KR102320260B1

KR102320260B1 - 웨스트나일 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102320260B1
Application number: KR1020200087325A
Authority: KR
Inventors: 장제윤; 이수영
Original assignee: 대한민국
Priority date: 2020-07-15
Filing date: 2020-07-15
Publication date: 2021-11-01

Abstract

본 발명은 웨스트나일 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명에 따른 웨스트나일 바이러스 검출용 분자마커를 이용하면 단시간 내 특이적이고 효율적인 웨스트나일 바이러스의 검출 또는 웨스트나일열의 진단이 가능할 수 있으므로, 신종감염병 발생에 대비하고, 감염병 발생 시 조기 진단을 통하여 감염병 확산의 차단이 가능할 것으로 사료된다.

Description

웨스트나일 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for specifically detecting West nile virus and uses thereof}

본 발명은 웨스트나일 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

최근 급격한 기후변화로 인해 전 세계적으로 모기 매개 감염병 발생이 증가하고 있으며, 우리나라도 해외여행 및 국제교류 증가로 인해 이러한 모기 매개 감염병의 국내 유입 가능성이 증대되고 있다. 국외유입 감염병은 지속적으로 증가하여 2010년 이후 매해 300-400여 명이 보고되었고 2014년과 2015년에도 각각 400명과 491명이 발생하여 증가 추세에 있다. 2015년에 신고된 주요 국외유입 감염병은 뎅기열(52%), 말라리아(14%), 세균성이질·A형간염(각 5%), 장티푸스(4%) 등이다. 유입 국가는 필리핀, 인도네시아, 태국, 인도, 중국, 베트남, 미얀마, 말레이시아 등 아시아 지역(약 84%)에 주로 분포하고 적도기니, 남수단 등 아프리카 지역(약 13%)에 일부 분포한다. 일반적으로 모기 매개 바이러스에 의한 인체 감염은 암컷 모기가 사람을 물때 발생한다. 대표적인 모기 매개 바이러스에 의한 질병은 말라리아, 뎅기 감염증(뎅기열), 웨스트나일열, 치쿤구니야열, 황열, 일본뇌염 등이 있으며, 연간 700만명 이상이 감염이 되고 전세계적으로 발생하며 감염으로 인한 사망자가 많은 편이다.

웨스트나일열은 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus)에 감염되어 발병하는 감염병으로, 사람을 비롯하여 말, 조류, 개, 고양이 등 다양한 종류의 동물에 감염되는 인수공통 감염병이다. 웨스트나일 바이러스는 1973년 우간다 웨스트나일 지역에서 발열을 주 증상으로 하는 여성에게서 처음으로 분리되었고 그 후 아프리카, 아시아, 호주 및 유럽에서 발병이 보고된 바 있다. 국내에서는 2007년 7월 지정전염병, 2011년 법정감염병으로 지정되었다.

웨스트나일열은 빨간집 모기군이 매개가 되어 발생하는 급성 감염병 질환으로 수혈, 장기이식, 모유 수유를 통해 전파될 수 있으므로 환자 발생 시에 주의가 필요하지만 일반적인 접촉자 관리는 필요하지 않다. 감염자 중 약 70-80%가 특별한 증세를 보이지 않고 자연회복을 통해 치유되지만 감염자의 1% 미만이 신경계 침습질환인 수막염, 뇌염, 급성이완성 마비 등으로 이어진다. 주요 숙주로는 지빠귀종(Turdus migratorius), 북부 홍관조(Cardinalis cardinalis), 집참새종(Passer domesticus), 블루종(Cyanocitta cristata), 북부 흉내지빠귀(Mimus polyglottos), 서부 미국어치의 일종(Aphelocoma californica), 미국 까마귀(Corvus brachyrhynchos), 미국 까치(Pica hudsonia) 등이 있다.

현재까지 특화 치료약은 없으나 신경 증상이 나타나는 바이러스성 뇌염에 중해 치료하게 되며, 중증 감염환자의 일부는 인공호흡기와 같은 중환자실 치료가 필요 할 수 있다. 국내의 경우 2012년 9월 해외 유입 사례가 최초로 보고된 이후 2018년까지 국내 발생사례는 없었다.

한편, 한국등록특허 제1236197호에는 '웨스트나일바이러스와 일본뇌염바이러스의 감별 진단'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2019-0002894호에는 '다중 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 모기 매개 바이러스 검출세트 및 검출방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 '웨스트나일 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도'에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 웨스트나일 바이러스의 E (envelope protein) 유전자 또는 NS (non-structural protein) 유전자에 대한 염기서열 정렬을 통하여 웨스트나일 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 염기서열 부위를 선별하였고, 선별된 부위의 서열을 기반으로 프라이머 세트를 제작하였다. 제작된 프라이머 세트들과 합성된 웨스트나일 RNA 주형을 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행한 결과, 비특이적 증폭 반응이 나타나지 않으면서, 합성된 RNA 주형의 100 fg 농도까지 검출이 가능하고, 지카 바이러스, 치쿤구니아 바이러스, 일본뇌염 바이러스 및 뎅기 바이러스 RNA 시료에 대해서는 교차 반응이 없는, 2개의 웨스트나일 바이러스 특이적 프라이머 세트를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 웨스트나일 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 웨스트나일열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료, 또는 야생에서 수집된 모기 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 웨스트나일 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 웨스트나일 바이러스 검출용 분자마커를 이용하면 단시간 내 특이적이고 효율적인 웨스트나일 바이러스의 검출 또는 웨스트나일열의 진단이 가능할 수 있으므로, 신종감염병 발생에 대비하고, 군과 같은 특수 목적의 집단생활을 하는 곳에서 감염병 발생 시 조기 진단을 통하여 감염병 확산의 차단이 가능할 것으로 사료된다.

도 1은 5개의 프라이머 세트를 이용한 converntional RT-PCR의 결과이다. M: DNA ladder, 1: WNV1-서열번호 1 및 2, 2: WNV2-서열번호 4 및 5, 4: WNV4-서열번호 7 및 8, 5: WNV5-서열번호 10 및 11, 6: WNV6-서열번호 13 및 14.
도 2는 선별된 2개의 프라이머/프로브 세트(WNV4-서열번호 7 및 8/서열번호 9; WNV5-서열번호 10 및 11/서열번호 12)의 검출한계를 확인하기 위해 단계 희석한 주형 RNA를 이용한 RT real time PCR의 standard curve, Ct 값 및 실시간 증폭 곡선 결과이다.
도 3은 선별된 2개의 프라이머/프로브 세트(WNV4-서열번호 7 및 8/서열번호 9; WNV5-서열번호 10 및 11/서열번호 12)의 교차 반응 실험 결과로, 사용된 바이러스 시료는 지카 바이러스(ZIKA), 치쿤구니아 바이러스(CHIKV), 일본뇌염 바이러스(JEV) 및 뎅기 바이러스(DENV)이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 또는 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.

웨스트나일 바이러스는 플라비바이러스과(Flaviviridae) 플라비바이러스속( Flavivirus)에 속하는 단일 가닥 RNA 바이러스로, 게놈의 길이는 약 11,000 뉴클레오티드이다.

플라비바이러스는 3개의 구조 단백질(capsid protein C, membrane protein M, envelope protein E)과 7개의 비구조 단백질(NS1, NS2a, NS2b, NS3, NS4a, NS4b 및 NS5) 및 5'와 3' 말단에 각각 noncoding region을 포함하고 있다. 구조 단백질의 E 유전자는 주요 표면 단백질로 막 당단백질(envelope glycoprotein)을 번역하고, 이것은 비리온(virion)이 숙주세포의 내막과 결합하여 숙주 세포내로 이동하는 역할을 한다. NS(non-structural protein) 유전자는 세포 수용체 결합 도메인 Ⅲ (cell receptor binding domain Ⅲ)가 존재하며 이것이 바이러스의 전파에 중요한 결정인자를 포함하는 것으로 보고되었으며, cellular RNA cap 구조는 RNA triphosphatase와 guanyltransferase의 활동을 통해 형성되며 이것을 비구조 단백질이 암호화(encoding)하고 있다.

본 발명의 프라이머 세트는 웨스트나일 바이러스의 E (envelope protein) 유전자를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머 세트이다.

또한, 본 발명의 상기 프라이머 세트는 서열번호 9 또는 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함할 수 있으며, 구체적으로는, 서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 9의 올리고뉴클레오티드 프로브를 함께 사용할 수 있으며, 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트와 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프로브를 함께 사용할 수 있다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 명세서에 있어서, "프로브"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 프라이머 세트에 있어서, 상기 프로브는 형광물질을 부착하여 제조하였다. 상기 형광물질은 HEX, FAM, JOE, ROX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 또는 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등의 염료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 프라이머 또는 프로브는 각 프라이머 또는 프로브의 서열 길이에 따라, 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 7의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 7의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머는 서열번호 7, 서열번호 8, 서열번호 9, 서열번호 10, 서열번호 11 및 서열번호 12의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 프라이머 또는 프로브로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명은 또한, 상기 프라이머 세트; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus) 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

웨스트나일열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료, 또는 야생에서 수집된 모기 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 프라이머 세트를 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus)를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 웨스트나일열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료, 또는 야생에서 수집된 모기 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 생물학적 시료는 개개인으로부터 얻어지는 폭넓은 범위의 모든 생물학적 체액을 포함하고, 바람직하게는 웨스트나일열 의심 개체 유래의 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 포유동물로부터 체액 및 조직, 생검 등을 획득하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.

상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 증폭 산물의 확인 즉, 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 진단 유전자 합성 및 진단 프라이머/프로브 디자인 및 합성

웨스트나일 바이러스 strain의 유전자 서열을 기반으로 상동성 분석을 통하여 검출부위를 선정하였다. 상동성 분석은 MEGA(http://www.megasoftware.net/) 5.1 프로그램을 이용하였으며, 프라이머 및 프로브는 플라비바이러스 속(Flavivirus)의 다른 종과는 상동성이 떨어지고 웨스트나일 바이러스 strain간에는 상동성이 높은 염기서열 부위를 선정한 후, 정방향 및 역방향 프라이머 세트의 조합에 의해 증폭되는 산물의 크기가 약 150~300 bp가 되도록 제작하였다.

염기서열 분석을 위한 참고 서열

GenBank accession no
NC_009942.1_97-10398	West Nile virus lineage 1
NC_001563.2_97-10389	West Nile virus lineage 2
KR868734.1	West Nile virus isolate FtC-3699
HW816192.1	JP 2015028058-A/23: WEST NILE VIRUS
AY646354.1	West Nile virus from USA

보고된 각 strain에서 상동성이 떨어지는 염기서열은 하기 표 2의 base code를 이용하여 디자인하였다. 웨스트나일 바이러스 검출을 위해 디자인된 프라이머 및 프로브의 정보는 표 3과 같다.

염기 코드(Degenerate Base, C, Wobble bases, IUB code)

IUB 기호	R	Y	M	K	S
Mixed base	A, G (Y)	C, T (R)	A, C (K)	G, T (M)	C, G
comment	puRines	pYrimidine	aMine	Keto	Strong (3H-bonds)
IUB 기호	W	H	B	V	D
Mixed base	A, T	A, T, C (D)	G, T, C (V)	G, A, C (B)	G, A, T (H)
comment	Weak (2H-bonds)	Not G	Not A	Not T	Not C

실시예 2. 최적 프라이머 세트 선별 테스트

웨스트나일 바이러스는 생물안정 2등급 연구시설에서 분자생물학적 혈청학적 검사가 가능하지만, 바이러스를 취급하기 위해서는 생물안전 3등급의 연구시설이 필요하다. 본 발명에서는 시료 확보가 어려운 웨스트나일 바이러스의 주형 RNA는 상동성 분석을 통해 얻어진 서열(GenBank accession no. NC_009942 염기서열)을 DNA 절편으로 합성한 후 PCR 반응으로 해당 부위를 증폭한 후 정제하고, in vitro transcription 방법으로 RNA를 합성한 후 사용하였다.

디자인된 프라이머 세트(표 3)의 웨스트나일 바이러스 특이도를 확인하기 위하여 conventional RT-PCR을 수행하였으며, 반응액은 표 4와 같고 프로토콜은 표 5와 같다. conventional RT-PCR의 결과는 전기영동으로 확인하였으며, 겔의 농도는 아가로스 1.5%와 low melting 아가로스 1%를 사용하였다.

conventional RT-PCR 반응액 조성

Component	volume
Template (1 ng/㎕)	1~2 ㎕
Forward primer (10 pmol/㎕)	1 ㎕
Reverse primer (10 pmol/㎕)	1 ㎕
2× PCR pre-mixture*	10 ㎕
D.W.	up to ~20 ㎕
Total	20 ㎕
* 2× PCR pre-mixture는 ㈜바이오니아의 2× PlusDual Star qPCR Mix 사용

conventional RT-PCR 조건

Reaction	Step	Temp. (℃)	Time	Cycle
Reverse Transcription		50	30 min
Taq-polymerase activation		95	5 min
Reaction	denaturation	95	20 sec	40
	annealing	55	20 sec
	extension	72	30 sec
Final-extension		72	10 min

5개의 프라이머 세트(WNV1-서열번호 1 및 2 (240 bp); WNV2-서열번호 4 및 5 (182 bp); WNV4-서열번호 7 및 8 (202 bp); WNV5-서열번호 10 및 11 (196 bp); WNV6-서열번호 13 및 14(238 bp))를 사용한 conventional RT-PCR 결과, 3개의 프라이머 세트(WNV1-서열번호 1 및 2; WNV2-서열번호 4 및 5; WNV6-서열번호 13 및 14)에서 비특이적 유전자 증폭이 확인되었다(도 1).

비특이적 반응이 확인되지 않은 2개의 프라이머 세트(WNV4-서열번호 7 및 8; WNV5-서열번호 10 및 11)에 대해서 디자인된 프로브(WNV4-서열번호 9; WNV5-서열번호 12)를 함께 적용하여 RT real time PCR을 수행하였다. 웨스트나일 바이러스의 주형 RNA는 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg 및 100 fg/rxn으로 단계 희석하여 사용하였으며, 농도별 Ct값을 비교하였다. real time PCR의 반응혼합물은 표 6의 조성과 같다. 각 실험은 3반복 수행하였다.

RT real time PCR 반응액 조성

Component	volume
Template (1 ng/㎕)	1~2 ㎕
Forward primer (10 pmol/㎕)	1 ㎕
Reverse primer (10 pmol/㎕)	1 ㎕
Probe (10 pmol/㎕)	1 ㎕
2× PCR pre-mixture*	10 ㎕
D.W.	up to ~20 ㎕
Total	20 ㎕
* 2× PCR pre-mixture는 ㈜진시스템의 2× Rapi:Spec Probe Master Mix with RTase for Model UF-150 및 ㈜바이오니아의 2× PlusDual Star RT-qPCR Master Mix 사용

RT real time PCR 조건

Reaction	Step	Temp. (℃)	Time	Cycle
Reverse Transcription		50	30 min
Taq-polymerase activation		95	10 min
Reaction	denaturation	95	20 sec	40
Reaction	annealing	55	1 min	40

그 결과, 도 2에서와 같이 2개의 프라이머 세트(WNV4 및 WNV5)는 주형 RNA의 농도별 Ct값의 변화(△Ct)가 일정하게 확인되고, 100 fg의 주형 RNA에 대해서도 29.28(WNV4) 및 27.74(WNV5)의 Ct값을 보여, 증폭 반응 수행 후 19~20분 내에 검사 결과를 확인할 수 있음을 알 수 있었다.

실시예 3. 교차반응성 확인

실시예 2를 통해 선별된 2개의 프라이머 세트(WNV4 및 WNV5)가 웨스트나일 바이러스에 특이적인 분자마커인지 확인하기 위해, 다른 플라비바이러스 속 바이러스와의 교차 반응성을 RT real time PCR을 통해 분석하였다. 사용된 바이러스 시료는 지카 바이러스(ZIKA strain AFMC-U), 치쿤구니아 바이러스(CHIKV) 및 뎅기 바이러스(DENV) 혈청형 1(Hawaii 11 NA 12), 2(KBPV-VR-29), 3(KBPV-VR-30) 및 4(KBPV-VR-31)를 사용하였다.

그 결과, 도 3에 개시된 것과 같이 2개의 프라이머 세트(WNV4 및 WNV5)는 다른 플라비바이러스 속 바이러스 시료에 대하여 증폭 반응이 확인되지 않았다. 이의 결과를 통해 본 발명의 2개의 프라이머 세트(WNV4 및 WNV5)가 웨스트나일 바이러스에 대한 효율적인 검출 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다.

<110> Republic of Korea(The Armed Forces Medical Command) <120> Molecular marker for specifically detecting West nile virus and uses thereof <130> PN20073 <160> 15 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gctctyttgg ygttyttcag 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gttmgagagg gtmacwgctc 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 atggagaggy gtsaacaaac 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 acacatgygc saartttgcc 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tggcgccgmw ggagtkatrc 20 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 gcaaytggaw graycatcyw g 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ccatwtttgt scatggmccg 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 cwgwcatmac gtartakgc 19 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 cacacaggyt ggagccactc 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gacrtcrggw catytgaagt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 carkgaagcy ackgamgara 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 gmrtmtgttc aaargckt 18 <210> 13 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tttggatttg gwctsacmag cactcg 26 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 agraytccat crccccacar 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 agayassaac acaackgaat 20

Claims

서열번호 7 및 서열번호 8의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트; 및 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트;를 포함하는 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus)를 검출하기 위한 프라이머 세트 조성물.
제1항에 있어서, 상기 프라이머 세트 조성물은 서열번호 9 및 서열번호 12의 염기서열로 이루어진 올리고뉴클레오티드 프로브를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 웨스트나일 바이러스를 검출하기 위한 프라이머 세트 조성물.
제1항 또는 제2항에 따른 프라이머 세트 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus) 검출용 키트.
제3항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
웨스트나일열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료, 또는 야생에서 수집된 모기 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항 또는 제2항의 프라이머 세트 조성물을 이용하여 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 웨스트나일 바이러스(West Nile Virus)를 검출하는 방법.
제5항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.