KR102392907B1 - 프라이머 세트 및 pna 블로커를 포함하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

프라이머 세트 및 pna 블로커를 포함하는 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머 세트 및 PNA 블로커를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 방법에 따른 조성물은 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머 세트 및 상기 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합하는 PNA 블로커를 포함하여, SARS-CoV-2 바이러스, 및 상기 SARS-CoV-2 바이러스와 유전자 서열이 유사한 바이러스 사이의 교차결합을 억제하면서 SARS-CoV-2 바이러스만을 특이적으로 민감하게 검출함으로써, 서열이 유사한 종 사이에서 검출하고자 하는 표적 유전자를 효과적으로 검출하거나, 이와 관련된 질환의 진단에 사용될 수 있다.

Description

프라이머 세트 및 PNA 블로커를 포함하는 조성물 및 이의 용도{COMPOSITION COMPRISING PRIMER SET AND PNA BLOCKER AND USING THEREOF}
본 발명은 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머 세트 및 PNA 블로커를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다.
코로나 바이러스는 단일가닥 양성 RNA를 게놈으로 가지고, 외피가 있는 바이러스로 1937년 처음 발견된 이후 사람을 포함하여 다양한 동물에게서 분리되었다. 코로나 바이러스는 4개의 그룹으로 나눌 수 있는데, 이중 α-코로나 코로나바이러스 및 β-코로나 바이러스는 주로 포유류에 감염되고, γ-코로나 바이러스 및 δ-코로나 바이러스는 조류에 감염된다. 그러나, 최근 돼지에서 δ-코로나 바이러스의 감염이 확인된 사례가 있다.
이와 같이, 코로나 바이러스는 이종 간 감염이 가능한 바이러스로 2003년에 전세계적으로 유행한 중증급성호흡기증후군을 일으키는 사스(SARS) 코로나 바이러스와 2015년에 국내에 전파되어 확산된 메르스(MERS) 코로나 바이러스가 있다. 이들 코로나 바이러스는 모두 박쥐에서 유래된 것으로 알려졌다. 또한, 최근 중국 우한에서 발생하여 전 세계적으로 유행하고 있는 신종 코로나 바이러스(2019-nCoV)도 이종 감염에 의한 것으로 확인되었다.
박쥐는 포유동물 중 비행능력이 있어 광범위한 지역에 서식할 수 있으며, 동굴 등 협소한 공간에서 다수의 개체가 집단으로 생활하는 특성으로 인해 한 개체가 바이러스에 감염될 경우 집단으로 감염이 전달된다. 또한, 비행을 통해 광범위한 지역으로 이동이 가능하여 다른 동물에로 감염을 확산시킬 수 있다. 또한, 박쥐는 다른 포유류와 달리 체온이 높아 바이러스에 대한 저항력이 있어 코로나 바이러스에 영향을 받지 않고 지속적인 감염을 전파할 수 있다.
즉, 사스나 메르스 바이러스의 대유행으로 큰 혼란을 겪은 바와 같이 사람에게 감염되지 않는 것으로 알려진 코로나 바이러스가 사람에게 감염될 가능성을 배제할 수 없게 되었다. 또한, 사람에게 감염이 되지 않는 것으로 알려진 박쥐 유래 코로나 바이러스가 사람에게 감염 및 전파되는 경우, 이의 확산을 조기에 차단하는 것이 어려워 그 사회적 파장과 혼란은 매우 크다. 그러나, 코로나바이러스과(Coronaviridae)에 속하는 바이러스들이 유사한 유전자 서열을 공유하고 있어, 그중에 검출하고자 하는 코로나바이러스를 높은 특이도로 검출할 수 있는 기술의 개발이 필요하다.
이와 관련하여, 대한민국 등록특허 제10-2109196호는시료로부터 별도의 핵산 추출 및 정제 과정 없이도 간단한 실시간 등온증폭기기만으로 분자진단 검사 결과를 현장에서 1시간 이내에 확인할 수 있는 2019 신종코로나바이러스(2019 novel coronavirus) 검출용 LAMP(loop-mediated isothermal amplification)용 조성물을 개시하고 있다.
대한민국 등록특허 제10-2109196호
본 발명의 목적은 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머 세트 및 PNA 블로커를 포함하는 조성물 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 특정 염기서열로 구성되는 PNA 블로커 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 표적 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트; 및 상기 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열(conserved sequence)에 특이적으로 결합하는 PNA 블로커(peptide nucleic acid blocker)를 포함하고, 상기 PNA 블로커는 프라이머 세트에 의해 증폭되는 부위에 결합하는 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 표적 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트 및 상기 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열(conserved sequence)에 특이적으로 결합하는 PNA 블로커를 이용하여 시료에서 표적 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는, 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성되는 PNA 블로커를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 PNA 블로커 및 표적 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 진단용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 진단용 조성물을 이용하여 시료에서 표적 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 방법에 따른 조성물은 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 프라이머 세트 및 상기 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합하는 PNA 블로커를 포함하여, SARS-CoV-2 바이러스, 및 상기 SARS-CoV-2 바이러스와 유전자 서열이 유사한 바이러스 사이의 교차결합을 억제하면서 SARS-CoV-2 바이러스만을 특이적으로 민감하게 검출함으로써, 서열이 유사한 종 사이에서 검출하고자 하는 표적 유전자를 효과적으로 검출하거나, 이와 관련된 질환의 진단에 사용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 블로커 및 프라이머 세트를 이용하여 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키는 방법을 나타내는 모식도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 블로커 및 프라이머 세트를 제작하기 위해 표적 유전자를 선별하는 것을 나타내는 모식도이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 합성 SARS-CoV-2 바이러스의 RNA를 RT-qPCR 방법으로 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 블로커 및 프라이머 세트를 이용하여 합성 SARS-CoV-2 바이러스의 RNA를 RT-qPCR 방법으로 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 프라이머 세트를 이용하여 합성 SARS-CoV 바이러스의 RNA를 RT-qPCR 방법으로 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 블로커 및 프라이머 세트를 이용하여 합성 SARS-CoV 바이러스의 RNA를 RT-qPCR 방법으로 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 블로커 및 프라이머 세트를 이용하여 Beta-CoV/Korea/KCDC03/2020, Beta-CoV/Korea/NMC01/2020 및 Beta-CoV/Korea/NMC02/2020 바이러스로부터 분리된 RNA를 RT-qPCR 방법으로 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 블로커가 SARS-CoV 바이러스에 결합하여 이의 증폭을 억제하는 온도를 확인한 결과 그래프이다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 블로커가 SARS-CoV 바이러스에 결합하여 이의 증폭을 억제하는 농도를 확인한 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 PNA 블로커의 결합 온도 및 농도에서 SARS-CoV-2 바이러스의 RNA를 RT-qPCR 방법으로 검출한 결과를 나타내는 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 표적 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트; 및 상기 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열(conserved sequence)에 특이적으로 결합하는 PNA 블로커(peptide nucleic acid blocker)를 포함하고, 상기 PNA 블로커는 프라이머 세트에 의해 증폭되는 부위에 결합하는 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 조성물을 제공한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "표적 유전자"는 검출하고자 하는 유전자를 의미하며, 표적 유전자, 타겟 유전자 등의 용어로 사용될 수 있다. 일반적으로 상기 표적 유전자는 특정 바이러스나 미생물을 검출하기 위해 사용되는 유전자로서, 본 발명의 일 실시예에 따르면, SARS-CoV-2 바이러스의 유전자일 수 있고, 구체적으로, SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자(nucleocapsid gene, N gene)일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "PNA(peptide nucleic acid)"는 펩티드 유사 백본(backbone)에 잔기로서 핵산 염기가 결합한 구조를 갖고, DNA 또는 RNA와 결합할 수 있는 분자를 의미한다. 상기 PNA 및 DNA 분자 사이의 이중결합은 DNA 분자 사이의 이중결합 보다 열안정성이 크고, 주형 DNA 분자에 상보적인 서열을 갖는 PNA는 동일한 서열을 갖는 DNA 분자보다 주형 DNA에 대한 결합능이 더 높다.
즉, 상기 용어, "PNA 블로커(blocker)"는 표적 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트에 의해 증폭되는 표적 서열에 결합하여 프라이머 세트에 의한 표적 유전자의 증폭을 억제하는 물질을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PNA 블로커는 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다.
일례로, 본 발명에 따른 조성물에 포함되는 프라이머 세트는 검출하고자 하는 바이러스, 박테리아, 세포 등에 특이적으로 존재하는 염기서열을 표적으로 제작되고, PNA 블로커는 상기 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하면서 표적 유전자와는 다른 바이러스, 박테리아, 세포 등에 공통적인 보존적 서열에 특이적으로 결합하도록 제작될 수 있다. 상기 조성물은 PNA 블로커가 먼저 유전자 주형에 결합한 뒤, 프라이머 세트가 결합되도록 조건을 변경함으로써, 검출하고자 하는 바이러스, 박테리아, 세포 등이 아님에도 표적 유전자와 상동성이 높아 프라이머 세트가 결합하여 증폭되는 교차반응을 억제할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 조성물은 유사 서열을 공유하는 바이러스, 박테리아 등 사이에서 원하는 바이러스, 박테리아만을 높은 특이도로 검출할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 조성물은 유전자 서열이 유사한 바이러스, 박테리아, 세포 등 사이에 나타나는 교차반응을 억제하여 검출하고자 하는 표적 유전자만을 특이적으로 증폭시킬 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성되는 PNA 블로커는 SARS-CoV-2 바이러스를 제외한 코로나바이러스과에 속하는 코로나바이러스의 보존적 서열에 특이적으로 결합하여 SARS-CoV-2 바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자를 표적으로 제작된 프라이머 세트가 교차반응으로 결합하더라도 이의 증폭을 억제함으로써, SARS-CoV-2 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있다. 이때, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 상기 PNA 블로커를 통상의 기술분야에 알려진 적절한 농도로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 PNA 블로커는 50 내지 900 nM, 100 내지 900 nM, 200 내지 900 nM, 300 내지 900 nM, 400 내지 900 nM, 50 내지 700 nM, 100 내지 700 nM, 200 내지 700 nM, 300 내지 700 nM, 400 내지 700 nM, 50 내지 600 nM, 100 내지 600 nM, 200 내지 600 nM, 300 내지 600 nM 또는 400 내지 600 nM의 농도로 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물을 표적 유전자를 통상적인 방법으로 증폭시킴으로써 검출할 수 있다. 이때, 상기 증폭은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있고, 구체적으로, 상기 조성물에 포함되는 PNA 블로커 및 프라이머 세트는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체일 수 있다. 발색효소는 퍼록시다제, 알칼라인 포스파타제 또는 산성 포스파타제일 수 있고, 형광물질은 티오우레아(FTH), 7-아세톡시쿠마린-3-일, 플루오레신-5-일, 플루오레신-6-일, 2',7'-디클로로플루오레신-5-일, 2',7'-디클로로플루오레신-6-일, 디하이드로 테트라메틸로사민-4-일, 테트라메틸로다민-5-일, 테트라메틸로다민-6-일, 4,4-디플루오로-5,7-디메틸-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸 또는 4,4-디플루오로-5,7-디페닐-4-보라-3a,4a-디아자-s-인다센-3-에틸, Cy3, Cy5, 폴리 L-라이신-플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 로다민-B-이소티오시아네이트(RITC), PE(Phycoerythrin) 또는 로다민일 수 있다.
또한, 상기 조성물은 이에 포함되는 PNA 블로커 및 프라이머 세트에 특이적으로 결합할 수 있는 리간드를 포함할 수 있다. 상기 리간드는 발색효소, 형광물질, 방사성 동위원소 또는 콜로이드 등의 검출체로 표지된 접합체, 및 스트렙타비딘 또는 아비딘이 처리된 리간드일 수 있다. 일례로, 상기 PNA 블로커 및 프라이머 세트는 SYBR 그린이나 프로브를 포함할 수 있다. 본 발명의 검출용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 시약 외에도 이들의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 더 포함할 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 조성물은 프로브를 더 포함할 수 있다. 상기 프로브는 표적 유전자의 증폭을 정량적으로 확인하기 위한 것으로, 상기 프로브는 형광 검출을 위한 물질이 결합된 형태일 수 있다. 상기 형광 검출을 위한 물질은 프로브의 5'-말단, 3'-말단 또는 양 말단에 결합될 수 있다. 구체적으로, 상기 프로브는 이의 5'-말단에 형광물질을, 3'-말단에 상쇄물질(quencher)이 결합될 수 있다. 일례로, 본 발명의 일 실시예에서, 상기 프로브는 서열번호 3으로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다.
본 발명에 따른 프라이머 세트, PNA 블로커 및 프로브는 표적 유전자의 서열을 기초로 통상적인 방법으로 제작될 수 있다. 또한, 상기 프라이머 세트, PNA 블로커 및 프로브는 각각의 기능을 유지하는 한, 이들을 구성하는 염기서열이 치환, 결실, 삽입된 변이체도 모두 포함할 수 있고, 구체적으로, 서열번호 1 내지 4로 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 포함하는 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트에 포함되는 조성물은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 조성물은 표적 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트; 및 상기 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합하는 PNA 블로커를 포함하고, 상기 PNA 블로커는 프라이머 세트에 의해 증폭되는 부위에 결합하는 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 상기 프라이머 세트 및 PNA 블로커는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 키트는 이에 포함되는 PNA 블로커 및 프라이머 세트의 세척이나 복합체의 분리 등과 같은 이후 단계를 용이하게 하기 위해 고형 기질에 결합될 수 있다. 이때, 고형 기질로는 합성수지, 니트로셀룰로오스, 유리기판, 금속기판, 유리섬유, 미세구체 또는 미세비드가 사용될 수 있다. 또한, 합성수지로는 폴리에스터, 폴리염화비닐, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, PVDF 또는 나일론 등이 사용될 수 있다.
또한, 상기 키트는 당업자에게 알려진 종래의 제조방법에 의해 제조될 수 있으며, 버퍼, 안정화제, 불활성 단백질 등을 더 포함할 수 있다. 상기 키트는 시약의 양을 탐색하기 위해 검출체로서 부착된 형광물질의 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법 또는 검출체로서 부착된 방사선 동위원소의 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법을 통한 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법을 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 표적 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트 및 상기 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열(conserved sequence)에 특이적으로 결합하는 PNA 블로커를 이용하여 시료에서 표적 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는, 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 검출하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 프라이머 세트 및 PNA 블로커는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 증폭은 통상의 기술분야에 잘 알려진 방법으로 수행될 수 있고, 통상의 기술자에 의해 적절히 변형되어 수행될 수 있다. 또한, 상기 증폭은 통상적인 방법으로 제조된 반응물을 사용하여 수행될 수 있다. 일례로, 상기 반응물은 주형, 프라이머, dNTP, 중합효소, 황산마그네슘 등을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 반응물에 포함되는 주형, 프라이머, dNTP, 중합효소, 황산마그네슘 등은 통상의 기술자에 의해 적절한 양으로 사용될 수 있다.
상기 시료는 표적 유전자를 검출하고자 하는 시료라면 모든 시료를 포함할 수 있다. 일례로, 상기 시료는 포유동물, 구체적으로 인간 유래의 시료일 수 있다. 또한, 상기 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제 크로마토그래피, 액체 크로마토그래피, 연속추출, 원심분리 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성되는 PNA 블로커를 제공한다.
본 발명에 따른 PNA 블로커는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 PNA 블로커는 프라이머 세트를 이용하여 검출하고자 하는 표적 유전자를 구성하는 염기서열 중, 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 PNA 블로커는 SARS-CoV-2 바이러스를 제외한 다른 코로나바이러스의 뉴클레오캡시드 유전자에서 보존적 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 구체적으로, 상기 PNA 블로커는 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 또한, 상기 PNA 블로커는 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보전적 서열에 특이적으로 결합하는 한, 서열번호 4로 기재된 염기서열과 80% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 97% 이상 또는 99% 이상의 상동성을 가질 수 있다.
본 발명에 따른 PNA 블로커는 검출하고자 하는 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합함으로써, 표적 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트의 교차반응에 의한 증폭을 억제할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 PNA 블로커 및 표적 유전자를 증폭시키는 프라이머 세트를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병 진단용 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 조성물에 포함되는 PNA 블로커 및 프라이머 세트는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 PNA 블로커는 검출 하고자 하는 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 한편, 상기 프라이머 세트는 PNA 블로커가 결합하는 부위를 포함하면서, 표적 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 PNA 블로커는 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성될 수 있고, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 각각 기재된 염기서열로 구성될 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 진단용 조성물은 PNA 블로커가 검출하고자 하는 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합하여 표적 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트의 교차반응에 의한 증폭을 억제함으로써, 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 검출을 억제할 수 있다.
상기 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병은 신종코로나바이러스감염증(COVID-19)일 수 있다.
또한, 상기 진단용 조성물은 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 진단용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병 진단용 키트를 제공한다.
본 발명에 따른 키트에 포함되는 PNA 블로커 및 프라이머 세트는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 PNA 블로커는 검출 하고자 하는 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 한편, 상기 프라이머 세트는 PNA 블로커가 결합하는 부위를 포함하면서, 표적 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 PNA 블로커는 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성될 수 있고, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 각각 기재된 염기서열로 구성될 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 키트는 이에 포함된 PNA 블로커가 검출하고자 하는 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합하여 표적 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트의 교차반응에 의한 증폭을 억제함으로써, 표적 유전자를 높은 특이성으로 검출할 수 있다.
상기 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병은 신종코로나바이러스감염증(COVID-19)일 수 있다.
또한, 상기 진단용 키트는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 진단용 조성물을 이용하여 시료에서 표적 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 방법에 사용되는 PNA 블로커 및 프라이머 세트는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 상기 PNA 블로커는 검출하고자 하는 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합할 수 있다. 한편, 상기 프라이머 세트는 PNA 블로커가 결합하는 부위를 포함하면서, 표적 유전자를 특이적으로 증폭시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 PNA 블로커는 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성될 수 있고, 상기 프라이머 세트는 서열번호 1 및 2로 각각 기재된 염기서열로 구성될 수 있다.
즉, 본 발명에 따른 방법은 이에 포함된 PNA 블로커가 검출하고자 하는 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합하여 표적 유전자를 증폭시키기 위한 프라이머 세트의 교차반응에 의한 증폭을 억제함으로써, 표적 유전자를 높은 특이성으로 검출할 수 있다.
상기 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병은 신종코로나바이러스감염증(COVID-19)일 수 있다.
또한, 상기 시료는 상기 서술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다, 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 청구범위에 기재된 기술적 사상과 실질적으로 동일한 구성을 갖고 동일한 작용 효과를 이루는 것은 어떠한 것이라도 본 발명의 기술적 범위에 포함된다.
실시예 1. 프라이머, 프로브 및 PNA(peptide nucleic acid) 블로커(blocker)의 제작
코로나바이러스과에 속하는 유전자 서열이 유사한 코로나바이러스들 사이에서 신종 코로나바이러스인 SARS-CoV-2 바이러스를 검출하기 위한 프라이머, 프로브 및 PNA 블로커를 제작하였다. 구체적으로, 본 발명에 따른 프라이머, 프로브 및 PNA 블로커는 유사한 유전자 서열을 공유하는 코로나바이러스과에 포함된 바이러스 중, SARS-CoV-2 바이러스를 높은 특이도로 검출하는 것을 목적으로 하여, SARS-CoV-2 바이러스에 특이적인 프라이머 및 프로브 세트, SARS-CoV-2 바이러스를 제외한 다른 코로나바이러스과에 포함되는 코로나바이러스(이하, '유사 코로나바이러스')에 특이적인 PNA 블로커를 제작하였다. 즉, 본 발명에 따른 프라이머 및 PNA 블로커를 첨가하여 증폭반응을 수행하는 경우, 만약 프라이머 및 프로브 세트가 유사 코로나바이러스의 유전자에 결합하더라도 PNA 블로커가 증폭되는 부위에 결합하여 이의 증폭을 억제한다(도 1).
프라이머, 프로브 및 PNA 블로커는 GISAID(https://www.gisaid.org/) 및 GenBank에 등록된 926개의 SARS-CoV-2 유전자 서열을 수집하고, 수집된 유전자 서열에서 N 유전자 서열에 대해 제작되었다(도 2). 제작된 프로브는 5'-말단에 FAM(6-carboxyfluorescein)을, 3'-말단에 BHQ(black hole quencher)를 결합시켰다. 또한, SARS-CoV-2 바이러스의 검출 시, 프라이머 및 프로브가 표적 유전자에 결합하기 전에 PNA 블로커가 유사 코로나바이러스 유전자에 먼저 결합하도록 하기 위해, 프라이머 및 프로브와, PNA 블로커가 다른 온도에서 표적 서열에 결합하도록 제작하였다. 상기 제작된 프라이머, 프로브 및 PNA 블로커의 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
이름 염기서열(5'→3') 서열번호
SARS-CoV2_forward GCGATCAAAACAACGTCGG 서열번호 1
SARS-CoV2_reverse ATACCATCTTGGACTGAGA 서열번호 2
SARS-CoV2_probe ACCGAAGAGCTACCAGACGA 서열번호 3
SARS-CoV2_PNA blocker ATCAACACCAATAGTGG 서열번호 4
실험예 1. SARS-CoV-2 바이러스 검출효과 확인
상기 제작된 프라이머, 프로브 및 PNA 블로커 세트를 이용하여 SARS-CoV-2 바이러스의 검출 효과를 실시간 RT-qPCR(real-time RT-quantitativePCR) 방법을 통해 확인하였다.
먼저, SARS-CoV-2 바이러스의 N 유전자 부위(28224-28623 bp)의 공지된 서열을 이용하여 DNA를 합성하였다. 합성한 DNA 염기 서열을 주형으로 MEGAscript® 키트(Invitrogen, 리투아니아)를 사용하여 RNA 전사체(transcript)를 수득하였다. 수득된 RNA 전사체의 카피수(copy number)를 Qubit™ RNA-HA 어세이 키트(Thermo Fisher Scientific Inc., 싱가포르)를 사용하여 확인하고, 이를 10배 단계희석하여 준비하였다. 이때, 대조군으로서 SARS-CoV 바이러스의 N 유전자 부위(28033-28430 bp)를 사용하였다.
한편, SARS-CoV-2 바이러스인 Beta-CoV/Korea/KCDC03/2020, Beta-CoV/Korea/NMC01/2020 및 Beta-CoV/Korea/NMC02/2020 바이러스는 베로 세포주(vero cell)를 사용하여 통상적인 방법으로 배양 및 증식하였다. 증식된 세포로부터 SARS-CoV-2 바이러스의 RNA를 RNeasy® 미니 키트(Qiagen, 독일)를 이용하여 추출하고, 이를 8배 단계희석하여 준비하였다.
상기 준비된 합성 RNA 전사체 또는 추출된 RNA 주형, TOPreal™ One-step RT-qPCR 키트(Enzynomics Co., 한국) 및 CFX96 실시간 PCR 탐지 시스템(Bio-Rad® Laboratories, Inc., 미국)을 이용하여 실시간 RT-qPCR을 수행하였다. 구체적으로, 3 ㎕의 RNA 주형, 1 ㎕의 정방향 프라이머(250 nM), 1 ㎕의 역방향 프라이머(250 nM), 1 ㎕의 프로브(250 nM), 1 ㎕의 PNA 블로커(500 nM), 20 ㎕의 TOPreal™ One-step RT-qPCR 키트 시약을 혼합하고, 총 부피가 20 ㎕가 되도록 RNase가 없는 증류수를 첨가하여 반응액을 준비하였다. 준비된 반응액을 이용하여 하기 표 2에 기재된 바와 같은 조건으로 실시간 RT-qPCR을 수행하였다.
단계 온도 시간 횟수(cycle)
역전사 50℃ 30분 1회
전-변성 95℃ 15분 1회
변성 95℃ 10초 40회
PNA 결합 73.4℃ 10초
프라이머 결합 50℃ 10초
신장 72℃ 10초
합성 RNA 전사체를 주형으로 사용하여 수행된 결과를 표 3 및 도 3 내지 6에, 추출된 RNA 주형을 사용하여 수행된 결과를 표 4 및 도 7에 나타내었다.
RNA 카피 수 SARS-CoV-2/PNA 무첨가
(평균 Ct값±SD)		 SARS-CoV-2/PNA 첨가
(평균 Ct값±SD)		 SARS-CoV/PNA 무첨가
(평균 Ct값±SD)		 SARS-CoV/PNA 첨가
(평균 Ct값±SD)
1×108 13.79±0.16 13.71±0.19 29.18±0.58 35.81±0.36
1×107 17.3±0.18 17.30±0.22 32.80±0.54 N/A
1×106 20.75±0.35 20.68±0.07 35.06±0.65 N/A
1×105 24.1±0.15 23.97±0.05 N/A N/A
1×104 27.46±0.35 27.53±0.08 N/A N/A
1×103 31.29±0.07 31.46±0.25 N/A N/A
1×102 35.06±0.54 34.62±0.06 N/A N/A
1×101 38.66±1.18 38.34±1.70 N/A N/A
1×100 N/A N/A N/A N/A
음성 대조군 N/A N/A N/A N/A
바이러스 희석배수 Beta-CoV/Korea/NMC01/2020
(평균 Ct값±SD)		 Beta-CoV/Korea/NMC02/2020
(평균 Ct값±SD)		 Beta-CoV/Korea/KCDC03/2020
(평균 Ct값±SD)
1×10-2 15.82±0.38 16.23±0.45 15.88±0.42
1×10-3 19.31±0.08 19.05±0.03 18.83±0.30
1×10-4 22.88±0.20 23.56±2.57 22.54±0.17
1×10-5 26.56±0.32 26.19±0.13 25.77±0.47
1×10-6 29.77±0.29 29.94±0.33 29.07±0.25
1×10-7 33.34±0.43 33.41±0.30 33.38±0.25
1×10-8 N/A N/A N/A
음성 대조군 N/A N/A N/A
그 결과, 도 3 및 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브를 이용하여 높은 민감도로 합성된 SARS-CoV-2 바이러스의 RNA를 검출할 수 있었고, 이와 같은 검출 효과는 PNA 블로커의 존재 유무에 영향을 받지 않았다. 한편, 도 5 및 6에 나타난 바와 같이, SARS-CoV 바이러스의 RNA는 PNA 블로커가 없이 RT-qPCR을 수행하였을 때 프라이머 및 프로브의 교차반응에 의해 검출되었지만, PNA 블로커의 존재하에서는 교차반응이 억제되었다. 또한, 이와 같은 결과는, 실험 결과를 표로 나타낸 표 3에서도 확인되었다.
또한, 도 7에 나타난 바와 같이, SARS-CoV-2 바이러스로부터 추출된 RNA 또한 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브에 의해 높은 민감도로 2종류의 바이러스가 모두 검출되었다. 이때, 진단 검출 한계(limit of detection, LOD)를 측정하고자, 10-8까지 단계희석하여 검출결과를 확인하였다. 이와 같은 결과는, 실험 결과를 표로 나타낸 표 4에서도 확인되었다.
즉, 상기 결과로부터 본 발명에 따른 프라이머 및 프로브는 SARS-CoV-2 바이러스만을 특이적으로 검출하는데 사용될 수 있음을 알 수 있었다.
실험예 2. 임상 시료에서의 SARS-CoV-2 바이러스 검출 확인
본 발명에 따른 프라이머, 프로브 및 PNA 블로커 세트가 임상 시료에 포함된 SARS-CoV-2 바이러스를 특이적으로 검출하는지를 다음과 같이 확인하였다.
실험은 RNA 주형 대신, 하기 표 5에 기재된 바와 같이 5종류의 코로나바이러스, 5종류의 인플루엔자 바이러스 및 6종류의 기타 호흡기 바이러스가 포함된 임상시료를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실험예 1에 기재된 바와 동일한 조건 및 방법으로 수행되었다. 그 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
바이러스 시료 수 탐지 수 Ct 값
코로나
바이러스		 SARS-CoV-2 14 13 18.10~35.19
MERS-CoV 1 ND 15.9
229E 17 ND 17.17~40.61
NL63 13 ND 17.18~40.91
OC43 17 ND 17.62~40.17
인플루엔자 바이러스 B 58 ND 16.05~41.0
H1N1 17 ND 15.84~41.15
H3N2 68 ND 9.16~41.18
HPAI H5NX 8 ND 22.2~24.54
H7N9 1 ND 21.25
기타 호흡기 바이러스 MPV(human metapneumovirus) 11 ND 19.10~39.49
RSV A(respiratory syncytial virus A) 3 ND 21.07~30.8
RSV B 46 ND 16.77~41.97
PIV(parainfluenza virus) 8 ND 27.93~39.75
AdV(adenovirus) 3 ND 27.96~40.21
HRV(rhinovirus) 37 ND 15.00~40.00
상기 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 프라이머, 프로브 및 PNA 블로커 세트는 임상시료에서도 SARS-CoV-2 바이러스를 92.9%의 높은 검출율로 검출함으로써, SARS-CoV-2 바이러스의 검출이나 SARS-CoV-2 바이러스에 의한 질병의 진단에 유용하게 사용될 수 있다.
실험예 3. PNA 블로커의 온도조건 확인
본 발명에 따른 PNA 블로커가 SARS-CoV 바이러스에 결합하여 교차반응을 억제하는 적절한 온도조건을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
실험은 PNA 블로커의 결합 온도를 68.8, 69.4, 70.1, 70.8, 71.3, 72.0, 72.7, 73.4, 74.1 또는 74.8℃로 달리하고, 주형을 넣지않고 실시간 RT-qPCR을 수행한 것을 제외하고는, 상기 실험예 1에 기재된 조건 및 방법으로 진행되었다.
그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 68.8 또는 73.4℃의 온도에서 PNA 블로커를 결합시킨 경우에만 위양성(false positive) 결과가 나오지 않았다.
실험예 4. PNA 블로커의 농도조건 확인
본 발명에 따른 PNA 블로커가 SARS-CoV 바이러스에 결합하여 교차반응을 억제하는 적절한 농도조건을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
실험은 PNA 블로커를 125, 250, 500 nM의 농도로 첨가하고, 상기 실험 결과 도출된 온도인 68.8 또는 73.4℃에서 주형으로 합성 SARS-CoV 바이러스의 RNA 전사체를 사용하여 실시간 RT-qPCR을 수행한 것을 제외하고는, 상기 실험예 1에 기재된 조건 및 방법으로 진행되었다. 실시간 RT-qPCR 결과를 확인하고, 그 결과 그래프를 도 9에 나타내었다.
도 9에 나타난 바와 같이, PNA 블로커가 68.8℃에서는 500 nM의 농도로 첨가된 경우에, 73.4℃에서는 125 또는 500 nM의 농도로 첨가된 경우에 SARS-CoV 바이러스의 N 유전자에 결합하여 증폭을 억제하였다.
실험예 5. PNA 블로커의 온도 및 농도조건에 따른 SARS-CoV-2 바이러스 검출 효과 확인
본 발명에 따른 PNA 블로커의 상기 확인된 온도 및 농도조건에서 SARS-CoV-2 바이러스 검출 효과를 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
구체적으로, 상기 확인된 농도 및 온도조건으로 PNA 블로커를 결합시키고, 주형으로 합성 SARS-CoV-2 바이러스의 RNA 전사체를 사용하여 실시간 RT-qPCR을 수행하였다. 이때, 실시간 RT-qPCR은 상기 실험예 1에 기재된 조건 및 방법으로 수행하고, 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 10에 나타난 바와 같이, PNA 블로커를 500 nM의 농도로 첨가하고, PNA 결합을 73.4℃의 온도에서 수행한 경우에 SARS-CoV-2 바이러스를 효과적으로 검출하였다.
<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> COMPOSITION COMPRISING PRIMER SET AND PNA BLOCKER AND USING THEREOF <130> DP-2020-0180-KR <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV2_forward <400> 1 gcgatcaaaa caacgtcgg 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV2_reverse <400> 2 ataccatctt ggactgaga 19 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV2_probe <400> 3 accgaagagc taccagacga 20 <210> 4 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SARS-CoV2_PNA blocker <400> 4 atcaacacca atagtgg 17

Claims (16)

  1. 표적 유전자를 증폭시키기 위한 서열번호 1 및 2로 기재된 염기서열로 구성되는 프라이머 세트; 및
    상기 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열(conserved sequence)에 특이적으로 결합하는 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성되는 PNA 블로커(peptide nucleic acid blocker)를 포함하고,
    상기 PNA 블로커는 프라이머 세트에 의해 증폭되는 부위에 결합하며,
    상기 프라이머 세트 및 PNA 블로커는 SARS-CoV-2 바이러스를 특이적으로 검출하는 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 PNA 블로커는 SARS-CoV-2 바이러스를 제외한 코로나바이러스과에 속하는 코로나바이러스에 특이적으로 결합하여 교차반응으로 결합된 프라이머의 증폭을 억제하는, 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 조성물.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트는 프로브를 더 포함하는, 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 조성물.
  7. 제1항의 조성물을 포함하는 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 키트로서,
    상기 키트는 SARS-CoV-2 바이러스를 특이적으로 검출하는 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 증폭시키기 위한 키트.
  8. 제1항의 조성물을 이용하여 시료에서 표적 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는, 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 검출하는 방법으로서,
    상기 방법은 SARS-CoV-2 바이러스를 특이적으로 검출하는 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 검출하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 방법은 PNA 블로커의 결합 후, 프라이머 세트의 결합이 진행되는, 교차반응 없이 표적 유전자를 특이적으로 검출하는 방법.
  10. 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성되는 PNA 블로커로서,
    상기 블로커는 SARS-CoV-2 바이러스를 교차반응 없이 특이적으로 검출하는 PNA 블로커.
  11. 표적 유전자를 증폭시키기 위한 서열번호 1 및 2로 기재된 염기서열로 구성되는 프라이머 세트; 및
    상기 표적 유전자와 유사한 서열을 포함하는 유전자들의 보존적 서열에 특이적으로 결합하는 서열번호 4로 기재된 염기서열로 구성되는 PNA 블로커를 포함하고,
    상기 PNA 블로커는 프라이머 세트에 의해 증폭되는 부위에 결합하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병 진단용 조성물..
  12. 제11항에 있어서, 상기 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병은 신종코로나바이러스감염증(COVID-19)인, 진단용 조성물.
  13. 삭제
  14. 제11항의 진단용 조성물을 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병 진단용 키트.
  15. 제11항의 진단용 조성물을 이용하여 시료에서 표적 유전자를 증폭시키는 단계를 포함하는 SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 상기 방법은 PNA 블로커의 결합 후, 프라이머 세트의 결합이 진행되는, SARS-CoV-2 바이러스 감염에 의한 질병 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법.
KR1020200109328A 2020-08-28 2020-08-28 프라이머 세트 및 pna 블로커를 포함하는 조성물 및 이의 용도 KR102392907B1 (ko)

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