WO2016013880A1 - 클램핑 프로브 및 검출 프로브를 이용한 다중 표적핵산 검출 방법의 이용 - Google Patents

클램핑 프로브 및 검출 프로브를 이용한 다중 표적핵산 검출 방법의 이용 Download PDF

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윤지혜
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김성기
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Definitions

  • the present invention relates to a method for detecting and using a target nucleic acid using a clamping probe and a detection probe, and can be used for various purposes as a rapid and sensitive detection of a small amount of a mutation contained in a gene sample. It can provide a variety of information for the diagnosis or research of diseases related to gene mutations.
  • the present invention relates to a method for assisting in the diagnosis of a disease or medical condition, monitoring of a disease, monitoring a disease, evaluating therapeutic efficacy, nucleic acid and protein signal transduction research, and the like by sensitively detecting a small amount of a mutation contained in a gene.
  • the present invention relates to a method of monitoring the progress of various diseases (eg, cancer) in a subject and a method of monitoring recurrence.
  • Genetic testing can confirm or identify suspected genetic disorders in patients with symptoms of the disease. In addition, by examining the presence of mutations in the genes causing the disease, it is possible to predict a disease that increases the likelihood and risk of developing the disease. Genotyping is reported to help prevent, early diagnose, treat, and manage disease, reducing morbidity and mortality.
  • This genetic test can be genetically tested on any tissue of the human body on the premise that all cells in the human body are genetically identical, but most easily, DNA can be extracted from blood and used.
  • Various samples may include DNA, RNA, chromosomes, metabolites, and the like.
  • genes such as oncogenes, mutations in tumor suppressor genes, deregulations and chromosomal abnormalities are used to determine the onset of cancer and the prognosis of drugs.
  • a variety of studies have been reported as findings are involved (Fearson ER et al., Cell ., 1990; KW Kinzler et al., Cell ., 1996; Manuel Serrano et al., Cell ., 1997; Amado RG et al., J. Clin. Oncol ., 2008, Raponi M et al., Curr. Opin.Pharmacol. , 2008; Siena Sert., J. Natl. Cancer Inst. , 2009).
  • Analysis of genes specific to cancer can indirectly determine whether cancer has developed. Examples include relative increases in EGFR nucleic acids, eg, relative decreases in tumor suppressor genes such as p53.
  • the report on the function of tumor genes suggests the need for mutation testing of tumor genes.
  • the response rate of cetuximab, an anti-EGFR antibody therapeutic to normal KRAS patients after mutation testing of the KRAS exon 2 (codons 12 and 13) genes commonly found in colorectal cancer About 35-45% (Lievre et al. Cancer Res 2006; 66: 3992-3995), and the rate of mutation of KRAS exon 2 (codons 12, 13) in the study to identify other variant RAS was 40- In case of normal KRAS exon 2, KRAS codons 61, 146, NRAS codons 61, 12, 13, and so on have about 15-20% of mutation rate. (Douillard et al. N Engl J Med . 2013).
  • FOLFOX6 fluoropyrimidine, leucovorin, oxaliplatin
  • FOLFIRI FOLFOX6
  • the second treatment in contrast, FOLFIRI or FOLFOX6
  • bevacizumab and cetuximab have demonstrated the effect of prolonging survival by adding bevacizumab to FOLFIRI during the first treatment, and the CRYSTAL study showed a normal KRAS gene.
  • Combined administration of FOLFIRI and cetuximab in patients with prolonged survival showed prolonged survival (Van Cutsem, J Clin Oncol . 2011).
  • the clinical characteristics of patients with a radiologic response to zefitinib in the subgroup analysis of gestratinib monotherapy phase 2 study by Astrazeneca were: female, non-smoker, adenocarcinoma. And it turned out that they were Asian, and this result was surprisingly consistent with the later erlotinib study.
  • the BR.21 study also showed significant differences in survival data among adenocarcinoma, non-smoker, and Asian among clinical factors related to erlotinib response.
  • the mutations that determine the EGFR-TKI response confirm that EGFR-TKI occurs in the exons that determine the tyrosin kinase domain acting within the cell, and they are ATP-binding pockets. Or a mutation associated with an activation loop.
  • the EGFR tyrosine kinase domain consists of seven exons (18-24). Most EGFR mutations are located in exons 18-21 and are classified into three types: 60% of the exon 19 deletions, 25% of the exon 21 missense mutations (L858R), and rarely the point mutations of exons 18, 20, 21 and The insertion / duplication of exon 20 is occupied.
  • EGFR mutations selectively activate the Akt and STAT pathways that promote cell promotion and antiapoptosis in EGFR downstream signaling pathways, but do not affect ERK pathways associated with cell proliferation. It has been found to occur and exhibit a quick effect.
  • the mutation rate of the EGFR tyrosine kinase domain is found in about 20% of the non-small cell lung cancers analyzed so far, and is found in a very high frequency in adenocarcinoma, Asians, women, and non-smokers, so that the EGFR-TKI response rate is exactly consistent with the clinical index. The results are showing. However, in the presence of EGFR mutations, the use of EGFR-TKI did not significantly increase survival.
  • K-ras has been suggested as one of the factors that determine the response to EGFR-TKI.
  • K-ras has been suggested as one of the factors that determine the response to EGFR-TKI.
  • K-ras exon 2 mutations there have been few reports of EGFR-TKI responses.
  • K-ras mutations are found in 30% of adenocarcinomas, which are common in smokers and men, and are almost exactly opposite to EGFR mutations due to their low frequency in the East.
  • non-smokers will be made through EGFR mutation and smokers will be caused by K-ras.
  • the endogenous resistance problem must be solved in order to increase the response rate to the EGFR-TKI.
  • Cetuximab (Cetuximab, C225, Erbitux) is a murine / human chimeric monoclonal antibody that binds to the extracellular soluble site domain III of EGFR and blocks dimerization of EGFR. Cetuximab is known to be effective in combination therapy with conventional cytotoxic chemotherapy rather than monotherapy. Docetaxel in a phase 2 study in patients with recurrent non-small cell lung cancer, whose immunologic EGFR expression was +1 or higher, was found to be cumulative in combination with cisplatin. The combination treatment resulted in encouraging results with a response rate of 25% and disease control rate of 60% or more. Based on this, a phase 3 study in combination with docetaxel or pemetrexed is currently in progress. Cetuximab is currently approved for colorectal cancer and has been reported to be synergistic in combination with radiotherapy in locally advanced head and neck cancer.
  • gefitinib and erlotinib are currently effective as a monotherapy for only a limited number of patients in secondary treatment
  • the acquisition tolerance problem, bevacizumab has proven effective as a primary treatment, but may be used only in some patients. It can provide information to solve the clues.
  • the combination of new target therapy and cytotoxic chemotherapy, combination therapy between target therapy, role as postoperative adjuvant therapy, role as chemopreventive agent, and development of molecular biological indicators for the selection of target therapy will be used in various studies. Can be.
  • anti-EGFR antibody has the effect of inhibiting cancer cell proliferation by inhibiting the RAS / MAPK mechanism that regulates cell proliferation.However, patients with mutations in KRAS do not respond to anti-EGFR antibody. It is very important (Herreros-Villanueva et al. Clin Chim Acta . 2014) to report the findings, and various test methods and techniques for identifying genotypes of cancer patients are introduced.
  • Genetic variation testing includes traditional methods such as Sanger sequencing, pyrosequencing, recently developed real-time PCR, and digital PCR.
  • Sanger sequencing is an inexpensive reagent and can show all sequencing to find new variants. Pyrosequencing is more sensitive, faster, and easier to interpret than sanger sequencing, but not all variants are identified ( Tan et al. World J Gastroenterol 2012).
  • Real-time PCR can be tested without the need for specialized background, can be performed quickly with less manpower, has excellent sensitivity and reproducibility, and it is easy to solve problems.
  • Representative methods for detecting small amounts of mutations also include allele specific PCR methods using primers specific for mutations to selectively increase the mutant gene (Rhodes et al., Diagn mol pathol., 6 : 49, 1997), scorpion real-time allele specific PCR (DxS 'scorpions and ARMS) method (Mark et al., Journal of Thoracic Oncology, 4: 1466, 2009), allele specificity Suppresses amplification of wild-type genes using allele specific primer technology and minor groove binder (MGB) probes, and selectively amplifies only mutant genes, and does not include the location of mutations using Taqman probes.
  • allele specific PCR methods using primers specific for mutations to selectively increase the mutant gene (Rhodes et al., Diagn mol pathol., 6 : 49, 1997), scorpion real-time allele specific PCR (DxS 'scorpions and ARMS) method (Mark et al., Journal
  • PNA Peptide nucleic acid
  • the PNA backbone has higher specificity than DNA probes for target nucleic acids that are electrically neutral and have complementary sequences.
  • it has the advantage of not being degraded by nuclease or protease, which is very useful for molecular diagnostic methods using probes (Egholm et al., Nature , 365: 556, 1993; Nielsen et al. , Bioconjugate Chem.
  • the PNA-LNA clamp (US Patent No. 2013-0005589; Yoshiaki Nagai et al. Cancer Res ., 65 (16): 7276, 2005) method is a PNA clamping probe with an array of wild-type genes for a target site. This is a method for selective amplification and detection by designing a hybrid LNA taqman probe having an array of mutated genes to be competitively hybridized.
  • PNA as both PCR clamp and sensor probes (US Patent Publication No. 2008-0176226) is a PNA probe using a PNA probe instead of a donor probe of a conventional Roche hive probe system. It is designed to clamp and detect simultaneously.
  • the PNA Clamping & Intercalator Detection method uses a PNA probe to clamp wild-type genes and selectively amplifies only mutant genes before intercalation.
  • Various techniques have been reported, including methods for detecting amplification products using intercalators.
  • Cancer is caused by genotyping mutations and there are approximately 50-80 mutations that do not exist in non-tumor cells (Joneset al., 2008; Parsons et al., 2008; Wood et al., 2007]).
  • Techniques for detecting such mutants include biopsy sample analysis and mutant tumor DNA analysis that circulates body fluids such as blood (Diehl et al., 2008).
  • biopsy sample analysis is invasive and has the potential for complications and other hazards.
  • the biopsy analysis method takes a tissue sample from a restriction site, where the tissue sample may be gastric positive or gastric negative when the tumor is heterologous or dispersed in normal tissue. To overcome this approach, a noninvasive and sensitive diagnostic method is needed.
  • tumor tissues may have different types of mutations (Heterogeneity), and normal cells are mixed in each cell, accurate detection of mutations requires the use of highly sensitive test methods, microscopic examination of tumor sites, and Selective DNA extraction and testing is essential.
  • PCR-RFLP polymerase chain reaction
  • RFLP restriction fragment length polymorphism
  • the polymorphism detection method through Tm analysis uses a probe complementary to a region containing a polymorphism for detection, to form a hybrid (double stranded nucleic acid) of a nucleic acid with a complementary detection probe. Then, the obtained hybrid is heat-treated, and the melting point of the hybrid to single-stranded nucleic acid according to the temperature rise is detected by signal measurement such as absorbance, and a polymorphism is determined using the result of the Tm value.
  • the Tm value is higher as the complementarity of both single-stranded nucleic acids in the hybrid is high, and lower as the complementarity is low. Therefore, by calculating the Tm value (evaluation reference value) for the hybrid between the gene and the complementary probe, the detection target site of the nucleic acid to be tested after comparing the Tm value (measurement value) between the nucleic acid to be tested and the probe is compared with the target gene. You can determine if they are the same. In addition, when the measured value is lower than the test evaluation reference value, it can be discriminated that the detection target site of the test nucleic acid is of a different type.
  • Such a method can detect a polymorphism only by measuring a signal after PCR reaction which added the detection probe.
  • the detection method using Tm analysis should be able to determine the difference of one base as the Tm value, and the result should be easy to interpret when the gene has a plurality of polymorphisms. In particular, even when a wild type polymorphism and a plurality of variant polymorphisms are mixed, it is required to accurately detect the presence or absence of mutation.
  • the probe can be designed to detect the difference of 1 base and also through the Tm analysis.
  • an object of the present invention is to provide a polymorphism detection probe and its use, which can discriminate polymorphisms for EGFR, KRAS, and NRAS genes, which are disease related genes, with simple and excellent sensitivity.
  • Genetic variation testing includes traditional methods such as Sanger sequencing, pyrosequencing, recently developed real-time PCR, and digital PCR.
  • Sanger sequencing is an inexpensive reagent and shows all sequencing, making it possible to find new variants.
  • Pyrosequencing an intermediate step between Sanger sequencing and real-time PCR, is more sensitive, faster, and easier to interpret than Sanger sequencing, but all variants can be identified. There is no.
  • specific variants can be found rather than real-time PCR, and new gene mutations can be identified through data analysis, but the test time is longer and the sensitivity is lower (Tan et al. World J). Gastroenterol 2012 October 7, 18 (37): 5171-5190).
  • the real-time PCR applied to the present technology can be tested without a professional background, and can proceed quickly with a small manpower. It also has excellent sensitivity and reproducibility, and is easy to solve when problems occur. However, not all variants are found because the genes are found for altered sequencing.
  • the present invention provides a method for detecting a very small amount of mutant genotypes with high detection sensitivity, and the method can be used for monitoring the whole cycle of a disease, prognosis, prediction of a disease, determination of a treatment policy of a disease, early diagnosis / diagnosis of a disease, a disease It is intended to be used for the prevention of diseases and the development of treatment for diseases.
  • the present invention includes one or more detection probes for detecting target nucleic acids in real time and clamping probes that inhibit amplification of wild-type or unwanted genes.
  • the invention provides a probe mixture, a simultaneous multiple target nucleic acid detection method using the same, and a molecular diagnostic kit using the same method.
  • the probe mixture of the present invention provides a simultaneous multiple target nucleic acid detection method using the clamping probe competitively hybridized on the same strand, and one or more detection probes in which a reporter and a quencher are combined, and a use thereof. .
  • various molecular diagnostic techniques such as molecular diagnosis, prenatal diagnosis, early diagnosis, cancer diagnosis, genetic related diagnosis, genetic trait diagnosis, diagnosis of infectious organism, determination of drug resistant bacteria, forensics, species identification of organisms, etc. Can be used for
  • the proper diagnosis and treatment of cancer patients requires the identification of various molecular characteristics of the carcinoma.
  • the technology of the present invention which is more sensitive and specific than the basic method, enables detection of trace gene expression, point mutations, fusion genes, and the like contained in normal DNA to understand the overall genetic basis of cancer, and to diagnose and treat Enables application to
  • the present invention sensitively detects mutants of EGFR, KRAS, NRAS, and the like contained in body fluids, particularly in the blood, thereby allowing early diagnosis / diagnosis, monitoring, and evaluation of related diseases, other medical conditions, and therapeutic efficacy.
  • the method may also include comparing mutation detection results related to the disease with a normal control to identify correlations between the mutation type and the disease or other medical conditions (eg, cancer).
  • the present invention also enables the determination of therapeutic methods and drug reactivity predictions through genotyping.
  • the target nucleic acid detection method enables suppression of wild type genes or unwanted gene amplification, and deletion or insertion of single base mutations and bases contained in a sample through selective amplification and selective detection of trace amounts of target nucleic acid genes. It is possible to effectively detect mutations by using multiple detection probes and multiple amplification suppression probes, enabling simultaneous analysis of real-time amplification curves and melting curves. Genotyping is possible. In addition, since the target can be detected with high sensitivity, it can be very useful for early diagnosis requiring a very small amount of target detection.
  • a small amount of the mutant type contained in the EGFR, KRAS, and NRAS genes can be easily and easily determined by Tm analysis.
  • Tm analysis using the polymorphism detection probe of the present invention can be performed to easily determine the type or variation of the polymorphism. And it can detect with excellent reliability. For this reason, this invention is especially useful with the sample containing a large amount of wild type gene and a small amount of mutant gene.
  • the polymorphisms of the EGFR, KRAS, and NRAS genes can be discriminated simply and with good reliability, the detection results can be reflected, for example, in the diagnosis and treatment of the disease as described above. . Therefore, it can be said that this invention is extremely useful in the medical field etc.
  • the present invention provides a method for detecting simultaneous multiple target nucleic acids using a clamping probe that suppresses amplification of a wild-type or unwanted gene, a reporter and a quencher, and the use of the detection method. It is about.
  • the detection probe of the present invention is a probe capable of selectively detecting a target nucleic acid gene to be detected.
  • Clamping probe refers to a probe capable of complementarily binding to a wild type gene or an undesired gene to inhibit an extension reaction of a polymerase between PCR reactions, and the probe mixture is a probe composed of one or more detection probes and clamping probes. Means system.
  • the target nucleic acid of the present invention means any kind of nucleic acid to be detected, and may or may not include a mutant gene.
  • DNA or mRNA of any kind including genomic DNA, mitochondrial DNA, and viral DNA, ribosomal RNA, non-coding RNA, tRNA, It may be characterized by all kinds of RNA, including viral RNA (viral RNA) and the like, but is not limited thereto. Annealing or hybridizing with primers or probes under hybridization, annealing or amplification conditions.
  • Hybridization of the present invention means that the complementary single stranded nucleic acids form a double-stranded nucleic acid. Hybridization can occur when the complementarity between the base sequences of two nucleic acids is a perfect match, or even when there is a mismatched base. The degree of progression of the complementarity reaction required for hybridization may vary depending on the hybridization conditions such as temperature.
  • Mutation of the present invention is a mutation in the wild-type gene nucleotide sequence, and includes not only single nucleotide polymorphism (SNP), but also a mutation occurs by substitution, deletion or insertion of the base. Also included are somatic mutations and germ line mutations that can occur in nature, including artificial mutations that artificially induce nucleotide variations.
  • SNP single nucleotide polymorphism
  • somatic mutations and germ line mutations that can occur in nature, including artificial mutations that artificially induce nucleotide variations.
  • Somatic mutations of the present invention are known to be a major cause of cell cancer by deregulation of signal transduction processes.
  • Examples of meaningful somatic mutations include various cancer-related genes such as KRAS, BRAF, EGFR, JAK2, HER2, BCL-ABL, NRAS, HRAS, IDH1, IDH2, C-KIT, TP53, EGFR, and PIK3CA.
  • KRAS KRAS
  • BRAF EGFR
  • JAK2 HER2
  • BCL-ABL NRAS
  • HRAS HRAS
  • IDH1, IDH2, C-KIT TP53
  • EGFR PIK3CA
  • the detection probe or the clamping probe may be selected from the group consisting of oligonucleotides, peptide nucleic acids (PNAs) and locked nucleic acids (LNAs) as all nucleic acids and nucleic acid analogs that complementarily bind to the target nucleic acid.
  • PNAs peptide nucleic acids
  • LNAs locked nucleic acids
  • the polymerase for PCR generally has nuclease activity, which may cause damage to the probe, it is preferable to use synthetic nucleic acid such as PNA that is stable to nuclease.
  • the detection probe serves to selectively detect a target target nucleic acid gene, it is possible to use a probe for detecting a nucleic acid known in the art.
  • a PNA probe is preferably used, and the PNA probe is artificial synthetic DNA, which can specifically bind to target DNA or RNA, and is stable to nucleases. Analysis is possible.
  • the PNA probe since the PNA probe has a property of inhibiting the progression of the polymerization reaction of the polymerase after binding to DNA, in the present invention, the PNA probe prepared to fully hybridize with the wild type gene was used as a clamping probe. For target nucleic acid detection, the PNA detection probe was invented to achieve complete hybridization with the target nucleic acid gene.
  • the clamping probe and the detection probe have specific functional groups such as side chains of natural amino acids and synthetic amino acids at alpha, beta, gamma, and linker positions of the N-terminal, C-terminal, or probe (synthetic nucleic acid) backbone of the probe.
  • the amino acid may have a charge, or may be characterized by having a negative charge or a positive charge, but is not limited thereto, probe conformational changes and charge assignment methods known in the art Can be used.
  • the detection probe of the present invention may combine a reporter and a quencher capable of quenching reporter fluorescence at both ends, and may include an intercalating fluorescent material.
  • a reporter is a substance that absorbs and emits light of a specific wavelength and emits fluorescence.
  • a reporter means a substance that can be labeled on a probe to confirm whether hybridization between the target nucleic acid and the probe has been performed, and thus, fluorescein and flu Oresin chlorotriazinyl, rhodamine green, rhodamine red, tetramethylrhodamine, FITC, Oregon green, Alexa Fluor , FAM, JOE, ROX, HEX, Texas Red, TET, TRITC, TAMRA, Cyanine-based dyes and thiadicarbocyanine dyes, but may be one or more selected from the group consisting of It is not limited to this, it is possible to use a material fluorescing known in the art.
  • the quencher means a material that absorbs the light generated by the reporter and decreases the fluorescence intensity.Dabcyl, TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, Blackberry Quencher, and Blackhole quencher ( Black Hole Quencher), Qxl, Iowa black (Iowa black) FQ, Iowa black RQ, IRDye QC-1 may be one or more selected from the group, but is not limited to this, the quencher has a range of reducing the fluorescence intensity depending on the type Since it is different, it can be used considering this.
  • Simultaneous multiple target nucleic acid detection method using the probe mixture of the present invention is to detect using one or more clamping probe (combined with a wild type gene or unwanted genes) to inhibit the polymerase elongation reaction Selective amplification of the target nucleic acid gene, characterized in that the detection of the presence or concentration of multiple target nucleic acids by using one or more detection probes (specific detection probe) to specifically detect the target nucleic acid, the target using a probe mixture Detection of nucleic acids allows simultaneous analysis of real time amplification curves and melting curves.
  • the clamping probe and the detection probe of the present invention hybridize with the target DNA on the same strand, or the clamping probe and the detection probe hybridize to complementary strands, thereby simultaneously blocking the detection of the wild-type gene and detection of the target nucleic acid gene. .
  • the clamping probe has a perfect match with the wild-type gene, the amplification of the wild-type gene can be suppressed, thereby enabling selective amplification and detection of a very small amount of the target nucleic acid gene, and using one or more detection probes. Simultaneous multiple detection of target nucleic acids is possible.
  • the clamping probe and the detection probe are annealed to the same strand or to different complementary strands, and the detection probe having the reporter and the quencher is to be detected. It specifically binds to the target nucleic acid gene to show an amplification curve signal (fluorescence).
  • the clamping probe is still hybridized with the wild type or unwanted genes to inhibit amplification of the wild type or unwanted genes, and the detection probes have a melting temperature lower than the temperature at the extension stage with the target nucleic acid. Because it was manufactured, it is separated from target nucleic acid and amplification proceeds.
  • the amplification curve can be analyzed in real time, and the melting curve can be analyzed using the amplification product generated through the amplification process.
  • the detection probe hybridizes with the target nucleic acid gene at a low temperature to generate a fluorescence signal, but as the temperature increases, the detection probe is separated from the target nucleic acid and the fluorescence is quenched.
  • the conventional amplification curve analysis method using real-time PCR to detect a plurality of target nucleic acids at the same time because the fluorescent material is used to detect the target nucleic acid in the sample, the number of targets to detect two or more target nucleic acids
  • multiple detection is limited because there is a problem that a probe having as many fluorescent materials is needed
  • the simultaneous multiple target nucleic acid detection method of the present invention can simultaneously perform amplification curve and melting curve analysis using a probe mixture, so that a single fluorescence It is possible to detect multiple targets using a substance.
  • L-glutamic acid (L-glutamic acid) or D-glutamic acid (D-glutamic acid) having a negative charge L-alanine (L-alanine) does not have a charge
  • D-alanine, a positively charged L-lysine or D-lysine side chain may be introduced at the gamma position of the PNA, and L-lysine (L- lysine) and L-glutamic acid (L-glutamic acid) at the linker position can be synthesized PNA probe.
  • the PNA probe which gave structural changes (stereostructure and charge variation) by combining D-glutamic acid at the gamma position of the PNA backbone, showed a difference in melting temperature between the target DNA and the single base mismatched DNA when compared to the PNA probe without the structural change.
  • ⁇ Tm is significantly increased, and the modified PNA probe of the present invention increases the specificity for single nucleotide sequence variation, thereby remarkable the difference in melting temperature between the wild type gene and the target nucleic acid gene. It can reduce the problems that may occur in the improvement and the melting curve analysis.
  • the conventional amplification curve analysis method using real-time PCR to detect a plurality of target nucleic acids at the same time because the fluorescent material is used to detect the target nucleic acid in the sample, the number of targets to detect two or more target nucleic acids
  • multiple detection is limited because there is a problem that a probe having as many fluorescent materials is needed
  • the simultaneous multiple target nucleic acid detection method of the present invention can simultaneously perform amplification curve and melting curve analysis using a probe mixture, so that a single fluorescence It is possible to detect multiple targets using a substance.
  • the simultaneous multiple detection method using the prop mixture of the present invention is not limited to the simultaneous analysis of the amplification curve and the melting curve, the amplification curve and the melting curve can be analyzed separately or sequentially analyzed, if necessary, amplification curve Only nucleic acid analysis or melting curve analysis can be performed to detect target nucleic acids. In particular, when quantitative analysis is not required, the presence or absence of target nucleic acid or genotype can be distinguished by omitting amplification curve analysis and performing only melting curve analysis.
  • Simultaneous multiple target nucleic acid detection method of the present invention specifically, (a) mixing a hybrid of a probe mixture consisting of a clamping probe and a detection probe and a primer to the sample sample containing the target nucleic acid to obtain a real-time amplification curve; (b) obtaining a melting curve between the amplification product and the detection probe while changing the temperature after the amplification process; And (c) analyzing the obtained real-time amplification curve and the melting curve separately or sequentially or simultaneously.
  • the clamping probe and the detection probe of step (a) can be variously adjusted according to the number of target nucleic acids to be detected, and in order to reduce the variation of the melting temperature value according to the concentration of the amplification product in the step of obtaining the melting curve.
  • a PCR cycle of 5 or more cycles, preferably 5 to 20 cycles separately from the step of obtaining a real-time amplification curve.
  • the detection method of the present invention comprises the steps of: (a) mixing a hybrid of a probe mixture consisting of a clamping probe and a detection probe and a primer to the sample sample containing the target nucleic acid to obtain a real-time amplification curve; (b) using a simultaneous multiple target nucleic acid detection method comprising analyzing the obtained real-time amplification curve,
  • the step of obtaining the amplification curve or the melting curve was performed through a real-time PCR (polymerase chain reaction), the analysis of the amplification curve may be characterized by measuring by measuring the cycle threshold (Ct) value. If the target nucleic acid is present in the sample or the amount of the target nucleic acid contained in the sample is large, the number of cycles reaching the threshold is reduced and the Ct value is measured to confirm the presence or absence of the target nucleic acid, and the amount of the initial target nucleic acid can also be measured. have.
  • Ct cycle threshold
  • the melting curve analysis is generally the last process after the real-time PCR process is finished, and the temperature of the sample is dropped to about 30 to 55 ° C. to an appropriate range of temperature from 0.5 to 1 per second up to 95 ° C.
  • the signal size of the fluorescence is measured in increments of °C, and as the temperature rises, when the detection probe and the target nucleic acid (one strand of the target nucleic acid that can be complementarily bound to the detection probe) are separated, the fluorescence is quenched and the fluorescent signal suddenly drops. , The presence of the target nucleic acid through the melting peak (melting peak).
  • Simultaneous multiple target nucleic acid detection method of the present invention can be characterized in that it is possible to detect the target nucleic acid contained in a 0.01%, 0.1% to 100% ratio in a nucleic acid sample sample of 10ng or less.
  • the 'sample' includes various samples, and preferably, a biosample is analyzed using the method of the present invention.
  • Biosamples of plant, animal, human, fungus, bacterial and viral origin can be analyzed.
  • the sample may be derived from a specific tissue or organ. Representative examples of tissues include connective, skin, muscle or nerve tissue.
  • organs include eyes, brain, lungs, liver, spleen, bone marrow, thymus, heart, lymph, blood, bone, cartilage, pancreas, kidney, gallbladder, stomach, small intestine, testes, ovaries, uterus, rectum, nervous system, Glands and internal vessels are included.
  • the biosample to be analyzed includes any cell, tissue, fluid from a biological source, or any other medium that can be well analyzed by the present invention, which is the consumption of humans, animals, humans or animals. Samples obtained from food prepared for use are included.
  • the biological sample to be analyzed includes a bodily fluid sample, which includes blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, ocular fluid, saliva, semen, brain extracts (e.g., brain grinds), spinal fluid, appendix, spleen And tonsil tissue extracts.
  • a bodily fluid sample which includes blood, serum, plasma, lymph, breast milk, urine, feces, ocular fluid, saliva, semen, brain extracts (e.g., brain grinds), spinal fluid, appendix, spleen And tonsil tissue extracts.
  • the target nucleic acid of the sample is DNA or RNA, and the molecule may be double stranded or single stranded. If the nucleic acid is double stranded as a starting material, it is desirable to make the two strands into single stranded or partially single-stranded form, and heat, alkali, formamide, urea and glycoxal are known methods of separating the strands. Treatment, enzymatic methods (eg, helicase action) and binding proteins, but are not limited to these.
  • the present invention relates to a kit and a use for simultaneous detection of target nucleic acids using a method for detecting simultaneous multiple target nucleic acids of the present invention and comprising a probe mixture consisting of a clamping probe and a detection probe.
  • the present invention assists in the diagnosis, prognosis, monitoring, evaluation of therapeutic efficacy, nucleic acid and protein delivery studies of the medical condition of the disease through a very small amount of mutant genotypes identified with high detection sensitivity in accordance with the detection method of the present invention. It can be used by the method. Using non-invasive samples (blood, urine, sputum, feces, saliva, cells) as well as invasive samples such as tissues, to detect biomarkers such as EGFR, KRAS, NRAS, and assess the presence of mutations in the biomarkers.
  • non-invasive samples blood, urine, sputum, feces, saliva, cells
  • biomarkers such as EGFR, KRAS, NRAS
  • the presence of the biomarker and the mutation may be used to monitor the entire cycle of the disease, the prognosis, prediction of the disease, determine the policy of treatment of the disease, diagnose / early diagnose the disease, prevent the disease, and develop a therapeutic agent for the disease. to provide.
  • the present invention has the advantage that it is possible to perform a variety of genetic tests at once, faster and cheaper, especially if only the modification of the genes that determine the therapeutic drug for a particular cancer by applying the present technology, one gene at present At the expense of testing it is possible to explore all the gene variants involved in the disease.
  • lung cancer patients should be tested for fusion of EML4-ALK, ROS1, KIF5B-RET genes with mutations in genes such as EGFR, KRAS, HER2, MET, TP53, NRAS, PIK3CA, and colorectal cancer. All mutations in genes such as TP53, NRAS, and PIK3CA should be examined to provide clinical help to patients.
  • the present invention is a clinical genome-related technology, it will be able to be quickly used in a variety of fields, such as treatment costs, loss due to side effects of drugs, cost reduction of new drug development by enabling personalized medical care based on individual genetic information quickly.
  • the present invention will provide an opportunity to select a more suitable therapeutic agent based on the progress of various clinical studies in Asian, drug therapy according to specific gene types.
  • Genetic disorders are diseases caused by genetic abnormalities. Genetic abnormalities present in the somatic cells appear as phenotypes, and since the same gene abnormalities exist in germ cells (sperm and egg), the phenotype is collectively referred to a disease transmitted to offspring.
  • the causes of genetic abnormalities are, firstly, errors that occur naturally when DNA is replicated, and secondly, they can be caused by a variety of chemical and environmental factors. According to a recent report of the Human Genome Project, there are 30,000-40,000 genes in human cells. According to these results, there are a myriad of human genetic diseases. In addition to these, we can predict that there are many types of genetic diseases and many more have not been studied.
  • Genetic polymorphism is one of the causes of multifactorial genetic diseases in which the incidence is largely dependent on the environment, and the probability of inheritance in a family is also very different depending on the individual and the disease. Genetic polymorphism is a different kind of person from the same gene, which includes short tandem repeat (STR) and single nucleotide polymorphism (SNP). STR repeats 2-5 short nucleotide sequences, and SNP means that the nucleotide sequence differs by about one nucleotide every 1.0 kb. STRs are used to identify paternity, and SNPs are widely used and studied, from individual identification to the possibility of disease development, prognosis, and response to specific drugs. Within 1% of the polymorphisms in the population is called "mutation". Recently, studies on gene polymorphism and mutations in major diseases such as cancer, diabetes, Alzheimer's disease, etc. are active. It is possible.
  • the DNA of cancer cells contained in the sample is extracted and various methods are used to interpret the gene of the patient. What is important when looking for genetic variants is the sensitivity of the detection method. Sensitivity refers to the percentage of variants that can be detected in the whole gene. Sanger sequencing has a false engative rate of 10%, pyrosequencing of about 5%, and recently developed The new methods have been reported to have excellent sensitivity with false negative rates of 1% and 0.1% (Nam et al. Korean J Pathol . 2014). In addition, since the results of genetic analysis vary according to the quality of the sample, it is reported that thorough management of the molecular testing process is important for accurate genetic testing (19. Nam et al. Korean J Pathol . 2014).
  • Diagnostic tests of genes are performed through a variety of tests for the purpose of confirming or differentially diagnosing a suspected genetic disorder in patients with disease symptoms.
  • Such genotyping can help prevent, early diagnose, treat, and manage disease, thereby reducing morbidity and mortality.
  • the genotyping test can be performed on any tissue of the human body, but it aims to use the most easily extracted DNA from the blood.
  • the sample may include DNA, RNA, chromosomes, metabolites, etc. in order to detect changes related to genetic diseases among the mutations in the genome.
  • Gene testing methods include direct analysis of DNA and RNA constituting genes, and biochemical or cytogenetic tests that indirectly identify genotypes inherited with disease genes and analyze metabolites. have.
  • Genotyping can be performed by a variety of methods, depending on the purpose of the test.
  • genotype SNPs and mutagenesis are characterized by hybridization with probes specific for alleles, mutation detection by enzymes, chemical cleavage of mismatched heterozygotes (Cotton et al., 1988), mismatched bases Cleavage by ribonuclease (Myers et al., 1985), mass spectrometry (US Pat. Nos.
  • nucleic acid sequencing single strand conformation polymorphism (SSCP (Orita et al., 1989), modified gradient gel electrophoresis (DGGE) (Fischer and Lerman, 1979a; Fischer and Lerman, 1979b), temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) Fischer and Lerman, 1979a; Fischer and Lerman, 1979b), restriction fragment length polymorphism (RFLP) (Kanand Dozy, 1978a; Kan and Dozy, 1978b), oligonucleotide linkage assays (OLA), Allele-specific PCR (ASPCR) (US Pat. No.
  • aspects of the invention relate to methods of monitoring disease (eg, cancer) progression in a subject, and further methods of monitoring disease recurrence in a subject.
  • aspects of the present invention also show that various non-cancer diseases and / or medical conditions also have genetic relevance and / or cause, and such diseases and / or medical conditions may also be diagnosed and / or monitored by the methods described herein. It is about the fact that it can.
  • nephropathy diabetes insipidus, diabetes mellitus type I, diabetes mellitus type II, nephropathy glomerulonephritis, bacterial or viral glomerulonephritis, IgA nephropathy, Henoho-Scherein (Henoch) Schonlein) purpura, membranous proliferative glomerulonephritis, melanoma nephropathy, Sjogren's syndrome, nephrotic syndrome microparalysis, focal glomerulosclerosis and related diseases, acute renal failure, acute tubulointerstitial nephritis, pyelonephritis, GU inflammatory disease, electron Hepatic, kidney transplant rejection, leprosy, reflux nephropathy, nephrolithiasis, hereditary nephropathy, medulla cystic disease, medulla spongy disease, polyc
  • Cancers that are monitored or otherwise profiled can be any type of cancer. This includes, but is not limited to, epithelial cell cancer, such as lung cancer, ovarian cancer, cervical cancer, endometrial cancer, breast cancer, brain cancer, colon cancer and prostate cancer. Gastrointestinal cancer, head and neck cancer, non-small cell lung cancer, nervous system cancer, kidney cancer, retinal cancer, skin cancer, liver cancer, pancreatic cancer, reproductive tract and gallbladder cancer, melanoma, and leukemia are also included.
  • the methods and compositions of the present invention may equally be applied to the detection, early diagnosis / diagnosis and prognosis of non-malignant tumors (eg neurofibromatosis, meningiomas and Schwann cell tumors) in a subject.
  • non-malignant tumors eg neurofibromatosis, meningiomas and Schwann cell tumors
  • Nucleic acids obtained from the body fluids of one or more subjects suffering from a given disease / medical condition are analyzed and compared to nucleic acids of one or more subjects not suffering from a given disease / medical condition. You can see the difference between the contents. Such differences include, but are not limited to, nucleic acid expression levels, selective splice variants, gene copy number variants (CNV), nucleic acid modifications, single nucleotide polymorphisms (SNPs), and mutations of nucleic acids (insertions, deletions or single nucleotide changes). It may be a genetic abnormality of. Once the differences in the genetic parameters of a particular nucleic acid have been identified for a particular disease, further studies involving clinically and statistically significant numbers of subjects have been conducted to determine between the genetic abnormality of the particular nucleic acid and the disease. Correlation between
  • the disease is caused by a mutation in the gene, it can be cured by changing the gene in question.
  • T lymphocytes were extracted from a girl with severe congenital immunodeficiency due to a deficiency in the gene that produces the enzyme adenosine deaminase (ADA). Infusion into the stomach was able to restore immune function.
  • ADA adenosine deaminase
  • Gene therapy involves ex-vivo gene therapy, which extracts target cells, inserts specific genes, and injects them, as well as injecting specific genes directly into target tissues. in vivo) gene therapy.
  • Most recent gene therapies are attempted primarily to treat cancer. This method involves injecting genes that make cancer cells sensitive to cancer cells or cancer drugs to kill cancer cells directly, and inserts various cytokine-generating genes into white blood cells to infiltrate cancer cells or secrete cytokines to produce immune responses. It can be divided into triggering methods. Cancer, acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), and monogenetic diseases are currently the main goals of gene therapy. It is possible to provide a variety of information on how to identify the genotype for such gene therapy. In addition, researches on gene polymorphism and differences of specific populations or races are being actively conducted, and this technology can be utilized.
  • the gene in the case of cancer, whether the gene is more vulnerable to a specific carcinogen, decreases the ability to recover the destroyed gene, or weakens the immune function involved in cancer prevention, all of which can be combined. It is very difficult to know whether or not to. Therefore, one gene may be involved in several diseases at the same time, and several genes may be related to one disease. Also, in the case of multifactorial genetic diseases, the presence of the gene does not necessarily cause the disease.
  • the best known cancer gene for example, is the BRCA1 mutant gene, which is linked to breast cancer, with 60% of women with this gene suffering from cancer at age 65. On the other hand, about 12% of women have this cancer.
  • Cancer is a genomic disease, and the genetic tendency adds environmental stimuli, and cancer cells are generated by various genetic mutations, which proliferate and change.
  • Recent important concepts include oncogenic addiction and synthetic lethality.
  • Oncogene addiction means that continuous activation of abnormal signaling pathways by one or two genes, among various genetic abnormalities, plays a key role in the development, proliferation, and maintenance of cancer. It is a theory.
  • Synthetic lethality is a concept that cancer cells cannot be killed when each gene is suppressed, but cancer cells can be destroyed when both genes are simultaneously suppressed. Finding the key genes and understanding the interactions of these genes will lead to better therapeutic effects and the use of various information using this technology.
  • cancer samples have somatic cell oncogene information of various regions, such as genomic genome, primary cancer site and metastatic cancer site, and thus can be used in various clinical applications.
  • SNP sequence polymorphism
  • CNV chromosome number variation
  • Cancer-specific somatic DNA mutations include mutations, amplifications, deletions, fusions, and methylation of specific genes. These analyzes are used to assess the risk of cancer as well as to diagnose and treat individual patients. The degree of expression of RNA and protein, individual immune responses, or cytokine secretion, as well as DNA mutations, can be used to assess cancer risk in individual patients and to diagnose and treat individual patients.
  • oncogene information is the mutation of oncogenes detected in each cancer tissue or blood.
  • Driver mutations are mostly oncogenes and are the major genetic changes that determine the patient's cancer development, progression, and response to treatment.
  • it can be utilized as a tool for identifying appropriate treatment by identifying metastatic gene changes in each cancer tissue or blood in cancer customized medicine.
  • it can be used as a big data of the cancer genome by analyzing the specific genetic pathway of the patient and using it as a method for sensitively detecting rare point mutations as well as hot spots.
  • EGFR epidermal growth factor
  • gefitinib epidermal growth factor tyrosine kinase inhibitor gefitinib has a response response of about 70% and patients with EGFR-activated mutations can survive for 10 months without tumor progression.
  • treatment strategies for lung adenocarcinoma are shifting from tissue-based approaches to key mutation-related therapies. The frequency of the occurrence of some key mutations varies among ethnicities, and therefore, extensive genetic studies are needed to develop new drug targets and targeted therapies for lung cancer.
  • Cancer cells with genetic modifications called driver mutations have an advantage in survival and growth compared to cells that do not have these modifications.
  • Core mutations occur in genes encoding signaling proteins such as kinase, which can generate constitutively active survival signals that initiate and maintain tumor development.
  • Cancer is genetically diverse and dynamic, with driver mutations and other new mutations that play an important role at the time of diagnosis when they develop, progress, or metastasize to treatment, or mutations that were not significant at diagnosis. Passenger mutations play a major role.
  • the concept of crisis model in which numerous mutations occur multiple times at once is introduced. Inhomogeneity is one of the most difficult and important tasks to be solved in the future, and this information can be used to sensitively detect a variety of mutations, thereby identifying various information.
  • cancer tissues of primary and metastatic sites in cancer tissues can be used for monitoring various genetic changes, changes due to continuous evolution in the patient's body, etc. have.
  • the process of obtaining tissue from cancer patients is a difficult process that causes a lot of burden on the patient, while the present invention enables a method of detecting cancer-specific genes from blood using a small amount of tissue or an easy collection, and various clinical demonstrations are possible. It can be used as a variety of data through.
  • Lung cancer is a common cancer and is known worldwide as the leading cause of cancer-related deaths. Although low-dose computed tomography screening techniques have increased the initial diagnosis rate, lung cancer is still a fatal disease with a very poor prognosis.
  • an EGFR blocking tyrosine kinase inhibitor (Iresa, Taceba, etc.) is effective for treatment.
  • direct sequencing method is a standard method, and a more sensitive PNA clamp method may be used.
  • mutation frequency can be measured in each patient tissue DNA with the same sensitivity as the conventional PNA clamp method, thereby obtaining more accurate information.
  • the effect of EGFR blocking tyrosine kinase inhibitor treatment on patients with mutations detected in sensitive methods is more clinically useful than direct group sequencing method, so detecting genotypes accurately and sensitively. There is a report that it is important.
  • EGFR mutant in lung cancer patients indicates that the patient can benefit from treatment with EGFR-targeting compound zephytinib or erlotinib.
  • Aberrant activation or overexpression of EGFR has been reported in several types of cancer. Even now, many studies have been conducted to find a target that plays a key role in the development of lung cancer and to understand genetic diversity, and studies on understanding genetic diversity using the present invention are possible.
  • Tumor genes that are activated in lung cancer include EGFR, ALK, RAS, ROS1, MET, RET, etc., and therapeutic agents targeting these key oncogenes can selectively remove cancer cells.
  • Epidermal growth factor receptor EGFR
  • EGFR is one of the ErbB tyrosine kinase receptors family (EGFR, HER-2, ErbB-3, ErbB-4) and is an extracelluar ligand.
  • Transmembrane tyrosine kinase has an intra-cellar domain including a binding domain and a tyrosine kinase domain.
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • AKT phosphatidylinositol 3-kinase
  • Gefitinib and erlotinib are representative agents that inhibit EGFR tyrosine kinase activity.
  • mutations in the EGFR kinase region are factors that predict the effects of EGFR TKI, and these mutations are mainly histologically expressed in adenocarcinoma, females, nonsmokers, and Asians. Based on the results of various clinical trials, patients currently diagnosed with stage 4 adenocarcinoma of non-small cell lung cancer are tested for EGFR mutation and receive EGFR TKI as an initial treatment in the presence of the mutation.
  • RAS proto-oncogenes such as KRAS, NRAS, HRAS and plays a role in regulating cell proliferation, differentiation and survival.
  • RAS protein is bound to guanosine diphosphate (GDP) in an inactive state and is activated when GDP is substituted with guanosine triphosphate (GTP) to signal RAS / RAF / MEK / MAPK and PI3K / AKT / mTOR Activate the delivery system.
  • GDP guanosine diphosphate
  • GTP guanosine triphosphate
  • activation of the RAS / RAF / MEK / MAPK signaling system occurs in about 20%, mainly due to KRAS mutations, and rarely HRAS or NRAS mutations.
  • EGFR tyrosine kinase inhibitors EGFR tyrosine kinase inhibitors
  • crizotinib received attention by dramatically reducing the time and cost of drug approval through patient selection using accurate biomarkers to predict response. It has a bad prognosis and has many problems to solve in prevention, diagnosis and treatment.
  • One of the causes is the genetic heterogeneity of lung cancer.
  • EGFR, KRAS, and NRAS mutant test results through the present invention is carried out lung cancer drug sensitivity test, tyrosine kinase inhibitors (TKI), which is useful for the treatment of non-small cell lung cancer (Gefitinib, Iressa) and Elo
  • TKI tyrosine kinase inhibitors
  • the EGFR mutation is a marker that can accurately predict the response to EGFR-TKI, such as Gefitinib (Iressa) and Erlotinib (Terceva), as a primary anticancer drug in patients with EGFR mutation-positive non-small cell lung cancer. Use is recommended.
  • KRAS mutations act as potent predictors of drug resistance that do not respond to TKI drugs, and KRAS mutations are found mainly in codons 12 and 13 of exon 2. KRAS mutations are found in 15-30% of non-small cell lung cancers, mainly in smoking patients and are mutually exclusive with EGFR mutations.
  • the target therapeutic agent for lung cancer is a combination of chemotherapy with vinorelbine, gemcitabine, taxanes, and platinum, a cytotoxic anticancer drug developed in the 1990s.
  • a cytotoxic anticancer drug developed in the 1990s.
  • the traditional cytotoxic anticancer drug treatment is not effective in the treatment of patients with advanced and metastatic NSCLC.
  • molecular biological studies on the pathophysiology of lung cancer have shown that gefitinib and erlotinib are the target drugs belonging to the small molecule EGFR-TKI as secondary or tertiary treatments of monotherapy. It is used.
  • angiogenesis inhibitor called bevacizumab has been recently described as paclitaxel / carboplatin or gemcitabine / carboplatin in the initial initial treatment of patients with advanced NSCLC. It has been confirmed that the combination of the three chemotherapeutic agents with existing chemotherapy agents is meaningful for the improvement of survival time.
  • Zefitinib (Gefitinib, Iressa) was a 9-19% treatment response rate in patients with advanced non-small cell lung cancer who had a history of treatment and improved symptoms in more than 40% of patients.
  • zephytinib In a placebo-controlled Phase 3 study, the addition of zephytinib to existing paclitaxel / carboplatin cytotoxic chemotherapy would not significantly improve treatment response, time to progression (TTP), and survival. I could't.
  • IRES Iressa Survival Evaluation in Lung Cancer
  • the zephytinib-treated group showed no significant difference between the placebo control group and the survival rate. However, small group analysis showed differences in survival rates between non-smokers and Asians.
  • EGFR mutation If there is EGFR mutation or satisfies two or more of three conditions such as female, adenocarcinoma, and non-smoker, it is used as secondary chemotherapy.Terracene (taxanes) and platinum (in primary and secondary chemotherapy) are used as tertiary chemotherapy. It is used when platinum) is used.
  • erlotinib (Tarceva) showed similar results to gefitinib with a 13% response rate and 51% disease control rate in phase II studies in patients with treatment history of non-small cell lung cancer, and immunohistochemistry. EGFR overexpression patients. However, response and survival in large-scale Phase 3 studies where erlotinib was observed as a first-line therapy with the addition of erlotinib to gemcitabine / cisplatin (TALENT) and carboplatin / paclitaxel (TRIBUTE) There was no significant improvement over the period.
  • erlotinib is a second-line therapy with a significant difference in progression-free survival of 2.2: 1.8 months and overall survival of 6.7: 4.7 months in the results of the placebo-controlled, 2: 1 randomized phase III study BR.21. It has been reported as the first target drug to demonstrate improved survival data in NSCLC.
  • Colorectal cancer is one of many tumors whose genetic mechanisms are involved in the development of tumors. Recently, these genetic abnormalities have been applied to actual clinical practice to treat patients.
  • the present invention can be significant in the study of the mechanism of such cancer.
  • Oncogene RAS exists in three forms, HRAS, KRAS, and NRAS, and produces guanosine triphosphate hydrolase (GTPase), which acts as a molecular switch.
  • GTPase guanosine triphosphate hydrolase
  • RAS transmits extracellular growth signals into the nucleus.
  • RAS When RAS is activated, it transforms cells through various pathways such as Raf / MAPK, PI3K / Akt, Mekk / JNK, and the p53 and TGF- ⁇ pathways. It acts to inhibit tumor suppressor pathways such as
  • the most common mutation in colorectal cancer among RAS is KRAS, which occurs intensively at codons 12, 13, and 61, and is resistant to GAP-mediated GTP hydrolysis to maintain a constantly activated state. do.
  • the fecal occult blood test for the diagnosis of colorectal cancer has been used for decades as a non-invasive colorectal cancer screening test and has been shown to reduce colorectal cancer mortality in several studies (Mandel JS, N Engl J Med). , 1993 / Kronborg O , Lancet 1996).
  • fecal DNA testing is performed to detect stool mutations or promoter hypermethylation in colon cancer.
  • the fecal DNA test is known to have 46-77% sensitivity to early colorectal cancer, which is superior to the fecal occult blood test and was recently added as a screening test for colorectal cancer.
  • studies are being conducted to find DNA, RNA, proteins, etc. related to colorectal cancer in the blood or urine for screening, and thus it is easy to find candidates for screening using the present technology or to confirm the influence of specific mutations. Can be.
  • genome instability and epigenetic changes play an important role in carcinogenesis, and a new early diagnosis method using the genetic and epigenetic changes found in colorectal cancer by identifying various signaling systems involved in cancer development. In addition to the development of new drugs, they can be used as predictors of the prognosis and treatment response of colorectal cancer and contribute to the development of personalized therapies.
  • Metastatic colon cancer is the second leading cause of death in the West, and treatment based on monoclonal antibodies (moAb) against EGFR, such as cetuximab and panitumumab, is significant in patients with mCRC. It provides survival benefits and is currently the standard ingredient of treatment regimens for these patients. That is, either alone or in combination with other anti-tumor drug (s), one of these moAbs, cetuximab (Eerbitux, Erbitux), combines platinum-based chemotherapy with squamous cell carcinoma of the head and neck, also known as head and neck cancer. It is also prescribed for the treatment of patients having.
  • moAb binds to foreign antigens expressed on cancer cells. Once bound, cancer cells are marked as destroyed by the patient's immune system.
  • moAbs can be designed to act on other cell types and molecules required for tumor growth.
  • moAbs can be used to prevent tumor growth by destroying malignant tumor cells and blocking specific cellular receptors.
  • Therapeutic moAb cetuximab and panitumumab bind to EGFR and prevent activation of intracellular signaling pathways (ie, RAS-RAF-MEK-ERK cascade and PI3K-akt pathway) induced by EGFR.
  • intracellular signaling pathways ie, RAS-RAF-MEK-ERK cascade and PI3K-akt pathway
  • KRAS gene encoding KRAS (Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) protein may be from human and is located on human chromosome 12 (p12.1), which is a protein encoded therefrom.
  • KRAS gene is GenBank accession no. It may have a nucleotide sequence provided in NM_004985, NM_033360 and the like.
  • KRAS is an EGFR downstream effector and a marker of primary resistance to anti-EGFR moAbs.
  • KRAS has a significant impact on the optimization of treatment in mCRC patients. Forty percent of colon tumors carry mutations in the KRAS gene and these patients have no effect of anti-EGFR moAbs. All mCRC patients considered for anti-EGFR moAb treatment in current clinical practice must undergo KRAS testing, and if KRAS mutations are detected the patient must be excluded from cetuximab or panitumumab treatment.
  • PTEN phosphatase and tensine homologues
  • BRAF serine / threonine-protein kinase B-Raf
  • PI3K phosphatidylinositol 3-kinase
  • RAS and RAF proteins are proteins that form a cascade of intracellular signal transduction by the RAS / RAF / MAPK pathway.
  • the RAF protein is activated by the active RAS protein
  • the MEK protein is activated by the active RAF protein
  • the MAPK protein is activated by the active MEK protein. This controls cell proliferation, differentiation, and the like.
  • Bevacizumab / FOLFIRI combination therapy is the first line of treatment for metastatic colorectal cancer and can extend response rates, progression free survival and overall survival (Hurwitz H, et al. NEJM 2004, 6. Petrelli et al. Clin Colorectal Cancer . 2013 Sep; 12 (3): 145-51).
  • Bevacizumab and ziv-aflibercept are the second-line treatments for metastatic colorectal cancer that have been shown to be effective in progression-free survival and overall survival (Giantonio et al. JCO 2007 14. Tabernero et al. European Journal of Cancer 50, 320-331, 2014).
  • Bevacizumab is a statistically significant progression-free survival and overall survival rate when continuous treatment of bevacizumab with chemotherapy combined with bevacizumab for the first treatment and chemotherapy with the second treatment after the first relapse. (Bennouna et al. Lancet Oncol . 14: 29: 37, 2013).
  • Tissue samples and plasma samples from 192 non-small cell lung cancer patients who participated in the randomized phase II trial were obtained.
  • tissue samples the results were obtained using sequencing method, and EGFR test was performed from plasma using the simultaneous multiple target nucleic acid detection method (C-Melting technology) of the present invention.
  • DNA was extracted using QIAGEN's QIAamp ® Circulating Nucleic Acid Kit (Cat # 55114).
  • 100 ml of proteinase K and 800 ⁇ l of buffer ACL containing 1.0 ⁇ g of carrier RNA were added to 1 ml plasma sample, followed by mixing well. Treated for hours.
  • 1.8 ml of ACB buffer was added and allowed to stand on ice for 5 minutes.
  • the solution was lowered onto a column using a vacuum, followed by washing in order of 600 ⁇ l of buffer ACW1, 750 ⁇ l of buffer ACW2, and 750 ⁇ l of 100% ethanol.
  • the column was separated in a vacuum system, centrifuged at 14,000 rpm for 3 minutes, and treated at 56 ° C. for 10 minutes to remove remaining ethanol. 100 ⁇ l of buffer AVE was added to the column, and DNA was eluted after centrifugation at 14,000 rpm for 1 minute. Eluted DNA was used for 5 ⁇ l in the C-melting experiment.
  • PCR was performed to detect EGFR mutations using DNA extracted from plasma.
  • 10 reagents for detecting 47 exon 18, 19, 20, and 21 mutations (G719X, E19del A, E19del B, S768I, T790M, E20ins A, E20ins B, L858R, L861Q, EIC) each in 19 ⁇ l.
  • EGFR test results of DNA extracted from plasma samples showed that the agreement with the existing tissue samples was 81.3% (95% confidence interval [CI], 75.0-86.5), and the sensitivity and specificity were respectively 62.0% (95% CI, 47.2-75.4) and 88.0% (95% CI, 81.5-92.9).
  • Table 1 shows the results of median progression-free survival (PFS) between 114 people who received EGFR-TKI treatment (Gefitinib, Iressa) or Erlotinib, Tarceva.
  • Example 2-1 Sample recruitment
  • Tissue samples and plasma samples from 135 non-small cell lung cancer patients who participated in the randomized phase II trial were obtained.
  • tissue samples the results were obtained using sequencing method, and KRAS test was performed from plasma using the simultaneous multiple target nucleic acid detection method (C-Melting technology) of the present invention.
  • DNA was extracted using QIAGEN's QIAamp ® Circulating Nucleic Acid Kit (Cat # 55114).
  • 100 ml of proteinase K (QIAGEN) and 800 ⁇ l of buffer ACL containing 1.0 ⁇ g of carrier RNA were added to 1 ml plasma sample, and then mixed well. Treated for hours.
  • 1.8 ml of ACB buffer was added thereto and allowed to stand on ice for 5 minutes. The solution was lowered to the column using vacuum, and then washed in the order of 600 ⁇ l Buffer ACW1, 750 ⁇ l buffer ACW2, and 750 ⁇ l 100% ethanol.
  • the column was separated in a vacuum system, centrifuged at 14,000 rpm for 3 minutes, and then treated at 56 ° C. for 10 minutes to remove residual ethanol. 100 ⁇ l of buffer AVE was added to the column, and DNA was eluted after centrifugation at 14,000 rpm for 1 minute. Eluted DNA was used for 5 ⁇ l in the C-melting experiment.
  • PCR was performed to detect KRAS mutations using DNA extracted from plasma.
  • nine reagents for detecting 29 exon2, 3, and 4 mutations (KC12a, KC12b, KC13a, KC13b, KC59, KC61, KC117, KC146, KIC) in 19 ⁇ l of Taq DNA polymerase (Enzynomics., Korea) After mixing 1 ⁇ l, 5 ⁇ l of DNA was added.
  • KRAS test results of DNA extracted from plasma samples showed that the agreement with the existing tissue samples was 81.5% (95% confidence interval [CI], 73.9-87.6), and the sensitivity and specificity were respectively 25.0% (95% CI, 5.5-57.2) and 87.0% (95% CI, 79.7-92.4).
  • mutations were detected in 16 additional patients compared to tissue samples in plasma samples.
  • Table 2 shows the median progression-free survival (PFS) results between 114 patients who received EGFR-TKI treatment.

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Abstract

본 발명은 클램핑 프로브 및 검출 프로브를 이용한 표적핵산 검출방법의 응용에 관한 것으로, 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하고 검출하고자 하는 극미량의 표적 유전자의 선택적 증폭 및 검출을 통해 시료 속에 포함된 미량의 변이 또는 특정 유전자 서열을 효과적으로 검출할 수 있다. 또한 융해 곡선 분석을 통한 동시에 다량의 유전형 판별이 가능하다. 특히 높은 검출 민감도로 확인되는 극소량의 돌연변이 유전형을 통해 질환의 의학적 병태를 진단, 예후, 모니터링, 치료 효능의 평가, 핵산 및 단백질 전달연구를 보조하는 방법 등으로 사용 가능하다. 조직과 같은 침습적 검체 뿐 아니라 비침습적 검체(혈액, 소변, 객담, 대변, 타액, 세포)를 이용하여 EGFR, KRAS, NRAS 등의 바이오마커 검출 및 바이오마커의 돌연변이의 존재를 평가하는 단계를 포함하고, 상기 바이오마커 및 돌연변이의 존재는 관련된 질병의 전주기 모니터링, 질병의 예후, 예측, 질병의 치료방침 결정, 질병의 진단/조기진단, 질병의 예방, 질병의 치료제 개발에 이용하기 위한 방법을 제공한다.

Description

클램핑 프로브 및 검출 프로브를 이용한 다중 표적핵산 검출 방법의 이용
본 발명은 클램핑 프로브 및 검출 프로브를 이용한 표적핵산의 검출 방법 및 이용에 관한 것으로서, 유전자 샘플에 포함된 미량의 돌연변이를 신속하고 민감하게 검출함에 따라 다양한 용도로 사용 가능하며, 특히 유전자 돌연변이 검출 방법 및 유전자 돌연변이 관련 질환의 진단 또는 연구에 필요한 다양한 정보를 제공할 수 있다.
또한, 유전자내의 미량 함유된 돌연변이를 민감하게 검출함으로써, 질환 또는 의학적 병태의 진단, 예후, 질병의 모니터링, 치료 효능의 평가, 핵산 및 단백질 신호 전달 연구 등을 보조하는 방법에 관한 것이다. 아울러, 본 발명은 대상체에서 각종 질병(예로서, 암)의 진행을 모니터링하는 방법 및 재발을 모니터링하는 방법에 관한 것이다.
유전자 검사를 수행함에 따라 질병의 증상이 있는 환자에서 의심되는 유전 질환을 확진하거나 감별할 수 있다. 그리고 질환의 원인이 되는 유전자의 돌연변이 유무 검사를 통해 질병의 발병 가능성과 발병 위험도가 높아지는 질환의 예측 또한 가능하다. 이러한 유전형 검사는 질병의 예방, 조기 진단, 치료 및 관리에 도움을 주어 질환의 이환율과 사망률을 감소시킬 수 있다고 보고되고 있다.
이러한 유전자 검사는 인체 내의 모든 세포는 유전적으로 동일하게 구성되어 있다는 전제로 인체의 어떤 조직으로도 유전자 검사가 가능하지만, 가장 쉽게는 혈액에서 DNA를 추출하여 사용할 수 있다. 다양한 시료로서는 DNA, RNA, 염색체, 대사물질 등이 있을 수 있다.
특히, 암의 발병과 약물의 예후 판단에 종양 유전자(Oncogenes)의 변이(mutations), 종양 억제 유전자(tumor suppressor genes)의 변이, 탈조절(deregulations)과 염색체의 이상(chromosomal abnormalities)등의 유전자의 이상이 관여한다는 사실이 밝혀지면서 다양한 연구가 보고되고 있다(Fearson ER et al., Cell., 1990; K.W Kinzler et al., Cell., 1996; Manuel Serrano et al., Cell., 1997; Amado RG et al., J. Clin. Oncol., 2008, Raponi M et al., Curr. Opin. Pharmacol., 2008; Siena S et al., J. Natl. Cancer Inst., 2009).
암에 특이적인 유전자의 분석을 통해 암의 발병 유무를 간접적으로 확인할 수 있다. 예로서, EGFR 핵산의 상대적인 증가, 예로서, p53과 같은 종양 억제 유전자의 상대적인 감소 등이 있다.
또한, 종양 유전자들의 기능과 암의 연관성 및 약물 반응성 등의 보고에서 종양 유전자의 돌연변이 검사의 필요성을 제시하고 있다. 예를 들어, 직결장암에서 흔하게 관찰되는 KRAS 엑손 2(코돈 12, 13) 유전자의 돌연변이 검사 후에 정상 KRAS 환자에 항-EGFR 항체(anti-EGFR antibody) 치료제인 세툭시맙(cetuximab)을 투여하면 반응율이 35~45% 정도이며(Lievre et al. Cancer Res 2006; 66:3992-3995), 다른 변이형 RAS를 확인하기 위한 연구의 진행에서 KRAS 엑손 2(코돈 12, 13)의 변이율은 40~45% 이고, KRAS 엑손 2가 정상인 경우에 KRAS 코돈 61, 146, NRAS 코돈 61, 12, 13 등의 변이율이 약 15~20%로 KRAS 엑손 2 외에 다른 RAS 돌연변이를 검사하면 RAS 변이율은 증가하게 된다는(Douillard et al. N Engl J Med. 2013) 보고가 있다.
암의 치료에 있어, 1차 항암화학요법제로 적절한 약물을 결정하는 것은 매우 중요하다. 대장암의 경우, 생물학적제제(Biologic agent)가 나오기 전에는 1차 치료제로 FOLFOX6(fluoropyrimidine, leucovorin, oxaliplatin) 혹은 FOLFIRI를 투여하고, 2차 치료제는 반대로 FOLFIRI 혹은 FOLFOX6를 투여하는 두 가지 방법(Tournigand, et al. JCO 2004)으로 치료를 진행하였다. 하지만 표적치료제인 베바시주맙(bevacizumab)과 세툭시맙(cetuximab)이 개발되면서 1차 치료시 FOLFIRI에 베바시주맙(bevacizumab)을 추가했을 때 생존 기간 연장 효과가 입증됐고, CRYSTAL 연구에서는 정상 KRAS 유전자인 환자에게 FOLFIRI과 세툭시맙(cetuximab)을 병용 투여하면 생존 기간이 연장되는 효과를 보여주었다(Van Cutsem, J Clin Oncol. 2011).
또한, 여러 가지 표적 치료제의 개발과 함께 이들 약제에 대한 반응을 예측할 수 있는 인자들에 대한 연구들이 보고되고 있다. 대표적으로 EGFR 단클론항체와 KRAS 유전자의 돌연변이에 관한 것으로 EGFR은 KRAS 신호전달체계를 통하여 세포의 성장과 전이를 촉진하기 때문에 KRAS 신호전달체계에 이상이 있는 경우 즉, KRAS나 BRAF에 돌연변이가 있는 경우 EGFR을 차단하는 효과가 감소할 수 있다. 실제로 KRAS 돌연변이와 BRAF 돌연변이는 세툭시맙(cetuximab)이나 파니투무맙(panitumumab)과 같은 EGFR 단클론 항체의 치료 효과 감소를 예측할 수 있는 표지자로 보고되어 있다 (Eberhard DA J ClinOncol, 2005 / Karapetis CS, N Engl J Med, 2008/ Di Nicolantonio F J ClinOncol, 2008).
이와 관련하여, 아스트라제네카(Astrazeneca)사의 제피티닙(gefitinib) 단일요법 2상 연구 자료에 대한 소집단 분석 자료에서 제피티닙에 대해 방사선학적 반응을 보인 환자의 임상적 특성은 여성, 비흡연자, 선암 그리고 동양인이라는 사실이 밝혀졌고 이러한 결과는 추후 엘로티닙(erlotinib) 연구 자료에서도 놀라울 만큼 일치하는 결과를 나타내었다. 또한 BR.21 연구 결과에서도 엘로티닙 반응과 관련있는 임상 요소 중 선암, 비흡연자, 동양인에서 유의한 생존 자료의 차이를 관찰할 수 있었다. 이러한 임상 자료를 바탕으로 EGFR-TKI에 반응하는 소집단 환자에서 이를 설명할 수 있는 어떤 분자적 기전이 존재할 것이라는 가설이 제기되었고 암유전자 중독(oncogene addiction)이라는 가설 하에 EGFR 유전자 염기서열 해독 결과 EGFR 돌연변이를 발견하게 되었다. 이미 여러 종양(유방암, 신경아교종, 전립선암 등)에서 EGFR 돌연변이는 알려져 있었으나 그 위치는 대부분 세포외 도메인(domain)에 발생하며 EGFR-TKI 반응과도 무관하다고 알려져 있었다.
반면, EGFR-TKI 반응을 결정하는 돌연변이 확인 결과 EGFR-TKI가 세포 내에서 작용하는 티로신키나아제 영역(tyrosin kinase domain)을 결정하는 엑손 내에 발생함을 확인하였고 이들은 ATP-결합 포켓(ATP-binding pocket)이나 활성 루프(activation loop)와 관련된 돌연변이임을 확인하였다. EGFR 티로신키나아제 도메인(EGFR tyrosine kinase domain)은 7개의 엑손 (18~24)으로 구성되어 있는데 대부분의 EGFR 돌연변이는 엑손 18~21에 위치하며 다음 세가지 유형으로 분류된다. 엑손 19의 결실(deletion)로 60%를 차지하며, 엑손 21의 미스센스 돌연변이(missense mutation, L858R)로 25%를 차지하며, 나머지는 드물지만 엑손 18, 20, 21의 점 돌연변이(point mutation)과 엑손 20의 삽입/중복(insertion/duplication)이 차지한다. 이러한 EGFR 돌연변이는 EGFR 하부 신호전달경로 중 세포 촉진 및 항아포프토시스를 촉진시키는 Akt와 STAT 경로를 선택적으로 활성화시키는 반면 세포증식과 관련된 ERK 경로에는 영향을 미치지 않는 것으로 알려져 있어 EFGR-TKI를 사용하면 아포프토시스가 발생하여 신속한 효과를 나타내는 것으로 밝혀져 있다. EGFR 티로신키나아제 도메인의 돌연변이률은 현재까지 분석된 비소세포폐암의 약 20%에서 발견되며 선암, 동양인, 여성, 비흡연자 등에서 월등히 높은 빈도로 발견되고 있어서 EGFR-TKI 반응률이 높은 임상지표와 정확하게 일치하는 결과를 보이고 있다. 하지만 EGFR 돌연변이가 있는 경우, EGFR-TKI를 사용하였을 경우 생존율이 유의하게 증가되지는 않는다고 보고되었다.
EGFR-TKI 내성 - EGFR-TKI가 임상에 도입된지 얼마되지 않은 시점에 EGFR-TKI에 대해 극적인 반응을 보였던 환자를 포함하여 대부분의 환자에서 결국에는 재발이 발생한다고 알려졌다. 최근 엑손 20에 2차 돌연변이(T790M)가 발생하여 제피티닙(gefitinib)이나 엘로티닙(erlotinib)에 대한 내성이 획득된다는 사실이 밝혀졌는데 이 돌연변이는 약물이 ATP-결합 포켓에서의 수소결합을 결정적으로 방해하는 것으로 추측되고 있으며, 이는 EGFR-TKI 사용에 있어서 극복해야 할 또 하나의 문제점으로서 획득내성의 문제가 없는 EGFR-TKI의 개발 연구가 진행 중이다.
EGFR-TKI 에 대한 반응을 결정하는 요소의 하나로 최근 K-ras가 제시되고 있는데 K-ras의 엑손 2 돌연변이가 있는 환자에 있어서 EGFR-TKI의 반응하는 경우는 거의 없다고 보고되고 있다. 선암 중 K-ras 돌연변이가 30%에서 발견된다고 알려져 있는데 흡연자 및 남자에서 흔히 발생하며 동양에서의 빈도가 낮다는 사실에서 EGFR 돌연변이와 거의 정확히 반대되는 현상을 보이고 있다. 이를 근거로 선암의 발암 과정에 있어서 비흡연자는 EGFR 돌연변이를 통해서 이루어지고 흡연자는 K-ras를 통해서 발병할 것이라는 가설도 제시되어 있다. EGFR 2차 돌연변이에 의한 획득내성 이외에 내인성 내성 문제도 EGFR-TKI에 대한 반응률을 높이기 위해 해결해야할 숙제인데 현재 이와 관련된 인자로서는 EGFR 리간드(ligand)의 역할, EGFR 하부경로인 PI3K/AKT 및 MAPK의 EGFR-비의존성 활성화에서 PTEN의 역할 그리고 EGFR 외의 다른 종양 경로(oncogenic pathway) (예를 들어, IGF-IR pathway) 등이 관련이 있을 것으로 추정되고 있다.
세툭시맙(Cetuximab, C225, Erbitux)은 EGFR의 세포외 수용성 부위 domain III에 결합하는 쥣과/인간 키메릭(murine/human chimeric) 단일클론항체로서 EGFR의 이량체화를 차단한다. 세툭시맙은 단일요법보다는 기존의 세포독성 항암요법과의 병용치료에서 효과를 보이는 것으로 알려져 있다. 시스플라틴(Cisplatin)과의 병용한 1상 연구에서 누적 독성이 없는 것으로 확인되었고 재발성 비소세포폐암 환자 중 면역조직화학에 의한 EGFR 발현이 +1 이상인 환자를 대상으로 한 2상 연구에서 도세탁셀(docetaxel)과 병용치료 한 결과 반응률 25%, 질병 조절률 60% 이상의 고무적인 결과를 나타내었다. 이를 기반으로 현재 도세탁셀 또는 페메트렉시드(pemetrexed)와의 병용치료 3상연구가 진행 중이다. 세툭시맙은 현재 대장암에서 승인을 받은 상태이며 국소진행성 두경부암에서 방사선요법과의 병용치료로 상승효과가 있다고 보고되고 있다.
이상과 같이 현재 승인받은 EGFR-TKI, 제피티닙과 엘로티닙 그리고 베바시주맙(bevacizumab) 외에 많은 표적치료제가 개발되고 활발한 임상 연구가 수행되고 있으며, 특정 유전자의 돌연변이형의 민감한 분석은 표적치료제 개발에 많은 정보를 제공할 수 있다.
특히 제피티닙과 엘로티닙이 현재 단일요법제로서 2차 치료에서 일부 제한된 환자에서만 효과를 보인다는 사실과 획득내성 문제, 베바시주맙이 1차 치료제로서 효과가 입증되었지만 일부 환자에서만 사용될 수 있다는 점등의 실마리를 풀 수 있는 정보를 제공할 수 있다. 또한 향후 새로운 표적치료제와 세포독성 항암요법과의 병용치료, 표적치료제 간의 병용요법, 수술 후 보조요법제로서의 역할, 화학예방제로서의 역할, 목표치료제 선택에 대한 분자생물학적 지표 개발 등이 연구에 다양하게 활용될 수 있다.
또한 Anti-EGFR antibody는 세포 증식을 조절하는 RAS/MAPK 기전을 억제함으로써 암세포의 증식을 억제하는 효과가 있으나, KRAS에 변이가 있는 환자는 anti-EGFR antibody에 반응하지 않으므로 화학요법시 암환자의 유전자형을 확인하는 것은 매우 중요하다(Herreros-Villanueva et al. Clin Chim Acta. 2014)는 보고가 있으며, 암 환자의 유전자형을 확인하기 위한 다양한 검사 방법과 기술들이 소개되고 있다.
임상적 의미가 있는 돌연변이의 검출은 매우 중요하기 때문에 분석하고자 하는 목적 또는 유전자의 종류에 따라 진단을 위한 다양한 검출 방법들이 보고되고 있다(Taylor CF, Taylor GR. Methods Mol. Med., 92:9, 2004). 하지만, 분석 샘플에 존재하는 돌연변이 암세포의 수는 정상세포대비 현저히 적기 때문에 이것의 검출은 매우 어려우며 고도의 검출 기술을 필요로 한다(Chung et al, Clin Endocrinol, 2006/ Trovisco et al, J Pathol., 2004).
유전자 변이 검사 방법으로는 전통적인 방법인 생어 시퀀싱(sanger sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 최근 개발된 리얼-타임 PCR(real-time PCR), 디지털 PCR(digital PCR) 등이 있다. 생어 시퀀싱(sanger sequencing)은 시약이 저렴하며 모든 시퀀싱을 보여줘 새로운 변이형을 찾는 것이 가능하다. 파이로시퀀싱(pyrosequencing)은 생어 시퀀싱(sanger sequencing)보다 민감도가 높고, 속도가 빠르며, 데이터 해석이 편하지만 모든 변이형을 확인할 수는 없다(Tan et al. World J Gastroenterol 2012). real-time PCR은 전문적인 배경 지식이 없어도 검사할 수 있고, 적은 인력으로 빠르게 진행할 수 있으며, 민감도와 재현성이 우수하고 문제 발생의 해결이 편리한 장점들이 보고되어 있다.
또한, 소량 함유된 돌연변이 검출을 위한 대표적 방법으로는 돌연변이 유전자를 선택적으로 증가시키기 위해 돌연변이에 특이적인 프라이머를 이용하는 대립형질 특이적(allele specific) PCR 방법(Rhodes et al., Diagn mol pathol., 6:49, 1997), 스콜피언 실시간 대립형질 특이적 PCR(scorpion Real-time allele specific PCR, DxS' scorpions and ARMS) 방법 (Mark et al., Journal of Thoracic Oncology, 4:1466, 2009), 대립형질 특이적(allele specific) 프라이머 기술과 MGB(minor groove binder)-프로브를 이용하여 야생형 유전자의 증폭을 억제하고 돌연변이 유전자만을 선택적으로 증폭 후, 택만(Taqman) 프로브를 이용하여 돌연변이가 일어난 위치를 포함하지 않고 증폭산물을 검출하는 CAST PCR 방법 (Didelot A et al., Exp Mol Pathol., 92:275, 2012), 임계적 변성온도(critical denaturation temperature, Tc)를 이용하여 돌연변이의 민감도를 증가시킬 수 있는 콜드-PCR(Cold-PCR) 방법(Zuo et al., Modern Pathol., 22:1023, 2009)등 실시간 PCR 기술에 기반을 둔 다양한 분석 방법이 소개되고 있으며, 이러한 방법들은 쉽고 빠르게 다양한 암 관련 유전자의 변이 진단 및 분석을 제공한다(Bernard et al., Clinical Chemistry, 48:1178, 2002).
피엔에이(Peptide nucleic acid, PNA)는 N-(2-아미노에틸)글리신 아미드를 기본 골격으로 하는 핵산 유사체이다(Nielsen PE et al., Science, 254(5037):1497, 1991). PNA 골격은 전기적으로 중성으로 상보적 염기서열을 갖는 표적 핵산에 대해서 DNA 프로브 보다 높은 특이성을 가진다. 또한 핵산분해효소(Nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 분해되지 않는 장점이 있어 프로브를 이용한 분자 진단 방법에 매우 유용하다(Egholm et al., Nature, 365:556, 1993; Nielsen et al., Bioconjugate Chem., 5:3, 1994; Demidov, et al., Biochem. Pharmacol., 48:1310, 1994). 이와 같은 PNA의 장점을 이용하여 1993년 PCR 클램핑(camping) 기술이 개발되었다 (Henrik Orum et al., Nucleic Acids Res., 21:5332, 1993). 이 기술은 PNA 프로브를 증폭을 원하지 않는 유전자와 결합시켜 PCR 증폭을 억제하는 기술로 야생형 유전자에 상보적인 피엔에이 프로브를 이용하면 PCR반응 중 야생형 유전자의 증폭을 선택적으로 억제하여 야생형에 비해 극소량 존재하는 돌연변이를 빠르고 정확하게 검출할 수 있다.
또한, 피엔에이 클램핑 기술을 응용한 다양한 기법들이 보고되어 있다. PNA-LNA clamp(미국 공개특허 제2013-0005589호; Yoshiaki Nagai et al. Cancer Res., 65(16):7276, 2005) 방법은 표적 부위에 대해서 야생형 유전자의 배열을 가지는 PNA 클램핑(clamping) 프로브와 변이 유전자의 배열을 가지는 검출용 LNA 택만(taqman) 프로브가 경쟁적으로 하이브리디제이션(hybridization)하도록 설계하여 선택적인 증폭 및 검출을 하는 방법이다. PNA 하이브 프로브(hyb probe)(PNA as both PCR clamp and sensor probe; 미국공개특허 제2008-0176226호)는 기존 로슈사의(roche) 하이브 프로브 시스템의 공여자(donor) 프로브대신 PNA 프로브를 사용하여 PNA 프로브를 통하여 클램핑과 검출을 동시에 하도록 설계된 방법이다. PNA 클램핑 & 인터컬레이터 검출(PNA Clamping & intercalator detection) 방법은(Makito Miyake et al., Biochem Biophys Res Commun., 2007)은 야생형 유전자를 PNA 프로브 이용해 클램핑하고 돌연변이형 유전자만 선택적으로 증폭 후 인터컬레이터(intercalator)를 이용하여 증폭산물을 검출하는 방법 등 다양한 기법들이 보고되어 있다.
암은 유전형의 돌연변이로 인해 발생되며, 비종양 세포에는 존재하지 않는 돌연변이가 대략 50-80개 존재한다([Joneset al., 2008]; [Parsons et al., 2008]; [Wood et al., 2007]). 이러한 돌연변이형을 검출하는 기법으로는 생검 샘플 분석 및 혈액과 같은 체액을 순환하는 돌연변이체 종양 DNA 분석 방법이 있다(Diehl et al., 2008). 하지만 생검 샘플 분석의 경우 침습성이며, 합병증 등의 유해성의 가능성이 있다. 또한, 생검 분석 방법은 제한 부위로부터 조직 샘플을 채취하는데, 종양이 이종성이거나, 정상 조직 내에 분산되어 있는 경우에 조직 샘플은 위 양성체 또는 위 음성체일 수 있다. 이러한 방법을 극복하기 위해서 비침습성이며 고감도의 진단 방법이 필요하다.
또한, 종양 조직은 세포마다 가지고 있는 돌연변이 종류가 다를 수 있고(Heterogeneity), 정상적인 세포가 섞여 있으므로, 정확한 돌연변이 검사를 위해서는 민감도가 높은 검사 방법의 사용과 현미경 검사를 통한 종양 부위 확인 절차 및 해당 부위에 대한 선택적인 DNA 추출 및 검사가 필수적이다.
또한, 혈액 등의 체액을 순환하는 돌연변이의 DNA 분석은 체액 중 돌연변이체 암 DNA의 복제수가 극도로 낮기 때문에 감도가 본래 불충분하다(Gormally et al., 2007). 이러한 단점을 극복하기 위해 높은 특이성 및 높은 민감도를 가진 종양 세포를 검출할 수 있는 진단 방법의 개발이 필요하다.
유전자의 다형을 검출하는 여러 가지 방법들이 보고되어 있으며, 예를 들면 PCR(Polymerase Chain Reaction)-RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)법 등을 들 수 있다. PCR-RFLP법은, 시료의 표적 DNA에 대하여, 검출 목적의 영역을 PCR로 증폭시켜, 그 증폭물을 제한 효소 처리하고, 다형에 의한 제한 단편 길이의 변화를, 서던하이브리다이제이션에 의해 타이핑하는 방법이다. 유전자에 목적의 변이가 존재하면, 제한 효소의 인식 부위가 소실하기 때문에, 절단의 유무, 즉, 제한 단편 길이의 변화에 의해, 변이의 유무를 검출할 수 있다. 그러나 PCR-RFLP법은, 예를 들면 PCR의 후, 얻어진 증폭물을 여러 가지 제한 효소로 처리 후 해석이 필요하며, 얻어진 증폭물의 제한 효소 처리과정은 1차로 수행된 증폭 산물을 이용하므로 결과의 오류가 발생할 수 있다.
최근에는 다형의 검출 방법으로서 Tm(Melting Temperature) 해석 방법이 제시되고 있다. Tm 해석을 통한 다형의 검출 방법은 검출 목적의 다형을 포함하는 영역에 상보적인 프로브를 사용하여, 핵산과 상보적인 검출 프로브와의 하이브리드(이중 가닥 핵산)을 형성시킨다. 그리고, 얻어진 하이브리드를 가열 처리하여, 온도 상승에 따른 하이브리드의 단일 가닥 핵산으로의 융해점을 흡광도 등의 시그널 측정으로 검출하여, Tm 값의 결과를 이용하여 다형을 판단하는 방법이다.
Tm 값은 하이브리드에 있어서의 양 단일 가닥 핵산의 상보성이 높을수록 높고, 상보성이 낮을수록 낮아진다. 따라서, 유전자와 상보적인 프로브와의 하이브리드에 대한 Tm 값(평가 기준치)을 산출하여, 검사하고자 하는 핵산과 프로브와의 Tm값(측정치)을 비교 후 검사하는 핵산의 검출 대상 부위가 목적의 유전자와 동일한 것인지 판별할 수 있다. 또한, 측정치가 검사 평가 기준치보다도 낮을 경우, 피검 핵산의 검출 대상 부위가 다른 형인 것으로 판별할 수 있다.
이러한 방법은 검출 프로브를 첨가한 PCR 반응 후 시그널 측정을 행하는 것만으로, 다형을 검출할 수 있다. Tm 해석을 이용한 검출 방법은 1 염기의 차이를 Tm 값으로 판단이 가능하여야 하며, 유전자가 복수의 다형을 갖는 경우 결과 해석이 용이해야 한다. 특히, 야생형의 다형과 복수의 변이형의 다형이 혼재하고 있는 경우 등이라도, 변이의 유무를 정확하게 검출할 것이 요청된다. 본 발명은 1 염기의 차이 또한 Tm 해석을 통해 검출이 가능하도록 프로브의 설계가 가능하다.
유전자의 다형의 검출은, 예를 들면 질환의 진단 및 치료법의 선택에 있어 중요하다. 따라서, 본 발명은, 질환 관련 유전자인 EGFR, KRAS, NRAS 유전자들에 대한 다형을, 간편하고 우수한 민감도로 판별 가능한, 다형 검출용 프로브 및 그 용도의 제공을 목적으로 한다.
유전자 변이 검사 방법으로는 전통적인 방법인 생어 시퀀싱(sanger sequencing), 파이로시퀀싱(pyrosequencing), 최근 개발된 리얼-타임 PCR(real-time PCR), 디지털 PCR(digital PCR) 등이 있다. 생어 시퀀싱(sanger sequencing)은 시약이 저렴하고 모든 시퀀싱을 보여줘 새로운 변이형을 찾는 것이 가능하다. 그러나 민감도가 낮고, 검사 시간이 길며 주관적인 해석이 가능하다는 단점이 있다. 생어 시퀀싱(sanger sequencing)과 리얼-타임 PCR(real-time PCR)의 중간 단계인 파이로시퀀싱(pyrosequencing)은 생어 시퀀싱보다 민감도가 높고, 속도가 빠르며, 데이터 해석이 편하지만 모든 변이형을 확인할 수는 없다. 또한, Real-time PCR과 비교 시에는 Real-time PCR보다는 특정한 변이형을 찾을 수 있고, 데이터 분석을 통해 새로운 유전자 변이도 확인할 수 있지만, 검사 소요 시간이 더 길고 민감도는 낮다 (Tan et al. World J Gastroenterol 2012 October 7; 18(37):5171-5190).
특히, 본 기술에 응용된 real-time PCR은 전문적인 배경 지식이 없어도 검사를 할 수 있고, 적은 인력으로 빠르게 진행할 수 있다. 또한 민감도와 재현성이 우수하고, 문제 발생 시 해결이 쉽다. 그러나, 변화된 시퀀싱(sequencing)을 대상으로 유전자를 발견하므로 모든 변이형을 찾을 수는 없다.
따라서, 본 발명은 높은 검출 민감도로 극소량의 돌연변이 유전형을 검출하는 방법을 제공하고, 이러한 방법을 질병의 전주기 모니터링, 질병의 예후, 예측, 질병의 치료방침 결정, 질병의 진단/조기진단, 질병의 예방, 질병의 치료제 개발 등에 이용하고자 한다.
표적핵산을 실시간으로 보다 민감하게 검출하기 위해, 클램핑 프로브(clamping probe)와 동시에 형광자 및 소광자가 포함된 형광 검출 프로브(detection probe)의 혼합체를 이용하여 원하는 유전자를 선택적으로 높은 민감도로 검출 가능함을 확인하였고, 인접한 돌연변이 검출이 용이함을 확인하였으며, 야생형 유전자와 표적핵산 유전자의 융해온도 차이를 확인하여 융해곡선(melting curve) 분석을 이용하여 동시에 다중 표적핵산의 검출을 통해 유전형 판별이 가능한 것을 확인하였다.
표적의 핵산을 보다 민감하게 검출하기 위해서, 본 발명은 표적핵산을 실시간으로 검출하기 위한 하나 이상의 검출 프로브(detection probe) 및 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe)를 포함하는 프로브 혼합체와 이를 이용한 동시 다중적 표적핵산 검출방법 및 상기 방법을 이용한 분자 진단 키트를 발명하였다.
본 발명의 프로브 혼합체는, 동일 가닥 상에서 경쟁적으로 혼성화되는 클램핑 프로브, 및 리포터(reporter)와 소광자(quenching)가 결합된 하나 이상의 검출 프로브를 이용한 동시 다중적 표적핵산 검출방법 및 그 용도를 제공한다.
본 발명의 프로브 혼합체 시스템을 이용하여, 분자진단, 산전진단, 조기진단, 암진단, 유전관련 진단, 유전 형질 진단, 감염균의 진단, 약제 내성균의 판별, 법의학, 생물체의 종 판별 등 다양한 분자진단 기술에 이용할 수 있다.
특히, 암 환자에게 적절한 진단 및 치료를 하기 위해서는 암종의 다양한 분자적 특성의 확인이 필요하다. 또한 기본의 방법보다 더욱 민감하고 특이성 높은 본 발명의 기술은, 정상 DNA 내에 포함된 미량의 유전자 발현, 점 돌연변이, 융합 유전자 등의 검출이 가능하여 암의 전반적인 유전적 기초를 이해하게 하고 진단 및 치료에 응용이 가능하게 한다.
일반적으로, 본 발명은 체액 내에 특히, 혈액에 함유되어 있는 EGFR, KRAS, NRAS 등의 돌연변이형을 민감하게 검출함으로써, 관련된 질환, 다른 의학적 병태, 및 치료 효능을 조기진단/진단, 모니터링 및 평가하는 것을 보조한다. 또한 질병과 관련된 돌연변이 검출 결과와 정상 대조군을 비교하여 돌연변이형과 질환과의 상관관계 또는 다른 의학적 병태(예를 들면, 암)를 확인하는 단계들을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명은 유전형 확인을 통한 치료방법 및 약물 반응성 예측 결정을 가능하게 한다.
본 발명에 따른 표적핵산 검출방법을 이용하면 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자 증폭의 억제가 가능하고, 극미량의 표적핵산 유전자의 선택적 증폭과 선택적 검출을 통해 시료 속에 포함된 단일염기변이 및 염기의 결손 또는 삽입에 의한 변이를 효과적으로 검출할 수 있으며, 다중의 검출 프로브와 다중의 증폭 억제 프로브를 사용하여 실시간 증폭곡선과 융해곡선의 동시 분석이 가능해 동시 다중적으로 표적핵산 검출 및 정량뿐 아니라 융해곡선분석을 통한 유전형 판별이 가능하다. 또한, 고민감도로 타겟 검출이 가능하므로 극소량의 타겟 검출이 필요한 조기진단에 매우 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 다형 검출용 프로브에 의하면, 예를 들면 EGFR, KRAS, NRAS 유전자에 포함된 미량의 돌연변이형을, Tm 해석에 의해, 간편하게 그리고, 우수한 신뢰성으로 판별할 수 있다. 구체적으로는, 예를 들면 시료 중에, 목적의 야생형인 유전자와 변이형인 유전자가 공존하고 있는 경우에도, 본 발명의 다형 검출용 프로브를 사용한 Tm 해석을 행함으로써 다형의 종류 또는 변이의 유무를, 간편하게 그리고, 우수한 신뢰성으로 검출할 수 있다. 이 때문에, 본 발명은, 다량의 야생형 유전자와 미량의 변이형의 유전자가 함유된 시료에 대하여, 특히 유용하다. 본 발명에 의하면, EGFR, KRAS, NRAS 유전자의 다형을, 간편하게 그리고, 우수한 신뢰성으로 판별할 수 있기 때문에, 예를 들면 검출 결과를, 상술한 바와 같은 질환의 진단 및 치료법의 선택 등에 반영할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 의료 분야 등에 있어서 극히 유용하다고 할 수 있다.
본 발명은 야생형 또는 원하지 않은 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브와 리포터(reporter) 및 소광자(quenching)가 결합된 검출 프로브를 이용하여 동시 다중적인 표적 핵산을 검출하는 방법 및 상기 검출 방법의 이용에 관한 것이다.
본 발명의 검출 프로브(detection probe)는 검출하고자 하는 표적 핵산 유전자를 선택적으로 검출할 수 있는 프로브이다. 클램핑 프로브(clamping probe)는 야생형 유전자 또는 원하지 않는 유전자와 상보적으로 결합하여 PCR 반응간 중합효소의 신장반응을 억제할 수 있는 프로브를 의미하고, 프로브 혼합체는 하나 이상의 검출 프로브 및 클램핑 프로브로 구성된 프로브 시스템을 의미한다.
본 발명의 표적 핵산은 검출하고자 하는 모든 종류의 핵산을 의미하며, 돌연변이 유전자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있다. 유전체 DNA(genomic DNA) 와 미토콘드리아 DNA(mitochondrial DNA), 바이러스 DNA(viral DNA)를 포함하는 모든 종류의 DNA 또는 mRNA, 리보솜 RNA(ribosomal RNA), 비-암호화 RNA(non-cording RNA), tRNA, 바이러스 RNA(viral RNA) 등을 포함하는 모든 종류의 RNA를 특징으로 할 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 혼성화, 어닐링(annealing) 또는 증폭 조건 하에서 프라이머 또는 프로브와 어닐링 또는 혼성화된다.
본 발명의 혼성화는 상보적인 단일가닥 핵산들이 이중-가닥 핵산을 형성하는 것을 의미한다. 혼성화는 2개 핵산의 염기서열간 상보성이 일치할 경우(perfect match) 일어나거나, 또는 일부가 일치하지 않는 (mismatch) 염기가 존재하여도 일어날 수 있다. 혼성화에 필요한 상보성의 반응의 진행정도는 온도와 같은 혼성화 조건에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 돌연변이는 야생형 유전자 염기서열에 변이가 발생한 것으로서, 단일염기다형성(SNP; single nucleotide polymorphism)뿐만 아니라, 염기의 치환, 결실 또는 삽입되어 변이가 일어난 것도 포함된다. 또한 자연에서 발생할 수 있는 체세포 돌연변이(somatic mutation)와 생식세포 돌연변이 (germ line mutation)가 포함되며, 인위적으로 염기서열의 변이를 유도한 인공 돌연변이 등도 제한 없이 포함된다.
본 발명의 체세포 변이는 신호 전달 과정의 탈조절 등에 의해 세포의 암화를 야기하는 주요 원인으로 알려져 있다. 의미있는 체세포 돌연변이(somatic mutation)로는 KRAS, BRAF, EGFR, JAK2, HER2, BCL-ABL, NRAS, HRAS, IDH1, IDH2, C-KIT, TP53, EGFR, PIK3CA등 각종 암 관련 유전자들을 예로 들 수 있다. 본 발명에서는 체세포 유전자 EGFR, KRAS, NRAS의 돌연변이의 경우에 대하여 본 발명이 작동함을 확인하고 그 응용 분야를 제시하였다.
본 발명에 있어서 검출 프로브 또는 클램핑 프로브는 표적핵산에 상보적으로 결합하는 모든 핵산 및 핵산 유사체로 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA(Locked nucleic acid)로 이루어진 군에서 각각 선택될 수 있다. PCR을 위한 중합효소에 일반적으로 뉴클레아제(nuclease) 활성이 있어 프로브의 손상이 생길 가능성도 있으므로 뉴클레아제에 안정한 PNA와 같은 합성핵산을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 검출 프로브는 목적 표적핵산 유전자를 선택적으로 검출시키는 역할을 하므로, 당업계에 알려진 핵산 검출을 위한 프로브의 사용이 가능하다.
본 발명의 일 실시예에서는 바람직하게 PNA 프로브를 사용하였으며, PNA 프로브는 인공합성 DNA로 타겟 DNA 또는 RNA와 특이적으로 결합이 가능하고, 뉴클레아제에 대해 안정하기 때문에 프로브를 기반으로 한 융해곡선 분석이 가능하다. 또한, PNA 프로브가 DNA와 결합 후 중합효소(polymerase)의 신장반응 진행을 억제하는 성질을 가지고 있으므로, 본 발명에서는 야생형 유전자와 완전한 혼성화를 이루도록 제조한 PNA 프로브는 클램핑 프로브로 사용하였으며, 동시 다중으로 표적핵산 검출을 위해 PNA 검출 프로브는 표적핵산 유전자와 완전한 혼성화를 이루도록 발명하였다.
또한 본 발명에 있어서, 클램핑 프로브 및 검출 프로브는 프로브의 N 말단, C 말단 또는 프로브(합성핵산) 골격의 알파, 베타, 감마, 링커(Linker) 위치에 천연 아미노산의 및 합성 아미노산의 곁사슬 등 특정 작용기를 결합시켜 입체구조적 변화를 줄 수 있으며, 상기 아미노산은 전하를 가지고 있지 않거나, 음전하 또는 양전하를 가지는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정된 것은 아니며, 당업계에 공지된 프로브 입체구조 변화 및 전하 부여 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 검출 프로브는 양 말단에 리포터(reporter)와 리포터 형광을 소광(quenching) 할 수 있는 소광자(quencher)가 결합 할 수 있으며, 인터컬레이팅(intercalating) 형광 물질을 포함할 수 있다. 리포터(reporter)는 특정 파장의 빛을 흡수, 방출하여 형광을 발하는 물질로서, 프로브에 표지하여 표적핵산과 프로브 사이의 혼성화가 이루어졌는지 확인할 수 있는 물질을 의미하여, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오로(Alexa Fluor), FAM, JOE, ROX, HEX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 시아닌(Cyanine) 계열 염료 및 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 염료로 구성되는 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 당업계에 알려진 형광을 발하는 물질의 사용이 가능하다.
또한, 소광자(quencher)는 리포터가 발생시킨 빛을 흡수하여 형광세기를 감소시키는 물질을 의미하며, 답실(Dabcyl), TAMRA, Eclipse, DDQ, QSY, 블랙베리 퀸처(Blackberry Quencher), 블랙홀 퀸처(Black Hole Quencher), Qxl, 아이오와 블랙(Iowa black) FQ, 아이오와 블랙 RQ, IRDye QC-1 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 소광자는 종류에 따라 형광세기를 감소하는 범위가 다르므로 이를 고려하여 사용할 수 있다.
본 발명의 프로브 혼합체를 이용한 동시 다중 표적핵산 검출방법은 야생형 유전자 혹은 원하지 않는 유전자와 상보적으로 결합하여 중합효소의 신장반응을 억제하는 하나 또는 하나 이상의 클램핑 프로브(clamping probe)를 이용하여 검출하고자 하는 표적핵산 유전자를 선택적으로 증폭시키고, 표적핵산을 특이적으로 검출하기 위한 하나 또는 하나 이상의 검출 프로브(detection probe)를 이용해 다중 표적핵산의 유무 또는 농도를 검출하는 것을 특징으로 하며, 프로브 혼합체를 이용한 표적핵산의 검출은 실시간 증폭곡선 및 융해곡선의 동시분석이 가능하다.
본 발명의 클램핑 프로브 및 검출 프로브는 동일가닥상에서 타겟 DNA와 혼성화하거나, 또는 클램핑 프로브 및 검출 프로브가 상보적인 가닥에 혼성화하여 야생형 유전자의 블로킹(blocking) 및 표적핵산 유전자의 검출을 동시에 진행하는 방법이다. 즉, 클램핑 프로브가 야생형 유전자와 완전한 혼성화(perfect match)를 이루면 야생형 유전자의 증폭을 억제시킬 수 있기 때문에, 극미량의 표적핵산 유전자의 선택적 증폭 및 검출이 가능하며, 또한, 하나 이상의 검출 프로브를 사용하여 동시 다중적으로 표적핵산 검출이 가능하다.
프로브 혼합체를 이용한 타겟 DNA의 증폭과정에 있어서, 어닐링(annealing) 단계에서는 클램핑 프로브와 검출 프로브가 동일가닥 또는 각각 서로 다른 상보적인 가닥에 어닐링하게 되고, 리포터와 소광자를 가지고 있는 검출 프로브는 검출하고자 하는 표적핵산 유전자에 특이적으로 결합하여 증폭곡선 신호(형광)를 나타내게 된다. 이후의 신장(extension) 단계에서 클램핑 프로브는 여전히 야생형 유전자 혹은 원하지 않는 유전자와 혼성화되어 있어 야생형 유전자 혹은 원하지 않는 유전자의 증폭을 억제하고, 검출 프로브는 표적핵산과의 신장단계의 온도보다 낮은 융해온도로 제작되었기 때문에 표적핵산과 분리되어 증폭이 진행된다.
이러한 증폭과정을 통해 실시간으로 증폭곡선을 분석할 수 있으며, 상기의 증폭과정을 통해 생성된 증폭산물을 이용하여 융해곡선 분석이 가능하다. 융해곡선 분석 단계에서 검출 프로브는 낮은 온도에서 표적핵산 유전자와 혼성화되어 형광신호를 나타내지만, 온도가 올라감에 따라 표적핵산과 분리되어 형광이 소광된다.
일반적으로, 복수의 표적핵산을 동시적으로 검출하기 위해 종래의 실시간 PCR을 이용한 증폭곡선 분석 방법은 시료 내 표적핵산을 검출함에 있어서 형광물질을 사용하기 때문에 두 가지 이상 표적핵산을 검출하기 위해서는 타겟 수만큼의 형광물질을 가진 프로브가 필요한 문제가 있어 다중 검출이 제한적이지만, 본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법은 프로브 혼합체를 이용하여 증폭곡선 및 융해곡선 분석을 동시에 수행할 수 있으므로, 하나의 형광물질을 이용하여 다중 타켓의 검출이 가능한 것을 특징으로 한다.
본 발명의 일 실시예에서는 융해온도 차이를 확인하기 위해, 음전하를 가지는 L-글루탐산 (L-glutamic acid) 또는 D-글루탐산 (D-glutamic acid), 전하를 가지고 있지 않은 L-알라닌(L-alanine) 또는 D-알라닌(D-alanine), 양전하를 가지는 L-라이신(L-lysine) 또는 D-라이신(D-lysine)의 곁사슬을 PNA의 감마 위치에 도입할 수 있으며, L-라이신(L-lysine), L-글루탐산 (L-glutamic acid)을 링커 위치에 도입한 PNA 프로브를 합성할 수 있다.
PNA 골격의 감마위치에 D-글루탐산 등을 결합시켜 구조적 변화(입체구조 및 전하변이)를 준 PNA 프로브는 구조적 변화가 없는 PNA 프로브와 비교하였을 때, 타겟 DNA와 단일염기 불일치 DNA의 융해온도 차가(ΔTm)가 크게 증가하며, 본 발명의 구조를 변형시킨 PNA 프로브는 단일 염기 서열 변이에 대한 특이도를 증가시켜 야생형 유전자와 표적핵산 유전자의 융해온도 차이를 현저하게 하기 때문에 실시간 증폭곡선의 비특이 결합에 대한 개선과 융해곡선 분석 시 나타날 수 있는 문제점을 감소시킬 수 있다.
일반적으로, 복수의 표적핵산을 동시적으로 검출하기 위해 종래의 실시간 PCR을 이용한 증폭곡선 분석 방법은 시료 내 표적핵산을 검출함에 있어서 형광물질을 사용하기 때문에 두 가지 이상 표적핵산을 검출하기 위해서는 타겟 수만큼의 형광물질을 가진 프로브가 필요한 문제가 있어 다중 검출이 제한적이지만, 본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법은 프로브 혼합체를 이용하여 증폭곡선 및 융해곡선 분석을 동시에 수행할 수 있으므로, 하나의 형광물질을 이용하여 다중 타켓의 검출이 가능한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 프로프 혼합체를 이용한 동시 다중적 검출방법은 증폭곡선 및 융해곡선의 동시 분석에 한정된 것이 아닌, 증폭곡선과 융해곡선을 별도로 분석하거나 순차적으로 분석할 수 있으며, 필요에 따라 증폭곡선 분석 또는 융해곡선 분석만 수행하여 표적핵산을 검출할 수 있다. 특히, 정량분석이 필요 없는 경우에는 증폭곡선 분석을 생략하고 융해곡선 분석만 수행하여도 표적핵산의 유무 또는 유전자형을 구별할 수 있다.
본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법은 구체적으로, (a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 클램핑 프로브 및 검출 프로브로 구성된 프로브 혼합체 및 프라이머를 혼합하여 혼성화시켜 실시간 증폭곡선을 얻는 단계; (b) 상기 증폭과정 이후 온도를 변화시키면서 증폭산물과 검출 프로브 간의 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 실시간 증폭곡선 및 융해곡선을 별도로 분석하거나 순차적 또는 동시에 분석하는 단계를 포함한다.
상기 (a) 단계의 클램핑 프로브 및 검출 프로브는 검출하고자 하는 표적핵산의 수에 따라 다양하게 조절이 가능하며, 상기 융해곡선을 얻는 단계에서 증폭 산물의 농도에 따른 융해온도 값의 편차를 감소시키기 위하여 융해 곡선을 얻는 단계 전에, 실시간 증폭곡선을 얻는 단계와는 별도로 5 사이클 이상의 PCR 사이클을 추가 할 수 있으며, 바람직하게 5 내지 20 사이클을 추가할 수 있다.
또한, 본 발명의 검출방법은 (a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 클램핑 프로브 및 검출 프로브로 구성된 프로브 혼합체 및 프라이머를 혼합하여 혼성화시켜 실시간 증폭곡선을 얻는 단계; (b) 상기 얻어지는 실시간 증폭곡선을 분석하는 단계를 포함하는 동시 다중적 표적핵산 검출방법을 이용하거나,
(a) 표적핵산이 포함되어 있는 검체 시료에 클램핑 프로브 및 검출 프로브로 구성된 프로브 혼합체 및 프라이머를 혼합하여 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계를 포함하는 동시 다중적 표적핵산 검출 방법을 이용할 수 있다.
본 발명에서 상기 증폭곡선 또는 융해곡선을 수득하는 단계는 실시간 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 수행하였으며, 증폭곡선의 분석은 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 분석하는 것을 특징으로 할 수 있다. 시료 내에 표적핵산이 존재하거나 시료에 포함된 표적핵산의 양이 많으면, threshold에 도달하는 cycle 수가 적어지게 되어 Ct 값이 적게 측정되므로 표적핵산의 유무를 확인할 수 있으며, 초기 표적핵산의 양도 측정할 수 있다.
또한, 융해곡선(melting curve) 분석은 일반적으로 실시간 PCR의 과정이 끝난 후에 마지막으로 진행되는 과정으로, 샘플의 온도를 적정 범위의 온도로 30 ~ 55℃ 정도로 떨어트린 후에 95℃까지 초당 0.5 내지 1℃씩 증가시키면서 형광의 시그널 크기를 측정하며, 온도가 올라감에 따라 검출 프로브와 표적핵산(검출 프로브와 상보적으로 결합 가능한 표적핵산의 한쪽 가닥)이 분리되면 형광이 소광되어 형광시그널이 갑자기 떨어지게 되므로, 멜팅 피크(melting peak)를 통해 표적핵산의 유무를 확인할 수 있다.
본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법은 10ng 이하의 핵산 샘플시료에 0.01%, 0.1% 내지 100% 비율로 포함된 표적핵산을 검출할 수 있는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서 '시료'는 다양한 시료를 포함하며, 바람직하게는, 본 발명의 방법을 이용하여 생물시료(biosample)를 분석한다. 식물, 동물, 인간, 균류, 박테리아 및 바이러스 기원의 생물시료가 분석될 수 있다. 포유류 또는 인간 기원의 시료를 분석하는 경우, 상기 시료는 특정 조직 또는 기관으로부터 유래될 수 있다. 조직의 대표적인 예로는 결합, 피부, 근육 또는 신경 조직이 포함된다. 기관의 대표적인 예로는, 눈, 뇌, 폐, 간, 비장, 골수, 흉선, 심장, 림프, 혈액, 뼈, 연골, 췌장, 신장, 담낭, 위, 소장, 고환, 난소, 자궁, 직장, 신경계, 선 및 내부 혈관이 포함된다. 분석되는 생물시료는 생물학적 근원으로부터 나온 어떠한 세포, 조직, 유체액(fluid), 또는 본 발명에 의하여 잘 분석될 수 있는 어떠한 다른 매질(medium)도 포함하며, 이는 인간, 동물, 인간 또는 동물의 소비를 위하여 제조된 음식으로부터 얻은 시료가 포함된다. 또한, 분석되는 생물시료는 체액 시료를 포함하며, 이는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물(예컨대, 뇌 분쇄물), 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물이 포함되나, 이에 한정하지는 않는다.
시료의 표적핵산은 DNA 또는 RNA이며, 상기 분자는 이중가닥 또는 단일가닥 형체일 수 있다. 초기물질로서 핵산이 이중가닥인 경우, 두 가닥을 단일 가닥으로, 또는 부분적인 단일-가닥 형태로 만드는 것이 바람직하며, 가닥들을 분리하는 것으로 알려진 방법들로 열, 알카리, 포름아미드, 우레아 및 글리콕살 처리, 효소적 방법(예, 헬리카아제 작용) 및 결합 단백질을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은 다른 관점에서, 본 발명의 동시 다중적 표적핵산의 검출방법을 이용하고, 클램핑 프로브 및 검출 프로브로 구성된 프로브 혼합체를 포함하는 표적핵산 동시 다중 검출용 키트 및 용도에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 본 발명의 검출 방법에 따라 높은 검출 민감도로 확인되는 극소량의 돌연변이 유전형을 통해 질환의 의학적 병태를 진단, 예후, 모니터링, 치료 효능의 평가, 핵산 및 단백질 전달연구를 보조하는 방법 등으로 사용 가능하다. 조직과 같은 침습적 검체 뿐만 아니라 비침습적 검체(혈액, 소변, 객담, 대변, 타액, 세포)를 이용하여, EGFR, KRAS, NRAS 등의 바이오마커 검출 및 바이오마커의 돌연변이의 존재를 평가하는 단계를 포함하고, 상기 바이오마커 및 돌연변이의 존재는 관련된 질병의 전주기 모니터링, 질병의 예후, 예측, 질병의 치료방침 결정, 질병의 진단/조기진단, 질병의 예방, 질병의 치료제 개발에 이용하기 위한 방법을 제공한다.
이와 관련하여, 본 발명은 다양한 유전자 검사를 한번에, 보다 빠르고 저렴하게 해낼 수 있는 장점으로, 특히 특정 암의 치료약제를 결정하는 유전자들의 변형만을 본 기술을 응용하여 탐지해낸다면, 현재 한 가지의 유전자를 검사하는 비용으로 해당 질환에 관련된 모든 유전자의 변형을 탐색하는 것이 가능하다. 이와 관련하여, 폐암환자는 EGFR, KRAS, HER2, MET, TP53, NRAS, PIK3CA 등 유전자의 변이와 함께 EML4-ALK, ROS1, KIF5B-RET 유전자 융합 여부를 검사하여야 하고, 직결장암은 KRAS, BRAF, TP53, NRAS, PIK3CA 등 유전자의 변이를 모두 검사하여야 환자에게 임상적인 도움을 줄 수 있다.
또한, 본 발명은 임상유전체 관련 기술로서, 개인별 유전자 정보에 근거한 맞춤의료를 신속히 가능하게 하여 치료비, 약물부작용에 따르는 손실, 신약개발 비용절감 등 매우 많은 분야에서 다양하게 활용될 것이다. 특히 본 발명은 특정 유전자 유형에 따른 약물 요법, 아시아인을 대상으로 한 다양한 임상 연구들의 진행을 토대로 더욱 적합한 치료제를 선택할 수 있는 기회를 제공할 것이다.
유전병이란 유전자 이상에 의해 생기는 질환으로 체세포 내에 존재하는 유전자 이상이 표현형으로 나타나며, 같은 유전자 이상이 생식세포(정자, 난자)에도 존재하기 때문에 그 표현형이 자손에게도 전달되는 질환을 통칭하는 것이다. 유전자 이상이 일어나는 원인들은 첫째, DNA가 복제될 때, 자연적으로 생기는 오류가 있으며, 둘째로는 여러 가지 화학물질 및 환경적 요인들에 의해서 일어날 수 있는 가능성이 있다. 최근 보고된 인간게놈프로젝트 연구 결과에 의하면 사람의 세포 내에는 30,000 - 40,000개의 유전자가 존재하며, 이런 결과에 따르면 인간 유전병의 종류는 무수히 많은 종류가 있을 것으로 추정할 수 있으며, 현재까지 밝혀진 유전병의 종류들 외에도 많은 종류의 유전병들이 존재하고 아직까지 연구되지 않은 유전병들이 훨씬 더 많다는 것을 예측할 수 있다.
본 발명에 우수한 검출 민감도를 통한 유전자 연구는 밝혀지지 않은 유전병의 종류를 예측할 수 있는 도구로서의 활용이 기대된다. 예를 들어 K-ras 유전자에 있어서, 코돈 12의 다형 및 코돈 13의 다형 중 적어도 한 쪽이, 변이형이면, 예를 들면 세툭시맙(cetuximab) 등의 항 EGFR 항체약에 대한 내성을 나타내고, 야생형이면, 내성을 나타내지 않는다고 판단할 수 있다.
다인성 유전자 질환은 그 발생이 환경에 의해 크게 좌우되며, 가계로 유전되는 확률 역시 개체와 해당 질병에 따라 매우 다른 문제가 되는 것이 유전자 다형성(genetic polymorphism)이다. 같은 유전자에서 사람마다 각기 다른 모습을 보이는 것이 유전자 다형성인데 그 종류로는 STR(short tandem repeat), SNP(single nucleotide polymorphism)등이 있다. STR은 2-5개의 짧은 염기 서열이 반복적으로 나타나는 것이며, SNP는 유전자에서 1.0kb마다 염기 서열이 하나 정도씩 다른 것을 의미한다. STR은 친자 감별에 사용되고, SNP은 개인 식별로부터 질병의 발병 가능성이나 예후 판단, 특정 약물에 대한 반응에 이르기까지 폭넓게 사용 및 연구되고 있다. 유전자다형성 중 집단 내에 1% 이내로 존재하는 것을 "돌연변이(mutation)"라고 부르는데 최근에는 암, 당뇨병, 알츠하이머 병 등 주요 질환에서 유전자 다형성 및 돌연변이에 대한 연구가 활발하며 이의 연구를 위하여 본 기술의 응용이 가능하다.
유전자의 변이형 검출을 진행하기 위하여, 검체에 포함된 암세포의 DNA를 추출과 다양한 기술을 통해 환자의 유전자를 해석하는 방법으로 진행된다. 유전자 변이형을 찾을 때 중요한 것은 검출 방법의 민감도(sensitivity)이다. 민감도는 전체 유전자 중에 몇 %의 변이형까지 검출할 수 있는가를 의미하며, 생어 시퀀싱(sanger sequencing)은 위음성(false engative)율이 10%, 파이로시퀀싱(pyrosequencing)은 약 5%이고, 최근 개발된 새로운 방법들은 위음성율이 1%, 0.1%일 정도로 민감도가 우수하다고 보고되어 있다(Nam et al. Korean J Pathol. 2014). 아울러, 검체의 질에 따라 유전자 분석 결과가 달라지므로, 정확한 유전자 검사를 위해서는 분자 검사 과정의 철저한 관리가 중요하다(19. Nam et al. Korean J Pathol. 2014)고 보고된 바 있다.
유전자의 진단적 검사(Diagnostic test)는 질병 증상이 있는 환자에서 의심되는 유전 질환을 확진하거나 감별진단을 위한 목적으로 여러 검사를 통해 수행한다. 또한 현재 증상은 없지만 유전질환의 가족력이 있는 사람에서 질환의 원인이 되는 돌연변이 유무를 알기 위한 검사를 수행하여 질병의 발병 가능성과 발병 위험도가 높아지는 질환의 예측이 가능하다. 이러한 유전형 검사는 질병의 예방, 조기 진단, 치료 및 관리에 도움을 주어 질환의 이환율과 사망률을 감소시킬 수 있다.
특히, 인체 내의 모든 세포는 유전적으로 동일하게 구성되어 있다는 전제하에 유전형 검사는 인체의 어떤 조직으로도 검사가 가능하지만, 가장 쉽게 혈액에서 DNA를 추출하여 사용하는 것을 목적으로 한다. 또한 유전체내의 변이 중 유전 질환과 관련된 변화를 검출하기 위하여 시료는 DNA, RNA, 염색체, 대사물질 등이 있을 수 있다. 유전자의 검사 방법은 유전자를 구성하는 DNA와 RNA를 직접 분석하는 방법 및 질병 유전자와 함께 유전되는 유전자형을 간접적으로 확인 및 대사산물을 분석하는 생화학적 검사(biochemical test)나 염색체검사(cytogenetic test)가 있다.
유전자형 검사는 검사하고자 하는 목적에 따라 다양한 방법에 의해 수행 될 수 있다. 특히, 유전형의 SNP 및 돌연변이화는 대립유전자에 특이적인 프로브와의 혼성화, 효소에 의한 돌연변이 검출, 미스매치된 이형접합체의 화학적 절단(문헌 [Cotton et al., 1988]), 미스매치된 염기의 리보뉴클레아제에 의한 절단(문헌 [Myers et al., 1985]), 질량 분광분석법(미국 특허 번호 제6,994,960호, 제7,074,563호, 및 제7,198,893호), 핵산 시퀀싱, 싱글 스트랜드 입체형태 다형성(SSCP) (문헌 [Orita et al., 1989]), 변성 구배 겔 전기영동(DGGE) (문헌 [Fischer and Lerman, 1979a]; [Fischer and Lerman, 1979b]), 온도 구배 겔 전기영동(TGGE) (문헌 [Fischer and Lerman, 1979a]; [Fischer and Lerman, 1979b]), 제한 단편 길이 다형성(RFLP) (문헌 [Kanand Dozy, 1978a]; [Kan and Dozy, 1978b]), 올리고뉴클레오티드 연결 분석법(OLA), 대립유전자-특이 PCR(ASPCR) (미국 특허 번호 제5,639,611호), 연결 연쇄 반응 (LCR) 및 그의 변형 방법(문헌 [Abravaya et al.,1995]; [Landegren et al., 1988]; [Nakazawa et al., 1994]), 유식세포 측정식 이형접합체 분석(WO/2006/113590) 및 그의 조합/변형에 의해 검출할 수 있다. 특히, 유전자 발현 수준은 유전자 발현 연속 분석 (SAGE) 기법에 의해 측정할 수 있다(문헌 [Velculescu et al., 1995]). 이러한 다양한 방법들의 적절한 분석 방법은 분석의 구체적인 목적, 환자의 상태/병력, 및 특정 암(들), 검출, 모니터링, 또는 치료하고자 하는 질환 또는 다른 의학적 병태에 따라 달라질 것이다.
본 발명의 측면은 대상체에서 질환 (예로서, 암) 진행을 모니터링하는 방법, 및 추가로 개체에서 질환 재발을 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 측면은 또한 각종 비-암 질환 및/또는 의학적 병태가 또한 유전적 관련성 및/또는 원인을 갖고 있으며, 그러한 질환 및/또는 의학적 병태 역시 본원에 기술된 방법에 의해 진단되고/거나 모니터링될 수 있다는 사실에 관한 것이다.
본원에 기술된 발명이 적용될 수 있는 질환 또는 다른 의학적 병태로 신장병증, 요붕증, 당뇨병 I형, 당뇨병 II형, 신장병 사구체신염, 세균성 또는 바이러스성 사구체신염, IgA 신장병증, 헤노호-쉐라인(Henoch-Schonlein) 자반증, 막증식성 사구체신염, 막성 신장병증, 쇼그렌 증후군, 신증후군 미세 변화병, 초점성 사구 체경화증 및 관련 질병, 급성 신부전증, 급성 세뇨관간질 신염, 신우신염, GU관 염증성 질환, 전자간증, 신장이식 거부, 나병, 역류 신장병증, 신장결석증, 유전성 신장병, 수질 낭성 질환, 수질 해면 질환, 다낭성신장병, 보통염색체 우성 다낭성 신장병, 보통염색체 열성 다낭성 신장병, 결절 경화증, 폰히펠-린다우병(von Hippel-Lindau disease), 가족성 박층-사구체 기저막 질병, 콜라겐 III 사구체병증, 피브로넥틴 사구체병증, 알포오트 증후군, 파브리 질환, 손발톱-슬개골 증후군, 선천성 비뇨성 기형, 모노클로날 감마 글로불린병증, 다발골수종, 아밀로이드증 및 관련 질병, 열병, 가족성 지중해열, HIV 감염-AIDS, 염증성 질환, 전신성 혈관염, 결절 다발동맥염, 베게너 육아종증, 다발동맥염, 괴사성 및 초승달 사구체신염, 다발성 근염-피부근염, 췌장염, 류마티스 관절염, 전신 홍반 루푸스, 통풍, 혈액 질병, 겸상적혈구병, 혈전 저혈소판증 자반증, 판코니 증후군, 이식, 급성 신장 손상, 과민성 대장 증후군, 용혈-요독 증후군, 급성 피질 괴사, 신장 혈전색전증, 외상 및 수술, 확산성 손상, 화상, 복부 및 혈관 수술, 마비 유도, 약물 사용 또는 약물 남용 부작용, 순환계 질환, 심근경색, 심부전증, 말초 혈관 질환, 고혈압, 관상동맥 심장 질환, 비-죽상경화 심혈관 질환, 죽상경화 심혈관 질환, 피부병, 일사병, 전신 경화증, 호흡기 질환, COPD, 폐쇄 수면 무호흡, 고산 저산소증 또는 내분비계 질환,말단거대증, 당뇨병, 또는 요붕증을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 모니터링되거나, 다르게는 프로파일링되는 암은 모든 종류의 암이 될 수 있다. 이는 제한없이, 상피 세포 암, 예로서, 폐암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 유방암, 뇌암, 결장암 및 전립선암을 포함한다. 위장관암, 두부경부 암, 비-소세포 폐암, 신경계암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 췌장암, 생식-요로암 및 담낭암, 흑색종, 및 백혈병 또한 포함한다. 추가로, 본 발명의 방법 및 조성물은 개체에서 비-악성 종양 (예로서 신경섬유종증, 수막종 및 슈반세포종)의 검출, 조기진단/진단 및 예후에도 동등하게 적용될 수 있다.
주어진 질환/의학적 병태 (예로서, 암의 임상적 유형 또는 하위유형)를 앓는 하나 이상의 대상체의 체액으로부터 얻은 핵산을 분석하고, 주어진 질환/의학적 병태를 앓지 않는 하나 이상의 대상체의 핵산과 비교하여 그 핵산 내용물 간의 차이를 확인할 수 있다. 상기 차이는 제한없이, 핵산 발현 수준, 선택적 스플라이스 변이체, 유전자 복제수 변이체 (CNV), 핵산 변형, 단일 뉴클레오티드 다형성 (SNP), 및 핵산의 돌연변이 (삽입, 결실 또는 단일 뉴클레오티드 변화)를 포함하는 임의의 유전적 이상일 수 있다. 일단 특정 핵산의 유전적 파라미터 상의 차이가 특정 질환에 대한 것으로 확인이 되고 나면, 임상적으로 및 통계학적으로 유의적인 수만큼 대상체를 포함하는 추가의 연구를 수행하여 특정 핵산의 유전적 이상과 질환 사이의 상관관계를 확립할 수 있다.
개인의 유전자, 단백질, 환경적인 정보를 종합하여 그 개인에 맞는 예방, 진단, 치료하는 의학의 발전을 위하는 다양한 기술의 개발이 필요하며, 예를 들어, 현재는 비소세포폐암환자에서 EGFR 돌연변이나 단일 유전자 변이를 Sanger DNA 염기서열분석이나 RT-PCR, FISH 등의 방법으로 확인하여 치료약제를 선택하고 있지만 앞으로는 환자의 전유전체나 엑솜(exome), 전사체(transcriptome)을 본 기술로 검사하여 개인별 맞춤치료에 도움을 주게 될 것이라는 보고가 있다.
질병이 유전자의 변이로 인해 일어난다면 문제가 되는 유전자를 바꾸어준다면 치료할 수도 있을 것이다. 예를 들어, 1990년 미국에서는 아데노신디아미네이즈(adenosine deaminase, ADA)라는 효소를 만드는 유전자의 결핍으로 심한 선천성 면역결핍증에 걸린 소녀로부터 T림프구를 추출한 후, ADA유전자를 이 림프구에 넣어 환자의 혈액 속에 다시 주입한 결과 면역기능을 회복시킬 수 있었다. 이와 같이 유전자를 이용해서 질병을 치료하는 것을 유전자치료(gene therapy)라고 한다.
유전자 치료에는 앞의 예와 같이 목표가 되는 세포를 추출해서 특정 유전자를 집어넣은 다음 다시 주입하는 체외(ex-vivo) 유전자 치료와 목표가 되는 조직에 특정 유전자를 바로 주입해서 치료 효과를 노리는 체내(in-vivo) 유전자 치료로 나눌 수 있다. 최근의 유전자 치료는 주로 암을 치료할 목적으로 시도되는 것이 대부분이다. 이는 암세포에 직접 암세포를 죽이는 항암유전자나 항암제에 민감하게 만드는 유전자를 주입하는 방법과 여러 사이토킨(cytokin)을 분비하는 유전자를 백혈구에 넣어 암세포에 침투하게 하거나 암세포 자체가 사이토킨을 분비하게 하여 면역 반응을 촉발하게 하는 방법으로 나눌 수 있다. 암이나 후천성면역결핍증(AIDS), 그리고 단일유전자질환 등이 현재 유전자치료의 주된 목표이다. 이러한 유전자치료를 위한 유전형의 확인방법에 다양한 정보 제공이 가능하다. 또한 특정 인구집단이나 인종의 유전자 다형성과 차이에 대한 연구들도 활발하게 이루어지고 있으며, 이에 본 기술의 활용이 가능하리라 본다.
또한, 암의 경우 해당 유전자가 특정 발암물질에 더 취약하게 하는 것인지, 파괴된 유전자를 복구하는 기능을 떨어뜨리는 것인지, 암 예방에 관여하는 면역기능을 취약하게 하는 것인지, 이 모든 것을 복합적으로 가능하게 하는 것인지 등에 대해 알기가 매우 어렵다. 그러므로 하나의 유전자가 여러 질환에 동시에 관여하기도 하며, 여러 유전자가 하나의 질환과 관련이 있기도 하다. 또 다인성 유전질환의 경우 그 유전자가 있다고 해서 반드시 질병이 발생하는 것도 아니다. 예컨대 가장 잘 알려진 암 유전자는 유방암과 관련이 있는 BRCA1 돌연변이 유전자인데 이 유전자가 있는 여성은 65세까지 60%가 유방암에 걸릴 수 있다. 반면 일반 여성은 12% 정도가 이 암에 걸린다. 이는 유방암이 매우 흔한 서구의 예이며 우리나라는 식생활 등 환경의 차이가 있어 꼭 그렇지만은 않다. 그러나 이 유전자는 전체 유방암 중 3%밖에 설명하지 않으며 이 외에도 알려져 있지 않은 인자가 너무나 많다. 그리고 이 유전자의 보인자 60%가 유방암에 걸린다는 것이 보인자라면 반드시 이 병에 걸린다는 것도 아니다. 하지만 이 유전자는 유방암 진단과 치료에 있어 상당히 의미가 있는 것임에는 틀림없다. 다른 질병들에 있어서 이렇게 높은 상관관계가 나타나는 유전자들은 많지 않으며, 보다 높은 민감도를 가진 본 발명의 기술 및 방법은 질병의 상관관계가 높은 유전자 발굴이 가능하게 할 것으로 보인다. 또한 유전자 다형성에 따른 약물 반응의 차이에 대한 연구를 통하여 맞춤 의학에 다양한 정보를 제공할 것이다.
암은 유전체 질환이고, 유전적인 성향에 환경적인 자극이 더해져 여러 유전자 변이에 의하여 암세포가 발생하고 이것이 증식하고 변이를 거듭하게 된다. 최근 중요한 개념으로 종양유전자 중독(oncogenic addiction)과 합성치사(synthetic lethality)가 있다. 종양유전자 중독이란 다양한 유전학적 이상 중에서 하나 혹은 두 개의 유전자 이상에 의한 비정상적인 신호전달경로의 지속적인 활성화가 암의 발생과 증식 및 유지에 핵심적인 역할을 담당하여 이러한 유전자를 불활성화시킴으로 암을 치료할 수 있다는 이론이다. 합성치사(synthetic lethality)는 각각의 유전자를 억제하였을 때는 암세포를 사멸시킬 수 없으나 두 유전자를 동시에 억제 시에는 암세포를 파괴할 수 있다는 개념이다. 이렇듯 핵심이 되는 유전자를 찾고 유전자의 상호작용을 이해하면 더 나은 치료 효과를 거둘 수 있을 것이며 본 기술을 이용한 다양한 정보의 활용이 가능하다.
특히 암의 샘플은 다른 질환의 샘플과는 달리 게놈 유전체와 원발암 부위와 전이암 부위 등 다양한 부위의 체세포 암유전체 정보가 있어 여러 임상적 활용이 가능하다. 이에, 본 발명을 이용한 샘플 유전형의 단기 염기서열 다형성(SNP)과 염색체수 변이(CNV) 분석을 통해 개개인의 암 발생 위험도 평가 및 조기 진단에 활용될 수 있다.
암 특이 체세포 DNA 변이는 특정 유전자의 돌연변이, 증폭, 결손, 융합, 메틸화 등이 있으며 이들 분석 결과는 암 발생 위험도 평가뿐 아니라, 각 환자의 진단과 치료에도 활용된다. DNA 변이뿐 아니라 RNA 및 단백질의 발현 정도, 개체 면역반응 또는 사이토카인의 분비 정도가 개개인 환자의 암 발생 위험도 평가 및 각 환자의 진단과 치료에도 활용될 수 있다.
현재 가장 각광을 받고 있는 암유전체 정보는 각각의 암 조직 또는 혈액에서 검출되는 암유전자의 돌연변이다. 핵심 돌연변이(Driver mutation)는 대부분 암유전자로써, 해당 환자의 암 발생 및 진행, 치료제에 대한, 반응을 결정하는 가장 주된 유전자 변화이다. 이러한 유전자의 변화를 보다 민감하게 검출함에 따라 암의 맞춤의료에 있어 각각의 암 조직 또는 혈액에서 전이 유전자 변화를 확인하여 적절한 치료법을 찾아내는 도구로서 활용될 수 있다. 특히 해당 환자의 특정 유전자 변화 경로 분석과 hot spot 만이 아닌 rare point 변이까지 민감하게 검출할 수 있는 방법으로 사용함에 따라 암 유전체의 빅데이터로서의 활용될 수 있다.
이와 관련하여, 폐선암에 있어서 약 10개의 핵심 돌연변이가 알려져 있으며, 이들 변형을 타겟팅하는 몇몇 약물이 보고되고 있다. 예컨대, 상피성장인자(EGFR) 타이로신 카이네이즈 억제제인 제피티닙(gefitinib)은 반응 응답률이 약 70%정도이며, EGFR-활성화 변이를 갖는 환자가 10개월 동안 종양 진행 없이 생존할 수 있다. 이와 같은 연구를 바탕으로 폐선암의 치료 전략은 조직 기반 접근에서 핵심 돌연변이 관련 치료법으로 옮겨가고 있다. 몇몇 핵심 돌연변이의 발생 빈도는 민족간 차이가 있으며, 따라서 폐암의 새로운 신약 타겟(druggable targets) 및 표적 치료를 개발하기 위하여 광범위한 유전적 연구가 필요한 것으로 나타났다.
핵심 돌연변이(driver mutations)라 불리는 유전적 변형을 갖는 암세포들은 이러한 변형을 갖지 않는 세포들과 비교하여 생존 및 성장에 있어서 이점을 갖는다. 핵심 돌연변이는 카이네이즈와 같은 신호화 단백질을 암호화하는 유전자에 발생하며, 이는 종양 발생을 개시하고 유지하는 구성적으로 활성이 있는 생존 신호를 발생시킬 수 있다.
암은 유전학적으로 매우 다양하고 역동적으로 변화하여, 치료에 내성이 생기거나 진행, 전이 되었을 때는 진단 당시에 중요한 역할을 담당하던 핵심 돌연변이(driver mutation)와 다른 새로운 돌연변이가 발생하거나 진단 당시 중요하지 않았던 변이(passenger mutation)가 주된 역할을 담당하기도 한다. 최근, 단계적인 자극과 돌연변이로 인해 암이 발생한다는 다단계 모형(multi-step model)과 달리, 한번에 다발성으로 수많은 변이가 발생하는 위기 모델(crisis model, chromothripsis)의 개념이 소개되면서, 종양의 진화와 비균질성은 앞으로 해결해야 할 가장 어렵고 중요한 과제로 본 기술을 이용하여 다양한 돌연변이를 민감하게 검출함으로써 다양한 정보의 확인이 가능할 것이다.
또한, 현재 유전자 검사 및 활용에 제한점인 개개인에 따른 유전자 발현의 차이, 암조직에는 원발암과 전이 부위의 암조직들이 다양한 유전자 변화, 환자의 체내에서 지속적인 진화로 인한 변화 등의 모니터링으로 활용될 수 있다. 특히 암환자로부터 조직을 얻는 과정은 환자에게 많은 부담을 초래하는 쉽지 않은 과정인 반면, 본 발명은 소량의 조직을 활용하거나 채취가 쉬운 혈액으로부터의 암 특이 유전자 검출 방법을 가능하게 하여 다양한 임상적 입증을 통해 다양한 데이터로 활용될 수 있다.
폐암의 예방, 조기진단/진단, 예후 및 치료방법 결정에 이용
폐암은 흔하게 발병하는 암으로서, 전 세계적으로 암 관련 사망의 주 원인으로 알려져 있다. 저선량 컴퓨터 단층촬영 스크리닝 기법이 도입되면서 초기 진단 비율이 높아지고 있지만, 폐암은 여전히 예후가 매우 좋지 않은 치명적인 질병이다.
폐암 환자에게 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR) 유전자의 활성화 돌연변이가 있으면, EGFR 차단 티로신 키아나제 억제제(이레사, 타세바 등)가 치료에 효과적이다. 기존의 EGFR 활성 돌연변이 검사법은 직접 염기서열 분석(direct sequencing) 방법이 표준법이며, 좀 더 예민한 PNA clamp 방법이 사용될 수 있다. 또한 차세대 염기서열 분석법을 활용한 아이온 토렌트(Ion Torrent) 분석 결과 기존의 PNA clamp 방법과 동일한 예민도와 함께 각 환자 조직 DNA에서 변이빈도도 측정이 가능하여 좀 더 정확한 정보를 얻을 수 있다. 또한 예민한 방법에서 변이가 검출된 환자의 EGFR 차단 티로신 키나아제 억제제 치료 효과는 직접 염기서열 분석(direct sequencing) 방법으로 변이가 검출된 환자 그룹보다 임상적 유용성이 더 높아 유전형을 정확하고 민감하게 검출하는 것이 중요하다는 보고가 있다.
폐암환자의 경우 EGFR 돌연변이체가 적어도 하나 존재한다는 것은 환자가 EGFR-표적화 화합물인 제피티닙 또는 엘로티닙을 사용한 치료법으로부터 이익을 얻을 수 있다는 것을 나타낸다. EGFR의 이상 활성화 또는 과발현은 여러 유형의 암에서 보고되었다. 지금도 폐암의 발생에 핵심 역할을 하는 표적을 찾고 유전적 다양성을 이해하려고 하는 많은 연구들이 이루어지고 있으며, 본 발명을 활용한 유전적 다양성 이해 연구가 가능하다.
폐암에서 활성화되는 종양유전자에는 EGFR, ALK, RAS, ROS1, MET, RET 등이 있고, 이러한 핵심 종양유전자를 표적으로 하는 치료제가 암세포를 선택적으로 제거할 수 있다. 상피세포 성장인자 수용체(epidermal growth factor receptor, EGFR)은 ErbB 티로신키나아제 수용체군(tyrosine kinase receptors family; EGFR, HER-2, ErbB-3,ErbB-4)중의 하나로, 세포외 리간드 결합 영역(extracelluar ligand-binding domain)과 티로신키나아제영역(tyrosine kinase domain)을 포함한 세포내 영역(intra-cellar domain)을 가지고 있는 막경유 티로신키나아제(transmembrane tyrosine kinase)이다. 호모다이머(Homodimer) 또는 헤테로다이머(heterodimer)를 이룬 수용체에 리간드가 결합하면 세포 내의 티로신키나아제가 활성화되고, 이렇게 EGFR에 의해 자극된 신호는 포스파티딜이노시톨 3-키나아제(phosphatidylinositol 3-kinase, PI3K)/AKT/mTOR, RAS/RAF/MAPK, JAK/STAT 신호전달경로를 활성화한다. 제피티닙(gefitinib)과 엘로티닙(erlotinib)은 EGFR 티로신키나아제 활성을 억제하는 대표적인 약제이다.
EGFR 키나제영역의 돌연변이가 EGFR TKI 의 효과를 예측할 수 있는 인자라는 것이 밝혀졌고, 이러한 돌연변이는 주로 조직학적으로 선암, 여성, 비흡연자, 동양인에서 발현된다. 여러 임상시험의 결과를 바탕으로 현재 비소세포폐암 4기 선암으로 진단된 환자는 EGFR 돌연변이 검사를 시행하여 돌연변이 존재 시 초치료로 EGFR TKI를 투여한다.
또한, RAS 원종양 유전자(proto-oncogene)는 KRAS, NRAS, HRAS 등이 있고 세포증식, 분화와 생존을 조절하는 역할을 담당한다. RAS 단백질은 비활성화 상태에서는 구아노신이인산 (guanosine diphosphate, GDP)과 결합되어 있고, GDP가 구아노신삼인산(guanosine triphosphate, GTP)로 치환되면 활성화되어 RAS/RAF/MEK/MAPK와 PI3K/AKT/mTOR 신호전달체계를 활성화 시킨다. 폐암에서 RAS/RAF/MEK/MAPK 신호전달체계의 활성화는 약 20%에서 나타나며, 주로 KRAS 돌연변이에 의한 것으로 HRAS나 NRAS의 돌연변이는 드물다. KRAS가 폐암의 발생에 중요한 역할을 담당하기 때문에 이를 표적으로 하는 많은 연구들이 있었으나, RAS 단백질의 번역 후 과정(post translational processing)을 억제하는 파네실트란스퍼라제(farnesyltransferase) 억제제와 RAS에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드(antisense oligonucle-otide)를 이용한 연구는 성공하지 못하였다고 보고되어 있다. 또한 KRAS 돌연변이를 가질 경우 EGFR 아래단계의 신호전달체계를 지속적으로 활성화하여 EGFR TKI에 저항성을 나타낸다는 보고가 있어 이를 확인하기 위한 본 발명의 활용이 가능하다.
한편, 비소세포폐암의 발생과 진행에 중요한 영향을 미치는 분자생물학적 기전이 밝혀지면서, 다양한 진단 방법과 표적 치료제들이 개발되어 비소세포 폐암환자의 생존율이 증가하였다. 특히 EGFR 돌연변이가 있는 선암 환자에게 EGFR 티로신키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI)를 투여하면 기존의 항암제에 비하여 반응률과 무진행 생존기간이 월등히 증가한다. 특히 크리조티닙(crizotinib)은 반응을 예측할 수 있는 정확한 생물학적 표지자(biomarker)를 이용한 환자 선택을 통하여, 약물 승인에 소요되는 시간과 비용을 엄청나게 감소시켜 주목을 받았으나 많은 연구에도 불구하고 비소세포폐암은 나쁜 예후를 보이고 예방과 진단, 치료에서 해결해야 할 많은 문제들을 가지고 있다. 그 원인 중의 하나가 폐암의 유전적 비균질성(heterogeneity)을 들 수 있다.
본 발명을 통한 EGFR, KRAS, NRAS 돌연변이형 검사 결과는 폐암 약제 감수성 검사를 수행하여, 비소세포성 폐암 치료에 유용한 티로신키나아제 억제제(tyrosine kinase inhibitor, TKI)인 제피티닙(Gefitinib, Iressa)과 엘로티닙(Erlotinib, Tarceva) 처방에 대한 예후를 예측함으로써, 환자의 치료 방침 결정에 결정적 정보를 제공할 수 있다. 특히, EGFR 돌연변이는 제피티닙(Gefitinib, Iressa)과 엘로티닙(Erlotinib, Tarceva) 같은 EGFR-TKI에 대한 반응을 정확하게 예측할 수 있는 표지자로서, EGFR 돌연변이 양성 비소세포성폐암 환자의 1차 항암 약제로서의 사용이 권장되고 있다.
또한, KRAS 돌연변이는 TKI 약물에 반응하지 않는 약물 저항성의 강력한 예측인자로 작용하며, KRAS 돌연변이는 주로 엑손(exon) 2번의 코돈 12와 13에서 발견된다. KRAS 돌연변이는 비소세포성 폐암의 15~30%에서 발견되고, 주로 흡연력이 있는 환자에서 관찰되며 EGFR 돌연변이와는 상호 배타적으로 발견된다.
한편, 폐암의 표적 치료제는 1990년대 개발된 세포독성 항암제인 비노렐빈(vinorelbine), 젬시타빈(gemcitabine), 탁산(taxanes) 등과 백금(platinum) 제제와의 병용 화학요법으로 비소세포폐암 환자의 치료 효과가 개선이 되었으나 전통적인 세포독성 항암제 치료로서는 진행성 및 전이성 비소세포폐암 환자의 치료에는 효과가 크지 않았다. 이후, 폐암의 병태생리에 대한 분자생물학적 연구들로 제피티닙(gefitinib)과 엘로티닙(erlotinib)은 소분자(small molecule) EGFR-TKI에 속하는 표적 치료제로서 단일요법제의 2차 혹은 3차 치료제로 사용되고 있다. 또한, 최근에는 베바시주맙(bevacizumab)이라는 혈관 신생 억제제가 진행성 비소세포폐암 환자의 1차 초기치료에 있어서 파클리탁셀/카보플라틴(paclitaxel/carboplatin) 혹은 젬시타빈/카보플라틴(gemcitabine/carboplatin) 등 기존의 화학요법제와의 3제 병합요법이 생존 기간의 향상에 의미가 있는 것이 확인되고 있다.
상기 제피티닙(Gefitinib, Iressa)은 치료경력이 있는 진행성 비소세포폐암 환자를 대상으로 2상 연구에서 9~19%의 치료 반응률 그리고 40% 이상의 환자에서 증상의 호전이 있었으나 뒤이어 시행된 대규모 무작위, 위약대조 3상 연구에서 기존의 파클리탁셀/카보플라틴(paclitaxel/carboplatin) 세포독성 항암요법에 제피티닙 추가가 치료반응률, 진행 시간(time to progression, TTP) 및 생존율 향상에 유의한 차이를 보여주지 못하였다. 또한 최근에 발표된 4상 연구 ISEL(Iressa Survival evaluation in Lung Cancer) 자료에 따르면 제피티닙 사용군이 위약 대조군과 생존율의 유의한 차이가 없는 결과를 나타내었다. 다만 소집단 분석에서 비흡연자와 동양인에서는 생존율의 차이를 보여 주었다. 현재 EGFR 돌연변이가 있거나 여성, 선암, 비흡연자 등 세가지 조건 중 두가지 이상을 만족하는 경우 2차 항암요법제로 사용하며, 3차 항암요법제로서는 1, 2차 항암치료에서 탁센(taxanes) 제제와 백금(platinum)을 사용한 경우에 사용되고 있다.
또한, 엘로티닙(Tarceva)은 치료경력이 있는 비소세포폐암 환자를 대상으로 2상 연구에서 13%의 반응률과 51%의 질병 조절률로 제피티닙과 유사한 결과를 보였으며, 면역조직화학(immunohistochemistry) 방법으로 EGFR 과발현 환자를 대상으로 하였다. 그러나 1차 요법으로 젬시타빈/시스플라틴(gemcitabine/cisplatin, TALENT) 및 카보플라틴/파클리탁셀(carboplatin/paclitaxel, TRIBUTE)에 엘로티닙(erlotinib)을 추가하여 효과를 관찰한 대규모 3상 연구에서 반응률 및 생존기간에 유의한 개선 효과를 보여주지 못하였다. 그러나 엘로티닙(erlotinib)은 2차 요법제로서 위약대조, 2:1 무작위 3상 연구인 BR.21의 결과에서 무진행 생존기간 2.2:1.8개월, 전체 생존기간 6.7:4.7개월의 유의한 차이를 보여 비소세포폐암에서 생존자료 향상을 증명 한 최초의 목표치료제로 보고되었다.
최근에는 EGFR 돌연변이 없는 폐암 환자에서는 기존 항암제가 표적치료제보다 효과적이라는 연구 결과가 발표된 바 있다. 국내 폐암환자 중 60% 정도를 차지하는 EGFR 돌연변이 음성 폐암환자의 치료에 있어서는 기존 세포독성 항암제가 EGFR 표적항암제인 '이레사(Iressa)' 나 '타세바(Tarceva)' 보다 효과적인 것으로 나타났다. EGFR 표적항암제와 기존 항암제 치료를 비교한 임상시험과 환자의 치료결과를 메타분석한 결과에서 표적항암제의 효능에 논란이 있어 온 EGFR 돌연변이 음성 환자군에서 최선의 치료 약제가 무엇인지 규명하기 위한 연구 수행 결과, EGFR 돌연변이 음성 환자는 기존 세포독성 항암제로 치료한 경우가 EGFR 표적항암제로 치료한 것 보다 암의 진행속도가 느리고(중앙 무진행 생존기간 6.4 개월 vs 4.5 개월), 종양크기도 더 많이 감소하였다(반응율 16.8% vs 7.2%). 이러한 결과는 이들 항암제가 1차 치료제로 사용되는 경우와 2차 치료제로 사용되는 경우 모두 관찰되었다. 따라서 향후 EGFR 돌연변이 음성환자에서는 EGFR 억제제보다 기존 항암제를 우선적으로 사용하는 것이 추천되는 등의 약물 반응성 검사에 돌연변이 검사의 결과가 중요하다.
대장암의 예방, 조기진단/진단, 예후 및 치료방법 결정에 이용
한편, 현재까지 확인된 대장암의 발생 원인은 유전적(genetic), 후성적(epigenetic)변화가 축적되면서 세포의 형질 전환이 일어나고 형질 전환된 세포의 증식을 통해 종양이 발생하는 것으로 보고되어 있다. 대장암은 종양의 발생에 관여하는 유전학적 기전이 많이 알려져 있는 종양 중 하나로 최근 이러한 유전학적 이상을 실제 임상에 적용하여 환자의 치료에 이용하고 있다. 이러한 암의 기전의 연구에 본 발명이 유의할 수 있다.
암유전자(oncogene)인 RAS는 HRAS, KRAS, NRAS의 세가지 형태로 존재하며, 분자적 스위치의 역할을 하는 구아노신 삼인산 가수분해효소(Guanosine triphosphate hydrolase, GTPase)를 만든다. RAS는 세포 바깥의 성장 신호를 핵 내로 전달하는 역할을 하는데 RAS 가 활성화되면 Raf/MAPK, PI3K/Akt, Mekk/JNK 등 다양한 경로를 통하여 세포를 변형(transformation)시키게 되고, p53 이나 TGF-β 경로와 같은 종양 억제 경로를 억제하는 역할을 한다. RAS 중 대장암에서 가장 흔하게 돌연변이를 일으키는 것은 KRAS로 코돈 12, 13, 61에 집중적으로 발생하며 GAP-매개 GTP 가수분해(GAP-mediated GTP hydrolysis)에 저항성을 가지게 되어 지속적으로 활성화된 상태를 유지하게 된다.
대장암의 진단을 위한 대변잠혈검사(fecal occult blood test)는 수십년간 비침습적인 대장암 선별검사로 사용되었으며 여러 가지 연구에서 대장암 사망률을 줄일 수 있는 것으로 알려져 있다(Mandel JS, N Engl J Med , 1993/ Kronborg O, Lancet 1996). 그러나 대장암, 특히 대장암의 전구 병변을 선별하는 데에는 민감도가 떨어진다는 문제점이 있다. 이러한 문제점을 해결하기 위해 대변 DNA 검사를 수행하는데, 대장암에서 발생하는 돌연변이나 촉진자 과메틸화를 대변에서 검출하는 방법이다. 2004년, APC, KRAS, P53 등의 돌연변이와 BAT-26, long DNA 등을 포함한 21개의 표지자를 대변에서 측정하는 방법을 이용하여 대변잠혈검사에 비하여 대장암에 대한 민감도가 우수함이 보고되었고(52% vs. 13%), 2008년에는 KRAS, APC 유전자의 돌연변이와 비멘틴(vimentin) 유전자의 촉진자 과메틸화 등 세 가지 표지자를 이용한 연구에서 진행성 선종 발견율이 46%로 대변잠혈검사의 10~17%보다 우수함이 보고되었다(Imperiale TF N Engl J Med, 2004). 이러한 대변 DNA 검사는 조기대장암에 대하여 46~77%의 민감도를 가지고 있는 것으로 알려져 있어 대변잠혈검사보다 우수하며 최근 대장암 선별검사법으로 추가되었다. 이외에도 혈액이나 소변에서 대장암과 관련된 DNA, RNA, 단백질 등을 찾아 선별 검사에 이용하려는 연구들이 진행되고 있으며, 이에 본 발명 기술을 이용한 선별검사 후보를 찾거나 특정 돌연변이의 영향력 등의 확인이 용이할 수 있다.
또한 발암기전에 있어 유전체 불안정과 후성적 변화가 중요한 역할을 하고 있음을 규명하며 암 발생에 관여되는 여러 가지 신호전달 체계를 밝혀냄으로써 대장암에서 발견되는 유전적, 후성적 변화를 이용한 새로운 조기 진단 방법이 개발되고 있으며, 새로운 약제 개발과 함께 대장암의 예후와 치료 반응에 대한 예측인자로서 활용되면서 개인 맞춤형 치료의 발전에 기여할 수 있다.
결장암의 예방, 조기진단/진단, 예후 및 치료방법 결정에 이용
전이성 결장암(mCRC)은 서방의 사망원인 2위인 암으로서, EGFR에 대항하는 단일 클론 항체(moAb), 예를 들어, 세툭시맙 및 파니투무맙(panitumumab)에 기반한 치료는 mCRC를 갖는 환자에게 현저한 생존 혜택을 제공하고 현재 이들 환자에 대한 치료 요법의 표준 성분이다. 즉, 단독으로 또는 다른 항종양성 약물(들)과 조합해서, 이들 moAb 중 하나, 세툭시맙(얼비툭스, Erbitux)은 백금 기반 화학요법과 조합해서, 두경부암으로도 명명된, 두경부의 편평상피암을 갖는 환자의 치료를 위해 역시 처방된다.
moAb는 암 세포 상에 발현된 외부 항원에 결합한다. 일단 결합되면, 암 세포는 환자의 면역 시스템에 의해 파괴된 것으로 표시된다. 암 세포를 표적으로 하는 것에 더해서, moAb는 종양 성장에 필요한 다른 세포 유형 및 분자 상에 작용하도록 설계될 수 있다. moAb는 악성 종양 세포를 파괴하고 특정 세포 수용체를 차단하는 것에 의해 종양 성장을 방지하도록 사용될 수 있다. 치료적 moAb 세툭시맙 및 파니투무맙은 EGFR에 결합하고 EGFR에 의해 유도되는 세포내 신호경로(즉, RAS-RAF-MEK-ERK 캐스케이드 및 PI3K-akt 경로)의 활성화를 방지한다. 불행히도, mCRC를 갖는 모든 환자가 moAb를 포함하는 치료 요법에 반응하는 것은 아니다. 이렇게 반응하지 않는 기전은 충분히 알려지지 않고 있다.
KRAS (Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) 단백질을 암호화하는 KRAS 유전자는 인간으로부터 유래하는 것일 수 있고 인간의 염색체 12(p12.1)에 위치하며, KRAS 단백질은 이로부터 암호화되는 단백질이다. KRAS 유전자는 GenBank accession no. NM_004985, NM_033360 등에 제공되는 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것일 수 있다.
KRAS는 EGFR 하류 이펙터이고, 항-EGFR moAb에 대한 1차 저항의 마커이다. KRAS는 mCRC환자의 치료의 최적화에 대해 상당한 영향력을 가진다. 결장 종양의 40퍼센트가 KRAS 유전자에서 돌연변이를 품고 있고 이들 환자는 항-EGFR moAb의 효과가 없다. 현재 임상 실시에서 항-EGFR moAb 치료에 대해 고려되는 모든 mCRC 환자는 KRAS 테스팅을 거쳐야만 하고, KRAS 돌연변이가 검출된다면 환자는 세툭시맙 또는 파니투무맙 치료로부터 배제되어야만 한다.
또한, 야생형 KRAS 종양을 갖는 mCRC 환자의 일부는 여전히 항-EGFR moAb로부터 혜택을 받지 못한다. 야생형 KRAS 대상에서 항-EGFR moAb에 대한 반응률은 화학요법과 조합될 때 대략적으로 60%이고 화학요법-불응 환자에서 단독으로 투여될 때 20% 미만이다.
PTEN(포스파타아제 및 텐신 동족체)의 발현의 손실은 물론, BRAF(세린/트레오닌-단백질 키나아제 B-Raf) 및 PI3K(포스파티딜이노시톨 3-키나아제)와 같은 다른 EGFR 하류 유전자의 돌연변이를 활성화하는 것, 및 다른 EGFR 조절 단백질에서의 변화는 이제까지 결정적이지 않은 결과를 갖는 항-EGFR 치료에 대한 반응에 있어서 유력한 후보로서 평가되고 있다.
RAS 단백질 및 RAF 단백질은, RAS/RAF/MAPK 경로에 의한 세포 내 시그널 전달의 캐스케이드를 형성하는 단백질이다. 상기 RAS/RAF/MAPK 경로는, 활성형 RAS 단백질에 의해 RAF 단백질이 활성화되고, 활성형 RAF 단백질에 의해 MEK 단백질이 활성화되고, 또한, 활성형 MEK 단백질에 의해 MAPK 단백질이 활성화된다. 이에 의해, 세포의 증식 및 분화 등을 조절하고 있다.
베바시주맙/FOLFIRI 병용요법은 전이성 직결장암의 1차 치료제로 적절한 치료제이고 반응율, 무진행 생존기간, 전체 생존기간을 연장시킬 수 있다 (Hurwitz H, et al. NEJM 2004, 6. Petrelli et al. Clin Colorectal Cancer. 2013 Sep;12(3):145-51). 전이성 직결장암의 2차 치료제로 무진행생존기간, 전체생존율에 효과를 보인 치료제는 베바시주맙과 지브-아플리베셉트(ziv-aflibercept)이다 (Giantonio et al. JCO 2007 14. Tabernero et al. European Journal of Cancer 50, 320-331, 2014). 베바시주맙은 1차 치료에 항암화학요법에 베바시주맙을 병용하고 1차 재발 후 2차 치료로 항암화학요법을 변경해 베바시주맙을 지속 투여했을 때 무진행생존기간, 전체생존율이 통계적으로 의미있게 연장시켰다(Bennouna et al. Lancet Oncol. 14: 29: 37, 2013).
[실시예]
[실시예1]
비소성 폐암환자를 대상으로 한 EGFR 돌연변이 검출
실시예 1-1. 샘플 모집
무작위배정 2상 시험에 참가한 192명의 비소세포성폐암 환자의 조직샘플과 혈액으로부터 분리된 플라스마 샘플을 얻었다. 조직 샘플의 경우 염기서열 분석(Sequencing) 방법을 이용하여 결과를 얻었으며 본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법(C-Melting technology)를 이용하여 플라스마로부터 EGFR 시험을 진행하였다.
실시예 1-2. DNA 추출
본 실험에는 QIAGEN사의 QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit (Cat# 55114)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 요약하면, 1 ㎖의 플라스마(plasma) 샘플에 프로테이나제 K (Proteinase K) 100 ㎕와 carrier RNA가 1.0 ㎍포함된 버퍼(Buffer) ACL을 800 ㎕ 첨가하여 잘 섞어준 후, 60℃에서 1시간 동안 처리하였다. 배양 후 ACB 버퍼 1.8 ㎖을 첨가하여 얼음(ice)에 5분간 정치하였다. 이 용액을 진공(vacuum)을 이용하여 컬럼(column)에 내린 후, 버퍼 ACW1 600 ㎕, 버퍼 ACW2 750 ㎕, 100% 에탄올 750 ㎕ 순서대로 세척하였다. 컬럼을 진공 시스템(vacuum system)에서 분리하여 14,000 rpm에서 3분간 원심분리 후, 56℃에서 10분간 처리하여 남아있는 에탄올을 제거하였다. 버퍼 AVE 100 ㎕를 컬럼에 첨가하여 14,000 rpm에서 1분간 원심분리 후 DNA를 용출하였다. 용출된 DNA는 C-melting 실험에 5 ㎕씩 사용되었다.
실시예 1-3. EGFR 돌연변이 확인
플라스마로부터 추출된 DNA를 이용하여 EGFR 변이 검출을 위한 PCR반응을 수행하였다. 요약하면, 엑손 18, 19, 20 및 21 돌연변이 47종 검출을 위한 10종의 시약(G719X, E19del A, E19del B, S768I, T790M, E20ins A, E20ins B, L858R, L861Q, EIC) 각 19 ㎕에 Taq DNA polymerase (Enzynomics., Korea) 1 ㎕씩 섞은 후, 5 ㎕의 DNA를 첨가하였다. PCR을 50℃에서 2분간 반응하여 UDG 불활성화(inactivation)를 진행한 후, 15분간 95℃에서 초기변성 후 15사이클(95℃에서 30초, 70℃에서 20초, 63℃에서 1분), 35사이클(95℃에서 10초, 53℃에서 20초, 73℃에서 20초)을 수반하였다. 그 후 95℃에서 15분, 35℃에서 5분 배양 후, 35℃~75℃까지 0.5℃씩 온도를 증가시키며 3초씩 시그널(FAM, HEX, ROX, Cy5)을 측정하여 Tm결과 값을 도출하였다. 상기 PCR반응은 192명 환자의 플라스마로부터 추출된 DNA에 모두 적용하였다.
실시예 1-4. 조직(tissue) 결과와의 상관성 및 생존율 분석
본 발명의 C-melting 기술을 이용하여, 플라스마 샘플로부터 추출한 DNA의 EGFR 시험 결과, 기존 조직샘플과의 일치율은 81.3% (95% confidence interval [CI], 75.0-86.5), 민감도 및 특이도는 각각 62.0% (95% CI, 47.2-75.4), 88.0% (95% CI, 81.5-92.9)로 확인되었다. 또한 플라스마 샘플에서 조직샘플에 비해 추가적으로 EGFR T790M (n=8), exon20ins (n=5)이 검출되었다. 표 1에 EGFR-TKI 치료 (제피티닙(Gefitinib, Iressa) 또는 엘로티닙(Erlotinib, Tarceva) 를 받은 114명 사이의 평균 무진행생존기간(median progression-free survival (PFS)) 결과를 표시하였다.
표 1
Figure PCTKR2015007656-appb-T000001
본 발명의 방법으로 사용하여 EGFR 돌연변이 검출결과에 대해 무진행 생존기간을 분석해본 결과 유의한 생존 결과를 확인할 수 있었다.
[실시예2]
비소성 폐암환자를 대상으로 한 KRAS 돌연변이 검출
실시예 2-1. 샘플 모집
무작위배정 2상 시험에 참가한 135명의 비소세포성폐암 환자의 조직샘플과 혈액으로부터 분리된 플라스마 샘플을 얻었다. 조직 샘플의 경우 염기서열 분석(Sequencing) 방법을 이용하여 결과를 얻었으며 본 발명의 동시 다중적 표적핵산 검출방법(C-Melting technology)를 이용하여 플라스마로부터 KRAS 시험을 진행하였다.
실시예 2-2. DNA 추출
본 실험에는 QIAGEN사의 QIAamp® Circulating Nucleic Acid Kit (Cat# 55114)를 사용하여 DNA를 추출하였다. 요약하면, 1 ㎖의 플라스마(plasma) 샘플에 프로테이나제 K (Proteinase K, QIAGEN)을 100 ㎕과 carrier RNA가 1.0 ㎍포함된 버퍼 ACL을 800 ㎕ 첨가하여 잘 섞어준 후, 60℃에서 1시간 동안 처리하였다. 배양 후 ACB 버퍼 1.8 ㎖을 첨가하여 ice에 5분간 정치하였다. 이 용액을 진공을 이용하여 컬럼에 내린 후, Buffer ACW1 600 ㎕, 버퍼 ACW2 750 ㎕, 100% 에탄올 750 ㎕ 순서대로 세척하였다. 컬럼을 진공 시스템에서 분리하여 14,000 rpm에서 3분간 원심분리 후, 56℃에서 10분간 처리하여 남아있는 에탄올을 제거하였다. 버퍼 AVE 100 ㎕를 컬럼에 첨가하여 14,000 rpm에서 1분간 원심분리 후 DNA를 용출하였다. 용출된 DNA는 C-melting 실험에 5 ㎕씩 사용되었다.
실시예 2-3. KRAS 돌연변이 확인
플라스마로부터 추출된 DNA를 이용하여 KRAS 변이 검출을 위한 PCR반응을 수행하였다. 요약하면, exon2, 3 및 4 돌연변이 29종 검출을 위한 9종의 시약(KC12a, KC12b, KC13a, KC13b, KC59, KC61, KC117, KC146, KIC) 각 19 ㎕에 Taq DNA polymerase (Enzynomics., Korea) 1 ㎕씩 섞은 후, 5 ㎕의 DNA를 첨가하였다. PCR을 50℃에서 2분간 반응하여 UDG 불활성화(inactivation)를 진행한 후, 15분간 95℃에서 초기변성 후 15사이클(95℃에서 30초, 70℃에서 20초, 63℃에서 1분), 35사이클(95℃에서 10초, 53℃에서 20초, 73℃에서 20초)을 수반하였다. 그 후 95℃에서 15분, 35℃에서 5분 배양 후, 35℃~75℃까지 0.5℃씩 온도를 증가시키며 3초씩 시그널(FAM, HEX, ROX, Cy5)을 측정하여 Tm결과 값을 도출하였다. 상기 PCR반응은 135명 환자의 플라스마로부터 추출된 DNA에 모두 적용하였다.
실시예 2-4. 조직(tissue) 결과와의 상관성 및 생존율 분석
본 발명의 C-melting 기술을 이용하여, 플라스마 샘플로부터 추출한 DNA의 KRAS 시험 결과, 기존 조직샘플과의 일치율은 81.5% (95% confidence interval [CI], 73.9-87.6), 민감도 및 특이도는 각각 25.0% (95% CI, 5.5-57.2), 87.0% (95% CI, 79.7-92.4)로 확인되었다. 또한 플라스마 샘플에서 조직샘플에 비해 추가적으로 16환자의 샘플에서 돌연변이가 검출되었다. 표 2 에 EGFR-TKI 치료를 받은 114명 사이의 평균 무진행생존기간(median progression-free survival (PFS)) 결과를 표시하였다.
표 2
Figure PCTKR2015007656-appb-T000002
본 발명의 방법으로 사용하여 KRAS 돌연변이 검사 결과에 대해 무진행 생존기간을 분석해본 결과 유의한 생존 결과를 확인할 수 있었다.

Claims (15)

  1. 암 질환의 진단, 예방, 치료 또는 예후 추정을 위하여, 환자의 시료로부터 EGFR 또는 KRAS 의 돌연변이를 검출하는 방법으로서,
    EGFR 또는 KRAS 의 돌연변이를 검출하기 위한 하나 이상의 검출 프로브(detection probe), 및 야생형 EGFR 유전자 및 야생형 KRAS 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe)를 포함하는 프로브 혼합체를 이용하는 검출 방법.
  2. 암 질환에 대한 티로신 키나아제 억제제(TKI) 투여 치료에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 EGFR 또는 KRAS 의 돌연변이를 검출하는 방법으로서,
    EGFR 또는 KRAS 의 돌연변이를 검출하기 위한 하나 이상의 검출 프로브(detection probe), 및 야생형 EGFR 유전자 및 야생형 KRAS 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe)를 포함하는 프로브 혼합체를 이용하는 검출 방법.
  3. 암 질환에 대한 세툭시맙 또는 파니투무맙 치료에 필요한 정보를 제공하기 위하여, 환자의 시료로부터 KRAS 의 돌연변이를 검출하는 방법으로서,
    KRAS 의 돌연변이를 검출하기 위한 하나 이상의 검출 프로브(detection probe), 및 야생형 KRAS 유전자의 증폭을 억제하는 클램핑 프로브(clamping probe)를 포함하는 프로브 혼합체를 이용하는 검출 방법.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 암 질환이 폐암, 난소암, 자궁경부암, 자궁내막암, 유방암, 뇌암, 결장암, 전립선암, 위장관암, 두부경부 암, 비소세포 폐암, 신경계암, 신장암, 망막암, 피부암, 간암, 췌장암, 생식-요로암, 담낭암, 흑색종, 및 백혈병으로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 환자의 시료는 혈액, 혈청, 혈장, 림프, 모유, 소변, 분변, 안구 유액, 타액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 충수, 비장 및 편도선 조직 추출물로 이루어진 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 프로브 또는 클램핑 프로브는 핵산유사체로, 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide), PNA(peptide nucleic acids) 및 LNA(Locked nucleic acid)로 이루어진 군에서 각각 선택되는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 프로브 또는 클램핑 프로브는 구조적 변형을 위해 아미노산 또는 아미노산의 곁사슬이 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 검출 프로브는 리포터(reporter) 및 소광자(quencher)가 결합된 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 환자의 시료에 클램핑 프로브 및 검출 프로브로 구성된 프로브 혼합체 및 프라이머를 혼합하여 혼성화시켜 실시간 증폭곡선을 얻는 단계; (b) 상기 증폭과정 이후 온도를 변화시키면서 증폭산물과 검출 프로브간의 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 실시간 증폭곡선 및 융해곡선을 별도로 분석하거나 순차적 또는 동시에 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 증폭은 실시간 PCR(polymerase chain reaction)을 통해 수행하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  11. 제 9 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 융해 곡선을 얻는 단계 전에, 실시간 증폭곡선을 얻는 단계와는 별도로 5 내지 20의 PCR 사이클을 추가하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 환자의 시료에 클램핑 프로브 및 검출 프로브로 구성된 프로브 혼합체 및 프라이머를 혼합하여 혼성화시켜 실시간 증폭곡선을 얻는 단계; (b) 상기 얻어지는 실시간 증폭곡선을 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, (a) 환자의 시료에 클램핑 프로브 및 검출 프로브로 구성된 프로브 혼합체 및 프라이머를 혼합하여 혼성화시키는 단계; (b) 온도를 변화시키면서 상기 혼성화된 산물을 융해시켜 융해곡선을 얻는 단계; 및 (c) 상기 얻어지는 융해곡선을 분석하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  14. 제 2 항에 있어서, 티로신 키나아제 억제제(TKI)가 제피티닙(gefitinib) 또는 엘로티닙(erlotinib)인 것을 특징으로 하는 검출 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항의 검출 방법을 이용하는 EGFR 또는 KRAS 검출용 키트.
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