KR101819938B1 - Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｅｇｆｒ 돌연변이 검출 방법 및 키트 - Google Patents

Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 ｅｇｆｒ 돌연변이 검출 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 EGFR 돌연변이 유전자가 존재하는 엑손 18, 19, 20 또는 21에서의 인프레임 결실(in frame deletion) 또는 치환 부분의 야생형과 특이적으로 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 프로브를 이용하여 야생형의 증폭을 억제함으로써 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 방법 및 상기 방법을 사용하기 위한 키트에 관한 것으로, 전립선암, 유방암, 결장암, 이자암, 난소암, 지라암, 고환암, 흉선암 및 폐암 등의 종양을 조기에 신속하고 정확하게 검사할 수 있어, 조기 암 진단으로 인한 효율적인 치료를 가능하게 할 것이다.

Description

ＰＮＡ 기반의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 ＥＧＦＲ 돌연변이 검출 방법 및 키트{Methods and kits for the EGFR mutant detection using PNA mediated Real-time PCR clamping}
본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acid, 이하 'PNA'라 함) 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 EGFR 유전자 돌연변이 검출 방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는, 하기 표 1에 열거된 EGFR의 키나제 도메인에서의 변이 엑손 18, 19, 20 또는 21에서의 인프레임 결실(in frame deletion) 또는 치환의 검출을 위하여 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브가 야생형의 증폭을 억제함으로써 소량의 돌연변이형만을 선택적으로 검출하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
암과 관련된 주된 사망의 원인 중 하나인 폐암은 상피세포암(epithelial cell cancer)의 일종으로 상피세포들의 비정상적인 가속화된 성장을 특징으로 하는 질환이다. 전립선암이나, 유방암, 결장암, 이자암, 난소암, 지라암, 고환암, 흉선암 등이 상피세포암에 포함된다. 상피세포의 가속화된 성장은 초기에는 종양형성을 유발하여 다른 기관 부위들로의 전이가 발생하기도 한다.
폐암을 진단하고 치료하고자 하는 많은 노력이 있었음에도 폐암의 5년 생존율은 70년대 12%에서 최근 15% 전후로 고작 3% 밖에 개선되지 않았다. 폐암은 남성에게 있어 전립선암에 이어 2번째, 여성에게 있어 유방암에 이어 2번째로 많이 발병한다. 폐에서 시작되는 암은 두 가지 주요한 타입으로 나누어지는데, 현미경 상에 그 암세포들이 어떻게 보이느냐에 따라 비소세포(non-small cell) 폐암과 소세포(small cell) 폐암으로 나누어진다. 전체 폐암의 약 75%가 비소세포폐암(NSCLC)으로 분류되며(예, 선암종), 나머지 25%가 소세포 폐암이다. 대부분의 폐암종은 초기에는 발견이 어려우며 진행된 상태에서 주로 진단되기 때문에 나쁜 예후를 나타낸다. 폐암 환자들의 경우 화학요법은 생존과 관련하여 효과를 제공하지만, 상당한 부작용이 따르므로 종양성장에 관여하는 중요한 유전적 손상을 특이적으로 표적화하는 치료제에 대한 필요성이 강조된다[Schiller JH et al., N Engl. J. Med., 346: 92-98, 2002].
암화과정에 중요한 역할을 하는 표피성장인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor; 이하 "EGFR")는 질량이 170 킬로달톤(kDa)으로 막에 결합된 단백질이며, 상피세포의 표면에 발현된다. EGFR은 세포주기조절분자들의 부류(class)인 단백질 티로신 키나제의 성장인자수용체 군(family)의 일원이다[W. J. Gullick et al., 1986, Cancer Res., 46:285-292]. EGFR은 세포외 도메인에 자신의 리간드(EGF 또는 TGF-α)가 결합하면 활성화되고, 그 결과, 동 수용체의 세포내 티로신 키나제 도메인이 자가인산화반응을 일으키게 된다[S. Cohen et al., 1980, J. Biol. Chem., 255:4834-4842; A. B. Schreiber et al., 1983, J. Biol.Chem., 258:846-853].
표피성장인자 수용체(EGFR)는 HER 키나제 축의 구성원 중의 하나로서, 몇 가지 서로 다른 암 치료법들의 개발을 위한 선택의 표적이 된다. EGFR 티로신 키나제 저해제(EGFR tyrosine kinase inhibitors: EGFR-TKIs)들은 이러한 치료법들 중의 하나이며, EGFR 경로의 활성화에는 티로신 잔기들의 가역인산화 과정이 요구된다. 결과적으로 EGFR-TKI들은 종양 세포들의 성장과 분화를 일으키는 세포의 신호경로를 촉발하거나 유지하는 일을 하고 있는 세포 표면의 수용체를 차단한다. 이러한 티로신 키나제 저해제는 HER-1로 명명되는 EGFR 키나제 도메인을 간섭(interfere)한다고 알려져 있으며 EGFR-TKI로는 퀴나졸린(quinazolines)과 피리도피리미딘(pyridopyrimidines), 그리고 피롤로피리미딘(pyrrolopyrimidines)이라는 3가지 종류의 화합물이 알려져 있다. 임상적인 개발에 있어서 보다 진보된 화합물들 중의 2가지로서 제피티니브(Gefitinib)(AstraZeneca UK Ltd.에 의해 개발된 화합물 ZD1839; 상표명 IRESSA 로 구입가능; 이하 "이레사")와 에를로티니브(Erlotinib)(Genentech, Inc.과 OSI Pharmaceuticals, Inc.에 의해 개발된 화합물 OSI774; 상표명 TARCEVA로 구입가능; 이하 "타세바")가 있는데, 둘 다 고무적인 임상결과들을 나타내고 있다. 이레사나 타세바를 사용하는 종래의 암 치료법은 각 화합물을 500 mg을 넘지 않는 양으로 매일, 경구 투여하는 것이다. 이레사는, 2003년 5월에, 진행된 비소세포 폐암 환자들의 치료를 위해 승인되어, 이러한 제품들 중 제일 먼저 미국 시장에 진입하게 되었다. 이레사는 경구적으로 유효한(orally active) 퀴나졸린으로서 EGFR 분자상의 티로신 키나제의 인산화를 직접 저해하여 효과를 나타낸다. 아데노신 삼인산(ATP)의 결합부위에 경쟁적으로 작용하며, 이는 HER-키나제 축의 억제로 이어진다.
그러나 상기 화합물들은 그 치료법에 있어서 환자들이 처음에는 반응을 하나 곧 내성을 나타내거나, 또는 처음부터 EGFR-TKI에 대해 측정 가능한 정도의 반응을 전혀 보이지 않을 수도 있다는 한계점이 있다. 즉, 진행된 비소세포 폐암 환자들 중 단지 10 내지 15%만이 EGFR 키나제 저해제들에 반응한다는 것이다. 따라서 이레사와 타세바에 대한 분자수준의 메카니즘에 대한 이해는 아마도 표적 치료법에 있어서 그러한 치료를 통한 효과를 극대화하는데 필수적인 요건이 될 것이다.
이레사 같은 티로신 키나제 저해제(TKI) 치료법은 대다수의 환자들에게서 효과적이지 않다. 종래 연구를 통해 EGFR의 키나제 도메인에서의 체세포 돌연변이의 존재가, 이레사 또는 타세바 같은 TKI에 대한 EGFR의 민감성을 현저하게 증가시킴을 발견하였다. 이러한 체세포 돌연변이들을 가진 환자들에게 현재의 TKI, 예를 들면 이레사 같은, 치료는 더욱 효과적으로 반응할 것이다.
현재까지의 EGFR 돌연변이에 대한 스크리닝은 직접 서열분석 또는 단일가닥 입체 다형태 분석(single-strand conformation polymorphism analysis)에 기초해 왔다. 핵산 증폭을 통한 스크리닝 방법은 염기서열분석 단계를 거쳐 돌연변이를 검출하는 방법이므로 반응시간이 오래 소요되고 번거로우며 많은 비용이 소요된다. 또한 임상 시료는 돌연변이가 야생형에 비해 아주 극소량 존재하는 경우가 많기 때문에, 소량의 돌연변이를 검출하는 것이 매우 중요함에도 불구하고, 상기의 방법은 낮은 검출 민감도를 가지므로 극소량의 돌연변이의 검출이 어렵다[Chung et al., Clin Endocrinol. 65:660-666, 2006; Trovisco et al., J Pathol . 202:247-251, 2004].
민감도를 증가시키기 위해 돌연변이에 특이적인 프라이머로 돌연변이를 선택적으로 증폭하는 대립형질 특이적(allele specific) PCR 방법[Rhodes et al., Diagn mol pathol . 6(1):49-57, 1997], 임계적 변성온도(critical denaturation temperature, Tc)를 이용하여 돌연변이만을 선택적으로 검출하는 콜드-PCR(Cold-PCR) 방법[Zuo et al., Modern Pathol . 22:1023-1031, 2009] 등이 사용되고 있다. 또한, 스코피언(scorpion) 프로브를 이용하여 돌연변이를 선택적으로 검출하는 스코피언 실시간 대립형질 특이적 PCR(scorpion Real-time allele specific PCR)(DxS' scorpions and ARMS) 방법도 사용되고 있다[Mark et al., Journal of Thoracic Oncology 4(12):1466-1472, 2009]. 이러한 기술은 쉽고 빠르게 다양한 진단에 적용이 가능하며, 암 관련 유전자의 변이 진단 및 분석을 위해 좋은 기술이 되고 있다[Bernard et al., Clinical Chemistry 48(8):1178-1185, 2002]. 그러나 상기한 방법은 돌연변이를 검출하기 위하여 돌연변이가 발생하는 부위에 각각 프로브나 프라이머를 모두 사용해야 하기 때문에 하나의 돌연변이를 검출하기 위하여 여러 반응이 요구되는 번거로움이 있다[Rhodes et al., Diagn mol pathol . 6(1):49-57, 1997, Zuo et al., Modern Pathol . 22:1023-1031, 2009].
파이로씨퀀싱(Pyrosequencing) 분석법은 96 시료를 분석하는데 중합효소연쇄반응 단계를 포함하여 4시간 정도의 시간으로 분석이 가능하며 직접염기서열 분석법에서 필요한 형광결합 증폭단계 없이, 정제와 소식자 결합 단계만으로 간단하게 분석이 가능하며, 정확한 염기서열을 확인하는데 있어서 반 정량적으로 분석하므로 내재된 돌연변이체의 양을 확인할 수 있는 장점을 가진 분석법이라고 보고되어있다[Agaton et al., Gene . 289:3-39, 2002; Kim et al., Diagn Mol Pathol . 17:118-125, 2008]. 그러나 상기 파이로씨퀀싱(Pyrosequencing) 분석법은 고가의 장비가 필요하므로 고가의 분석비용이 소요되는 단점이 있다.
최근에는 돌연변이형을 선택적으로 검출하는 기술로 상기한 방법과는 달리 야생형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 이용하여 다량 존재하는 야생형의 증폭을 억제하는 방법으로 돌연변이를 선택적으로 검출하는 PNA 클램핑(clamping) 기술이 개발되었다. PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다[Nielsen et al., Science, 254:1497-1500, 1991]. PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화 (hybridization) 반응을 일으켜서 겹가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹가닥은 DNA/DNA 겹가닥보다, PNA/RNA 겹가닥은 DNA/RNA 겹가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기(nucleobase)는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소 (Nuclease)나 단백질분해효소 (protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다. PNA 클램핑 기술은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 프로브가 완벽하게 결합되면 효소 등이 인지하지 못하여 증폭반응이 일어나지 않고, 점 돌연변이가 있는 경우에는 PNA 프로브가 완벽하게 결합하지 못하기 때문에 증폭반응이 일어나게 되는 원리를 이용하는 방법으로, 야생형에 비해 극소량 존재하는 돌연변이를 빠르고 정확하게 검출할 수 있어 많이 이용되고 있다.
PNA를 이용한 EGFR 돌연변이 검출 기술로는 PNA를 탐침자로 이용하여 gene scan또는 Taqman probe를 이용하여 검출하는 기술이 있다[US 2010/0009360 A1, Jan.14, 2010]. 그러나 상기 미국공개특허는 EGFR유전자 중 엑손 19 결손의 17mer, 엑손 21 L858R 돌연변이의 15mer, 엑손 20 T790M 돌연변이의 14mer PNA 탐침을 이용한 구체 예만을 제공하고 있고 또한, 돌연변이형을 구별하기 위한 gene scan 또는 Taqman probe를 이용한 방법은 PNA 클램핑 프로브 이외에 용융곡선을 측정하기 위한 형광을 검출할 수 있는 공여체 형광물질(donor fluorophore)과 수용체(acceptor)가 부착되어 있는 프로브가 다량 포함되어 있기 때문에 분석 비용이 높아지는 단점과 이를 위한 고가의 장비가 요구되는 문제점이 있다.
이에 본 발명자들은 길이가 긴(15 내지 30mer, 특히 16 내지 27mer) PNA 클램핑 프로브를 이용하여 야생형과의 증폭 사이클 차이만으로 변이형을 검출함으로써 gene scan 이나 taqman probe를 이용한 변이형 검출 기술보다 간편할 뿐만 아니라, 다량의 야생형의 증폭을 완벽하게 저해하여 변이형의 검출 민감도를 향상시킴으로써 극소량 섞여있는 돌연변이를 높은 민감도로 신속 정확하게 검출할 수 있는, PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 EGFR 돌연변이 검출 기술을 개발하여, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 EGFR 돌연변이 검출 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 EGFR 돌연변이를 검출하는 방법에 사용하기 위한 검출 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1면은
(1) EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 유전자의 엑손 18 야생형 코돈 719, 엑손 19 야생형 코돈 746 내지 749, 엑손 20 야생형 코돈 767 내지 771, 엑손 20 야생형 코돈 768, 엑손 20 야생형 코돈 790, 엑손 21 야생형 코돈 858 또는 861의 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 증폭시키는 클램핑 프라이머 세트와, 상기 각각의 코돈 부위에 상응하는 야생형 유전자와 완전하게 결합하는 15 내지 30mer의 길이를 갖는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, EGFR 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
(2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 EGFR 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는;
단계를 포함하는, EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제2면은
서열번호 1 내지 91로부터 선택되는 어느 하나의 PNA 클램핑 프로브를 포함하는, 상기 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 PNA 프로브로는 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하고 검출하는 방법이 매우 간단하며, EGFR 유전자의 돌연변이를 단시간 내에 우수한 민감도 및 특이도로 극소량 포함되어 있는 돌연변이까지 검출이 이루어지므로 대량 분석 및 임상에서 사용하기에 매우 용이할 것으로 기대된다.
또한, 본 발명에 따른 EGFR 유전자의 돌연변이 검출방법은 전립선암, 유방암, 결장암, 이자암, 난소암, 지라암, 고환암, 흉선암 및 폐암 등의 종양을 조기에 신속하고 정확하게 검사할 수 있어, 조기 암 진단으로 인한 효율적인 치료를 가능하게 할 것이다.
도 1은 EGFR 엑손 18 코돈 719 돌연변이를 검출하는 프로브의 선별에 있어서,본 발명의 서열번호 6 내지 10의 PNA 프로브를 이용하여 프로브에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이고,
도 2는 EGFR 엑손 19 유전자 결손을 검출하는 프로브의 선별에 있어서, 본 발명의 서열번호 11 및 20 내지 26의 PNA 프로브를 이용하여 프로브에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이며,
도 3은 EGFR 엑손 20 2307_2308 CCAGCGTGG 유전자(a), EGFR 엑손 20 2307_2308 CCAGCGTGG 유전자(b) 및 EGFR 엑손 20 2319_2320 CAC 유전자(c) 삽입을 검출하는 프로브의 선별에 있어서, 본 발명의 서열번호 35 내지 37의 PNA 프로브, 서열번호 42 내지 46의 PNA 프로브 및 서열번호 55 내지 59의 PNA 프로브를 이용하여 프로브에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이고,
도 4는 EGFR 엑손 20 코돈 768 돌연변이를 검출하는 프로브의 선별에 있어서, 본 발명의 서열번호 61 및 62의 PNA 프로브를 이용하여 프로브에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이며;
도 5는 EGFR 엑손 20코돈 790 돌연변이를 검출하는 프로브의 선별에 있어서, 본 발명의 서열번호 69 내지 74의 PNA 프로브를 이용하여 프로브에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이고;
도 6은 EGFR 엑손 21 코돈 858 돌연변이(a) 및 EGFR 엑손 21 코돈 861 돌연변이(b)의 검출 프로브의 선별에 있어서, 본 발명의 서열번호 89 내지 91의 PNA 프로브의 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이며;
도 7은 EGFR 엑손 19 유전자의 결실 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지(a) 및 본 발명의 서열번호 20의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 통한 EGFR 엑손 19 유전자 결실 돌연변이의 포함 농도에 따른 검출 민감도(b)를 비교한 그래프이고,
도 8은 EGFR 엑손 20 코돈 790 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지(a) 및 본 발명의 서열번호 74의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 통한 EGFR 엑손 20 코돈 790 돌연변이의 포함 농도에 따른 검출 민감도(b)를 비교한 그래프이며,
도 9는 EGFR 엑손 21 코돈 858 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지(a) 및 본 발명의 서열번호 90의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR을 통한 EGFR 엑손 21 코돈 858 돌연변이의 포함 농도에 따른 검출 민감도(b)를 비교한 그래프이고,
도 10은 EGFR 돌연변이를 가진 세포주를 대상으로, 종래기술의 PNA 프로브와
본 발명의 서열번호 20(a), 서열번호 90(b) 및 서열번호 74(c)의 PNA 프로브를 이용하여 EGFR 돌연변이 농도에 따른 검출 민감도(ΔCt)를 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이를 검출하는 것이다.
1.PNA 클램핑 프로브의 설계 및 제작
하기 표 1에 열거된 EGFR의 키나제 도메인에서의 변이 엑손 18, 19, 20 또는 21에서의 인프레임 결실(in frame deletion) 또는 치환의 검출을 위하여 PNA 클램핑 프로브를 설계 및 제작하였다.
Figure 112010012958897-pat00001
[del: deletion, ins: insertion]
본 발명의 PNA 프로브는 EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21의 돌연변이 및 유전자의 결실, 삽입 및 치환이 발생하는 부분의 야생형 유전자 서열에 완벽하게 결합할 수 있는(perfectly matched) 것으로서 15개 이상, 바람직하게는 15 내지 30개, 보다 바람직하게는 16 내지 27개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 PNA 프로브는 EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21의 돌연변이 및 유전자의 결실 및 치환이 발생하는 부분이 프로브의 가운데에 위치하고 그 서열은 야생형 유전자의 서열을 갖도록 고안된 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 PNA 프로브는 하기 표 2에 기재한 서열번호 1 내지 91 중 어느 하나에 기재된 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지식을 이용하여 용이하게 변형할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것인 바, 16mer 이상의 길이를 갖는 PNA 프로브로서 본 발명에 따른 PNA 클램핑 실시간 PCR을 이용하여 증폭 사이클 차이만으로 EGFR 엑손 18, 19, 20 또는 21의 돌연변이 및 유전자의 결실 및 삽입 그리고 치환이 발생하는 부분을 효과적으로 검출해낼 수 있는 것인 한, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.
구체적으로는, 서열번호 1 내지 10은 EGFR 엑손 18의 코돈 719의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고, 돌연변이를 검출하기 위한 프로브이다. 상기 검출하는 엑손 18에서의 돌연변이는 뉴클레오티드 2155의 구아닌이 티민 또는 아데닌으로 치환되어 코돈 719의 야생형 글리신이 각각 시스테인 또는 세린으로 치환된 것과 뉴클레오티드 2156의 구아닌이 시토신으로 치환되어 코돈 719의 야생형 글리신이 알라닌으로 치환된 것이 포함된다. 서열번호 1 내지 10은 EGFR 엑손 18의 코돈 719를 포함하는 2146 내지 2166번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다. 서열번호 11 내지 26은 EGFR 엑손 19의 코돈 746 내지 759 부분의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브이다. 상기 EGFR의 엑손 19에 존재하는 유전자 돌연변이에는 코돈 746 내지 759의 결실이 포함되며, 뉴클레오티드 2235 내지 2258에서 9, 12, 15, 18mer의 뉴클레오티드가 결실되어 있거나, 뉴클레오티드의 결실과 동시에 치환되어 있는 것이 포함된다. 서열번호 11 내지 26은 EGFR 엑손 19의 코돈 746 내지 759를 포함하는 2233 내지 2260번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다. 서열번호 27 내지 59는 EGFR 엑손 20의 코돈 767 내지 771의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브이다. 상기 EGFR 엑손 20에 존재하는 유전자 돌연변이에는 뉴클레오티드 2307와 뉴클레오티드 2308 사이에 CCAGCGTGG가 삽입되는 것과, 뉴클레오티드 2319와 뉴클레오타이드 2320의 사이에 시토신, 아데닌 및 시토신(CAC)이 삽입된 것(2319_2320 ins CAC), 그리고 뉴클레오티드 2310와 뉴클레오티드 2311 사이에 구아닌, 구아닌 및 티민(GGT)이 삽입된 것이 포함된다. 서열번호 27 내지 59는 EGFR 엑손 20의 코돈 767 내지 771을 포함하는 2292 내지 2330번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다. 서열번호 60 내지 65는 EGFR 엑손 20의 코돈 768의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브이다. 상기 EGFR 엑손 20에 존재하는 돌연변이는 뉴클레오티드 2303의 구아닌이 티민으로 치환된 것으로서 이 치환의 결과, 아미노산이 치환되는데, 아미노산 768의 야생형 세린이 이소루신으로 대체된다. 서열번호 60 내지 65는 EGFR 엑손 20의 코돈 768을 포함하는 2292 내지 2315번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다. 서열번호 66 내지 78은 EGFR 엑손 20의 코돈 790의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브이다. EGFR 엑손 20의 코돈 790에서의 돌연변이에는 뉴클레오티드 2369의 시토신이 티민으로 치환된 것이 포함되는데 이 치환의 결과, 아미노산이 치환되며, 아미노산 790의 야생형인 트레오닌이 메티오닌으로 대체된다. 서열번호 66 내지 78은 EGFR 엑손 20의 코돈 790을 포함하는 2359 내지 2380번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다. 서열번호 79 내지 91은 EGFR 엑손 21의 코돈 858 및 861의 야생형과 완벽하게 결합하여 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하기 위한 프로브이다. 상기 유전자의 치환은 EGFR의 엑손 21에 존재하는 돌연변이는 적어도 하나의 아미노산의 치환이 포함되며, 이에는 뉴클레오티드 2573의 티민이 구아닌으로 치환되는 것이 포함된다. 상기 치환의 결과로 아미노산 858의 야생형 류신이 아르기닌으로 대체된다. 또한 엑손 21에서의 상기 치환에는 뉴클레오티드 2582의 티민이 아데닌으로 치환된 것이 포함되며, 이 치환의 결과, 아미노산 861의 야생형 류신이 글루타민으로 대체된다. 서열번호 79 내지 91은 EGFR 엑손 21의 코돈 858 및 861을 포함하는 2567 내지 2589번째 염기에 특이적으로 혼성화되도록 고안되었다.
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Figure 112010012958897-pat00003
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상기 프로브들 중 대표적으로 서열번호 6 내지 10의 프로브를 적용하여 엑손 18의 코돈 719의 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과, 서열번호 8 내지 10의 프로브 모두 우수한 효과를 나타내며 특히 서열번호 8의 프로브가 보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 1 참조).
서열번호 11 및 20 내지 26의 프로브를 적용하여 엑손 19의 코돈 746 내지 759 야생형의 증폭을 저해하고 유전자 결손이 있는 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과 서열번호 11 및 20의 프로브가 우수한 효과를 나타내며 특히 서열번호 20의 프로브가 보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 2 참조).
서열번호 35 내지 37 및 42 내지 46 그리고 55 내지 59의 프로브를 적용하여 엑손 20의 코돈 767 내지 771 야생형의 증폭을 저해하고 유전자 삽입이 있는 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과 서열번호 35, 42, 43, 55 및 58의 프로브가 우수한 효과를 나타내며, 특히 서열번호 35, 43, 58의 프로브가 보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 3 참조).
서열번호 61 및 62의 프로브를 적용하여 엑손 20의 코돈 768의 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과, 두 개의 프로브 모두 우수한 효과를 나타내며 특히 서열번호 62의 프로브가 보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 4 참조).
서열번호 69 내지 74의 프로브를 적용하여 엑손 20의 코돈 790의 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과, 서열번호 72 내지 74의 프로브 모두 우수한 효과를 나타내며 특히 서열번호 74의 프로브가 보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 5 참조).
서열번호 89 내지 91의 프로브를 적용하여 엑손 21의 코돈 858 및 861의 야생형의 증폭을 저해하고 돌연변이를 검출하는 효과를 확인한 결과, 서열번호 89 내지 91의 프로브 모두 우수한 효과를 나타내며 특히 서열번호 90의 프로브가 보다 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다(도 6 참조).
본 발명의 PNA 프로브는 반응효율 및 용해도를 증가시키기 위해 N-말단 또는 C-말단에 친수성 기능기를 포함할 수 있으며, 예로서 N-말단 또는 C-말단에 친수성 링커나 친수성 아미노산, 또는 아민기를 1개 내지 여러 개 포함할 수 있다[J Chem Technol Biotechnol 81: 892-899, 2006; Tetrahedron Lett 39:7255-7258, 1998; Proc Natl Acad Sci USA 99:5953-5958, 2002; Anal Chem 69:5200-5202, 1997]. 구체적인 예로서, N-말단에 라이신(lysine)이 1개 부착된 PNA 프로브를 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다[Dueholm et al., J Org chem . 59(19): 5767-5773, 1994; Christensen J peptide Sci 1(3): 175-183, 1995; Thomson et al., Tetrahedron 51(22): 6179-6194, 1995].
2. EGFR 유전자 클램핑 프라이머의 설계 및 제작
본 발명에서 "EGFR 유전자 클램핑 프라이머"라 함은 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있는 야생형 유전자의 증폭은 억제하고, PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있지 않는(즉, 미스매치가 존재하는) 돌연변이 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 가리킨다.
본 발명의 클램핑 프라이머는 특별히 제한되는 것은 아니나, 보다 높은 민감도 및 특이도로 돌연변이를 검출하기 위해서는 PNA 클램핑 프로브를 기준으로 하여 한 방향으로는 PNA 프로브와 일부분이 겹쳐지도록 하며 다른 한 방향으로는 검출하고자 하는 부위를 포함하되 PCR 증폭산물의 크기를 고려하여 고안하는 것이 바람직하다. 또한 PNA 프로브와의 Tm을 고려하고, 길이는 17mer 내지 30mer, 특히 17mer 내지 24mer 사이이며, PNA 프로브의 Tm 보다 낮게 설계하는 것이 바람직하다. 진단 민감도 및 특이도를 극대화할 수 있도록, 야생형과 상보적으로 결합하는 PNA 클램핑 프로브 서열 중 돌연변이가 일어나는 염기 바로 앞부분을 포함하도록 설계하는 것이 바람직하다. 구체적인 예에 따르면, 서열번호 1 내지 91의 PNA 프로브와 3 내지 12개의 염기서열이 포함되도록 17mer 내지 30mer, 특히 17mer 내지 24mer의 클램핑 프라이머를 설계하였다.
본 발명에서 예시된 서열번호 103의 정방향 프라이머는 서열번호 1 내지 10의 EGFR 유전자 엑손 18의 코돈 719의 상류 부분 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 본 발명에서 예시된 서열번호 103의 정방향 프라이머와 조합되는 서열번호 102의 역방향 프라이머는 EGFR 유전자 인트론 18 부위의 64 내지 83번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 서열번호 106 내지 110의 정방향 및 역방향 프라이머는 서열번호 11 내지 26의 EGFR 유전자 엑손 19의 결손의 상류 부분 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다.
본 발명에서 예시된 서열번호 106 내지 109의 정방향 프라이머와 조합되는 서열번호 105의 역방향 프라이머는 EGFR 유전자 인트론 19 부위의 56 내지 75번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었으며, 또한 서열번호 110의 역방향 프라이머와 조합되는 서열번호 104의 정방향 프라이머는 EGFR 유전자 인트론 19 부위의 7 내지 26번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 서열번호 114 내지 120의 정방향 프라이머는 서열번호 27 내지 78의 EGFR 유전자 엑손 20의 유전자 삽입 및 코돈 768, 790의 상류 부분 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다.
본 발명에서 예시된 서열번호 114 내지 120의 정방향 프라이머와 조합되는 서열번호 113의 역방향 프라이머는 EGFR 유전자 엑손 20 부위의 119 내지 138번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 서열번호 122 및 123의 정방향 프라이머는 서열번호 79 내지 91의 EGFR 유전자 엑손 21의 유전자 코돈 858 및 861의 상류 부분 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다.
본 발명에서 예시된 서열번호 122 및 123의 정방향 프라이머와 조합되는 서열번호 121의 역방향 프라이머는 EGFR 유전자 인트론 21 부위의 16 내지 35번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었다. 프라이머의 길이는 17mer 내지 30mer, 특히 17mer 내지 24mer 사이로 각각 프라이머 조합의 증폭산물의 크기가 50 bp 내지 500 bp가 되도록 고안되었다.
한편, EGFR 유전자의 엑손 18 및 19의 염기서열분석을 통한 유전자 확인을 위하여 본 발명에서 제공되는 서열번호 95 및 101, 104, 111의 정방향 프라이머는 EGFR 유전자 인트론 18 부위의 -159 내지 -139번째 염기, 엑손 18 부위의 9 내지 28번째 염기, 엑손 19 부위의 7 내지 26번째 염기 및 인트론 19 부위의 -197 내지 -178번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었고, 상기 프라이머와 조합되는 역방향 프라이머는 서열번호 96으로 EGFR 유전자 인트론 18 부위의 165 내지 184번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었으며, 프라이머의 길이는 17mer 내지 30mer, 특히 17mer 내지 24mer 사이로 고안되었다. 이들 프라이머는 조합되어 증폭산물의 크기가 400 bp 내지 1500 bp가 되도록 고안되었다.
EGFR 유전자의 엑손 20의 염기서열분석을 통한 유전자 확인을 위하여, 본 발명에서 제공되는 서열번호 97 및 112의 정방향 프라이머는 EGFR 유전자 인트론 20 부위의 -200 내지 -181번째 염기 및 인트론 20 부위의 -95 내지 -77번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었고, 상기 프라이머와 조합되는 역방향 프라이머는 서열번호 98으로 EGFR 유전자 인트론 20 부위의 170 내지 189번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었으며 프라이머의 길이는 17mer 내지 30mer, 특히 17mer 내지 24mer 사이로 고안되었다. 이들 프라이머는 조합되어 증폭산물의 크기가 300 bp 내지 700 bp가 되도록 고안되었다.
EGFR 유전자의 엑손 21의 염기서열분석을 통한 유전자 확인을 위하여, 본 발명에서 제공되는 서열번호 99의 정방향 프라이머는 EGFR 유전자 인트론 21 부위의 -28 내지 -9번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었고, 상기 프라이머와 조합되는 역방향 프라이머는 서열번호 100으로 EGFR 유전자 인트론 21 부위의 259 내지 278번째 염기를 특이적으로 인식하도록 고안되었으며, 프라이머의 길이는 17mer 내지 30mer, 특히 17mer 내지 24mer 사이로 고안되었다. 이들 프라이머는 조합되어 증폭산물의 크기가 300 bp 내지 700 bp가 되도록 고안되었다. 각각의 프라이머의 특성은 하기 표 3에 정리되어 있다.
Figure 112010012958897-pat00005
3. PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 EGFR 돌연변이 검출
본 발명에 따른 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출방법은
(1) EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 유전자의 엑손 18 야생형 코돈 719, 엑손 19 야생형 코돈 746 내지 749, 엑손 20 야생형 코돈 767 내지 771, 엑손 20 야생형 코돈 768, 엑손 20 야생형 코돈 790, 엑손 21 야생형 코돈 858 또는 861의 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 증폭시키는 클램핑 프라이머 세트와, 상기 각각의 코돈 부위에 상응하는 야생형 유전자와 완전하게 결합하는 15 내지 30mer의 길이를 갖는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, EGFR 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
(2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 EGFR 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는;단계를 포함한다.
본 발명의 상기 단계 (1)의 EGFR 유전자는 대상 검체로부터 추출하여 준비한다. 본 발명에서는 핵산추출에 특별한 제한이 없으며, 일반적으로 사용하는 모든 핵산 추출방법을 사용할 수 있으며, 시판중인 핵산 추출키트 등을 사용하여 환자의 혈액 또는 종양 표본으로부터 DNA를 추출하여 준비한다.
본 발명의 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이는 엑손 18 G719X의 치환; 엑손 19의 결손 또는 결손 및 치환; 엑손 20의 삽입, S768I 또는 T790M의 치환; 엑손 21 L858R 또는 L861Q의 치환;으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 (1) 단계의 PNA 클램핑 프로브는 16 내지 27mer의 길이의 염기서열로 이루어지는 것으로, 서열번호 1 내지 91로부터 선택되는 어느 하나인 것을 포함한다.
본 발명의 상기 단계 (1)의 EGFR 유전자 클램핑 프라이머 세트는 정방향 프라이머로서 서열번호 103, 106 내지 109, 114 내지 120, 122 및 123로부터 선택되는 어느 하나 이상인 프라이머를 포함하고, 바람직하게는 서열번호 103, 108, 115, 118 내지 120 및 122로부터 선택되는 어느 하나 이상인 프라이머이며, 역방향 프라이머로서는 서열번호 110의 프라이머를 포함한다.
본 발명의 상기 단계 (1)의 PNA 클램핑 프로브는 N-말단 또는 C-말단 친수성 기능기를 포함하며, 실시간 PCR 클램핑의 반응물 중 PNA 클램핑 프로브는 1 내지 1000 nM의 최종농도를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명은 실시간 PCR 클램핑 방법을 이용하여 EGFR 유전자의 돌연변이를 검출한다. 상기 실시간 PCR 클램핑 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클의 수(Cycle threshold, 이하 'Ct'라 함)로 나타내므로 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 상기 방법은 전기영동 후, 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭 정도를 자동화 및 수치화시켜 신속·간편하게 진단할 수 있는 방법이다.
본 발명에서는 인터컬레이터(intercalator) 방법을 이용하여 형광을 검출하는데, 이 방법은 증폭된 이중가닥 DNA에 형광표지가 결합해 형광을 발하게 되는데 이때의 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 측정하게 된다.
본 발명에서는 유전자 증폭산물을 확인하기 위한 형광물질로서 실시간 유전자 검출방법에 사용되는 DNA-결합 형광물질(DNA-binding fluorophore)을 사용하며 그 종류에 특별한 제한은 없다. 예를 들어, 사이버 그린(SYBR Green) I 외에도 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, SYTOX Orange 등을 사용할 수 있다(Gudnason et al ., Nucleic Acids Res. 35(19):e127, 2007; Bengtsson et al ., Nucleic Acids Res . 31(8):e45; Wittwer et al., Clinical Chemistry 49(6):853-860, 2003).
본 발명에서는 실시간 PCR 클램핑에 의한 유전자 증폭을 분석하여, EGFR 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는 바, 증폭된 Ct값을 비교하여 EGFR 유전자의 돌연변이 유무를 확인할 수 있다. 야생형 유전자와 혼성화되도록 고안된 PNA 프로브가 EGFR 돌연변이 코돈 유전자 부위에 혼성화되어 증폭을 저해하게 되면 증폭이 저해되어 높은 Ct값이 나타나게 된다.
돌연변이 유무 및 그 농도는 하기 식 1에 의해 얻어지는 △Ct값으로부터 확인한다.
Figure 112010012958897-pat00006
돌연변이형 유전자가 다량 포함되어 있을수록 Ct 값이 낮게 나타나므로, △Ct 값은 큰 값을 나타내게 된다.
본 발명은 Real-Time PCR 및 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 전립선암, 유방암, 결장암, 이자암, 난소암, 지라암, 고환암, 흉선암 및 폐암으로부터 선택되는 1종 이상의 암의 치료 또는 진단하는데 이용할 수 있으며, EGFR 신호 전달 체계에 관여하는 기작을 연구하는 데에도 매우 유용하게 사용될 수 있다. 또한 개체군-기초 연구와 같이 다량의 시료 분석을 요구하는 연구에도 효과적으로 적용될 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
[ 실시예 1] EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21의 돌연변이 및 유전자의 결실, 삽입 및 치환되는 야생형의 증폭을 억제하기 위한 PNA 프로브 합성
EGFR 유전자의 엑손 18, 19, 20 및 21의 돌연변이 및 유전자의 결실, 삽입 및 치환의 야생형과 완벽하게 결합하는 91개의 PNA 프로브를 상기 표 2에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 각 코돈의 야생형과 완벽하게 결합하는 프로브는 돌연변이와의 효과적인 분리를 위하여 돌연변이가 일어나는 염기서열이 프로브의 중간에 위치하도록 고안하였다. 한국등록특허 제464261호에 기재된 방법에 따라, PNA 프로브를 합성하였다[Lee et al ., Org Lett , 9:3291-3293, 2007].
[ 실시예 2] EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21의 돌연변이 및 유전자의 결실, 삽입 및 치환의 표적핵산을 증폭하기 위한 프라이머 합성
EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21의 돌연변이 및 유전자의 결실, 삽입 및 치환의 표적핵산의 증폭 및 클램핑 PCR을 위하여 EGFR 유전자의 엑손 18, 19, 20 및 21 부위를 분석하여 프라이머를 제작하였다. 상기 프라이머는 EGFR 엑손 18 및 19의 야생형 및 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 서열번호 95 및 96으로 이루어진 프라이머 한 세트와 엑손 18의 코돈 719의 유전자를 확인하기 위한 서열번호 101 및 102로 이루어진 프라이머 한 세트, 엑손 19의 유전자 결손을 확인하기 위한 서열번호 104 및 111과 조합되는 서열번호 105로 이루어진 프라이머 한 세트와 서열번호 103 및 서열번호 106 내지 109의 EGFR 엑손 18 코돈 719 및 엑손 19 유전자 결손의 클램핑 프라이머를 합성하였으며, 엑손 18 코돈 719의 클램핑에 사용된 역방향 프라이머는 EGFR 엑손 18 코돈 719 유전자를 확인하기 위하여 고안된 서열번호 102의 역방향 프라이머를 동일하게 사용하였고, 엑손 19 유전자 결손의 클램핑에 사용된 역방향 프라이머는 서열번호 EGFR 엑손 19 유전자 결손을 확인하기 위하여 고안된 서열번호 105의 역방향 프라이머를 동일하게 사용하였다.
EGFR 엑손 20의 유전자 삽입 및 코돈 768 및 790의 야생형 및 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 서열번호 97 및 98으로 이루어진 프라이머 한 세트와 서열번호 112 및 113으로 이루어진 프라이머 한 세트, 서열번호 114 내지 120의 EGFR 엑손 20의 유전자 삽입 및 코돈 768 및 790의 클램핑 프라이머를 합성하였으며, EGFR 엑손 20의 유전자 삽입 및 코돈 768 및 790 클램핑에 사용된 역방향 프라이머는 EGFR 엑손 EGFR 엑손 20의 유전자 삽입 및 코돈 768 및 790 유전자를 확인하기 위하여 고안된 서열번호 113의 역방향 프라이머를 동일하게 사용하였다.
EGFR 엑손 21의 코돈 858 및 861의 야생형 및 돌연변이 유전자를 확인하기 위한 서열번호 99 및 100으로 이루어진 프라이머 한 세트와 서열번호 122 및 123의 EGFR 엑손 21의 코돈 858 및 861의 클램핑 프라이머를 합성하였으며, EGFR 엑손 21의 코돈 858 및 861 클램핑에 사용된 역방향 프라이머로 서열번호 122의 프라이머를 합성하여 사용하였다. 사용한 프라이머의 서열은 상기 표 3에 나타낸 바와 같다. 프라이머는 ㈜바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
[ 실시예 3] EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21의 표적핵산을 제조하기 위한 돌연변이유발 및 클론제조
인간의 전체 DNA를 이용하여 서열번호 95 및 96 한 세트와 97 및 98 한 세트, 99 및 100 한 세트 프라이머를 적용하여 EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21 부분의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 핵산을 pGEM-T 이지 벡터(promega, USA)에 결찰하고 E. Coli JM 109 세포에 형질전환하여 DNA를 대량 확보하였다. 변이 유전자를 가진 클론을 확보하기 위해 상기한 방법으로 제조된 정상 클론을 이용하여 돌연변이용 프라이머를 제작하고 부위특이적 돌연변이유발 키트(Stratagene, USA)를 사용하여 변이 유전자를 가진 클론을 확보하였다. 확보된 클론은 염기서열 분석으로 그 변이 여부를 확인하였다.
[ 실시예 4] EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21의 야생형 및 돌연변이 세포주( cell line)로부터의 핵산 추출
EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21의 돌연변이 및 유전자의 결실, 삽입 및 치환의 야생형 및 돌연변이의 표적핵산을 확보하기 위하여, 미국표준세포주은행 및 한국세포주은행으로부터 세포주를 분양 받았다. 야생형 세포주로 A549(genomic DNA) 인간 폐암 세포주[KCLB10185, 한국세포주은행(KCLB), 서울, 한국]를 분양 받았으며, 하기 표 4의 돌연변이 세포주들은 한국세포주은행 및 미국표준세포주은행으로부터 분양 받았다.
Figure 112010012958897-pat00007
상기 분양 받은 세포주는 RPMI1640(Hyclone, Thermo scientific, USA)에 10% 열-불활성화 우태아혈청(FBS, Hyclone, Thermo scientific, USA)과 1X 페니실린-스트렙토마이신(Welgene, Korea)이 첨가된 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO2)가 유지되는 배양기에서 배양하였다. 배양된 세포주는 High Pure PCR Template Preparation Kit(Roche, USA)를 사용하여 키트에서 제공한 매뉴얼에 의거하여 DNA를 추출하여 표적핵산을 확보하였다. 상기 확보된 핵산은 나노드롭 스펙트로포토미터(ND 2000C, Thermo Scientific, USA)를 사용하여 정량하고 -20℃에 보관하여 사용하였다.
상기 분양 받은 인간 세포주들로부터 각각 분리한 전체 DNA를 상기 표 3에 기재되어 있는 서열번호 95 및 96의 프라이머 세트와 서열번호 97 및 98의 프라이머 세트, 서열번호 99 및 100 프라이머 세트를 적용하여 EGFR 엑손 18, 19, 20 및 21 부분의 유전자를 증폭하였다. 증폭된 PCR 산물을 LabopassTM PCR 정제 키트(코스모진텍, 한국)를 사용하여 정제한 후 염기서열을 분석하여 유전자형을 확인하였다. 유전자형이 확인된 야생형 및 변이형 세포주는 본 발명의 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법의 검체로 사용하였다.
[ 실시예 5] EGFR 엑손 15 코돈 600에 대한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법 확립
실시예 3에서의 클론으로부터 추출된 DNA와 실시예 4에서의 세포주로부터 추출된 DNA를 이용하여 하기 조건으로 실시간 PCR 클램핑을 수행하여 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 방법을 확립하고 최적의 PNA 프로브를 선정하였다.
클론에서 추출된 DNA 용액 1 ㎕ 또는 cell line에서 추출된 주형 DNA 용액(50 ng/㎕) 1 ㎕, 상기 표 2에 나타난 1개의 정방향의 클램핑 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 역방향의 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 상기 표 2에 나타낸 프로브 중 1개의 클램핑 프로브(100 nM) 1 ㎕, 2X IQ Sybr 그린 슈퍼믹스(Bio-Rad, USA) 10 ㎕, 증류수 6 ㎕를 가하고 실시간 DNA 증폭기(Real-time PCR machine, CFX96TM Real-Time PCR System, Bio-RAD사 제품)를 이용하여 95℃에서 3분 동안 반응시킨 후 95℃ 30초, 70℃ 20초, 63℃ 30초, 72℃ 30초로 이루어진 반응과정을 40회 반복하였다. 형광은 72℃ 중합반응 단계에서 측정하였다. 그 결과는 도 1 내지 6에 나타내었다.
[ 실시예 6] PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 EGFR 유전자의 돌연변이 검출한계 측정
상기 실시예 5에서 확립된 실시간 PCR 클램핑 방법을 사용하여 야생형 유전자에 돌연변이 유전자를 각각 50 ng, 20 ng, 10 ng, 5 ng, 1 ng이 포함하도록 제작하여 돌연변이 유전자의 농도에 따른 Ct값 사이의 상관관계를 분석하여, 돌연변이형의 검출한계를 확인하였다.
그 결과를 도 7 내지 9에 나타내었다. 도 7 내지 9에 나타난 바와 같이, 용액 내 상대적인 돌연변이 유전자의 농도가 높을수록 형광이 역치값에 도달하는 반응횟수를 나타내는 Ct값이 일정하게 감소하여 용액 내 돌연변이 유전자의 농도와 Ct값 사이에 상관관계가 있음을 확인할 수 있었다.
[ 비교예 1] EGFR 돌연변이 유전자 검출을 위한 종래기술과의 비교
미국공개특허 US2010/0009360에 개시된 PNA 프로브와 본 발명에 따른 PNA 프로브를 비교하기 위하여, 하기 표 5에 나타낸 바와 같은 상기 미국공개특허의 EGFR 엑손 19 유전자 결실 및 엑손 20의 코돈 790, 엑손 21의 코돈 858의 돌연변이의 야생형에 대한 PNA 프로브를 제작하였다.
Figure 112010012958897-pat00008
상기 미국공개특허의 프로브와 본 발명에 따른 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 실시하여 돌연변이 검출여부를 확인하였다.
그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10의 a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 미국공개특허 서열번호 92의 프로브 사용 시에는 돌연변이형의 존재나 농도 증가에 따라 Ct값에 별다른 차이가 없어(즉 ΔCt값이 작아) 돌연변이 검출이 어려웠던 것에 비해, 본 발명에 따른 PNA 프로브 사용 시 돌연변이형의 존재에 의해 Ct값이 크게 감소할(즉 ΔCt값이 클) 뿐만 아니라, 돌연변이형의 농도 증가에 따라 Ct값이 일정하게 감소하여 돌연변이형을 효과적으로 검출해낼 수 있었다.
또한, 도 10의 b의 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이, 미국공개특허의 서열번호 94 프로브 사용 시에는 돌연변이형의 존재나 농도 증가에 따라 Ct값에 별다른 차이가 없어(즉 ΔCt값이 작아) 돌연변이의 검출이 어려웠던 것에 비해, 본 발명에 따른 PNA 프로브 사용 시 돌연변이형의 존재에 의해 Ct값이 크게 감소할(즉 ΔCt값이 클) 뿐만 아니라, 돌연변이형의 농도 증가에 따라 Ct값이 일정하게 감소하여 돌연변이형을 효과적으로 검출해낼 수 있었다.
마지막으로 도 10의 c로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 미국 공개특허 서열번호 93 프로브 본 발명에 따른 PNA 프로브와 유사한 검출 민감도를 나타내나, 본 발명의 돌연변이형 검출이 조금 더 높은 ΔCt값을 나타내고 있어, 본 발명에 따른 PNA 프로브를 사용으로 1%의 비율로 섞여있는 돌연변이의 유무도 검출할 수 있음을 확인할 수 있었다.
<110> Panagene Inc. <120> Methods and kits for the EGFR mutant detection using PNA mediated Real-time PCR clamping <160> 123 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18CS-21-1 <400> 1 aaagtgctgg gctccggtgc g 21 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18CS-20-1 <400> 2 aagtgctggg ctccggtgcg 20 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18CS-20-2 <400> 3 aaagtgctgg gctccggtgc 20 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18CS-19-1 <400> 4 aagtgctggg ctccggtgc 19 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18CS-18-1 <400> 5 gtgctgggct ccggtgcg 18 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18CAS-21-1 <400> 6 cgcaccggag cccagcactt t 21 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18CAS-20-1 <400> 7 cgcaccggag cccagcactt 20 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18CAS-20-2 <400> 8 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DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2017CAS-21 <400> 44 tggtggttgt ccacgctggc 20 <210> 45 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2017CAS-19 <400> 45 ggtggttgtc cacgctggc 19 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2017CAS-18 <400> 46 ggtggttgtc cacgctgg 18 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2016CS-21-1 <400> 47 acaaccccca cgtgtgccgc c 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2016CS-21-2 <400> 48 caacccccac gtgtgccgcc t 21 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2016CS-20-1 <400> 49 caacccccac gtgtgccgcc 20 <210> 50 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2016CS-19-1 <400> 50 aacccccacg tgtgccgcc 19 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2016CS-21-3 <400> 51 acaacctcca cgtgtgccgc c 21 <210> 52 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2016CS-21-4 <400> 52 caacctccac gtgtgccgcc t 21 <210> 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62 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S768ICS-19 <400> 62 tgatgcccag cgtggacaa 19 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S768ICAS-21 <400> 63 gttgtccacg ctggccatca c 21 <210> 64 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S768ICAS-20 <400> 64 gttgtccacg ctggccatca 20 <210> 65 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> S768ICAS-19 <400> 65 ttgtccacgc tggccatca 19 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCS-21-1 <400> 66 cagctcatca cgcagctcat g 21 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCS-20-1 <400> 67 cagctcatca cgcagctcat 20 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCS-20-2 <400> 68 agctcatcac gcagctcatg 20 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCS-19-1 <400> 69 agctcatcac gcagctcat 19 <210> 70 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCS-19-2 <400> 70 gctcatcacg cagctcatg 19 <210> 71 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCS-19-3 <400> 71 cagctcatca cgcagctca 19 <210> 72 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCS-18-1 <400> 72 agctcatcac gcagctca 18 <210> 73 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCS-18-2 <400> 73 gctcatcacg cagctcat 18 <210> 74 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCS-17-1 <400> 74 gctcatcacg cagctca 17 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCAS-21-1 <400> 75 catgagctgc gtgatgagct g 21 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCAS-20-1 <400> 76 atgagctgcg tgatgagctg 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCAS-20-2 <400> 77 catgagctgc gtgatgagct 20 <210> 78 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790MCAS-19-1 <400> 78 atgagctgcg tgatgagct 19 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CS-22-1 <400> 79 ttgggctggc caaactgctg gg 22 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CS-21-1 <400> 80 ttgggctggc caaactgctg g 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CS-21-2 <400> 81 tgggctggcc aaactgctgg g 21 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CS-20-1 <400> 82 tgggctggcc aaactgctgg 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CS-20-2 <400> 83 ttgggctggc caaactgctg 20 <210> 84 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CAS-22-1 <400> 84 cccagcagtt tggccagccc aa 22 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CAS-21-1 <400> 85 ccagcagttt ggccagccca a 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CAS-21-2 <400> 86 cccagcagtt tggccagccc a 21 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CAS-20-1 <400> 87 ccagcagttt ggccagccca 20 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CAS-20-2 <400> 88 cagcagtttg gccagcccaa 20 <210> 89 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CAS-19-1 <400> 89 cagcagtttg gccagccca 19 <210> 90 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CAS-19-2 <400> 90 agcagtttgg ccagcccaa 19 <210> 91 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21CAS-19-3 <400> 91 ccagcagttt ggccagccc 19 <210> 92 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E19-patent <400> 92 agatgttgct tctctta 17 <210> 93 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790M-patent <400> 93 tcatcacgca gctc 14 <210> 94 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> L858R-Patent <400> 94 agtttggcca gccca 15 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-exon18/19-F-1 <400> 95 gcgtacattt gtccttccaa a 21 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-exon18/19-R <400> 96 ggccagtgct gtctctaagg 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-exon20-F <400> 97 ctctcccact gcatctgtca 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-exon20-R <400> 98 gatgggacag gcactgattt 20 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-exon21-F <400> 99 cctcacagca gggtcttctc 20 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EGFR-exon21-R <400> 100 atcctgcagg gagagactga 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18-B-F <400> 101 gcctcttaca cccagtggag 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18-B-R <400> 102 acagcttgca aggactctgg 20 <210> 103 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E18 clamping F' <400> 103 gaattcaaaa agatcaaagt gctg 24 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E19-B-F <400> 104 tggatcccag aaggtgagaa 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E19-B-R <400> 105 cagctgccag acatgagaaa 20 <210> 106 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E19 clamping F' <400> 106 cgtcgctatc aaggaattaa ga 22 <210> 107 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E19 clamping F-1 <400> 107 aaattcccgt cgctatcaag 20 <210> 108 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E19 clamping F-2 <400> 108 aaaattcccg tcgctatcaa 20 <210> 109 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E19 clamping F-3 <400> 109 ggccaaaatt cccgtcgcta tcaa 24 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E19 clamping R <400> 110 gatttccttg ttggctttcg 20 <210> 111 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E19 internal F <400> 111 gattcgtgga gcccaacagc 20 <210> 112 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E20-B-F <400> 112 atcgcattca tgcgtcttc 19 <210> 113 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E20-B-R <400> 113 gtctttgtgt tcccggacat 20 <210> 114 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E20 clamping F <400> 114 aagcctacgt gatggccag 19 <210> 115 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E20 clamping F-1 <400> 115 gaagcctacg tgatggcc 18 <210> 116 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2016 clamping F <400> 116 gtggacaacc cccacgt 17 <210> 117 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2016 clamping F-1 <400> 117 gcgtggacaa cccccac 17 <210> 118 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> T790M clamping F <400> 118 tccaccgtgc agctcatc 18 <210> 119 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2016 clamping F-2 <400> 119 ggccagcgtg gacaacc 17 <210> 120 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E2017 clamping F <400> 120 gtgatggcca gcgtggac 18 <210> 121 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21-B-R <400> 121 ggaaaatgct ggctgaccta 20 <210> 122 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21 clamping F <400> 122 gatcacagat tttgggctgg 20 <210> 123 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E21 clamping F-1 <400> 123 tgtcaagatc acagattttg gg 22

Claims (12)

  1. (1) EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 유전자의 엑손 18 야생형 코돈 719, 엑손 19 야생형 코돈 746 내지 749, 엑손 20 야생형 코돈 767 내지 771, 엑손 20 야생형 코돈 768, 엑손 20 야생형 코돈 790, 엑손 21 야생형 코돈 858 또는 861의 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 증폭시키는 클램핑 프라이머 세트 및,
    상기 각각의 코돈 부위에 상응하는 야생형 유전자와 완전하게 결합하고 상기 프라이머 세트에 포함된 프라이머의 서열과 일부 중복되는,서열번호 1 내지 91로부터 선택되는 어느 하나인 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에,
    EGFR 유전자에 대해 실시간 PCR(real-time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
    (2) DNA 삽입(intercalating) 형광물질로 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 EGFR 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는;
    단계를 포함하는, EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 EGFR 유전자의 돌연변이 검출은 실시간 PCR의 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 EGFR 유전자의 돌연변이 유무 또는 농도를 결정하는 것을 특징으로 하는 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이는 엑손 18 G719X의 치환; 엑손 19의 결손 또는 결손 및 치환; 엑손 20의 삽입, S768I 또는 T790M의 치환; 엑손 21 L858R 또는 L861Q의 치환;으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 (1) 단계의 EGFR 유전자 클램핑 프라이머 세트는 EGFR 유전자 엑손 18 야생형 코돈 719, 엑손 19 야생형 코돈 746 내지 749, 엑손 20 야생형 코돈 767 내지 771, 엑손 20 야생형 코돈 768, 엑손 20 야생형 코돈 790, 엑손 21 야생형 코돈 858 또는 861 상류부분에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출 방법.
  7. 제 6항에 있어서,
    상기 EGFR 유전자 클램핑 프라이머 세트는 정방향 프라이머로서 서열번호 103, 106 내지 109, 114 내지 120, 122 및 123로부터 선택되는 어느 하나 이상의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출 방법.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 EGFR 유전자 클램핑 프라이머 세트는 역방향 프라이머로서 서열번호 110의 프라이머를 포함하는 것을 특징으로 하는 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출 방법.
  9. 삭제
  10. 제1항에 있어서,
    상기 DNA 삽입(intercalating) 형광물질은 사이버 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3 및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것을 특징으로 하는 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출 방법.
  11. 제 1항 또는 제 2항에 있어서,
    상기 EGFR 유전자의 돌연변이 검출은 전립선암, 유방암, 결장암, 이자암, 난소암, 지라암, 고환암, 흉선암 및 폐암으로부터 선택되는 1종 이상의 암의 치료 또는 진단하는데 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출 방법.
  12. EGFR(Epidermal Growth Factor Receptor) 유전자의 엑손 18 야생형 코돈 719, 엑손 19 야생형 코돈 746 내지 749, 엑손 20 야생형 코돈 767 내지 771, 엑손 20 야생형 코돈 768, 엑손 20 야생형 코돈 790, 엑손 21 야생형 코돈 858 또는 861의 뉴클레오티드를 포함하는 부위를 증폭시키는 클램핑 프라이머 세트,
    상기 각각의 코돈 부위에 상응하는 야생형 유전자와 완전하게 결합하고 상기 프라이머 세트에 포함된 프라이머의 서열과 일부 중복되는, 서열번호 1 내지 91로부터 선택되는 어느 하나인 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브,
    및,
    DNA 삽입(intercalating) 형광물질을 포함하는 제1항에 따른 EGFR 유전자의 키나제 도메인 돌연변이 검출방법에 사용하기 위한 키트.
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