CN112941161A - 评价脑梗死的风险的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及评价脑梗死的风险的方法和用于进行该方法的试剂盒，所述评价脑梗死的风险的方法基于检测RNF213基因中的p.R4810K多态性。

Description

评价脑梗死的风险的方法
技术领域
本发明涉及评价脑梗死的风险的方法和用于进行该方法的试剂盒，所述评价脑梗死的风险的方法基于检测RNF213基因中的p.R4810K多态性。
背景技术
在日本，每年脑中风的死亡人数高达11万人，占其70～80％的脑梗死成为偏瘫、痴呆等的主要原因。脑梗死是向脑细胞输送血液的血管阻塞、脑细胞死亡的疾病，分为以脑部的相对较粗的血管的动脉硬化为主要原因的动脉粥样硬化性脑梗死、脑部的较细血管发生多发性阻塞的腔隙性脑梗死、在心脏内产生的血栓从心脏流出而阻塞脑部的大血管的心源性脑梗死等。通常认为动脉粥样硬化性脑梗死和腔隙性脑梗死与高血压、糖尿病等生活习惯病有关，另外，心源性脑梗死与心房纤维性颤动等心律不齐等有关。
作为针对发生脑梗死的患者的处置，基于磁共振成像(MRI；Magnetic ResonanceImaging)图像或计算机断层扫描(CT；Computed Tomography)图像，推测出脑梗死的种类(动脉粥样硬化性脑梗死、腔隙性脑梗死或心源性脑梗死)，并且确定血栓的存在部位。另外，为了使阻塞于血管内的血栓溶解，对患者给予组织型纤溶酶原激活剂(tPA；TissuePlasminogen Activator)。在需要时，对患者进行经皮冠状动脉介入治疗(血管内治疗)。在经皮冠状动脉介入治疗中，根据发生的脑梗死的种类，从使用血栓回收装置或血栓抽吸装置的治疗以及包括支架植入术在内的经皮血管成形术等中选择合适的治疗方法。
现有技术文献
非专利文献
非专利文献1：Okazaki S et al.Circulation.2019 Jan 8；139(2):295-298
非专利文献2：メディカルサイエンスダイジェスト2019年2月号「もやもや病感受性遺伝子RNF213の遺伝子型迅速判定システムの開発」
发明内容
发明要解决的问题
对于心源性脑梗死的治疗，可以使用血栓回收装置、血栓抽吸装置和经皮血管成形术中的任意者，但治疗动脉粥样硬化性脑梗死时，若使用血栓回收装置，则引起阻塞血管的内皮病变，由原位血栓形成(in-situ thrombosis；在原位的血栓形成)所致的再阻塞的危险性增高。因此，在动脉粥样硬化性脑梗死的治疗中，需要使用血栓抽吸装置或选择经皮血管成形术。在针对发生脑梗死患者的这些治疗中，使用MRI或CT的图像时，医师通过目视来判断发生的脑梗死的种类和合适的治疗方法。
在脑梗死的实际治疗现场，需要在短时间(从患者被送往医院后约1小时～1个半小时左右)内进行这些判断，但仅通过图像信息难以进行这些判断，需求图像信息之外的能够迅速且简便地确定脑梗死的种类的方法。因此，本发明的目的在于，提供能够使医师在短时间内确定脑梗死的种类的方法。
用于解决问题的方案
即，本发明的目的通过以下的发明而实现。
〔1〕
一种评价脑梗死的风险的方法，其特征在于，检测由被检者采集的待检体中的基因组DNA中存在的RNF213基因中的p.R4810K多态性(RNF213 p.R4810K多态性)，所述方法包括如下工序：
(1)将所述待检体与包含表面活性剂和蛋白酶K的PCR缓冲液混合的工序；
(2)将工序(1)中得到的混合液与DNA聚合酶、扩增包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的碱基序列的PCR引物对、和寡核苷酸荧光标记探针组混合并进行PCR的工序，所述寡核苷酸荧光标记探针组为：与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针、以及与对应于该突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的组，并且所述寡核苷酸上结合的荧光染料彼此不同；和
(3)检测所述PCR产物的工序。
〔2〕
根据〔1〕所述的方法，其中，所述RNF213 p.R4810K多态性为突变型的纯合型或突变型与野生型的杂合型。
〔3〕
根据〔1〕或〔2〕所述的方法，其中，所述待检体为血液或唾液。
〔4〕
根据〔1〕～〔3〕中任一项所述的方法，其中，所述工序(1)中，表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
〔5〕
根据〔1〕～〔4〕中任一项所述的方法，其中，所述工序(1)中，PCR缓冲液为包含KCl、MgCl2和dNTP混合物(包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物)的Tris缓冲液。
〔6〕
根据〔1〕～〔5〕中任一项所述的方法，其中，所述工序(1)中，PCR缓冲液包含下述物质，所述物质与吸附于DNA聚合酶的源自生物体的抑制PCR的带负电的物质、以及吸附于DNA的源自生物体的抑制PCR的带正电的物质结合，中和所述带负电的物质和带正电的物质的PCR抑制作用。
〔7〕
根据〔1〕～〔6〕中任一项所述的方法，其中，所述工序(2)中，扩增包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的碱基序列的PCR引物对由序列号1(正向)和序列号2(反向)表示。
〔8〕
根据〔1〕～〔7〕中任一项所述的方法，其中，所述工序(2)中，与包含对应于RNF213p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的碱基序列由序列号3表示，与对应于所述突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的碱基序列由序列号4表示。
〔9〕
根据〔1〕～〔8〕中任一项所述的方法，其中，所述工序(3)中，在观察到源自与所述突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的荧光强度的增加的情况下，判定为检测出RNF213 p.R4810K多态性。
〔10〕
根据〔1〕～〔9〕中任一项所述的方法，其中，在判定为检测出RNF213 p.R4810K多态性的情况下，判定为发生脑梗死的风险高。
〔11〕
根据〔1〕～〔10〕中任一项所述的方法，其中，所述脑梗死为烟雾病和动脉粥样硬化性脑梗死。
〔12〕
一种试剂盒，其为检测由被检者采集的待检体中的基因组DNA中存在的RNF213基因中的p.R4810K多态性(RNF213 p.R4810K多态性)的试剂盒，所述试剂盒具备：扩增包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的碱基序列的PCR引物对、和寡核苷酸荧光标记探针组，所述寡核苷酸荧光标记探针组为：与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针、以及与对应于该突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的组，并且所述寡核苷酸上结合的荧光染料彼此不同。
〔13〕
根据〔12〕所述的试剂盒，其中，所述PCR引物对由序列号1(正向)和序列号2(反向)表示。
〔14〕
根据〔12〕或〔13〕所述的试剂盒，其中，所述与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的碱基序列由序列号3表示，与对应于所述突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的碱基序列由序列号4表示。
〔15〕
根据〔12〕～〔14〕中任一项所述的试剂盒，其还具备包含表面活性剂和蛋白酶K的PCR缓冲液。
〔16〕
根据〔15〕所述的试剂盒，其中，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
〔17〕
根据〔15〕或〔16〕所述的试剂盒，其中，所述PCR缓冲液为包含KCl、MgCl2和dNTP混合物(包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物)的Tris缓冲液。
〔18〕
根据〔15〕～〔17〕中任一项所述的试剂盒，其中，所述PCR缓冲液包含下述物质，所述物质与吸附于DNA聚合酶的源自生物体的抑制PCR的带负电的物质、以及吸附于DNA的源自生物体的抑制PCR的带正电的物质结合，中和所述带负电的物质和带正电的物质的PCR抑制作用。
发明的效果
根据本发明，能够在不进行作为预处理的DNA提取的情况下，从由患者采集的生物体试样中迅速且特异性地检测与动脉粥样硬化性脑梗死具有相关性的RNF213 p.R4810K多态性。由此，能够迅速地判定被检者发生的脑梗死的种类。
附图说明
图1：(A)为示出使用本发明的方法和试剂盒，来分析人工合成的包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型基因、和对应于该突变型基因的野生型基因的结果的图，(B)为示出使用本发明的方法和试剂盒分析人血液和唾液样品的结果的图。作为PCR引物对，使用由序列号1(正向)和序列号2(反向)表示的引物对。作为寡核苷酸荧光标记探针组，使用具有由序列号3和序列号4表示的碱基序列的荧光标记探针。(A)包含野生型基因(纯合体)的A1中，野生型基因的荧光强度(实线)增强，但突变型基因的荧光强度(虚线)未增强。在包含突变型基因(纯合体)的A2中，突变型基因的荧光强度(虚线)增强，但野生型基因的荧光强度(实线)未增强。包含野生型基因和突变型基因(杂合体)的A3中，野生型基因和突变型基因的荧光强度(分别为实线和虚线)分别增强。(B)在血液和唾液样品(分别为B1和B2)中，野生型基因的荧光强度(实线)增强，但突变型基因的荧光强度(虚线)未增强。判定任意的样品均为野生型的纯合体。在不包含血液或唾液样品的阴性对照(B3)中，未观察到荧光强度的增强。
具体实施方式
本发明提供评价脑梗死的风险的方法，其特征在于，检测由被检者采集的待检体中的基因组DNA中存在的RNF213基因中的p.R4810K多态性(RNF213 p.R4810K多态性)。本发明的方法包括如下工序：(1)将上述待检体与包含表面活性剂和蛋白酶K的PCR缓冲液混合的工序；(2)将工序(1)中得到的混合液与DNA聚合酶、扩增包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的碱基序列的PCR引物对、和寡核苷酸荧光标记探针组混合并进行PCR的工序，所述寡核苷酸荧光标记探针组为：与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列、以及对应于该突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的组，并且所述寡核苷酸上结合的荧光染料彼此不同；以及(3)检测上述PCR产物的工序。
本发明的方法中，为了检测RNF213 p.R4810K多态性，可以使用由被检者采集的待检体中的基因组DNA。由被检者采集的待检体只要包含基因组DNA就没有特别限定。作为待检体，例如可列举出：包括全血、血浆和血清等在内的血液以及血液相关试样、淋巴液、唾液、鼻水、汗、泪、尿、粪便、组织液(组织间液、细胞间液和间质液)、体腔液(腹水、胸水、心包液、脑脊液、关节液和眼房水)、胸腔、腹腔、颅腔或椎管内的渗出液(胸水或腹水等)、以及细胞、组织或脏器的破碎物和提取液等。这些待检体当中，外周血和唾液由于采集时对被检者的侵入性低而优选，唾液由于侵入性更低而更优选。作为本发明的方法中使用的待检体量，依赖于待检体中含有的基因组DNA量，若待检体为唾液或外周血则优选0.1～10μL，更优选0.5～2μL。
RNF213 p.R4810K多态性是RNF213基因所编码的蛋白的第4810位的精氨酸变为赖氨酸的多态性。该基因多态性是RNF213基因的第14576位的碱基在野生型中为鸟嘌呤(G)、而在突变型中为腺嘌呤(A)的单核苷酸多态性(SNP：single nucleotide polymorphism)(Liu W,Morito D,Takashima S,et al.PLoS One.2011；6:e22542.)。本发明的方法可以通过检测该SNP来进行脑梗死的风险的评价。根据本发明而检测的RNF213 p.R4810K多态性是突变型的纯合型或突变型与野生型的杂合型。
通过将由被检者采集的待检体与包含表面活性剂和蛋白酶K的PCR缓冲液进行混合，从而使待检体溶解而游离出核酸。PCR缓冲液中包含的表面活性剂将细胞和生物体组织等溶解，作为表面活性剂，可以选择阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂或非离子表面活性剂。优选为作为阴离子表面活性剂的十二烷基硫酸钠，与待检体混合时优选为0.1～0.5％(w/v)。蛋白酶K具有使DNA和RNA降解酶失活的作用，与待检体混合时优选为100～300μg/mL。本发明的一个实施方式中，上述PCR缓冲液包含KCl、MgCl2和dNTP混合物(脱氧核糖核苷酸5’-三磷酸；deoxyribonucleotide 5’-triphosphate；包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物)。上述PCR缓冲液优选Tris盐酸，但不限定于此。对于dNTP、MgCl2、KCl和缓冲液，本领域技术人员可以设定合适的浓度。例如，MgCl2为1.5mM，KCl为35mM，dNTP分别为200μM，Tris盐酸为10mM。本发明的一个实施方式中，上述PCR缓冲液包含下述物质，所述物质与吸附于DNA聚合酶的源自生物体的抑制PCR的带负电的物质(例如，某种糖和色素等)、以及吸附于DNA的源自生物体的抑制PCR的带正电的物质(例如，某种蛋白质等)结合，中和所述带负电的物质和带正电的物质的PCR抑制作用。作为上述PCR缓冲液，可以使用基因扩增用试剂Ampdirect(注册商标、岛津制作所)。
对于待检体与上述PCR缓冲液的混合液而言，可以通过与DNA聚合酶和扩增包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的碱基序列的PCR引物对混合而开始PCR。上述DNA聚合酶是嗜热菌来源的耐热性DNA聚合酶，可以使用Taq、Tth、KOD、Pfu和它们的突变体，但不限定于这些。为了避免由DNA聚合酶所致的非特异性扩增，还可以使用热启动DNA聚合酶。作为热启动DNA聚合酶，例如可列举出BIOTAQ(注册商标)热启动DNA聚合酶。热启动DNA聚合酶有：结合有抗DNA聚合酶抗体的DNA聚合酶、和对酶活性位点进行热敏性化学修饰的DNA聚合酶，本发明中可以使用任意者。
本发明中使用的PCR引物对能够以由被检者采集的待检体中的基因组DNA作为模板通过聚合酶链式反应(polymerase chain reaction、PCR)扩增包含作为分析对象的RNF213 p.R4810K多态性的上述单核苷酸多态性位点的核酸片段。对于野生型RNF213基因，扩增位点也相同。作为所扩增的核酸片段的长度，优选包含RNF213 p.R4810K多态性的上述单核苷酸多态性位点的80～100碱基。作为这样的PCR引物对，优选在严格的条件下对包含序列号5所示的碱基序列的区域进行杂交的寡核苷酸(正向引物和反向引物)。此处的严格的条件是指：在引物与模板DNA结合的步骤、即PCR的退火中，模板DNA与引物的结合具有特异性的条件。作为本发明的PCR引物对的碱基长度，优选15～25个碱基。本发明中最优选的PCR引物对的碱基序列如下所示。
(正向)5’-TTCCAGAACGTCCAGCAAGT-3’(序列号1)
(反向)5’-ACAGTCCTGGTCCTGTCAGA-3’(序列号2)
下述的序列号5是RNF213基因中包含RNF213 p.R4810K多态性的上述单核苷酸多态性的区域的碱基序列。只要包含上述单核苷酸多态性位点，则可以对序列号5中的任意的碱基序列进行扩增。
5’-CCCAATAACATTTTTTAGGTAAATAAAAATTGTTACTGGGTGGTCTTCCCTTCTCCAGGAAGCAGAGCTGAGGCTGGTAAAGTTCCTGCCTGAGATTTTGGCCTTGCAAAGGGATCTAGTGAAGCAGTTCCAGAACGTCCAGCAAGTTGAATACAGCTCCATCAGAGGCTTCCTCAGCAAGCACAGCTCAGGTGTGGCTCTGCTCTGACAGGACCAGGACTGTCCCGCATTTGGCGGTTCGAAAGGATCACTGCATAGGGGAACAGGGTGGGGCGGAGGGGAGGAGGCGCTGATGGGTGCTCTATAGCCTAAGCCCTTACCATGCGGTGAAGGGTGCTTGAACCCCAAAA-3’(序列号5)
本发明中使用的寡核苷酸荧光标记探针组是与包含对应于RNF213p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针、和与对应于该突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的组合。包含对应于RNF213p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列是指：包含RNF213基因的第14576位的SNP(G替换为A者)的碱基序列，对应于该突变型碱基序列的野生型碱基序列是指：包含无突变的RNF213基因的第14576位的碱基(G)的碱基序列。与突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针在严格的条件下与通过PCR而扩增的包含RNF213 p.R4810K多态性的上述单核苷酸多态性位点的核酸片段杂交，但在严格的条件下不与以野生型RNF213基因作为模板通过PCR而扩增的具有野生型碱基序列的核酸片段杂交。另一方面，与上述野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针在严格的条件下与以野生型RNF213基因作为模板通过PCR而扩增的具有野生型碱基序列的核酸片段杂交，但在严格的条件下不与通过PCR而扩增的包含RNF213 p.R4810K多态性的上述单核苷酸多态性位点的核酸片段杂交。此处的严格的条件是指：在通过PCR而扩增的核酸片段与寡核苷酸荧光标记探针之间，在退火时形成特异性杂交体、不形成非特异性杂交体的条件。
对于本发明的寡核苷酸荧光标记探针，作为碱基长度，优选10～25个碱基，更优先为15～20个碱基。本发明中最优选的寡核苷酸荧光标记探针组的碱基序列如下所示。
与突变型碱基序列结合的荧光标记探针：5’-CTCCATCAAAGGCTTCCT-3’(序列号3)
与野生型碱基序列结合的荧光标记探针：5’-CTCCATCAGAGGCTTCCT-3’(序列号4)
本发明中，为了检测RNF213 p.R4810K多态性而使用PCR。对于PCR条件(温度、时间和循环数)的设定，本领域技术人员可以容易地进行。本发明中，PCR产物的检测可以通过实时测定来进行。PCR产物的实时测定也称为实时PCR。本发明中，为了利用荧光来检测PCR产物，而使用寡核苷酸荧光标记探针。作为荧光标记探针，可以列举出水解探针、分子信标(Molecular Beacon)和环状探针等，但不限定于这些。水解探针是5’末端被荧光染料修饰、且3’末端被淬灭物质修饰的寡核苷酸。水解探针在PCR的退火时与模板DNA特异性杂交，但由于探针上存在淬灭剂，因此即使照射激发光，荧光的产生也被抑制。在之后的延伸反应步骤中，若与模板DNA杂交的水解探针在Taq DNA聚合酶所具有的5’→3’核酸外切酶活性作用下被分解，则荧光染料从探针中游离，消除了淬灭剂对荧光产生的抑制而发出荧光。通过测定该荧光强度，从而能够测定扩增产物的产量。作为上述荧光染料，可列举出6-羧基荧光素(FAM；6-carboxyfluorescein)、6-羧基-X-罗丹明(ROX；6-carboxy-X-rhodamine)、Cy3和Cy5(花菁系色素)以及六氯-6-羧基荧光素(HEX；4,7,2’,4’,5’,7’-hexachloro-6-carboxyfluorescein)等，但不限定于这些。作为上述淬灭剂，可以列举出TAMRA(注册商标)、BHQ(Black Hole Quencher、注册商标)1、BHQ2、MGB-Eclipse(注册商标)和DABCYL等，但不限定于这些。
本发明中，使用与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针和与对应于该突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针这2种荧光标记探针，区分检测2种DNA靶碱基序列。为此，用彼此不同的荧光染料标记上述2种荧光标记探针。彼此不同的荧光染料的组合只要荧光特性不同、在荧光测定中不相互干扰就没有特别限定。
在PCR产物的实时测定中，使用对应于所使用的荧光染料的荧光滤光片来监测PCR产物的扩增曲线。在荧光强度根据PCR循环数而增加的情况下，判定待检体中的分析对象的DNA的存在为阳性，另一方面，PCR中荧光强度未增加的情况下，判定为阴性。本发明的一个实施方式中，通过对源自与上述突变型碱基序列结合的荧光标记探针和与上述野生型碱基序列结合的荧光标记探针的荧光强度的增加进行比较，从而能够判定RNF213 p.R4810K多态性的存在。RNF213 p.R4810K多态性为纯合型的情况，可观察到源自与上述突变型碱基序列结合的荧光标记探针的荧光强度的增加，但观察不到源自与上述野生型碱基序列结合的荧光标记探针的荧光强度的增加。RNF213p.R4810K多态性为突变型与野生型的杂合型的情况，可观察到源自与上述突变型碱基序列结合的荧光标记探针和与上述野生型碱基序列结合的荧光标记探针这两者的荧光强度的增加。另一方面，野生型RNF213基因(纯合型)中，仅观察到源自与上述野生型碱基序列结合的荧光标记探针的荧光强度的增加。在观察到源自与上述突变型碱基序列结合的荧光标记探针的荧光强度的增加的情况下，判定为检测出RNF213 p.R4810K多态性。
在另一实施方式中，可以基于PCR产物的扩增曲线与某个阈值线(ThresholdLine)相交的PCR循环数(Cq值)来判定RNF213 p.R4810K多态性的存在。通常，Cq值小时，表示模板DNA量多、即基因表达量高，另一方面，Cq值大时，表示模板DNA量少、即基因表达水平低。在对于使用与上述突变型碱基序列结合的荧光标记探针而给出规定的Cq值的情况下，判定为检测出RNF213 p.R4810K多态性。RNF213 p.R4810K多态性为突变型与野生型的杂合型的情况下，对于使用两种荧光标记探针，给出一定的Cq值，但两者不限于显示相同的值。野生型RNF213基因(纯合型)的情况下，仅对于使用与上述野生型碱基序列结合的荧光标记探针给出一定的Cq值。所使用的荧光标记探针中，在PCR产物的扩增曲线与某个阈值线不相交的情况下，即未给出Cq值的情况，表示不存在该荧光标记探针所结合的碱基序列。
RNF213基因是脑梗死的疾病易感性基因，报道称RNF213 p.R4810K多态性的存在与包括日系人在内的东亚系人的烟雾病和动脉粥样硬化性脑梗死的发病有关(非专利文献1和2)。因此，在检测出RNF213 p.R4810K多态性的情况下，能够判定为发生作为脑梗死的烟雾病和动脉粥样硬化性脑梗死的风险高。
本发明提供检测由被检者采集的待检体中的基因组DNA中存在的RNF213基因中的p.R4810K多态性(RNF213 p.R4810K多态性)的试剂盒。本发明的试剂盒具备：扩增包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的碱基序列的PCR引物对、和寡核苷酸荧光标记探针组，所述寡核苷酸荧光标记探针组为：与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列、以及与对应于该突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的组，并且所述寡核苷酸上结合的荧光染料彼此不同。
本发明的试剂盒中所具备的上述PCR引物对和上述寡核苷酸荧光标记探针组与本发明的评价脑梗死的风险的方法中使用的PCR引物对和荧光标记探针组相同。本发明的试剂盒可以用于在临床现场简便且迅速地进行基因检测的基因型快速判定系统。作为基因型快速判定系统，例如可列举出岛津制作所制GTS-7000。
一个实施方式中，为了容易地用于基因型快速判定系统，本发明的试剂盒可以具备用于待检体预处理的包含表面活性剂和蛋白酶K的PCR缓冲液。上述表面活性剂优先为阴离子表面活性剂，更优先为十二烷基硫酸钠。一个实施方式中，上述PCR缓冲液可以是包含KCl、MgCl2和dNTP混合物(包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物)的Tris缓冲液。一个实施方式中，PCR缓冲液可以包含下述物质，所述物质与吸附于DNA聚合酶的源自生物体的抑制PCR的带负电的物质、以及吸附于DNA的源自生物体的抑制PCR的带正电的物质结合，中和所述带负电的物质和带正电的物质的PCR抑制作用。一个实施方式中，本发明的试剂盒可以具备基因扩增用试剂Ampdirect或Ampdirect Plus(均为注册商标、岛津制作所)。
在将本发明的试剂盒用于基因型快速判定系统时，通过将作为阳性对照的人工合成的包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型基因和对应于该突变型基因的野生型基因引入上述系统中，从而能够进行基因型的自动判定。
实施例
接着，列举实施例对本发明进行详细地说明，但本发明的范围不限定于这些。
[实施例1]
〔基于人工合成基因的确认试验〕
使用人工合成的包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型基因和对应于该突变型基因的野生型基因，基于本发明的试剂盒和方法，确认了上述突变型基因和上述野生型基因的判定精度。
(方法)
作为样品，使用上述野生型基因(纯合体)、上述突变型基因(纯合体)、或上述野生型基因和上述突变型基因(杂合体)。通过将Ampdirect Plus试剂(注册商标、岛津制作所)、由序列号1(正向)和序列号2(反向)表示的PCR引物对、由序列号3和序列号4表示的荧光标记探针(荧光染料分别为FAM和ROX)以及纯化水混合而制备PCR反应液。在PCR反应管中加入上述任意的样品1μL、上述PCR反应液24μL和BIOTAQ(注册商标)DNA聚合酶(Bioline公司、UK)0.25μL并进行混合，立即使用实时PCR装置(GTS-7000、岛津制作所)测定了PCR反应。将95℃/10秒-60℃/30秒循环50次来进行PCR。
(结果)
将测定结果示于图1的(A)。在反应开始后约90分钟时，包含野生型基因(纯合体)的A1中，野生型基因的荧光强度(实线)增强，但突变型基因的荧光强度(虚线)未增强。包含突变型基因(纯合体)的A2中，突变型基因的荧光强度(虚线)增强，但野生型基因的荧光强度(实线)未增强。包含野生型基因和突变型基因(杂合体)的A3中，野生型基因和突变型基因的荧光强度(分别为实线和虚线)分别增强。由这些结果示出：通过使用本发明的PCR引物对和荧光标记探针，能够准确地识别RNF213 p.R4810K多态性和野生型。
[实施例2]
〔使用来自被检者的待检体的验证试验〕
对于人血液样品，使用本发明的试剂盒和方法，研究了是否为RNF213 p.R4810K多态性。
(方法)
用包含表面活性剂的血液溶解液将由国立研究开发法人国立循环器病研究中心给予的人血液样品(全血)或人唾液样品稀释10倍。在PCR反应管内将该稀释液1μL与实施例1相同的PCR反应液24μL和BIOTAQ(注册商标)DNA聚合酶(Bioline公司、UK)0.25μL混合，立即使用实时PCR装置(GTS-7000、岛津制作所)测定了PCR反应。将95℃/10秒-60℃/30秒循环50次来进行PCR。
(结果)
将测定结果示于图1的(B)。对于血液样品(B1)和唾液样品(B2)样品，野生型基因的荧光强度(实线)均增强，但突变型基因的荧光强度(虚线)未增强。因此，判定任意的样品均为野生型的纯合体。在不包含血液或唾液样品的阴性对照(B3)中，未观察到荧光强度的增强。
[实施例3]
对于由国立研究开发法人国立循环器病研究中心给予的人血液(全血)22个样品(16个野生型纯合体样品和6个野生型和突变型的杂合体样品)，将使用本发明的试剂盒和方法而得到的判定结果与使用了DNA测序的序列分析结果进行比较。其结果，在全部例子中，对于是否为RNF213 p.R4810K多态性的判定结果一致。因此，本发明的试剂盒和方法对于来自被检者的待检体显示出极高的突变型和野生型的判定精度。
序列表
<110> 国立研究开发法人国立循环器病研究中心(National Cerebral andCardiovascular Center)
株式会社岛津制作所(SHIMADZU CORPORATION)
<120> 评价脑梗死的风险的方法
<130>
<160> 5
<170>
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220> 引物
<223> 合成寡核苷酸，作为PCR正向引物来扩增RNF213基因片段.
<400> 1
ttccagaacg tccagcaagt 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220> 引物
<223> 合成寡核苷酸，作为PCR反向引物来扩增RNF213基因片段.
<400> 2
acagtcctgg tcctgtcaga 20
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220> 探针
<223> 合成寡核苷酸，作为探针来检测所扩增的RNF213基因片段.
<400> 3
ctccatcaaa ggcttcct 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列（Artificial Sequence）
<220> 探针
<223> 合成寡核苷酸，作为探针来检测所扩增的RNF213基因片段.
<400> 4
ctccatcaga ggcttcct 18
<210> 5
<211> 350
<212> DNA
<213> 智人（Homosapiens）
<400> 5
cccaataaca ttttttaggt aaataaaaat tgttactggg tggtcttccc ttctccagga 60
agcagagctg aggctggtaa agttcctgcc tgagattttg gccttgcaaa gggatctagt 120
gaagcagttc cagaacgtcc agcaagttga atacagctcc atcagaggct tcctcagcaa 180
gcacagctca ggtgtggctc tgctctgaca ggaccaggac tgtcccgcat ttggcggttc 240
gaaaggatca ctgcataggg gaacagggtg gggcggaggg gaggaggcgc tgatgggtgc 300
tctatagcct aagcccttac catgcggtga agggtgcttg aaccccaaaa 350

Claims (18)

1.一种PCR引物对与寡核苷酸荧光标记探针组的组合的、在制备用于评价脑梗死的风险的方法的试剂盒中的应用，
所述PCR引物对为扩增包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的碱基序列的PCR引物对，
所述寡核苷酸荧光标记探针组为与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针、以及与对应于该突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的组，
所述评价脑梗死的风险的方法的特征在于，检测由被检者采集的待检体中的基因组DNA中存在的RNF213基因中的p.R4810K多态性、即RNF213p.R4810K多态性，所述方法包括如下工序：
(1)将所述待检体与包含表面活性剂和蛋白酶K的PCR缓冲液混合的工序；
(2)将工序(1)中得到的混合液与DNA聚合酶、扩增包含对应于RNF213p.R4810K多态性的基因突变的碱基序列的PCR引物对、和寡核苷酸荧光标记探针组混合并进行PCR的工序，所述寡核苷酸荧光标记探针组为：与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针、以及与对应于该突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的组，并且所述寡核苷酸上结合的荧光染料彼此不同；和
(3)检测所述PCR产物的工序。
2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述RNF213 p.R4810K多态性为突变型的纯合型、或突变型与野生型的杂合型。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其中，所述待检体为血液或唾液。
4.根据权利要求1～3中任一项所述的应用，其中，所述工序(1)中，表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
5.根据权利要求1～4中任一项所述的应用，其中，所述工序(1)中，PCR缓冲液为包含KCl、MgCl2和dNTP混合物的Tris缓冲液，所述dNTP混合物为包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物。
6.根据权利要求1～5中任一项所述的应用，其中，所述工序(1)中，PCR缓冲液包含下述物质，所述物质与吸附于DNA聚合酶的源自生物体的抑制PCR的带负电的物质、以及吸附于DNA的源自生物体的抑制PCR的带正电的物质结合，中和所述带负电的物质和带正电的物质的PCR抑制作用。
7.根据权利要求1～6中任一项所述的应用，其中，所述工序(2)中，扩增包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的碱基序列的PCR引物对由序列号1的正向引物和序列号2的反向引物表示。
8.根据权利要求1～7中任一项所述的应用，其中，所述工序(2)中，与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的碱基序列由序列号3表示，与对应于所述突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的碱基序列由序列号4表示。
9.根据权利要求1～8中任一项所述的应用，其中，所述工序(3)中，在观察到源自与所述突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的荧光强度增加的情况下，判定为检测出RNF213 p.R4810K多态性。
10.根据权利要求1～9中任一项所述的应用，其中，在判定为检测出RNF213 p.R4810K多态性的情况下，判定为发生脑梗死的风险高。
11.根据权利要求1～10中任一项所述的应用，其中，所述脑梗死为烟雾病和动脉粥样硬化性脑梗死。
12.一种试剂盒，其为检测由被检者采集的待检体中的基因组DNA中存在的RNF213基因中的p.R4810K多态性、即RNF213 p.R4810K多态性的试剂盒，所述试剂盒具备：扩增包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的碱基序列的PCR引物对、和寡核苷酸荧光标记探针组，所述寡核苷酸荧光标记探针组为：与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针、以及与对应于该突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的组，并且所述寡核苷酸上结合的荧光染料彼此不同。
13.根据权利要求12所述的试剂盒，其中，所述PCR引物对由序列号1的正向引物和序列号2的反向引物表示。
14.根据权利要求12或13所述的试剂盒，其中，所述与包含对应于RNF213 p.R4810K多态性的基因突变的突变型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的碱基序列由序列号3表示，与对应于所述突变型碱基序列的野生型碱基序列结合的寡核苷酸荧光标记探针的碱基序列由序列号4表示。
15.根据权利要求12～14中任一项所述的试剂盒，其还具备包含表面活性剂和蛋白酶K的PCR缓冲液。
16.根据权利要求15所述的试剂盒，其中，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠。
17.根据权利要求15或16所述的试剂盒，其中，所述PCR缓冲液为包含KCl、MgCl2和dNTP混合物的Tris缓冲液，所述dNTP混合物为包含dATP、dGTP、dCTP和dTTP的混合物。
18.根据权利要求15～17中任一项所述的试剂盒，其中，所述PCR缓冲液包含下述物质，所述物质与吸附于DNA聚合酶的源自生物体的抑制PCR的带负电的物质、以及吸附于DNA的源自生物体的抑制PCR的带正电的物质结合，中和所述带负电的物质和带正电的物质的PCR抑制作用。
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