KR20110109627A - Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석 방법 및 키트 - Google Patents

Ｐｎａ 기반의 실시간 ｐｃｒ 클램핑을 이용한 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 와파린 대사와 관련된 CYP2C9 및 VKORC1 유전자의 특정 유전형과 특이적으로 결합하는 PNA(peptide nucleic acid) 프로브를 이용하여 특정 유전형의 증폭을 억제함으로써 CYP2C9 및 VKORC1의 유전형을 분석하는 방법, 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것으로서, CYP2C9 및 VKORC1의 유전형을 높은 민감도와 특이도로 분석할 수 있다.

Description

ＰＮＡ 기반의 실시간 ＰＣＲ 클램핑을 이용한 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석 방법 및 키트{Methods and kits for genotyping of warfarin metabolism-associated genes using PNA mediated Real-Time PCR clamping}
본 발명은 PNA(Peptide Nucleic Acid, 이하 'PNA'라 함) 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 와파린(warfarin) 대사관련 유전자 CYP2C9(cytochrome P450, subfamily ⅡC, polypeptide9)과 VKORC1(vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1)의 유전형 분석 방법 및 키트에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 CYP2C9과 VKORC1의 야생형 또는 돌연변이형에 특이적으로 결합하는 PNA 프로브를 이용하여 CYP2C9과 VKORC1의 유전형을 높은 민감도로 분석하는 방법 및 상기 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
와파린이란 심방세동, 심부정맥혈전증 등의 질환이나, 심장판막치환술 등의 치료 단계에서 혈액 응고로 혈관이 막히는 혈전, 색전증 등을 예방하고 치료하기 위해 사용하는 약물로 용량이 부족하면 혈관 막힘으로 중풍 등을 초래하고 용량이 과하면 뇌출혈 등을 일으킬 수 있다[Hirsh et al., Chest, 2001, 119, 8S-21S; Stein et al., Chest, 2001, 119, 220S-227S]. 이러한 와파린은 민족 간, 개개인, 더 나아가 몸무게나 나이, 복용하는 약 등에 따라 적정 투여량이 달라지게 된다[Loebstein et al., Clin. Pharmacol. Ther., 2001, 70, 159-164; Zhao et al., Clin. Pharmacol. Ther., 1996, 76, 210-219; Xie et al., Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2001, 41, 815-851; TaKahashi et al., Clin. Pharmacol. Ther., 2003, 73, 253-263]. 와파린의 적정 투여량이 개개인마다, 민족 간마다 차이 나는 이유는 CYP2C9과 VKORC1 유전자의 유전적 다형성이 다르게 나타나기 때문이다. 이러한 이유로 CYP2C9과 VKORC1의 유전형을 분석하는 것은 와파린의 적정 투여량 결정에 영향을 미칠 수 있다[McClain et al., Genet. Med., 2008, 10, 89-98]. 또한 최근 식품의약품안전청은 항응고제인 와파린의 허가사항에 유전자 변이정보를 검사해 개인별 사용량을 차별화하는 권장사항을 추가한 바 있다.
와파린을 대사하는 CYP2C9 유전자에 대해서는 30여 가지의 유전적 다형성이 알려져 있으며, 서양인에서는 CYP2C9*1(wild type), CYP2C9*2(c. 430C>T), CYP2C9*3(c. 1075A>C)가 주로 발견되고, 한국인에서는 CYP2C9*2는 드물며 CYP2C9*3가 약 3.0%의 빈도로 발견되는 것으로 알려져 있다[Bae et al., Br J Clin Pharmacol., 2005, 60, 418-422; Yoon et al., Br J Clin Pharmacol., 2001, 51, 277-280]. CYP2C9*2와 CYP2C9*3은 효소의 활성을 감소시켜 와파린에 대한 민감도를 감소시키고, 심각한 경우에는 출혈 합병증을 야기시킨다[Furuya et al., Pharmacogenetics, 1995, 5, 389-392; Aithal et al., Lancet, 1999, 353, 717-719; Higashi et al., JAMA, 2002, 287, 1690-1698].
와파린은 VKORC1 유전자의 기능을 억제하여 응고인자들(Ⅱ, Ⅶ, Ⅸ, Ⅹ)의 활성을 억제시켜 항응고 작용을 한다[Yin & Miyata, Thrombosis Research, 2007, 120, 1-10; Yuan et al., Human molecular genetics, 2005, 14, 1745-1751]. VKORC1 유전자 내의 돌연변이가 와파린 약제내성 환자들에게서 발견되었고, 인트론의 유전자 변이도 특정의 와파린 개체간 다양성과 연관이 있다는 것이 밝혀진 바 있다[Rost et al., Nature, 2004, 427, 537-541; Harrington et al., Thromb Haemost., 2005, 93, 23-26; D'Andrea et al., Blood, 2005, 105, 645-649]. VKORC1의 프로모터 서열인 -1639G>A, 인트론 서열인 1173C>T, 3'비번역부위(UTR; untranslated region) 내에 위치한 3730G>A 이 와파린의 적정 투여량을 결정짓는 데 중요한 영향을 미친다. 1173CC형인 경우 1173CT나 1173TT인 경우보다, 3730AA형인 경우에는 3730GG나 3730GA인 경우보다 와파린 투여량을 높여야 하며, -1639AA형인 경우는 -1639GG인 경우보다 투여량을 낮춰야 한다[Yin & Miyata, Thrombosis Research, 2007, 120, 1-10].
그러므로 CYP2C9 430C>T, CYP2C9 1075A>C, 1639G>A, 1173C>T, 3730G>A의 유전자 변이의 분석은 환자에게 와파린을 처방하는 데 있어 적정 용량을 예측하는 데 이용 가능하므로, 와파린 처방의 효율을 향상시킨다. 현재 와파린 처방은 환자에게 규격화된 복용량이 우선 주어지고, 그 후 약물에 대한 반응을 모니터하여 적절한 복용량을 조절하여 환자 개개인마다 다르게 투여된다. 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석에 따라 예상된 복용량은 복용유지량(와파린을 연속 투여할 때에 체액 중의 약물 농도를 적절하다고 알려진 농도 범위로 유지하기 위한 와파린의 복용량)에 훨씬 근접하게 되며, 따라서 와파린 복용이 더 빠르고 안정적이게 된다.
와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법으로는 중합효소연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR) 후 염기서열분석을 통한 변이 검출 방법, 특정 염기서열을 인식해 절단하는 제한효소를 사용하여 절단된 유전형과 절단되지 않은 유전형의 증폭산물의 크기를 통해 분석하는 방법[Chern et al., Clinaca chimica acta, 2006, 367, 108-113], 야생형과 돌연변이형 유전자의 3차원적 구조(conformation) 차이에 따른 전기영동상 이동 거리의 변화를 통해 분석하는 방법인 중합효소연쇄반응-단일쇄 형태구조 다형성(Polymerase chain reaction-single strand conformation polymorphism, PCR-SSCP) 방법[Ieiri et al., Ther Drug Monit., 2000, 22, 237-244] 등이 사용되었다. 그러나 상기 방법들은 PCR 이후 제한효소로 절단하는 과정 및 전기영동의 과정, 염기서열분석의 단계를 거쳐 돌연변이를 분석하는 방법이므로 반응시간이 오래 소요되고 번거로우며 많은 비용이 소요된다.
이러한 문제점을 줄이기 위해 반응 시간을 줄이고 보다 간편하게 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석에 사용되고 있는 방법으로 표적핵산에 특이적인 프라이머를 이용하여 표적핵산을 선택적으로 증폭하는 대립형질 특이적(allele specific) PCR 방법이 대두되었다. 최근에는 민감도를 더 높이기 위해 이 특이적 PCR 방법을 응용한 방법들이 소개되고 있는데, 그 예로 대립형질 특이적 PCR을 수행한 후 칩에 반응시켜 유전형을 분석하는 Autogenomics사의 INFINITI analyzer, 대립형질 특이적인 프라이머의 5'말단에 신호의 발광을 위한 택(tag)을 사용한 Luminex Molecular Diagnostics사의 Tag-It Mutation detection assay 등이 있다. 또한 절단효소(cleavase)와 프로브를 이용한 Third Wave Technologies사의 Invader assay 등도 있다. 이러한 기술은 쉽고 빠르게 다양한 진단에 적용이 가능하지만 표적핵산을 분석하기 위해 표적으로 하는 서열에 특이적인 프로브나 프라이머를 사용해야 하기 때문에 하나의 표적 핵산을 분석하기 위해 여러 반응이 요구되거나 복잡한 단계를 거쳐야 하는 번거로움이 있다[King et al., Am J Clin Pathol., 2008, 129, 876-883].
또 다른 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석법인 파이로씨퀀싱(Pyrosequencing) 분석법은 프라이머-디렉티드 PCR(primer-directed PCR) 과정에서 한번에 하나씩 순차적인 뉴클레오티드의 첨가와 병합에 의해 뉴클레오티드가 병합되면서 방출되는 파이로포스페이트, ATP 설파릴레이즈(sulfurylase) 및 루시퍼레이즈(luciferase) 효소와 짝지어져 빛을 방출시키게 되며, 이 빛을 검출하는 방식으로 이루어진다. 방출된 빛은 순차적으로 들어간 각각의 뉴클레오티드의 반응 순서대로 신호 피크를 나타내고, 이 신호 피크는 병합된 뉴클레오티드의 수와 비례하여 상대적 높이를 나타내게 된다. 파이로씨퀀싱 분석법은 96 시료를 분석하는데 중합효소연쇄반응 단계를 포함하여 약 4시간 내에 분석이 가능하며 직접 염기서열분석법에서 필요한 형광결합 증폭단계 없이, 정제와 프라이머 결합 단계만으로 간단하게 분석이 가능하여, 정확한 염기서열을 확인하는데 있어서 반정량적으로 분석하므로 내재된 돌연변이체의 양을 확인할 수 있는 장점을 가진 분석법이라고 보고되어 있다[King et al., Am J Clin Pathol., 2008, 129, 876-883]. 그러나 파이로씨퀀싱 분석법은 고가의 장비가 필요하므로 고가의 분석비용이 소요되는 단점이 있다.
최근에 실시간(Real-Time) PCR을 이용하여 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법이 대두되었다[Babic et al., Clinica Chimica Acta., 2009, 406, 143-147]. 실시간 PCR법은 PCR 증폭량을 실시간으로 확인하면서 해석하는 방법으로 전기영동이 필요 없어 신속하게 정량할 수 있다. 이 실시간 PCR은 통상 형광시약을 사용하게 된다. 형광을 측정하는 방법에는 크게 인터컬레이팅(intercalating)법, TaqMan™ 프로브법, 분자 비컨(Molecular Beacon)법이 있다.
분자 비컨법의 경우 양 말단을 형광물질(FAM, TAMRA 등)과 소광체(quencher) 물질(DABCYL 등)로 수식한 헤어핀형 이차구조를 갖는 프로브를 PCR 반응액에 첨가하는 방법이다. 분자 비컨 프로브는 유리 상태에서 헤어핀 구조를 취하고 형광 물질과 소광체 물질이 근접해 있어 형광발생이 억제된다. 프로브는 어닐링(annealing) 단계에서 주형과 상보적인 영역에서 특이적으로 혼성화하고 이 때 형광물질과 소광체 물질과의 거리가 멀어져 소광체 물질에 의한 억제가 해소되어 프로브상의 형광색소가 형광을 나타낸다. 한편 혼성화하지 않은 분자 비컨 프로브는 헤어핀 구조를 유지하고 있어 형광을 나타내지 않으며 매 사이클이 돌 때마다 형광이 늘어나게 된다.
TaqMan™ 프로브법은 5'말단에는 형광물질(FAM 등)을, 3'말단에는 소광체 물질(TAMRA 등)을 갖는 프로브를 PCR 반응액에 첨가하는 방법이다. TaqMan™ 프로브는 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 소광체에 의해 형광발생이 억제된다. 연장(extension) 반응 시에 Taq DNA 폴레머레이즈가 갖는 5'→3'엑소뉴클레이즈 활성으로 주형에 혼성화한 TaqMan™ 프로브가 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리됨으로써 소광체에 의한 억제가 해제되어 형광을 발한다. 이 경우 매 사이클이 돌아갈 때마다 증폭량에 비례해서 형광이 강해진다.
인터컬레이팅법은 두 가닥 DNA에 결합하여 형광을 나타내는 시약(Intercalator: 사이버 그린 I, 에티디움브로마이드 등)을 PCR 반응에 첨가하여 증폭과 함께 발색하는 형광을 검출하는 방법이다. 인터컬레이터의 형광강도를 검출하여 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있고, 또한 증폭 DNA의 융해온도를 측정할 수 있다.
기존 방법은 TaqMan™ 프로브법은 비특이적으로 형광을 발산하지 않아 정확하고 증폭산물의 크기에 상관없이 형광이 일정하다는 장점이 있지만 프라이머와 프로브를 따로 제작하여야 한다는 단점이 있다.
PNA는 핵산염기가 인산 결합이 아니라 펩티드 결합으로 연결된 유사 DNA로 1991년에 처음 보고되었다[Nielsen et al., Science, 1991, 254, 1497-1500]. PNA는 화학적인 방법으로 합성되고 자연계에서는 발견되지 않는다. PNA는 상보적인 염기 서열의 천연 핵산과 혼성화(hybridization) 반응을 일으켜서 겹 가닥을 형성한다. 핵산 염기의 수가 같은 경우 PNA/DNA 겹 가닥은 DNA/DNA 겹 가닥보다, PNA/RNA 겹 가닥은 DNA/RNA 겹 가닥보다 안정하다. PNA의 기본 골격으로는 N-(2-아미노에틸)글리신이 아미드 결합에 의해 반복적으로 연결된 것이 가장 흔히 쓰이고, 이 경우 펩티드 핵산의 기본 골격(backbone)은 음전하를 띠는 천연 핵산의 기본 골격과 달리 전기적으로 중성이다. PNA에 존재하는 4개의 핵산 염기는 DNA의 핵산 염기와 비슷한 공간을 차지하고 핵산 염기 사이의 거리도 천연 핵산의 경우와 거의 같다. PNA는 화학적으로 천연 핵산보다 안정할 뿐 아니라 핵산분해효소(nuclease)나 단백질분해효소(protease)에 의해 분해되지 않아 생물학적으로도 안정하다. PNA는 또한 전기적으로 중성이기 때문에 PNA/DNA, PNA/RNA 겹 가닥의 안정성은 염 농도에 영향을 받지 않는다. 이러한 성질 때문에 PNA는 상보적인 핵산 염기 서열을 천연 핵산보다 더 잘 인식할 수 있어서 진단 또는 다른 생물학적, 의학적 목적으로 응용된다.
PNA 클램핑 기술은 상기한 PNA의 장점을 이용하여 PNA 프로브가 완벽하게 결합되면 효소 등이 인지하지 못하여 증폭반응이 일어나지 않고, 프로브에 상보적이지 않은 서열이 있는 경우에는 PNA 프로브가 완벽하게 결합하지 못하기 때문에 증폭반응이 일어나게 되는 원리를 이용하는 방법으로, 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체 및 이형 접합체를 빠르고 정확하게 분석할 수 있다. 미국공개특허 제2008/0176226호는 표적핵산의 선택된 부위를 증폭하는 프라이머 세트와 야생형의 상기 선택된 부위와 완벽하게 결합하는 PNA 프로브 존재 하에 PCR을 수행하고, 얻어진 PCR 산물에 대해 용융곡선 분석을 수행하여 표적핵산의 돌연변이를 검출하는 방법 및 키트를 개시하고 있다. 그러나 상기 방법은 증폭반응의 사이클 수가 아닌 용융곡선의 차이로 돌연변이형을 구별하게 되는데, PNA 클램핑 프로브 이외에 용융곡선을 측정하기 위한 형광을 검출할 수 있는 공여체 형광물질(donor fluorophore)과 수용체(acceptor)가 부착되어 있는 프로브를 필요로 한다. 이와 같이 형광이 표지된 프로브를 다량 포함하여 검출을 하게 되므로 분석을 위한 비용이 높아지는 문제점이 발생한다. 또한, 상기 미국공개특허는 K-ras 돌연변이를 검출하기 위하여 N-말단에 플루오레세인으로 표지된 17mer PNA(센서 프로브)와 3'-말단에 LC-Red 640으로 표지된 44mer DNA(앵커 프로브)를 이용한 예만을 구체적으로 개시하고 있을 뿐, 다른 유전자의 유전형 분석에 대해서는 어떠한 교시나 암시도 하지 않았다.
본 발명자들은 종래 기술보다 더욱 쉽고 간편하게 와파린 유전자의 유전형을 분석하기 위해 PNA를 이용하여 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 또는 VKORC1 3730의 유전자와 특이적으로 결합할 수 있는 PNA 프로브를 설계하고, 이들을 이용하여 어느 PCR 기기에나 쉽게 이용할 수 있을 뿐만 아니라 높은 민감도와 특이도로 해당 유전형을 분석할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석 방법을 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 다른 목적은 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석 키트를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1면은
(1) CYP2C9 또는 VKORC1 유전자로부터 선택되는 와파린 대사관련 유전자에 대해, CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 또는 VKORC1 3730의 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열을 증폭시키는 프라이머 세트와, 야생형 또는 돌연변이형의 해당 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열과 완전하게 결합하는 PNA 클램핑 프로브의 존재 하에, 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
(2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 상기 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는:
단계를 포함하는, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제2면은
서열번호 1 내지 119 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 PNA 클램핑 프로브를 포함하는, 본 발명에 따른 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법에 사용하기 위한 키트에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 혈액 응고로 혈관이 막히는 혈전, 색전증 등을 예방하고 치료하기 위해 사용하는 약물인 와파린의 적정 투여량을 결정하기 위한 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 및/또는 VKORC1 3730의 유전형을 우수한 민감도 및 특이도로 분석할 수 있다. 또한 프로브로 이용된 PNA 자체가 생물학적 효소 및 물리적인 요소에 매우 안정하고 분석하는 방법이 매우 간단하며 단시간 내에 분석이 이루어지므로, 대량 분석 및 임상에서 사용하기에 매우 용이할 것으로 기대된다.
도 1은 야생형 또는 돌연변이형 PNA 클램핑 프로브를 이용한 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 원리를 나타내는 모식도이고;
도 2는 CYP2C9 430의 야생형(430CC)과 돌연변이형(430TT)의 동형 접합체 및 이형 접합체(430CT)의 분석 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이고;
도 3은 CYP2C9 1075의 야생형(1075AA)과 돌연변이형(1075CC)의 동형 접합체 및 이형 접합체(1075AC)의 분석 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이며;
도 4는 VKORC1 -1639의 야생형(-1639GG)과 돌연변이형(-1639AA)의 동형 접합체 및 이형 접합체(-1639GA)의 분석 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이고;
도 5는 VKORC1 1173의 야생형(1173CC)과 돌연변이형(1173TT)의 동형 접합체 및 이형 접합체(1173CT)의 분석 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이며;
도 6은 VKORC1 3730의 야생형(3730GG)과 돌연변이형(3730AA)의 동형 접합체 및 이형 접합체(3730GA)의 분석 결과를 보여주는 실시간 PCR 곡선 이미지이고;
도 7은 본 발명에 따른 서열번호 4, 5, 6 및 8의 PNA 프로브 또는 서열번호 10, 11, 13, 14, 15, 16 또는 17의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 CYP2C9 430의 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 검출 민감도(△Ct)를 비교한 그래프이며;
도 8은 본 발명에 따른 서열번호 22 및 23의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 CYP2C9 1075 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 검출 민감도(△Ct)를 비교한 그래프이고;
도 9는 본 발명에 따른 서열번호 60, 61, 63 및 68의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 VKORC1 -1639 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 검출 민감도(△Ct)를 비교한 그래프이며;
도 10은 본 발명에 따른 서열번호 82, 83, 84 및 86의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 VKORC1 1173 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 검출 민감도(△Ct)를 비교한 그래프이고;
도 11은 본 발명에 따른 서열번호 101 내지 107 또는 113 내지 119의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 VKORC1 3730 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 검출 민감도(△Ct)를 비교한 그래프이며;
도 12는 본 발명에 따른 서열번호 6과 17의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 CYP2C9 430 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체 및 이형 접합체의 농도에 따른 검출 민감도(사이클 수와 △Ct)를 나타낸 그래프이고;
도 13은 본 발명에 따른 서열번호 23과 32의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 CYP2C9 1075 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체 및 이형 접합체의 농도에 따른 검출 민감도(사이클 수와 △Ct)를 나타낸 그래프이며;
도 14는 본 발명에 따른 서열번호 63과 78의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 VKORC1 -1639 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체 및 이형 접합체의 농도에 따른 검출 민감도(사이클 수와 △Ct)를 나타낸 그래프이고;
도 15는 본 발명에 따른 서열번호 86과 87의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 VKORC1 1173 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체 및 이형 접합체의 농도에 따른 검출 민감도(사이클 수와 △Ct)를 나타낸 그래프이며;
도 16은 본 발명에 따른 서열번호 103과 113의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 통한 VKORC1 3730 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체 및 이형 접합체의 농도에 따른 검출 민감도(사이클 수와 △Ct)를 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 PNA 프로브를 이용한 PNA 클램핑 기술과 실시간 PCR 기술을 접목하여 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 어느 PCR 기기에서나 보다 쉽고 간편하게 분석하는 방법을 제공하기 위한 것이다. 구체적으로, PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 와파린 대사관련 유전자, 구체적으로는 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173, VKORC1 3730의 유전형 분석에 관한 것이다.
1. PNA 클램핑 프로브의 설계 및 제작
본 발명의 PNA 프로브는 각각 와파린 대사관련 유전자에 속하는 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 및 VKORC1 3730의 야생형과 돌연변이형 유전자 서열에 완벽하게 결합할 수 있는 것으로서, 13개 이상, 바람직하게는 13 내지 30개, 보다 바람직하게는 13 내지 22개, 가장 바람직하게는 14 내지 22개의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 PNA 프로브는 각각 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 및 VKORC1 3730의 야생형과 돌연변이형 유전자 부위가 프로브의 가운데에 위치하도록 고안된 것이 바람직하다. 예를 들어, 본 발명의 PNA 프로브는 하기 표 1에 기재한 서열번호 1 내지 119 중 어느 하나의 염기서열로 구성될 수 있다. 상기 염기서열로부터 당업자가 통상의 지식을 이용하여 용이하게 변형할 수 있는 범위 내의 PNA 프로브 서열들은 모두 본 발명의 범위 내에 속하는 것으로 보아야 할 것인 바, 13mer 이상의 길이를 갖는 PNA 프로브로서 본 발명에 따른 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용하여 증폭 사이클 차이만으로 와파린 대사관련 유전자에 속하는 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 및/또는 VKORC1 3730 유전자의 유전형을 효과적으로 분석할 수 있는 것인 한, 본 발명의 범위 내에 포함되는 것이다.
구체적으로, 서열번호 1 내지 9는 CYP2C9 430의 염기가 C(야생형)인 유전자에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, 서열번호 10 내지 18은 CYP2C9 430의 염기가 T(돌연변이형)인 유전자에 완벽하게 결합하도록 설계하였다. 서열번호 19 내지 25는 CYP2C9 1075의 염기가 A(야생형)인 유전자에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, 서열번호 26 내지 32는 CYP2C9 1075의 염기가 C(돌연변이형)인 유전자에 완벽하게 결합하도록 설계하였다. 서열번호 33 내지 69는 VKORC1 -1639의 염기가 G(야생형)인 유전자에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, 서열번호 70 내지 78은 VKORC1 -1639의 염기가 A(돌연변이형)인 유전자에 완벽하게 결합하도록 설계하였다. 서열번호 79 내지 86은 VKORC1 1173의 염기가 C(야생형)인 유전자에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, 서열번호 87 내지 95는 VKORC1 1173의 염기가 T(돌연변이형)인 유전자에 완벽하게 결합하도록 설계하였다. 서열번호 96 내지 107은 VKORC1 3730의 염기가 G(야생형)인 유전자에 완벽하게 결합하도록 설계하였고, 서열번호 108 내지 119는 VKORC1 1173의 염기가 A(돌연변이형)인 유전자에 완벽하게 결합하도록 설계하였다.
서열번호 이름 서열(5'→3') Mer수
1 430w-18 CTTGAACACGGTCCTCCA 18
2 430w-22-1 TTCCTCTTGAACACGGTCCTCA 22
3 430w-22-2 TGAACACGGTCCTCAATGCTCC 22
4 430w-21-2 TGAACACGGTCCTCAATGCTC 21
5 430w-20-2 GAACACGGTCCTCAATGCTC 20
6 430w-19-2 GAACACGGTCCTCAATGCT 19
7 430wc-22-3 CCTCTTGAACACGGTCCTCAAT 22
8 430wc-22-4 TCTTGAACACGGTCCTCAATGC 22
9 430wc-22-5 TTGAACACGGTCCTCAATGCTC 22
10 430m-18 CTTGAACACAGTCCTCCA 18
11 430m-22-1 TTCCTCTTGAACACAGTCCTCA 22
12 430m-22-2 TGAACACAGTCCTCAATGCTCC 22
13 430m-21-2 TGAACACAGTCCTCAATGCTC 21
14 430m-20-2 GAACACAGTCCTCAATGCTC 20
15 430m-19-2 GAACACAGTCCTCAATGCT 19
16 430mc-22-3 CCTCTTGAACACAGTCCTCAAT 22
17 430mc-22-4 TCTTGAACACAGTCCTCAATGC 22
18 430mc-22-5 TTGAACACAGTCCTCAATGCTC 22
19 1075wc-19 GATACATTGACCTTCTCCC 19
20 1075wc-21 GATACATTGACCTTCTCCCCA 21
21 1075wc-22 GATACATTGACCTTCTCCCCAC 22
22 1075wc-20-1 AGGTCAATGTATCTCTGGAC 20
23 1075wc-19-1 AGGTCAATGTATCTCTGGA 19
24 1075wc-19-2 AAGGTCAATGTATCTCTGG 19
25 1075wc-18-1 AAGGTCAATGTATCTCTG 18
26 1075mc-19 GATACCTTGACCTTCTCCC 19
27 1075mc-21 GATACCTTGACCTTCTCCCCA 21
28 1075mc-22 GATACCTTGACCTTCTCCCCAC 22
29 1075mc-20-1 AGGTCAAGGTATCTCTGGAC 20
30 1075mc-19-1 AGGTCAAGGTATCTCTGGA 19
31 1075mc-19-2 AAGGTCAAGGTATCTCTGG 19
32 1075mc-18-1 AAGGTCAAGGTATCTCTG 18
33 1639wc-19 CCATTGGCCGGGTGCGGTG 19
34 1639wc-21 ACCATTGGCCGGGTGCGGTGG 21
35 1639wc-22 AACCATTGGCCGGGTGCGGTGG 22
36 1639wc-19-1 ACCATTGGCCGGGTGCGGT 19
37 1639wc-19-2 CAACCATTGGCCGGGTGCG 19
38 1639wc-18-1 CAACCATTGGCCGGGTGC 18
39 1639wc-17-1 AACCATTGGCCGGGTGC 17
40 1639wc-19-t/NI CCATTTGCCGGGTGCGGTG 19
41 1639wc-18-t CATTGGTCGGGTGCGGTG 18
42 1639wc-18-NP CATTGGCCGGGTGCGGTG 18
43 1639wc-18-T-1 CCATTTGCCGGGTGCGGT 18
44 1639wc-18-T-2 CCATTGGCCGGTTGCGGT 18
45 1639wc-18-T-3 CCATTGGCTGGGTGCGGT 18
46 1639wc-18-NI-1 CCATTGGCCGGGTGCGGT 18
47 1639wc-18-NI-2 CCATTGGCCGGGTGCGGT 18
48 1639wc-18-NI-3 CCATTGGCCGGGTGCGGT 18
49 1639wc-17 CATTGGCCGGGTGCGGT 17
50 1639wc-17-T-1 CATTGTCCGGGTGCGGT 17
51 1639wc-17-T-2 CCATTGGTCGGGTGCGG 17
52 1639wc-17-T-3 CATTGGCCGGTTGCGGT 17
53 1639wc-17-NI-1 CATTGGCCGGGTGCGGT 17
54 1639wc-16 ATTGGCCGGGTGCGGT 16
55 1639wc-16 CCATTGGCCGGGTGCG 16
56 1639wc-16-T-1 ATTGTCCGGGTGCGGT 16
57 1639wc-16-T-2 CCATTGGCCGGTTGCG 16
58 1639wc-16-NI-1 CATTGGCCGGGTGCGG 16
59 1639wc-15-T-1 TTGTCCGGGTGCGGT 15
60 1639wc-15-T-2 CATTGGCCGGTTGCG 15
61 1639wc-15-NI-1 CATTGGCCGGGTGCG 15
62 1639wc-15 TTGGCCGGGTGCGGT 15
63 1639wc-14-T1 ATTGTCCGGGTGCG 14
64 1639wc-14-T2 ATTGGCCGGTTGCG 14
65 1639wc-14-NI-1 ATTGGCCGGGTGCG 14
66 1639wc-14-T3 CATTGTCCGGGTGC 14
67 1639wc-14-T4 CATTGGCCGGTTGC 14
68 1639wc-13-T1 ATTGGCCGGTTGC 13
69 1639wc-15-T3 CATTGGTCGGGTGCG 15
70 1639mc-19 CCATTGGCCAGGTGCGGTG 19
71 1639mc-21 ACCATTGGCCAGGTGCGGTGG 21
72 1639mc-22 AACCATTGGCCAGGTGCGGTGG 22
73 1639mc-19-1 ACCATTGGCCAGGTGCGGT 19
74 1639mc-19-2 CAACCATTGGCCAGGTGCG 19
75 1639mc-18-1 CAACCATTGGCCAGGTGC 18
76 1639mc-17-1 AACCATTGGCCAGGTGC 17
77 1639mc-19-t CCATTTGCCAGGTGCGGTG 19
78 1639mc-18-NI CCATTGGCCAGGTGCGGT 18
79 1173wc-19 ATCATCGACCCTTGGACTA 19
80 1173wc-21 GATCATCGACCCTTGGACTAG 21
81 1173wc-22 AGATCATCGACCCTTGGACTAG 22
82 1173wc-20-1 AGATCATCGACCCTTGGACT 20
83 1173wc-19-1 AGATCATCGACCCTTGGAC 19
84 1173wc-19-2 GATCATCGACCCTTGGACT 19
85 1173wc-18 ATCATCGACCCTTGGACT 18
86 1173wc-20 ATCATCGACCCTTGGACTAG 20
87 1173mc-19 ATCATCGACTCTTGGACTA 19
88 1173mc-21 GATCATCGACTCTTGGACTAG 21
89 1173mc-22 AGATCATCGACTCTTGGACTAG 22
90 1173mc-20-1 AGATCATCGACTCTTGGACT 20
91 1173mc-19-1 AGATCATCGACTCTTGGAC 19
92 1173mc-19-2 GATCATCGACTCTTGGACT 19
93 1173mc-18 ATCATCGACTCTTGGACT 18
94 1173mc-22 AGATCATCGACTCTTGGACTAG 22
95 1173mc-21 GATCATCGACTCTTGGACTAG 21
96 3730WASC-22-1 ATTGTCATGTGCGGTTATGGCA 22
97 3730WASC-22-2 TTGTCATGTGCGGTTATGGCAG 22
98 3730WASC-21 TTGTCATGTGCGGTTATGGCA 21
99 3730WASC-20 TGTCATGTGCGGTTATGGCA 20
100 3730WASC-18 TCATGTGCGGGTATGGCA 18
101 3730WASC-19-1 GTCATGTGCGGGTATGGCA 19
102 3730WASC-19-2 TGTCATGTGCGGGTATGGC 19
103 3730WASC-20-1 TGTCATGTGCGGGTATGGCA 20
104 3730WASC-20-2 TTGTCATGTGCGGGTATGGC 20
105 3730WASC-21 TTGTCATGTGCGGGTATGGCA 21
106 3730WASC-21G TTGTCATGTGCGGGTATGGCA 21
107 3730WASC-22G ATTGTCATGTGCGGGTATGGCA 22
108 3730MASC-22-1 ATTGTCATGTGTGGTTATGGCA 22
109 3730MASC-22-2 TTGTCATGTGTGGTTATGGCAG 22
110 3730MASC-21 TTGTCATGTGTGGTTATGGCA 21
111 3730MASC-20 TGTCATGTGTGGTTATGGCA 20
112 3730MASC-18 TCATGTGTGGGTATGGCA 18
113 3730MASC-19-1 GTCATGTGTGGGTATGGCA 19
114 3730MASC-19-2 TGTCATGTGTGGGTATGGC 19
115 3730MASC-20-1 TGTCATGTGTGGGTATGGCA 20
116 3730MASC-20-2 TTGTCATGTGTGGGTATGGC 20
117 3730MASC-21 TTGTCATGTGTGGGTATGGCA 21
118 3730MASC-21G TTGTCATGTGTGGGTATGGCA 21
119 3730MASC-22G ATTGTCATGTGTGGGTATGGCA 22
본 발명의 PNA 프로브는 반응효율 및 용해도를 증가시키기 위하여 N-말단(N-terminal) 또는 C-말단(C-terminal)에 친수성 기능기를 포함할 수 있으며, 예를 들어 N-말단 또는 C-말단에 친수성 링커나 아미노산, 또는 아민기를 1개 내지 여러 개 포함할 수 있다[Shakeel et al., J. Chem. Technol. Biotechnol., 2006, 81, 892-899; Gildea et al., Tetrahedron Lett., 1998, 39, 7255-7258; Demidov et al., PNAS, 2002, 99, 5953-5958; Wang et al., Anal. Chem., 1997, 69, 5200-5202]. 구체적으로, 본 발명에서는 N-말단에 라이신(lysine)이 1개 부착되거나, N-말단과 C-말단에 라이신(lysine)이 1개씩 부착된 프로브를 사용하였다.
본 발명에서 사용되는 PNA 올리고머는 한국등록특허 제464,261호의 방법에 따라 Bts(Benzothiazolesulfonyl)기로 보호된 PNA 단량체, 또는 공지의 Fmoc(9-flourenylmethloxycarbonyl) 또는 t-Boc(t-butoxycarbonyl)으로 보호된 PNA 단량체를 이용하여 합성될 수 있다[Dueholm et al., J. Org. Chem., 1994, 59, 5767-5773; Christensen et al., J Peptide Sci, 1995, 3, 175-183; Thomson et al., Tetrahedron Letters, 1995, 22, 6179-6194].
2. 와파린 대사관련 유전자 클램핑 프라이머의 설계 및 제작
본 발명에서 "와파린 대사관련 유전자 클램핑 프라이머"라 함은 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있는 유전자의 증폭은 억제하고 PNA 프로브와 완벽하게 결합되어 있지 않은(즉, 미스매치가 존재하는) 유전자를 증폭시키는 PCR 프라이머를 가리킨다.
본 발명의 클램핑 프라이머는 특별히 제한되는 것은 아니나, 보다 높은 민감도 및 특이도로 유전형을 분석하기 위해서는 PNA 클램핑 프로브를 기준으로 하여 한 방향으로는 PNA 프로브와 일부분이 겹쳐지도록 하며 다른 한 방향으로는 분석하고자 하는 부위를 포함하되 PCR 증폭산물의 크기를 고려하여 고안하는 것이 바람직하다. 또한 PNA 프로브와의 Tm을 고려하고, 길이는 17mer에서 30mer 사이이며, PNA 프로브의 Tm 보다 낮게 설계하는 것이 바람직하다. 분석 민감도 및 특이도를 극대화할 수 있도록, 각각 야생형과 돌연변이형에 상보적으로 결합하는 PNA 클램핑 프로브 서열 중 해당 야생형과 돌연변이형의 염기 바로 앞부분을 포함하도록 설계하는 것이 바람직하다. 구체적인 예에 따르면, 서열번호 1 내지 18의 PNA 프로브의 5' 부위의 9 내지 12개의 염기서열이 포함되도록 18mer 내지 23mer의 클램핑 프라이머를 설계하였다.
본 발명에서 예시된 서열번호 120 및 121은 CYP2C9의 엑손3에 위치한 430을 포함하는 영역을 증폭하도록 설계되었고, 서열번호 122 및 123은 CYP2C9의 엑손7에 위치한 1075를 포함하는 영역을 증폭하도록 설계되었으며, 서열번호 124 내지 128은 VKORC1의 프로모터 부위에 위치한 -1639를 포함하는 영역을 증폭하도록 설계되었다. 또한 서열번호 129 및 130는 VKORC1의 인트론 부위에 위치한 1173을 포함하는 영역을 증폭하도록 설계되었고, 서열번호 131 및 132는 VKORC1의 3'비번역부위에 위치한 3730을 포함하는 영역을 증폭하도록 설계되었다. 각각의 프라미어의 조합에 의한 증폭산물의 크기가 200bp가 넘지 않도록 고안되었다. 각 프라이머의 특성은 하기 표 2에 정리되어 있다.
서열번호 이름 방향 서열(5'→3') 길이(mer)
120 430R 역방향 ccacccttggtttttctcaa 20
121 430 FC 정방향 ggaagaggagcattgaggac 20
122 1075R 역방향 tcgaaaacatggagttgcag 20
123 1075 FC 정방향 tgcacgaggtccagagatac 20
124 1639 FC 정방향 cctgaaaaacaaccattggcc 21
125 1639R-2 역방향 gactacaggtgcctgccacc 20
126 1639 test F-1 정방향 gaagacctgaaaaacaaccattg 23
127 1639 test R-1 역방향 gccaggcttgtcttaaactcc 21
128 1639 test F-2 정방향 aagacctgaaaaacaaccattgg 23
129 1173R-1 역방향 tgctgttggattgattgaggatg 23
130 1173FC 정방향 ggtgccaggagatcatcgac 20
131 3730R 역방향 accacagtccatggcagac 19
132 3730 FC 정방향 cctcctcctgccataccc 18
3. PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석
본 발명에 따른 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석 방법은
(1) CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 또는 VKORC1 3730에 특이적인 클램핑 프라이머 세트와 PNA 클램핑 프로브의 존재 하에, 와파린 대사관련 유전자에 대해 실시간 PCR을 수행하는 단계; 및
(2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는:
단계를 포함한다.
본 발명의 와파린 대사관련 유전자는 대상 검체로부터 추출하여 준비된다. 본 발명에서는 핵산추출에 특별한 제한이 없으며, 일반적으로 사용하는 모든 핵산 추출방법을 사용할 수 있으며, 시판 중인 핵산 추출키트 등을 사용하여 환자의 혈액으로부터 DNA를 추출하여 준비된다.
본 발명의 실시간 PCR 클램핑 방법은 지수적인 증폭이 일어나는 초기 시료의 양을 형광물질의 지수적 증가가 탐지되기 시작하는 사이클 수(Cycle threshold, 이하 'Ct'라 함)로 나타내므로, 보다 정확한 정량분석이 가능하며 반응을 실시간으로 분석할 수 있다. 본 방법은 전기영동 후 영상분석기로 강도를 측정하는 단계가 생략되고 증폭산물의 증폭 정도를 자동화 및 수치화시켜 신속·간편하게 진단할 수 있는 방법이다.
본 발명에서 실시간 PCR 클램핑의 반응물 중 PNA 클램핑 프로브는 1 내지 1000nM의 최종농도를 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에서는 인터컬레이팅법을 이용하여 형광을 검출하는데, 이 방법은 증폭된 이중가닥 DNA에 형광표지가 결합해 형광을 발하게 되는데 이 때의 형광 강도를 측정함으로써 증폭산물의 생성량을 측정하게 된다. 이로써 어느 PCR 기기에나 적용할 수 있고 프라이머를 따로 제작하지 않아도 높은 민감도 및 특이도로 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석할 수 있다.
본 발명에서는 유전자 증폭산물을 확인하기 위한 형광물질로서 실시간 유전자 분석방법에 사용되는 DNA-결합 형광물질(DNA-binding fluorophore)을 사용하며 그 종류에 특별한 제한은 없다. 예를 들어, 사이버 그린 Ⅰ(SYBR Green I) 외에 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO-3, SYTOX Orange 등을 사용할 수 있다[Gudnason et al., Nucleic Acids Res., 2007, 35, e127; Bengtsson et al., Nucleic Acids Res 15, 2003, 31, e45; Wittwer et al., Clinica Chemistry, 2003, 49, 853-860].
본 발명에서는 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 결정하는바, 증폭된 Ct값을 비교하여 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 확인할 수 있다. 야생형 유전자와 혼성화되도록 고안된 PNA 프로브가 야생형의 와파린 대사관련 유전자에 혼성화되면 증폭이 저해되어 높은 Ct값을 갖게 된다. 또한, 돌연변이형 유전자와 혼성화되도록 고안된 PNA 프로브가 돌연변이형의 와파린 대사관련 유전자에 혼성화되면 증폭이 저해되어 높은 Ct값을 갖게 된다.
와파린 대사관련 유전자의 유전형은 하기 수학식 1에 의해 얻어지는 △Ct 값으로부터 확인한다.
[수학식 1]
△Ct = 양성대조 시료로부터 얻어진 Ct값 - 미지의 시료로부터 얻어진 Ct값
[양성대조 시료: 프로브가 완벽하게 결합하는 유전자(야생형 프로브의 경우 야생형 유전자, 돌연변이형 프로브의 경우 돌연변이형 유전자) 시료]
야생형 프로브와 돌연변이형 유전자가 혼성화되는 경우, 염기서열이 완벽하게 결합되지 않아 야생형 프로브와 야생형 유전자의 혼성화에 비해 낮은 Ct값을 갖게 되므로, △Ct값은 큰 값을 나타내게 된다. 또한, 돌연변이형 프로브와 야생형 유전자가 혼성화되는 경우, 염기서열이 완벽하게 결합되지 않아 돌연변이형 프로브와 돌연변이형 유전자의 혼성화에 비해 낮은 Ct값을 갖게 되므로, △Ct값은 큰 값을 나타내게 된다. 도 1에 본 발명에 따른 야생형 또는 돌연변이형 PNA 클램핑 프로브를 이용한 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 원리를 모식적으로 나타내었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.
실시예 1: 와파린 대사관련 유전자인 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 및 VKORC1 3730의 야생형과 돌연변이형 PNA 프로브 합성
와파린 대사관련 유전자에 속하는 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 및 VKORC1 3730의 야생형과 돌연변이형 유전자에 각각 완벽하게 결합하는 119개의 PNA 프로브를 상기 표 1에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 각각의 PNA 프로브는 야생형과 돌연변이형 유전자의 효과적인 분리를 위하여 해당 염기서열이 프로브의 중간에 위치하도록 고안하였다. 한국등록특허 제464,261호에 기재된 방법에 따라, PNA 프로브를 합성하였다[Lee et al., Org. Lett., 2007, 9, 3291-3293].
실시예 2: 와파린 대사관련 유전자인 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 및 VKORC1 3730의 클론 확보
아래 표 3에 나열한 프라이머의 조합으로 증폭된 PCR 산물을 플라스미드 벡터에 클로닝(cloning)하였다. 클론들을 대장균 JM109에 형질전환하여 야생형 유전자를 대량확보하고, 클론 유전자를 시퀀싱(sequencing)하여 유전형을 확인하였다. 확인된 야생형 유전자를 바탕으로 퀵체인지 부위-특이적 돌연변이유발 키트(QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit, STRATAGENE Inc., 미국)로 돌연변이 유전자를 제작하여 대장균 JM109에 형질전환하고 시퀀싱하여 변이유무를 확인하였다. 유전형이 확인된 야생형과 돌연변이형 클론은 본 발명의 PNA기반 실시간 PCR 클램핑의 대조군 검체로 사용하였다.
서열번호 이름 방향 서열(5'→3') 길이(mer)
133 2C9430F 정방향 gaagcctgtgtggctgaata 20
134 2C9430R 역방향 ccattcccaccatgttgact 20
135 2C91075F 정방향 ttacccatgcccctttgtta 20
136 2C91075R 역방향 actcgaaagccatgacaaca 20
137 1639F-1 정방향 gagccagcaggagagggaaa 20
138 1639R-1 역방향 ctcagcctcccaagtagtttgga 23
139 1173F-1 정방향 cagtgacatggaatcctgacgtg 23
129 1173R-1 역방향 tgctgttggattgattgaggatg 23
140 3730F 정방향 gcaaggctaagaggcactga 20
131 3730R 역방향 accacagtccatggcagac 19
실시예 3: 와파린 대사관련 유전자인 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173, VKORC1 3730 표적핵산을 증폭하기 위한 프라이머 합성
와파린 대사관련 유전자에 속하는 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 및 VKORC1 3730의 표적핵산 증폭 및 클램핑 PCR을 위하여 프라이머를 제작하였다. 프라이머는 CYP2C9 430의 야생형 및 돌연변이형 유전자를 확인하기 위한 서열번호 120 및 121로 이루어진 프라이머 한 세트와 CYP2C9 1075의 야생형 및 돌연변이형 유전자를 확인하기 위한 서열번호 122 및 123으로 이루어진 프라이머 한 세트, VKORC1 -1639의 야생형 및 돌연변이형 유전자를 확인하기 위한 서열번호 124 및 125로 이루어진 프라이머 한 세트, VKORC1 1173의 야생형 및 돌연변이형 유전자를 확인하기 위한 서열번호 129 및 130로 이루어진 프라이머 한 세트, 및 VKORC1 3730의 야생형 및 돌연변이형 유전자를 확인하기 위한 서열번호 131 및 132로 이루어진 프라이머 한 세트를 합성하였다. 사용한 프라이머의 서열은 상기 표 2에 나타낸 바와 같다. 프라이머는 ㈜바이오니아(한국)에 의뢰하여 합성하였다.
실시예 4: 와파린 대사관련 유전자의 유전형 분석을 위한 PNA 프로브를 이용한 실시간 PCR 클램핑 방법 확립
상기 실시예 2의 클론 유전자를 이용하여 PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑 방법을 확립하였다.
주형 DNA 용액(50 ng/㎕) 1 ㎕, 상기 표 2에 나타낸 클램핑 센스 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 안티센스 프라이머(10 pmole/㎕) 1 ㎕, 표 1에 나타낸 프로브 중 1개의 클램핑 프로브(100nM) 1 ㎕, 2× IQ 사이버 그린 슈퍼믹스(Bio-Rad, USA) 10 ㎕, 증류수 6 ㎕를 가하고 실시간 DNA 증폭기(Real-Time PCR machine, CFX96TM Real-Time PCR System, Bio-RAD사 제품)를 이용하여 95℃에서 3분 동안 반응시킨 후 95℃ 30초, 70℃에서 20초, 63℃ 30초, 72℃ 30초 반응과정을 40회 반복하였다. 형광은 72℃ 중합반응 단계에서 측정하였다.
도 2 내지 도 6에 각각 CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 1173, VKORC1 -1639 및 VKORC1 3730의 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체 및 이형 접합체의 분석 결과를 나타내었다. 상기 도면에 나타낸 결과로부터, 해당 유전자에 대한 야생형 프로브를 사용하는 경우, 야생형 유전자의 증폭은 억제되는 반면 돌연변이형 유전자의 증폭이 일어나고, 돌연변이형 프로브를 사용하는 경우, 돌연변이형 유전자의 증폭은 억제되는 반면 야생형 유전자의 증폭이 일어남을 알 수 있다. 아울러, 야생형과 돌연변이형의 이형 접합체의 경우 야생형의 동형 접합체와 돌연변이형의 동형 접합체의 중간 정도로 증폭이 일어남을 알 수 있다.
도 7 내지 도 11에 각각 특정 서열의 PNA 프로브를 이용하여 실시간 PCR 클램핑을 수행한 경우, CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 및 VKORC1 3730 유전자의 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체의 검출 민감도(△Ct)를 비교한 결과를 나타내었다. 상기 도면에 나타낸 결과로부터, 본 발명에 따른 PNA 클램핑 프로브를 이용하여 상기 유전자의 유전형을 정확하게 분석할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 5: PNA 기반의 실시간 PCR 클램핑을 이용한 와파린 대사관련 유전자의 검출한계 측정
상기 실시예 4에서 확립된 실시간 PCR 클램핑 방법을 사용하여 1 ㎕ 당 107, 106, 105, 104, 103, 102, 101개의 표적핵산을 포함하도록 제작하여 유전자의 농도에 따른 Ct값 사이의 상관관계를 분석하여, 야생형과 돌연변이형의 동형 접합체 및 이형 접합체의 검출한계를 확인하였다.
그 결과들을 도 12 내지 도 16에 나타내었다. 상기 도면들에 나타난 바와 같이, 야생형 프로브를 사용하는 경우 돌연변이 유전자의 농도가 높을수록 형광이 역치 값에 도달하는 반응횟수를 나타내는 Ct값이 일정하게 감소하고, 돌연변이형 프로브를 사용하는 경우 야생형 유전자의 농도가 높을수록 Ct값이 일정하게 감소하여 돌연변이/야생형 유전자의 양과 Ct값 사이에 상관관계가 있음을 알 수 있다.
<110> Panagene Inc. <120> Methods and kits for genotyping of warfarin metabolism-associated genes using PNA mediated Real-time PCR clamping <160> 140 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 1 cttgaacacg gtcctcca 18 <210> 2 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 2 ttcctcttga acacggtcct ca 22 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 3 tgaacacggt cctcaatgct cc 22 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 4 tgaacacggt cctcaatgct c 21 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 5 gaacacggtc ctcaatgctc 20 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 6 gaacacggtc ctcaatgct 19 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 7 cctcttgaac acggtcctca at 22 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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PNA probe <400> 17 tcttgaacac agtcctcaat gc 22 <210> 18 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 18 ttgaacacag tcctcaatgc tc 22 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 19 gatacattga ccttctccc 19 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 20 gatacattga ccttctcccc a 21 <210> 21 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 21 gatacattga ccttctcccc ac 22 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 22 aggtcaatgt atctctggac 20 <210> 23 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 23 aggtcaatgt atctctgga 19 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 24 aaggtcaatg tatctctgg 19 <210> 25 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 25 aaggtcaatg tatctctg 18 <210> 26 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 26 gataccttga ccttctccc 19 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 27 gataccttga ccttctcccc a 21 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 28 gataccttga ccttctcccc ac 22 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 29 aggtcaaggt atctctggac 20 <210> 30 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 30 aggtcaaggt atctctgga 19 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 31 aaggtcaagg tatctctgg 19 <210> 32 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 32 aaggtcaagg tatctctg 18 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 33 ccattggccg ggtgcggtg 19 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 34 accattggcc gggtgcggtg g 21 <210> 35 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 35 aaccattggc cgggtgcggt gg 22 <210> 36 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 36 accattggcc gggtgcggt 19 <210> 37 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 37 caaccattgg ccgggtgcg 19 <210> 38 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 38 caaccattgg ccgggtgc 18 <210> 39 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 39 aaccattggc cgggtgc 17 <210> 40 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 40 ccatttgccg ggtgcggtg 19 <210> 41 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 41 cattggtcgg gtgcggtg 18 <210> 42 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 42 cattggccgg gtgcggtg 18 <210> 43 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 43 ccatttgccg ggtgcggt 18 <210> 44 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 44 ccattggccg gttgcggt 18 <210> 45 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 45 ccattggctg ggtgcggt 18 <210> 46 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 46 ccattggccg ggtgcggt 18 <210> 47 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 47 ccattggccg ggtgcggt 18 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 48 ccattggccg ggtgcggt 18 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 49 cattggccgg gtgcggt 17 <210> 50 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 50 cattgtccgg gtgcggt 17 <210> 51 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 51 ccattggtcg ggtgcgg 17 <210> 52 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 52 cattggccgg ttgcggt 17 <210> 53 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 53 cattggccgg gtgcggt 17 <210> 54 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 54 attggccggg tgcggt 16 <210> 55 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 55 ccattggccg ggtgcg 16 <210> 56 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 56 attgtccggg tgcggt 16 <210> 57 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 57 ccattggccg gttgcg 16 <210> 58 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 58 cattggccgg gtgcgg 16 <210> 59 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 59 ttgtccgggt gcggt 15 <210> 60 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 60 cattggccgg ttgcg 15 <210> 61 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 61 cattggccgg gtgcg 15 <210> 62 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 62 ttggccgggt gcggt 15 <210> 63 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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<210> 73 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 73 accattggcc aggtgcggt 19 <210> 74 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 74 caaccattgg ccaggtgcg 19 <210> 75 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 75 caaccattgg ccaggtgc 18 <210> 76 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 76 aaccattggc caggtgc 17 <210> 77 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 77 ccatttgcca ggtgcggtg 19 <210> 78 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 78 ccattggcca ggtgcggt 18 <210> 79 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 79 atcatcgacc cttggacta 19 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 80 gatcatcgac ccttggacta g 21 <210> 81 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 81 agatcatcga cccttggact ag 22 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 82 agatcatcga cccttggact 20 <210> 83 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 83 agatcatcga cccttggac 19 <210> 84 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 84 gatcatcgac ccttggact 19 <210> 85 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 85 atcatcgacc cttggact 18 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 86 atcatcgacc cttggactag 20 <210> 87 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 87 atcatcgact cttggacta 19 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 88 gatcatcgac tcttggacta g 21 <210> 89 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 89 agatcatcga ctcttggact ag 22 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 90 agatcatcga ctcttggact 20 <210> 91 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 91 agatcatcga ctcttggac 19 <210> 92 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 92 gatcatcgac tcttggact 19 <210> 93 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 93 atcatcgact cttggact 18 <210> 94 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 94 agatcatcga ctcttggact ag 22 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 95 gatcatcgac tcttggacta g 21 <210> 96 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 96 attgtcatgt gcggttatgg ca 22 <210> 97 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 97 ttgtcatgtg cggttatggc ag 22 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 98 ttgtcatgtg cggttatggc a 21 <210> 99 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 99 tgtcatgtgc ggttatggca 20 <210> 100 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 100 tcatgtgcgg gtatggca 18 <210> 101 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 101 gtcatgtgcg ggtatggca 19 <210> 102 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 102 tgtcatgtgc gggtatggc 19 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 103 tgtcatgtgc gggtatggca 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 104 ttgtcatgtg cgggtatggc 20 <210> 105 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 105 ttgtcatgtg cgggtatggc a 21 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 106 ttgtcatgtg cgggtatggc a 21 <210> 107 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 107 attgtcatgt gcgggtatgg ca 22 <210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PNA probe <400> 108 attgtcatgt gtggttatgg ca 22 <210> 109 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Forward primer <400> 126 gaagacctga aaaacaacca ttg 23 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 127 gccaggcttg tcttaaactc c 21 <210> 128 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 128 aagacctgaa aaacaaccat tgg 23 <210> 129 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 129 tgctgttgga ttgattgagg atg 23 <210> 130 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 130 ggtgccagga gatcatcgac 20 <210> 131 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 131 accacagtcc atggcagac 19 <210> 132 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 132 cctcctcctg ccataccc 18 <210> 133 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 133 gaagcctgtg tggctgaata 20 <210> 134 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 134 ccattcccac catgttgact 20 <210> 135 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 135 ttacccatgc ccctttgtta 20 <210> 136 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 136 actcgaaagc catgacaaca 20 <210> 137 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 137 gagccagcag gagagggaaa 20 <210> 138 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer <400> 138 ctcagcctcc caagtagttt gga 23 <210> 139 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 139 cagtgacatg gaatcctgac gtg 23 <210> 140 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer <400> 140 gcaaggctaa gaggcactga 20

Claims (10)

  1. (1) CYP2C9(cytochrome P450, subfamily ⅡC, polypeptide9) 또는 VKORC1(vitamin K epoxide reductase complex, subunit 1) 유전자로부터 선택되는 와파린 대사관련 유전자에 대해, CYP2C9 430, CYP2C9 1075, VKORC1 -1639, VKORC1 1173 또는 VKORC1 3730의 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열을 증폭시키는 프라이머 세트와, 야생형 또는 돌연변이형의 해당 뉴클레오티드를 포함하는 염기서열과 완전하게 결합하는 PNA(Peptide Nucleic Acid) 클램핑 프로브의 존재 하에, 실시간 PCR(Real-Time Polymerase Chain Reaction)을 수행하고;
    (2) 상기 실시간 PCR에 의한 유전자 증폭을 분석하여 상기 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는:
    단계를 포함하는, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 단계 (2)에서 실시간 PCR의 Ct(cycle threshold)값을 측정하여 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (1)의 PNA 클램핑 프로브는 13 내지 22mer 길이의 염기서열로 이루어지는 것인, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 단계 (1)의 PNA 클램핑 프로브는 서열번호 1 내지 119의 염기서열 중 어느 하나로 이루어지는 것인, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (1)의 프라이머 세트는 CYP2C9 또는 VKORC1 유전자의 상류부분에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머를 포함하는 것인, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, CYP2C9 또는 VKORC1 유전자의 상류부분에 특이적으로 결합하는 정방향 프라이머는 서열번호 121, 123, 124, 126, 128, 130 및 132의 염기서열 중 어느 하나로 이루어지는 것인, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 단계 (1)의 프라이머 세트는 각각 서열번호 121과 120; 123과 122; 124, 126 또는 128과, 125 또는 127; 130과 129; 또는, 132와 131의 정방향 프라이머와 역방향 프라이머로 이루어지는 것인, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 단계 (2)에서 DNA 인터컬레이팅(intercalating) 형광물질을 사용하여 유전자 증폭을 분석하는, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  9. 제8항에 있어서, DNA 인터컬레이팅 형광물질은 사이버 그린 I, 에버그린, 에티디움브로마이드(EtBr), BEBO, YO-PRO-1, TO-PRO-3, LC 그린, SYTO-9, SYTO-13, SYTO-16, SYTO-60, SYTO-62, SYTO-64, SYTO-82, POPO-3, TOTO-3, BOBO--및 SYTOX 오렌지로 구성된 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 것인, 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법.
  10. 서열번호 1 내지 119 중 어느 하나의 염기서열로 이루어지는 PNA 클램핑 프로브:
    를 포함하는, 제4항에 따른 와파린 대사관련 유전자의 유전형을 분석하는 방법에 사용하기 위한 키트.
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