ES2346589T3 - Metodo para la deteccion de mutaciones en egfr en muestras de sagre. - Google Patents
Metodo para la deteccion de mutaciones en egfr en muestras de sagre.Info
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Abstract
Método para la detección de mutaciones en el gen EGFR en una muestra de sangre de un sujeto, dicho método comprende: (i)obtener el ADN de dicha muestra; (ii)amplificar la secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región específica del gen EGFR por medio de PCR usando una sonda de ácido proteíno-nucleico en donde dicha sonda de ácido proteíno-nucleico es capaz de específicamente reconocer e hibridar con la secuencia salvaje de EGFR inhibiendo por tanto su amplificación; y (iii)detectar dicha mutación.
Description
Método para la detección de mutaciones en EGFR
en muestras de sangre.
La presente invención se refiere a la detección
de mutaciones en EGFR en una muestra de sangre (suero/plasma) de un
sujeto.
El cáncer de pulmón es la principal causa de
mortalidad por cáncer tanto en hombres como en mujeres. La
prevalencia del cáncer de pulmón es segunda sólo respecto a la del
cáncer de próstata en hombres y cáncer de mama en mujeres.
Recientemente, el cáncer de pulmón ha sobrepasado a las enfermedades
cardíacas como la principal causa de mortalidad por tabaquismo.
Además, la mayoría de los pacientes que desarrollan cáncer de pulmón
fuman y tienen daño por tabaquismo en el corazón y los pulmones, lo
que hace de las terapias agresivas quirúrgicas o multimodales
opciones menos viables. La mayoría de los carcinomas de pulmón se
diagnostican en una fase avanzada, lo que confiere un mal
pronóstico.
El cáncer de pulmón no microcítico (NSCLC, por
sus siglas en inglés) representa aproximadamente el 75% de todos
los cánceres de pulmón. NSCLC es un agregado heterogéneo de
histologías. Las histologías más comunes son carcinoma epidermoide
o escamoso, adenocarcinoma y carcinoma de células grandes.
Varios estudios han intentado identificar
marcadores clínicos, de laboratorio y moleculares que puedan ayudar
a los clínicos e investigadores a distinguir subgrupos de pacientes
de NSCLC. De acuerdo con esto, varios estudios han mostrado que el
receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se sobreexpresa
en el 40 al 80 por ciento de los cánceres de pulmón no microcíticos
y muchos otros cánceres epiteliales.
La señalización anormal del receptor del factor
de crecimiento epidérmico (EGFR) es crítica para limitar la
sensibilidad a agentes anticancerosos y la activación independiente
de ligando de la tirosina quinasa del EGFR con frecuencia está
producida por mutaciones en EGFR en el dominio extracelular, lo que
se ha observado en varios tipos de tumores, tal como glioblastoma
multiforme. La señalización por EGFR se desencadena mediante la
unión de factores de crecimiento, tal como el factor de crecimiento
epidérmico (EGF). La autofosforilación y transfosforilación de los
receptores a través de sus dominios tirosina quinasa produce el
reclutamiento de efectores posteriores y la activación de señales
proliferativas y de supervivencia celular.
Dos mutaciones representan aproximadamente el
90% de las mutaciones de EGFR descritas hasta la fecha en
adenocarcinomas de pulmón. En la población blanca, el tipo de
mutación más común, visto en alrededor del 65% de los casos con
mutaciones en EGFR, es una deleción corta que mantiene el marco de
lectura de 9, 12, 15, 18 o 24 nucleótidos en el exón 19. La segunda
mutación más común, vista en alrededor del 35% de los casos con
mutaciones en EGFR, es una mutación puntual (CTG a CGG) en el exón
21 en el nucleótido 2573, que produce la sustitución de leucina por
arginina en el codón 858 (L858R) adyacente al motivo DFG en el
lóbulo carboxi-terminal en el bucle de activación
de la quinasa.
Estas mutaciones en EGFR son auténticas
mutaciones somáticas en NSCLC y no se han identificado en otros
tipos de tumores primarios. Además, las mutaciones en EGFR son un
determinante fuerte de respuesta tumoral a gefitinib en cáncer de
pulmón no microcítico (NSCLC). Se han descrito otras mutaciones
mucho menos comunes en los exones 18, 20 y 21.
Hasta ahora, el cribado para estas mutaciones se
ha basado en la secuenciación directa o análisis de polimorfismo de
conformación de hebra única. Los métodos de amplificación de ácidos
nucleicos (por ejemplo, reacción en cadena de la polimerasa)
permiten la detección de números pequeños de moléculas mutantes
entre un fondo de normales. Mientras que medios alternativos para
detectar pequeños números de células tumorales (tal como citometría
de flujo) en general se han limitado a tumores malignos
hematológicos, los ensayos de amplificación de ácidos nucleicos han
demostrado tanto sensibilidad como especificidad para identificar
células malignas y para predecir el pronóstico después de la
quimioterapia.
Se han desarrollado varias estrategias de
amplificación de ácidos nucleicos para detectar pequeños números de
moléculas mutantes en tejido tumoral sólido. Por ejemplo, un método
sensible y específico identifica ADN mutante del oncogén ras basado
en el fallo para cortar un sitio de restricción en el 12º codón
crucial (Kahn et al. Rapid and sensitive nonradioactive
detection of mutant K-ras genes via "enriched"
PCR amplification. Oncogene. Junio 1991;
6(6):1079-83). Se pueden aplicar protocolos
similares para detectar cualquier región mutada de ADN en una
neoplasia, lo que permite la detección de ADN de otros oncogenes o
ADN asociado a tumor. Puesto que el ADN mutado se puede detectar no
sólo en el cáncer primario sino tanto en lesiones precursoras como
en sitios metastásicos, los ensayos de amplificación de ácidos
nucleicos proporcionan un medio de detectar y seguir el cáncer
tanto pronto como tarde en el curso de la enfermedad.
\newpage
Otros estudios han usado ensayos de
amplificación de ácidos nucleicos para analizar la sangre periférica
de pacientes con cáncer para detectar ADN intracelular extraído de
células cancerosas circulantes en pacientes. Sin embargo, se debe
enfatizar que estos estudios intentan usar ensayos de amplificación
basados en ácidos nucleicos para detectar ADN intracelular extraído
de células cancerosas circulantes. El ensayo se realiza en la
fracción celular de la sangre de pacientes que tienen cáncer usando
el precipitado celular o células de la sangre, y la fracción de
suero o plasma convencionalmente se ignora o desecha antes del
análisis. Puesto que tal planteamiento requiere la presencia de
células cancerosas metastásicas circulantes (para tumores no
hematológicos), es de uso clínico limitado en pacientes con cánceres
tempranos y no es útil en la detección de neoplasias no
hematológicas no invasivas o estados pre-
cancerosos.
cancerosos.
Se sabe en el estado de la técnica que en la
sangre de personas sanas circulan cantidades pequeñas pero
significativas de ADN normal y se ha encontrado que esta cantidad
aumenta en estados cancerosos. El estado de la técnica contiene la
divulgación de que el ADN mutante de oncogén se podría detectar en
el plasma o suero de sangre periférica de pacientes de cáncer. Sin
embargo, en general estos artículos también se han limitado a
pacientes con cáncer avanzado o enfermedad neoplásica o
proliferativa conocida. Algunos autores (Kimura et al.,
2006. EGFR Mutation of Tumor and Serum in
Gefitinib-Treated Patients with
Chemotherapy-Naive Non-small Cell
Lung Cancer) han descrito que se pueden detectar mutaciones en el
gen EGFR en muestras de suero de pacientes que padecen NSCLC. Dicho
documento describe la detección de tales mutaciones por medio de PCR
y secuenciación usando cebadores que flanquean dichas
mutaciones.
La presente invención se refiere a un método
para la detección de mutaciones en el gen EGFR en una muestra de
sangre de un sujeto, dicho método comprende:
- (i)
- obtener el ADN de dicha muestra;
- (ii)
- amplificar la secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región específica del gen EGFR por medio de PCR usando una sonda de ácido proteíno-nucleico, en donde dicha sonda de ácido proteíno-nucleico es capaz de específicamente reconocer e hibridar con la secuencia salvaje de EGFR inhibiendo por tanto su amplificación; y
- (iii)
- detectar dicha mutación.
\vskip1.000000\baselineskip
Aquí, los inventores han desarrollado y validado
un ensayo basado en la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
para la detección de las mutaciones más comunes de EGFR en muestras
de suero/plasma. Este ensayo ofrece mayor sensibilidad analítica al
aumentar la amplificación de alelos mutantes en la muestra a ser
analizada mediante el uso de una sonda de ácido
proteíno-nucleico (APN) comparado con métodos
estándar, en los que se usan cebadores que flanquean las mutaciones
para la amplificación por PCR y análisis de secuenciación posterior.
De esta manera, aquí se proporciona un planteamiento consistente y
accesible para la identificación rápida de la mayoría de los
pacientes de cáncer de pulmón que es probable que respondan a
inhibidores específicos de EGFR.
Además, mientras que el análisis directo del
tejido neoplásico es con frecuencia difícil o imposible (tal como
en casos de enfermedad oculta no reconocida), el método descrito
anteriormente tiene la ventaja de usar sangre, tal como sangre
periférica, para la detección de dicha mutación. La sangre
periférica es fácilmente accesible y susceptible para ensayos
basados en ácidos nucleicos.
Para facilitar el entendimiento de la presente
descripción, a continuación se explicará el significado de algunos
términos y expresiones en el contexto de la invención:
El término "sujeto", se refiere a un ser
humano hombre o mujer de cualquier edad o raza. Preferiblemente
incluye seres humanos que tienen o se sospecha que tienen cáncer de
pulmón no microcítico (NSCLC). Los expertos en las técnicas médicas
conocen bien los métodos de diagnóstico para NSCLC y la definición
clínica de los diagnósticos de NSCLC. Como ejemplos, los métodos
para identificar sujetos que se sospecha que tienen NSCLC pueden
incluir exploración física, antecedentes familiares del sujeto,
antecedentes del sujeto, biopsia de pulmón o ciertas tecnologías de
diagnóstico por imagen tal como ultrasonografía.
El término "ácido nucleico" se refiere a un
compuesto multimérico que comprende nucleósidos o análogos de
nucleósidos que tienen bases nitrogenadas heterocíclicas, o análogos
de bases, que están unidos mediante enlaces fosfodiéster para
formar un polinucleótido.
El término "ADN" se refiere a ácido
desoxirribonucleico. Una secuencia de ADN es una secuencia
desoxirribonucleica. El ADN es un polímero largo de nucleótidos y
codifica la secuencia de residuos de aminoácidos en proteínas
usando el código genético.
El término "sonda de ácido
proteíno-nucleico" se refiere a un análogo
sintético de ADN en el que el esqueleto fosfodiéster se cambia por
unidades repetitivas de
N-(2-aminoetil)-glicina a la que se
unen las unidades de purina y pirimidina a través de enlazador
metilcarbonilo.
En un aspecto, la invención se refiere a un
método, de aquí en adelante denominado "método de la
invención", para la detección de mutaciones en el gen EGFR en
una muestra de sangre de un sujeto, dicho método comprende:
- (i)
- obtener el ADN de dicha muestra;
- (ii)
- amplificar la secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región específica del gen EGFR por medio de PCR usando una sonda de ácido proteíno-nucleico, en donde dicha sonda de ácido proteíno-nucleico es capaz de específicamente reconocer e hibridar con la secuencia salvaje de EGFR inhibiendo por tanto su amplificación; y
- (iii)
- detectar dicha mutación.
El método de la invención se puede usar para
detectar cualquier mutación en el gen EGFR. En una forma de
realización particular de la invención, la mutación en el gen EGFR
a ser detectada se selecciona del grupo que consiste en: deleciones
ELREA en el exón 19, la mutación L858R en el exón 21 y la mutación
T790M.
Los ejemplos ilustrativos, no limitantes, de
muestras de las que se pueden extraer y analizar los ácidos
nucleicos usando el método de la invención incluyen, pero no están
limitados a, sangre tanto normal como cancerosa (suero o plasma) y
otros líquidos corporales que contienen ácidos nucleicos que se
puedan detectar.
Para llevar a cabo el método de la invención, se
obtiene una muestra del sujeto en estudio. En una forma de
realización particular, la muestra es una muestra de sangre. Las
muestras se pueden obtener de sujetos previamente diagnosticados o
no con NSCLC, o de sujetos que están recibiendo o han recibido
previamente tratamiento anti-NSCLC. En una forma de
realización, la muestra es una muestra de un sujeto que tiene tejido
de función pulmonar normal, es decir, un sujeto sin evidencias de
NSCLC.
En la práctica de la invención, la sangre se
recoge por métodos estándar en un tubo de recogida, que
preferiblemente comprende vidrio siliconizado, sin anticoagulante
para la preparación de suero o con EDTA, heparina o anticoagulantes
similares, lo más preferiblemente EDTA, para la preparación de
plasma. El plasma opcionalmente se puede convertir con
posterioridad en suero mediante incubación del plasma anticoagulado
con un volumen igual de cloruro de calcio a 37ºC durante un breve
periodo de tiempo, lo más preferiblemente durante
1-3 minutos, hasta que tiene lugar la coagulación.
El coagulo se puede precipitar después mediante una breve
centrifugación y retirar el plasma desproteinizado a otro tubo. De
forma alternativa, se puede omitir la centrifugación. También se
puede obtener el suero usando tubos activadores de coagulación.
En una forma de realización particular de la
invención, se puede utilizar el suero o plasma directamente para la
identificación del ADN mutante. En otra forma de realización
particular, el ácido nucleico se extrae del plasma o suero como un
paso inicial de la invención. En tales casos, el ADN total extraído
de dichas muestras representaría el material de trabajo adecuado
para la posterior amplificación.
Una vez que se ha obtenido la muestra, se lleva
a cabo la amplificación de ácidos nucleicos. En una forma de
realización particular, la amplificación del ADN se lleva a cabo por
medio de PCR. El experto en la materia conoce bien los principios y
condiciones generales para la amplificación y detección de ácidos
nucleicos, tal como el uso de PCR. En particular, la reacción en
cadena de la polimerasa (PCR) llevada a cabo mediante el método de
la presente invención usa cebadores oligonucleotídicos u
oligonucleótidos de amplificación apropiados y específicos para
amplificar específicamente las secuencias diana de EGFR. Ejemplos
ilustrativos, no limitantes, de tales oligonucleótidos de
amplificación incluyen las secuencias de SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO:
2. Los términos "cebadores oligonucleotídicos" u
"oligonucleótidos de amplificación" se usan aquí de forma
indistinguible y se refiere a un ácido nucleico polimérico que
tiene en general menos de 1.000 residuos, incluyendo aquellos en un
intervalo de tamaño que tienen un límite inferior de alrededor de 2
a 5 residuos y un límite superior de alrededor de 500 a 900
residuos. En formas de realización preferidas, los cebadores
oligonucleotídicos están en un intervalo de tamaño que tiene un
límite inferior desde alrededor de 5 hasta alrededor de 15 residuos
y un límite superior desde alrededor de 100 hasta 200 residuos. Más
preferiblemente, los cebadores oligonucleotídicos de la presente
invención están en un intervalo de tamaño que tiene un límite
inferior desde alrededor de 10 hasta alrededor de 15 residuos y un
límite superior desde alrededor de 17 hasta 100 residuos. Aunque los
cebadores oligonucleotídicos se pueden purificar a partir de ácidos
nucleicos naturales, en general se sintetizan usando cualquiera de
una variedad de métodos enzimáticos o químicos bien conocidos. En
una forma de realización particular de la invención, tales
cebadores oligonucleotídicos permiten la amplificación específica de
los fragmentos de ADN correspondientes a la deleción de
nucleótidos específicos en el exón 19 en el gen de EGFR.
De esta manera, en una forma de realización
particular, el método de la invención se puede usar para la
detección de deleciones ELREA en el exón 19. En una forma de
realización preferida, la presente invención se refiere a un método
para la detección de deleciones de 9, 12, 15, 18 o 24 nucleótidos en
el exón 19 del gen EGFR.
En otra forma de realización particular, el
método de la invención se puede usar para la detección de la
mutación L858R en el exón 21 del gen EGFR. En otra forma de
realización, el método de la invención se puede usar para la
detección de la mutación T790M en el gen EGFR.
El término "oligonucleótido de
amplificación" se refiere a un oligonucleótido que hibrida con un
ácido nucleico diana, o su complemento, y participa en una reacción
de amplificación de ácido nucleico. Los oligonucleótidos de
amplificación incluyen cebadores y
promotores-cebadores en los que el extremo 3' del
oligonucleótido se extiende enzimáticamente usando otra hebra de
ácido nucleico como molde. En algunas formas de realización, un
oligonucleótido de amplificación contiene al menos alrededor de 10
bases contiguas y más preferiblemente alrededor de 12 bases
contiguas, que son complementarias a una región de la secuencia
diana (o su hebra complementaria). Las bases que se unen a la diana
son preferiblemente al menos alrededor del 80% y más preferiblemente
alrededor del 90% al 100% complementarias a la secuencia a la que
se unen. Un oligonucleótido de amplificación tiene preferiblemente
desde alrededor de 10 hasta alrededor de 60 bases de longitud y
puede incluir nucleótidos modificados o análogos de bases.
Los términos "amplificar" o
"amplificación" se refieren a un procedimiento para producir
múltiples copias de una secuencia diana de ácido nucleico o su
complemento o fragmentos de la misma (es decir, el producto
amplificado puede contener menos de la secuencia diana completa).
Por ejemplo, se pueden producir fragmentos amplificando una parte
del ácido nucleico diana mediante el uso de un oligonucleótido de
amplificación que hibride con, e inicie la polimerización a partir
de, una posición interna del ácido nucleico diana. Los métodos
conocidos de amplificación incluyen, por ejemplo, amplificación por
reacción en cadena de la polimerasa (PCR), amplificación mediada
por replicasa, amplificación por reacción en cadena de la ligasa
(LCR), amplificación por desplazamiento de hebra (SDA) y
amplificación asociada a transcripción o mediada por transcripción
(TMA). La amplificación por PCR usa ADN polimerasa, cebadores para
hebras opuestas y ciclación térmica para sintetizar múltiples
copias de ADN o ADNc. La amplificación mediada por replicasa usa
QB-replicasa para amplificar secuencias de ARN. La
amplificación por LCR usa al menos cuatro oligonucleótidos
diferentes para amplificar hebras complementarias de una diana
usando ciclos de hibridación, ligación y desnaturalización. SDA usa
un cebador que contiene un sitio de reconocimiento para una
endonucleasa de restricción y una endonucleasa que corta una hebra
de un dúplex de ADN hemimodificado que incluye la secuencia diana,
seguido por una serie de pasos de extensión de cebador y
desplazamiento de hebra. También se conoce un método de
amplificación isotérmica por desplazamiento de hebra que no se basa
en cortes de endonucleasas. La amplificación asociada a
transcripción o mediada por transcripción usa un cebador que
incluye una secuencia promotora y una ARN polimerasa específica para
el promotor para producir múltiples transcritos de una secuencia
diana, amplificando así la secuencia diana.
Las formas de realización preferidas de la
presente invención amplifican las secuencias diana de EGFR usando
los presentes oligonucleótidos de amplificación en una amplificación
por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El experto en la
materia apreciará que estos oligonucleótidos de amplificación se
pueden usar fácilmente en otros métodos de amplificación de ácidos
nucleicos que use extensión de cebador mediada por polimerasa.
En el paso de amplificación del método de la
invención, se amplifica la secuencia de ácido nucleico
correspondiente a una región específica del gen EGFR por medio de
PCR usando una sonda de ácido proteíno-nucleico
(APN). Las sondas de APN son análogos de ácidos nucleicos en los
que el esqueleto de azúcar fosfato de un ácido nucleico natural se
ha cambiado por un esqueleto peptídico sintético, normalmente
formado de unidades de
N-(2-aminoetil)-glicina, lo que
produce un imitador aquiral y sin carga. Esta nueva molécula es
químicamente estable y resistente a rotura hidrolítica (enzimática)
y por tanto no se espera que se degrade dentro de la célula viva. A
pesar de todas estas variaciones de los ácidos nucleicos naturales,
APN es aún capaz de unirse al ADN de forma específica de secuencia
así como al ARN obedeciendo las reglas de puentes de hidrógeno de
Watson y Crick. Estos complejos híbridos muestran estabilidad
térmica extraordinaria y muestran propiedades únicas de fuerza
iónica. En muchas aplicaciones, se prefieren las sondas de APN a
las sondas de ácido nucleico porque, de forma diferente a los
dúplex ácido nucleico/ácido nucleico que se desestabilizan en
condiciones de baja sal, los dúplex APN/ácido nucleico se forman y
permanecen estables en condiciones de muy baja sal. Los expertos en
la técnica de la hibridación de ácidos nucleicos reconocerán que
factores normalmente usados para imponer o controlar la rigurosidad
de la hibridación incluyen la concentración de formamida (u otro
reactivo químico desnaturalizante), la concentración de sal (es
decir, fuerza iónica), temperatura de hibridación, concentración de
detergente, pH y la presencia o ausencia de caotropos. La
rigurosidad óptima para una combinación sonda/secuencia diana con
frecuencia se encuentra mediante la técnica bien conocida de fijar
varios de los factores de rigurosidad anteriormente mencionados y
después determinar el efecto de variar un único factor de
rigurosidad. Se pueden modular los mismos factores de rigurosidad
para controlar así la rigurosidad de la hibridación de un APN a un
ácido nucleico, excepto que la hibridación de un APN es bastante
independiente de la fuerza iónica. La rigurosidad óptima para un
ensayo se puede determinar de forma experimental mediante examen de
cada factor de rigurosidad hasta que se alcanza el grado de
discriminación deseado.
Se pueden preparar oligómeros de APN según
protocolos estándar de síntesis en fase sólida para péptidos
(Merrifield, B. 1986. Solid-phase synthesis.
Science 232, 341-347) usando, por ejemplo, una
resina de (metil-benzhidril)amina
poliestireno como el soporte sólido. Los APN pueden contener una
arquitectura quimérica, tal como una quimera APN/ADN, donde se
fusiona un oligómero de APN a un oligómero de ADN.
Las muestras clínicas contienen moléculas de ADN
con el alelo salvaje además de moléculas de ADN con el alelo
mutante. Así, en condiciones normales, es difícil detectar
mutaciones en EGFR (alelo mutante) en un fondo grande de genes EGFR
salvajes (alelo salvaje). La sonda de APN utilizada por los
inventores es capaz de específicamente reconocer e hibridar con la
secuencia salvaje de EGFR. Como ejemplo ilustrativo, no limitante,
la sonda de APN a ser usada para llevar a cabo el método de la
presente invención comprende la sonda de APN descrita como la SEQ
ID NO: 3 en el ejemplo que acompaña la presente invención. Tal sonda
se añade a la mezcla de reacción de PCR inhibiendo de esta manera
la amplificación del alelo salvaje y favoreciendo la amplificación
del alelo mutante presente en la muestra, es decir mutante de EGFR,
lo que facilita su posterior detección. Los expertos en la materia
apreciarán que una sonda de APN adecuada no necesita tener
exactamente estas secuencias de ácido nucleico que hibrida para ser
operativa sino que con frecuencia se modifica según las condiciones
particulares del ensayo. Por ejemplo, se pueden preparar sondas de
APN más cortas mediante truncado de la secuencia de ácido nucleico
si se necesita modificar la estabilidad del híbrido para disminuir
así la Tf y/o ajustar la rigurosidad. De forma similar, se puede
truncar la secuencia de ácido nucleico en un extremo y extender en
el otro siempre que la secuencia discriminante de ácido nucleico
permanezca en la secuencia de la sonda de APN. Se considera que
tales variaciones de las secuencias del ácido nucleico que hibrida
dentro de los parámetros descritos aquí son formas de realización
de esta invención.
Como se puede observar en el ejemplo 1 de la
presente invención, las condiciones de la reacción en cadena de la
polimerasa usando tal sonda de APN aplicada en el método de la
presente invención son tales que sólo 40 ciclos de amplificación
son suficientes para obtener un producto preciso de amplificación
por PCR que comprende un fragmento genómico de 120 pb que incluye
la mutación de interés del exón 19 en el gen EGFR.
Las condiciones generales para la PCR del método
de la presente invención son como se ilustra en el ejemplo 1 de la
presente invención. En este ejemplo, el ADN usado para la reacción
de amplificación por PCR es de muestras de suero/plasma.
Se han divulgado previamente muchos métodos para
detectar y analizar productos de amplificación de PCR. En
particular, la detección de mutantes de la secuencia de ADN puede
seguir cualquiera de un número de métodos que conocen los expertos
en la materia (Kilger et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:
2032-4). En una forma de realización particular de
la invención, el paso de detección del método de la invención se
lleva a cabo por medio de secuenciación de ácidos nucleicos.
Ejemplos ilustrativos, no limitantes, de métodos de secuenciación
de ácidos nucleicos son secuenciación cíclica (Sarkar et al.,
1995, Nucleic Acids Res. 23: 1269-70) o
secuenciación directa de didesoxinucleótidos, en la que parte o todo
el ADN de interés que se ha recogido de la muestra se usa como
molde para reacciones de secuenciación. Se usa un cebador
oligonucleotídico o un conjunto de cebadores específicos para el
gen o ADN de interés en reacciones estándar de secuenciación. Se
pueden usar otros métodos de secuenciación de ADN, tales como
secuenciación mediante hibridación, secuenciación usando un
"chip" que contiene muchos oligonucleótidos para hibridación
(como, por ejemplo, los producidos por Affymetrix Corp.; Ramsay
et al., 1998, Nature Biotechnology 16: 40-44;
Marshall et al., 1998, Nature Biotechnology 16:
27-31), secuenciación mediante HPLC (DeDionisio
et al., 1996, J Chromatogr A 735: 191-208) y
modificaciones de estrategias de secuenciación de ADN tal como
ensayo diagnóstico específico de alelo multiplex (MASDA; Shuber
et al., 1997, Hum. Molec. Genet. 6: 337-47),
huella de didesoxi (Sarkar et al., 1992, Genomics 13:
441-3; Martincic et al., 1996, Oncogene 13:
2039-44) y métodos de PCR basados en sonda
fluorogénica (tal como Taqman; Perkin-Elmer Corp.;
Heid et al., 1996, Genome Res. 6: 986-94) y
métodos basados en cleavase.
De forma alternativa, la amplificación se puede
llevar a cabo usando cebadores que se marcan de forma apropiada y
los productos amplificados de la extensión del cebador se pueden
detectar usando procedimientos y equipo para detectar el marcador.
Preferiblemente, las sondas de esta invención se marcan con al menos
un grupo detectable, en donde el grupo o grupos
detectable(s) se seleccionan del grupo que consiste en: un
conjugado, un sistema de detección ramificado, un cromóforo, un
fluoróforo, un marcador de espín, un radioisótopo, una enzima, un
hapteno, un éster de acridinio y un compuesto luminiscente. Como
ejemplo ilustrativo, no limitante, en el método de la presente
invención los cebadores usados se pueden marcar con un fluoróforo.
Más particularmente, el cebador inverso del método de la presente
invención se marca con el fluoróforo 6-FAM en su
extremo 5'. Este fluoróforo emite fluorescencia con una longitud de
onda pico de 522 nm. La PCR se puede llevar a cabo usando uno de
los cebadores marcados con, por ejemplo, colorantes FAM, HEX, VIC o
NED.
En una forma de realización preferida de la
invención, la detección y análisis posterior del ADN amplificado
con el método de la invención se lleva a cabo mediante la técnica de
GeneScan como se ilustra en el ejemplo que acompaña la presente
invención. De esta manera, en un ejemplo ilustrativo, no limitante,
para llevar a cabo el paso de detección del método de la invención,
se añade una alícuota de la reacción de PCR (típicamente 1 \mul)
a 9 \mul de formamida HI-DI y 0,25 \mul de
marcador de GeneScan -estándar de tamaño 500 LIZ. Después de
desnaturalizar, la muestra se coloca en el analizador genético ABI
3130 y se lleva a cabo electroforesis capilar. Los datos sin
procesar se analizan usando el software de GeneScan. Este análisis
es muy importante puesto que los productos de PCR se clasificarán
por tamaño mediante extrapolación a un estándar de tamaño en la
muestra. Usando esta técnica los inventores son capaces de detectar
de una forma muy precisa y exacta la mutación de interés.
La invención se ilustra adicionalmente con los
siguientes ejemplos, que se proporciona para ilustrar ciertas
formas de realización de la presente invención y no se debe
interpretar como limitante de la invención.
\global\parskip0.930000\baselineskip
Se colocó sangre venosa (10 ml) de cada sujeto
en tubos que contenían 50 mmoles de EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético) por litro y el ADN genómico se aisló con
el Mini Kit de ADN de sangre QIAmp® (Qiagen, Alemania), según las
instrucciones del fabricante.
- -
- Analizador de ADN Abi Prism 3130 (Perkin-Elmer, Applied Biosystems)
- -
- Placa de reacción óptica de 96 pocillos (Applied Biosystems, No. de catálogo 4306737).
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción de PCR se hizo como
sigue:
- -
- 2,5 \mul de tampón 10x (Ecogen)
- -
- 0,5 \mul de MgCl_{2} 50 mM (Ecogen)
- -
- 0,625 \mul de dNTP 10 mM (Promega)
- -
- 1,25 \mul de cada cebador 10 \muM
- -
- 0,1 \mul de TAQ polimerasa (Ecogen)
- -
- 12,5 \mul de sonda de APN 5 mM (Applied Biosystems)
- -
- 5 \mul de ADN de suero o plasma
- -
- Añadir H_{2}O destilada estéril hasta un volumen final de 25 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de reacción de PCR se hizo como
sigue:
- -
- 2,5 \mul de tampón 10x (Ecogen)
- -
- 0,5 \mul de MgCl_{2} 50 mM (Ecogen)
- -
- 0,625 \mul de dNTP 10 mM (Promega)
- -
- 1,25 \mul de cada cebador 10 \muM
- -
- 0,1 \mul de TAQ polimerasa (Ecogen)
- -
- 5 \mul de ADN de suero o plasma
- -
- Añadir H_{2}O destilada estéril hasta un volumen final de 25 \mul.
\vskip1.000000\baselineskip
El cebador inverso se marcó con el fluoróforo
6-FAM (6-FAM emite fluorescencia con
una longitud de onda pico de 522 nm).
| Cebador directo: | ACTCTGGATCCCAGAAGGTGAG | (SEQ ID NO: 1) |
| Cebador inverso: | 6-FAM-CCACACAGCAAAGCAGAAACTC | (SEQ ID NO: 2) |
| Secuencia de la sonda de APN: Ac-AGATGTTGCTTCTCTTA | \hskip0,3cm (SEQ ID NO: 3) |
\global\parskip1.000000\baselineskip
La PCR se realizó como sigue: 95ºC durante 5
minutos seguido por 40 ciclos a 95ºC durante 30 segundos, 58ºC
durante 30 segundos y 72ºC durante 1 minutos y una extensión final
de 72ºC durante 5 minutos.
\vskip1.000000\baselineskip
- -
- 9 \mul de formamida HI-DI (Applied Biosystems)
- -
- 0,25 \mul de marcador GeneScan -estándar de tamaño 500 LIZ (Applied Biosystems)
- -
- 1 \mul de producto final de PCR diluido
Las muestras se desnaturalizaron a 93ºC durante
3 minutos y se enfriaron en hielo durante 10 minutos. Después se
sometieron a electroforesis capilar y posteriormente se sometieron a
una longitud de onda de excitación de 494 nm para la detección de
la longitud de onda de emisión a 522 nm en el analizador de ADN ABI
3130.
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron un total de 41 muestras de
suero/plasma mediante GeneScan para la detección de deleciones en
el exón 19. Todas las muestras analizadas eran de pacientes con
mutaciones positivas en tejido tumoral.
Los resultados del análisis por GeneScan
muestran que el 55% de las muestras con mutaciones positivas en
tejido tumoral también eran positivas mediante el análisis por
GeneScan (Tabla 1).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se colocó sangre venosa (10 ml) de cada sujeto
en tubos que contenían 50 mmoles de EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético) por litro y el ADN genómico se aisló con
el Mini Kit de ADN de sangre QIAmp® (Qiagen, Alemania), según las
instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
- - AB 7000 o 7900HT (Applied Biosystems)
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de la reacción de PCR se hizo como
sigue (tabla 2):
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La PCR se realizó como sigue: 60ºC durante 2
minutos seguido por 50 ciclos a 95ºC durante 10 minutos seguido por
50 ciclos a 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto y 30
segundos.
\vskip1.000000\baselineskip
La sonda para detectar las secuencias salvajes
se marcó con el fluorocromo VIC, mientras que la sonda para
detectar el alelo mutante se marcó con el fluorocromo FAM.
| Cebador directo: | AACACCGCAGCATGTCAAGA | (SEQ ID NO: 4) |
| Cebador inverso: | TTCTCTTCCGCACCCAGC | (SEQ ID NO: 5) |
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda para la detección del alelo salvaje
marcada con el fluorocromo VIC:
| VIC-TCACAGATTTTGGGCTGGCCAAAC-TAMRA | (SEQ ID NO: 6) |
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda para la detección del alelo mutante
marcada con el fluorocromo FAM:
| 6-FAM-CAGATTTTGGGCGGGCCAAAC-TAMRA | (SEQ ID NO: 7) |
| Sonda de APN: AGTTTGGCCAGCCCA | (SEQ ID NO: 8) |
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron un total de 41 muestras de
suero/plasma mediante GeneScan para la detección de mutaciones en
L858R. Todas las muestras analizadas eran de pacientes con
mutaciones positivas en el tejido tumoral.
Los resultados del análisis del ensayo de la
actividad 5'-nucleasa muestran que el 55% (L858R) de
las muestras con mutaciones positivas en el tejido tumoral también
eran positivas mediante este análisis (tabla 3)
Se colocó sangre venosa (10 ml) de cada sujeto
en tubos que contenían 50 mmoles de EDTA (ácido
etilendiaminotetraacético) por litro y el ADN genómico se aisló con
el Mini Kit de ADN de sangre QIAmp® (Qiagen, Alemania), según las
instrucciones del fabricante.
\vskip1.000000\baselineskip
- - AB 7000 o 7900HT (Applied Biosystems)
\vskip1.000000\baselineskip
La mezcla de la reacción de PCR se hizo como en
el ejemplo 2 (tabla 2).
La PCR se realizó como sigue: 60ºC durante 2
minutos seguido por 50 ciclos a 95ºC durante 10 minutos seguido por
50 ciclos a 95ºC durante 15 segundos y 60ºC durante 1 minuto y 30
segundos.
\vskip1.000000\baselineskip
La sonda para detectar las secuencias salvajes
se marcó con el fluorocromo VIC, mientras que la sonda para
detectar el alelo mutante se marcó con el fluorocromo FAM.
| Cebador directo: AGGCAGCCGAAGGGC | (SEQ ID NO: 9) |
| Cebador inverso: CCTCACCTCCACCGTGCA | (SEQ ID NO: 10) |
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda para la detección del alelo salvaje
marcada con el fluorocromo VIC:
| VIC- TGAGCTGCGTGATGA-MGB | (SEQ ID NO: 11) |
\vskip1.000000\baselineskip
Sonda para la detección del alelo mutante
marcada con el fluorocromo FAM:
| 6-FAM-TGAGCTGCATGATGA-MGB | (SEQ ID NO: 12) |
| Sonda de APN: TCATCACGCAGCTC | (SEQ ID NO: 13) |
\vskip1.000000\baselineskip
Se analizaron un total de 4 muestras de
suero/plasma. Todas las muestras analizadas eran de pacientes con
mutaciones positivas en el tejido tumoral.
Los resultados del análisis del ensayo de la
actividad 5'-nucleasa muestran que el 75% (T790M) de
las muestras con mutaciones positivas en el tejido tumoral también
eran positivas mediante este análisis (tabla 4 para T790M)
\global\parskip0.000000\baselineskip
<110> PANGAEA BIOTECH, S.A.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> MÉTODO PARA LA DETECCIÓN DE
MUTACIONES EN EGFR EN MUESTRAS DE SANGRE
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P1665EPPC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> EP 07787764.5
\vskip0.400000\baselineskip
<141> 20/07/2007
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<150> EP06117551
\vskip0.400000\baselineskip
<151> 20/07/2006
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.5
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo diseñado para la
detección de la deleción ELREA en el exón 19 del gen EGFR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 22
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso diseñado para la
detección de la deleción ELREA en el exón 19 del gen EGFR. El
cebador está modificado mediante marcaje con el fluoróforo
6-FAM en su extremo 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de ácido
proteíno-nucleico (APN) diseñada para la detección
de la deleción ELREA en el exón 19 del gen EGFR. El cebador está
modificado con un grupo Ac en su extremo 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo diseñado para la
detección de la mutación L858R en el exón 21 del gen EGFR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso diseñado para la
detección de la mutación L858R en el exón 21 del gen EGFR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 24
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda diseñada para la detección de
los alelos salvajes del gen EGFR en la región de la mutación L858R.
El cebador está modificado con un grupo VIC en el extremo 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 21
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda diseñada para la detección del
mutante L858R en el alelo del gen EGFR. El cebador está modificado
con un grupo 6-FAM en el extremo 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de ácido
proteíno-nucleico (APN) diseñada para la detección
de la mutación L858R en el exón 21 del gen EGFR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador directo diseñado para la
detección de la mutación T790M en el exón 21 del gen EGFR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\hskip1cm13
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 18
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Cebador inverso diseñado para la
detección de la mutación T790M en el exón 21 del gen EGFR
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\hskip1cm14
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda diseñada para la detección del
alelo salvaje del gen EGFR en la región de la mutación T790M. El
cebador está modificado con un grupo VIC en el extremo 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 11
\hskip1cm15
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 12
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 15
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda diseñada para la detección del
mutante T790M en el alelo del gen EGFR. El cebador está modificado
con un grupo 6-FAM en el extremo 5'
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 12
\hskip1cm16
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 13
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 14
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Sonda de ácido
proteíno-nucleico (APN) diseñada para la detección
de la mutación T790M en el exón 21 del gen EGFR.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 13
\hskip1cm17
Claims (7)
1. Método para la detección de mutaciones en el
gen EGFR en una muestra de sangre de un sujeto, dicho método
comprende:
- (i)
- obtener el ADN de dicha muestra;
- (ii)
- amplificar la secuencia de ácido nucleico correspondiente a una región específica del gen EGFR por medio de PCR usando una sonda de ácido proteíno-nucleico en donde dicha sonda de ácido proteíno-nucleico es capaz de específicamente reconocer e hibridar con la secuencia salvaje de EGFR inhibiendo por tanto su amplificación; y
- (iii)
- detectar dicha mutación.
2. Método según la reivindicación 1, en donde la
mutación en el gen EGFR a ser detectada se selecciona del grupo que
consiste en: deleciones ELREA en el exón 19, la mutación L858R en el
exón 21 y la mutación T790M.
3. Método según la reivindicación 1, en donde
dicha muestra de sangre es una muestra de suero o plasma.
4. Método según la reivindicación 1, en donde el
paso de detección se lleva a cabo por medio de secuenciación de
ácido nucleico.
5. Método según la reivindicación 1, en donde el
paso de detección se lleva a cabo por medio de tecnología
GeneScan.
6. Método según la reivindicación 5, en donde
dicha tecnología GeneScan comprende usar un cebador
oligonucleotídico que está fluorescentemente marcado en su extremo
5' con un colorante fluorescente.
7. El método de la reivindicación 6, en donde
dicho colorante fluorescente se selecciona del grupo que consiste
en colorantes 6-FAM, HEX o NED.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP06117551 | 2006-07-20 | ||
| EP06117551A EP1881079A1 (en) | 2006-07-20 | 2006-07-20 | Method for the detection of EGFR mutations in blood samples |
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| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2346589T3 true ES2346589T3 (es) | 2010-10-18 |
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Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES07787764T Active ES2346589T3 (es) | 2006-07-20 | 2007-07-20 | Metodo para la deteccion de mutaciones en egfr en muestras de sagre. |
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| RS (1) | RS51428B (es) |
| SI (1) | SI2046985T1 (es) |
| WO (1) | WO2008009740A1 (es) |
Families Citing this family (43)
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