KR102555047B1 - 사비아 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 사비아 바이러스 (Sabia virus)를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는, 사비아 바이러스를 검출하기 위한 마커 조성물에 관한 것이다.

Description

사비아 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도{Molecular marker for specifically detecting Sabia virus and uses thereof}

본 발명은 사비아 바이러스 (Sabia virus)를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도에 관한 것이다.

항생제 개발과 예방접종의 발달로 감염병으로 인한 사망이 급속도로 감소하였으나 1970년대 이후 새롭게 발견된 주요 신종감염병만 30여개 이상이 발생하였고 없어질것 같았던 감염병이 새롭게 만연하거나 재출현(re-emerging)하게 되었으며 80년대 중반부터는 신종 및 재출현 감염병 문제가 공중보건의 주요 문제로 부각되었으며, 90년대부터는 이에 대비 및 대응방안이 선진국을 중심으로 본격화되었다.

국내 신종 감염병 발생현황을 살펴보면 2001년 첫 환자가 신고된 후 뎅기열이 가장 흔하고 매년 증가 추세에 있다. 신고된 환자는 대부분 국외 체류 중에 감염되었으며 감염된 지역은 필리핀, 인도네시아, 태국, 말레이시아 등 주로 동남아 지역이다.

군은 일정한 규율과 질서를 가지고 조직된 집단으로 밀도 높은 단체 생활 및 야외 활동이 많은 것이 특징이다. 만약 군부대내 감염병 발생시 단체 생활로 전파의 속도가 매우 빠르기 때문에, 감염병의 조기 진단과 치료를 통하여 전파를 방지하는 것이 중요하다.

아레나바이러스과(Arenaviridae) 바이러스는 Mammarenavirus, Reptarenavirus 및 Hartmanivirus 속을 포함하며, Reptarenavirus 및 Hartmanivirus는 파충류가 숙주이고, Mammarenavirus는 포유류가 숙주인 바이러스이다. Mammarenavirus는 41개의 구별되는 바이러스 종을 포함하고 있으며, 유전적, 지역적, 역학적 관계에 따라 구세계(유럽, 아시아, 아프리카를 가리킴) 및 신세계(남북 아메리카를 가리킴)의 2개 그룹으로 구분되며, 이 중 신세계 그룹은 다시 4개의 계통군(A, B, C와 A/Rec(D))으로 구분되고, 구아나리토(Guanarito) 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스, 차파레(Chapare) 바이러스를 포함하는 남미 출혈열 바이러스의 경우 계통군 B에 속한다. 자연적으로 각각의 아레나바이러스는 하나 혹은 제한된 설치류(rodent) 종에 의해 전파되며, 지역적 풍토병으로 감염순환 된다.

아레나바이러스는 음의 방향 가닥(negative sense), large(L, 약 7.2kb)와 small(S, 약 3.4kb) 분절로 이루어진 이분절화(bi-segmented) RNA 게놈을 가진 바이러스로, 상기 각 분절은 두개의 ORF(open reading frame)와 비-코딩 유전자간부위(non-coding Intergenic region, hairpin 구조)로 구성되어 있다. 아레나바이러스는 에어로졸을 통해 사람 간 전파가 가능하다.

한편, 한국공개특허 제2020-0056348호에는 '크리미언콩고 출혈열 바이러스의 아형을 동시에 검출하기 위한 프라이머 및 프로브, 및 이를 이용한 크리미언콩고 출혈열 바이러스의 검출방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0028017호에는 '아레나바이러스와 관련된 감염증을 포함하는 출혈열 바이러스를 치료하기 위한, 설포닐 세미카르바지드, 카르보닐 세미카르바지드, 세미카르바지드 및 우레아, 이의 약제 조성물, 및 방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 사비아 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 분자마커 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 남미 출혈열 바이러스[구아나리토(Guanarito) 바이러스, 주닌(Junin) 바이러스, 마추포(Machupo) 바이러스, 사비아(Sabia) 바이러스]의 L 분절 또는 S 분절에 대한 염기서열 정렬을 통하여 사비아 바이러스를 특이적으로 검출할 수 있는 염기서열 부위를 선별하였고, 선별된 부위의 서열을 기반으로 프라이머 세트 및 프로브를 제작하였다. 제작된 프라이머 세트 및 프로브들과 합성된 사비아 바이러스 RNA 주형을 이용하여 실시간 RT-PCR(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행한 결과, 비특이적 증폭 반응이 나타나지 않으면서, 합성된 RNA 주형의 1 fg 농도까지 검출이 가능하고, 다른 남미 출혈열 바이러스인 주닌 바이러스, 마추포 바이러스 및 구아나리토 바이러스 RNA 시료에 대해서는 교차 반응이 없는, 2개의 사비아 바이러스 특이적 프라이머 세트 및 프로브를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는, 사비아 바이러스 (Sabia virus)를 검출하기 위한 마커 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 사비아 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

또한, 본 발명은 남미 출혈열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계; 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 마커 조성물을 이용하여 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및 상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 사비아 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 사비아 바이러스 (Sabia virus) 검출용 분자마커를 이용하면 단시간 내에 특이적이고 효율적으로 사비아 바이러스를 검출하거나 또는 브라질 출혈열의 진단이 가능할 수 있으므로, 신종감염병 발생에 대비하고, 군과 같은 특수 목적의 집단생활을 하는 곳에서 감염병 발생 시 조기 진단을 통하여 감염병 확산의 차단이 가능할 것으로 사료된다.

도 1은 사비아 바이러스의 합성 DNA를 이용한 프라이머/프로브 세트의 conventional PCR의 결과이다.
도 2는 사비아 바이러스의 RNA를 이용한 프라이머/프로브 세트의 RT real time PCR의 결과로, 좌측의 표는 Ct값과 형광 증폭의 양을 나타내며 우측그래프는 실시간 증폭 곡선을 보여준다.
도 3은 선별된 프라이머/프로브 세트의 검출한계를 확인하기 위해 단계 희석한 주형 RNA를 이용한 RT real time PCR의 실시간 증폭 곡선 및 standard curve 결과이다.
도 4는 선별된 프라이머/프로브 세트의 교차 반응 실험 결과로, 사용된 바이러스 시료는 사비아 바이러스(SABV), 마추포 바이러스(MACV), 주닌 바이러스(JUNV) 및 구아나리토 바이러스(GTOV)이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프로브;로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 프라이머 세트 및 프로브를 포함하는, 사비아 바이러스 (Sabia virus)를 검출하기 위한 마커 조성물을 제공한다.

본 발명의 사비아 바이러스는 남미 출혈열 중 하나인 브라질출혈열(Brazilian hemorrhagic fever)의 병원체이다.

본 발명에 따른 마커 조성물에 있어서, 상기 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어진 마커는 사비아 바이러스의 L 분절의 RNA 의존 RNA 중합효소(RdRP) 코딩 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 마커이며, 상기 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프로브로 이루어진 마커는 S 분절의 당단백질(glycoprotein, GP) 코딩 서열을 특이적으로 증폭할 수 있는 마커이다.

사비아 바이러스를 포함하는 아레나바이러스는 2개로 분절된 단일 가닥 양쪽극성(ambisense) RNA 게놈을 가지고 있으며, 각 RNA 분절은 반대 방향(orientation)으로 위치한 두 개의 바이러스 단백질을 코드화하는데, 음의 방향 RNA 게놈이 단일 mRNA의 전사 주형과 두 번째 mRNA의 양의 방향 복제 주형 역할을 한다. S 분절 RNA는 약 3.5 kb 크기로 바이러스의 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein, NP)과 당단백질(glycoprotein, GP)을 코딩하고 있으며, L 분절 RNA는 약 7.2 kb 크기로 바이러스성 RNA 의존 RNA 중합효소(RNA-dependent RNA-polymerase, RdRP)와 작은 링(RING) 도메일 포함 단백질(Z)를 코딩한다. Z 단백질은 동형의 올리고머를 형성하고, 비리온(virion)의 구조 요소이다.

본 발명에 있어서, "프라이머"는 카피하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.

본 발명에 있어서, "프로브"란 상보적인 단일가닥 표적 서열과 혼성화하여 이중가닥 분자 (혼성체)를 형성하는 디옥시리보뉴클레오티드 및 리보뉴클레오티드를 포함하는 자연적인 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 마커 조성물에 있어서, 상기 프로브는 형광물질을 부착하여 제조될 수 있다. 상기 형광물질은 HEX, FAM, JOE, ROX, 텍사스 레드(Texas Red), TET, TRITC, TAMRA, 플루오레신(fluorescein), 플루오레신 클로로트리아지닐(fluorescein chlorotriazinyl), 로다민 그린(rhodamine green), 로다민 레드(rhodamine red), 테트라메틸로다민(tetramethylrhodamine), FITC, 오레곤 그린(Oregon green), 알렉사 플루오르(Alexa Fluor), 시아닌(Cyanine) 계열 염료 또는 씨아디카르보시아닌(thiadicarbocyanine) 등의 염료일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 프라이머 또는 프로브는 각 프라이머 또는 프로브의 서열 길이에 따라, 서열번호 4, 5, 6, 10, 11 및 12의 서열 내의 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상, 20개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 예를 들면, 서열번호 4의 프라이머(20개 올리고뉴클레오티드)는 서열번호 4의 서열 내의 15개 이상, 16개 이상, 17개 이상, 18개 이상, 19개 이상의 연속 뉴클레오티드의 절편으로 이루어진 올리고뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 또한, 상기 프라이머 또는 프로브는 서열번호 4, 5, 6, 10, 11 및 12의 염기서열의 부가, 결실 또는 치환된 서열도 포함할 수 있다.

본 명세서에 있어서, 프라이머 또는 프로브로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)를 포함할 수 있거나 또는 삽입 물질(intercalating agent)를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 프라이머의 적합한 길이는 사용하고자 하는 프라이머의 특성에 의해 결정하지만, 통상적으로 15 내지 30 bp의 길이로 사용한다. 프라이머는 주형의 서열과 정확하게 상보적일 필요는 없지만 주형과 혼성복합체(hybrid-complex)를 형성할 수 있을 정도로 상보적이어야만 한다.

본 발명은 또한, 상기 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 사비아 바이러스 검출용 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함할 수 있으며, 리보뉴클레아제(ribonuclease) 저해제, 내열성 중합 효소 등을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 DNA 폴리머라제는 RNA 의존성 DNA 폴리머라제(RNA dependent DNA polymerase)와 같은 역전사 효소일 수 있으며, 다양한 소스로부터 기원한 역전사 효소, 예를 들면, 조류 골수 아세포증 바이러스-유래 역전사 효소(avian myeloblastosis virus-derived virus reverse transcriptase; AMV RTase), 마우스 백혈병 바이러스-유래 역전사 효소(murine leukemia virus-derived virus reverse transcriptase; MuLV RTase) 및 라우스-관련 바이러스 2 역전사 효소(Rous-associated virus 2 reverse transcriptase; RAV-2 RTase)를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 버퍼는 역전사 버퍼 및 PCR 버퍼를 모두 포함할 수 있으며, 상기 내열성 중합 효소는 EF Taq 중합 효소일 수 있다.

본 발명의 일 구현 예에 있어서, 상기 키트는 또한 최적의 반응 수행 조건을 기재한 사용자 안내서를 추가로 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 역전사 완충액 및 PCR 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.

본 발명은 또한,

남미 출혈열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;

상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 마커 조성물을 이용하여 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및

상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 사비아 바이러스를 검출하는 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 남미 출혈열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계를 포함한다. 상기 생물학적 시료는 개개인으로부터 얻어지는 폭넓은 범위의 모든 생물학적 체액을 포함하고, 바람직하게는 남미 출혈열 의심 개체 유래의 세포, 조직, 생검, 파라핀조직, 혈액, 혈청, 혈장, 소변 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 포유동물로부터 체액 및 조직, 생검 등을 획득하는 방법은 당업계에 알려진 통상의 방법을 이용할 수 있다.

상기 시료에서 총 RNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있으며, 예를 들면, 페놀 추출 방법을 이용할 수 있다. 상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 본 발명의 일 실시예에 따른 하나 이상의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트를 프라이머로 이용하여 RT-PCR을 수행하여 표적 서열을 증폭할 수 있다. 이러한 PCR 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 상업적으로 이용가능한 키트를 이용할 수도 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 증폭 산물의 확인 즉, 검출은 겔 전기영동, 모세관 전기영동, DNA 칩, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 증폭 산물을 검출하는 방법 중의 하나로서, 겔 전기영동을 수행할 수 있으며, 겔 전기영동은 증폭 산물의 크기에 따라 아가로스 겔 전기영동 또는 아크릴아미드 겔 전기영동을 이용할 수 있다. 또한, 모세관 전기영동을 수행할 수 있다. 모세관 전기영동은 예를 들면, ABi Sequencer를 이용할 수 있다. 또한, 형광 측정 방법은 프라이머 또는 프로브의 5'-말단에 Cy-5 또는 Cy-3를 표지하여 PCR을 수행하면 표적 서열이 검출가능한 형광 표지 물질로 표지되며, 이렇게 표지된 형광은 형광 측정기를 이용하여 측정할 수 있다. 또한, 방사성 측정 방법은 PCR 수행시 ³²P 또는 ³⁵S 등과 같은 방사성 동위원소를 PCR 반응액에 첨가하여 증폭 산물을 표지한 후, 방사성 측정기구, 예를 들면, 가이거 계수기(Geiger counter) 또는 액체섬광계수기(liquid scintillation counter)를 이용하여 방사성을 측정할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 진단 유전자 합성 및 진단 프라이머/프로브 디자인 및 합성

남미 출혈열 바이러스의 유전자 서열을 기반으로 상동성 분석을 통하여 검출부위를 선정하였다. 상동성 분석은 MEGA(http://www.megasoftware.net/) 5.1 프로그램을 이용하였으며, 프라이머 및 프로브는 다른 종과는 상동성이 떨어지고 사비아 바이러스를 특이적으로 구별할 수 있는 염기서열 부위를 선정한 후, 정방향 및 역방향 프라이머 세트의 조합에 의해 증폭되는 산물의 크기가 약 150~300 bp가 되도록 제작하였다.

염기서열 분석을 위한 참고 서열

GenBank accession no	name
NC_005082	Guanarito virus - L segment
NC_005080	Junin virus - L segment
NC_005079	Machupo virus - L segment
NC_006313	Sabia virus - L segment
NC_005077	Guanarito virus - S segment
NC_005081	Junin virus - S segment
NC_005078	Machupo virus - S segment
NC_006317	Sabia virus - S segment

사비아 바이러스 검출을 위해 디자인된 프라이머 및 프로브의 정보는 하기 표 2와 같다. 사비아 바이러스의 S 분절은 당단백질(glycoprotein)과 뉴클레오캡시드 단백질(nucleocapsid protein) 코딩 유전자로 구성되어 있고, 당단백질 유전자를 표적으로 1세트(S-GP), 뉴클레오캡시드 단백질 유전자를 표적으로 1세트(S-NP)의 프라이머/프로브를 디자인하였다. L 분절은 징크 핑거 단백질(zinc finger protein)과 L 중합효소(polymerase) 유전자로 구성되어 있고, 징크 핑거 단백질 유전자를 표적으로 1세트(Z), L 중합효소 유전자를 표적으로 2세트(L1/L2)의 프라이머/프로브를 디자인하였다.

사비아 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 프로브

Segment	마커명 (합성크기)		염기서열 (5'→3') (서열번호)	비고
L	Z protein-01 (zinc finger protein) 165bp	정방향	gctggttcgccaatacaaat (1)
		역방향	AGTCTTCTGGAGGTGGAGCA (2)
		프로브	aagagctccccacatccatt (3)
	L protein L polymerase-01 153bp	정방향	cagcttcgtgtctgattgga (4)
		역방향	ACCAAGGCTTTGATTGTTGG (5)
		프로브	ccacagaaaggttgaggtgg (6)
	L protein L polymerase-02 174bp	정방향	caatgctgaggcaatagcaa (7)
		역방향	TCCCTGTTAGACCCAACCTG (8)
		프로브	gtaagcaccaacactggcaa (9)
S	glycoprotein precursor-01 (glycoproteins)118bp	정방향	gccacttggtgtcttgaggt (10)
		역방향	CTGCTTCTGTGCTCAACTGC (11)
		프로브	atggctgaacatgatcgtca (12)
	nucleocapsid protein-01 147bp	정방향	tggttttcaacagcagcaag (13)
		역방향	TCCCCCATGGTATTGTCACT (14)
		프로브1	ggggttgtaaggatttggga (15)
		프로브2	ctgcactgacaatcgcttgt (16)

사비아 바이러스를 비롯한 남미 출혈열 바이러스(주닌 바이러스, 마추포 바이러스, 구아나리토 바이러스)의 PCR 주형으로 사용될 유전자 부위를 합성하였으며, 각 바이러스의 L 분절은 바이러스 간 교차 반응성 테스트를 위해 각 바이러스별로 디자인된 프라이머 및 프로브 위치를 정렬하여 합성하였다. 합성된 유전자는 pUC57 플라스미드(Macrogen)에 클로닝하였으나 RNA 확보를 위한 in vitro transcription을 수행하기 위해 T7과 SP6 프로모터를 보유한 pGEM-3Zf(+) 벡터(Promega)에 다시 클로닝하였다. 합성된 유전자를 대장균에 형질전환 하였을 때 대장균에서 단백질을 발현하거나 형질을 변경시킬 수 없도록 최소한의 유전자의 범위 안에서 합성하고자 하였으며 사용한 대장균은 JM109(: SP6 RNA polymerase가 없어 삽입된 염기서열은 DNA gyrase와 topoisomerase Ⅳ와 같은 단백질이 발현되지 않으며 항생제 저항성에 영향을 미치지 않음) competent cell을 이용하였다.

주형 서열 공여체 정보

플라스미드 명칭	학명	도입유전자 (전체 크기)	정보 유래 (1. GenBank #, 2. 합성염기서열 부위)
pGEM-GTOV-S	Guanarito virus (GTOV)	S segment (1140bp)	1. NC_005077, 2. glycoprotein precursor nt 301-780(480), nt 1201-1440(240) nucleocapsid protein nt 1021-1200(180), nt 1201-1440(240)
pGEM-GTOV-L		L segment (1128bp)	1. NC_005082, 2. L protein nt 1801-1980(180), nt 2701-2940(240), nt 3601-3780(180), nt 6061-6300(240) Z protein nt 1-288(288)
pGEM-JUNV-S	Junin virus (JUNV)	S segment (1080bp)	1. NC_005081 2. glycoprotein precursor nt 1-660(660), nucleocapsid protein nt 121-540(420)
pGEM-JUNV-L		L segment (1098bp)	1. NC_005080, 2. L protein nt 1741-2040(300), nt 4381-4620(240), nt 6001-6633(273) Z protein nt 1-285(285)
pGEM-MACV-S	Machupo virus (MACV)	S segment (1140bp)	1. NC_005078, 2. glycoprotein precursor nt 361-720(360), nucleocapsid protein nt 241-1020(780)
pGEM-MACV-L		L segment (1005bp)	1. NC_005079, 2. L protein nt 361-480(120), nt 4021-4200(180), nt 4561-4740(180), nt 6061-6300(240) Z protein nt 1-285(285)
pGEM-SABV-S	Sabia virus (SABV)	S segment (450bp)	1. NC_006317, 2. glycoprotein precursor nt 291-560(270), nucleocapsid protein nt 421-600(180)
pGEM-SABV-L		L segment (1023bp)	1. NC_006313, 2. L protein nt 241-720(480), nt 3181-3420(240) Z protein nt 1-303(303)

실시예 2. 최적 프라이머 세트 선별 테스트

사비아 바이러스는 국민보건상 국가관리가 필요하다고 보건복지부장관이 고시하는 병원미생물의 유전자를 이용하는 실험으로 「유전자변형생물체의 국가간 이동 등에 관한 법률」 제22조의2제1항, 같은 법 시행령 제23조의6제2항 및 같은 법 시행규칙 제14조의5제1항에 따라 위와 같이 유전자변형생물체의 개발ㆍ실험 승인이 필요하다. 본 발명자는 2020년 5월 29일 질병관리본부로부터 유전자변형 생물체 개발 실험의 승인을 취득하였다(제20-RDM-016).

사비아 바이러스의 주형 RNA는 상동성 분석을 통해 얻어진 서열(표 3 참고)을 DNA 절편으로 합성한 후 PCR 반응으로 해당 부위를 증폭한 후 정제하고, in vitro transcription 방법으로 RNA를 합성한 후 사용하였다.

먼저, 디자인된 프라이머 및 프로브 세트(표 2)의 사비아 바이러스 특이도를 확인하기 위하여 conventional PCR을 수행하였다. 각 반응은 NTC (non template control)과 사비아 바이러스의 S 분절/L 분절 DNA 1ng을 사용하여 수행하였다. 반응액은 표 4와 같고 프로토콜은 표 5와 같다. Conventional PCR의 결과는 전기영동으로 확인하였으며, 겔의 농도는 아가로스 1.5%와 low melting 아가로스 1%를 혼합하여 사용하였다.

Conventional PCR 반응액 조성

Component	volume
Template (1 ng/㎕)	1 ㎕
Forward primer (10 pmol/㎕)	1 ㎕
Reverse primer (10 pmol/㎕)	1 ㎕
2× Master mixture*	10 ㎕
Nuclease free water	up to ~20 ㎕
Total	20 ㎕
* 2× master mixture는 ㈜바이오니아의 AccuPower Dual-star qPCR master mix 사용

Conventional PCR 조건

Reaction	Step	Temp. (℃)	Time	Cycle
Taq-polymerase activation		95	5 min
Reaction	denaturation	95	20 sec	40
	annealing	55	20 sec
	extension	72	30 sec
Final-extension		72	10 min

Conventional PCR 수행 결과, 5개의 프라이머 세트 모두 비특이적 반응이 확인되지 않았고 표적 위치를 정확하게 검출하여 예측된 크기의 산물을 증폭해내는 것을 알 수 있었다(도 1). 비특이적 반응이 확인되지 않은 5개의 프라이머 세트에 대해 함께 고안된 프로브를 적용하여 RNA 주형을 대상으로 RT real time PCR을 수행하였다. RT real time PCR의 반응물 조성 및 반응 조건은 하기 표 6 및 7과 같다. 본 발명에서 사용한 프로브는 TaqMan 프로브이며, 형광 염료는 FAM, 소광제(quencher)는 BHQ1을 사용하였다.

RT real time PCR 반응액 조성

Component	volume
Template (1 ng/㎕)	1 ㎕
Forward primer (10 pmol/㎕)	1 ㎕
Reverse primer (10 pmol/㎕)	1 ㎕
TaqMan probe (10 pmol/㎕)	1 ㎕
10× Hotstart buffer	2 ㎕
2× Master mixture*	10 ㎕
Nuclease free water	up to ~20 ㎕
Total	20 ㎕
* 2× master mixture는 ㈜바이오니아의 AccuPower Dual-Hotstart RT-qPCR master mix 사용

One-step RT real time PCR 조건

Reaction	Step	Temp. (℃)	Time	Cycle
Reverse Transcription		50	30 min
Taq-polymerase activation		95	10 min
Reaction	denaturation	95	20 sec	40
	annealing	55	1 min

그 결과, 도 2에 개시된 바와 같이 SABV-S-NP 및 SABV-L2 마커는 다른 마커에 비해 검출되는 Ct 값이 현저히 높거나 형광 증폭이 다른 마커에 비해 낮게 확인되어, 제외시켰다. 따라서 SABV-Z, SABV-L1과 SABV-S-GP를 이용하여 농도별 RT real time PCR 테스트를 진행하였다. 사비아 바이러스의 주형 RNA는 10배 단계 희석하여 1 ng ~ 0.1 fg/rxn으로 사용하였으며, 농도별 Ct값을 비교하였다. real time PCR의 반응혼합물은 표 6의 조성과 같다. 각 실험은 3반복 수행하였다. 그 결과, L 분절의 Z가 L 분절의 L1과 S분절의 GP보다 Ct 값이 낮은 것으로 확인되었으며, GP와 L1은 유사한 Ct값을 나타내는 것을 확인할 수 있었다(도 3).

실시예 3. 교차반응성 확인

실시예 2를 통해 선별된 3개의 프라이머/프로브 세트가 사비아 바이러스에 특이적인 분자마커인지 확인하기 위해서 다른 남미 출혈열 바이러스와의 교차 반응성을 RT real time PCR을 통해 분석하였다. 사용된 바이러스 시료는 주닌 바이러스, 마추포 바이러스, 구아나리토 바이러스이고, 각 주형 서열은 표 3과 같다.

그 결과, 하기 표 8에 개시된 것과 같이 SABV-Z 마커는 주닌 바이러스의 시료에 대해 비특이적 증폭 반응을 일으키는 것을 알 수 있었다. 상기 결과를 통해 본 발명의 2개의 프라이머/프로브 세트(SABV-L1, SABV-S-GP)가 사비아 바이러스에 대한 효율적인 검출 마커로 사용될 수 있음을 알 수 있었다(도 4).

사비아 바이러스 특이 프라이머/프로브 세트를 이용한 남미 출혈열 바이러스 4종의 RT real time PCR

	프라이머/프로브 세트별 Ct값 (3회 반복 수행의 평균값)
	SABV-Z	SABV-L1	SABV-S-GP
SABV	14.30	14.88	15.43
MACV	n/a	n/a	n/a
JUNV	28.66	n/a	n/a
GTOV	n/a	n/a	n/a
NTC	n/a	n/a	n/a

<110> Republic of Korea(Armed Forces Medical Command) <120> Molecular marker for specifically detecting Sabia virus and uses thereof <130> PN21121 <160> 16 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 gctggttcgc caatacaaat 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 agtcttctgg aggtggagca 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 3 aagagctccc cacatccatt 20 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 cagcttcgtg tctgattgga 20 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 accaaggctt tgattgttgg 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 6 ccacagaaag gttgaggtgg 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 caatgctgag gcaatagcaa 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 tccctgttag acccaacctg 20 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 9 gtaagcacca acactggcaa 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 gccacttggt gtcttgaggt 20 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 11 ctgcttctgt gctcaactgc 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 12 atggctgaac atgatcgtca 20 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 13 tggttttcaa cagcagcaag 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 14 tcccccatgg tattgtcact 20 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 15 ggggttgtaa ggatttggga 20 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> probe <400> 16 ctgcactgac aatcgcttgt 20

Claims (5)

1. 서열번호 4 및 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 프로브; 및 서열번호 10 및 서열번호 11의 올리고뉴클레오티드 프라이머 세트 및 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 프로브;를 포함하는, 사비아 바이러스 (Sabia virus)를 검출하기 위한 마커 조성물.
2. 제1항의 마커 조성물; 및 증폭 반응을 수행하기 위한 시약을 포함하는, 사비아 바이러스 검출용 키트.
3. 제2항에 있어서, 상기 증폭 반응을 수행하기 위한 시약은 DNA 폴리머라제, dNTPs 및 버퍼를 포함하는 것인 키트.
4. 남미 출혈열 의심 환자로부터 분리된 생물학적 시료로부터 총 RNA를 분리하는 단계;
   상기 분리된 총 RNA를 주형으로 하고, 제1항의 마커 조성물을 이용하여 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)을 수행하여 표적 서열을 증폭하는 단계; 및
   상기 증폭 단계의 산물을 검출하는 단계;를 포함하는, 사비아 바이러스를 검출하는 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 증폭 산물의 검출은 DNA 칩, 겔 전기영동, 방사성 측정, 형광 측정 또는 인광 측정을 통해 수행되는 것인 방법.

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