KR102577378B1 - 뇌경색의 리스크 평가 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은, RNF213 유전자에 있어서의 p.R4810K 다형을 검출하는 것에 의한 뇌경색의 리스크 평가 방법 및 그 방법을 실행하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

뇌경색의 리스크 평가 방법{METHOD FOR EVALUATING RISK OF ISCHEMIC STROKE}
본 발명은, RNF213 유전자에 있어서의 p.R4810K 다형을 검출하는 것에 의한 뇌경색의 리스크 평가 방법 및 그 방법을 실행하기 위한 키트에 관한 것이다.
일본에서의 뇌졸중의 사망자는 연간 11 만명에 달하며, 그 7 ∼ 8 할을 차지하고 있는 뇌경색은, 반신 마비나 인지증 등의 주요한 원인이 되고 있다. 뇌경색은, 뇌세포에 혈액을 보내는 혈관이 폐색되어 뇌세포가 사멸하는 질환으로, 뇌의 비교적 굵은 혈관의 동맥 경화를 주된 원인으로 한 아테로마 혈전성 뇌경색, 뇌의 가는 혈관이 다발성으로 폐색되는 라크나 경색, 심장 내에 생긴 혈전이 심장으로부터 흘러 나와 뇌의 대혈관을 폐색하는 심원성 뇌색전 등으로 분류된다. 일반적으로, 아테로마 혈전성 뇌경색 및 라크나 경색은, 고혈압이나 당뇨병 등의 생활 습관병과 관계되고, 또 심원성 뇌색전은, 심방세동 등의 부정맥 등이 관계되는 것으로 생각되고 있다.
뇌경색을 발증한 환자에 대한 처치로서, MRI (Magnetic Resonance Imaging) 화상 또는 CT (Computed Tomography) 화상에 기초하여, 뇌경색의 종류 (아테로마 혈전성 뇌경색, 라크나 경색 또는 심원성 뇌색전) 를 추정함과 함께, 혈전의 존재 부위가 특정된다. 또, 혈관 내에 막힌 혈전을 용해시키기 위해, tPA (Tissue Plasminogen Activator) 가 환자에게 투여된다. 필요한 경우에는, 환자에 대해 카테터 치료 (혈관 내 치료) 가 실시된다. 카테터 치료에 있어서는, 발증한 뇌경색의 종류에 따라, 혈전 회수 디바이스 또는 혈전 흡인 디바이스를 사용하는 치료 및 스텐트 유치를 포함하는 경피적 혈관 형성술 등에서 적절한 치료법이 선택된다.
심원성 뇌색전의 치료에 대해서는, 혈전 회수 디바이스, 혈전 흡인 디바이스 및 경피적 혈관 형성술 중 어느 것도 사용할 수 있지만, 아테로마 혈전성 뇌경색의 치료의 경우, 혈전 회수 디바이스를 사용하면, 폐색 혈관에 대한 내피 장해를 일으켜, in-situ thrombosis (in site 에서의 혈전 형성) 에 의한 재폐색의 위험성이 높아진다. 이 때문에, 아테로마 혈전성 뇌경색의 치료에 있어서는, 혈전 흡인 디바이스의 사용 또는 경피적 혈관 형성술을 선택할 필요가 있다. 뇌경색을 발증한 환자에 대한 이들 처치에 있어서, MRI 또는 CT 의 화상을 사용하는 경우, 시술자는, 육안에 의해 발증한 뇌경색의 종류 및 적절한 치료법을 판단한다.
실제의 뇌경색의 치료 현장에서는, 단시간 (환자가 병원에 반송되고 나서 약 1 시간 ∼ 1 시간 반 정도) 에 이들 판단을 실시할 필요가 있는데, 화상 정보만으로는 이들 판단은 곤란하여, 화상 정보와는 별도로 뇌경색의 종류를 신속하고 간편하게 특정할 수 있는 방법이 요구되고 있다. 따라서, 본 발명의 목적은, 시술자가 단시간에 뇌경색의 종류를 특정할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명의 목적은, 이하의 발명에 의해 달성된다.
〔1〕
피검자로부터 채취된 검체 중의 게놈 DNA 에 존재하는 RNF213 유전자에 있어서의 p.R4810K 다형 (RNF213 p.R4810K 다형) 을 검출하는 것을 특징으로 하는, 뇌경색의 리스크 평가 방법으로서,
(1) 상기 검체를, 계면 활성제 및 프로테이나아제 K 를 함유하는 PCR 완충액과 혼합하는 공정 ;
(2) 공정 (1) 에서 얻어진 혼합액을, DNA 폴리메라아제, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 염기 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머쌍, 그리고 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 및 그 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 세트로서, 그 올리고뉴클레오티드에 결합하는 형광 색소가 서로 상이한 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트와 혼합되고, PCR 을 실시하는 공정 ; 및,
(3) 상기 PCR 산물을 검출하는 공정 ;
을 포함하는 방법.
〔2〕
상기 RNF213 p.R4810K 다형이, 변이형의 호모 접합형 또는 변이형과 야생형의 헤테로 접합형인,〔1〕에 기재된 방법.
〔3〕
상기 검체가, 혈액 또는 타액인,〔1〕또는〔2〕에 기재된 방법.
〔4〕
상기 공정 (1) 에 있어서, 계면 활성제가, 도데실황산나트륨인,〔1〕∼〔3〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔5〕
상기 공정 (1) 에 있어서, PCR 완충액이, KCl, MgCl2 및 dNTP 믹스 (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 로 이루어지는 혼합물) 를 함유하는 트리스 완충액인,〔1〕∼〔4〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔6〕
상기 공정 (1) 에 있어서, PCR 완충액이, DNA 폴리메라아제에 흡착하는 생체 유래의 부전하 물질 및 DNA 에 흡착하는 생체 유래의 정전하 물질로서 PCR 을 저해하는 물질에 결합하고, 상기 부전하 물질 및 정전하 물질의 PCR 저해 작용을 중화하는 물질을 함유하는,〔1〕∼〔5〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔7〕
상기 공정 (2) 에 있어서, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 염기 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머쌍이, 서열 번호 1 (포워드) 및 서열 번호 2 (리버스) 로 나타내어지는,〔1〕∼〔6〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔8〕
상기 공정 (2) 에 있어서, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 염기 서열이 서열 번호 3 으로 나타내어지고, 상기 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 염기 서열이 서열 번호 4 로 나타내어지는,〔1〕∼〔7〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔9〕
상기 공정 (3) 에 있어서, 상기 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브에서 유래하는 형광 강도의 증가가 관찰된 경우에, RNF213 p.R4810K 다형이 검출된 것으로 판정하는,〔1〕∼〔8〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔10〕
RNF213 p.R4810K 다형이 검출된 것으로 판정된 경우에, 뇌경색을 발증하는 리스크가 높은 것으로 판정하는,〔1〕∼〔9〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔11〕
상기 뇌경색이, 모야모야병 및 아테로마 혈전성 뇌경색인,〔1〕∼〔10〕중 어느 하나에 기재된 방법.
〔12〕
피검자로부터 채취된 검체 중의 게놈 DNA 에 존재하는 RNF213 유전자에 있어서의 p.R4810K 다형 (RNF213 p.R4810K 다형) 을 검출하는 키트로서, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 염기 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머쌍, 그리고 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 및 그 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 세트로서, 그 올리고뉴클레오티드에 결합하는 형광 색소가 서로 상이한 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트를 구비하는 키트.
〔13〕
상기 PCR 프라이머쌍이, 서열 번호 1 (포워드) 및 서열 번호 2 (리버스) 로 나타내어지는,〔12〕에 기재된 키트.
〔14〕
상기 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 염기 서열이 서열 번호 3 으로 나타내어지고, 상기 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 염기 서열이 서열 번호 4 로 나타내어지는,〔12〕또는〔13〕에 기재된 키트.
〔15〕
추가로, 계면 활성제 및 프로테이나아제 K 를 함유하는 PCR 완충액을 구비하는,〔12〕∼〔14〕중 어느 하나에 기재된 키트.
〔16〕
상기 계면 활성제가, 도데실황산나트륨인,〔15〕에 기재된 키트.
〔17〕
상기 PCR 완충액이, KCl, MgCl2 및 dNTP 믹스 (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 로 이루어지는 혼합물) 를 함유하는 트리스 완충액인,〔15〕또는〔16〕에 기재된 키트.
〔18〕
상기 PCR 완충액이, DNA 폴리메라아제에 흡착하는 생체 유래의 부전하 물질 및 DNA 에 흡착하는 생체 유래의 정전하 물질로서 PCR 을 저해하는 물질에 결합하고, 상기 부전하 물질 및 정전하 물질의 PCR 저해 작용을 중화하는 물질을 함유하는,〔15〕∼〔17〕중 어느 하나에 기재된 키트.
본 발명에 의하면, 아테로마 혈전성 뇌경색과 상관이 있는 RNF213 p.R4810K 다형을, 환자로부터 채취한 생체 시료로부터, 전처리로서 DNA 추출을 하지 않고 신속하게, 또한 특이적으로 검출할 수 있다. 이로써, 피검자가 발증한 뇌경색의 종류를 신속하게 판정할 수 있다.
도 1 은, 본 발명의 방법 및 키트를 사용하여, (A) 인공 합성한 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 유전자 및 그 변이형 유전자에 대응하는 야생형 유전자를 분석한 결과, 및 (B) 인간 혈액 및 타액 샘플을 분석한 결과를 나타내는 도면이다. PCR 프라이머쌍으로는, 서열 번호 1 (포워드) 및 서열 번호 2 (리버스) 로 나타내어지는 프라이머쌍을 사용하였다. 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트로는, 서열 번호 3 및 서열 번호 4 로 나타내어지는 염기 서열을 갖는 형광 표지 프로브를 사용하였다. (A) 야생형 유전자 (호모체) 를 포함하는 A1 에서는, 야생형 유전자에 대한 형광 강도 (실선) 는 증강되지만, 변이형 유전자에 대한 형광 강도 (파선) 는 증강되지 않았다. 변이형 유전자 (호모체) 를 포함하는 A2 에서는, 변이형 유전자에 대한 형광 강도 (파선) 는 증강되지만, 야생형 유전자에 대한 형광 강도 (실선) 는 증강되지 않았다. 야생형 유전자 및 변이형 유전자 (헤테로 접합체) 를 포함하는 A3 에서는, 야생형 유전자 및 변이형 유전자에 대한 형광 강도 (각각 실선 및 파선) 가 각각 증강되었다. (B) 혈액 및 타액 샘플 (각각 B1 및 B2) 에 있어서, 야생형 유전자에 대한 형광 강도 (실선) 는 증강되었지만, 변이형 유전자에 대한 형광 강도 (파선) 는 증강되지 않았다. 어느 샘플 모두 야생형의 호모 접합체인 것으로 판정되었다. 혈액 또는 타액 샘플을 포함하지 않는 네거티브 컨트롤 (B3) 에서는, 형광 강도의 증강은 관찰되지 않았다.
본 발명은, 피검자로부터 채취된 검체 중의 게놈 DNA 에 존재하는 RNF213 유전자에 있어서의 p.R4810K 다형 (RNF213 p.R4810K 다형) 을 검출하는 것을 특징으로 하는, 뇌경색의 리스크 평가 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은, (1) 상기 검체를, 계면 활성제 및 프로테이나아제 K 를 함유하는 PCR 완충액과 혼합하는 공정 ; (2) 공정 (1) 에서 얻어진 혼합액을, DNA 폴리메라아제, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 염기 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머쌍, 그리고 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열 및 그 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트로서, 그 올리고뉴클레오티드에 결합하는 형광 색소가 서로 상이한 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트와 혼합되고, PCR 을 실시하는 공정 ; 및, (3) 상기 PCR 산물을 검출하는 공정 ; 을 포함한다.
본 발명의 방법에 있어서, RNF213 p.R4810K 다형을 검출하기 위해서는, 피검자로부터 채취된 검체 중의 게놈 DNA 를 사용할 수 있다. 피검자로부터 채취된 검체는, 게놈 DNA 를 포함하는 것이면 특별히 한정되지 않는다. 검체로는, 예를 들어, 전혈, 혈장 및 혈청 등을 포함하는 혈액 그리고 혈액 관련 시료, 림프액, 타액, 콧물, 땀, 눈물, 소변, 분변, 조직액 (조직간액, 세포간액 및 간질액), 체강액 (복수, 흉수, 심낭액, 뇌척수액, 관절액 및 안방수), 흉강, 복강, 두개강 혹은 척주관 내의 삼출액 (흉수 또는 복수 등), 그리고 세포, 조직 또는 장기의 파쇄물 및 추출액 등을 들 수 있다. 이들 검체 중에서, 채취시의 피검자에 대한 침습성이 낮은 점에서 말초혈 및 타액이 바람직하고, 더욱 침습성이 낮은 점에서 타액이 보다 바람직하다. 본 발명의 방법에 있어서 사용되는 검체량으로는, 검체에 함유되는 게놈 DNA 양에 의존하지만, 검체가 타액 또는 말초혈이면, 0.1 ∼ 10 ㎕ 가 바람직하고, 0.5 ∼ 2 ㎕ 가 보다 바람직하다.
RNF213 p.R4810K 다형은, RNF213 유전자가 코드하는 단백질의 4810 번째의 아르기닌이 리신으로 바뀌는 다형이다. 이 유전자다형은, RNF213 유전자의 14576 번째의 염기가, 야생형에서는 구아닌 (G) 인 반면, 변이형에서는 아데닌 (A) 이 되는 일염기다형 (SNP : single nucleotide polymorphism) 이다 (Liu W, Morito D, Takashima S, et al. PLoS One. 2011 ; 6 : e22542.). 본 발명의 방법은, 이 SNP 를 검출함으로써, 뇌경색의 리스크 평가를 실시할 수 있다. 본 발명에 의해 검출되는 RNF213 p.R4810K 다형은, 변이형의 호모 접합형 또는 변이형과 야생형의 헤테로 접합형이다.
피검자로부터 채취된 검체는, 계면 활성제 및 프로테이나아제 K 를 함유하는 PCR 완충액과 혼합함으로써, 검체가 용해되고, 핵산이 유리된다. PCR 완충액에 함유되는 계면 활성제는, 세포 및 생체 조직 등을 용해시키는데, 계면 활성제로는, 음이온 계면 활성제, 양이온 계면 활성제, 양쪽성 계면 활성제 또는 비이온 계면 활성제를 선택할 수 있다. 바람직하게는, 음이온 계면 활성제인 도데실황산나트륨이고, 검체와의 혼합시에 0.1 ∼ 0.5 ％ (w/v) 인 것이 바람직하다. 프로테이나아제 K 는, DNA 및 RNA 분해 효소를 불활화시키는 작용이 있으며, 검체와의 혼합시에 100 ∼ 300 ㎍/㎖ 인 것이 바람직하다. 본 발명의 일 실시양태에 있어서, 상기 PCR 완충액은, KCl, MgCl2 및 dNTP 믹스 (deoxyribonucleotide 5'-triphosphate ; dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 로 이루어지는 혼합물) 를 함유한다. 상기 PCR 완충액은 트리스염산이 바람직하지만, 이것에 한정되지 않는다. dNTP, MgCl2, KCl 및 완충액에 대해, 당업자라면 적절한 농도를 설정할 수 있다. 예를 들어, MgCl2 가 1.5 mM, KCl 이 35 mM, dNTP 가 각각 200 μM 및 트리스염산이 10 mM 이다. 본 발명의 일 실시양태에 있어서, 상기 PCR 완충액은, DNA 폴리메라아제에 흡착하는 생체 유래의 부전하 물질 (예를 들어, 어떤 종류의 당 및 색소 등) 및 DNA 에 흡착하는 생체 유래의 정전하 물질 (예를 들어, 어떤 종류의 단백질 등) 로서 PCR 을 저해하는 물질에 결합하고, 상기 부전하 물질 및 정전하 물질의 PCR 저해 작용을 중화하는 물질을 함유한다. 상기 PCR 완충액으로서, 유전자 증폭용 시약 Ampdirect (등록 상표, 시마즈 제작소) 를 사용할 수 있다.
검체와 상기 PCR 완충액의 혼합액은, DNA 폴리메라아제 및 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 염기 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머쌍과 혼합됨으로써 PCR 을 개시할 수 있다. 상기 DNA 폴리메라아제는, 호열성 세균 유래의 내열성 DNA 폴리메라아제이고, Taq, Tth, KOD, Pfu 및 이들의 변이체를 사용할 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. DNA 폴리메라아제에 의한 비특이적 증폭을 피하기 위해, 핫 스타트 DNA 폴리메라아제를 사용해도 된다. 핫 스타트 DNA 폴리메라아제로는, 예를 들어, BIOTAQ (등록 상표) 핫 스타트 DNA 폴리메라아제를 들 수 있다. 핫 스타트 DNA 폴리메라아제에는, 항 DNA 폴리메라아제 항체가 결합한 DNA 폴리메라아제 및 효소 활성 부위를 열감수성 화학 수식한 DNA 폴리메라아제가 있지만, 본 발명에 있어서는 어느 것도 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서 사용하는 PCR 프라이머쌍은, 피검자로부터 채취된 검체 중의 게놈 DNA 를 주형으로 하고, 폴리메라아제 연쇄 반응 (polymerase chain reaction, PCR) 에 의해, 분석 대상인 RNF213 p.R4810K 다형의 상기 일염기다형 부위를 포함하는 핵산 단편을 증폭시킬 수 있다. 야생형 RNF213 유전자에 대해서도 증폭 부위는 동일하다. 증폭시키는 핵산 단편의 길이로는, RNF213 p.R4810K 다형의 상기 일염기다형 부위를 포함하는 80 ∼ 100 염기가 바람직하다. 이와 같은 PCR 프라이머쌍으로는, 서열 번호 5 에 나타내는 염기 서열로 이루어지는 영역에 대해 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하는 올리고뉴클레오티드 (포워드 프라이머 및 리버스 프라이머) 가 바람직하다. 여기서의 스트린젠트한 조건이란, 주형 DNA 에 프라이머가 결합하는 스텝인 PCR 에 있어서의 어닐링에 있어서, 주형 DNA 와 프라이머의 결합이 특이적인 조건을 말한다. 본 발명의 PCR 프라이머쌍은, 염기 길이로서 15 ∼ 25 염기가 바람직하다. 본 발명에 있어서 가장 바람직한 PCR 프라이머쌍의 염기 서열은, 이하에 나타내어진다.
(포워드) 5'- TTCCAGAACGTCCAGCAAGT -3' (서열 번호 1)
(리버스) 5'- ACAGTCCTGGTCCTGTCAGA -3' (서열 번호 2)
하기의 서열 번호 5 는, RNF213 유전자에 있어서 RNF213 p.R4810K 다형의 상기 일염기다형을 포함하는 영역의 염기 서열이다. 상기 일염기다형 부위를 포함하는 한에 있어서, 서열 번호 5 의 임의의 염기 서열을 증폭시킬 수 있다.
5'- CCCAATAACATTTTTTAGGTAAATAAAAATTGTTACTGGGTGGTCTTCCC
TTCTCCAGGAAGCAGAGCTGAGGCTGGTAAAGTTCCTGCCTGAGATTTTG
GCCTTGCAAAGGGATCTAGTGAAGCAGTTCCAGAACGTCCAGCAAGTTGA
ATACAGCTCCATCAGAGGCTTCCTCAGCAAGCACAGCTCAGGTGTGGCTC
TGCTCTGACAGGACCAGGACTGTCCCGCATTTGGCGGTTCGAAAGGATCA
CTGCATAGGGGAACAGGGTGGGGCGGAGGGGAGGAGGCGCTGATGGGTGC
TCTATAGCCTAAGCCCTTACCATGCGGTGAAGGGTGCTTGAACCCCAAAA -3' (서열 번호 5)
본 발명에 있어서 사용하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트는, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브와, 그 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 조합이다. RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열이란, RNF213 유전자의 14576 번째의 SNP (G 가 A 로 치환된 것) 를 포함하는 염기 서열을 가리키고, 그 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열이란, 변이가 없는 RNF213 유전자의 14576 번째의 염기 (G) 를 포함하는 염기 서열을 가리킨다. 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브는, PCR 에 의해 증폭된 RNF213 p.R4810K 다형의 상기 일염기다형 부위를 포함하는 핵산 단편에 대해, 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하지만, 야생형 RNF213 유전자를 주형으로 하여 PCR 에 의해 증폭된 야생형 염기 서열을 갖는 핵산 단편에 대해, 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하지 않는다. 한편, 상기 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브는, 야생형 RNF213 유전자를 주형으로 하여 PCR 에 의해 증폭된 야생형 염기 서열을 갖는 핵산 단편에 대해, 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하지만, PCR 에 의해 증폭된 RNF213 p.R4810K 다형의 상기 일염기다형 부위를 포함하는 핵산 단편에 대해, 스트린젠트한 조건에서 하이브리다이즈하지 않는다. 여기서의 스트린젠트한 조건이란, PCR 에 의해 증폭된 핵산 단편과 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 사이에서, 어닐링시에 특이적인 하이브리드가 형성되고, 비특이적인 하이브리드는 형성되지 않는 조건을 말한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브는, 염기 길이로서 10 ∼ 25 염기가 바람직하고, 보다 바람직하게는 15 ∼ 20 염기이다. 본 발명에 있어서 가장 바람직한 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트의 염기 서열은, 이하에 나타내어진다.
변이형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브 : 5'- CTCCATCAAAGGCTTCCT -3' (서열 번호 3)
야생형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브 : 5'- CTCCATCAGAGGCTTCCT -3' (서열 번호 4)
본 발명에 있어서, RNF213 p.R4810K 다형을 검출하기 위해 PCR 을 사용한다. PCR 조건 (온도, 시간 및 사이클수) 의 설정은, 당업자라면 용이하게 실시할 수 있다. 본 발명에 있어서, PCR 산물의 검출은 리얼 타임 측정에 의해 실시할 수 있다. PCR 산물의 리얼 타임 측정은, 리얼 타임 PCR 이라고도 불린다. 본 발명에서는, PCR 산물을 형광에 의해 검출하기 때문에, 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브를 사용한다. 형광 표지 프로브로는, 가수 분해 프로브, Molecular Beacon 및 사이클링 프로브 등을 들 수 있고, 이들에 한정되는 것은 아니다. 가수 분해 프로브는, 5' 말단이 형광 색소로, 또 3' 말단이 ??처 물질로 수식된 올리고뉴클레오티드이다. 가수 분해 프로브는, PCR 의 어닐링시에, 주형 DNA 에 특이적으로 하이브리다이즈하지만, 프로브 상에 ??처가 존재하기 때문에, 여기광을 조사해도 형광의 발생은 억제된다. 그 후의 신장 반응 스텝에서, Taq DNA 폴리메라아제가 갖는 5' → 3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해, 주형 DNA 에 하이브리다이즈한 가수 분해 프로브가 분해되면, 형광 색소가 프로브로부터 유리되고, ??처에 의한 형광의 발생의 억제가 해제되어 형광을 발한다. 이 형광 강도를 측정함으로써, 증폭 산물의 생성량을 측정할 수 있다. 상기 형광 색소로는, FAM (6-carboxyfluorescein), ROX (6-carboxy-X-rhodamine), Cy3 및 Cy5 (Cyanine 계 색소) 그리고 HEX (4,7,2',4',5',7'-hexachloro-6-carboxyfluorescein) 등 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 상기 ??처로는, TAMRA (등록 상표), BHQ (Black Hole Quencher, 등록 상표) 1, BHQ2, MGB-Eclipse (등록 상표) 및 DABCYL 등을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다.
본 발명에 있어서는, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 및 그 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 2 종류의 형광 표지 프로브를 사용하여, 2 종류의 DNA 표적 염기 서열을 구별하여 검출한다. 이 때문에, 상기 2 종류의 형광 표지 프로브는, 서로 상이한 형광 색소로 표지된다. 서로 상이한 형광 색소의 조합은, 형광 특성이 상이하고, 형광 측정에 있어서 서로 간섭이 없으면 특별히 한정되지 않는다.
PCR 산물의 리얼 타임 측정에 있어서, 사용하는 형광 색소에 대응한 형광 필터를 사용하여 PCR 산물의 증폭 곡선을 모니터한다. PCR 사이클수에 따라 형광 강도가 증가하는 경우에는, 검체에 있어서의 분석 대상의 DNA 의 존재가 양성인 것으로 판정되고, 한편, PCR 에 있어서 형광 강도가 증가하지 않는 경우에는 음성인 것으로 판정된다. 본 발명의 일 실시양태에 있어서, 상기 변이형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브 및 상기 야생형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브에서 유래하는 형광 강도의 증가를 비교함으로써, RNF213 p.R4810K 다형의 존재를 판정할 수 있다. RNF213 p.R4810K 다형이 호모 접합형인 경우, 상기 변이형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브에서 유래하는 형광 강도의 증가가 관찰되지만, 상기 야생형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브에서 유래하는 형광 강도의 증가는 관찰되지 않는다. RNF213 p.R4810K 다형이 변이형과 야생형의 헤테로 접합형인 경우, 상기 변이형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브 및 상기 야생형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브의 양방에서 유래하는 형광 강도의 증가가 관찰된다. 한편, 야생형 RNF213 유전자 (호모 접합형) 에서는, 상기 야생형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브에서 유래하는 형광 강도의 증가만이 관찰된다. 상기 변이형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브에서 유래하는 형광 강도의 증가가 관찰되는 경우에, RNF213 p.R4810K 다형이 검출된 것으로 판정된다.
다른 실시양태에 있어서, PCR 산물의 증폭 곡선이, 어느 일정한 임계값선 (Threshold Line) 과 교차하는 PCR 사이클수 (Cq 값) 를 기초로, RNF213 p.R4810K 다형의 존재를 판정할 수 있다. 통상적으로, Cq 값이 작은 경우, 주형 DNA 양이 많은, 즉 유전자 발현량이 많고, 한편, Cq 값이 큰 경우, 주형 DNA 양이 적은, 즉 유전자 발현 레벨이 낮은 것이 나타난다. 상기 변이형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브의 사용에 대해 소정의 Cq 값이 부여되는 경우, RNF213 p.R4810K 다형이 검출된 것으로 판정된다. RNF213 p.R4810K 다형이 변이형과 야생형의 헤테로 접합형인 경우, 양방의 형광 표지 프로브의 사용에 대해 일정한 Cq 값이 부여되지만, 양자가 동일한 값을 나타낸다고는 할 수 없다. 야생형 RNF213 유전자 (호모 접합형) 에서는, 상기 야생형 염기 서열에 결합하는 형광 표지 프로브의 사용에 대해서만, 일정한 Cq 값을 부여한다. 사용한 형광 표지 프로브에 있어서, PCR 산물의 증폭 곡선이 어느 일정한 임계값선과 교차하지 않는 경우, 즉 Cq 값이 부여되지 않는 경우에는, 그 형광 표지 프로브가 결합하는 염기 서열이 존재하지 않는 것이 나타난다.
RNF213 유전자는 뇌경색의 질환 감수성 유전자이며, RNF213 p.R4810K 다형의 존재는, 일본계 외국인을 포함하는 동아시아계 외국인에 있어서의 모야모야병 및 아테로마 혈전성 뇌경색의 발증과 상관하는 것이 보고되어 있다 (비특허문헌 1 및 2). 따라서, RNF213 p.R4810K 다형이 검출된 경우에는, 뇌경색인 모야모야병 및 아테로마 혈전성 뇌경색을 발증하는 리스크가 높은 것으로 판정할 수 있다.
본 발명은, 피검자로부터 채취된 검체 중의 게놈 DNA 에 존재하는 RNF213 유전자에 있어서의 p.R4810K 다형 (RNF213 p.R4810K 다형) 을 검출하는 키트를 제공한다. 본 발명의 키트는, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 염기 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머쌍, 그리고 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열 및 그 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트로서, 그 올리고뉴클레오티드에 결합하는 형광 색소가 서로 상이한 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트를 구비한다.
본 발명의 키트에 구비되는 상기 PCR 프라이머쌍 및 상기 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트는, 본 발명의 뇌경색의 리스크 평가 방법에 있어서 사용되는 PCR 프라이머쌍 및 형광 표지 프로브 세트와 동일하다. 본 발명의 키트는, 임상 현장에서 간편하고 신속하게 유전자 검사를 실시하는 유전자형 신속 판정 시스템에 있어서 사용할 수 있다. 유전자형 신속 판정 시스템으로는, 예를 들어 시마즈 제작소 제조 GTS-7000 을 들 수 있다.
일 실시양태에 있어서, 본 발명의 키트는, 유전자형 신속 판정 시스템에 대한 적용을 용이하게 하기 위해, 검체 전처리에 사용하는 계면 활성제 및 프로테이나아제 K 를 함유하는 PCR 완충액을 구비할 수 있다. 상기 계면 활성제는, 바람직하게는 음이온 계면 활성제이고, 보다 바람직하게는 도데실황산나트륨이다. 일 실시양태에 있어서, 상기 PCR 완충액은, KCl, MgCl2 및 dNTP 믹스 (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 로 이루어지는 혼합물) 를 함유하는 트리스 완충액이어도 된다. 일 실시양태에 있어서, 상기 PCR 완충액은, DNA 폴리메라아제에 흡착하는 생체 유래의 부전하 물질 및 DNA 에 흡착하는 생체 유래의 정전하 물질로서 PCR 을 저해하는 물질에 결합하고, 상기 부전하 물질 및 정전하 물질의 PCR 저해 작용을 중화하는 물질을 함유해도 된다. 일 실시양태에 있어서, 본 발명의 키트는, 유전자 증폭용 시약 Ampdirect 또는 동 Ampdirect Plus (모두 등록 상표, 시마즈 제작소) 를 구비할 수 있다.
본 발명의 키트를, 유전자형 신속 판정 시스템에 적용할 때에, 포지티브 컨트롤로서, 인공 합성한 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 유전자 및 그 변이형 유전자에 대응하는 야생형 유전자를 상기 시스템에 짜 넣음으로써, 유전자형의 자동 판정이 가능해진다.
실시예
다음으로 실시예를 들어 본 발명을 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위는 이들에 의해 한정되지 않는다.
[실시예 1]
〔인공 합성 유전자에 의한 확인 시험〕
인공 합성한 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 유전자 및 그 변이형 유전자에 대응하는 야생형 유전자를 사용하여, 본 발명의 키트 및 방법에 기초하여, 상기 변이형 유전자 및 상기 야생형 유전자의 판정 정밀도를 확인하였다.
(방법)
샘플에는, 상기 야생형 유전자 (호모체), 상기 변이형 유전자 (호모체), 또는 상기 야생형 유전자 및 상기 변이형 유전자 (헤테로 접합체) 를 사용하였다. PCR 반응액은, Ampdirect Plus 시약 (등록 상표, 시마즈 제작소), 서열 번호 1 (포워드) 및 서열 번호 2 (리버스) 로 나타내어지는 PCR 프라이머쌍, 서열 번호 3 및 서열 번호 4 로 나타내어지는 형광 표지 프로브 (형광 색소는, 각각 FAM 및 ROX) 그리고 정제수를 혼합함으로써 조제하였다. PCR 반응 튜브에, 상기 어느 샘플 1 ㎕, 상기 PCR 반응액 24 ㎕ 및 BIOTAQ (등록 상표) DNA 폴리메라아제 (Bioline 사, UK) 0.25 ㎕ 를 첨가하여 혼합하고, 즉시 리얼 타임 PCR 장치 (GTS-7000, 시마즈 제작소) 를 사용하여 PCR 반응을 측정하였다. PCR 은, 95 ℃/10 초-60 ℃/30 초를 50 사이클 실시하였다.
(결과)
측정 결과를 도 1(A) 에 나타내었다. 반응 개시 후 약 90 분에서, 야생형 유전자 (호모체) 를 포함하는 A1 에서는, 야생형 유전자에 대한 형광 강도 (실선) 는 증강되지만, 변이형 유전자에 대한 형광 강도 (파선) 는 증강되지 않았다. 변이형 유전자 (호모체) 를 포함하는 A2 에서는, 변이형 유전자에 대한 형광 강도 (파선) 는 증강되지만, 야생형 유전자에 대한 형광 강도 (실선) 는 증강되지 않았다. 야생형 유전자 및 변이형 유전자 (헤테로 접합체) 를 포함하는 A3 에서는, 야생형 유전자 및 변이형 유전자에 대한 형광 강도 (각각 실선 및 파선) 가 각각 증강되었다. 이들 결과로부터, 본 발명의 PCR 프라이머쌍 및 형광 표지 프로브를 사용함으로써, RNF213 p.R4810K 다형과 야생형을 정확하게 식별할 수 있는 것이 나타났다.
[실시예 2]
〔피검자로부터의 검체를 사용한 밸리데이션 시험〕
인간 혈액 샘플에 대해, 본 발명의 키트 및 방법을 사용하여, RNF213 p.R4810K 다형인지의 여부를 검토하였다.
(방법)
국립 연구 개발 법인 국립 순환기병 연구 센터로부터 공여된 인간 혈액 샘플 (전혈) 또는 인간 타액 샘플을, 계면 활성제를 함유하는 혈액 용해액으로 10 배로 희석하였다. 이 희석액 1 ㎕ 를, PCR 반응 튜브 내에서 실시예 1 과 동일한 PCR 반응액 24 ㎕ 및 BIOTAQ (등록 상표) DNA 폴리메라아제 (Bioline 사, UK) 0.25 ㎕ 와 혼합하고, 즉시 리얼 타임 PCR 장치 (GTS-7000, 시마즈 제작소) 를 사용하여 PCR 반응을 측정하였다. PCR 은, 95 ℃/10 초-60 ℃/30 초를 50 사이클 실시하였다.
(결과)
측정 결과를 도 1(B) 에 나타내었다. 혈액 샘플 (B1) 및 타액 샘플 (B2) 샘플 중 어느 것 모두 야생형 유전자에 대한 형광 강도 (실선) 는 증강되지만, 변이형 유전자에 대한 형광 강도 (파선) 는 증강되지 않았다. 따라서, 어느 샘플 모두 야생형의 호모 접합체인 것으로 판정되었다. 혈액 또는 타액 샘플을 포함하지 않는 네거티브 컨트롤 (B3) 에서는, 형광 강도의 증강은 관찰되지 않았다.
[실시예 3]
국립 연구 개발 법인 국립 순환기병 연구 센터로부터 공여된 인간 혈액 (전혈) 22 샘플 (야생형 호모 접합체 16 샘플 및 야생형과 변이형의 헤테로 접합체 6 샘플) 에 대해, 본 발명의 키트 및 방법을 사용하여 얻어진 판정 결과를, DNA 시퀀스를 사용한 서열 해석 결과와 비교하였다. 그 결과, 전체예에 대해 RNF213 p.R4810K 다형인지의 여부의 판정 결과가 일치하였다. 따라서, 본 발명의 키트 및 방법은, 피검자로부터의 검체에 대해 변이형 및 야생형의 판정 정밀도가 매우 높은 것이 나타났다.
SEQUENCE LISTING <110> SHIMADZU CORPORATION <120> Method of Evaluating the Risk of Ischemic Stroke <160> 5 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Primer <223> Synthetic oligonucleotide to act as a PCR forward primer to amplify RNF213 gene fragment. <400> 1 ttccagaacg tccagcaagt 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Primer <223> Synthetic oligonucleotide to act as a PCR reverse primer to amplify RNF213 gene fragment. <400> 2 acagtcctgg tcctgtcaga 20 <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Probe <223> Synthetic oligonucleotide to act as a probe to detect amplified RNF213 gene fragment. <400> 3 ctccatcaaa ggcttcct 18 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> Probe <223> Synthetic oligonucleotide to act as a probe to detect amplified RNF213 gene fragment. <400> 4 ctccatcaga ggcttcct 18 <210> 5 <211> 350 <212> DNA <213> Homosapiens <400> 5 cccaataaca ttttttaggt aaataaaaat tgttactggg tggtcttccc ttctccagga 60 agcagagctg aggctggtaa agttcctgcc tgagattttg gccttgcaaa gggatctagt 120 gaagcagttc cagaacgtcc agcaagttga atacagctcc atcagaggct tcctcagcaa 180 gcacagctca ggtgtggctc tgctctgaca ggaccaggac tgtcccgcat ttggcggttc 240 gaaaggatca ctgcataggg gaacagggtg gggcggaggg gaggaggcgc tgatgggtgc 300 tctatagcct aagcccttac catgcggtga agggtgcttg aaccccaaaa 350

Claims (18)

  1. 피검자로부터 채취된 검체 중의 게놈 DNA 에 존재하는 RNF213 유전자에 있어서의 p.R4810K 다형 (RNF213 p.R4810K 다형) 을 검출하는 것을 특징으로 하는, 뇌경색의 리스크 평가 방법으로서,
    (1) 상기 검체를, 계면 활성제 및 프로테이나아제 K 를 함유하는 PCR 완충액과 혼합하는 공정 ;
    (2) 공정 (1) 에서 얻어진 혼합액을, DNA 폴리메라아제, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 염기 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머쌍, 그리고 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 및 그 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 세트로서, 그 올리고뉴클레오티드에 결합하는 형광 색소가 서로 상이한 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트와 혼합되고, PCR 을 실시하는 공정 ; 및,
    (3) 상기 PCR 산물을 검출하는 공정 ;
    을 포함하고,
    상기 공정 (2) 에 있어서, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 염기 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머쌍이, 서열 번호 1 (포워드) 및 서열 번호 2 (리버스) 로 나타내어지는, 뇌경색의 리스크 평가 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 RNF213 p.R4810K 다형이, 변이형의 호모 접합형 또는 변이형과 야생형의 헤테로 접합형인, 뇌경색의 리스크 평가 방법.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 검체가, 혈액 또는 타액인, 뇌경색의 리스크 평가 방법.
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 공정 (1) 에 있어서, 계면 활성제가, 도데실황산나트륨인, 뇌경색의 리스크 평가 방법.
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 공정 (1) 에 있어서, PCR 완충액이, KCl, MgCl2 및 dNTP 믹스 (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 로 이루어지는 혼합물) 를 함유하는 트리스 완충액인, 뇌경색의 리스크 평가 방법.
  6. 제 1 항에 있어서,
    상기 공정 (1) 에 있어서, PCR 완충액이, DNA 폴리메라아제에 흡착하는 생체 유래의 부전하 물질 및 DNA 에 흡착하는 생체 유래의 정전하 물질로서 PCR 을 저해하는 물질에 결합하고, 상기 부전하 물질 및 정전하 물질의 PCR 저해 작용을 중화하는 물질을 함유하는, 뇌경색의 리스크 평가 방법.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 공정 (2) 에 있어서, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 염기 서열이 서열 번호 3 으로 나타내어지고, 상기 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 염기 서열이 서열 번호 4 로 나타내어지는, 뇌경색의 리스크 평가 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 공정 (3) 에 있어서, 상기 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브에서 유래하는 형광 강도의 증가가 관찰된 경우에, RNF213 p.R4810K 다형이 검출된 것으로 판정하는, 뇌경색의 리스크 평가 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 6 항, 제 8 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    RNF213 p.R4810K 다형이 검출된 것으로 판정된 경우에, 뇌경색을 발증하는 리스크가 높은 것으로 판정하는, 뇌경색의 리스크 평가 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 6 항, 제 8 항 및 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 뇌경색이, 모야모야병 및 아테로마 혈전성 뇌경색인, 뇌경색의 리스크 평가 방법.
  12. 피검자로부터 채취된 검체 중의 게놈 DNA 에 존재하는 RNF213 유전자에 있어서의 p.R4810K 다형 (RNF213 p.R4810K 다형) 을 검출하는 키트로서, RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 염기 서열을 증폭시키는 PCR 프라이머쌍, 그리고 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 및 그 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 세트로서, 그 올리고뉴클레오티드에 결합하는 형광 색소가 서로 상이한 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브 세트를 구비하고,
    상기 PCR 프라이머쌍이, 서열 번호 1 (포워드) 및 서열 번호 2 (리버스) 로 나타내어지는, 키트.
  13. 삭제
  14. 제 12 항에 있어서,
    상기 RNF213 p.R4810K 다형에 대응하는 유전자 변이를 포함하는 변이형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 염기 서열이 서열 번호 3으로 나타내어지고, 상기 변이형 염기 서열에 대응하는 야생형 염기 서열에 결합하는 올리고뉴클레오티드 형광 표지 프로브의 염기 서열이 서열 번호 4 로 나타내어지는, 키트.
  15. 제 12 항에 있어서,
    추가로, 계면 활성제 및 프로테이나아제 K 를 함유하는 PCR 완충액을 구비하는, 키트.
  16. 제 15 항에 있어서,
    상기 계면 활성제가, 도데실황산나트륨인, 키트.
  17. 제 15 항에 있어서,
    상기 PCR 완충액이, KCl, MgCl2 및 dNTP 믹스 (dATP, dGTP, dCTP 및 dTTP 로 이루어지는 혼합물) 를 함유하는 트리스 완충액인, 키트.
  18. 제 15 항에 있어서,
    상기 PCR 완충액이, DNA 폴리메라아제에 흡착하는 생체 유래의 부전하 물질 및 DNA 에 흡착하는 생체 유래의 정전하 물질로서 PCR 을 저해하는 물질에 결합하고, 상기 부전하 물질 및 정전하 물질의 PCR 저해 작용을 중화하는 물질을 함유하는, 키트.
KR1020200170710A 2019-12-11 2020-12-08 뇌경색의 리스크 평가 방법 KR102577378B1 (ko)

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