 435 480-499 5'-gactgagagaggaatacgtc-3' (SEC ID Nº: 458) 968-985 5'-gccagttagccaacctcc-3' (SEC ID Nº: 459) 970-985 5'-cagttagccaacctcc-3' (SEC ID Nº: 460)
(Ejemplo 3-2) (Referencia) Diseño de Cebador para Detectar CK20
A partir de las secuencias de las regiones seleccionadas en el Ejemplo 3-1, se obtuvieron los siguientes cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos a aplicar al método LAMP.
FIP: Secuencias de bases de Regiones F1c y F2 Acopladas KFA-5 5'-ttcatgctgagatgggactgggaggttcaactaacggagc-3' (SEC ID Nº: 461) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 436 y la SEC ID Nº: 439 están acopladas) KFA-5 a 5'-ttcatgctgagatgggactgggttcaactaacggagctgag-3' (SEC ID Nº: 462) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 436 y la SEC ID Nº: 440 están acopladas) KFA-5b 5'-ttcatgctgagatgggactggactaacggagctgagacg-3' (SEC ID Nº: 463) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 436 y la SEC ID Nº: 441 están acopladas) KFA-5d5'-gctgagatgggactggagttcgaggttcaactaacggagc-3' (SEC ID Nº: 464) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 437 y la SEC ID Nº: 439 están acopladas) KFA-5e 5'-gctgagatgggactggagttcgttcaactaacggagctgag-3' (SEC ID Nº: 465) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 437 y la SEC ID Nº: 440 están acopladas) KFA-5f 5'-gctgagatgggactggagttcactaacggagctgagacg-3' (SEC ID Nº: 466) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 437 y la SEC ID Nº: 441 están acopladas) AFA5'-caatttgcaggacacaccgagattgaagagctgcgaagtc-3' (SEC ID Nº: 467) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 438 y la SEC ID Nº: 442 están acopladas) RIP: Secuencias de bases de Regiones R1c y R2 Acopladas KRA-5 5'-ctagaggagaccaaggcccagagagctcaacagcgac-3' (SEC ID Nº: 468) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 445 y la SEC ID Nº: 449 están acopladas) KRA-5a 5'-tctagaggagaccaaggccctccagagagctcaacagc-3' (SEC ID Nº: 469) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 446 y la SEC ID Nº: 450 están acopladas) KRA-5c 5'-tctagaggagaccaaggcccacagcgactggaggttg-3'(SEC ID Nº: 470) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 446 y la SEC ID Nº: 451 están acopladas) KRA-5d 5'-agaccaaggcccgttacagcagagagctcaacagcgac-3' (SEC ID Nº: 471) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 447 y la SEC ID Nº: 449 están acopladas) KRA-5e 5'-agaccaaggcccgttacagctccagagagctcaacagc-3' (SEC ID Nº: 472) (Las secuencias de bases de la
SEC ID Nº: 447 y la SEC ID Nº: 450 están acopladas) KRA-5f 5'-agac caaggcccgttacagcagctcaacagcgactgg-3' (SEC ID Nº: 473) (Las secuencias de bases de la SEC ID Nº: 447 y la SEC ID Nº: 452 están acopladas) ARAf 5'-ctgctgaggacttcagactgacttggagatcagcttccac-3' (SEC ID Nº: 474) (Las secuencias de bases de la SEC ID
5 Nº: 448 y la SEC ID Nº: 453 están acopladas)
Cebador F3: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región F3)
AF3 5'-cgactacagtgcatattacagac-3' (SEC ID Nº: 443) KF3-5 5'-cagcaacaggtcacagtg-3' (SEC ID Nº: 444)
10 Cebador R3: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región R3)
AR3 5'-gtagggttaggtcatcaaagac-3' (SEC ID Nº: 454) KR3-5 5'-gcgttccatgttactccg-3' (SEC ID Nº: 455)
Cebador de bucle: (secuencia idéntica a secuencia de bases de la región de bucle F o bucle R)
LPF2 5'-gcagttgagcatccttaatct-3' (SEC ID Nº: 456) K-LPF2 5'-ctcaaggctctgggagg-3' (SEC ID Nº: 457) LPR6 5’-gactgagagaggaatacgtc-3' (SEC ID Nº: 458) K-LPR1 5'-gccagttagccaacctcc-3' (SEC ID Nº: 459) K-LPR2 5'-cagttagccaacctcc-3' (SEC ID Nº: 460)
15 EJEMPLOS DE ENSAYO
Se midieron los efectos obtenidos cuando se realiza el método RT-LAMP usando diferentes cebadores para detectar CK18, CK19 o CK20 obtenidos anteriormente y se determinaron de acuerdo con los ejemplos de Ensayo 1 a 3.
20 (Ejemplo de ensayo 1-1) (Referencia) Observación de Amplificación
Este ensayo se realizó para examinar el tiempo necesario desde el inicio de la reacción hasta que pudo observarse amplificación; en todos los casos, la medición se realizó por el método RT-LAMP usando la siguiente combinación
25 de diversos cebadores para detectar CK18 humana.
1) Método para preparar muestra de ARN de CK18 humana
Realizando RT-PCR usando un cebador diseñado basándose en una secuencia de bases de CK18 humana, se aisló
30 ADNc de CK18 humana a partir de ARN total derivado de KATOIII (células de cáncer de estómago). A partir de ADNc de CK18 humana clonado en pBluescript (plásmido fabricado por STRATAGENE), se sintetizó un producto de transcripción usando un sistema de transcripción in vitro (sistema de transcripción in vitro Riboprobe (fabricado por Promega)). La concentración de ARN de la solución no diluida obtenida de esta manera se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm y, basándose en el resultado, la solución se diluyó en 50 ng/µl de ARN de levadura (fabricado
35 por Ambion) de forma que el número de copias del ARN de CK18 humana fue 60000, 6000, 600, 60, 6 y 0 (control), que se usaron como soluciones de molde.
2) Conjunto de cebadores para detectar CK18 humana
40 Se usó una diversidad de cebadores en las combinaciones mostradas en la Tabla 1.
(Tabla 1) Conjunto de cebadores (Cada número representa el número de SEC ID, y cada cebador significa un cebador que comprende una secuencia representada por cada número de SEC ID) Conjunto de cebadores I II III IV
FIP 234 252 259 278
RIP 287 297 307 332 Cebador F3 66 68 72 79 Cebador R3 179 182 184 193 Cebador de bucle (bucle F) 203 211 212 214 Cebador de bucle (bucle R) 220 223 226 228
3) Composición de solución de reacción dNTP (fabricados por GIBCO) 0,4 mM MgS04 2 mM Ditiotreitol 5 mM Betaína (fabricado por Sigma) 640 mM Tampón Thermopol (fabricado por New England BioLabs) 0,125 mg/ml Transcriptasa inversa de AMV (fabricada por Promega) 1,25 U ADN polimerasa de Bst (fabricada por New England BioLabs) 16 U Bromuro de etidio
Cebador FIP 40 pmol, RIP 40 pmol,
Cebador F3 5 pmol, Cebador R3 5 pmol, Cebador de bucle (bucle F, bucle R) cada uno 20 pmol
4) Método RT-LAMP
5 A 23 µl de solución de reacción que contenía los seis tipos de cebadores anteriores, se añadieron 2 µl de muestra de ARN de CK18 humana y la mezcla se calentó a 65ºC durante una hora.
5) Observación de amplificación
10 Como el producto amplificado tiene una estructura bicatenaria, el bromuro de etidio se intercala en la estructura bicatenaria para emitir fluorescencia. El aumento de intensidad de fluorescencia (Rn) se midió a tiempo real usando PRISM 7700 fabricado por ABI.
6) Resultados
15 Los resultados de los casos en los que se usaron respectivamente los conjuntos de cebadores I a IV se muestran en las FIG. 1 a 4. Estos resultados demuestran que cuanto mayor es la cantidad de molde de CK18 humana, más corto es el tiempo necesario hasta que puede observarse la amplificación, en cada conjunto. En los conjuntos de cebadores I y III, se observó amplificación en 20 minutos incluso en el caso de 600 copias, mientras que en el
20 conjunto de cebadores II, la amplificación se observó después de aproximadamente 20 minutos en el caso de 6000 copias. Como ocurre en el caso del conjunto de cebadores IV, se observó amplificación después de aproximadamente 20 minutos en el caso de 6000 copias, y después de aproximadamente 30 minutos incluso en el caso de 600 copias.
25 (Ejemplo de ensayo 1-2) (Referencia) Efecto de cebador de bucle
Entre los conjuntos de cebadores considerados en el Ejemplo de ensayo 1-1, se seleccionó el conjunto de cebadores I en el que el tiempo necesario para la observación de la amplificación fue más corto, y se realizó un ensayo para examinar la sensibilidad en presencia/ausencia de un cebador de bucle.
30 1) Método para preparar muestra de ARN de CK18 humana
Se prepararon muestras que tenían números de copias de 60000, 6000, 600 y 0 (control) de una manera similar a la descrita en el Ejemplo de ensayo 1-1.
35 2) Conjunto de cebadores
Se usaron el conjunto de cebadores I mostrado en la Tabla 1 y un conjunto de cebadores excluyendo cada cebador de bucle del conjunto de cebadores I.
40 3) Composición de solución de reacción.
Se usó una solución de reacción similar a la del Ejemplo de ensayo 1-1, y en cuanto el conjunto que excluía el cebador de bucle, no se añadió ningún cebador de bucle.
45 4) Método RT-LAMP
A 23 µl de solución de reacción que contenía seis o cuatro tipos de cebadores, se añadieron 2 µl de muestra de ARN de CK18 humana y la mezcla se calentó a 65ºC durante una hora.
50 5) Observación de amplificación
La medición se realizó a tiempo real de una manera similar al Ejemplo de ensayo 1-1. 6) Resultados Los resultados de la determinación se muestran en las FIG. 5 y 6. Estos resultados demuestran que el tiempo
necesario hasta que pudo observarse la amplificación fue menor en el caso en el que no se usó un cebador de bucle. Sin embargo, incluso en el caso en el que se usó un cebador de bucle, se observó amplificación de CK18 humana después de aproximadamente 50 minutos incluso en el caso de 60000 copias.
(Ejemplo 1-3) (Referencia) Especificidad de amplificación para CK18 humana Se examinó la especificidad de amplificación para CK18 humana cuando la medición se realizó usando el conjunto de cebadores I. Se sabe que las citoqueratinas (CK) tienen isoformas tales como CK19, 20 humanas y similares aparte de CK18 humana. Estas isoformas comprenden una secuencia de bases que tienen una homología de aproximadamente un 60% con CK18 humana. Este ensayo se realizó para determinar si la CK18 humana podía
ensayarse de forma distinguible de la CK19 o 20 humanas cuando la medición se realizaba usando el conjunto de cebadores anterior. 1) Método para preparar muestra de ARN Se preparó una muestra de ARN de CK18 humana que tenía un número de copias de 60000 de una manera similar
a la descrita en el Ejemplo de ensayo 1-1. También con respecto a los ARN de CK19 humana y CK20 humana, se prepararon muestras de una manera similar. 2) Conjunto de cebadores Se usó el conjunto de cebadores I mostrado en la Tabla 1. 3) Composición de solución de reacción Se usó una solución de reacción similar a la del Ejemplo de ensayo 1-1. 4) Método RT-LAMP Se usaron condiciones similares a las descritas en el Ejemplo de ensayo 1. 5) Observación de amplificación. La medición se realizó a tiempo real de una manera similar al Ejemplo de ensayo 1-1.
6) Resultados Los resultados se muestran en la FIG. 7. Estos resultados demuestran que el ARN de CK18 humana, pero no el ARN de CK19 humana ni el ARN de CK20 humana se amplificaron cuando se usó el conjunto de cebadores I, revelando especificidad del conjunto de cebadores I por el ARN de CK18 humana.
(Ejemplo de ensayo 2-1) (Referencia) Efecto de conjuntos de cebadores (Grupo A) para detectar CK19 humana
Este ensayo se realizó para examinar un patrón de amplificación cuando se midió el ARN de CK19 humana por el método RT-LAMP usando un conjunto de cebadores seleccionado del Grupo A mostrado en el Ejemplo 2-2. 1) Conjunto de cebadores (Grupo A) El examen se realizó usando un conjunto de cebadores que consistía en FIP: FA-401, RIP: RA-401, F3: F3-401 y
R3: R3-401, y un conjunto de cebadores en combinación con diversos cebadores de bucle: LPF-401 y LPR-401, LPF-401 y LPR-402, LPF-401 y LPR-403 o LPF-401 y LPR-404.
2) Método para preparar ARN de CK19 humana Al realizar RT-PCR usando un cebador diseñado basándose en una secuencia de bases de CK19 humana, se aisló ADNc de CK19 humana a partir del ARN total derivado de KATOIII (células de cáncer de estómago). A partir del ADNc de CK19 humana clonado en pBluescript (plásmido fabricado por STRATAGENE), se sintetizó un producto de transcripción usando un sistema de transcripción in vitro (sistema de transcripción in vitro Riboprobe (fabricado por Promega)). La concentración de ARN de la solución no diluida obtenida de esta manera se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm y, basándose en el resultado, la solución se diluyó en 50 ng/µl de ARN de levadura (fabricado
por Ambion) de forma que el número de copias del ARN de CK19 humana fue 60000, 6000, 600, 60, 6 y 0 (control), que se usaron como soluciones de molde.
3) Composición de solución de reacción
Se usó una solución de reacción similar a la del Ejemplo de ensayo 1-1 y, en cuanto al conjunto que excluía el cebador de bucle, no se añadió un cebador de bucle.
4) Método RT-LAMP
A 23 µl de solución de reacción que contenía cuatro tipos de cebadores que no incluía cebadores de bucle o que contenía seis tipos de cebadores incluyendo cebadores de bucle, se añadieron 2 µl de muestra de ARN de CK19 humana, y la mezcla se calentó a 65ºC durante una hora.
5) Observación de amplificación
La medición se realizó a tiempo real de una manera similar a la del Ejemplo de ensayo 1-1.
6) Resultados
Los resultados obtenidos para el conjunto de cebadores que no incluía cebadores de bucle y el conjunto de cebadores que incluía diversos cebadores de bucle se muestran en las FIG. 8 a 12. Estos resultados demuestran que el tiempo necesario hasta que pudo observarse amplificación fue de aproximadamente 40 minutos después de iniciar el ensayo cuando no se usaron cebadores de bucle. Por otra parte, como se muestra en las FIG. 9 a 12, en el caso de los sistemas que incluyen cebadores de bucle, pudo observarse amplificación aproximadamente entre 10 minutos y 20 minutos.
(Ejemplo de ensayo 2-2) (Referencia) Efecto de conjunto de cebadores (Grupo C) para detectar CK19 humana
Este ensayo se realizó para examinar un patrón de amplificación cuando se midió ARN de CK19 humana por el método RT-LAMP usando un conjunto de cebadores seleccionado del Grupo A mostrado en el Ejemplo 2-2.
1) Conjunto de cebadores (Grupo C)
Se realizó un examen usando un conjunto de cebadores consistente en: FIP: FA-1101, RIP: RA-1101, F3: F3-1101 y R3: R3-1101, y un conjunto de cebadores en combinación con diversos cebadores de bucle: LPF-1101 y LPR-1101, LPF-1101 y LPR-1102, LPF-1101 y LPR-1103, LPF-1101 y LPR-1104, LPF-1102 y LPR-1101 o LPF-1103 y LPR1101.
2) Preparación de muestra de ARN de CK19 humana
Siguiendo la operación mostrada en el Ejemplo de ensayo 2-1, se prepararon muestras de forma que los números de copias fueran 60000, 6000, 600, 60 y 0 (control), respectivamente.
3) La composición de la solución de reacción, 4) el método RT-LAMP y 5) la observación de la amplificación se realizaron de una manera similar al Ejemplo de ensayo 2-1.
6) Resultados
Los resultados obtenidos para el conjunto de cebadores que no incluía cebadores de bucle y el conjunto de cebadores que incluía diversos cebadores de bucle se muestran en las FIG. 13 a 19. Estos resultados demuestran que cuando no se usaban cebadores de bucle, el tiempo necesario hasta que pudo observarse la amplificación fue de aproximadamente 30 minutos después de iniciar el ensayo (FIG. 13). Por otra parte, en los sistemas que usan cebadores de bucle, pudo observarse amplificación aproximadamente entre 10 minutos y 20 minutos, cuando se combinaron con LPF-1101 y LPR-1101 (FIG. 14), LPF-1101 y LPR-1102 (FIG. 15), LPF-1101 y LPR-1104 (FIG. 17), LPF-1102 y LPR-1101 (FIG. 18) o LPF-1103 y LPR-1101 (FIG. 19). Cuando se combinaron con LPF-1101 y LPR1103 (FIG. 16) pudo observarse amplificación aproximadamente a 20 minutos.
(Ejemplo de ensayo 2-3) (Referencia) Efecto de conjuntos de cebadores (Grupo D) para detectar CK19 humana
Este ensayo se realizó para examinar el patrón de amplificación cuando se midió el ARN de CK19 humana por el método RT-LAMP usando un conjunto de cebadores seleccionado del Grupo D mostrado en el Ejemplo 2-2.
1) Conjunto de cebadores (Grupo D)
El examen se realizó usando un conjunto de cebadores que consistía en FIP: FA-601, RIP: RA-604, F3: F3-601 y
R3: R3-601, y un conjunto de cebadores en combinación con diversos cebadores de bucles: LPF-601 y LPR-601.
2) Preparación de muestra de ARN de CK19 humana
Después de la operación mostrada en el Ejemplo de ensayo 2-1, se prepararon muestras de forma que los números de copias fueran 60000, 6000, 600, 60 y 0 (control), respectivamente.
3) La composición de la solución de reacción, 4) el método RT-LAMP y 5) la observación de la amplificación se realizaron de una manera similar al Ejemplo de ensayo 2-1.
6) Resultados
Los resultados obtenidos para el conjunto de cebadores que no incluía cebadores de bucle y el conjunto de cebadores que incluía diversos cebadores de bucle se muestran en la FIG. 20 y FIG. 21, respectivamente. Estos resultados demuestran que cuando no se usaron cebadores de bucle, el tiempo necesario hasta que pudo observarse la amplificación de ácidos nucleicos fue de aproximadamente 70 minutos. Además, incluso para el número de copias de 0, se observó una amplificación no específica, sugiriendo una especificidad ligeramente baja. Por otra parte, cuando se usaron cebadores de bucle, pudo observarse amplificación aproximadamente a los 20 minutos, y no se observó amplificación no específica para el número de copias de 0. La especificidad se mejoró mediante el uso de cebadores de bucle.
(Ejemplo de ensayo 2-4) Medición de sensibilidad
Este ensayo se realizó para examinar la sensibilidad de medición de ARN de CK19 humana cuando la medición se realizó usando cada conjunto de cebadores seleccionado del Grupo A, C y D mostrados en los Ejemplos de ensayo 2-1 a 2-3, o un conjunto de cebadores seleccionado del Grupo B.
1) Conjunto de cebadores
Grupo A: FIP: FA-401, RIP: RA-401, F3: F3-401, R3: R3-401, Cebador de bucle: LPF-401, LPR-404
Grupo B: FIP: FA1-EK, RIP: RA6-EK, F3: F3-EK, R3: R3-EK, Cebador de bucle: LPFL-EK, LPR2-EK
Grupo C: FIP: FA-1101, RIP: RA-1101, F3: F3-1101, R3: R3-1101, Cebador de bucle: LPF-1101, LPR-1101
Grupo D: FIP: FA-601, RIP: RA-604, F3: F3-601, R3: R3-601, Cebador de bucle: LPF-601, LPR-601
2) Preparación de muestra de ARN de CK19 humana
Siguiendo la operación mostrada en el Ejemplo de ensayo 2-1, se prepararon muestras de forma que los número de copias fueran de 60000, 20000, 6000, 2000, 600, 200, 60, 20 y 0 (control), respectivamente.
3) La composición de la solución de reacción, 4) el método RT-LAMP y 5) la observación de amplificación se realizaron de una manera similar al Ejemplo de ensayo 2-1.
6) Resultados
Los resultados se muestran en las FIG. 22 a 25. Estos resultados demuestran que en todos los grupos de conjuntos de cebadores, cuanto mayor es el número de copias menor es el tiempo necesario hasta que puede observarse la amplificación de ácidos nucleicos, y se observó amplificación aproximadamente a 15-25 minutos cuando el número de copias fue de 60000. En cuanto al Grupo A, se observó amplificación a 20-30 minutos cuando el número de copias fue de 200 o mayor (FIG. 22); en cuanto al Grupo B, se observó amplificación a 15-20 minutos cuando el número de copias fue de 200 o mayor (FIG. 23), en cuanto al Grupo C, se observó amplificación a 15-25 minutos cuando el número de copias fue de 600 o mayor (FIG. 24); y en cuanto al Grupo D, se observó amplificación a 25-35 minutos cuando el número de copias fue de 200 o mayor (FIG. 25).
(Ejemplo de ensayo 2-5) Especificidad de amplificación por ARN de CK19 humana
La especificidad de amplificación por ARN de CK19 humana se examinó cuando la medición se realizó usando cada conjunto de cebadores mostrado en el Ejemplo de ensayo 2-4. Se sabe que las citoqueratinas (CK) tienen isoformas tales como CK18, 20 humanas y similares además de CK19 humana. Estas isoformas comprenden una secuencia de bases que tiene aproximadamente un 60% de homología con CK19 humana. Este ensayo se realizó para determinar si CK19 humana podía ensayarse de forma distinguible de CK18 o 20 humanas cuando la medición se realizó usando el conjunto de cebadores anterior.
1) Conjunto de cebadores
El examen se realizó para el mismo conjunto de cebadores que se usó en el Ejemplo de ensayo 2-4.
2) Preparación de muestra de ARN
Se prepararon muestras de ARN de CK19 humana de forma que los números de copias fueran 60000, 6000, 600 y 0 (control) realizando una operación similar a la del Ejemplo de ensayo 2-1. En cuanto a los ARN de CK18 humana y 5 CK20 humana, se prepararon muestras de una manera similar de forma que los números respectivos de copias fueran 60000.
3) La composición de la solución de reacción, 4) el método RT-LAMP y 5) la observación de la amplificación se realizaron de una manera similar al Ejemplo de ensayo 2-1. 10 6) Resultados
Las FIG. 26 a 29 muestran resultados usando cada conjunto de cebadores mostrado en el Ejemplo de ensayo 2-4. Estos resultados demuestran que el ARN de CK19 humana, pero no el ARN de CK18 humana ni el ARN de CK20 15 humana se amplifican cuando se usa cualquier grupo de conjunto de cebadores.
(Ejemplo de ensayo 2-6) (Referencia) Observación de amplificación con respecto al ARN de CK19 humana (medición de turbidez)
20 1) Conjunto de cebadores (Grupo C)
Se realizó el examen para un conjunto de cebadores usando FIP: FA-1101, RIP: RA-1101, F3: F3-1101, R3: R31101 y cebadores de bucle: LPF-1101 y LPR-1101 en combinación.
25 2) Preparación de muestra de ARN de CK19 humana
Se prepararon muestras de forma que los números de copias fueran 100000, 10000, 1000 y 0 (control) realizando una operación similar a la del Ejemplo de ensayo 2-1.
30 3) Composición de solución de reacción
dNTPs (fabricado por GIBCO) 0,4 mM MgSO4 2 mM Ditiotreitol 5 mM Betaína (fabricado por Sigma) 640 mM Tampón Thermopol (fabricado por New England BioLabs) Transcriptasa inversa de AMV (fabricada por Promega) 1,25 U Bst ADN polimerasa (fabricada por New England BioLabs) 16 U Tergitol (fabricado por Sigma) 1%
Cebador FIP 40 pmol, RIP 40 pmol, Cebador F3 5 pmol, Cebador R3 5 pmol,
Cebador de bucle (bucle F, bucle R) cada uno 20 pmol Tris HCI (pH 8) 60 mM
4) El método RT-LAMP se realizó de la manera descrita en el Ejemplo de ensayo 2-1. La reacción se dejó durante 35 1,5 horas en un tubo de 0,2 ml a 65ºC.
5) Observación de la amplificación
Se determinó la turbidez de la reacción RT-LAMP a lo largo del tiempo a partir de la absorbancia a una longitud de 40 onda de 500 nm. Como máquina de medición se usó LA-200 fabricada por Teramecs.
6) Resultados
Los resultados se muestran en la FIG. 30. Dependiendo del número de copias del molde, el inicio de la amplificación 45 se observó entre 11 y 13 minutos después de iniciar la medición.
(Ejemplo de ensayo 2-7) (Referencia) Observación de amplificación con respecto a ARN de CK19 humana (medición de turbidez)
50 1) Conjunto de cebadores (Grupo C) Se realizó el examen para un conjunto de cebadores usando FIP: FA-1101, RIP: RA-1101, F3: F3-1101, R3: R31101 y cebadores de bucle: LPF-1101 y LPR-1101 en combinación, y para el conjunto de cebadores al que se añadió inhibidor de RNasa.
5 2) Preparación de muestra de ARN de CK19 humana
Se prepararon muestras de forma que los números de copias fueran 100000, 10000, 1000 y 0 (control) realizando una operación similar a la del Ejemplo de ensayo 2-1.
10 3) Composición de solución de reacción
Se usó una solución de reacción que tenía una composición similar a la del Ejemplo de ensayo 2-6 con la excepción de que se añadieron 25 U de inhibidor de RNasa (fabricado por TOYOBO).
15 4) El método RT-LAMP y 5) la observación de la amplificación se realizaron de una manera similar al Ejemplo de ensayo 2-6.
6) Resultados
20 Los resultados se muestran en la FIG. 31. Dependiendo del número de copias del molde, se observó el inicio de la amplificación entre 10 y 12 minutos después de iniciar la medición. Al añadir inhibidor de RNasa, se redujo la influencia de las sustancias que inhiben la reacción de amplificación, de forma que se redujo el tiempo necesario hasta que pudo observarse la amplificación.
25 (Ejemplo de ensayo 3-1) (Referencia)
Este ensayo se realizó para examinar el tiempo necesario hasta que pudo observarse la amplificación desde el inicio de la reacción para cada conjunto de cebadores, medido por el método RT-LAMP usando las siguientes
30 combinaciones de cebadores a partir de los diversos cebadores mostrados en el Ejemplo 3-2.
1) Método para preparar muestra de ARN de CK20 humana
Al realizar RT-PCR usando un cebador diseñado basándose en una secuencia de bases de CK20 humana, se aisló
35 ADNc de CK20 humana a partir de ARN total derivado de KATOIII (células de cáncer de estómago). A partir de ADNc de CK20 humana clonado en pBluescript (plásmido fabricado por STRATAGENE), se sintetizó un producto de transcripción usando un sistema de transcripción in vitro (sistema de transcripción in vitro Riboprobe (fabricado por Promega)). La concentración de ARN de la solución no diluida obtenida de esta manera se determinó midiendo la absorbancia a 260 nm y, basándose en los resultados, la solución se diluyó en 50 ng/µl de ARN de levadura
40 (fabricado por Ambion) de manera que el número de copias de ARN de CK20 humana fue 600000, y estas soluciones se usaron como soluciones de molde.
2) Conjunto de cebadores
45 En la Tabla 2 se muestra una diversidad de cebadores que se usaron en las combinaciones.
(Tabla 2) Puede observarse el conjunto de cebadores y el tiempo necesario hasta la amplificación FIP RIP Cebador F3 Cebador Tiempo R3 (min) KFA-5 KRA-5 KF3-5 KR3-5 25
KFA-5a KRA-5 KF3-5 KR3-5 26 KFA-5b KRA-5 KF3-5 KR3-5 23 KFA-5d KRA-5 KF3-5 KR3-5 26 KFA-5e KRA-5 KF3-5 KR3-5 25 KFA-5f KRA-5 KF3-5 KR3-5 24 KFA-5 KRA-5a KF3-5 KR3-5 30 KFA-5 KRA-5b KF3-5 KR3-5 35 KFA-5 KRA-5d KF3-5 KR3-5 30 KFA-5 KRA-5e KF3-5 KR3-5 36 KFA-5 KRA-5f KF3-5 KR3-5 40
3) Composición de la solución de reacción 50
Se usó una composición similar a la del Ejemplo de ensayo 1-1, y no se añadieron cebadores de bucle
4) Método RT-LAMP
A 23 µl de solución de reacción que contenía los cuatro cebadores anteriores, se añadieron 2 µl de muestra de ARN de CK20 humana y la mezcla se calentó a 65ºC durante una hora.
5) Observación de amplificación
La medición se realizó a tiempo real de una manera similar a la del Ejemplo de ensayo 1-1
6) Resultados
El tiempo necesario hasta la amplificación pudo observarse cuando la reacción se realizó usando cada conjunto de cebadores y se muestra en la Tabla 2. Estos resultados muestran que el tiempo máximo es 40 minutos y la amplificación se confirmó en 30 minutos en la mayoría de los conjuntos de cebadores.
(Ejemplo de ensayo 3-2) (Referencia)
Este ensayo se realizó para examinar la sensibilidad cuando se realizó la medición por el método RT-LAMP usando un conjunto de cebadores que requería un tiempo corto de observación de amplificación seleccionado a partir de los conjuntos de cebadores examinados en el Ejemplo de ensayo 3-1, y usando un conjunto de cebadores combinado con cebadores de bucle.
1) Método para preparar muestra de ARN de CK20 humana
Se prepararon muestras de forma que los números de copias fueran 0, 190, 960, 4800, 24000, 120000 y 600000 respectivamente realizando una operación similar a la del Ejemplo de ensayo 3-1.
2) Conjunto de cebadores
Se realizó el examen para los conjuntos de cebadores de las siguientes combinaciones
Conjunto 1: FIP (KFA-5b), RIP (KRA-5)
Cebador F3 (KF3-5), Cebador R3 (KR3-5)
Cebadores de bucle (K-LPF2, K-LPR1)
Conjunto 2: FIP (KFA-5b), RIP (KRA-5)
Cebador F3 (KF3-5), Cebador R3 (KR3-5)
Cebadores de bucle (K-LPF2, K-LPR2)
3) Composición de la solución de reacción
Se usó una composición similar a la del Ejemplo de ensayo 1-1.
4) El método RT-LAMP y 5) la observación de la amplificación se realizaron de una manera similar a la del Ejemplo de ensayo 3-1.
6) Resultados
El resultado del examen en cuanto al conjunto de cebadores 1 se muestra en la FIG. 32. El resultado muestra que cuanto mayor es la cantidad de molde de ARN de CK20 humana, más corto es el tiempo necesario hasta que puede observarse la amplificación. Sin embargo, incluso en el caso en el que la cantidad de molde fue de 190 copias, se observó amplificación de ADN en 30 minutos, e incluso en el caso en el que la cantidad de molde era de 600000 copias, se observó amplificación de ADN aproximadamente a los 10 minutos. Se obtuvo un resultado similar para el caso del conjunto de cebadores 2.
(Ejemplo de ensayo 3-3) (Referencia) Especificidad de amplificación por ARN de CK20 humana
Se examinó la especificidad de amplificación por CK20 humana cuando la medición se realizó usando los conjuntos de cebadores seleccionados en el Ejemplo de ensayo 3-2. Se demuestra que las citoqueratinas (CK) tienen isoformas tales como CK18, 19 humanas y similares aparte de CK20 humana. Estas isoformas comprenden una secuencia de bases que tiene aproximadamente un 60% de homología con CK20 humana. Este ensayo se realizó para determinar si CK20 humana podía ensayarse de forma distinguible de CK18 o 19 humanas cuando la medición se realizó usando los conjuntos de cebadores de acuerdo con la presente invención.
1) Método para preparar una muestra de ARN Se preparó una muestra de ARN de CK20 humana que tenía un número de copias de 600000 de una manera similar a la descrita en el Ejemplo de ensayo 3-1. En cuanto los ARN de CK18 humana y CK19 humana, las muestras se prepararon de una manera similar.
2) Conjunto de cebadores Se usaron los conjuntos de cebadores 1 y 2 seleccionados en el Ejemplo de ensayo 3-2. 3) La composición de la solución de reacción, 4) el método RT-LAMP y 5) la observación de amplificación se
realizaron de una manera similar al Ejemplo de ensayo 3-2. 6) Resultados En la FIG. 33 se muestra un resultado del examen en relación con el conjunto de cebadores 1. El resultado
demuestra que el ARN de CK20 humana, pero no el ARN de CK18 humana ni el ARN de CK19 humana se amplifican cuando se usa el conjunto de cebadores 1, revelando especificidad por el ARN de CK20 humana. Se obtuvo un resultado similar para el caso del conjunto de cebadores 2.
(Ejemplo de ensayo 3-4) (Referencia) Sensibilidad de medición
Este ensayo se realizó para examinar la sensibilidad de medición para el ARN de CK20 humana, cuando la medición se realizó usando cada conjunto de cebadores. 1) Método para preparar una muestra de ARN de CK20 humana Se prepararon muestras de forma que los números de copias fueran 0, 190, 960, 4800, 24000, 120000 y 600000
respectivamente realizando una operación similar a la del Ejemplo de ensayo 3-1. 2) Conjunto de cebadores El examen se realizó para el conjunto de cebadores de la siguiente combinación.
Conjunto 3: FIP (AFA), RIP (ARAf), cebador F3 (AF3), cebador R3 (AR3) Cebadores de Bucle (LPF2, LPR6)
3) La composición de la solución de reacción, 4) el método RT-LAMP y 5) la observación de la amplificación se realizaron de una manera similar al Ejemplo de ensayo 3-2. 6) Resultados Los resultados del examen se muestran en la FIG. 34. Los resultados demuestran que cuanto mayor es la cantidad
de molde de ARN de CK20 humana, más corto es el tiempo necesario hasta que puede observarse la amplificación. Sin embargo, incluso en el caso en el que la cantidad de molde era de 190 copias, se observó amplificación de ADN en 30 minutos, e incluso en el caso en el que la cantidad de molde era de 600000 copias, se observó amplificación de ADN aproximadamente a los 10 minutos.
(Ejemplo de ensayo 3-5) (Referencia)
Este ensayo se realizó para examinar la especificidad de amplificación por ARN de CK20 humana cuando la medición se realizó usando el conjunto de cebadores seleccionado en el Ejemplo de ensayo 3-4. 1) Método para preparar muestra de ARN Se preparó una muestra de ARN de CK20 humana de forma que el número de copias fuera 600000. También se
prepararon muestras de ARN de CK18 y CK19 humanas de una manera similar. 2) Conjunto de cebadores Se seleccionó el conjunto de cebadores (conjunto 3) seleccionado en el Ejemplo de ensayo 3-4. 3) La composición de la solución de reacción, 4) el método RT-LAMP y 5) la observación de la amplificación se
realizaron de una manera similar al Ejemplo de ensayo 3-2. 6) Resultados Los resultados se muestran en la FIG. 35. Estos resultados demuestran que el ARN de CK20 humana, pero no el
ARN de CK18 humana ni el ARN de CK19 humana se amplifican por el conjunto de cebadores seleccionado.
Aplicabilidad Industrial
Como se ha descrito anteriormente, se descubrió que cuando se realiza el método LAMP usando un conjunto de cebadores de la presente invención, el ARN de CK19 humana puede amplificarse con eficacia y especificidad. De acuerdo con este descubrimiento, los conjuntos de cebadores de la presente invención permiten la detección de ARN de CK19 humana en un periodo corto, y se consigue una reducción del tiempo necesario para el diagnóstico de metástasis de cáncer en ganglios linfáticos usando medios de amplificación de ácidos nucleicos.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Sysmex Corporation
<120> Cebador CK
<130> GP03-1006PCT

<150>

JP P2002-145689 <151 > 21-05-2002

<150>

JP P2002-175271 <151 > 17-06-2002

<150>

JP P2002-199759 <151 > 09-07-2002

<160> 474
<170> Patentln versión 3.1
<210> 1
<211> 1412
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 1 <210> 2 imagen1
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 10
<400> 2 tgaagtaatg gctccagtct ctg 23
<210> 3 15 <211> 22
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 3 agtaatggct ccagtctctg ac 22
<210> 4
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 4 ttgaagtaat ggctccagtc tct 23
<210> 5
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 5 acctggggtc ccttctt 17
<210> 6
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 6 gggtcccttc ttctccaag 19
<210> 7
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 7 ggtcccttct tctccaagtg 20
<210> 8
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 8 gtcccttctt ctccaagtgc 20
<210> 9
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 9 tcccttcttc tccaagtgct 20
<210> 10
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 10 cccttcttct ccaagtgctc 20
<210> 11
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 11 ccttcttctc caagtgctcc 20
<210> 12
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 12 acagactggc gcatggc 17
<210> 13
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 13 tcaatgacct tgcggagcc 19
<210> 14
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 14 atcaatgacc ttgcggagcc 20
<210> 15
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 15 catcaatgac cttgcggagc 20
<210> 16
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 16 tcatcaatga ccttgcggag c 21
<210> 17
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 17 agcctcgatc tctgtctcc 19
<210> 18
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 18 gagctggcaa tctgggct 18
<210> 19
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 19 agctggcaat ctgggctt 18
<210> 20
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 20 gctggcaatc tgggcttg 18
<210> 21
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 21 ctggcaatct gggcttgtag g 21
<210> 22
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 22 tggcaatctg ggcttgtagg 20
<210> 23
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 23 ggcaatctgg gcttgtaggc 20
<210> 24
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 24 cacggtcaac ccagagc 17
<210> 25
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 25 gatcttggcg aggtcctga 19
<210> 26
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 26 cggatgtctg ccatgatctt g 21
<210> 27
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 27 ccagctcgtc atattgggcc 20
<210> 28
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 28 cagcagactg tgtggtgacc 20
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<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 29 gtgagcgtcg tctcagca 18
<210> 30
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 30 gctggccttc agatttctca tg 22
<210> 31
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 31 ccaggctcct cactctgtcc a 21
<210> 32
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 32 tccagtctct gacctggggt c 21
<210> 33
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 33 ctccacagac tggcgcatgg 20
<210> 34
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 34 gggcatctac ctccacggtc aa 22
<210> 35
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 35 gaccactgtg gtgctctcct c 21
<210> 36
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 36 cagctccaac ctcagcagac tg 22
<210> 37
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 37 ggtttgcatg gagttgctgc tg 22
<210> 38
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 38 gagagcaaaa tccggga 17
<210> 39
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 39 agagcaaaat ccgggag 17
<210> 40
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 40 gagcaaaatc cgggagc 17
<210> 41
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 41 aatccgggag cacttgg 17
<210> 42
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 42 gaggctggag agcaaaa 17
<210> 43
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 43 cgtcttgctg ctgatgac 18
<210> 44
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 44 gtcttgctgc tgatgactt 19
<210> 45
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 45 tagagtcaag tatgagacag agc 23
<210> 46
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 46 agagtcaagt atgagacaga gc 22
<210> 47
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 47 agtcaagtat gagacagagc t 21
<210> 48
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 48 gaacgacatc catgggc 17
<210> 49
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 49 cgaggctctc aaggagg 17
<210> 50
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 50 gaggctctca aggagga 17
<210> 51
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 51 aggctctcaa ggaggag 17
<210> 52
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 52 catgaagaag aaccacgaag 20
<210> 53
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 53 gcctacaagc ccagattg 18
<210> 54
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 54 gttgaccgtg gaggtag 17
<210> 55
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 55 ccccaaatct caggacc 17
<210> 56
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 56 accgagagga gctagac 17
<210> 57
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 57 aggagagcac cacagtg 17
<210> 58
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 58 gagctgagac gtacagtc 18
<210> 59
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 59 gagaccatgc aaagcctgaa 20
<210> 60
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 60 gaggctggag agcaaaatcc 20
<210> 61
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 61 cgtcttgctg ctgatgactt 20
<210> 62
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 62 ggaagtaaaa ggcctacaag cc 22
<210> 63
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 63 gaaccgagag gagctagaca a 21
<210> 64
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 64 gtctcagcag attgaggaga g 21
<210> 65
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 65 tggaagatgg cgaggacttt 20
<210> 66
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 66 ctggcctctt acctgga 17
<210> 67
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 67 aggagaccat gcaaagc 17
<210> 68
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 68 tcttcgcaaa tactgtggac 20
<210> 69
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 69 cagatcttcg caaatactgt g 21
<210> 70
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 70 tcgcaaatac tgtggacaa 19
<210> 71
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 71 caaatactgt ggacaatgcc 20
<210> 72
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 72 cgtcttgctg ctgatgac 18
<210> 73
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 73 agtcaagtat gagacagagc t 21
<210> 74
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 74 caccaatatc acacgactgc 20
<210> 75
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 75 catgaagaag aaccacgaag 20
<210> 76
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 76 agaaccacga agaggaag 18
<210> 77
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 77 gttgaccgtg gaggtag 17
<210> 78
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 78 cccaatatga cgagctgg 18
<210> 79
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 79 aggagctaga caagtactgg 20
<210> 80
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 80 caagtactgg tctcagcag 19
<210> 81
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 81 tctgctgagg ttggagc 17
<210> 82
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 82 gaggcatcca gaacgagaag 20
<210> 83
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 83 agcctggaga ccgagaac 18
<210> 84
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 84 aatgcccgca tcgttctg 18
<210> 85
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 85 ggaggagctg ctcttcatg 19
<210> 86
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 86 ccgggcccaa tatgacga 18
<210> 87
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 87 ccgagaggag ctagacaagt 20
<210> 88
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 88 tgagatcgcc acctaccg 18
<210> 89
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>

<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 89 gatcatcgag gacctgaggg 20
<210> 90
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 90 cagagactgg agccattact tca 23
<210> 91
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 91 gactggagcc attacttcaa gate 24
<210> 92
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 92 actggagcca ttacttcaag atca 24
<210> 93
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 93 ctggagccat tacttcaaga tcatc 25
<210> 94
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 94 tggagccatt acttcaagat catcg 25
<210> 95
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 95 ggagccatta cttcaagatc atcg 24
<210> 96
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 96 gagccattac ttcaagatca tcgag 25
<210> 97
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 97 agccattact tcaagatcat cgagg 25
<210> 98
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 98 gccattactt caagatcatc gagg 24
<210> 99
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 99 ccattacttc aagatcatcg aggac 25
<210> 100
<211> 25
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 100 cattacttca agatcatcga ggacc 25
<210> 101
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 101 agaacgacat ccatgggct 19
<210> 102
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 102 gaacgacatc catgggctc 19
<210> 103
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 103 aacgacatcc atgggctcc 19
<210> 104
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 104 acgacatcca tgggctcc 18
<210> 105
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 105 catgggctcc gcaaggt 17
<210> 106
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 106 tcacacgact gcagctgg 18
<210> 107
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 107 caccaatatc acacgactgc ag 22
<210> 108
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 108 tatcacacga ctgcagctgg 20
<210> 109
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 109 atcacacgac tgcagctgg 19
<210> 110
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 110 ttcatgaaga agaaccacga agag 24
<210> 111
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 111 agctctgggt tgaccgtg 18
<210> 112
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 112 gctctgggtt gaccgtg 17
<210> 113
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 113 ctctgggttg accgtgg 17
<210> 114
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 114 tctgggttga ccgtgga 17
<210> 115
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 115 ctgggttgac cgtggag 17
<210> 116
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 116 tgggttgacc gtggagg 17
<210> 117
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 117 ggttgaccgt ggaggtaga 19
<210> 118
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 118 gttgaccgtg gaggtagatg c 21
<210> 119
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 119 ttgaccgtgg aggtagatgc 20
<210> 120
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 120 tgaccgtgga ggtagatgc 19
<210> 121
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 121 gaccgtggag gtagatgcc 19
<210> 122
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 122 accgtggagg tagatgcc 18
<210> 123
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 123 gcccccaaat ctcaggac 18
<210> 124
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 124 cccaatatga cgagctggct 20
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 125 caagtactgg tctcagcaga ttg 23
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<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 126 tgctgagacg acgctcac 18
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<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 127 tgagacgtac agtccagtcc 20
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<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 128 acagcctgag ggaggtg 17
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<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 129 cgagaaccgg aggctggaga 20
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<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 130 agatcatcga ggacctgagg gc 22
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<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 131 gacatccatg ggctccgcaa 20
<210> 132
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 132 caggacctcg ccaagatcat gg 22
<210> 133
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 133 cacacagtct gctgaggttg ga 22
<210> 134
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 134 gagacgacgc tcacagagct g 21
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<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 135 ccacccgccg gatagtggat 20
<210> 136
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 136 gtcatcagca gcaagacg 18
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<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 137 agtcatcagc agcaagacg 19
<210> 138
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 138 gcattgtcca cagtatttgc 20
<210> 139
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 139 cattgtccac agtatttgcg 20
<210> 140
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 140 attgtccaca gtatttgcga 20
<210> 141
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 141 ttgtccacag tatttgcga 19
<210> 142
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 142 tgtccacagt atttgcgaa 19
<210> 143
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 143 gtccacagta tttgcgaaga 20
<210> 144
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 144 tccacagtat ttgcgaagat c 21
<210> 145
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 145 ccacagtatt tgcgaagatc t 21
<210> 146
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 146 cacagtattt gcgaagatct g 21
<210> 147
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 147 ctcctccttg agagcct 17
<210> 148
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 148 tcctccttga gagcctc 17
<210> 149
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 149 cctccttgag agcctcg 17
<210> 150
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<210> 151
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 151 ccttgagagc ctcgatc 17
<210> 152
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 152 cttgagagcc tcgatctc 18
<210> 153
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 153 gagcctcgat ctctgtc 17
<210> 154
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 154 agcctcgatc tctgtctc 18
<210> 155
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 155 gcctcgatct ctgtctc 17
<210> 156
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 156 acttcctctt cgtggttc 18
<210> 157
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 157 ggccttttac ttcctcttcg 20
<210> 158
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 158 tacttcctct tcgtggttc 19
<210> 159
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 159 tacctccacg gtcaacc 17
<210> 160
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 160 cggatgtctg ccatgatc 18
<210> 161
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 161 ggatgtctgc catgatctt 19
<210> 162
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 162 ccagctcgtc atattggg 18
<210> 163
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 163 caatctgctg agaccagtac 20
<210> 164
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 164 tctgctgaga ccagtactt 19
<210> 165
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 165 ctccaacctc agcagac 17
<210> 166
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 166 agtccaggtc gatctcc 17
<210> 167
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 167 tggccttcag atttctcatg 20
<210> 168
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 168 caagctggcc ttcagatt 18
<210> 169
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 169 aaggtgcagc aggatcc 17
<210> 170
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 170 taatggctcc agtctctgac c 21
<210> 171
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 171 tcaatctgca gaacgatgcg 20
<210> 172
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 172 gagagcctcg atctctgtct c 21
<210> 173
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 173 gagagcctcg atctctgtct 20
<210> 174
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 174 ttgtctagct cctctcggtt c 21
<210> 175
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 175 ttgtctagct cctctcggtt 20
<210> 176
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 176 caggtcgatc tccaaggact 20
<210> 177
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 177 gctggccttc agatttctca 20
<210> 178
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 178 gctggcttaa tgcctcagaa 20
<210> 179
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 179 agctctgtct catacttgac t 21
<210> 180
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 180 agtcatcagc agcaagacg 19
<210> 181
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 181 gtcatcagca gcaagacg 18
<210> 182
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 182 ggccttttac ttcctcttcg 20
<210> 183
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 183 acttcctctt cgtggttc 18
<210> 184
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 184 ctggcaatct gggcttg 17
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<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 185 gaggtcctga gatttggg 18
<210> 186
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 186 tctagctcct ctcggttc 18
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<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 187 caatctgctg agaccagtac 20
<210> 188
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 188 ctccaacctc agcagac 17
<210> 189
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 189 cagactgtgt ggtgacc 17
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<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 190 actgtggtgc tctcctc 17
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<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 191 gactgtacgt ctcagctc 18
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<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 192 ggctgttctc caagctg 17
<210> 193
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 193 catctgtagg gcgtagcg 18
<210> 194
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 194 catactcctg ggcctgg 17
<210> 195
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 195 gcgaagatct gagccctca 19
<210> 196
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 196 catcagcagc aagacggg 18
<210> 197
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 197 tgaagagcag ctcctcctt 19
<210> 198
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 198 gctctcctca atctgctgag 20
<210> 199
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 199 gctggccttc agatttctca 20
<210> 200
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 200 cctccctcag gctgttctc 19
<210> 201
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 201 ccaaagggta ccctgcttc 19
<210> 202
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 202 acctggggtc ccttctt 17
<210> 203
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 203 gggtcccttc ttctccaag 19
<210> 204
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 204 ggtcccttct tctccaagtg 20
<210> 205
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 205 caagtgctcc cggattttgc 20
<210> 206
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 206 aagtgctccc ggattttgc 19
<210> 207
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 207 agtgctcccg gattttgct 19
<210> 208
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 208 gtgctcccgg attttgctc 19
<210> 209
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 209 tgctcccgga ttttgctct 19
<210> 210
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 210 gctcccggat tttgctctc 19
<210> 211
<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 211 cagctctgtc tcatacttga ctct 24
<210> 212
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 212 acagactggc gcatggc 17
<210> 213
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18 <400> 213 cctcttcgtg gttcttcttc at 22
<210> 214
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 214 cctcagcaga ctgtgtggt 19
<210> 215
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 215 cagcagactg tgtggtgacc 20
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 216 cagctctgtc tcatacttga ctct 24
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 217 gagctggcaa tctgggct 18
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 218 tgtccaaggc atcaccaaga 20
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 220 cgcaaatact gtggacaatg cc 22
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<211> 24
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 221 cagatcttcg caaatactgt ggac 24
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<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 222 gatcatcgag gacctgaggg 20
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<213> Artificial
<220>
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<220>
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<213> Artificial
<220>
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<220>
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 227 cccccaaatc tcaggacc 18
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK18

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK18

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 231 acaccaatat cacacgactg ca

22

<210> 232 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 232 ggcccaatat gacgagctgg

20

<210> 233 <211> 20 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 233 tggcaaagtg gtgtctgaga

20

<210> 234 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 234 tgaagtaatg gctccagtct ctggagagca aaatccggga

40

<210> 235 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 235 tgaagtaatg gctccagtct ctgagagcaa aatccgggag

40

<210> 236 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 236 tgaagtaatg gctccagtct ctggagcaaa atccgggagc

40

<210> 237 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 237 tgaagtaatg gctccagtct ctgaatccgg gagcacttgg

40

<210> 238 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 238 agtaatggct ccagtctctg acgagagcaa aatccggga

39

<210> 239 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 239 agtaatggct ccagtctctg acagagcaaa atccgggag

39

<210> 240 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 240 agtaatggct ccagtctctg acgagcaaaa tccgggagc

39

<210> 241 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 241 agtaatggct ccagtctctg acaatccggg agcacttgg

39

<210> 242 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 242 ttgaagtaat ggctccagtc tctgagagca aaatccggga

40

<210> 243 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 243 ttgaagtaat ggctccagtc tctagagcaa aatccgggag

40

<210> 244 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 244 ttgaagtaat ggctccagtc tctgagcaaa atccgggagc

40

<210> 245 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 245 ttgaagtaat ggctccagtc tctaatccgg gagcacttgg

40

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 246 gggtcccttc ttctccaagg aggctggaga gcaaaa

36

<210> 247 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 247 acctggggtc ccttcttgag gctggagagc aaaa

34

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 248 ggtcccttct tctccaagtg gaggctggag agcaaaa

37

<210> 249 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 249 tcccttcttc tccaagtgct gaggctggag agcaaaa

37

<210> 250 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 250 ccttcttctc caagtgctcc gaggctggag agcaaaa

37

<210> 251 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 251 acagactggc gcatggccgt cttgctgctg atgac

35

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 252 acagactggc gcatggcgtc ttgctgctga tgactt

36

<210> 253 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

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42

<210> 254 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 254 tcaatgacct tgcggagcca gagtcaagta tgagacagag c

41

<210> 255 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 255

tcaatgacct tgcggagcca gtcaagtatg agacagagct

40

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 256 atcaatgacc ttgcggagcc tagagtcaag tatgagacag agc

43

<210> 257 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 257 atcaatgacc ttgcggagcc agagtcaagt atgagacaga gc

42

<210> 258 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 258 atcaatgacc ttgcggagcc agtcaagtat gagacagagc t

41

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

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43

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 260 catcaatgac cttgcggagc agagtcaagt atgagacaga gc

42

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<220>

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41

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44

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43

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<400> 264 tcatcaatga ccttgcggag cagtcaagta tgagacagag ct

42

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36

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37

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<213> Artificial
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<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
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<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
<220>

<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<211> 40
<212> ADN
<213> Artificial
<220>

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK18

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK18

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK18

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 279 gctggccttc agatttctca tggagctgag acgtacagtc

40

<210> 280 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 280 ccaggctcct cactctgtcc agagaccatg caaagcctga a

41

<210> 281 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 281 tccagtctct gacctggggt cgaggctgga gagcaaaa

38

<210> 282 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

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38

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

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44

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 284 gaccactgtg gtgctctcct cgaaccgaga ggagctagac aa

42

<210> 285 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<400> 285 cagctccaac ctcagcagac tggtctcagc agattgagga gag

43

<210> 286 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 286 ggtttgcatg gagttgctgc tgtggaagat ggcgaggact tt

42

<210> 287 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 287 gatcatcgag gacctgaggg gtcatcagca gcaagacg

38

<210> 288 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 288 gatcatcgag gacctgaggg agtcatcagc agcaagacg

39

<210> 289 <211> 44 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 289 cagagactgg agccattact tcacacagta tttgcgaaga tctg

44

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 290 cagagactgg agccattact tcatccacag tatttgcgaa gatc

44

<210> 291 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<400> 291 cagagactgg agccattact tcatgtccac agtatttgcg aa

42

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

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43

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43

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45

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43

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44

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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 308 tcacacgact gcagctgggg ccttttactt cctcttcg 38
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
<400> 326 accgtggagg tagatgccgg atgtctgcca tgatctt 37
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<211> 36
<212> ADN
<213> Artificial
<220>

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK18

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK18

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36

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40

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

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40

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

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35

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 331 tgagacgtac agtccagtcc caagctggcc ttcagatt

38

<210> 332 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 332 tgagacgtac agtccagtcc tggccttcag atttctcatg

40

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<220>

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34

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42

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41

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 337 gacatccatg ggctccgcaa gagagcctcg atctctgtct

40

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<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK18

<400> 338 caggacctcg ccaagatcat gggaaccgag aggagctaga caa

43

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<220>

<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK18
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<212> ADN
<213> Homo sapiens
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
10
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
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<212> ADN
<213> Artificial
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<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<212> ADN
<213> Artificial
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<213> Artificial
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<212> ADN
<213> Artificial
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<212> ADN
<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<213> Artificial
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<213> Artificial
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<213> Artificial
<220>
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<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 402 tcgacaacgc ccgt 14
<210> 403
<211> 15
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 403 ccgtctggct gcaga 15
<210> 404
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 404 cgtctggctg cagatga 17
<210> 405
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 405 gtctggctgc agatgact 18
<210> 406
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 406 tctggctgca gatgactt 18
<210> 407
<211> 16
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 407 tccgggcacc gatctc 16
<210> 408
<211> 16
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 408 ggcaccgatc tcgcca 16
<210> 409
<211> 15
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 409 gggcaccgat ctcgc 15
<210> 410
<211> 15
<212> ADN
<213> Artificial
<220>

<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 410 gcaccgatct cgcca

15

<210> 411 <211> 18 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 411 tcatggccga gcagaacc

18

<210> 412 <211> 16 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 412 catggccgag cagaac

16

<210> 413 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 413 tgtagtagtg gctgtagtcg cgagctagag gtgaagatcc g

41

<210> 414 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 414 tgtagtagtg gctgtagtcg cgagatccgc gactggtac

39

<210> 415 <211> 42 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 415 tcgtgtagta gtggctgtag tcgagctaga ggtgaagatc cg

42

<210> 416 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK19

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK19

<223>

ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 416 tcgtgtagta gtggctgtag tcggtgaaga tccgcgactg

40

<210> 417 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 417 tcgtgtagta gtggctgtag tcgagatccg cgactggtac

40

<210> 418 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 418 gtgccaccat tgagaactcc ggttcggaag tcatctgc

38

<210> 419 <211> 43 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 419 ggagttctca atggtggcac caactactac acgaccatcc agg

43

<210> 420 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 420 tgtcctgcag atcgacaacg ccgtctcaaa cttggttcgg a

41

<210> 421 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 421 gtcctgcaga tcgacaacgc ctccgtctca aacttggttc g

41

<210> 422 <211> 34 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<400> 422 ttggcccctc agcgtacaag agctggccta cctg

34

<210> 423 <211> 36 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 423 aggtcagtgt ggaggtggcg catgtcactc aggatc

36

<210> 424 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 424 agcggaatcc acctccacga ggaaatcagt acgctgag

38

<210> 425 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 425 aatccacctc cacactgacc gaggaaatca gtacgctgag

40

<210> 426 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 426 atccacctcc acactgaccg aggaaatcag tacgctgag

39

<210> 427 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 427 tccacctcca cactgaccga ggaaatcagt acgctgag

38

<210> 428 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220>

<400> 428 tctcgccaag atcctgagtg caggcttcag catccttc 38
<210> 429
<211> 37
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 429 tctcgccaag atcctgagtg ggtgaaccag gcttcag 37
<210> 430
<211> 37
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 430 tctcgccaag atcctgagtg gtgaaccagg cttcagc 37
<210> 431
<211> 38
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 431 tctcgccaag atcctgagtg gaaccaggct tcagcatc 38
<210> 432
<211> 37
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 432 tctcgccaag atcctgagtg accaggcttc agcatcc 37
<210> 433
<211> 38
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19
<400> 433 tcgccaagat cctgagtgac caggcttcag catccttc 38
<210> 434
<211> 40
<212> ADN
<213> Artificial
<220>

<223> ADN diseñado basado en el gen de CK19

<400> 434

agatcctgag tgacatgcga agcaggcttc agcatccttc

40

5

<210> 435

<211> 1275

<212> ADN

<213> Homo sapiens

10

<400> 435

imagen3
<210> 436
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 436 ttcatgctga gatgggactg g 21
<210> 437
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 437 gctgagatgg gactggagtt c 21
<210> 438
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 438 caatttgcag gacacaccga g 21
<210> 439
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 439 gaggttcaac taacggagc 19
<210> 440
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 440 gttcaactaa cggagctgag 20
<210> 441
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 441 actaacggag ctgagacg 18
<210> 442
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 442 attgaagagc tgcgaagtc 19
<210> 443
<211> 23
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 443 cgactacagt gcatattaca gac 23
<210> 444
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 444 cagcaacagg tcacagtg 18
<210> 445
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 445 ctagaggaga ccaaggccc 19
<210> 446
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 446 tctagaggag accaaggccc 20
<210> 447
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 447 agaccaaggc ccgttacagc 20
<210> 448
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 448 ctgctgagga cttcagactg a 21
<210> 449
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 449 agagagctca acagcgac 18
<210> 450
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 450 tccagagagc tcaacagc 18
<210> 451
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 451 acagcgactg gaggttg 17
<210> 452
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 452 agctcaacag cgactgg 17
<210> 453
<211> 19
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 453 cttggagatc agcttccac 19
<210> 454
<211> 22
<212> ADN
<213> Artificial <220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 454 gtagggttag gtcatcaaag ac 22
<210> 455
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 455 gcgttccatg ttactccg 18
<210> 456
<211> 21
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 456 gcagttgagc atccttaatc t 21
<210> 457
<211> 17
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 457 ctcaaggctc tgggagg 17
<210> 458
<211> 20
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 458 gactgagaga ggaatacgtc 20
<210> 459
<211> 18
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 459 gccagttagc caacctcc 18
<210> 460
<211> 16
<212> ADN
<213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 460 cagttagcca acctcc

16

<210> 461 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 461 ttcatgctga gatgggactg ggaggttcaa ctaacggagc

40

<210> 462 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 462 ttcatgctga gatgggactg ggttcaacta acggagctga g

41

<210> 463 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 463 ttcatgctga gatgggactg gactaacgga gctgagacg

39

<210> 464 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 464 gctgagatgg gactggagtt cgaggttcaa ctaacggagc

40

<210> 465 <211> 41 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 465 gctgagatgg gactggagtt cgttcaacta acggagctga g

41

<210> 466 <211> 39 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 466 gctgagatgg gactggagtt cactaacgga gctgagacg

39

<210> 467 <211> 40 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 467 caatttgcag gacacaccga gattgaagag ctgcgaagtc

40

<210> 468 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 468 ctagaggaga ccaaggccca gagagctcaa cagcgac

37

<210> 469 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 469 tctagaggag accaaggccc tccagagagc tcaacagc

38

<210> 470 <211> 37 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 470 tctagaggag accaaggccc acagcgactg gaggttg

37

<210> 471 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220> <223> ADN diseñado basado en el gen de CK20

<400> 471 agaccaaggc ccgttacagc agagagctca acagcgac

38

<210> 472 <211> 38 <212> ADN <213> Artificial

<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 472 agaccaaggc ccgttacagc tccagagagc tcaacagc 38
<210> 473
<211> 37
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 473 agaccaaggc ccgttacagc agctcaacag cgactgg 37
<210> 474
<211> 40
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> ADN diseñado basado en el gen de CK20
<400> 474 ctgctgagga cttcagactg acttggagat cagcttccac 40

Claims (3)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un conjunto de cebadores para la amplificación de ácidos nucleicos para detectar citoqueratina 19 humana por el método LAMP que comprende al menos cuatro tipos de cebadores, en el que dicho conjunto de cebadores

   5 comprende un oligonucleótido de acuerdo con la SEC ID Nº: 419, o una cadena complementaria de la SEC ID Nº: 419; o un cebador capaz de hibridar con el cebador de acuerdo con la SEC ID Nº: 419 o el complemento del mismo en condiciones rigurosas.
2. 2. Un método para detectar citoqueratina 19 humana por el método LAMP usando el conjunto de cebadores de 10 acuerdo con la reivindicación 1.
3. 3. Uso del conjunto de cebadores de acuerdo con la reivindicación 1 para la detección de un ácido nucleico de citoqueratina 19 en una muestra usando el método LAMP.