CN106536758A - 利用夹紧探针及检测探针的多靶核酸检测方法的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及利用夹紧探针及检测探针的靶核酸检测方法的应用，本发明可通过抑制野生型基因或不必要的基因的扩增，并选择性地扩增及检测所要检测的极微量的靶基因，来有效地检测试样内所包含的微量的变异或特定基因序列。并且，可通过熔解曲线分析来同时辨别多种基因型。尤其，可使用为通过被确认为高检测敏感度的极少量的突变基因型来辅助疾病的医学病态的诊断、预后、监测、治疗功效的评价、核酸及蛋白质转导研究的方法等。本发明包括利用组织等侵袭性标本和非侵袭性标本(血液、小便、痰、大便、唾液、细胞)来检测表皮生长因子受体EGFR、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物KRAS、神经母细胞瘤病毒癌基因NRAS等生物标志物并评价生物标志物的突变的存在的步骤，上述生物标志物及突变的存在提供用于在相关疾病的生命周期检测、疾病的预后、预测、决定疾病的治疗方针、疾病的诊断/早期诊断、疾病的预防、疾病治疗剂的开发中利用的方法。

Description

利用夹紧探针及检测探针的多靶核酸检测方法的应用

技术领域

本发明涉及利用夹紧探针及检测探针的靶核酸的检测方法及应用，随着迅速并敏感地检测基因试样所包含的微量的突变，可用在多种用途，尤其可向基因突变检测方法及对基因突变相关疾病的诊断或研究提供所需的多种信息。

并且，本发明涉及敏感地检测基因内微量含有的突变，由此辅助疾病或医学病态的诊断、预后、疾病的监测、治疗功效的评价、核酸及蛋白质信号转导研究等的方法。并且，本发明涉及在对象中监测各种疾病(例如，癌)的发作的方法及监测复发的方法。

背景技术

随着执行基因检查，可在具有疾病症状的患者中确诊或鉴别有所怀疑的遗传病。并且，也可通过检查是否存在引起疾病的基因的突变来预测提高疾病的发病可能性和危险度的疾病。在报告中指出，这种基因型的检查可有助于疾病的预防、早期诊断、治疗及管理，从而减少疾病的发病率和死亡率。

这种基因检查以人体内的所有细胞在遗传方面相同为前提，可以利用人体的任何组织进行基因检查，但最容易的方法为在血液中提取脱氧核糖核酸(DNA)来使用。多种试样可以为脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)、染色体、代谢物质等。

尤其，随着查明肿瘤基因(Oncogenes)的变异(mutations)、肿瘤抑制基因(tumorsuppressor genes)的变异、反常(deregulations)和染色体的异常(chromosomalabnormalities)等基因的异常干涉癌症的发明和药物的预后判断的事实，报告出多种研究(Fearson ER et al.,Cell.,1990；K.W Kinzler et al.,Cell.,1996；Manuel Serrano etal.,Cell.,1997；Amado RG et al.,J.Clin.Oncol.,2008,Raponi M et al.,Curr.Opin.Pharmacol.,2008；Siena S et al.,J.Natl.Cancer Inst.,2009)。

可通过对特异性基因的分析来间接地确认是否存在癌症的发病。例如，具有表皮生长因子受体(EGFR)核酸的相对增加，例如，具有如p53等肿瘤抑制基因的相对减少等。

并且，在肿瘤基因的功能和癌症的相关性及药物反应性等报告中提出肿瘤基因的突变检查的必要性。例如，有报告指出，若在结肠癌中频频观察得到的克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)外显子2(密码子12、密码子13)基因的突变检查后，向正常的克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物患者投用作为抗表皮生长因子受体抗体(anti-EGFRantibody)治疗剂的西妥昔单抗(cetuximab)，则反应率为35～45％左右(Lievre etal.Cancer Res 2006；66：3992-3995)，且在用于确认其他变异型大鼠肉瘤(RAS)的研究中，克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物外显子2(密码子12、密码子13)的变异率为40～45％，在克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物外显子2为正常的情况下，克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物密码子61、密码子146、神经母细胞瘤病毒癌基因(NRAS)密码子61、密码子12、密码子13等的变异率为约15～20％，因此，若检查癌除基因外显子2之外的其他大鼠肉瘤突变，则大鼠肉瘤变异率增加(Douillard et al.N Engl J Med.2013)。

在癌症的治疗中，以第一次抗癌化学疗法剂决定适当的药物极为重要。在大肠癌的情况下，在推出生物药剂(Biologic agent)之前，以投用FOLFOX6(氟尿嘧啶(fluoropyrimidine)、亚叶酸钙(leucovorin)、奥沙利铂(oxaliplatin))或FOLFIRI作为第一次治疗剂，并投用FOLFIRI或FOLFOX6作为第二次治疗剂的两种方法(Tournigand,etal.JCO 2004)进行治疗。然而，随着开发作为靶向治疗剂的贝伐单抗(bevacizumab)和西妥昔单抗(cetuximab)，当进行第一次治疗时，在向FOLFIRI追加贝伐单抗的情况下，已证明出具有生存期间延长效果，在晶体(CRYSTAL)研究中，若向正常的克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因患者并用FOLFIRI和西妥昔单抗，则呈现出生存期间延长的效果(VanCutsem,J Clin Oncol.2011)。

并且，与多种靶向治疗剂的开发一同报告出可预测这些药剂的反应的因子的研究。代表性地，涉及表皮生长因子受体(EGFR)单克隆抗体和克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS)基因的突变，表皮生长因子受体由于可通过克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物信号转导体系来促进细胞的生长和转移，因此在克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物信号转导体系出现异常的情况下，即，在克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物或鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1(BRAF)发生突变的情况下，可减少阻断表皮生长因子受体的效果。实际上，报告中指出，克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变和鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1突变为可预测减少如西妥昔单抗或帕尼单抗(panitumumab)的表皮生长因子受体单克隆抗体的治疗效果的标志物(Eberhard DA J ClinOncol,2005/Karapetis CS,N Engl J Med,2008/Di Nicolantonio F J ClinOncol,2008)。

与此相关，在对阿斯利康制药有限公司(Astrazeneca)的吉非替尼(gefitinib)单一疗法的2期研究资料的小组分析资料中，证明出对吉非替尼表现出释放学性反应的患者的临床特性为女性、非吸烟者、腺癌及东洋人的事实，而且这种结果在之后的厄洛替尼(erlotinib)研究资料中也表现出出奇的一致的结果。并且，在BR.21的研究结果中也可观察到与厄洛替尼反应相关的临床要素中，在腺癌、非吸烟者、东洋人中存在类似的生存资料的差异。基于这种临床资料，提出在与表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂(EGFR-KTI)发生反应的小组患者中存在可说明原因的某种分子机制的假设，且在假设癌基因依赖(oncogene addiction)的条件下，对表皮生长因子受体基因的碱基序列进行解读后发现表皮生长因子受体发生突变。虽然已知在多种肿瘤(乳腺癌、神经胶质瘤、前列腺癌等)中，表皮生长因子受体发生突变，但其位置发生在大部分细胞外结构域(domain)中，也与表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的反应无关。

相反，在决定表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂反应的突变确认结果，确认表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂在用于决定在细胞内产生作用的酪氨酸激酶结构域(tyrosin kinase domain)的外显子内产生，且确认这些为与腺嘌呤核苷三磷酸结合袋(ATP-binding pocket)或活性环(activation loop)相关的突变。表皮生长因子受体-酪氨酸激酶结构域(EGFR tyrosine kinase domain)由七个外显子(18～24)构成，但大部分的表皮生长因子受体突变位于外显子18～21且分为如下三种类型。外显子19的缺失(deletion)占60％，外显子21的错义突变(L858R，missense mutation)占25％，剩余的很罕见，但为外显子18、外显子20、外显子21的点突变(point mutation)和外显子20的插入/复制(insertion/duplication)。这种表皮生长因子受体突变被公认为选择性地激活用于在表皮生长因子受体的下部信号转导通路中促进细胞及抗凋亡的苏氨酸激酶(Akt)和转录激活因子(STAT)通路，相反，不影响与细胞增殖相关的细胞外信号调节激酶(ERK，extracellular signal-regulated kinas)通路，因此被证明为若使用表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂，则会发生凋亡来表现迅速的效果。表皮生长因子受体酪氨酸激酶结构域的突变率发现于到目前为止所分析的非小细胞肺癌的约20％中，且以特别高的频率发现于腺癌、东洋人、女性、非吸烟者等中，从而表现出与表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂反应率高的临床指标完全一致的结果。然而，有报告指出，在发生表皮生长因子受体突变的情况下，若使用表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂，则生存率并未明显增加。

在表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂耐性-表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂投入临床不久，发现包括对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂表现出极端反应的患者的大部分的患者终究会发生复发。目前，证明出外显子20发生第二次突变(T790M)来获得对吉非替尼或厄洛替尼的耐性的事实，但推测这种突变会决定性地妨碍药物在腺嘌呤核苷三磷酸结合袋中的氢键，且这也是在使用表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的过程中需要克服的又一问题，因此，正在进行没有获得耐性问题的表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的开发研究。

目前，作为决定对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的反应的要素中的一个，提出克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(K-ras)，但对于具有克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物外显子2突变的患者来说，几乎没有发生表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的进行反应的情况。虽然告知在腺癌的30％中发现克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，但容易发生在吸烟者及男性之中，且在东洋中的频率低的事实中呈现出与表皮生长因子受体突变几乎完全相反的现象。基于此，也公开在腺癌的致癌过程中，非吸烟者通过表皮生长因子受体突变来发病，而吸烟者则通过克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物来发病的假设。除基于表皮生长因子受体第二次突变的获得耐性之外，内生性耐性问题也是为了提高表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的反应率而需要解决的问题，但推定目前作为与此相关的因子，与表皮生长因子受体配体(ligand)的作用、作为表皮生长因子受体的下部通路的磷脂酰肌醇(-3)激酶(PI3K)/苏氨酸激酶(AKT)及促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)的表皮生长因子受体-非依赖性活性化中四硝酸戊赤藓醇(PTEN)的作用及除表皮生长因子受体之外的其他肿瘤通路(oncogenic pathway)(例如，胰岛素样生长因子受体通路(IGF-IRpathway))等有关。

西妥昔单抗((Cetuximab，C225，Erbitux)作为与表皮生长因子受体的细胞外与收容性部位结构域III(domain III)相结合的鼠科/人嵌合(murine/human chimeric)单克隆抗体而阻断表皮生长因子受体的二聚化。众所周知，与单一疗法相比，西妥昔单抗在与现有的细胞毒性抗癌疗法的并用治疗中效果明显。在与顺双氯双氨泊铂(Cisplatin)并用的1期研究中确认没有毒性，而在复发性非小细胞肺癌患者中基于免疫组织化学的表皮生长因子受体的表达在以+1以上的患者为对象的2期研究中与多西他奇(docetaxel)并用治疗的结果，呈现出25％的反应率、60％以上的疾病调整率等振奋人心的结果。基于此，目前正在进行与多西他奇或培美曲塞(pemetrexed)的并用治疗3期研究。目前，西妥昔单抗在大肠癌中得到承认，且有报告指出，在局部晚期头颈部癌中因与释放疗法的并用治疗而具有上升效果。

如上所述，除目前得到承认的表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂、吉非替尼、厄洛替尼及贝伐单抗之外，正在开发多种靶向治疗剂，并执行活跃的临床研究，而特定基因的突变型的敏感分析可向靶向治疗剂的开发提供很多信息。

尤其，虽然已经证明目前吉非替尼和厄洛替尼作为单一疗法剂而仅对第二次治疗中的一部分受限的患者呈现出效果的事实和获得耐性问题、贝伐单抗作为第一次治疗剂的效果，但可以提供为何只有一部分患者才可以使用的解开线索的信息。并且，今后可以在研究中以多种方式使用与新的靶向治疗剂和细胞毒性抗癌疗法间的并用治疗、靶向治疗剂间的并用疗法、作为手术后辅助疗法剂的作用、对目标治疗剂的选择的分子生物学指标的开发等。

并且，抗表皮生长因子受体抗体抑制调整细胞增殖的大鼠肉瘤/促分裂原活化蛋白激酶机制，由此具有抑制癌细胞的增殖的效果，但在克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物发生变异的患者对抗表皮生长因子受体抗体不发生反应，因此，有报告指出在进行化学疗法时，确认癌患者的基因型极为重要(Herreros-Villanueva et al.Clin ChimActa.2014)，并且在报告中介绍多种用于确认癌患者的基因型的检查方法和技术。

由于具有临床意义的突变的检测极为重要，因此根据所要分析的目的或基因的种类来报告出用于诊断的多种检测方法(Taylor CF,Taylor GR.Methods Mol.Med.,92:9,2004)。然而，由于分析试样中存在的突变癌细胞的数量相对少于正常细胞，因此，对突变癌细胞的检测极为困难，且需要高超的检测技术(Chung et al,Clin Endocrinol,2006/Trovisco et al,J Pathol.,2004)。

作为基因变异检查方法，具有作为传统方法的桑格测序(sanger sequencing)、焦磷酸测序(pyrosequencing)、目前开发的实时荧光定量聚合酶链式反应(real-time PCR)、数字聚合酶链式反应(digital PCR)等。桑格测序由于试剂的价格低廉且呈现出所有的测序，因此可找出新的变异型。焦磷酸测序虽然比桑格测序敏感度高，且速度快，而且还方便于数据解释，但无法确认所有变异型(Tan et al.World J Gastroenterol2012)。实时荧光定量聚合酶链式反应具有即使没有专门的背景知识也可以进行检查，且可以以较少人力快速地进行检查，而且敏感度和再现性优秀、便于解决所发生的问题的优点。

并且，作为用于检测少量含有的突变的代表性方法，介绍基于为了选择性增加突变基因而在突变利用特异性引物的等位基因特异性(allele specific)聚合酶链式反应方法(Rhodes et al.,Diagn mol pathol.,6:49,1997)、天蝎式实时等位基因特异性聚合酶链式反应(scorpion Real-time allele specific PCR，DxS'scorpions and ARMS)方法(Mark et al.,Journal of Thoracic Oncology,4:1466,2009)、利用等位基因特异性引物技术和小沟结合物(MGB，minor groove binder)-探针来抑制野生型基因的扩增并且仅选择性扩增突变基因后，利用探针技术(Taqman)探针来不包括发生突变的位置而检测扩增产物的竞争性等位基因特异的TaqMan聚合酶链式反应(CAST PCR)方法(Didelot A et al.,Exp Mol Pathol.,92:275,2012)、可利用临界变性温度(TC，critical denaturationtemperature)来增加突变的敏感度的低变性温度下复合扩增聚合酶链式反应(Cold-PCR)方法(Zuo et al.,Modern Pathol.,22:1023,2009)等实时的聚合酶链式反应技术的多种分析方法，且这些方法容易且迅速地提供与多种癌相关的基因的变异诊断及分析(Bernardet al.,Clinical Chemistry,48:1178,2002)。

肽核酸(PNA，Peptide nucleic acid)为以N-(2-氨基乙基)甘氨酰胺为基本骨架的核酸类似物(Nielsen PE et al.,Science,254(5037):1497,1991)。与脱氧核糖核酸探针相比，肽核酸骨架作为电中性而对具有互补碱基序列的靶核酸具有更高的特异性。并且，由于具有不被核酸酶(Nuclease)或蛋白酶(protease)分解的优点，因而极其有用于利用探针的分子诊断方法(Egholm et al.,Nature,365:556,1993；Nielsen et al.,Bioconjugate Chem.,5:3,1994；Demidov,et al.,Biochem.Pharmacol.,48:1310,1994)。利用这种肽核酸的优点，1993年开发出聚合酶链式反应夹紧(clamping)技术(Henrik Orumet al.,Nucleic Acids Res.,21:5332,1993)。该技术作为将肽核酸探针与不需要扩增的基因相结合来抑制聚合酶链式反应扩增的技术，若利用与野生型基因互补的肽核酸探针，则在聚合酶链式反应中选择性地抑制野生型基因的扩增，从而可迅速且准确地检测与野生型相比存在极少量的突变。

并且，报告出应用肽核酸夹紧技术的多种技法。肽核酸-锁核酸箝(美国公开专利第2013-0005589号；Yoshiaki Nagai et al.Cancer Res.,65(16):7276,2005)方法为以对靶部位使具有野生型基因排列的肽核酸夹紧探针和具有变异基因排列的检测用锁核酸探针技术探针竞争性地进行杂交(hybridization)的方式设计来选择性地进行扩增及检测的方法。肽核酸杂交探针(hyb probe)(PNA as both PCR clamp and sensor probe；美国公开特许第2008-0176226号)为以使用肽核酸探针来代替现有罗氏公司(roche)的杂交探针系统的供体(donor)探针，并通过肽核酸探针来同时进行夹紧和检测的方式设计的方法。肽核酸夹紧&嵌入剂检测(PNA Clamping&intercalator detection)方法(Makito Miyake etal.,Biochem Biophys Res Commun.,2007)为利用肽核酸探针夹紧野生型基因并且仅选择性地扩增突变型基因后利用嵌入剂来检测扩增产物的方法等多种技法。

发明内容

技术问题

癌症由基因型的突变引起，大约有50～80种并不存在于非肿瘤细胞中的突变([Joneset al.,2008]；[Parsons et al.,2008]；[Wood et al.,2007])。作为检测这种突变型的技法，具有活检标本分析及循环如血液等体液的突变体肿瘤基因分析方法(Diehlet al.,2008)。然而，在分析活检标本的情况下，可存在侵袭性、合并症等的有害性。并且，活检分析方法从局限的部位中提取组织试样，但在肿瘤为异性或分散于正常组织内的情况下，组织试样可以为假阳性体或假阴性体。为了克服这种方法，需要非侵袭性且高灵敏度的诊断方法。

并且，肿瘤组织的每个细胞所具有的突变种类可以不同(Heterogeneity)，且混有正常的细胞，因此，为了准确的突变检查，必须执行通过高敏感度的检查方法和显微镜检查的肿瘤部位确认步骤及对于对相应部位的选择性的脱氧核糖核酸的提取及检查。

并且，在血液等体液中循环的突变的脱氧核糖核酸分析由于在体液中的突变体癌脱氧核糖核酸的复制数极低，因此灵敏度本来就不充分(Gormally et al.,2007)。为了克服这种缺点，需要开发可检测具有高特异性及高敏感度的肿瘤细胞的诊断方法。

有报告指出很多用于检测基因多态性的方法，例如，可举例聚合酶链式反应(PCR，Polymerase Chain Reaction)-限制性片段长度多态性(RFLP，Restriction FragmentLength Polymorphism)法等。聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法为对于试样的靶脱氧核糖核酸以聚合酶链式反应扩增检测目的的区域，并且对扩增物进行约束酶处理，以萨瑟思杂交来序列分析基于多态性的限制断片长度的变化的方法。若在基因中存在目的变异，则可因约束酶的识别部位消失而通过是否存在切割，即，限制断片长度的变化来检测是否存在变异。然而，例如在聚合酶链式反应后，聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性法需要对所获得的扩增物进行多种约束酶处理后进行分析，而所获得的扩增物的约束酶处理过程因利用第一次执行的扩增产物而在结果中可能发生误差。

目前，作为多态性的检测方法，提出解链温度(Tm，Melting Temperature)分析方法。通过解链温度分析的多态性的检测方法为使用与包括检测目的的多态性的区域互补的探针，来形成检测探针的杂交物(双链核酸)，上述检测探针与核酸互补。并且，上述解链温度为对所获得的杂交物进行加热处理，从而以吸光度等的信号测定来检测作为温度上升的杂交物的单链核酸的解链点，并利用解链温度值的结果来判断多态性的方法。

杂交物的两单链核酸的互补性越高，解链温度值越高，而杂交物的两单链核酸的互补性越低，解链温度越低。因此，可计算出与基因互补的探针之间的杂交物的解链温度值(评价基准值)，并对所要检查的核酸和与探针的解链温度值(测定值)进行比较后，判别所检查的核酸的检测对象部位是否与目的基因相同。并且，在测定值低于检查平均基准值的情况下，可判断出被检核酸的检测对象部位为其他型。

这种方法可在添加检测探针的聚合酶链式反应后以仅执行信号测定的方式检测多态性。利用解链温度分析的检测方法应可以以解链温度值来判断单碱的差异，且在基因具有多个多态性的情况下，便于进行结果分析。尤其，即使是在野生型的多态性和多个变异型的多态性混合存在的情况下，也需要准确地检测是否存在变异。本发明可以以能够通过单碱的差异或解链温度分析来进行检测的方式设计探针。

例如，基因的多态性的检测在疾病的诊断及治疗法的选择方面非常重要。因此，本发明的目的在于，提供可以以简单且优秀的敏感度来判别作为疾病相关基因的表皮生长基因受体、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物及神经母细胞瘤病毒癌基因的多态性检测用探针及其用途。

作为基因变异检查方法，具有作为传统方法的桑格测序、焦磷酸测序、目前开发的实时荧光定量聚合酶链式反应、数字聚合酶链式反应等。桑格测序因试剂的价格低廉且呈现出所有的测序而可找出新的变异型。然而，桑格测序具有敏感度低，检查时间长且可进行主观性分析的缺点。作为桑格测序和实时荧光定量聚合酶链式反应的中间步骤的焦磷酸测序虽然比桑格测序敏感度高，且速度快，还便于数据解释，但无法确认所有变异型。并且，在与实时荧光定量聚合酶链式反应进行比较时，可找出比实时荧光定量聚合酶链式反应特定的变异型，并且也可通过数据分析来确认新的基因变异，但检查所消耗的时间变长且敏感度低(Tan et al.World J Gastroenterol 2012October7；18(37):5171-5190)。

尤其，应用于本技术的实时荧光定量聚合酶链式反应即使没有专门的背景知识也可以进行检查，且可以以减少人力快速地进行检查。并且，敏感度和再现性优秀、便于解决所发生的问题。然而，由于以发生变化的测序(sequencing)为对象来发现基因，因此无法找打所有变异型。

因此，本发明提供以高的检测敏感度检测极少量的突变基因型的方法，并将这种方法利用于疾病的生命周期监测、疾病的预后、预测、决定疾病的治疗方针、疾病的诊断/早期诊断、疾病的预防、疾病治疗剂的开发等。

解决问题的手段

为了更为敏感地实时检测靶核酸，利用夹紧探针(clamping probe)和一同包含荧光子及淬灭基团的荧光检测探针(detection probe)的混合体来确认可以选择性地以高敏感度检测所需基因，并确认容易进行相邻的突变检测，而且确认野生型基因和靶核酸基因的解链温度差异，从而确认可以利用熔解曲线(melting curve)分析来同时通过多靶核酸的检测判别基因型。

为了更为敏感地检测靶核酸，本发明发明了包含用于实时检测靶核酸的一个以上的检测探针及用于抑制野生型基因或不必要基因的扩增的夹紧探针的探针混合体和利用上述探针混合体的同时多靶核酸检测方法及利用上述同时多靶核酸检测方法的分子诊断试剂盒。

本发明的探针混合体提供利用在相同链上竞争性地进行杂交的夹紧探针及由报告基团(reporter)和淬灭基团(quenching)相结合的一个以上的检测探针的同时多靶核酸检测方法及其用途。

可利用本发明的探针混合体系统来应用于分子诊断、产前诊断、早期诊断、癌症诊断、基因相关诊断、基因物质诊断、感染菌的诊断、抗药性细菌的判别、法医学、生物体的种类判别等多种分子诊断技术。

尤其，为了对癌症患者实施适当的诊断及治疗，需要确认癌瘤的多种分子特性。并且，比基本的方法更为敏感且特异性高的本发明的技术可检测正常基因内所包含的微量的基因表达、点突变、融合基因等，并且便于理解癌症总体的遗传性基础，而且可应用于诊断及治疗。

一般情况下，本发明敏感地检测体液内，尤其，血液内所含有的表皮生长因子受体、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物及神经母细胞瘤病毒癌基因等的突变型，由此辅助相关的疾病、其他医学性病态及早期诊断/诊断治疗功效、监测及评价。并且，可包括对与疾病相关的突变检测结果和正常对比组进行比较来确认突变型和疾病间的相关关系或其他医学性病态(例如，癌症)的步骤。并且，本发明可使通过基因型来确认的治疗方法及药物反应性预测决定变得可能。

发明效果

若利用本发明的靶核酸检测方法，则可抑制野生型基因或不必要的基因的扩增，且可通过极微量的靶核酸基因的选择性的扩增和选择性的检测来有效地检测由试样内所包含的单碱变异及碱基的缺失或插入引起的变异，并且可使用多个检测探针和多个扩增抑制探针来同时分析扩增曲线和熔解曲线，从而不仅可以同时进行多靶核酸检测及定量，而且可通过熔解曲线分析来判别基因型。并且，可以以高敏感度检测靶，因此可极为有效地使用于需要极少量靶检测的早期诊断。

例如，根据本发明的多态性检测用探针，可以简单且以优秀的依赖性判别表皮生长因子受体、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物及神经母细胞瘤病毒癌基因所包含的微量的突变型。具体地，例如，在试样中，即使是在目的野生型的基因和变异型的基因共存的情况下，也执行使用本发明的多态性检测用探针的解链温度分析，由此可以简单且以优秀的依赖性检测多态性的种类或是否存在变异。因此，本发明对含有大量的野生型基因和微量的变异型基因的试样尤其有用。根据本发明，由于可简单且以优秀的依赖性判别表皮生长因子受体、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物及神经母细胞瘤病毒癌基因的多态性，因此，例如可在如上所述的疾病的诊断及治疗法的选择方面反映检测结果。因此，本发明可谓对医疗领域等极为有用。

具体实施方式

本发明涉及利用用于抑制野生型或不必要的基因的扩增的夹紧探针和由报告基团及淬灭基团相结合的检测探针来同时检测多靶核酸的方法及上述检测方法的应用。

本发明的检测探针可为选择性地检测所要检测的靶核酸基因的探针。夹紧探针可意味着与野生型基因或不必要的基因互补结合来在进行聚合酶链式反应期间抑制聚合酶延伸反应的探针，探针混合体意味着由一个以上的检测探针及夹紧探针构成的探针系统。

本发明的靶核酸可意味着所要检测的所有种类的核酸，且可包括突变基因或不包括突变基因。可以以包含遗传体脱氧核糖核酸(genomic DNA)和线粒体脱氧核糖核酸(mitochondrial DNA)、病毒脱氧核糖核酸(viral DNA)的所有种类的基因或包含信使核糖核酸(mRNA)、核糖体核糖核酸(ribosomal RNA)、非编码核糖核酸(non-cording RNA)、转运核糖核酸、病毒核糖核酸(viral RNA)等所有种类的核糖核酸为特征，但并不局限于此。在杂交、退火(annealing)或扩增条件下，与引物或探针进行退火或杂交。

本发明的杂交意味着互补的单链核酸形成双链核酸。可在两个核酸的碱基序列间互补性一致的情况下实现杂交，或者即使存在一部分错配(mismatch)的碱基的情况下也可以实现杂交。杂交所需的互补性的反应的进行程度可根据温度等杂交条件而变得不同。

本发明的突变作为在野生型基因碱基序列中发生变异的突变，不仅包括单核酸多态性(SNP，single nucleotide polymorphism)，而且还包括由碱基的取代、缺失或插入引起的变异。并且，包括可在自然中发生的体细胞突变(somatic mutation)和生殖细胞突变(germ line mutation)，而且还无限制地包括人为诱导碱基序列的变异的人工突变等。

本发明的体细胞变异被誉为通过信号转导过程的反常等来导致细胞发生癌变的主要原因。有意义的体细胞突变(somatic mutation)可例举克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1、表皮生长因子受体、JAK2、HER2、BCL-ABL、神经母细胞瘤病毒癌基因、人V-HA-RAS肉瘤病毒癌基因同源物(HRAS)、异柠檬酸脱氢酶1(IDH1)、,新陈代谢基因异柠檬酸脱氢酶2(IDH2)、C-KIT、TP53、表皮生长因子受体、PIK3CA等各种与癌症相关的基因。本发明确认本发明对体细胞基因表皮生长因子受体、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物及神经母细胞瘤病毒癌基因的突变的情况作出反应，并公开其应用领域。

在本发明中，检测探针或夹紧探针作为与靶核酸互补结合的所有核酸及核酸类似物，可分别选自由寡核苷酸(oligonucleotide)、肽核酸(peptide nucleic acids)及锁核酸(Locked nucleic acid)组成的组中。由于用于聚合酶链式反应的聚合酶一般具有核酸酶(nuclease)活性，存在发生探针受损的可能性，因此，优选地，使用如肽核酸等对核酸酶稳定的合成核酸。并且，检测探针起到选择性地检测目的靶核酸基因的作用，因此，可使用本发明所属技术领域公知的用于检测核酸的探针。

优选地，在本发明的一实施例中使用肽核酸探针，且肽核酸探针作为人工合成脱氧核糖核酸而可以与靶脱氧核糖核酸或核糖核酸以特异性的方式相结合，并且由于对核酸酶稳定，因此可进行基于探针的熔解曲线分析。并且，由于肽核酸探针具有在与脱氧核糖核酸相结合后抑制聚合酶的延伸反应的性质，因此，在本发明中，使用以与野生型基因实现完全实现杂交的方式制备的肽核酸探针作为夹紧探针，且为了同时以多重方式检测靶核算，肽核酸检测探针与靶核酸基因实现完整的杂交。

并且，在本发明中，夹紧探针及检测探针可在N末端、C末端或探针(合成核酸)骨架的α、β、γ、接头(Linker)位置结合天然氨基酸及合成氨基酸的支链等特定官能团，由此带来立体结构性变化，上述氨基酸可以以不具有电荷，或者具有阴电荷或阳电荷为特征，但并不局限于此，可使用本发明所属技术领域公知的探针立体结构变化及电荷赋予方法。

本发明的检测探针的两末端可以与能够对报告基团和报告基团荧光进行猝灭(quenching)的淬灭基团相结合，并且可包含嵌入(intercalating)荧光物质。报告基团作为吸收、释放特定波长的光来释放荧光的物质，意味着可标志于探针来确认是否实现靶核酸和探针之间的杂交的物质，可以为选自由荧光素(fluorescein)、荧光素氯三嗪(fluorescein chlorotriazinyl)、罗丹明绿(rhodamine green)、罗丹明红(rhodaminered)、四甲基若丹明(tetramethylrhodamine)、异硫氰酸荧光素(FITC)、俄勒冈绿(Oregongreen)、超级绿色荧光(Alexa Fluor)、羧基荧光素(FAM)、JOE、罗红霉素(ROX)、六亚甲基四胺(HEX)、德克萨斯红(Texas Red)、四亚甲基二砜四胺(TET)、四甲基若丹明异硫氰酸盐(TRITC)、羧基四甲基罗丹明(TAMRA)、青霉素(Cyanine)系列染料及三碳菁(thiadicarbocyanine)染料组成的组中的一种以上，但并不局限于此，可使用本发明所述技术领域公知的释放荧光的物质。

并且，淬灭基团意味着吸收报告基团所释放的光来减少荧光强度的物质，可以为选自苯甲酸(Dabcyl)、羧基四甲基罗丹明、Eclipse、二氯二氰基苯醌(DDQ)、QSY、黑莓猝灭(Blackberry Quencher)、黑洞猝灭(Black Hole Quencher)、Qxl、爱荷华黑(Iowa black)FQ、爱荷华黑RQ、IRDye QC-1组中的一种以上，且并不局限于此，根据种类的不同，淬灭基团减少荧光强度的范围也不同，从而可以考虑其来使用。

利用本发明的探针混合体的同时，多靶核酸检测方法的特征在于，利用与野生型基因或不必要的基因互补结合来抑制聚合酶延伸反应的一个或一个以上的夹紧探针来选择性地扩增所要检测的靶核酸基因，并利用用于特异性地检测靶核酸的一个或一个以上的检测探针来检测是否存在多靶核酸或监测浓度，而且可利用探针混合体的靶核酸的检测来实时一同分析扩增曲线及熔解曲线。

本发明的夹紧探针及检测探针为在相同链上与靶基因进行杂交，或者与夹紧探针及检测探针互补的链杂交来同时进行野生型基因的阻断(blocking)及靶核酸基因的检测的方法。即，若夹紧探针完全与野生型基因杂交(perfect match)，则可抑制野生型基因的扩增，因此可进行极微量的靶核酸基因的选择性的扩增及检测，并且，可使用一个以上的额检测探针来同时检测多靶核酸。

在利用探针混合体的靶基因的扩增过程中，在退火步骤中夹紧探针和检测探针向相同链或互不相同的互补的链进行退火，并且具有报告基团和淬灭基团的检测探针与所要检测的靶核酸基因特异性地相结合，来表现出扩增曲线信号(荧光)。在之后的延伸(extension)步骤中，夹紧探针依然与野生型基因或不必要的基因进行杂交，从而抑制野生型基因或不必要基因的扩增，并且，由于以低于靶核酸的延伸步骤的解链温度制备出检测探针，因此，检测探针与靶核酸相分离来进行扩增。

可通过这种扩增过程来实时分析扩增曲线，且可利用在上述扩增过程中产生的扩增产物来分析熔解曲线。在熔解曲线分析步骤中，检测探针虽然在较低温度下与靶核酸基因进行杂交，来呈现出荧光信号，但随着温度上升，上述检测探针与靶核酸相分离来猝灭荧光。

一般情况下，为了同时检测多个靶核酸，以往的利用实时的聚合酶链式反应的扩增曲线分析方法在试样内检测靶核酸的过程中，使用荧光物质，因此，为了检测两种以上的靶核酸而需要与靶数量相同的具有荧光物质的探针，从而多重检测受到限制，但本发明的同时检测多靶核酸的方法可利用探针混合体来同时执行扩增曲线及熔解曲线分析，因此以可利用一个荧光物质来进行多靶的检测为特征。

在本发明的一实施例中，可以为了确认溶解温度的差异而在肽核酸的γ位置导入具有阴电荷的L-谷氨酸(L-glutamic acid)或D-谷氨酸(D-glutamic acid)、不具有电荷的L-丙氨酸(L-alanine)或D-丙氨酸(D-alanine)、具有阳电荷的L-赖氨酸(L-lysine)或D-赖氨酸(D-lysine)的支链，且可合成在接头位置导入L-赖氨酸、L-谷氨酸的肽核酸探针。

在肽核酸骨架的γ位置结合D-谷氨酸等来赋予结构性变化(立体结构及电荷变异)的肽核酸探针与没有结构性变化的肽核酸探针相比时，靶脱氧核糖核酸和单碱错配脱氧核糖核酸的解链温度之差(Δ解链温度)大幅度增加，且对本发明的结构实施变形的肽核酸探针也增加对单碱序列发生变异的特意性，从而使野生型基因和靶核酸基因的溶解温度差异变得显著，因此，可改善对于实时的扩增曲线的非特异结合，并减少可在熔解曲线分析时出现的问题。

一般情况下，为了同时检测多个靶核酸而利用以往的实施聚合酶链式反应的扩增曲线分析方法在试样内检测靶核酸的过程中使用荧光物质，因此，为了检测两种以上靶核酸而需要与靶数量相同数量的具有荧光物质的探针，使得多重检测受到限制，但本发明的同时检测多靶核酸的方法可利用探针混合体来同时执行对扩增曲线及熔解曲线的分析，因此以可利用一种荧光物质来进行多靶的检测为特征。

并且，利用本发明的探针混合体的同时检测多靶核酸的方法并不局限于对扩增曲线及熔解曲线的同时分析，而是可以单独或依次分析扩增曲线或熔解曲线，并且根据需要，可以只执行扩增曲线或熔解曲线分析来检测靶核酸。尤其，在不需要定量分析的情况下，即使省略扩增曲线分析而仅分析熔解曲线也可区分是否存在靶核酸或基因型。

本发明的同时检测多靶核酸的方法具体包括：步骤(a)，在包含靶核酸的标本试样中混合由夹紧探针及检测探针构成的探针混合体及引物来进行杂交，并获得实时的扩增曲线；步骤(b)，在上述扩增步骤之后，一边使温度发生变化，一边获得扩增产物和检测探针间的熔解曲线；以及步骤(c)，单独分析或依次分析或同时分析所获得的上述实时的扩增曲线及熔解曲线。

上述步骤(a)的夹紧探针及检测探针可根据所要检测的靶核酸的数量进行多种调整，在获得上述熔解曲线的步骤中，可以为了减少扩增产物的浓度的解链温度值的偏差而在获得熔解曲线的步骤之前，与获得实时的扩增曲线的步骤单独地追加5循环以上的聚合酶链式反应循环，优选地，可追加5至20循环的聚合酶链式反应循环。

并且，本发明的检测方法可利用同时检测多靶核酸的方法，上述同时检测多靶核酸的方法包括：步骤(a)，在包含靶核酸的标本试样中混合由夹紧探针及检测探针构成的探针混合体及引物来进行杂交，并获得实时的扩增曲线；以及步骤(b)，分析所获得的上述实时的扩增曲线，或者可包括：步骤(a)，在包含靶核酸的标本试样中混合由夹紧探针及检测探针构成的探针混合体及引物来进行杂交；步骤(b)，一边使温度发生变化，一边使杂交后的上述产物解链来获得熔解曲线；以及步骤(c)，分析所获得的上述熔解曲线。

在本发明中，可通过实时的聚合酶链式反应来执行上述获取扩增曲线或熔解曲线的步骤，而扩增曲线的分析的特征在于，可以以测定循环阈值(CT，cycle threshold)来进行分析。若试样内存在靶核酸或试样所包含的靶核酸的量较多，则达到阈值(threshold)的循环数量会变少，从而较少地测定出循环阈值，因此可确认是否存在靶核酸，也可确认早期靶核酸的量。

并且，熔解曲线分析作为通常在结束实时的聚合酶链式反应之后最后进行的步骤，可将标本的温度降低至适当范围的30～55℃内的温度后，按每秒钟0.5至1℃的速度增加至90℃，并测定荧光的信号大小，若检测探针和靶核酸(可以与检测探针互补结合的靶核酸的一侧链)随着温度的上升而分离，则会使荧光猝灭，使得荧光信号突然下降，从而可通过解链峰值(melting peak)来确认是否存在靶核酸。

本发明的同时检测多靶核酸的方法的特征在于，可检测在10ng以下的标本试样中以0.01％、0.1％至100％比率包含的靶核酸。

在本发明中，“试样”包括多种试样，优选地，利用本发明的方法来分析生物试样(biosample)。可分析源于植物、动物、人类、真菌、细菌及病毒的生物试样。在分析源于哺乳类或人类的试样的情况下，上述试样可来源于特定组织或器官。组织的代表性例包括键、皮肤、肌肉或神经组织。器官的代表性例包括眼、脑、肺、肝、脾、骨髓、胸腺、心脏、淋巴、血液、骨、软骨、胰腺、肾、胆囊、胃、小肠、睾丸、卵巢、子宫、直肠、神经系统、腺和内部血管。所分析的生物试样包括来源于生物学根源的某种细胞、组织、流体(fluid)或可根据本发明来容易地进行分析的其他介质(medium)，而这包括为了人类、动物、人类或动物的消耗而从所制备的食物中获得的试样。并且，所分析的生物试样包括体液试样，体液试样包括血液、血清、血浆、淋巴、母乳、小便、大便、眼内液、唾液、精液、脑提取物(例如，脑粉碎物)、脊髓液、阑尾、脾脏和扁桃体组织提取物，但并不局限于此。

试样的靶核酸为脱氧核糖核酸或核糖核酸，且上述分子可以为双链或单链形体。在作为早期物质的核酸为双链的情况下，优选地，将双链分成单链，或者制成部分单链形态，对链进行分离的众所周知的方法包括热、碱、甲酰胺、尿素、乙二醛处理处理、酶方法(例如，解螺旋酶作用)及结合蛋白，但并不局限于此。

在另一观点中，本发明涉及利用本发明的同时检测多靶核酸的方法，并包含由夹紧探针及检测探针构成的探针混合体的靶核酸的同时多重检测用试剂盒及用途。

在另一观点中，本发明可使用为通过根据本发明的检测方法来以高的检测敏感度确认的极少量突变基因型，来辅助对疾病的医学性病态的诊断、预后、监测、治疗功效的评价、核酸及蛋白质转导研究的方法等。本发明包括利用组织等侵袭性标本和非侵袭性标本(血液、小便、痰、大便、唾液、细胞)来检测表皮生长因子受体、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、神经母细胞瘤病毒癌基因等生物标志物并评价生物标志物的突变的存在的步骤，上述生物标志物及突变的存在提供用于在相关疾病的生命周期检测、疾病的预后、预测、决定疾病的治疗方针、疾病的诊断/早期诊断、疾病的预防、疾病治疗剂的开发中利用的方法。

与此相关，本发明具有可一次性且更迅速地且低廉地进行多种基因检查的优点，尤其，若仅应用决定特定癌症治疗药剂的基因的变形来探知本技术，则目前可仅以检查一种基因的费用来探知与对应疾病相关的所有基因的变形。与此相关，肺癌患者需要与表皮生长因子受体、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、第二型受体、MET、TP53、神经母细胞瘤病毒癌基因、PIK3CA等基因的变异一同检查是否存在EML4-淋巴瘤激酶、ROS1、KIF5B-RET基因解链，而结肠癌只有检查克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1、TP53、神经母细胞瘤病毒癌基因、PIK3CA等基因的变异，才可以给予患者临床性的帮助。

并且，本发明作为与临床遗传体相关的技术，可迅速根据个人的基因信息来制定医疗，从而可使用于由治疗费用、药物副作用引起的损失、节约新药开发费用等多个领域。尤其，本发明可基于特定基因类型的药物疗法、以东洋人为对象的多种临床研究来提供可以选择更为适合的治疗剂的机会。

遗传病为由基因异常引起的疾病，表现为存在于体细胞内的基因异常，而由于相同基因异常也存在于生殖细胞(精子、卵子)，因此，其表现型也向子孙转导的疾病。发生基因异常的原因如下：第一，当脱氧核糖核酸被复制时，存在自然产生的误差；第二，具有可通过多种化学物质及环境因素来引起的可能性。目前，按报告指出的人类基因组计划的研究，人类细胞内存在30000～40000个基因，根据这种结果，可推定人类遗传病的种类极多，并且，除目前为止公开于世的遗传病的种类之外，还存在多种遗传病，而且可预测至今未被研究发现的遗传病更是数不胜数。

期待本发明的通过优秀检测敏感度的基因研究可作为预测未被发现的遗传病的种类的工具来使用。例如，在克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物中，可判断若在密码子12的多态性及密码子13的多态性中至少一侧为变异型，例如，对西妥昔单抗等抗表皮生长因子受体抗体药呈现出耐性，且为野生型，则判断为无法呈现耐性。

多因子基因疾病的发生很受环境的影响，且家族遗传的概率也根据个体和对应疾病而变得极为不同的现象为基因多态性(genetic polymorphism)。在相同基因中，每个人均表现出不同状态的现象称为基因多态性，但其具有短串联重复(STR，short tandemrepeat)、单核酸多态性(single nucleotide polymorphism)等种类。短串联重复意味着2～5个短碱基序列的反复表现，而单核酸多态性意味着在基因中的每1.0kb中具有至少一个不同的碱基序列。短串联重复用于亲子鉴定，单核酸多态性则在个人识别至疾病的发病可能性或者预后判断、对特定药物的反应范围内广泛地进行使用及研究。在基因多态性中，在组内以1％以内存在的现象称为“突变”，但目前在癌症、糖尿病、阿尔茨海默病等主要疾病中对于基因多态性及突变的研究变得活跃，并且可以为了研究多态性及突变而应用本发明的技术。

为了进行基因的变异型检测而进行提取标本所包含的癌细胞的基因和通过多种技术来分析患者基因的方法。在寻找基因变异型时，重要的是检测方法的敏感度(sensitivity)。敏感度意味着在整个基因中可检测多少％的变异型，桑格测序的假阴性(false engative)率为10％、焦磷酸测序约为5％，而目前所开发的新方法的假阴性率为1％、0.1％左右，因此被看作是具有优秀的敏感度(Nam et al.Korean J Pathol.2014)。并且，有报告指出，根据标本的质量，基因分析结果变得不同，因此，为了进行准确的基因检查，需要彻底管理分子检查过程(19.Nam et al.Korean J Pathol.2014)。

通过多种检查来执行基因的诊断性检查(Diagnostic test)，用于在具有疾病症状的患者中确诊或鉴别诊断所怀疑的遗传疾病。并且，对目前虽然没有症状，但具有遗传疾病的家族病史的人执行是否存在成为发病原因的突变的检查，从而可预测疾病的发病可能性和发病危险度逐渐变高的疾病。这种基因型检查可有助于疾病的预防、早期诊断、治疗及管理，从而可减少疾病的发病率和死亡率。

尤其，在人体内的所有细胞在遗传性方面相同的前提下，能够以人体的某种组织来进行基因型检查，但最简单地，以从血液中提取脱氧核糖核酸来使用为目的。并且，在遗传体内的变异中，为了检测与遗传疾病相关的变化，试样可以为脱氧核糖核酸、核糖核酸、染色体、代谢物质等。基因的检查方法具有直接分析构成脱氧核糖核酸和核糖核酸的方法、间接确认与疾病基因一同遗传的基因型及分析代谢产物的生物化学试验(biochemicaltest)或染色体试验(cytogenetic test)。

根据所要检查的目的，能够以多种方法执行基因型检查。尤其，基因型的单核酸多态性及突变化可通过与等位基因特异性的探针的杂交、基于酶的突变检测、错配的异形结合体的化学性切割(文献[Cotton et al.,1988])、基于错配的碱基的核糖核酸的切割(文献[Myers et al.,1985])、质谱法(美国专利号第6994960号、第7074563号、第7198893号)、核酸测序、单链构象多态性(SSCP)(文献[Orita et al.,1989])、变性梯度凝胶电泳(DGGE)(文献[Fischer and Lerman，1979a]、[Fischer and Lerman，1979b])、温度梯度凝胶电泳(TGGE)(文献[Fischer and Lerman，1979a]、[Fischer and Lerman，1979b])、限制性片段长度多态性(RFLP)(文献[Kanand Dozy，1978a]、[Kan and Dozy，1978b])、寡核苷酸连接分析法(OLA)、等位基因特异聚合酶链式反应(ASPCR)(美国专利号第5639611号)、连接酶链反应(LCR)及其变形方法(文献[Abravaya et al.,1995]、[Landegren et al.,1988]、[Nakazawa et al.,1994])、流式细胞测定式异形结合体分析(WO/2006/113590)及其组合/变形来检测。尤其，可通过基因表达系列分析(SAGE，Serial analysis of geneexpression)技法来测定基因表达水平(文献[Velculescu et al.,1995])。这种多种方法中的适当的分析方法可根据分析的具体目的、患者的状态/病例及(多个)特定癌症、所要检测、监测或治疗的疾病或其他医学性病态而不同。

本发明的实施方式涉及在对象中监测疾病(例如，癌症)发作的方法及还在个体监测疾病复发的方法。本发明的实施方式也涉及非癌症和/或医学性病态也具有遗传相关性和/或原因，且这种疾病和/或医学性病态也可被本发明所述的方法诊断和/或监测的事实。

本申请所记述的可适用于本发明的疾病或其他医学性病态包括肾病、尿崩症、I型糖尿病、II型糖尿病、肾脏疾病肾小球肾炎、细菌性或病毒性肾炎肾小球、IgA肾病、过敏性紫癜(Henoch-Schonlein)、膜增生性肾小球肾炎、膜性肾病、干燥综合症、肾病综合症微小病变、局灶性肾小球硬化症及相关疾病、急性肾功能衰竭、急性肾小管间质性肾炎、肾盂肾炎、血管炎症性疾病、先兆子痫、肾移植排斥、麻风病、反流性肾病、肾结石、遗传性肾病、水囊肿病、水质海绵状疾病、多囊性肾病、普通染色体显性多囊肾病，普通染色体劣性多囊肾病，结节性硬化症、脑视网膜血管瘤病(von Hippel-Lindau disease)、家族性薄层-肾小球基底膜病、胶原III肾小球病、纤连蛋白肾小球病、奥尔波特综合征、法布里病、指甲-髌骨综合征、先天性泌尿畸形、单克隆丙种球蛋白病、多发性骨髓瘤、淀粉样变和相关疾病、热病、家族性地中海热、人类免疫缺陷病毒(HIV)感染艾滋病(AIDS)、炎症性疾病、系统性血管炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病、多动脉炎、坏死性及新月肾小球肾炎、多发性肌炎-皮肌炎、胰腺炎、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、痛风、血液病、镰状细胞病、血栓性血小板减少症紫癜、范科尼综合征、移植、急性肾损伤、过敏性肠综合征、溶血-尿毒症综合症、急性皮质坏死、肾栓塞、外伤及外科手术、扩散性损伤、烧伤、腹部及血管手术、麻痹诱导、药物使用或滥用药物的副作用、循环系统疾病，心肌梗死、心脏衰竭、末梢血管疾病、高血压、冠心病心脏疾病、非动脉粥样硬化心血管疾病、动脉粥样硬化心血管疾病、皮肤疾病、中暑、全身性硬化症、呼吸系统疾病、慢性阻塞性肺病(COPD)、阻塞性睡眠呼吸暂停、高山缺氧或内分泌疾病、肢端肥大症、糖尿病或尿崩症，但并不局限于此。被监测或被分析的癌症可为所有种类的癌症。上述癌症不受限制，包括上皮细胞癌，例如，肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌及前列腺腺癌。还包括胃肠癌、头颈癌、非小细胞肺癌、神经癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖泌尿癌、胆囊癌、黑素瘤及白血病。并且，本发明的方法及组合物也可以在个体中等同适用于非-恶性肿瘤(例如，神经纤维瘤、脑膜瘤、雪旺氏细胞瘤)的检测、早期诊断/诊断及预后。

对患有指定的疾病/医学性病态(例如，癌症的临床类型或亚型)的一个以上的对象的体液中的核酸进行分析，并与未患有指定疾病/医学性病态的一个以上的对象的核酸进行比较来确认该核酸内容物间的差异。上述差异不受限制，可以为包括核酸表达水平、可选剪接变体、基因拷贝数变体(CNV)、核酸变形、单核苷酸多态性及核酸的突变(插入、缺失或单一核糖核酸变化)的任意遗传性异常。一旦确认特定核酸的遗传性参数上的差异为对特定疾病的差异，就可以执行与临床及统计学的留意数量相对应地包括对象的追加研究，从而确立特定核酸的遗传性异常和疾病之间的相关关系。

有报告指出，需要开发综合个人的基因、蛋白质、环境信息来进行适合于个人的预防、诊断、治疗的医学发展的多种技术，例如，虽然目前在非小细胞肺癌患者中通过桑格脱氧核糖核酸(Sanger DNA)碱基序列分析或逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)、荧光原位杂交(FISH)等方法来确认表皮生长因子受体突变或单一基因变异，从而选择治疗药剂，但今后通过本技术来检查全基因组或外显子组(exome)、转录组(transcriptome)来有助于个人定制型治疗。

若由基因的变异引起疾病，则只要更换有问题的基因就可以进行治疗。例如，1990年在美国，从因为缺乏制造腺甙脱氨酶(ADA，adenosine deaminase)的基因而患有严重的先天性免疫缺陷的少女提取T淋巴细胞后，向上述淋巴细胞放入腺甙脱氨酶基因后重新向血液中注入，结果，可恢复免疫功能。将利用上述基因来治疗疾病的方法称为基因治疗(gene therapy)。

如上述例所示，基因治疗可以被分为提取作为目标的细胞来放入特定基因之后重新注入的体外(ex-vivo)基因治疗和直接向目标组织注入特定基因来期待治疗效果的体内(in-vivo)基因治疗。目前的基因治疗大部分以癌症治疗为目的。这可以被分为直接向癌细胞注入用于猝灭癌细胞的抗癌基因或用于对抗癌剂变得敏感的基因的方法和向白血球放入分泌多个细胞因子(cytokin)的基因来使其浸透癌细胞或由癌细胞自身分泌细胞因子来促发免疫反应的方法。癌或后天性免疫缺陷综合症(AIDS)及单一基因疾病等为目前基因治疗的主要目的。可向用于这种基因治疗的基因型的确认方法提供多种信息。并且，活跃地进行针对特定人口组或人种的基因多态性和差异的研究，并且希望可将本技术应用于此。

并且，在癌症的情况下，很难知道对应基因是否对特定致癌物质更为脆弱、是否降低复原被破坏基因的功能、是否使参与癌症预防的免疫功能变得脆弱、是否使所有可能性变得可能等。因此，一个基因同时干涉多种疾病，且多个基因也与一种疾病相关。并且，在多因子遗传疾病的情况下，即使有上述基因，也未必发生疾病。例如，最有名的癌基因为与乳腺癌相关的乳腺癌敏感性基因(BRCA1)突变基因，但具有该基因的女性至65岁为止，可有60％患上乳腺癌。相反，普通女性的12％患有该病。这是因为乳腺癌为极为常见的西方的例，且在韩国，由于存在饮食生活等环境的差异而不一定如此。然而，此基因仅说明整体乳腺癌中的3％，此外还有数不胜数的不为人知的因子。并且，在该基因的持有者中，如果60％患有乳腺癌，就不一定意味着只要是持有者就一定患有此病。然而，毋庸置疑，该基因对乳腺癌的诊断和治疗有相当的意义。对于其他疾病，呈现出如此高的相关关系的基因并不多，具有更为高的敏感度的本发明的技术及方法可发掘疾病的相关关系高的基因。并且，通过对基因多态性的药物反应的差异的研究，可向定制医学提供多种信息。

癌症为遗传体疾病，且在遗传性的趣向中加上环境性刺激，从而借助多个基因变异来产生癌细胞，并增殖癌细胞来重复发生变异。目前作为重要的概念，具有癌基因依赖(oncogenic addiction)和合成致死(synthetic lethality)。癌基因依赖为基于多种遗传性异常中一个或两个基因异常的非正常性信号转导通路的持续性活性化来对癌症的发生和增殖及维持起到担当核心作用，以此可钝化这种基因来治疗癌症的理论。合成致死为即使在抑制各个的基因时不能灭绝癌细胞，但在同时抑制两种基因时，可破坏癌症细胞的概念。像这样，若找出核心基因并理解基因的相互作用，则可获得更好的治疗效果，而且可使用利用本技术的多种信息。

尤其，癌症的标本与其他疾病的标本不同，具有基因组遗传体和原发性癌症部位和转移癌部位等多种部位的体细胞癌症遗传体信息，从而可进行多种临床性使用。对此，可通过分析利用本发明的标本基因型的单核酸多态性和染色体数变异(CNV)，来使用于每个人的癌症发生危险度的评价及早期诊断。

癌症特异体细胞脱氧核糖核酸变异具有特定基因的突变、扩增、缺失、解链、甲基化等，它们的分析结果不仅使用于癌症发生危险度的评价，而且还用于各患者的诊断和治疗。不仅是脱氧核糖核酸变异，而且核糖核酸及蛋白质的表达程度、个体免疫反应或细胞因子的分泌程度也可使用于每个患者的癌症发生危险度的评价及各患者的诊断和治疗。

目前，最受瞩目的癌症遗传体信息为从各个癌症组织或血液中检测的癌基因的突变。驱动突变(Driver mutation)的大部分作为癌基因，是决定对应患者的癌症的发生及发作、对治疗剂的反应的最主要的基因变化。随着更为敏感地检测这种基因的变化，对于癌症的定制医疗，可使用为在各个的癌组织或血液中确认转移基因变化来找出适合的治疗法的道具。尤其，随着使用为可敏感地检测对应患者的特定基因变化通路分析和并非热点(hotspot)的稀有点(rare point)变异的方法，可使用为癌症遗传体的大数据。

与此相关，对于肺腺癌，已公开约为10个驱动突变，且有报告指出以这些变形为靶向的几种药物。例如，作为表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的吉非替尼的反应应答率为约70％，具有表皮生长因子受体-活性化变异的患者在10个月内即使没有肿瘤发作也可以生存。基于这种研究，肺腺癌的治疗战略从基于组织接近转向驱动突变相关治疗法。不同民族间的几种驱动突变的发生频率存在差异，因此表现出为了开发肺癌的新药物靶标(druggable targets)及靶向治疗而需要进行广范围的遗传性研究。

被称为驱动突变的具有遗传性变形的癌细胞与不具有这种变形的细胞相比，在生存及生长方面具有优势。驱动突变在用于对激酶等信号蛋白进行加密的基因中发生，且上述驱动突变可以以揭示并维持肿瘤发生的结构来产生生存信号。

从遗传学角度来看，癌症的种类非常多，且活跃地发生变化，因此，当对治疗产生耐性或在发生发作、转移时，在诊断当时发生担当重要作用的驱动突变和其他新突变，或者由诊断时并不重要的突变(passenger mutation)担当主要作用。目前，与因步骤性刺激和突变而发生癌的多步骤模型(multi-step model)不同，介绍一次以多发性地发生很多变异的危机模型(crisis model,chromothripsis)的概念，并将肿瘤的进化和异质性作为所要解决的最为艰难且最为重要的问题，利用本技术来敏感地检测多种突变，由此可确认多种信息。

并且，目前可使用为对局限基因检查及使用的每个人的基因表达差异、在癌组织中的原发性癌症和转移部位的癌组织的多种基因变化、在患者的体内由持续性进化引起的变化等的监测。尤其，从癌症患者获得组织的过程为会给患者带来很多负担的极为困难的过程，相反，本发明可使用少量的组织或者可从容易采集的血液中实施癌症特异基因检测方法，从而可通过多种临床性证明来使用为多种数据。

利用于肺癌的预防、早期诊断/诊断、预后及治疗方法的决定

众所周知，肺癌作为普遍发作的癌症，是全世界范围癌症相关死亡的主要原因。随着导入低剂量计算机断层扫描技术，虽然提高早期诊断比率，但肺癌依然是预后极为不乐观的致命性疾病。

对于肺癌患者而言，只要具有表皮生长因子受体基因的活性化突变，表皮生长因子受体阻断酪氨酸激酶抑制剂(易瑞沙、特罗凯等)就对治疗有效。在以往的表皮生长因子受体活性突变检查法中，直接碱基序列分析方法为标准法，也可使用更为灵敏的肽核酸箝术(PNA clamp)。并且，使用新一代碱基序列分析法的离子激流(Ion Torrent)分析结果，与以往的肽核酸箝术具有相同灵敏度，并且也可在各患者组织脱氧核糖核酸中检测变异频率，从而可获得较为准确的信息。并且，与通过直接碱基序列分析方法来检测发生变异的患者组相比，在灵敏的方法中检测到变异的患者的表皮生长因子受体阻断酪氨酸激酶抑制剂的治疗效果具有更高的临床有用性，从而报告出以准确且敏感的方式进行检测极为重要。

在肺癌患者的情况下，至少存在一个表皮生长因袭受体突变体意味着患者可从使用作为表皮生长因子受体靶向化合物的吉非替尼或厄洛替尼的治疗方法中获得利益。有报告指出，在多种类型的癌症中，表皮生长因子受体实现异常活性化或超表达。至今，还在进行寻找对肺癌的发生起到核心作用的靶，并理解遗传多样性的研究，而且可进行使用本发明的遗传多样性的理解研究。

在肺癌中实现活性化的肿瘤基因具有表皮生长因子受体、淋巴瘤激酶、大鼠肉瘤、ROS1、MET、RET等，且以这种核心肿瘤基因为靶的治疗剂可选择性地去除癌细胞。表皮生长因子受体作为受体家族酪氨酸激酶结构域受体组(tyrosine kinase receptors family；EGFR，HER-2，ErbB-3，ErbB-4)中的一个，是具有细胞外配体结构域(extracelluar ligand-binding domain)和酪氨酸激酶结构域(tyrosine kinase domain)的细胞内域(intra-cellar domain)的跨膜酪氨酸激酶(transmembrane tyrosine kinase)。若配体与组成同型二聚体(Homodimer)或异源二聚体(heterodimer)的受体相结合，则使细胞内的酪氨酸激酶结构域实现活性化，而像这样被表皮生长因子受体刺激的信号使磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)、苏氨酸激酶/mTOR、大鼠肉瘤/迅速加速性纤维肉瘤(RAF)/促分裂原活化蛋白激酶、JAK/转录激活因子信号转导通路活性化。吉非替尼和厄洛替尼为抑制表皮生长因子受体酪氨酸激酶结构域的具有代表性的药剂。

表皮生长因子受体激酶结构域的突变被公开为是可预测表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的效果的因子，这种突变从组织学角度来看主要在腺癌、女性、非吸烟者、东洋人中进行表达。基于多次临床试验的结果，对当前诊断为非小细胞肺癌4期腺癌的患者执行表皮生长因子受体突变检查，并在存在突变时，投用表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂作为早期治疗。

并且，大鼠肉瘤原癌基因(proto-oncogene)具有克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、神经母细胞瘤病毒癌基因及人V-HA-RAS肉瘤病毒癌基因同源物等，并且担当调整细胞增殖、分化和生存的作用。大鼠肉瘤蛋白质在非活性化状态下与鸟苷二磷酸(GDP，guanosine diphosphate)相结合，若鸟苷二磷酸被鸟苷三磷酸(GTP，guanosinetriphosphate)取代，则蛋白质实现活性化来使大鼠肉瘤/迅速加速性纤维肉瘤/丁酮(MEK)/促分裂原活化蛋白激酶和磷脂酰肌醇3-激酶苏氨酸激酶/mTOR信号转导体系活性化。在肺癌中，约在20％中呈现出大鼠肉瘤/迅速加速性纤维肉瘤/丁酮/促分裂原活化蛋白激酶信号转导体系的活性化，且主要基于克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变的活性化，而很少有V-HA-RAS肉瘤病毒癌基因同源物或神经母细胞瘤病毒癌基因的突变。有报告指出，由于克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物对肺癌的发生担当重要的作用，因此具有很多视其为靶的研究，但利用对大鼠肉瘤蛋白质的翻译后过程(post translationalprocessing)进行抑制的法尼基(farnesyltransferase)抑制剂和对大鼠肉瘤的反义脱氧核苷酸的研究并未取得成功。并且，有报告指出，在具有克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变的情况下，使表皮生长因子受体之后步骤的信号转导体系持续性地实现活性化来呈现出对表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的抵抗性，从而可使用用于确认上述现象的本发明。

另一方面，随着公开对非小细胞肺癌的发生和发作产生重要影响的分子生物学机制，并开发出多种诊断方法和靶向治疗剂，从而增加非小细胞肺癌患者的生存率。尤其，若存在表皮生长因子受体突变的腺癌患者服用表皮生长因子受体酪氨酸激酶结构域抑制剂，则与以往的抗癌剂相比，显著增加反应率和中位无进展生存期。尤其，克唑替尼(crizotinib)因选择利用可预测反应的准确的生物学标志物的患者，来急剧减少药物批准所消耗的时间和费用而受到瞩目，但虽然有很多研究，却依然表现出不乐观的预后，并且还存在在预防和诊断、治疗中需要解决的问题。其原因中的一个可例举肺癌的遗传性异质性(heterogeneity)。

本发明的表皮生长因子受体、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、神经母细胞瘤病毒癌基因突变型检查结果通过执行肺癌的药剂感受性检查来预测对有利于非小细胞肺癌的作为酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)的吉非替尼(易瑞沙(Iressa))和厄洛替尼(特罗凯(Tarceva))处方的预后，从而可以在决定患者的治疗方针方面提供决定性的信息。尤其，表皮生长因子受体突变作为可以准确预测对吉非替尼(易瑞沙)和厄洛替尼(特罗凯)的反应的标志物，提倡用作表皮生长因子受体突变的阳性非小细胞肺癌患者的第一次抗癌药剂。

并且，克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变作用为不与酪氨酸激酶抑制剂药物发生反应的药物抵抗性的强有力的预测因子，主要在外显子2号的密码子12和13中发现克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变。克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变发现于非小细胞肺癌的15～30％中，且主要在吸烟患者中观察得到，且与表皮生长因子受体突变以互斥的方式发现。

另一方面，肺癌的靶向治疗剂以于1990年代开发的作为细胞毒性抗癌剂的长春瑞滨(vinorelbine)、吉西他滨(gemcitabine)、紫杉烷(taxanes)等与铂(platinum)制剂之间的并用化学疗法使非小细胞肺癌患者的治疗效果得到改善，但作为传统型细胞毒性抗癌剂治疗，对发作性及转移性非小细胞肺癌患的治疗不具有明显的效果。之后，作为对肺癌的病态生理的分子生物学研究，吉非替尼和厄洛替尼作为属于小分子(small molecule)表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂的靶向治疗剂，使用为单一疗法的第二次或第三次治疗剂。并且，确认目前被称为贝伐单抗的血管新生抑制剂在发作性非小细胞肺癌患者的第一次早期治疗方面，与紫杉醇/卡铂或吉西他滨/卡铂等以往的化学疗法剂的三联疗法对生存期间的提高具有意义。

上述吉非替尼以具有治疗经历的发作性非小细胞肺癌患者为对象，在2期研究中呈现出9～19％的治疗反应率，而在40％以上的患者中存在症状的好转，但在之后执行的大型随机安慰剂对比的3期研究中，在以往的紫杉醇/卡铂细胞毒性抗癌疗法追加吉非替尼的结果，并未呈现出对治疗反应率、疾病进展时间(TTP，time to progression)及生存率提高的显著差异。并且，根据目前发表的4期研究在肺癌易瑞沙生存评价(ISEL，IressaSurvival evaluation in Lung Cancer)资料中呈现出吉非替尼使用组与安慰剂对比组相比，生存率没有显著的差异。只是在小组分析中，非吸烟者和东洋人却表现出生存率的差异。目前，只有在具有表皮生长因子受体突变，或者女性、腺癌、非吸烟者等三个条件中满足两种以上的情况下，才使用为第二次抗癌疗法剂，在第一次、第二次抗癌治疗中使用紫杉烷类制剂和铂的情况下，使用为第三次抗癌疗法剂。

并且，厄洛替尼以具有治疗经历的非小细胞肺癌患者为对象，在2期研究中以13％的反应率和51％的疾病调整率呈现出与吉非替尼类似的结果，且利用免疫组织化学(immunohistochemistry)方法，以表皮生长因子受体超表达患者为对象。然而，在利用第一次疗法在吉西他滨/顺双氯双氨泊铂及卡铂/紫杉醇追加厄洛替尼来观察效果的大规模3期研究中，并未呈现出反应率及生存期间显著改善的效果。然而，厄洛替尼作为第二次疗法剂，若与安慰剂对比，在作为2:1随机3期研究的BR.21结果中，表现出无进展生存期为2.2:1.8个月、总生存期6.7:4.7个月的显著差异，因此被报告为在非小细胞肺癌中证明生存资料提高的目标治疗剂。

目前，有研究表明，在没有表皮生长因子受体突变的肺癌患者中，以往的抗癌剂比靶向治疗剂更为有效。对韩国国内肺癌患者中占60％左右的表皮生长因子受体突变阴性肺癌患者的治疗而言，以往的细胞毒性抗癌剂与作为表皮生长因子受体靶抗癌剂的“易瑞沙”或“特罗凯”相比，更为有效。在对表皮生长因子受体靶抗癌剂和以往的抗癌剂治疗进行的临床试验和患者的治疗结果进行元分析的结果，靶抗癌剂的功效存在争论，因此，在整个表皮生长因子受体突变阴性患者组中执行用于查明何为最优的治疗药剂的研究，结果，利用以往细胞毒性抗癌剂进行治疗的情况与利用表皮生长因子受体靶抗癌剂进行治疗的情况相比，表皮生长因子受体突变阴性患者的癌症的发作速度变慢(中位无进展生存期6.4个月vs 4.5个月)，且肿瘤大小也更加减少(反应率16.8％vs7.2％)。这种结果在使用这些抗癌剂作为第一次治疗剂的情况和使用这些抗癌剂作为第二次治疗剂的情况中均被观察。因此，今后在表皮生长因子受体突变阴性患者中，与表皮生长因子受体抑制剂相比，优先推荐使用以往的抗癌剂等对药物反应性检查而言，突变检查的结果很重要。

利用于大肠癌的预防、早期诊断/诊断、预后及治疗方法的决定

另一方面，有报告指出，至今已确认的大肠癌的发病原因为由遗传性、后天性变化积累并发生细胞的形质转换，并且通过形质转换的细胞的增殖来产生肿瘤。大肠癌作为参与肿瘤的发生且已知具有遗传学机制的肿瘤中的一种，目前，实际临床适用这种遗传学异常来治疗患者。本发明可对这种癌症机制的研究有意义。

作为癌基因的大鼠肉瘤以人V-HA-RAS肉瘤病毒癌基因同源物、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、神经母细胞瘤病毒癌基因三种形态存在，并制成起到分子开关作用的三磷酸鸟苷水解酶(GTPase，Guanosine triphosphate hydrolase)。大鼠肉瘤起到向核内转导细胞外生长信号的作用，但若使大鼠肉瘤活性化，则通过迅速加速性纤维肉瘤/促分裂原活化蛋白激酶、磷脂酰肌醇3-激酶/苏氨酸激酶、Mekk/蛋白激酶等多种通路来转换(transformation)细胞，并起到抑制如p53或TGF-β通路等肿瘤抑制通路的作用。大鼠肉瘤中最频繁地在大肠癌中引起突变的为克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物，而集中发生于密码子12、密码子13、密码子61，对断片-介质三磷酸鸟苷水解(GAP-mediated GTPhydrolysis)具有抵抗性，从而维持持续性活性化的状态。

用于大肠癌诊断的大便潜血试验(fecal occult blood test)在数十年间使用为筛查非侵袭性大肠癌的方法，且在多个研究中指出可减少大肠癌死亡率(Mandel JS,NEngl J Med,1993/Kronborg O,Lancet 1996)。然而，当筛选大肠癌，尤其，大肠癌的机制病变时，存在敏感度降低的问题。为了解决这种问题，执行大便脱氧核糖核酸检查，但其实是在大便中检测大肠癌中所发生的突变或启动子甲基化的方法。有报告指出，在2004年，与大便潜血试验相比，利用在大便中测定包含抗原提呈细胞、克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、P53等的突变和BAT-26、长脱氧核糖核酸等的21个标志物的方法对大肠癌的敏感度更为优秀(52％vs13％)，且有报告指出，在2008年，在利用克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物、抗原提呈细胞基因的突变和波形蛋白(vimentin)基因的启动子甲基化等三个标志物的研究中，发作性腺瘤发现率为46％，从而比大便潜血试验的10～17％更为优秀(ImperialeTF N Engl J Med，2004)。已知，对于早期大肠癌，这种大便脱氧核糖核酸检查具有46～77％的敏感度，因此比大便潜血试验优秀，从而目前已成为为大肠癌筛查法。此外，正在进行在血液或小便中找出与大肠癌相关的脱氧核糖核酸、核糖核酸、蛋白质等来用于筛查的研究，对此，可容易地找出利用本发明技术的筛查后补或确认特定突变的影响力等。

并且，已查明在致癌期之前，遗传体不稳定和后天性变化起到重要作用，并且已查明参与癌发生的多个信号转导体系，由此开发利用在大肠癌中发现的遗传性、后天性变化的新早期诊断方法，而且可以与新药剂开发一同作为对于大肠癌的预后和治疗反应的预测因子来使用，并可贡献于个人定制治疗的发展。

利用于结肠癌的预防、早期诊断/诊断、预后及治疗方法的决定

转移性结肠癌(mCRC)作为西方的第二个癌症致死的原因，基于针对表皮生长因子受体单克隆抗体，例如，西妥昔单抗及帕尼单抗的治疗给予转移性结肠癌患者显著的生存利益，并且是目前对于这些患者的治疗疗法的标准成分。即，单独或与其他抗肿瘤性药物组合后，与这些单克隆抗体中的一种，例如，西妥昔单抗与基于铂的化学疗法组合后，也为了治疗被命名为头颈部肿瘤的具有头颈部的鳞状细胞癌的患者而下处方。

单克隆抗体与表达在癌细胞上的外部抗原相结合。只要一旦相结合，就显示为癌细胞被患者的免疫系统破坏。除了靶向癌细胞，单克隆抗体可被设计成作用于肿瘤生长所需的其他细胞类型及分子上。单克隆抗体可通过阻断破坏恶性肿瘤细胞的特定细胞受体来防止肿瘤生长。治疗性单克隆抗体西妥昔单抗及帕尼单抗与表皮生长因子受体相结合，且防止通过表皮生长因子受体诱导的细胞内信号通路(即，大鼠肉瘤-迅速加速性纤维肉瘤-丁酮-细胞外信号调节激酶级联及磷脂酰肌醇3-激酶-苏氨酸激酶通路)的活性化。不幸的是，并不是具有转移性结肠癌的所有患者对包含单克隆抗体的治疗疗法产生反应。还未充分了解像这样不产生反应的机制。

对克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物(KRAS，Ki-ras2 Kirsten rat sarcomaviral oncogene homolog)蛋白质实施加密的基因可来源于人类，且可位于人类的染色体12(p12.1)，而克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物蛋白质为由此加密的蛋白质。克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因可具有向GenBank accession no.NM_004985，NM_033360提供的核苷酸序列的同源物。

克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物为表皮生长因子受体下游效应，且对抗表皮生长因子受体单克隆抗体的第一次抗拒的标记。克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物对转移性结肠癌患者治疗的最优化具有相当大的影响力。结肠肿瘤的40％在克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物中藏有突变，且这些患者没有抗表皮生长因子受体单克隆抗体的效果。目前，在临床实施中对抗表皮生长因子受体单克隆抗体治疗考虑的所有转移性结肠癌患者应通过克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物测试，并且若检测到克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变，则患者只能从西妥昔单抗或帕尼单抗治疗中排除。

并且，具有野生型克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物肿瘤的转移性结肠癌患者的一部分依然无法从抗表皮生长因子受体单克隆抗体得到利益。在野生型克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物对象中，在与化学疗法组合时，对抗表皮生长因子受体单克隆抗体的反应率大约为60％，而向化学疗法难治患者单独投用时，则低于20％。

不仅是磷酸酶及张力蛋白同源物表达的损失，而且还使如丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶的鼠类肉瘤滤过性毒菌致癌性同源体B1(B-Raf)及磷脂酰肌醇3-激酶等其他表皮生长因子受体下游基因的突变活性化，以及在其他表皮生长因子受体调整蛋白质中的变化被评价为对于至今为止不具有决定性结果的抗表皮生长因子受体治疗的反应的有利的后补。

大鼠肉瘤蛋白质及迅速加速性纤维肉瘤蛋白质为形成基于大鼠肉瘤/迅速加速性纤维肉瘤/促分裂原活化蛋白激酶通路的细胞内信号转导的级联的蛋白质。在上述大鼠肉瘤/迅速加速性纤维肉瘤/促分裂原活化蛋白激酶通路中，迅速加速性纤维肉瘤蛋白质被活性型大鼠肉瘤蛋白质活性化，丁酮蛋白质被活性型迅速加速性纤维肉瘤蛋白质活性化，并且，促分裂原活化蛋白激酶蛋白质被活性型丁酮蛋白质活性化。由此，调整细胞的增殖及分化。

贝伐单抗/FOLFIRI并用疗法为适合用作转移性结肠癌的第一次治疗剂的治疗剂，并可延长反应率、中位无进展生存期、总生存期间(Hurwitz H,et al.NEJM 2004,6.Petrelli et al.Clin Colorectal Cancer.2013Sep；12(3):145-51)。作为转移性结肠癌的第二次治疗剂，对中位无进展生存期、总生存率呈现出效果的治疗剂为贝伐单抗和阿柏西普(ziv-aflibercept)(Giantonio et al.JCO 2007 14.Tabernero et al.EuropeanJournal of Cancer 50,320-331,2014)。贝伐单抗在第一次治疗中与抗癌化学疗法并用，且在第一次复发后，在作为第二次治疗变更抗癌化学疗法后持续投用贝伐单抗时，显著延长中位无进展生存期、总生存率(Bennouna et al.Lancet Oncol.14:29:37,2013)。

实施例

实施例1

以非小细胞肺癌患者为对象的表皮生长因子受体突变的检测

实施例1-1.标本采集

获得从参加随机安排2期试验的192名非小细胞肺癌患者的组织标本和血液中分离的血浆标本。在组织标本的情况下，利用碱基序列分析方法来获得结果，并且利用本发明的同时检测多靶核酸的方法来在血浆中进行表皮生长因子受体试验。

实施例1-2.脱氧核糖核酸的提取

在本实验中，利用凯杰公司(QIAGEN)的Circulating Nucleic AcidKit(Cat#55114)来提取脱氧核糖核酸。对此进行简要说明如下，向1ml的血浆(plasma)标本添加800μl的包含100μl的蛋白酶K(Proteinase K)和1.0μg的载体核酸的缓冲液(Buffer)ACL，并搅拌好后，在60℃温度下处理1小时。在进行培养之后，添加1.8ml的ACB缓冲液，之后在冰(ice)上放置5分钟。在利用真空(vacuum)来将上述溶液放入柱状物(column)后，以缓冲液ACW1 600μl、缓冲液ACW2 750μl、100％乙醇750μl的顺序进行洗涤。在真空系统(vacuum system)中分离柱状物来以14000rpm中离心分离3分钟后，在56℃温度下处理10分钟，从而去除剩余乙醇。在柱状物添加缓冲液AVE 100μl来在14000rpm下进行1分钟的离心分离后，溶出脱氧核糖核酸。在熔融(C-Melting)实验中按5μl的量使用所溶出的脱氧核糖核酸。

实施例1-3.表皮生长因子受体突变的确认

利用从血浆中提取的脱氧核糖核酸来执行用于检测表皮生长因子受体变异的聚合酶链式反应。对此进行简要说明如下，在19μl的用于检测外显子18、外显子19、外显子20及外显子21突变47种的10种试剂(G719X、E19del A、E19del B、S768I、T790M、E20ins A、E20ins B、L858R、L861Q、EIC)中分别混合1μl的耐热性脱氧核糖核酸聚合酶(Taq DNApolymerase)(韩国Enzynomics公司，(Enzynomics.,Korea))后，添加5μl的脱氧核糖核酸。在50℃温度下进行2分钟的聚合酶链式反应，来进行尿嘧啶糖基化酶灭活后，在95℃温度下进行15分钟的早期变形并执行15循环(在95℃温度下执行30秒钟、在70℃温度下执行20秒钟、在63℃温度下执行1分钟)、35循环(在95℃温度下执行10秒钟、在53℃温度下执行20秒钟、在73℃温度下执行20秒钟)。之后，在95℃温度下培养15分钟，在35℃温度下培养5分钟后，每次分别增加0.5℃的温度，直到35℃～75℃为止，且每3秒钟测定信号(羧基荧光素、六亚甲基四胺、罗红霉素、Cy5)，来导出解链温度结果值。上述聚合酶链式反应均适用于从192名患者的血浆提取的脱氧核糖核酸。

实施例1-4.与组织(tissue)结果间的相关性及生存率的分析

本发明的利用熔融技术来从血浆标本提取的基因的表皮生长因子受体试验结果，与以往组织标本的一致率为81.3％(95％置信区间(confidence interval)[CI]，75.0-86.5)、敏感度及特异度也分别确认为62.0％(95％CI，47.2-75.4)、88.0％(95％CI，81.5-92.9)。并且，与组织标本相比，在血浆试样中还检测到表皮生长因子受体T790M(n＝8)、exon20ins(n＝5)。表1表示接受表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂治疗(吉非替尼(Gefitinib、Iressa)或厄洛替尼(Erlotinib、Tarceva)的114名之间的平均中位无进展生存期(median progression-free survival(PFS))结果。

表1

	平均无进展生存期(mo)	P
			组织表皮生长因子受体19del or L858R pos vs.neg	9.2vs.1.7	＜.0001
血浆表皮生长因子受体19del or L858R pos vs.neg	8.4vs.1.9	.045

使用本发明的方法来对表皮生长因子受体突变检测结果分析中位无进展生存期，结果，可以确认显著的生存结果。

实施例2

以非小细胞肺癌患者为对象的克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变的检测

实施例2-1.标本的采集

获得从参加随机安排2期试验的135名非小细胞肺癌患者的组织标本和从血液获得分离的血浆标本。在组织标本的情况下，利用碱基序列分析方法来获得结果，并且利用本发明的同时检测多靶核酸的方法来在血浆中进行克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物试验。

实施例2-2.脱氧核糖核酸的提取

在本实验中，使用凯杰生物公司的QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit(Cat#55114)来提取脱氧核糖核酸。对此进行简要说明如下，向1ml的血浆(plasma)标本添加800μl的包含100μl的蛋白酶K(Proteinase K)和1.0μg的载体核酸的缓冲液(Buffer)ACL，并搅拌好后，在60℃温度下处理1小时。在进行培养后，添加1.8ml的ACB缓冲液，并在冰(ice)上放置5分钟。在利用真空来将上述溶液落放入柱状物后，以600μl的缓冲液ACW1(BufferACW1)、750μl的缓冲液ACW2(Buffer ACW2)、750μl的100％乙醇的顺序对柱状物进行清洗。在真空系统中分离柱状物，并在14000rpm的转速下进行3分钟的离心分离后，在56℃的温度下进行10分钟的处理，从而去除残留的乙醇。向柱状物添加100μl的缓冲液AVE来以14000rpm进行1分钟的离心分离后，溶出脱氧核糖核酸。在熔融(C-Melting)实验中按5μl的量使用所溶出的脱氧核糖核酸。

实施例2-3.确认克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变

利用从血浆中提取的脱氧核糖核酸来执行用于检测克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物变异的聚合酶链式反应。对此进行简要说明如下，向19μl的用于检测外显子2、外显子3及外显子4的突变29种的9种试剂(KC12a、KC12b、KC13a、KC13b、KC59、KC61、KC117、KC146、KIC)中分别混合1μl的耐热性脱氧核糖核酸聚合酶(韩国Enzynomics公司)后，添加5μl的脱氧核糖核酸。在50℃的温度下进行2分钟的聚合酶链式反应，来进行尿嘧啶糖基化酶(UDG)灭活(inactivation)，之后在95℃的温度下进行15分钟的初期变性后，执行15循环(在95℃的温度下执行30秒、在70℃的温度下执行20秒、在63℃的温度下执行1分钟)、35循环(在95℃的温度下执行10秒、在53℃的温度下执行20秒、在73℃的温度下执行20秒)。之后，在95℃的温度下培养15分钟，并在35℃的温度下培养5分钟后，每次分别增加0.5℃的温度，直到35℃～75℃为止，且每3秒钟测定信号(羧基荧光素、六亚甲基四胺、罗红霉素、Cy5)，来导出解链温度结果值。上述聚合酶链式反应均适用于从135名患者的血浆中提取的脱氧核糖核酸。

实施例2-4.与组织结果间的相关性及生存率的分析

本发明的利用熔融技术来从血浆标本提取基因的克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物试验结果，与以往组织标本间的一致率为81.5％(95％置信区间[CI]，73.9-87.6)、敏感度及特异度分别确认为25.0％(95％CI，5.5-57.2)、87.0％(95％CI，79.7-92.4)。并且，与组织标本相比，血浆标本还从16患者的标本中检测出突变。表2表示接受表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂治疗的114名患者的平均中位无进展生存期结果。

表2

	平均无进展生存期(mo)	P
			组织克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物pos vs.neg	1.8 vs 5.4	.073
血浆克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物pos.vs.neg	1.6 vs 5.5	.003

使用本发明的方法来对克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物突变检测结果进行中位无进展生存期分析的结果，可确认显著的生存结果。

Claims (15)

1.一种利用探针混合体的检测方法，作为为了癌症的诊断、预防、治疗或预后估计而从患者的试样中检测表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变的方法，其特征在于，上述探针混合体包括：

一个以上的检测探针，用于检测表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变；以及

夹紧探针，用于抑制野生型表皮生长因子受体基因及野生型克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因的扩增。

2.一种利用探针混合体的检测方法，作为为了提供对癌症的酪氨酸激酶抑制剂给药治疗所需的信息而从患者的试样中检测表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变的方法，其特征在于，上述探针混合体包括：

一个以上的检测探针，用于检测表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变；以及

夹紧探针，用于抑制野生型表皮生长因子受体基因及野生型克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因的扩增。

3.一种利用探针混合体的检测方法，作为为了提供对癌症的西妥昔单抗或帕尼单抗的治疗所需的信息而从患者的试样中检测克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变的方法，其特征在于，上述探针混合体包括：

一个以上的检测探针，用于检测克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物的突变；以及

夹紧探针，用于抑制野生型克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物基因的扩增。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，癌症选自由肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳腺癌、脑癌、结肠癌、前列腺癌、胃肠癌、头颈癌，非小细胞肺癌、神经癌、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖道癌、胆囊癌、黑素瘤及白血病组成的组中。

5.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，患者的试样选自由血液、血清、血浆、淋巴、母乳、小便、粪便、眼内液、唾液、精液、脑提取物、脊髓液、阑尾、脾脏及扁桃体组织提取物组成的组中。

6.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，上述检测探针或夹紧探针作为核酸类似物，分别选自由寡核苷酸、肽核酸及锁核酸组成的组中。

7.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，上述检测探针或夹紧探针为了结构变形而与氨基酸或氨基酸的支链相结合。

8.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，上述检测探针与报告基团及淬灭基团相结合。

9.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，在患者的试样中混合由夹紧探针及检测探针构成的探针混合体及引物来进行杂交，并获得实时的扩增曲线；

步骤(b)，在上述扩增步骤之后，一边使温度发生变化，一边获得扩增产物和检测探针间的熔解曲线；以及

步骤(c)，单独分析或依次分析或同时分析所获得的上述实时的扩增曲线及熔解曲线。

10.根据权利要求9所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，上述扩增通过实时的聚合酶链式反应来执行。

11.根据权利要求9所述的用探针混合体的检测方法，其特征在于，在上述步骤(b)的获得熔解曲线的步骤之前，与获得实时的扩增曲线的步骤单独地追加5至20的聚合酶链式反应循环。

12.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，在患者的试样中混合由夹紧探针及检测探针构成的探针混合体及引物来进行杂交，并获得实时的扩增曲线；以及

步骤(b)，分析所获得的上述实时的扩增曲线。

13.根据权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，包括：

步骤(a)，在患者的试样中混合由夹紧探针及检测探针构成的探针混合体及引物来进行杂交；

步骤(b)，一边使温度发生变化，一边使杂交后的上述产物解链来获得熔解曲线；以及

步骤(c)，分析所获得的上述熔解曲线。

14.根据权利要求2所述的利用探针混合体的检测方法，其特征在于，酪氨酸激酶抑制剂为吉非替尼或厄洛替尼。

15.一种表皮生长因子受体或克尔斯滕大鼠肉瘤病毒癌基因同源物检测用试剂盒，利用权利要求1至3中任一项所述的利用探针混合体的检测方法。