KR20190044330A

KR20190044330A - 위암의 림프절 전이를 예측하기 위한 마이크로rna 마커

Info

Publication number: KR20190044330A
Application number: KR1020170136631A
Authority: KR
Inventors: 이다근
Original assignee: 아주대학교산학협력단
Priority date: 2017-10-20
Filing date: 2017-10-20
Publication date: 2019-04-30
Also published as: KR102108299B1

Abstract

본 발명은 위암의 림프절 전이를 예측하기 위한 miRNA 마커에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 점막내 조기위암에서 miRNA 발현 프로파일을 이용하여 림프절 전이를 예측하는 것에 관한 것이다. 본 발명에 따른 miRNA 바이오마커의 발현을 이용한 림프절 전이 예측은 조기위암 환자에 내시경적 점막하층 박리술을 시행하기 전에 적용함으로써 위암의 조기 치료 성적을 더욱 높일 수 있으며, 위암 수술의 범위나 방법 등을 보다 명확히 설정할 수 있으므로, 임상 적용에 매우 유용하다.

Description

위암의 림프절 전이를 예측하기 위한 마이크로RNA 마커 {MicroRNA Biomarker for Predicting Lymph Node Metastasis of Gastric Cancer}

본 발명은 위암의 림프절 전이를 예측하기 위한 마이크로RNA (miRNA)마커에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 점막내 조기위암에서 miRNA 발현 프로파일을 이용하여 림프절 전이를 예측하는 것에 관한 것이다.

위암(gastric cancer)은 전 세계에서 네 번째로 가장 흔한 암이며, 두 번째로 높은 암 사망의 원인 질환으로, 우리나라를 포함한 동아시아 국가에서 특히 그 발병률이 높다. 위암의 발병률은 한국 남성에서 암 발생 1위, 여성에서는 4위를 차지하고 있다.

최근에는 건강검진이 보편화되어, 우리나라의 위암은 진행성 위암 (advanced gastric cancer; AGC)보다는 조기위암(early gastric cancer; EGC)의 발생빈도가 상대적으로 빠르게 증가하여 전체 위암 중 조기위암이 차지하는 비중이 50%를 넘어서고 있다. 조기위암은 진행성 위암과는 달리 치료 성과가 좋아, 5년 생존율이 거의 90%에 이르고 있다. 현재 조기위암의 경우에는 암이 점막층 (mucosa)에 국한되어 있거나, 점막하층 (submucosa)의 표층 (~500μm 이내)까지만 침윤되어 있을 경우, 그 육안적 모양과 조직학적 유형에 따라 내시경적 점막하층 박리술 (endoscopic submucosal dissection, ESD)을 시행하고 있다. ESD를 받은 후에 점막하층 (submucosa)으로 암이 침윤한 깊이가 500μm 이상이거나 혈관이나 림프관으로 암이 침범한 것이 관찰되는 경우에는 추가적으로 위의 수술적 절제와 주변의 림프절 곽청을 시행하지만, 암이 점막내에 국한된 경우는 ESD로 치료한 뒤 추가적인 치료 없이 관찰하고 있다.

하지만, 위 점막에 국한된 점막내위암 (intramucosal gastric cancer; IMC)도 위 주변의 림프절로 전이할 수 있다. 약 1.9~6.4 %의 점막내 위암에서 주변 림프절로의 전이가 발견된다고 보고되었다 (Oh SY et al., Ann Surg . 265(1):137-142, 2017; Pyo JH et al., Ann Surg Oncol . 23(Suppl 5):784-791, 2016; Pyo JH et al., PLoS One. 11(5):e0156207, 2016). 이러한 수치는 ESD 치료 대상이 되는 암으로 확대시킨다면 더 증가할 수 있다. 주변 림프절로의 전이 여부를 모른 채 환자가 ESD만 시행 받은 경우, 환자는 결국 국소재발과 암의 전이 (metastasis)로 생명의 위협을 받게 된다. 즉, 위암의 치료에 내시경적 점막하층 박리술 (endoscopic submucosal dissection, ESD)은 높은 성공률을 보이며, 조기위암의 치료에 개복 수술과 함께 적용되고 있으나, 내시경 검사를 통해서 위암의 전이 여부를 모두 진단 및 예측하지는 못하고 있다. 전이된 위암을 내시경적 점막하층 박리술로 위암 조직만을 절제한 경우, 전이된 암이 완전히 치료되지 않아 재발 등의 위험성을 내포하게 된다. 수술이나 내시경적 점막하층 박리술 등의 위암 조직 제거 시술 전에 위암으로 진단된 환자에서 전이 여부를 판단할 수 있다면 종양 제거 방법의 선택 및 수술 전 수술 방법과 범위 결정에 유용하여 위암 환자의 생존율 증대와 수술 후 합병증 감소에 도움을 줄 것이다.

현재 점막내위암에서 림프절 전이와 관계된 종양의 육안적 분류나 병리학적 지표에 대한 연구 (Oh SY et al., Ann Surg . 265(1):137-142, 2017; Pyo JH et al., Ann Surg Oncol . 23(Suppl 5):784-791, 2016; Pyo JH et al., PLoS One. 11(5):e0156207, 2016)는 다수 진행되어 있으나, 이러한 병리학적 지표에 근거한 예측은 변수가 많고, 그 자체로 정확도가 높지 않다. 또한, 분화가 나쁜 조직학적 유형인 반지모양세포위암 (signet ring cell carcinoma)은 점막내 국한된 경우에 오히려 림프절 전이의 빈도가 더 낮거나 다른 유형과 비슷하다고 알려져 있다 (Hyung WJ et al., Cancer. 1;94(1):78-83, 2002; Chiu CT et al., Dig Dis Sci. 56:1749-56, 2011; Lee SH et al., Eur J Gastroenterol Hepatol . 27(2):170-4, 2015). 이러한 기존에 알려진 조직병리학적 특징만으로 림프절 전이를 예측하는 것은 한계가 있다. 한편, 유전자 발현 프로파일 등의 분석을 통한 위암환자의 예후나 재발 등을 예측하려는 연구도 다수 있으나, 이는 거의 진행성 위암을 대상으로 한 것일 뿐 아니라 실제 임상적으로도 그 결과를 적용하기에 어려움이 있어서, 실제 조기위암에서 림프절 전이와 관계된 신뢰할만한 바이오마커는 알려진 바가 없다.

최근 새로운 암 및 질환의 표지자로서 많은 관심을 받고 있는 것들 중 하나로 miRNAs가 있으며, 다양한 암을 대상으로 miRNA 연구가 진행되고 있다. 그러나, 위암의 림프절 전이 예측 마커로서의 miRNA에 대해서는 아직 밝혀진 바 없다.

이에, 본 발명자들은 조기위암 환자에서 림프절 전이를 효율적으로 예측하고 확인할 수 있는 방법을 찾고자 위하여 예의 노력한 결과, 내시경적 점막하층 박리술을 시행 받은 점막내위암 환자 중 림프절 전이가 있는 점막내암(M-MGC)에서 발현 수준이 의미있게 변하는 miRNA 마커를 발굴하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 조기위암에서 림프절 전이를 효율적으로 예측할 수 있는 miRNA 마커를 발굴하여, 상기 miRNA 마커의 발현 수준을 측정하고 대조군과 비교하여 위암의 림프절 전이 예측을 위한 정보제공 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 위암의 림프절 전이 예측용 조성물 및 상기 조성물을 포함하는 위암의 림프절 전이 예측용 키트를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 위암의 림프절 전이가 의심되는 환자의 시료로부터 miR-3175, miR-4505, miR-3620-5p, miR-4459, miR-4507, miR-1587, miR-4720-5p, miR-4742-5p, miR-628-5p, miR-6779-5p, miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-6831-5p, miR-125a-5p, miR-486-5p, miR-181d-5p 및 miR-3609로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 위암의 림프절 전이 예측을 위한 정보제공 방법을 제공한다.

본 발명은 또한, miR-3175, miR-4505, miR-3620-5p, miR-4459, miR-4507, miR-1587, miR-4720-5p, miR-4742-5p, miR-628-5p, miR-6779-5p, miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-6831-5p, miR-125a-5p, miR-486-5p, miR-181d-5p 및 miR-3609로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 위암의 림프절 전이 예측용 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 조성물을 포함하는 위암의 림프절 전이 예측용 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 miRNA 바이오마커의 발현을 이용한 림프절 전이 예측은 조기위암 환자에 내시경적 점막하층 박리술을 시행하기 전에 적용함으로써 위암의 조기 치료 성적을 더욱 높일 수 있으며, 위암 수술의 범위나 방법 등을 보다 명확히 설정할 수 있으므로, 임상 적용에 매우 유용하다.

도 1은 림프절 전이가 있는 점막내암 (M-MGC)에서만 의미있게 증가하거나 감소하는 miRNA를 찾기 위한 miRNA Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 Array에 대한 도식도이다.
도 2는 림프절 전이가 있는 점막내위암 (M-IMC)에서 발현이 증가한 11종의 miRNA를 나타낸 것이다.
도 3은 림프절 전이가 있는 점막내위암 (M-IMC)에서 발현이 감소한 10종의 miRNA를 나타낸 것이다.
도 4는 21종의 miRNA 중 기능이 알려진 10종의 miRNA를 나타낸 것이다.
도 5는 LOOCV (leave-one-out-cross-validation) 방법으로 21종의 miRNA의 림프절 전이를 예측하여 ROC (receiver operating characteristic) 분석한 결과이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명은 조기위암의 림프절 전이 마커를 발견하고, 해당 마커에 특이적으로 결합 가능한 핵산을 이용하여 효과적으로 위암의 림프절 전이를 예측하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 miRNA 마커를 이용한 방법은 위암의 림프절 전이를 조기에 예측 가능하게 하고, 이에 따라 조기 치료 및 예후의 개선을 초래하고, 또한 외과적, 방사선 요법적, 및 화학 요법적인 치료의 유효성의 모니터를 가능하게 한다.

본 발명에서는 정상 조직, 림프절 전이가 없는 점막내 위암 (N-IMC) 및 림프절 전이가 있는 점막내 위암 (M-IMC)에서 발현 수준이 의미있게 변하는 miRNA 21종을 선별하고, 이들의 발현 프로파일을 통해 조기위암의 림프절 전이를 효과적으로 예측할 수 있음을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일 관점에서 (a) 위암의 림프절 전이가 의심되는 환자의 시료로부터 miR-3175, miR-4505, miR-3620-5p, miR-4459, miR-4507, miR-1587, miR-4720-5p, miR-4742-5p, miR-628-5p, miR-6779-5p, miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-6831-5p, miR-125a-5p, miR-486-5p, miR-181d-5p 및 miR-3609로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (b) 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계를 포함하는 위암의 림프절 전이 예측을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 대조군에 비해 miR-3175, miR-4505, miR-3620-5p, miR-4459, miR-4507, miR-1587, miR-4720-5p, miR-4742-5p, miR-628-5p 및 miR-6779-5p로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 증가하는 경우, 또는, 대조군에 비해 miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-6831-5p, miR-125a-5p, miR-486-5p, miR-181d-5p 및 miR-3609로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 감소하는 경우, 위암의 림프절 전이 위험성이 있는 것으로 결정하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "miRNA" 또는 "microRNA" 또는 "miR"은 이의 전구체 RNA 전사체가 작은 줄기-루프(stem-loop)를 형성할 수 있고 이로부터 성숙한 "miRNA"가 엔도뉴클레아제 다이서(Dicer)에 의해 절단되는 내인성의, 비-암호화된 유전자의 생성물을 포함하는 RNA(또는 RNA 유사체)를 말한다. miRNA는, 이들이 이의 발현을 조절하는 mRNA와는 구분되는 유전자내에서 암호화된다.

일 예에서, 용어 "miRNA" 또는 "microRNA"는 함께 공유결합된 적어도 10개의 뉴클레오타이드 및 35개 이하의 뉴클레오타이드의 단일가닥 RNA 분자를 말한다. 상기 miRNA 또는 이들의 상보가닥 분자는 15 내지 50개, 바람직하게는 15 내지 30개, 더욱 바람직하게는 18 내지 25개의 핵산을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에 기술된 바와 같은 miRNA의 서열은 하기 표 1의 서열번호 1 내지 서열번호 21의 miRNA를 포함한다.

서열번호	miRNA	miRBase Accession No.
1	miR-3175	MIMAT0015052
2	miR-4505	MIMAT0019041
3	miR-3620-5p	MIMAT0022967
4	miR-4459	MIMAT0018981
5	miR-4507	MIMAT0019044
6	miR-1587	MIMAT0019077
7	miR-4720-5p	MIMAT0019833
8	miR-4742-5p	MIMAT0019872
9	miR-628-5p	MIMAT0004809
10	miR-6779-5p	MIMAT0027458
11	miR-106b-3p	MIMAT0004672
12	miR-500a-3p	MIMAT0002871
13	miR-502-3p	MIMAT0004775
14	miR-574-3p	MIMAT0003239
15	miR-1231	MIMAT0005586
16	miR-151b	MIMAT0010214
17	miR-6831-5p	MIMAT0027562
18	miR-125a-5p	MIMAT0000443
19	miR-486-5p	MIMAT0002177
20	miR-181d-5p	MIMAT0002821
21	miR-3609	MIMAT0017986

당해 분야의 숙련가에게 인식될 수 있는 바와 같이, miRNA는 "ATGC"와 같은 문자를 포함하는 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드의 유형이다. 뉴클레오타이드는 좌측으로부터 우측으로 5'→3' 순서이며 달리 나타내지 않는 한 "A"는 데옥시아데노시드, "C"는 데옥시사이티딘, "G"는 독시구아노시드, 및 "T"는 데옥시티미딘을 나타낸다. 문자 A, C, G 및 T는 당해 분야에서 표준인 것으로서, 염기 자체, 뉴클레오사이드, 또는 염기를 포함하는 뉴클레오타이드를 언급하는데 사용될 수 있다. 당해 용어는 천연적으로 존재하는 핵염기, 당, 및 뉴클레오타이드간(골격) 연결로 구성된 올리고뉴클레오타이드 및 또한 유사하게 작용하거나 특이적으로 개선된 작용을 지닌 비-천연적으로 존재하는 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드를 포함한다. 천연적으로 존재하는 폴리뉴클레오타이드에서, 뉴클레오사이드간 연결은 전형적으로 포스포디에스테르 결합이며, 소 단위는 "뉴클레오타이드"로 언급된다. 용어 "올리고뉴클레오타이드"는 또한 염기 및/또는 당과 같은 완전히 또는 부분적으로 변형되거나 치환된 올리고뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.

본 개시내용의 분야에서 인식될 수 있는 바와 같이, 본원에 기술된 방법 중 어느 것에서도, miRNA는 상기 표 1에 나열된 miRNA의 서열과 100% 서열 동일성을 갖지 않을 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계는 바이오 키트 분야에서 통상 사용되는 방법에 따라 측정될 수 있는데, 예컨대 역전사효소 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사효소 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 또는 유전자 칩 등이 포함되며 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 위암의 림프절 전이가 의심되는 환자의 시료는 위의 점막층 (mucosa) 또는 점막하층 (submucosa)으로부터 분리된 조직 또는 세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 본 발명의 위암은 조기위암 (early gastric cancer; EGC)인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 점막내위암 (intramucosal gastric cancer; IMC)인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에 사용된 것으로서, 용어 "암"은 조절되지 않은 증식, 불멸성, 전이 잠재성, 신속한 성장 및 증식 속도, 및 당해 분야에 공지된 특정의 특징적인 형태학적 특성과 같은 암-유발 세포의 대표적인 특징을 지니는 세포의 존재를 말한다. 일 예에서, "암"은 위암 또는 위장 암일 수 있다. 일 예에서, "암"은 악성 암뿐만 아니라 전-악성 암도 포함할 수 있다. 따라서, 용어 "위암"은 국립 보건원의 국립 암 연구소에 의해 기술된 바와 같은 위암의 모든 단계를 포함한다.

본원에 사용된 것으로서, 본원에 기술된 방법 중 어느 것에서도, 용어 "대상체" 및 "환자"는 동물(예를 들면, 포유동물, 어류, 양서류, 파충류, 조류 및 곤충)을 언급하기 위해 상호교환적으로 사용될 수 있다. 일 예에서, 대상체는 포유동물(예를 들면, 비-사람 포유동물(예를 들면, 개, 고양이, 또는 영장류) 및 사람)일 수 있다. 일 예에서, 대상체는 영장류(예를 들면, 침팬지 및 사람)일 수 있다. 일 예에서, 대상체는 사람일 수 있다. 일 예에서, 대상체는 위암(또는 위장암)을 지니거나 지니지 않은 사람일 수 있다.

본 발명은 다른 관점에서, miR-3175, miR-4505, miR-3620-5p, miR-4459, miR-4507, miR-1587, miR-4720-5p, miR-4742-5p, miR-628-5p, miR-6779-5p, miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-6831-5p, miR-125a-5p, miR-486-5p, miR-181d-5p 및 miR-3609로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 위암의 림프절 전이 예측용 조성물에 관한 것이다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제는 상기 표 1의 miRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 miRNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.

프라이머는 짧은 자유 3' 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 갖는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성이 개시될 수 있다. 본 발명에서는 위 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 위암의 림프절로의 전이 여부를 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

프로브는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수십 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며 라벨링 되어 있다. 프로브는 올리고뉴클로타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 위 하나 이상의 miRNA와 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여 발현 수준을 확인함으로써 위암의 림프절로의 전이 여부를 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.

이러한 프라이머 또는 프로브는 공지된 miRNA의 서열을 바탕으로 당업자가 적절히 디자인할 수 있다.

예컨대, 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.

본 발명은 또 다른 관점에서, miR-3175, miR-4505, miR-3620-5p, miR-4459, miR-4507, miR-1587, miR-4720-5p, miR-4742-5p, miR-628-5p, miR-6779-5p, miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-6831-5p, miR-125a-5p, miR-486-5p, miR-181d-5p 및 miR-3609로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 위암의 림프절 전이 예측용 조성물을 포함하는 위암의 림프절 전이 예측용 키트에 관한 것이다.

발명의 위암의 림프절 전이 진단용 조성물에는 위의 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 제제 이외에 위암의 림프절 전이 예측용 키트로 사용되기에 적합하도록 하기 위한 다른 성분들이 포함될 수 있다. 즉, 상기 조성물 이외에 예측 키트에 통상적으로 사용되는 구성을 추가로 포함하는 것일 수 있다.

예컨대 본 발명의 예측 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 miRNA를 증폭할 수 있는 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제 및 역전사효소와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 예측 키트는 유전자 칩 키트일 수 있다. 유전자 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판, 및 형광표식 프로브를 제작하기 위한 시약, 제제, 효소 등을 포함할 수 있다. 또한, 기판은 정량 대조구 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.

키트는 또한 양성 대조군 및/또는 음성 대조군 반응을 위한 핵산 주형(들)을 포함할 수 있다. 키트는 또한 대상체로부터 수득한 샘플로부터 miRNA의 분리에 필요한 어떠한 반응 성분 또는 완충제도 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트에 추가적으로 형광물질을 포함할 수 있으며, 상기 형광물질은 스트렙아비딘-알칼리 탈인화효소 접합물질(strepavidin-like phosphatease conjugate), 화학형광물질(chemiflurorensce) 및 화학발광물질 (chemiluminescent)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.

본원에 예증적으로 기술된 발명은 본원에 특이적으로 개시되지 않은 어떠한 성분 또는 성분들, 제한 또는 제한들의 부재하에서 적합하게 실시될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 용어 "포함하는", "포괄하는", "함유하는" 등은 확장하여 및 제한없이 판독될 것이다. 또한, 본원에 사용된 용어들 및 표현들은 설명의 용어로서 및 제한없이 사용되었으며, 나타내고 기술된 특징들 또는 이의 일부의 어떠한 등가물을 제외한 이러한 용어 및 표현들의 사용에 있어 의도는 없지만, 다양한 변형이 특허청구된 영역내에서 가능함이 인식된다. 따라서, 본 발명은 바람직한 구현예 및 임의의 특징에 의해 특별하게 개시되었지만, 개시된 본원에 구현된 본 발명의 변형 및 변화가 당해 분야의 숙련가에 의해 재분류될 수 있으며 이러한 변형 및 변화는 본 발명의 영역내에 있음이 고려된다.

[ 실시예 ]

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

위암 환자 실험군

실험군의 샘플들은 2006년에서 2012년까지 아주대학교 병원에서 위암으로 수술 받은 환자 중 병기가 T stage 1a (종양이 점막에 국한됨)인 것중 주변 림프절에 전이가 확인된 16개의 위암 조직으로 선정하였다. 대조군은 2012년부터 2013년까지 아주대학교 병원에서 위암으로 수술 받은 환자중 병기가 T stage 1a이면서 림프절 전이가 없고, 이후 3년 이상의 추적관찰 기간중 재발하지 않은 환자의 위암조직 12개를 선정하여 진행하였으며, 이 환자들중 7개의 위 조직에서 정상위조직을 선정하여 또다른 대조군으로 삼아 연구를 진행하였다.

이 연구는 세계의사회 (헬싱키 선언문)의 윤리 강령에 따라서 실행되었고, 아주대학교 병원의 임상시험심사위원회 (IRB)의 승인을 받았다.

실시예 1: Affymetrix GeneChip miRNA 4.0 Array

샘플 조직에서 총 RNA를 TRIzol 시약(Invitrogen, CA, USA)을 사용하여 제조자의 안내에 따라 추출하였다. RNA 농도는 나노드랍(NanoDrop, USA)을 사용하여 정량하였고, RNA 순도는 2100 바이오어날라이저(Agilent Technologies, CA, USA))를 사용하여 측정하였다. 추출된 RNA는 마이크로어레이 분석을 시행하기 전에는 -80 ℃에서 보관하였다. miRNA 마이크로어레이 분석은 RNA 추출한 지 2일 이내에 수행하였다.

총 35개 RNA 샘플에 대하여 마이크로어레이를 수행하였으며, Affymetrix Genechip miRNA 4.0 array 실험은 제조사의 프로토콜을 따랐다.

각각 130ng의 35개 RNA 샘플을 FlashTag™ Biotin RNA Labeling Kit (Genisphere, Hatfield, PA, USA)을 이용하여 표지한 후, 99℃에서 5분, 45℃에서 5분 놓아두었다. RNA-array 혼성화는 Affymetrix　 450 Fluidics Station 기기에서 16시간 동안 수행되었다. 혼성화 완료된 chip을 Genechip Fluidics Station 450 (Affymetrix, Santa Clara, California, United States)에서 수세한 후, Affymetrix GCS 3000 canner (Affymetrix, Santa Clara, California, United States)를 이용하여 스캔하였다. 스캔 완료 후, Affymetrix　 GeneChip™ Expression Console software를 이용하여 chip QC와 RNA normalization을 진행하였다.

정상 조직과 림프절 전이가 있는 점막내암 간의 발현을 비교하여 257개의 유저자를 선별하고, 림프절 전이가 없는 점막내암과 림프절 전이가 있는 점막내암 간의 발현을 비교하여 85개의 유전자를 선별하였다. 그 다음, 각각의 군에서 중복되는 27개의 유전자를 선별하고, 6개의 snoRNAs (small nucleolar RNAs)를 제외한 21종의 miRNA를 발굴하였다 (도 1). 상기 miRNA들은 정상과 차이가 있는 miRNA들만 선택한 것으로 기능에 초점을 맞추어 선별하였다.

발굴한 21종 miRNA의 발현을 정상 조직, 림프절 전이가 없는 점막내 위암 (N-IMC) 및 림프절 전이가 있는 점막내 위암 (M-IMC)에서 상대적으로 비교하였다. 그 결과, 10종의 miRNA miR-3175, miR-4505, miR-3620-5p, miR-4459, miR-4507, miR-1587, miR-4720-5p, miR-4742-5p, miR-628-5p 및 miR-6779-5p는 M-IMC에서만 발현이 의미있게 증가하였고 (도 2), 11종의 miRNA miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-6831-5p, miR-125a-5p, miR-486-5p, miR-181d-5p 및 miR-3609는 M-IMC에서만 발현이 의미있게 감소하였다 (도 3).

실시예 2: miRNA 표적 유전자들의 기능적 분석

실시예 1에서 발굴한 21종의 miRNA의 신뢰도와 유용성을 입증하기 위하여, 기능이 알려진 10종의 miRNA들의 기능적 pathway를 분석하였다 (표 2). 표 2는 Tarbase (DIANA tool)이라는 온라인 DB를 이용하여 분석한 것으로, 실험적으로 입증된 miRNA의 표적 유전자들을 바탕으로 해당 miRNA들과 관련된 signaling pathway를 알려주는 프로그램이다.

그 결과, 10종의 miRNA miR-3175, miR-628-5p, miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-125a-5p 및 miR-486-5p은 위의 표에서 보는 것과 같이 colorectal cancer, pathways in cancer, cell cycle, neutrophin signaling pathway, transcriptional misregulation in cancer 등 모두 암의 발생과 진행에 중요한 역할을 하는 것으로 나타났다. 특히, 종양의 전이와 관련되어 있는 것으로 알려진 혈관신생 신호경로 (angiogenic signaling pathway)로 암 전이에 핵심적인 경로인 adherens junction, HIF-1 signaling, focal adhesion과 관련이 있는 것으로 확인되었다 (도 4).

즉, 본 발명의 miRNA가 억제하는 타겟 유전자들은 종양의 혈관 생성 및 종양의 전이 촉진에 관여하는 기능을 조절하는 것으로 나타났다.

실시예 3: 복수의 miRNA 마커 조합에 의한 위암의 림프절 전이 예측 성능 평가

림프절 전이가 있는 점막내 위암 (M-IMC)에서 dysregulated 되어있는 21종의 miRNA를 이용하여 림프절 전이를 예측하기 위해, BRB-어레이툴 소프트웨어 (Version 2.13.2 for ×64 systems, NCI, Bethesda, MD)를 사용하였다. BRB-어레이툴은 유효성 검증(validation)의 한 방법인LOOCV (leave one out cross validation)를 실행하는 알고리즘인 CCP, DLDA, BCCP를 제공한다.

따라서, LOOCV 방법으로 ROC (Receiver-Operating Characteristic) 분석을 해 본 결과 AUC=0.917(CCP), 0.911(DLDA), 0.88(BCCP)로 나타났다 (도 5). 즉, 표 1의 21종의 miRNA 조합은 림프절 전이를 효과적으로 예측할 수 있음을 확인할 수 있었다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> AJOU UNIVERSITY INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION <120> MicroRNA Biomarker for Predicting Lymph Node Metastasis of Gastric Cancer <130> P17-B209 <160> 21 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-3175 <400> 1 cggggagaga acgcagugac gu 22 <210> 2 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-4505 <400> 2 aggcugggcu gggacgga 18 <210> 3 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-3620-5p <400> 3 gugggcuggg cugggcuggg cc 22 <210> 4 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-4459 <400> 4 ccaggaggcg gaggaggugg ag 22 <210> 5 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-4507 <400> 5 cuggguuggg cugggcuggg 20 <210> 6 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-1587 <400> 6 uugggcuggg cuggguuggg 20 <210> 7 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-4720-5p <400> 7 ccuggcauau uugguauaac uu 22 <210> 8 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-4742-5p <400> 8 ucaggcaaag ggauauuuac aga 23 <210> 9 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-628-5p <400> 9 augcugacau auuuacuaga gg 22 <210> 10 <211> 21 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-6779-5p <400> 10 cugggagggg cuggguuugg c 21 <210> 11 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-106b-3p <400> 11 ccgcacugug gguacuugcu gc 22 <210> 12 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-500a-3p <400> 12 augcaccugg gcaaggauuc ug 22 <210> 13 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-502-3p <400> 13 aaugcaccug ggcaaggauu ca 22 <210> 14 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-574-3p <400> 14 cacgcucaug cacacaccca ca 22 <210> 15 <211> 20 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-1231 <400> 15 gugucugggc ggacagcugc 20 <210> 16 <211> 18 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-151b <400> 16 ucgaggagcu cacagucu 18 <210> 17 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-6831-5p <400> 17 uagguagagu gugaggagga gguc 24 <210> 18 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-125a-5p <400> 18 ucccugagac ccuuuaaccu guga 24 <210> 19 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-486-5p <400> 19 uccuguacug agcugccccg ag 22 <210> 20 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-181d-5p <400> 20 aacauucauu guugucggug ggu 23 <210> 21 <211> 24 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> hsa-miR-3609 <400> 21 caaagugaug aguaauacug gcug 24

Claims

다음 단계를 포함하는 위암의 림프절 전이 예측을 위한 정보제공 방법:
(a) 위암의 림프절 전이가 의심되는 환자의 시료로부터 miR-3175, miR-4505, miR-3620-5p, miR-4459, miR-4507, miR-1587, miR-4720-5p, miR-4742-5p, miR-628-5p, miR-6779-5p, miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-6831-5p, miR-125a-5p, miR-486-5p, miR-181d-5p 및 miR-3609로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
(b) 상기 측정된 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 정상 대조군 시료와 비교하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조군에 비해 miR-3175, miR-4505, miR-3620-5p, miR-4459, miR-4507, miR-1587, miR-4720-5p, miR-4742-5p, miR-628-5p 및 miR-6779-5p로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 증가하는 경우, 위암의 림프절 전이 위험성이 있는 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 (b) 단계는 대조군에 비해 miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-6831-5p, miR-125a-5p, miR-486-5p, miR-181d-5p 및 miR-3609로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준이 감소하는 경우, 위암의 림프절 전이 위험성이 있는 것으로 결정하는 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정하는 단계는 역전사효소 중합효소반응, 경쟁적 역전사효소 중합효소반응, 실시간 역전사효소 중합효소반응, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅 또는 유전자 칩에 의해 측정하는 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 시료는 위의 점막층 (mucosa) 또는 점막하층 (submucosa)으로부터 분리된 조직 또는 세포인 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측을 위한 정보제공 방법.
제1항에 있어서, 상기 위암은 조기위암 (early gastric cancer; EGC)인 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측을 위한 정보제공 방법.
제6항에 있어서, 상기 위암은 점막내위암 (intramucosal gastric cancer; IMC)인 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측을 위한 정보제공 방법.
miR-3175, miR-4505, miR-3620-5p, miR-4459, miR-4507, miR-1587, miR-4720-5p, miR-4742-5p, miR-628-5p, miR-6779-5p, miR-106b-3p, miR-500a-3p, miR-502-3p, miR-574-3p, miR-1231, miR-151b, miR-6831-5p, miR-125a-5p, miR-486-5p, miR-181d-5p 및 miR-3609로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 miRNA의 발현 수준을 측정할 수 있는 제제를 포함하는 위암의 림프절 전이 예측용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 제제는 상기 하나 이상의 miRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 상기 miRNA를 증폭할 수 있는 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측용 조성물.
제8항에 있어서, 상기 위암은 조기 위암 (early gastric cancer; EGC)인 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 위암은 점막내위암 (intramucosal gastric cancer; IMC)인 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측용 조성물.
제8항 또는 제9항의 조성물을 포함하는 위암의 림프절 전이 예측용 키트.
제12항에 있어서, 상기 키트는 RT-PCR 키트, 또는 유전자 칩 키트인 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측용 키트.
제12항에 있어서, 상기 위암은 조기 위암 (early gastric cancer; EGC)인 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측용 키트.
제14항에 있어서, 상기 위암은 점막내위암 (intramucosal gastric cancer; IMC)인 것을 특징으로 하는 위암의 림프절 전이 예측용 키트.