KR20200092653A

KR20200092653A - 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20200092653A
Application number: KR1020190009813A
Authority: KR
Inventors: 박기범; 한연수; 조용훈; 배영민
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2019-01-25
Filing date: 2019-01-25
Publication date: 2020-08-04
Also published as: EP3916111A4; BR112021014503A2; WO2020153673A1; EP3916111B1; KR102181996B1; EP3916111A1

Abstract

본 발명은 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 플라비바이러스 진단용 키트 및 플라비바이러스 진단 방법에 관한 것으로, 한 쌍의 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용하여 시료로부터 뎅기 바이러스 1형, 뎅기바이러스 2형, 뎅기바이러스 3형, 뎅기바이러스 4형, 일본뇌염바이러스, 웨스트나일바이러스, 황열바이러스 및 지카바이러스를 높은 민감도로 모두 검출할 수 있다. 또한, 기존 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트의 고질적인 문제인 위양성(false positive) 반응 문제가 개선되어 플라비바이러스의 유입 및 감염을 효과적으로 검출할 수 있다.

Description

플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트 및 이의 용도{Universal Primer Sets for Detecting Flavivirus and Use Thereof}

본 발명은 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트 및 이의 용도에 관한 것이다.

뎅기 바이러스, 황열 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 지카바이러스는 모두 플라비비리대과(family Flaviviridae) 플라비바이러스속(genus Flavivirus)에 속하는 바이러스이며 흰줄숲모기, 이집트숲모기, 빨간집모기, 작은빨간집모기, 금빛숲모기 등 국내외에 서식하는 질병매개모기에 의해 동물과 사람간에, 사람과 사람간에 질병이 전파된다.

뎅기열을 일으키는 뎅기 바이러스는 강한 통증을 일으키는 질병으로 전 세계적으로 100여개국 이상에서 발생하며 전 세계 인구 중 40%인 25억명 가량의 인구가 뎅기 감염증에 노출되고 있는 실정이다. 주로 열대 및 아열대 지역에 분포해 있으며 적도 기준 남북 위도 35도까지 광범위하게 위치하고 있다. 한국의 경우 뎅기열 토착 지역은 아니나 매년 해외에서 감염 후 국내에서 발병되어 신고되는 건수는 꾸준히 증가하여 2001년 6건에서 2016년 313건으로 크게 증가하고 있는 추세이다. 이들 뎅기바이러스의 유전형은 1형, 2형, 3형, 4형까지 보고되어 있으며 감염 시 조기에 치료하면 사망률이 1%이나 중증으로 발전하여 출혈열 증상이 일어날 경우 사망률이 20%까지 증가하는 것으로 알려져 조기진단이 매우 중요한 상황으로 증상 발생 및 완치 후 특이 항체를 이용하여 간편 검사를 실시하거나 증상 초기에 혈액에서 viral RNA를 추출하여 PCR 법으로 바이러스를 조기에 진단하는 방법이 사용되고 있다.

황열병은 아프리카, 남미, 북미 지역에서 유행중인 급성 바이러스 출혈열의 일종으로 황열 바이러스가 원인 병원체로 알려져 있으며 이집트숲모기가 주요 질병 매개체로 알려져 있다. 3 내지 6일간의 잠복기 경과후 발열, 전신통, 구토 등이 발생하며 증상이 생긴 후 적절히 조치하지 못하면 7 내지 10일 사이에 쇼크와 혼수 증상이 나타나게 된다. 이후 황달이 발생할 경우 사망률은 20 내지 50%에 이르는 질병이다. 황열병은 혈액에서 바이러스를 분리하거나 조직검사를 통해 항원/항체 반응을 이용한 바이러스 항원을 검출하는 방법과 검체에서 viral RNA를 추출 뒤 RT-PCR 법으로 바이러스를 유무를 진단하는 방법이 주로 사용되고 있다.

일본뇌염은 일본뇌염 바이러스에 의해 발병하는 질병으로 작은빨간집모기와 빨간집모기가 주요 매개체로 알려져 있다. 일본뇌염의 경우 2018년 기준 국내에 토착화된 모기 매개 바이러스성 질병으로 매년 질병관리본부와 기후 변화 매개체 감시 거점센터에서는 작은빨간집모기를 채집하여 작은빨간집모기 발견 시 전국에 일본뇌염주의보를, 하루 평균 채집 개체수 500마리 이상, 전체 모기 채집량의 50% 초과시 전국에 일본뇌염 경보를 발령하여 공중보건을 지키는데 기여하고 있다. 일본뇌염은 태평양 연안 아시아 지역에서 주로 발견되며 10개 이상의 국가에서 17억명 이상의 인구가 감염 위험에 놓여 있다. 말레이시아와 인도네시아에서는 풍토병화 되어 지속적으로 거주민들을 괴롭히고 있으며 중국, 일본, 한국 등에서는 고온 다습한 여름말. 국내 기준 모기 활동이 왕성한 8월에서 11월 사이에 유행적으로 발병하고 있다. 일본뇌염의 경우 일반적인 바이러스 질병처럼 특별한 치료방법이 없어 예방이 최선인 상황이나 다행히 백신이 개받되어 한국인의 경우 생후 및 유아기경에 백신을 접종하므로 질병발생율이 현격히 낮은 상황이다. 일본뇌염의 진단도 마찬가지로 혈액에서 항체를 이용하여 진단하거나 viral RNA를 추출후 RT-PCR을 이용하여 분자진단을 하는 방식으로 바이러스를 진단하고 있다.

웨스트나일열은 웨스트나일 바이러스에 의해 발생하는 질병으로 국내에서는 2007년 7월 지정전염병으로 고시, 2011년 제4군 법정감염병으로 지정되었다. 국내에서는 2012년경 웨스트나일 사례가 최초로 보고되었으나 이는 아프리카 기니에 거주하다 국내로 들어와 발병한 것으로 역학조사결과 밝혀졌다. 웨스트나일은 새가 보유하고 있다가 모기를 매개로 사람 및 말로 전파되는 질환으로 아프리카, 중동, 유럽에서 유행하고 있으며 미국의 경우 동부지방에서 웨스트나일열이 대규모로 유행하고 있기 때문에 미국과 교류가 많은 우리나라의 경우 사람 또는 수입조류를 통해 웨스트나일열이 국내로 유입될 가능성이 높다고 할 수 있다. 웨스트나일 바이러스도 마찬가지로 검체에서 바이러스를 분리 후 배양하여 확인하는 배양법, 항체를 이용한 항원/항체법, 핵산을 추출하여 RT-PCR 기반 바이러스 특이 유전자를 검출하는 분자진단을 통해 바이러스를 진단할 수 있다.

지카 바이러스는 황열 바이러스, 뎅기 바이러스와 마찬가지로 모기를 통해 전염되며 이집트숲모기와 흰줄숲모기를 통해 전파할 수 있음이 보고되었다. 국내에선 흰줄숲모기가 서식하고 있으므로 토착화가 가능한 주요 매개 질병중의 하나로 여겨지고 있다. 지카 바이러스의 경우 증상이 가벼운 지카열을 발생시키나 임산부에 감염 시 소두증을 앓는 아기를 출산할 수 있음이 제시되었고 수혈과 성접촉을 통해 전염될 수 있음이 보고되어 전 세계적으로 공포가 확산되고 있는 실정이다. 지카 바이러스의 경우 문제성 질병으로 확인된 지 시일이 길지 않기 때문에 항체를 이용한 신속 진단법보다는 viral RNA를 추출하고 RT-PCR법에 의해 지카 바이러스 특이 유전자를 검출하는 분자진단법이 많이 개발되었다.

이들 플라비바이러스속에 속하는 주요 질병원들은 모기를 통해 전파되기 때문에 전세계 각국의 질병관리본부 및 유관기관에서는 지역에서 매년 지속적으로 모기를 채집 후 viral RNA를 추출하고 PCR기반 분자진단을 통해 해당지역에 신규 바이러스가 유입되는지를 지속적으로 감시하는 Bio surveillance 업무를 수행하고 있다. 국내에서는 검역원, 기후 변화 매개체 감시 거점센터, 지자체 보건환경연구원 등에서 관련 업무를 수행하고 있으며 RT-PCR 및 실시간 PCR을 이용하여 뎅기 바이러스, 황열 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 지카 바이러스의 국내 유입을 지속적으로 관찰하고 있다. 이러한 공중보건 업무를 위해 국내에서는 질병매개모기로부터 바이러스를 검출하는 표준시험법을 구축하였으며 이는 Yang 등이 2010년 보고한 논문을 기반으로 작성되었다. 해당 논문에서는 SYBR Green I 기반 실시간 PCR과 플라비바이러스가 공통적으로 보유하고 있는 NS5 유전자 서열을 검출하는 FL-F1. FL-R3, FL-R4 프라이머 셋트를 이용하여 212bp를 검출하는 방법을 제시하였고 융해곡선 분석을 통해 바이러스의 종류를 판별하는 방법을 제시하였다.

2017년 Vina-Rodriguez 등은 신규 플라비바이러스를 검출하기 위해 RT-qPCR과 마이크로어레이기법을 조합하여 신규바이러스를 검출하는 방법을 개발하였는데 이는 Yang과 마찬가지로 플라비바이러스가 보유하고 있는 NS5 유전자 서열을 검출하는 프라이머 세트를 이용하여 시료로부터 바이러스를 검출하고 이후 PCR 산물을 마이크로어레이를 이용하여 분석하는 방법을 제시하였다.

모기로부터 다양한 종류의 바이러스를 검출하는 연구들이 보고되었으나 두 논문에선 위음성과 위양성을 해결하지 못하였으며 특히 국내에서 표준시험법으로 채택하고 있는 Yang의 방법의 경우 시험에 사용하는 프라이머의 구조적 문제로 분자진단의 민감도가 극적으로 저하되고 있으며 프라이머 이합체화(primer dimerization) 문제로 위양성 반응이 강하게 나타난다는 문제가 발생하므로 바이러스의 감염 여부를 재확인하기 위한 추가실험이 수반되는 등의 문제가 발생하고 있다. 따라서 Bio surveillance에 적합한 뎅기 바이러스, 황열 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 지카바이러스의 검출방법의 개발은 전세계적으로 그리고 국가적으로 요구되고 있는 상황이다.

Yang, C. F., et al. (2010). "Screening of mosquitoes using SYBR Green I-based real-time RT-PCR with group-specific primers for detection of Flaviviruses and Alphaviruses in Taiwan." Journal of Virological Methods 168(1-2): 147-151. Vina-Rodriguez, A., et al. (2017). "A Novel Pan-Flavivirus Detection and Identification Assay Based on RT-qPCR and Microarray." Biomed Res Int 2017: 4248756.

본 발명자들은 다양한 플라비바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 범용 프라이머를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 뎅기 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 황열 바이러스 및 지카 바이러스의 염기서열을 정렬하고 보존적인 지역을 선별하여 프라이머의 2차구조분석과 서열 수정(modification)을 통해 최적의 증폭효율과 특이성을 갖는 한 쌍의 프라이머 세트를 제작하고, 상기 프라이머 세트를 이용하는 경우, 높은 민감도로 플라비바이러스의 유입 및 감염을 조기 검출할 수 있음을 규명함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명의 목적은 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 포함하는 플라비바이러스 진단용 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 플라비바이러스 진단 방법을 제공하는데 있다.

본 발명은 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 플라비바이러스 진단용 키트 및 플라비바이러스 진단 방법에 관한 것으로, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하면 시료로부터 다양한 플라비바이러스를 높은 민감도로 검출할 수 있다.

본 발명자들은 다양한 플라비바이러스를 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 범용 프라이머를 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 뎅기 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 황열 바이러스 및 지카 바이러스의 염기서열을 정렬하고 보존적인 지역을 선별하여 프라이머의 2차구조분석과 서열 수정(modification)을 통해 최적의 증폭효율과 특이성을 갖는 한 쌍의 프라이머 세트를 제작하고, 상기 프라이머 세트를 이용하는 경우, 높은 민감도로 플라비바이러스의 유입 및 감염을 조기 검출할 수 있음을 규명하였다.

이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.

본 발명의 일 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 구성된 플라비바이러스(Flavivirus) 검출용 범용 프라이머 세트에 관한 것이다.

본 발명에서 용어 "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 식물체 핵산의 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고, 주형 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다.

본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, LNA(Locked Nucleic Acid), 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트(alkyl phosphorothioate) 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 본 발명의 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머는 LNA(Locked Nucleic Acid)를 포함한다.

본 발명의 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머는 플라비바이러스에 속하는 다양한 바이러스의 검출에 사용될 수 있다.

본 발명에서 용어 "플라비바이러스(Flavivirus)"는 플라비비리대 (Flaviviridae)과의 플라비바이러스(Flavivirus) 속에 속하는 40-50 nm 크기의 양성 단일 가닥 RNA 바이러스로, 모기나 진드기가 주요 매개체이며, 감염시 동물이나 사람에게 열성 또는 뇌염질환을 일으킨다.

본 발명의 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머를 이용하여 검출 가능한 플라비바이러스는 뎅기 바이러스(Dengue virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 황열 바이러스(Yellow fever virus) 및 지카 바이러스(Zika virus)이다.

본 발명의 다른 일 양태는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 구성된 플라비바이러스(Flavivirus) 검출용 범용 프라이머 세트를 포함하는 플라비바이러스 진단용 키트에 관한 것이다.

상기 키트는 시료로부터 플라비바이러스를 진단 또는 검출하는데 사용될 수 있다.

상기 키트는 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 구성된 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성 성분 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다.

상기 키트는 PCR 분석을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 조성물일 수 있고, 상기 각각의 프라이머 세트 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액(pH 및 마그네슘 농도는 다양), 데옥시뉴클레오타이드(dNTPs), Taq-폴리머라아제와 같은 효소, DNase, RNAse 억제제, DEPC-수(DEPCwater) 및 멸균수 등을 포함할 수 있다.

상기 키트는 특정한 형태로 한정되는 것은 아니며, 다양한 형태로 구현될 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 용기(예컨대, 일회용 PCR 튜브 등)에 담겨 있는 동결 건조된(lyophilized) 프라이머 세트를 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 일 양태는 다음 단계를 포함하는 플라비바이러스(Flavivirus) 진단 방법에 관한 것이다:

(a) 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;

(b) 추출된 RNA를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)을 수행하는 단계;

(c) 상기 (b) 단계의 반응물을 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

(d) 상기 (c) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계.

상기 (a) 단계의 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 정액 및 체액으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 플라비바이러스가 검출될 수 있는 시료이면 어느 것이나 사용 가능하고, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에서, 시료 내 목적 바이러스에서 얻어진 총 RNA로부터 합성된 cDNA에 결합하는 프라이머 쌍을 이용하여 유전자 증폭 반응을 실시할 수 있다.

상기 프라이머 세트를 이용하여 실시하는 단계 (b)의 RT-PCR 조건은 40 내지 60℃에서 5분 내지 30분 동안 반응시켜 실시할 수 있으나, 당업자의 기술 수준에서 이해할 수 있는 통상의 방법에 따라 수행될 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.

상기 프라이머 세트를 이용하여 실시하는 단계 (c)의 PCR 조건은 90 내지 97℃, 2 내지 15분간 반응하고 다시 90 내지 97℃에서 5초 내지 30초, 56 내지 60℃에서 5초 내지 1분, 72℃에서 10초 내지 1분, 80 내지 85℃에서 2초 내지 10초로 30 내지 45 사이클로 증폭하여 실시할 수 있으나, 당업자의 기술 수준에서 이해할 수 있는 통상의 방법에 따라 수행될 수 있어 특별히 제한하지는 않는다.

상기 (b) 단계 및 (c) 단계는 단일 튜브에서 연속적으로 수행되는 것일 수 있다.

상기 (d) 단계의 증폭 산물의 검출은 모세관 전기영동, DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 및 인광 측정으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 상기 증폭 산물 검출할 수 있는 것이면 당업계에 공지된 어느 것이나 사용 가능하고, 이에 제한되지 않는다.

상기 검출 단계에서 257 bp의 증폭산물을 수득한 경우, 시료에 플라비바이러스가 감염되었다고 판정할 수 있고, 융해곡선 분석결과 시료의 melting peak가 81℃ 이상으로 관찰될 경우 시료에 플라비바이러스가 감염되었다고 판정할 수 있다.

본 발명은 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트, 상기 프라이머 세트를 포함하는 플라비바이러스 진단용 키트 및 플라비바이러스 진단 방법에 관한 것으로, 한 쌍의 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용하여 시료로부터 뎅기 바이러스 1형, 뎅기 바이러스 2형, 뎅기 바이러스 3형, 뎅기 바이러스 4형, 일본뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 황열 바이러스 및 지카 바이러스를 높은 민감도로 모두 검출할 수 있다. 또한, 기존 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트의 고질적인 문제인 위양성(false positive) 반응 문제가 개선되어 플라비바이러스의 유입 및 감염을 효과적으로 검출할 수 있다.

도 1은 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트 제작을 위해 사용된 플라비바이러스 유전체 서열에 대한 정보이다.
도 2는 진단법 검증용 인공 바이러스 서열 합성을 위해 제작한 벡터에 관한 도면이다.
도 3a는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용한 DENV4 검출 결과이다.
도 3b는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용한 DENV3 검출 결과이다.
도 3c는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용한 DENV2 검출 결과이다.
도 3d는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용한 DENV1 검출 결과이다.
도 3e는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용한 YFV 검출 결과이다.
도 3f는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용한 ZIKA 검출 결과이다.
도 3g는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용한 JEV 검출 결과이다.
도 3h는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용한 WNV 검출 결과이다.
도 4a는 희석한 RNA panel 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 증폭곡선이다.
도 4b는 희석한 RNA panel 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 융해곡선이다.
도 4c는 DENV1에 대해 RNA panel 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하여 확인한 증폭곡선 및 융해곡선이다.
도 4d는 DENV2에 대해 RNA panel 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하여 확인한 증폭곡선 및 융해곡선이다.
도 4e는 DENV3에 대해 RNA panel 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하여 확인한 증폭곡선 및 융해곡선이다.
도 4f는 DENV4에 대해 RNA panel 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 확인한 증폭곡선 및 융해곡선이다.
도 4g는 JEV ANYANG300에 대해 RNA panel 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하여 확인한 증폭곡선 및 융해곡선이다.
도 4h는 WNV2에 대해 RNA panel 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하여 확인한 증폭곡선 및 융해곡선이다.
도 4i는 YFV에 대해 RNA panel 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하여 확인한 증폭곡선 및 융해곡선이다.
도 4j는 ZIKA에 대해 RNA panel 기반 역전사 실시간 중합효소연쇄반응을 실시하여 확인한 증폭곡선 및 융해곡선이다.
도 5a는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용한 DENV4 검출 결과이다.
도 5b는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용한 DENV3 검출 결과이다.
도 5c는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용한 DENV2 검출 결과이다.
도 5d는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용한 DENV1 검출 결과이다.
도 5e는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용한 YFV 검출 결과이다.
도 5f는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용한 ZIKA 검출 결과이다.
도 5g는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용한 JEV 검출 결과이다.
도 5h는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용한 WNV 검출 결과이다.
도 6a는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용하여 DENV1에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 6b는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용하여 DENV3에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 6c는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용하여 DENV2에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 6d는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용하여 DENV4에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 6e는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용하여 JEV에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 6f는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용하여 YFV에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 6g는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용하여 WNV에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 6h는 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트를 이용하여 ZIKA에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 7a는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용하여 DENV1에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 7b는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용하여 DENV3에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 7c는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용하여 DENV2에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 7d는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용하여 DENV4에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 7e는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용하여 JEV에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 7f는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용하여 YFV에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 7g는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용하여 WNV에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.
도 7h는 매개체 감염 플라비바이러스 표준시험법에 제시된 프라이머 세트를 이용하여 ZIKA에 대해 실시한 역전사 실시간 중합효소연쇄반응의 Ct값 변화를 통한 직진성 평가 결과이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 플라비바이러스 검출을 위한 프라이머 제작

뎅기 바이러스 1형 1993종, 뎅기 바이러스 2형 1471종, 뎅기 바이러스 3형 943종, 뎅기 바이러스 4형 228종, 일본뇌염(1형, 2형, 3형, 4형, 5형) 335종, 웨스트나일 바이러스(1형, 2형) 1414종, 황열 바이러스 147종, 지카 바이러스(아프리카형, 아시아형) 766종을 다중서열정렬 후 가장 보존적인 지역을 선별 후 프라이머의 2차구조분석과 서열 modification을 통해 최적의 증폭효율과 특이성을 갖는 한 쌍의 프라이머 세트를 제작하였다(표 1).

프라이머 이름	염기서열(5'-3')	서열번호
L2CNU3-F_Pflavi	T+ACA+ACAT+GATGGGVAARAGAGARAARAA	1
L2CNU3-R5_Pflavi	C+CR+GCRGTRTCATCRGCRTASA	2

+A, +T, +G, +C는 LNA(locked nucleic acid)를 의미함

Virus	Genbank no.	관련 서열번호	L2CNU3-F_Pflavi 위치	L2CNU3-R5_Pflavi 위치
DENV1	MF314188	3
DENV2	MF314189	4
DENV3	KF954947	5
DENV4	HQ332173	6
Zika virus	KU501216	7
Yellow fever virus	JN628281	8
Japanese encephalitis virus anyang300	KF711994	9
West Nile virus	KT359349	10

실시예 2: 제작한 프라이머를 이용하여 플라비바이러스 검출

2-1. 벡터 제작

뎅기, 지카, 웨스트 나일 등 인체에 유해한 바이러스의 경우, 배양하기 어렵고 바이러스의 위험성으로 인해 생물안전 3등급 이상의 시설에서만 다룰 수 있다. 분자 진단 마커를 개발하고자 할 때, 바이러스의 genome 정보를 알고 있다면 target region만 부분적으로 합성하여 PCR 기반 분자진단의 template으로 사용할 수 있다.

본 발명에 사용된 합성유전자는 ㈜바이오니아의 유전자합성 서비스를 이용하여 새롭게 합성하였으며 유전정보는 표 2에 명시된 genbank DB를 참조하였다.

합성유전자는 pBHA 플라스미드 벡터에 삽입한 형태의 dsDNA로 입수하였다(도 2). 그러나 플라비바이러스는 RNA 바이러스이므로 dsDNA를 곧바로 사용할 경우 실제와 다를 수 있기 때문에 합성된 dsDNA를 template 으로 하여 RNA를 전사시킨 다음, 정제 후 진단마커의 template 으로 사용하였다.

이를 위하여 합성서열의 5’ 말단에 TAATACGACTCACTATAGGG TTTGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGG(서열번호 11)와 3’ 말단에 CCACCGCTGAGCAATAACTAGCTTTCCCTATAGTGAGTCGTATTA(서열번호 12) 를 추가하였다.

Panel(KT359349|West Nile virus2|2014/hun를 예로 들면 다음과 같다.

TAATACGACTCACTATAGGG TTTGCTAGTTATTGCTCAGCGGTGGGTGGAGAATGCAACACCTGCATCTACAACATGATGGGAAAGAGAGAGAAGAAGCCTGGAGAGTTCGGCAAAGCTAAAGGCAGCAGAGCCATTTGGTTCATGTGGCTAGGGGCCCGCTTCCTGGAGTTTGAAGCTCTCGGATTCCTCAATGAAGACCACTGGCTGGGTAGGAAGAACTCAGGAGGAGGAGTTGAAGGCTTAGGACTGCAGAAGCTTGGGTACATCTTGAAGGAAGTCGGAACAAAGCCTGGAGGAAAGATCTACGCCGATGATACCGCAGGCTGGGACACACGCATCACCAAAGCTGACCTCGAGAACCACCGCTGAGCAATAACTAGCTTTCCCTATAGTGAGTCGTATTA

상기 밑줄로 표시한 TAATACGACTCACTATAGGG 서열은 T7 promoter sequence 로서 해당서열이 존재 시 T7 RNA polymerase가 T7 promoter 에 결합하여 DNA를 template 으로 RNA를 전사할 수 있다. 이후 합성된 dsRNA를 template 으로 분자진단마커의 민감도와 정확도를 평가하였다.

2-2. 검출시험

시료로부터 RNA를 분리하고, 표 3의 조성으로 표 4의 조건에 따라 동일한 튜브에서 Reverse transcription과 PCR이 연차적으로 일어나는 1step RT-PCR 로 PCR을 수행하였다.

요소	사용량
2x PCR master mix	10ul
Primer (10pmole/ul) Fw	1ul
Primer (10pmole/ul) Rev	1ul
RNA	5ul
Molecular biology grade water	3ul

단계	온도	시간	반복 수
RT reaction	50℃	15min	1cycle
Hot start	95℃	10min	1cycle
Denature	95℃	10sec	40cycle
Annealing	58℃	15sec
Extension	72℃	15sec
Detection	83℃	5sec
Dissociation	65℃-95℃ 0.5℃/5sec

실시예 1에서 제작한 프라이머를 이용하여 검출시험을 수행한 결과, 뎅기 바이러스 1형, 뎅기 바이러스 2형, 뎅기 바이러스 3형, 뎅기 바이러스 4형, 일본뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스, 황열 바이러스, 지카 바이러스를 모두 검출(257 bp)할 수 있었다(도 3a 내지 도 3h). 낮은 농도와 No template control에서 primer dimer가 관찰되지 않았다. 모든 바이러스가 검출되었으며, PCR band도 뚜렷하게 나타났다.

뎅기 바이러스 3형의 경우 최소 3카피까지 검출이 가능하였고 뎅기 바이러스 4형, 2형의 경우 30카피까지 뎅기바이러스 1형, 황열병, 지카 바이러스, 일본뇌염 바이러스, 웨스트나일 바이러스의 경우 300카피까지 검출이 가능하였다(표 5).

특이도와 민감도를 높이기 위한 올리고뉴클레오티드 서열 modification 및 프라이머 구조최적화를 통해 선별한 본 발명의 프라이머 세트의 최저한계 검출농도는 3 내지 300 copies/rxn로 기존 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트의 최저한계 검출농도인 300만 copies/rxn에 비하여 현저히 개선되었다. 그에 따라, 기존 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트의 고질적인 문제인 위양성(false positive) 문제가 발생하지 않는다.

실시간 1step 역전사 중합효소연쇄반응 실험결과

시료	Virus	Copies/reaction	Cq	Melting temperature
1	DENV1	3*E9	9.74	81.5
2	DENV1	3*E8	14.52	81.5
3	DENV1	3*E7	17.48	81.5
4	DENV1	3*E6	21.24	81.5
5	DENV1	3*E5	25.07	81.5
6	DENV1	3*E4	28.83	81.5
7	DENV1	3*E3	31.85	81.5
8	DENV1	3*E2	38.04	82
9	DENV1	3*E1	No Cq	74.5
10	DENV1	3*E0	No Cq	67.5
11	DENV2	3*E9	10.28	82
12	DENV2	3*E8	15.84	82
13	DENV2	3*E7	18.56	82
14	DENV2	3*E6	22.23	82
15	DENV2	3*E5	26.1	82
16	DENV2	3*E4	29.81	82.5
17	DENV2	3*E3	33.57	82.5
18	DENV2	3*E2	36.49	82.5
19	DENV2	3*E1	39.22	83.5
20	DENV2	3*E0	No Cq	75
21	DENV3	3*E9	8.54	81.5
22	DENV3	3*E8	12.93	81.5
23	DENV3	3*E7	16.36	81.5
24	DENV3	3*E6	19.98	81.5
25	DENV3	3*E5	23.99	81.5
26	DENV3	3*E4	27.7	81.5
27	DENV3	3*E3	32.02	82
28	DENV3	3*E2	35.42	82
29	DENV3	3*E1	36.97	82.5
30	DENV3	3*E0	39.09	85.5
31	DENV4	3*E9	13.69	82.5
32	DENV4	3*E8	18.4	82.5
33	DENV4	3*E7	20.34	82.5
34	DENV4	3*E6	23.97	82.5
35	DENV4	3*E5	27.83	82.5
36	DENV4	3*E4	31.42	82.5
37	DENV4	3*E3	35	83
38	DENV4	3*E2	39	83
39	DENV4	3*E1	No Cq	65
40	DENV4	3*E0	No Cq	65
41	JEV ANYANG	3*E9	10.74	83.5
42	JEV ANYANG	3*E8	15.33	83
43	JEV ANYANG	3*E7	18.46	83
44	JEV ANYANG	3*E6	22.19	83.5
45	JEV ANYANG	3*E5	26.1	83.5
46	JEV ANYANG	3*E4	29.9	83.5
47	JEV ANYANG	3*E3	33.7	83.5
48	JEV ANYANG	3*E2	38.24	84
49	JEV ANYANG	3*E1	No Cq	65
50	JEV ANYANG	3*E0	No Cq	95
51	WNV	3*E9	11.72	83.5
52	WNV	3*E8	16.62	83.5
53	WNV	3*E7	19.87	83.5
54	WNV	3*E6	23.66	83.5
55	WNV	3*E5	27.53	84
56	WNV	3*E4	31.35	84
57	WNV	3*E3	34.66	84
58	WNV	3*E2	36.56	85
59	WNV	3*E1	No Cq	65
60	WNV	3*E0	No Cq	67.5
61	YFV	3*E9	9.48	83
62	YFV	3*E8	14.12	83
63	YFV	3*E7	16.99	83
64	YFV	3*E6	20.78	83
65	YFV	3*E5	24.55	83
66	YFV	3*E4	28.19	83
67	YFV	3*E3	32.14	83
68	YFV	3*E2	36.35	83
69	YFV	3*E1	No Cq	67
70	YFV	3*E0	No Cq	67.5
71	ZIKA	3*E9	10.45	83
72	ZIKA	3*E8	15.03	83
73	ZIKA	3*E7	18.22	83
74	ZIKA	3*E6	22.04	83
75	ZIKA	3*E5	26.18	83.5
76	ZIKA	3*E4	30.28	83.5
77	ZIKA	3*E3	33.96	83.5
78	ZIKA	3*E2	36.87	83.5
79	ZIKA	3*E1	No Cq	67.5
80	ZIKA	3*E0	No Cq	67
81	NTC	NTC	No Cq	76.5
82	NTC	NTC	No Cq	75.5

상기 프라이머 세트를 이용한 경우, 음성대조군에서도 증폭곡선과 융해곡선이 전혀 관찰되지 않음으로써 재실험의 횟수를 줄이고, 추가 분석 시험의 시간과 비용을 절약하며, 보다 민감한 검출을 통해 바이러스 유입 또는 감염의 조기 검출을 가능하게 한다(도 4a 및 도 4b).

2-3. 매개체 감염 플라비바이러스 진단을 위한 질병관리본부 표준시험법과의 비교

매개체 감염 플라비바이러스 검출 표준시험법에 따르면 Verso SYBR Green 1-Step RT-qPCR, Thermo Fisher Scientific을 이용하여 Real time PCR 수행 후 Melting curve 기반으로 양성을 판별한다.

병원체 검출용 Primer 정보

Name	Polarity	Sequence (5' to 3')	서열번호
FL-F1	sense	GCCATATGGTACATGTGGCTGGGAGC	13
FL-R3	antisense	GTKATTCTTGTGTCCCAWCCGGCTGTGTCATC	14
FL-R4	antisense	GTGATGCGRGTGTCCCAGCCRGCKGTGTCATC	15

사용한 시약 조성

Reaction mixture	Volume	Final concentration
Verso Enzyme Mix	0.25㎕
1-Step QPCR SYBR ROX Mix	12.5㎕	1X
RT Enhancer	1.25㎕
Forward primer, FL-F1 (1uM)	1.75㎕	70nM
Reverse primer, FL-R3 (1uM)	1.75㎕	70nM
Reverse primer, FL-R4 (1uM)	1.75㎕	70nM
ultra pure water	0.75㎕
RNA	5㎕	1pg~100ng
Total reaction volume	25㎕

Realtime-Reverse Transcription-PCR 조건

Step	Temperature	Time	Cycle
cDNA synthesis	50℃	30min	1 cycle
Inactivation of Reverse transcriptase	95℃	15min	1 cycle
Denaturation	94℃	15sec	45cycles
Annealing	58℃	20sec
Extension*	72℃	30sec
* 이 step에서 fluorescent signal을 읽도록 설정해 놓는다.

융해곡선분석방법

단계	온도	설명
Denaturation	95℃	30sec
Starting temp.	60℃	30sec
Melting step	~ 90℃	0.5℃씩 가열/cycle, 각 사이클당 10초간 유지 및 형광분석

Amplification plot 분석에서 보이는 형광시그널이 바이러스 특이적인 산물인지 아니면 primer dimer나 비특이적 산물인지를 감별하기 위해 다음과 같은 조건으로 melt curve analysis (융해곡선분석)를 수행한다.

융해곡선기반 양성판정

매개질병명	융해온도
일본뇌염 바이러스	83-84℃
웨스트나일 바이러스	83-84℃
뎅기열 바이러스	81-82℃
Negative control (primer dimer)	79℃

Amplification plot에서 형광시그널이 확인되고 융해곡선 분석결과 바이러스 특이적인 융해온도가 확인되면 양성으로 판정한다. 최종판정은 클로닝 또는 다이렉트시퀀싱을 통한 염기서열분석을 통해 내려진다.

상기 방법을 통해 PCR을 수행한 후 증폭산물에 대하여 전기영동을 실시한 결과, 낮은 농도의 template와 No template control에서 강한 primer dimer가 관찰되었고, band가 선명하지 않았으며 WNV는 검출되지 않았다(도 5a 내지 도 5h).

본 발명의 상기 프라이머 세트(표 1)는 질병관리본부 표준시험법에 기재된 프라이머 세트(표 6)에 비하여 최대 100만배 높은 민감도를 나타냈다(도 3 및 도 5).

본 발명의 프라이머 세트(도 6a 내지 도 6h)와 질병관리본부 표준시험법에 기재된 프라이머 세트(도 7a 내지 도 7h)에 대하여 Template 희석 배수에 따른 Ct값의 변화를 통한 직진성을 평가하였다. R²값이 1에 가까울 수록 직진성이 높다. 직진성이 낮을 경우 목표 유전자의 양과 상관 없이 CT 값이 측정되므로 정량이 어렵다. 본 발명의 프라이머 세트를 이용한 경우, R²값은 평균 0.99로 1에 가깝게 나타났으나, 질병관리본부의 검출 프라이머 세트를 이용한 경우에 R²값은 0.75로 직진성이 낮게 나타났다.

PCR 효율은 90-110%의 효율이 이상적이며 90% 보다 매우 낮을 경우 유전자 검출 민감도가 낮아지며 110%보다 높을 경우 거짓 양성 반응이 나타나거나 PCR inhibitor가 샘플 내에 높을 경우 발생한다.

Template 희석 배수에 따른 PCR 효율 평가(본 발명의 검출 방법)

	Slope	Efficiency
DENV1	-3.621	88.87166
DENV2	-3.54	91.35902
DENV3	-3.423	95.94825
DENV4	-3.353	98.71945
JEV ANYANG 300	-3.678	87.0195
WNV	-3.712	85.95016
YFV	-3.57	90.59524
ZIKA	-3.846	81.97444

표 11에서 보는 바와 같이, 본 발명의 검출 방법의 경우, 80-100%의 PCR 효율을 나타냈다.

Template 희석 배수에 따른 PCR 효율 평가(질병관리본부 표준시험법)

	Slope	Efficiency
DENV1	-1.64479	305.4909
DENV2	-1.56418	335.8247
DENV3	-1.67188	296.3962
DENV4	-1.788	262.4801
JEV ANYANG 300	-1.6023	320.8251
WNV	-0.48958	10930.24
YFV	-1.73806	276.1438
ZIKA	-1.778	265.115

표 12에서 보는 바와 같이, 질병관리본부 표준시험법의 경우, 265-10930%의 PCR 효율을 나타낸다. 이러한 결과는 Primer dimer에 의한 거짓 양성반응으로 인해 template이 양이 적은 샘플에서도 높은 CT값이 나타났을 때 발생한다.

<110> INDUSTRY FOUNDATION OF CHONNAM NATIONAL UNIVERSITY <120> Universal Primer Sets for Detecting Flavivirus and Use Thereof <130> PN190002 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L2CNU3-F_Pflavi <400> 1 tacaacatga tgggvaarag agaraaraa 29 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L2CNU3-R5_Pflavi <400> 2 ccrgcrgtrt catcrgcrta sa 22 <210> 3 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panel(MF314188|Dengue virus 1|2016_Singapore_DENV-1_NPHL <400> 3 agggaaaatg tgctacgtgt gtttacaaca tgatggggaa gagagagaaa aagctaggag 60 aatttggaaa ggcaaaagga agtcgtgcaa tatggtacat gtggttggga gcacgctttc 120 tagagttcga agctcttggt ttcatgaacg aagaccactg gttcagcaga gagaattcac 180 tcagcggagt ggaaggagaa ggactccaca aacttggata tatactcaga gacatatcaa 240 agattccagg gggaaacatg tacgctgatg acacagccgg atgggataca aggataacag 300 aggacgacct tcagaa 316 <210> 4 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panel(MF314189|Dengue virus 2|2016_Singapore_DENV-2_NPHL <400> 4 aaggaaagtg tgagacatgt gtgtataaca tgatgggaaa gagagagaag aagctagggg 60 agttcggcaa agcaaaaggc agcagagcca tatggtacat gtggcttgga gcacgcttct 120 tagagtttga agccctggga ttcttgaatg aagatcactg gttttccaga gagaactccc 180 tgagtggagt agaaggagaa gggctgcaca aactaggcta cattctaaga gacgtgagta 240 agaaagaagg aggagcaatg tacgccgatg acaccgcagg atgggacaca agaatcacgc 300 tagaggactt gaaaaa 316 <210> 5 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panel(KF954947|Dengue virus 3|13GDZDVS30C-China <400> 5 tgggcaagtg tggaagctgt gtttacaaca tgatgggcaa gagagagaag aaacttggag 60 agtttggcaa agcaaaaggc agtagagcta tatggtacat gtggttggga gccaggtacc 120 ttgagttcga agcccttgga ttcttaaatg aagaccactg gttctcgcgt gaaaactctt 180 acagtggagt agaaggagaa ggactgcaca agctaggcta catattaagg gacatttcca 240 agatacccgg aggagccatg tatgctgatg acacagctgg ttgggacaca agaataacag 300 aagatgacct gcacaa 316 <210> 6 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panel(HQ332173|Dengue virus 4|VE_61110_2007 <400> 6 aagggaaatg tgaatcgtgt gtctataaca tgatgggaaa acgtgagaaa aagttaggag 60 agtttggcag agccaaggga agccgagcaa tctggtatat gtggctggga gcgcggtttc 120 tggaatttga agccctgggt tttttgaatg aagatcactg gtttggcaga gaaaactcat 180 ggagtggagt ggaaggggaa ggtctgcaca gattgggata catcctggag gagatagaca 240 agaaggatgg agacctaatg tatgctgatg acacagcagg ctgggacaca agaatcactg 300 aggatgatct tcaaaa 316 <210> 7 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panel(KU501216|Zika virus|103344 <400> 7 gaggagagtg ccagagttgt gtgtacaaca tgatgggaaa aagagaaaag aaacaagggg 60 aatttggaaa ggccaagggc agccgcgcca tctggtatat gtggctaggg gctagatttc 120 tagagttcga agcccttgga ttcttgaacg aggatcactg gatggggaga gagaactcag 180 gaggtggtgt tgaagggctg ggattacaaa gactcggata tgtcctagaa gagatgagtt 240 gcataccagg aggaaggatg tatgcagatg acactgctgg ctgggacacc cgcatcagca 300 ggtttgatct ggagaa 316 <210> 8 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panel(JN628281|Yellow fever virus|17D Flavimun TVX <400> 8 aaggcaggtg tcggacttgt gtgtacaaca tgatggggaa aagagagaag aagctgtcag 60 agtttgggaa agcaaaggga agccgtgcca tatggtatat gtggctggga gcgcggtatc 120 ttgagtttga ggccctggga ttcctgaatg aggaccattg ggcttccagg gaaaactcag 180 gaggaggagt ggaaggcatt ggcttacaat acctaggata tgtgatcaga gacctggctg 240 caatggatgg tggtggattc tacgcggatg acaccgctgg atgggacacg cgcatcacag 300 aggcagacct tgatga 316 <210> 9 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panel(KF711994|Japanese encephalitis virus|Anyang300 <400> 9 gaggagagtg tcacacatgt atctacaata tgatggggaa aagagagaag aaacctggag 60 agtttggaaa agctaaagga agcagggcca tttggttcat gtggcttgga gcacggtatc 120 tagagtttga agctttgggg ttcctgaatg aagaccattg gctgagccga gagaattcag 180 gaggtggagt ggaaggctca ggcgtccaaa agctgggata catcctccgt gacatagcag 240 gaaagcaagg agggaaaatg tacgctgatg acaccgccgg atgggacact agaattacca 300 gaactgattt agaaaa 316 <210> 10 <211> 316 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Panel(KT359349|West Nile virus2|2014/hun <400> 10 gtggagaatg caacacctgc atctacaaca tgatgggaaa gagagagaag aagcctggag 60 agttcggcaa agctaaaggc agcagagcca tttggttcat gtggctaggg gcccgcttcc 120 tggagtttga agctctcgga ttcctcaatg aagaccactg gctgggtagg aagaactcag 180 gaggaggagt tgaaggctta ggactgcaga agcttgggta catcttgaag gaagtcggaa 240 caaagcctgg aggaaagatc tacgccgatg ataccgcagg ctgggacaca cgcatcacca 300 aagctgacct cgagaa 316 <210> 11 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 5' end <400> 11 taatacgact cactataggg tttgctagtt attgctcagc ggtgg 45 <210> 12 <211> 45 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 3' end <400> 12 ccaccgctga gcaataacta gctttcccta tagtgagtcg tatta 45 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FL-F1 <400> 13 gccatatggt acatgtggct gggagc 26 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FL-R3 <400> 14 gtkattcttg tgtcccawcc ggctgtgtca tc 32 <210> 15 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FL-R4 <400> 15 gtgatgcgrg tgtcccagcc rgckgtgtca tc 32

Claims

서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 구성된 플라비바이러스(Flavivirus) 검출용 범용 프라이머 세트.
제 1 항에 있어서, 상기 플라비바이러스는 뎅기 바이러스(Dengue virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 황열 바이러스(Yellow fever virus) 및 지카 바이러스(Zika virus)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 플라비바이러스 검출용 범용 프라이머 세트.
서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트로 구성된 플라비바이러스(Flavivirus) 검출용 범용 프라이머 세트를 포함하는 플라비바이러스 진단용 키트.
제 3 항에 있어서, 상기 플라비바이러스는 뎅기 바이러스(Dengue virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 황열 바이러스(Yellow fever virus) 및 지카 바이러스(Zika virus)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 플라비바이러스 진단용 키트.
다음 단계를 포함하는 플라비바이러스(Flavivirus) 진단 방법:
(a) 시료로부터 RNA를 추출하는 단계;
(b) 추출된 RNA를 주형으로 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription PCR)을 수행하는 단계;
(c) 상기 (b) 단계의 반응물을 주형으로 하고, 서열번호 1 및 서열번호 2의 프라이머 세트를 이용하여 PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
(d) 상기 (c) 단계의 증폭 산물을 검출하는 단계.
제 5 항에 있어서, 상기 플라비바이러스는 뎅기 바이러스(Dengue virus), 일본뇌염 바이러스(Japanese encephalitis virus), 웨스트나일 바이러스(West Nile virus), 황열 바이러스(Yellow fever virus) 및 지카 바이러스(Zika virus)로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 플라비바이러스 진단 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 정액 및 체액에서 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것인, 플라비바이러스 진단 방법.