KR20180047774A - 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 rnf213 유전자의 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물 및 이의 이용 - Google Patents

Abstract

RNF213 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물, 키트 및 이를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다. 상기 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물을 이용하면 일반적인 염기서열분석 기술에 비하여 간단하면서도 정확하게 관련 질환의 원인 돌연변이를 검출할 수 있다.

Description

실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 RNF213 유전자의 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물 및 이의 이용{Composition for diagnosing diseases caused by mutation of RNF213 gene using Real-Time PCR, and use thereof}

RNF213 유전자의 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 RNF213 유전자의 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물, 키트, 및 이를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 RNF213 유전자의 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.

모야모야병(moyamoya disease)은 양측 내경동맥 형성부전이라고도 하며, 특별한 이유 없이 뇌 속 특정 혈관 즉, 내경동맥의 끝부분이 막히는 만성 진행성 뇌혈관 질환을 말한다 뇌혈관 동맥 조영상에 따라 일본말로 "담배연기가 모락모락 올라가는 모양"의 뜻을 지닌 모야모야병으로 명명되었다. 일본의 경우 1990년까지 집계된 환자 수는 약 3,300명이며 매년 새로 발견되는 환자 수는 약 200명으로 알려져 있다. 세계에서 일본 다음으로는 한국과 중국에 이 질환이 많이 발생된다.

이 질병은 전반적인 정확한 발병 원리나 원인은 밝혀지지 않았으나, 최근 RNF213 유전자의 c.14429G>A (p.Arg4810Lys) 변이가 중요한 유전적 요인으로 밝혀졌다(J Hum Genet 2011; 56:34-40). 일본인 모야모야병 환자의 경우 가족성 환자의 약 95%와 산발성 환자의 약 73%에서 이 변이가 발견되었다. 이 변이는 정상 일본인의 약 1.4%에서 발견되었으며, 따라서 RNF213 c.14429G>A (p.Arg4810Lys) 변이를 가지고 있는 사람에서 모야모야병의 Odds Ratio는 약 190.8 (95% Confidence Interval 71.7-507.9)로 추정되었다. 후속 연구에서 중국인과 한국인 모야모야병 환자에서도 이 변이는 모야모야병의 중요한 유전적 원인임이 확인되었다(PLoS One 2011; 6:e22542, PLoS One 2015;10:e0130663, J Neurosurg 2016;124:1221-1227).

또한, 최근에는 RNF213 유전자의 c.14429G>A (p.Arg4810Lys) 변이가 모야모야병 뿐만 아니라 뇌혈관 협착증(intracranial stenosis), 뇌혈관 동맥경화증(intracranial atherosclerosis), 신장동맥 협착증(rental artery stenosis), 폐동맥 혈관병증(pulmonary vasculopathy) 등 다양한 질환과 관련되었음이 알려졌다(PLoS One 2015;10:e0130663, PLoS One 2016;11:e0156607, Am J Med Genet 2016;170:2453-2456).

이에 본 발명자들은 모야모야병 및 관련 질환의 유전적 요인으로서 RNF213 유전자의 돌연변이를 효과적으로 검출하기 위한 방법에 대해 연구를 수행하여 본 발명을 완성하였다.

J Hum Genet 2011; 56:34-40. PLoS One 2011; 6:e22542. PLoS One 2015; 10:e0130663. J Neurosurg 2016; 124:1221-1227. PLoS One 2016; 11:e0156607. Am J Med Genet 2016; 170:2453-2456.

일 양상은 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물을 제공한다.

다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 키트를 제공한다.

다른 양상은 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

일 양상은 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물로서,

상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍이며,

상기 프로브는 서열번호 3 및 4의 프로브 쌍이며,

상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되며,

상기 프로브 쌍은 RNF213 유전자의 야생형에 결합하는 야생형 검출용 프로브와 RNF213 유전자의 돌연변이에 결합하는 돌연변이 검출용 프로브로 이루어진 것인 조성물을 제공한다.

상기 RNF213 유전자의 돌연변이는 하기와 같이 정의된다:

RNF213(Ring finger protein 213) 유전자의 돌연변이는 서열번호 5로 표시되는 RNF213 유전자(NCBI Accession no. NM_001256071)에서 코딩 서열(coding sequence: CDS)을 기준으로 표시된다. 서열번호 5에서 151번 내지 15774번 위치의 뉴클레오티드 서열은 RNF213 유전자의 코딩 서열(CDS)에 해당한다. 번역 개시 코돈은 ATG의 A를 뉴클레오티드 +1로 표시하며, 서열번호 5에서 151번 위치의 A가 뉴클레오티드 +1로 표시된다.

치환(substitution) 돌연변이는 기호 ">"를 표시하여 기재하며, ">" 앞의 문자는 정상인 RNF213 유전자의 뉴클레오티드이며, ">" 뒤의 문자는 돌연변이 RNF213 유전자의 뉴클레오티드를 의미한다.

돌연변이 "c.14429G>A"는 서열번호 5의 뉴클레오티드 서열의 코딩 서열(CDS)에서 14429번째 위치의 G가 A로 치환된 것을 의미한다.

상기 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병은 예를 들어, 모야모야병, 뇌혈관 협착증(intracranial stenosis), 뇌혈관 동맥경화증(intracranial atherosclerosis), 신장동맥 협착증(rental artery stenosis), 폐동맥 혈관병증(pulmonary vasculopathy) 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다(PLoS One 2015;10:e0130663, PLoS One 2016;11:e0156607, Am J Med Genet 2016;170:2453-2456).

용어, "프라이머(primer)"는 중합효소연쇄반응에서 증폭되는 표적 핵산 부위의 5' 말단 서열 또는 3' 말단 서열에 각각 상보적이고, 적합한 온도에서 중합효소연쇄반응액 중 주형-지시 핵산의 중합효소반응의 개시점으로 작용할 수 있는 단일-가닥 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 프라이머의 적합한 길이는 반응 온도와 프라이머의 용도 등의 인자에 따라 정해지나, 일반적으로 15 내지 30개의 뉴클레오티드로 이루어진다.

용어, "프로브(probe)"는 표적 서열에 상보적인 서열을 포함하는, 단일가닥 핵산 분자를 의미한다. 프로브는 혼성화 특이성이 손상되지 않는 범위 내에서 변형될 수 있다. 예를 들면, 리포터 형광물질 또는 소광물질(quencher)이 프로브의 말단에 부착될 수 있다.

상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되어 실시간 중합효소연쇄반응에서 사용할 수 있다.

상기 형광물질은 6-FAM(6-Carboxyfluorescein), VIC, TET(2',7'-dichloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), 6-JOE(6-carboxy-4',5'-dichloro-2',7'-dimethoxyfluorescein), HEX(2',4',5',7'-tetrachloro-6-carboxy-4,7-dichlorofluorescein), Cy3(Cyanine 3), 또는 Cy5일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 VIC는 비슷한 파장대의 JOE 또는 HEX에 비해 강도(intensity)가 약 2~3배 높으므로, 형광물질로 VIC를 사용하는 경우 검출 민감도가 더욱 우수할 수 있다.

상기 소광물질은 MGB-NFQ, 6-TAMRA(6-carboxytetramethylrhodamine), BHQ(Black Hole Quencher)-1, BHQ-2, BH3-3, 또는 ROX(carboxy-X-rhodamine)일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 MGB-NFQ는 MGB(Minor Groove Binder)와 NFQ(Non-Fluorescent Quencher)의 두가지 유닛으로 구성되어 있다. MGB는 프로브의 Tm(melting temperature)를 높여주고 주형과 프로브의 결합력을 향상시키는 역할을 할 수 있기 때문에, 길이가 짧으면서 특이도가 높은 프로브의 제작이 가능하다. 또한, TAMRA 또는 ROX가 배경 형광을 발생시키는 것과 달리, NFQ는 형광을 띠지 않기 때문에 배경 형광을 발생시키지 않는다는 장점이 있다.

상기 서열번호 3의 프로브는 RNF213 유전자의 돌연변이에 결합하는 돌연변이 검출용 프로브이다.

상기 서열번호 4의 프로브는 RNF213 유전자의 야생형에 결합하는 야생형 검출용 프로브이다.

상기 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브는 상이한 형광물질에 의해 표지될 수 있다. 야생형 검출용 프로브의 형광물질에 의한 신호와 돌연변이 검출용 프로브의 형광물질에 의한 신호가 구별되므로, 야생형 검출용 프로브의 신호가 양성이면 야생형, 돌연변이 검출용 프로브의 신호가 양성이면 돌연변이, 양자 모두의 신호가 양성이면 야생형과 돌연변이의 이형접합형인 것으로 판단할 수 있다.

상기 RNF213 유전자의 돌연변이는 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 검출된다.

상기 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물은 실시간 중합효소연쇄반응의 수행을 위해 필요한 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소, 및 완충 용액을 더 포함할 수 있다.

실시간 중합효소연쇄반응은 표적 핵산의 증폭과 측정을 동시에 진행한다. 중합효소연쇄반응에 의한 증폭 산물로부터 발생하는 형광의 강도를 실시간으로 측정하므로, 전통적인 중합효소연쇄반응에 비해 신속하게 민감하게 결과를 확인할 수 있다. 또한, 증폭 산물의 분석을 위한 전기영동이나 서열결정과 같은 추가적인 단계를 필요로 하지 않는다.

상기 실시간 중합효소연쇄반응은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 통상적인 조건에서 수행될 수 있고, 실시간 중합효소연쇄반응의 진행 중 어닐링 및 연장 단계에서 형광물질이 부착된 프로브로부터의 형광을 측정할 수 있다.

예시적으로, 상기 야생형 검출용 프로브는 5' 말단에 FAM으로 표지되고, 돌연변이 검출용 프로브는 VIC로 표지될 수 있다. 프로브가 표적 서열에 혼성화되면, 3' 말단에 존재하는 소광물질의 작용에 의해 5' 말단의 형광물질이 형광을 방출하지 못한다. 그러나, 중합효소연쇄반응의 연장 단계에서, Taq 중합효소와 같은 열안정성 DNA 중합효소의 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성에 의해 주형에 혼성화된 프로브가 분해되고, 5' 말단의 형광물질이 프로브로부터 분리되어 소광물질에 의한 형광억제로부터 벗어나서 형광을 방출한다. 따라서, FAM에 의한 형광 신호는 야생형 유전자형을 의미하고, VIC에 의한 형광 신호는 돌연변이 유전자형을 의미할 수 있다. 두 신호가 동시에 검출되는 경우는 야생형과 돌연변이가 접합된 이형접합형을 의미할 수 있다.

다른 양상은 상기 조성물을 포함하는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 키트를 제공한다.

구체적으로, 상기 키트는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 키트로서,

상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍이며,

상기 프로브는 서열번호 3 및 4의 프로브 쌍이며,

상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되며,

상기 프로브 쌍은 RNF213 유전자의 야생형에 결합하는 야생형 검출용 프로브와 RNF213 유전자의 돌연변이에 결합하는 돌연변이 검출용 프로브로 이루어진 것인 키트일 수 있다.

상기 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병은 예를 들어, 모야모야병, 뇌혈관 협착증, 뇌혈관 동맥경화증, 신장동맥 협착증, 폐동맥 혈관병증 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 키트는 실시간 중합효소연쇄반응 키트일 수 있다.

상기 키트는 실시간 중합효소연쇄반응의 수행을 위해 필요한 1종 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 키트는 dNTP 혼합물(dATP, dCTP, dGTP, dTTP), DNA 중합효소, 완충 용액 등을 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 키트는 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너 등을 더 포함할 수 있다.

다른 양상은 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,

검체로부터 분리된 DNA를 주형으로, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 및 서열번호 3 및 4의 프로브 쌍을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및

RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 부위의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하고,

상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되며,

상기 프로브 쌍은 RNF213 유전자의 야생형에 결합하는 야생형 검출용 프로브와 RNF213 유전자의 돌연변이에 결합하는 돌연변이 검출용 프로브로 이루어진 것인 방법을 제공한다.

상기 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병은 예를 들어, 모야모야병, 뇌혈관 협착증, 뇌혈관 동맥경화증, 신장동맥 협착증, 폐동맥 혈관병증 등일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

상기 RNF213 돌연변이 부위의 유전자형을 확인하는 단계에서 상기 RNF213 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 프로브 신호와 돌연변이 검출용 프로브 신호의 동시 검출은 상기 검체가 이형접합자(heterozygote)라는 것을 나타낼 수 있다.

상기 형광물질은 6-FAM, VIC, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, 또는 Cy5일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 소광물질은 MGB-NFQ, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BH3-3, 또는 ROX일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 검체로부터 분리된 DNA를 주형으로, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 및 서열번호 3 및 4의 프로브 쌍을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 "진단"은 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미한다. 따라서, 상기 "RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 진단"이란 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병의 위험을 예측하는 것을 의미할 수 있다.

상기 "검체"란 검사, 분석 등에 사용되는 생물이나 물질을 의미하는 것으로서, RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 발병 여부 또는 발병 가능성을 확인하거나 발병 위험도를 예측하거나 보인자 여부를 확인하고자 하는 개체로부터 분리한 시료일 수 있다. 상기 검체는 개체로부터 분리된 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨와 같은 시료 등을 포함할 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

실시간 중합효소연쇄반응은 본 발명이 속하는 기술분야에서 알려진 통상적인 조건에서 수행될 수 있다. 실시간 중합효소연쇄반응의 진행 중 어닐링 및 연장 단계에서 형광물질이 부착된 프로브로부터의 형광을 측정한다. 형광의 측정 및 분석은 실시간 중합효소연쇄반응에서 발생되는 형광을 분석하는 소프트웨어를 이용하여 용이하게 수행될 수 있다.

상기 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법은 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 부위의 유전자형을 확인하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 RNF213 돌연변이 부위의 유전자형을 확인하는 단계에서 실시간 중합효소연쇄반응은 각 RNF213 돌연변이 부위에 대해, 유전자형이 확인된 야생형 유전자 및 돌연변이형 유전자를 대조군으로 포함할 수 있다.

상기 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브는 상이한 형광물질에 의해 표지될 수 있다. RNF213 돌연변이 부위의 유전자형은 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브의 형광 신호 검출에 의해 판단된다. 야생형 검출용 프로브의 형광 신호만 검출되는 경우, 해당 검체는 그 돌연변이 부위에 돌연변이를 갖지 않는 야생형, 즉, 정상이라는 것을 의미하고, 돌연변이 검출용 프로브의 형광 신호만 검출되는 경우, 이는 그 돌연변이의 동형접합형의 존재 즉, 모야모야병 또는 관련 질환 환자일 가능성이 높다는 것을 의미하며, 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브의 형광 신호가 모두 검출되는 경우, 이는 야생형과 돌연변이 모두가 존재하는 이형접합형을 갖는다는 것을 의미한다.

일 양상에 따른 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물을 이용하면 일반적인 염기서열분석 기술에 비하여 간단하면서도 정확하게 상기 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 원인 돌연변이를 검출할 수 있다.

또한, 일 양상에 따른 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법을 이용하면 상기 질병의 원인 유전자에 대한 야생형, 돌연변이형 또는 이형접합형을 간편하게 확인할 수 있다.

도 1은 RNF213 유전자의 돌연변이 c.14429G>A를 검출하기 위한 프라이머 및 대립유전자 특이적 프로브 시스템의 작용 원리를 나타낸 도면이다.
도 2는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 검출용 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 이용하여 야생형 대조군에 대한 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 3은 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 검출용 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 이용하여 돌연변이형 대조군에 대한 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 4는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 검출용 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 이용하여 헤테로형 대조군에 대한 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 5는 정상인 105명에 대하여 실시간 PCR과 염기서열분석을 수행하여 결정된 RNF213 c.14429G>A 돌연변이 부위의 유전자형 분석 결과이다.
도 6은 정상인 105명에 대하여 실시간 PCR을 수행하여 4건의 이형접합성(heterozygosity)을 확인한 결과이다.
도 7은 정상인 105명 중 4명의 이형접합성 검체 즉, #16, #19, #23 및 #43에 대한 실시간 PCR 및 염기서열분석 결과이다.
도 8은 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F1 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 9는 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F2 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 10은 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F2 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 11은 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F3 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 12는 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F4 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 13은 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F5 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 14는 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F6 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 15는 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F6 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.
도 16은 구체적인 서열이 다른 다양한 조합의 프라이머 및 프로브를 사용하여 음성 검체에 대해 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1. RNF213 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브 제작

서열번호 5의 RNF213 유전자(NCBI accession number: NM_001256071)의 돌연변이는 모야모야병, 뇌혈관 협착증, 뇌혈관 동맥경화증, 신장동맥 협착증, 폐동맥 혈관병증 등을 유발하는 것으로 알려져 있다. 따라서, RNF213 유전자의 돌연변이 c.14429G>A(p.R4810K)를 검출하기 위해 이용할 수 있는 프라이머 및 프로브를 제작하였다.

RNF213 유전자의 서열을 바탕으로, Primer Expres 3.0.1을 이용하여 c.14429G>A 돌연변이 부위를 증폭시킬 수 있는 프라이머 쌍을 설계하였다. 또한, c.14429G>A 돌연변이 부위의 야생형과 돌연변이형에 완벽하게 결합하는 프로브를 제작하였다. 각 프로브의 5' 말단에는 형광물질을 표지하였고, 3' 말단에는 형광을 내지 못하도록 하는 소광물질(quencher)을 표지하였다. 이때 변이가 있는 유전자 단편과 결합하는 프로브는 형광물질로 VIC를 표지하였고, 변이가 없는 야생형 유전자 단편과 결합하는 프로브는 형광물질로 FAM을 표지하였다. 프라이머의 제작은 코스모진텍(한국)에 의뢰하였으며, 프로브의 제작은 Life Technologies(미국)에 의뢰하였다. 하기 표 1에 RNF213 c.14429G>A 돌연변이 부위를 증폭하는 프라이머 쌍, 및 야생형 및 돌연변이형을 검출하는 프로브를 나타내었다. 도 1은 RNF213 유전자의 돌연변이 c.14429G>A를 검출하기 위한 프라이머 및 대립유전자 특이적 프로브 시스템의 작용 원리를 나타낸 도면이다.

유형	서열번호	명칭	서열
정방향 프라이머	1	RNF_MGB F1	5' AGAACGTCCAGCAAGTTGAATACA 3'
역방향 프라이머	2	RNF_MGB R1	5' TTTCGAACCGCCAAATGC 3'
돌연변이형 검출용 프로브	3	RNF213(A) probe	(VIC)5'CTCCATCAAAGGCT 3'(MGB-NFQ)
야생형 검출용 프로브	4	RNF213(G) probe	(FAM)5'CTCCATCAGAGGC 3'(MGB-NFQ)

실시예2. 실시간 중합효소연쇄반응에 의한 RNF213 유전자 돌연변이의 검출

검체로부터 채취한 혈액 샘플로부터 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 게놈(genomic) DNA를 추출하였다. 실시간 PCR 반응에는 실시예 1에서 제조한 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 사용하였다. 표 2는 실시간 PCR 반응에 사용한 마스터 믹스처(master mixture)를 나타낸 것이다. 구체적으로, 상기 추출한 DNA 2 ㎕, 2x PCR reaction mixture(BioSewoom, Seoul, Korea) 12.5 ㎕, 프라이머(5 nM), 야생형 프로브(3nM)와 돌연변이형 프로브(3nM)를 포함하고, 핵산분해효소(nuclease)가 없는 증류수로 총 부피 25 ㎕로 맞춘 반응액에서 실시간 PCR 반응을 실시하였다. 표 3은 실시간 PCR 반응 조건을 나타낸 것이다. 구체적으로, PCR 반응은 50℃에서 2분. 95℃에서 10분; 95℃에서 15초, 60℃ 40초의 40 사이클의 조건으로 CFX96 실시간 PCR 장비(Bio-Rad)에서 수행하였다. 각 사이클마다 VIC와 FAM에 의한 형광을 측정하였다.

성분	용량(㎕)
2x PCR reaction mixture	12.5
프라이머 및 프로브 mixture	3
증류수	7.5
주형 DNA	2
총 부피	25

온도	시간	사이클	데이터 수집
50 ℃	2분	1 사이클
95 ℃	10분	1 사이클
95 ℃	15초	40 사이클
60 ℃	40초		형광 검출 (VIC, FAM)

실시간 PCR의 대조군은 표 1에 기재된 프라이머 조합을 이용한 중합효소연쇄반응과 서열결정에 의해 야생형 및 돌연변이형 유전자를 준비하여 이용하였다. 즉, 표 1에 의해 프라이머의 조합을 이용한 중합효소연쇄반응에 의해 수득된 산물을 플라스미드(plasmid) 벡터에 클로닝하고, 이를 대장균에 형질전환시켜 야생형 유전자를 대량으로 준비하고, 서열분석에 의해 염기서열을 확인하고, 야생형 유전자에 부위-특이적 돌연변이 유발 키트를 이용하여 돌연변이 유전자를 준비하고, 서열결정에 의해 확인한 후 이용하였다. 표 4는 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 부위의 유전자형을 결정하기 위한 키트의 구성요소를 나타낸 것이다.

키트 구성요소

2x PCR reaction mixture

프라이머 및 프로브mixture

양성 대조군 1 (야생형)

양성 대조군 2 (돌연변이형)

양성 대조군 3 (헤테로형)

증류수

FAM 염료에 양성을 나타내는 샘플은 야생형 유전자를 가진 샘플이고, VIC 염료에 양성을 나타내는 샘플은 돌연변이 유전자를 가진 샘플로 진단하였다. VIC와 FAM에 모두 양성을 나타내는 샘플은 야생형과 돌연변이 유전자를 모두 갖는 이형접합 돌연변이(hetero)로 진단하였다.

도 2는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 검출용 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 이용하여 야생형 대조군에 대한 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.

도 3은 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 검출용 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 이용하여 돌연변이형 대조군에 대한 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.

도 4는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 검출용 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 이용하여 헤테로형 대조군에 대한 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다.

도 2 내지 4에 나타낸 바와 같이, 표 1의 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 이용하여, RNF213 야생형, RNF213 돌연변이 동형접합성, 및 RNF213 돌연변이 이형접합성을 명확히 구별할 수 있음을 확인할 수 있었다.

실시예 3. 임상검체의 유전자형 분석

실시예 1에서 제작된 RNF213 유전자 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 사용하여 실제 임상검체를 대상으로 유전자 검사를 실시하였다.

먼저 모야모야병과 관련된 증상이 없으나 RNF213 유전자에 대한 돌연변이의 유무가 확인되지 않은 정상인 105명을 모집하였다. 정상인 105명으로부터 채취한 혈액 샘플로부터 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, Germany)를 사용하여 게놈(genomic) DNA를 추출하였다. 실시간 PCR 반응에는 실시예 1에서 제조한 프라이머 쌍 및 프로브 쌍을 사용하였다. 표 5는 실시간 PCR 반응에 사용한 마스터 믹스처(master mixture)를 나타낸 것이다. 구체적으로, 상기 추출한 DNA 5 ㎕, 2x PCR reaction mixture(BioSewoom, Seoul, Korea) 12.5 ㎕, 프라이머(5 nM), 야생형 프로브(3nM)와 돌연변이형 프로브(3nM)를 포함하고, 핵산분해효소(nuclease)가 없는 증류수로 총 부피 25 ㎕로 맞춘 반응액에서 실시간 PCR 반응을 실시하였다. 실시간 PCR 반응 조건은 실시예 2와 동일하게 하였다. 각 사이클마다 VIC와 FAM에 의한 형광을 측정하였다.

성분	용량(㎕)
2x PCR reaction mixture	12.5
프라이머 및 프로브 mixture	3
증류수	4.5
주형 DNA	5
총 부피	25

한편, 상기 실시간 PCR 결과가 정확한지 검증하기 위하여, 동일한 105명의 정상인에 대하여 염기서열분석검사를 실시하였다.

구체적으로, 정상인 105명으로부터 채취한 혈액샘플로부터 DNA를 추출하였다. DNA 추출 시에는 QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen, Germany)를 사용하였고 키트의 사용설명서에 따라 DNA를 추출하였다. 추출한 DNA 2 ㎕, 2x PCR mixture(BioSewoom, Seoul, Korea) 12.5 ㎕, 하기 표 6의 RNF213-CF 및 -CR 프라이머(10 nM)를 포함하고, 핵산분해효소(nuclease)가 없는 증류수로 총 부피 25 ㎕로 맞춘 반응액에서 PCR 반응을 실시하였다. PCR 반응은 95℃에서 10분; 95℃에서 30초, 60℃ 30초, 72℃에서 30초의 45 사이클; 72℃에서 5분의 조건으로 AB 2720 PCR 장비(Applied Biosystems)에서 수행하였다. 반응이 끝난 후, PCR 산물은 1.5% 아가로즈 겔 상에서 전기영동을 실시하였으며, UV 분광광도계(Thermo Scientific, USA)에서 PCR 산물을 확인하였다. 이후, 증폭된 PCR 산물에 엑소뉴클레아제 I(20 U/㎕, NEB, UK) 0.2 ㎕, Shrimp alkaline phosphatase(1 U/㎕,NEB, UK) 0.8ul, 10X Exo 버퍼(NEB, UK) 그리고 핵산분해효소(nuclease)가 없는 증류수 4.25 ㎕를 첨가 후, 37℃에서 30분, 85℃ 15분 처리하여 정제하였다.

정제된 PCR 산물에 40 ㎕의 핵산분해효소(nuclease)가 없는 증류수를 첨가한 반응물 1~2.5 ㎕, 하기 표 6의 RNF213-CR 염기서열분석 프라이머 2 nM, 5X 염기서열분석 버퍼(Applied Biosystems, USA) 3.2 ㎕, BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing RR-100(Applied Biosystems, USA) 0.8 ㎕를 포함하고 핵산분해효소(nuclease)가 없는 증류수로 총 부피 10 ㎕로 맞추어 염기서열분석 반응을 실시하였다. 염기서열분석 반응은 96℃에서 1분; 96℃에서 10초, 50℃ 5초, 60℃에서 4분의 25 사이클의 조건으로 AB 2720 PCR 장비(Applied Biosystems)에서 시행하였다. 반응이 끝난 후, Magbesil®GREEN(Promega, USA)의 사용법에 따라 정제를 진행한 다음, 진공 농축기(vacuum concentrator)를 이용하여 정제된 DNA를 완전히 건조시킨 후, 용출 버퍼(Elution Buffer) 30 ㎕를 첨가하여 완전히 용해시켰다. 이 중 15 ㎕를 염기서열분석 플레이트에 분주하여 3730xl DNA 분석기(Applied biosystems, USA)로 반응을 진행하고, Sequencing Analysis 5.1.1 소프트웨어(Applied biosystems, USA)를 사용하여 염기서열 분석을 실시하였다. 분석된 염기서열 정보에서 RNF213 p.R4810K (c.14429G>A) 변이 여부를 확인하였다.

서열번호	명칭	서열	증폭산물 크기(bp)
6	RNF213-CF primer	5' actgggtggtcttcccttct 3' (정방향)	388 bp
7	RNF213-CR primer	5' gaaggagtgagccgagtttg 3' (역방향)

도 5는 정상인 105명에 대하여 실시간 PCR과 염기서열분석을 수행하여 결정된 RNF213 c.14429G>A 돌연변이 부위의 유전자형 분석 결과이다.

도 6은 정상인 105명에 대하여 실시간 PCR을 수행하여 4건의 이형접합성(heterozygosity)을 확인한 결과이다.

도 7은 정상인 105명 중 4명의 이형접합성 검체 즉, #16, #19, #23 및 #43에 대한 실시간 PCR 및 염기서열분석 결과이다.

도 5 내지 7에 나타낸 바와 같이, 실시간 PCR에 의해 확인된 유전자형과 염기서열분석에 의한 유전자형의 결과가 일치하는 것을 확인하였다. 즉, RNF213 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는 진단용 조성물을 사용하여 돌연변이 보인자들의 각 돌연변이를 100% 정확하게 검출할 수 있었다.

비교예 1. 프라이머 및 프로브의 서열에 따른 RNF213 돌연변이 검출 특이성의 확인

RNF213 c.14429G>A 돌연변이 부위를 검출할 수 있는 다양한 종류의 프라이머 및 프로브를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 후, 검출 특이성을 확인하는 실험을 하였다.

구체적으로, 하기 표 7에 기재된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 돌연변이형 검출용 프로브를 다양한 조합으로 사용하여 실시예 2와 동일한 방법으로 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다. 실험에 사용한 정방향 프라이머, 역방향 프라이머 및 돌연변이형 검출용 프로브의 조합은 다음과 같다:

(1) F1 primer, R1 primer, 및 ZEN probe

(2) F2 primer, R1 primer, 및 ZEN probe

(3) F3 primer, R1 primer, 및 ZEN probe

(4) F4 primer, R1 primer, 및 ZEN probe

(5) F5 primer, R1 primer, 및 ZEN probe

(6) F6 primer, R1 primer, 및 ZEN probe

유형	서열번호	명칭	서열
정방향 프라이머	8	F1 primer	5'-AGCAAGTTGAATACAGCTCCATTAA-3'
정방향 프라이머	9	F2 primer	5'-AGCAAGTTGAATACAGCTCCATTAAA-3'
정방향 프라이머	10	F3 primer	5'-GCAAGTTGAATACAGCTCCATGAA-3'
정방향 프라이머	11	F4 primer	5'-CAAGTTGAATACAGCTCCAACAA-3'
정방향 프라이머	12	F5 primer	5'-CAAGTTGAATACAGCTCCACCAA-3'
정방향 프라이머	13	F6 primer	5'-CAAGTTGAATACAGCTCCAGCAA-3'
역방향 프라이머	14	R1 primer	5'-CCCTATGCAGTGATCCTTTCG-3'
돌연변이형 검출용 프로브	15	ZEN probe	5'-/6-FAM/ACCAGGACT/ZEN/GTCCCGCATTTGGC/IABkFQ/-3'

도 8은 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F1 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 야생형에서도 증폭 신호가 관찰되었고, 주형을 넣지 않은 NTC(Non-template control)에 대해서도 증폭 신호가 관찰되었으므로, 상기 프라이머 및 프로브 조합은 비특이적 증폭에 의해 돌연변이에 대한 검출 특이성이 낮은 것으로 판단되었다.

도 9 및 10은 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F2 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다. 도 9 및 10에 나타낸 바와 같이, 야생형에서도 증폭 신호가 관찰되었고, 염기서열분석검사로 RNF213 c.14429G>A 돌연변이 음성으로 확인된 음성검체에 대해서도 증폭 신호가 관찰되었으므로, 상기 프라이머 및 프로브 조합은 비특이적 증폭에 의해 돌연변이에 대한 검출 특이성이 낮은 것으로 판단되었다.

도 11은 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F3 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다. 도 11에 나타낸 바와 같이, 야생형에서도 증폭 신호가 관찰되었고, 주형을 넣지 않은 NTC에 대해서도 증폭 신호가 관찰되었으므로, 상기 프라이머 및 프로브 조합은 비특이적 증폭에 의해 돌연변이에 대한 검출 특이성이 낮은 것으로 판단되었다.

도 12는 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F4 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다. 도 12에 나타낸 바와 같이, 야생형에서도 증폭 신호가 관찰되었으므로, 상기 프라이머 및 프로브 조합은 비특이적 증폭에 의해 돌연변이에 대한 검출 특이성이 낮은 것으로 판단되었다.

도 13은 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F5 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다. 도 13에 나타낸 바와 같이, 야생형에서도 증폭 신호가 관찰되었고, 주형을 넣지 않은 NTC에 대해서도 증폭 신호가 관찰되었으므로, 상기 프라이머 및 프로브 조합은 비특이적 증폭에 의해 돌연변이에 대한 검출 특이성이 낮은 것으로 판단되었다.

도 14 및 15는 RNF213 c.14429G>A 돌연변이를 검출하기 위한 F6 primer, R1 프라이머 및 ZEN probe를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다. 도 14 및 15에 나타낸 바와 같이, 야생형에서도 증폭 신호가 관찰되었고, 염기서열분석검사로 RNF213 c.14429G>A 돌연변이 음성으로 확인된 음성검체에 대해서도 증폭 신호가 관찰되었으므로, 상기 프라이머 및 프로브 조합은 비특이적 증폭에 의해 돌연변이에 대한 검출 특이성이 낮은 것으로 판단되었다.

상기와 같이 구체적인 서열이 다른 다양한 조합의 프라이머 및 프로브를 사용하였을 때 검출 특이성이 낮은 것과 달리, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브는 검출 특이성이 매우 높으므로 RNF213 c.14429G>A 돌연변이 부위의 유전자형을 분석하기에 가장 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.

비교예 2. 프라이머 및 프로브의 서열에 따른 RNF213 야생형 또는 돌연변이형 검출 특이성의 확인

RNF213 c.14429G>A 돌연변이 부위의 유전자형을 분석할 수 있는 다양한 종류의 프라이머 및 프로브를 이용하여 음성 검체에서 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 후, 각각의 야생형 검출용 프로브 또는 돌연변이형 검출용 프로브에 의해 비특이적 증폭이 발생하는지 확인하는 실험을 하였다.

구체적으로, 하기 표 8에 기재된 정방향 프라이머, 역방향 프라이머, 돌연변이형 검출용 프로브 및 야생형 검출용 프로브를 다양한 조합으로 사용하여 염기서열분석검사로 RNF213 c.14429G>A 돌연변이 음성으로 확인된 검체 DNA에 대해 실시예 2와 동일한 방법으로 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하였다.

유형	서열번호	명칭	서열
정방향 프라이머	16	RNF213_Zen F1 primer	5’CAGTTCCAGAACGTCCAGCAA 3’
정방향 프라이머	17	RNF213_Zen F2 primer	5’ GTTCCAGAACGTCCAGCAA 3’
역방향 프라이머	18	RNF213_Zen R1 primer	5’TTTCGAACCGCCAAATGC 3’
돌연변이형 검출용 프로브	19	RNF213(ZEN-A1) probe	(FAM) 5’AATACAGCTCCATCAAAGGCTTCCTCA 3’ (IABkFQ)
돌연변이형 검출용 프로브	20	RNF213(ZEN-A2) probe	(FAM) 5’CAGCTCCATCAAAGGCTTCCTCA 3’ (IABkFQ)
야생형 검출용 프로브	21	RNF213(ZEN-G1) probe	(HEX) 5’TTGAATACAGCTCCATCAGAGGCTTCC 3’ (IABkFQ)
야생형 검출용 프로브	22	RNF213(ZEN-G2) probe	(HEX) 5’CAGCTCCATCAGAGGCTTCC 3’ (IABkFQ)

도 16은 구체적인 서열이 다른 다양한 조합의 프라이머 및 프로브를 사용하여 음성 검체에 대해 실시간 중합효소연쇄반응을 수행한 결과이다. 도 16에 나타낸 바와 같이, 음성검체에 대해서도 증폭 신호가 관찰되었으므로, 상기 프라이머 및 프로브 조합은 비특이적 증폭에 의해 야생형 또는 돌연변이에 대한 검출 특이성이 낮은 것으로 판단되었다.

이와 달리, 실시예 1에서 제조한 프라이머 및 프로브는 검출 특이성이 매우 높으므로 RNF213 c.14429G>A 돌연변이 부위의 유전자형을 분석하기에 가장 적합하다는 것을 확인할 수 있었다.

<110> Samsung Life Public Welfare Foundation BIOSEWOOM, INC. <120> Composition for diagnosing diseases caused by mutation of RNF213 gene using Real-Time PCR, and use thereof <130> PN115412KR <160> 22 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF-MGB F1 primer <400> 1 agaacgtcca gcaagttgaa taca 24 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF-MGB R1 primer <400> 2 tttcgaaccg ccaaatgc 18 <210> 3 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213(A) probe <400> 3 ctccatcaaa ggct 14 <210> 4 <211> 13 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213(G) probe <400> 4 ctccatcaga ggc 13 <210> 5 <211> 21062 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 ggggcgacag cgcgcggcag gcggcgagct cgggggccgc agaaaatgaa actgaagccg 60 tggtcacgtg acaggacatg tagtatatag caggctgcca gcgactcctg ctcttgcttc 120 tggatctgca gggcagtccc agcaggaccc atggagtgtc cttcgtgcca gcatgtctcc 180 aaggaggaaa cccccaagtt ctgcagccag tgcggagaga ggctgcctcc 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cactgcccac 16140 ccctcttttt ttttttcttc taattctgta ctcacaaaag agaatctcat tttcttcttt 16200 cttccattcc cttaaattct gagtactgta catatatttc tgggttccca cgatgatgtg 16260 aaaaactacc agactgtttt ttgtcttctc acaaagacaa gaaaaatcag ggcattttgt 16320 gagtgcctta agatcaaact aacaagatct gaccctctcc cctcacagtg agccactgcc 16380 ccacttcaga gggtaagagc caaaagcctc attgtgaaag gcactggact tggaccaggg 16440 acaccatcag ggccttggtt ttctcacgca taaaatggag agtggattaa tcgccaaaga 16500 ttcttctgat ctgacatttt gaaattgtga gagaaactag atgactgtaa acttggtcac 16560 aggcctggtt ctggcagttc tttgcggact tttttctagc attatgccaa ataaacatgc 16620 agtctcagtg tgctctcgca tgtatgaata tctagtcctt tctgtggttc tcagccaaga 16680 cataaaaact aggactcaga gcacatacaa aaccagttat gtttcggaaa gagggaaaag 16740 agtccccgag cccggatctt gtgctgcttt tctcactgac gtgttgcctt ttttctttac 16800 aaaatctgct ttgatactta ggacctctct ggactaattt ctcttcctag acagctcagc 16860 acagctattg atatgttaga ggcagtatcc ttaatattca ttctaaatga gttaacgact 16920 taacttgaaa ttgggcctaa ggagtgagaa ctacaaaaat acaaaatgct tgtccaggac 16980 tcagccatgc acaccttgag cagcgccggc aggaggcacg gaaggaactg tgctccgttc 17040 tcctcactgt catggtgcca ccagtgtctg atgaagggca gagtgaccca gactgcaggc 17100 agtaactgac ttcacacagt ccctggcatt tagtcatctg tgattgtttt atcactctgg 17160 actgtgcaga gccacctgcc accgagatct gcattccgac tgcctatgaa cgggtgtggg 17220 ggccgggggc tggcttgctg aagtcttcaa cttgcactcg gagctccttt gatacctcag 17280 agctggctgt caggtggcag ctcacaccca gactcactgg ccacacctca gcaggggggg 17340 agtcgagtgt cagtctcttt ctgtgaaggc tttttttttc ctttggcctg ggaatttttc 17400 ccatttttat gaaggggttt taaattgttt cattttgtgt gctgtgcttc aaagccttaa 17460 ctgtcaaatc ttgcattatc ttgtttgtac agaaatatac tggcctagca gaggcaaaaa 17520 aaaaaaaaat gaattttatt ttacttgtca cacctgtctt aataaactgg agttttgctg 17580 ctaaagaact cttctctctg ggggcagagc ttctatttat ggcacataga catcagctag 17640 gcttttggga atcgtttgtg ttctttgtgg aaatgtcctt tagaagcacc catgaagtag 17700 tgtgttcaga ctgtgcacac agaaaacagg ctctgccttc acatgtgaga cggtggactt 17760 ttcctctgga caaaatgaca gcatcctggc gactccacag tggagctgag cgccactccc 17820 tgtagccgat ctgggactga aacgcttaca cctctgcctc agaaggagtc ccccatgccc 17880 tgcctgaaat gacttcactg gacacagcgg ggctgcagct aacggggtac aggtaggagc 17940 taactaactt cacccctgag tccacttgcg gggtaagaga taaacagtaa cccttccagg 18000 agcccactga cgttggagtg ctaaaaatgc cccttcaggg ggaaaactgc attttctctt 18060 ccaaaaagga aaggttcttc caggcgagaa acctgtggtc tagaaccaca gcaagaagag 18120 gaggcatgct ggcctgcacc ggaagactca ctttgtctgc cctgcgccag cctcacctca 18180 ccctgcagtt cccgtttccg ccatggatgc ctcatcacca accctgacct tccccctccc 18240 aaccctttat tcatcctcac tcccactcat acccgcctcc ctggacagtt ccctgctgca 18300 gagttctttc tgctttcagc cctaccttgg tggtgattta cctgaaaatc ttcacaactg 18360 atcattatct ccttctcttt gagacctgac tgaaaaaatt aggtgtgcac acctgtaatc 18420 ccagctacct gggaggctga ggtatgagga ttgcttgagc ctgggagttt gaggctgcag 18480 tgagctatga ttgcaccact gcactccaac ctgggtgaca gagtgagacc ctgtctcaaa 18540 aaaaaataaa ataaggacct tattgtgtgt gcaaattatt tgcctttcat gaatagttat 18600 gagactttgt gcatgtgtta accgagacgg ccctgagcta tttcagttac tcctgtatgt 18660 tcaggcaatt ccaatttaga aacaaacttc cagtgataaa tattgggaag aaaatgtcag 18720 ctcagggcca agtaggtaaa gccacccaag tctagccatg cacacaggca ctagtgtgct 18780 gaaggaaaac acctctgatt tgatacataa agtgtgaagg ttgcataact ggggaggtgg 18840 ctggagaaaa cctgagcctc gagctgagta acaatccaag ccatgattag catttatatt 18900 gcattctgca ttattctcat cctatcacgt tcattaagtt caaccattac cattacgaat 18960 cccgtttcca gctggaaaaa caagcgccag gaaagtgcat ttccccccca cccccccccc 19020 ccaaccagag caactttggt cagaagtcac acctaatcac cctctctgca ggatatgctg 19080 gggatagccc ttttgaggag gtgggggtgt atgcgaaagc aacctggggc caaagcaggg 19140 ggaagcagga gagactggag gggccctggg tccagcaagt gctccaccag gctgcccctg 19200 ctcaggtgct ccacagccca taaaaaacgc cttcagccct gctgtgcttc ccctcacacc 19260 taaacttact ataagggtcc taccttcccc agtattcctt catgatcact gctacctgtg 19320 ccctgaagcg caacagaacc tcaacccaga ggacagccac ttcctcagaa cccacgatct 19380 ttgccccatc gccacaggtc catgagtgac tcctaattac caaatccaag ggctccttca 19440 ccctgaccac tctggaaccc aacaaagctg acacacagcc cagcccagac aggcctgaat 19500 gtgggtcctg gctctcccat ttgccagttc tacagccatg ggcaagtggc tcgacctctc 19560 taagcttcag tttcctcgtc tgtgaaatat ctgtcagtgc tcttaaggga ggagaccacc 19620 ccacatattg tcttacgccc aatttctgcc tccaaagaga gaagtaaaaa ctaaaaggca 19680 gaaatgaaat ccacaagcag acagcctgca ccacaccctg ggcctggtag ttaaagatcg 19740 acgcctgacc taatcagtga tgctatctat agattacaga cattatatag aaaagcaccg 19800 tgaaaatccc tgtcctgttc tgttccgttc taattacggg tgcatgcagc ccccagtcac 19860 gtaccccctg cttgctcaat caatcacgac cctctcacgc agacccctta agagttgtga 19920 gcccttaaaa gggacaggaa ttgctcactc ggggagctca gttgttggag acatgagtct 19980 tgccgaagcg cccggctgaa taaagccctt ctttaactcg tgtctgaggg gttttctctg 20040 cagcttgtcc tgctacattt cttggttccc tgaccaggaa tctaggtgat taatggatgg 20100 ttgaggcagc ccctcagacg gcttaggcct gccctgtgga gcatccctgt ggaggactcc 20160 agccagcttg agcgacatgg atcctgagag cgctctcagg caggcaattg ccccagtgga 20220 atgcctggcc agagcagtgt gtagcaggcc cccgaggagg atcaacgcag tggctgaaca 20280 ccgggaagga actgccactt ggagtccaga catctgaaac ttggtaagac tggtctttgg 20340 aacttgccca ctccatttga ggggaagcgt ggcctgatca cccacggcgt gcctgtactg 20400 gcactctggt ttttgttttt gacttgactt ggattgcttg atactttggt tttggttttg 20460 acctgacttg gatatcctga tactctgatt ttggttttga ttttggtttg gtgtaaactg 20520 taaaagtgtg tgtgtgccct ttttacctgt tctttgtttt gtggtatgcg tgtagggtga 20580 gcgtaatgtt ttgtcttgaa gaagcatggg tcaagcacaa agtaagacca ccccactagg 20640 aactatgctg aaaaatttca ggaaaggatt taagggagac tatggagtac tatgacacca 20700 ggaaaactta aaactttgtg taagatagac tggccagcat tagaggtagg ttggccatca 20760 gagtgaagcc tggacaggtc ccttgtttca aaggtatggc acaaggtaac ctgtaagcca 20820 gggtacccac accagttccc gtacacagac acttggttac agctggtttt agactcccca 20880 cccgcccgcc ccaacagtgg ttgagagaac agcagcataa gtggctggca gaggcaagga 20940 aagaccagca gagagagaaa gaggaagaga cagacaaaga gggagtcaga gagagagaga 21000 gaaagagaca gaggcaaaag gaaagtcaaa gagaaagaga cagaaaatca agaggaaaaa 21060 aa 21062 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213-CF primer <400> 6 actgggtggt cttcccttct 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213-CR primer <400> 7 gaaggagtga gccgagtttg 20 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F1 primer <400> 8 agcaagttga atacagctcc attaa 25 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F2 primer <400> 9 agcaagttga atacagctcc attaaa 26 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F3 primer <400> 10 gcaagttgaa tacagctcca tgaa 24 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F4 primer <400> 11 caagttgaat acagctccaa caa 23 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F5 primer <400> 12 caagttgaat acagctccac caa 23 <210> 13 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> F6 primer <400> 13 caagttgaat acagctccag caa 23 <210> 14 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> R1 primer <400> 14 ccctatgcag tgatcctttc g 21 <210> 15 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ZEN probe <400> 15 accaggactg tcccgcattt ggc 23 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213_Zen F1 primer <400> 16 cagttccaga acgtccagca a 21 <210> 17 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213_Zen F2 primer <400> 17 gttccagaac gtccagcaa 19 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213_Zen R1 primer <400> 18 tttcgaaccg ccaaatgc 18 <210> 19 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213(ZEN-A1) probe <400> 19 aatacagctc catcaaaggc ttcctca 27 <210> 20 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213(ZEN-A2) probe <400> 20 cagctccatc aaaggcttcc tca 23 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213(ZEN-G1) probe <400> 21 ttgaatacag ctccatcaga ggcttcc 27 <210> 22 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNF213(ZEN-G2) probe <400> 22 cagctccatc agaggcttcc 20

Claims (14)

1. RNF213(Ring finger protein 213) 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 검출용 프라이머 및 프로브를 포함하는, RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물로서,
   상기 프라이머는 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍이며,
   상기 프로브는 서열번호 3 및 4의 프로브 쌍이며,
   상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되며,
   상기 프로브 쌍은 RNF213 유전자의 야생형에 결합하는 야생형 검출용 프로브와 RNF213 유전자의 돌연변이에 결합하는 돌연변이 검출용 프로브로 이루어진 것인 조성물.
2. 청구항 1에 있어서, 상기 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병은 모야모야병, 뇌혈관 협착증, 뇌혈관 동맥경화증, 신장동맥 협착증 또는 폐동맥 혈관병증인 것인 조성물.
3. 청구항 1에 있어서, 상기 형광물질은 6-FAM, VIC, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, 또는 Cy5인 것인 조성물.
4. 청구항 1에 있어서, 상기 소광물질은 MGB-NFQ, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BH3-3, 또는 ROX인 것인 조성물.
5. 청구항 1에 있어서, 상기 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브는 상이한 형광물질에 의해 표지되는 것인 조성물.
6. 청구항 1에 있어서, 상기 RNF213 유전자의 돌연변이는 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 검출되는 것인 조성물.
7. 청구항 1 내지 6 중 어느 하나의 조성물을 포함하는 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 키트.
8. 청구항 7에 있어서, 상기 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병은 모야모야병, 뇌혈관 협착증, 뇌혈관 동맥경화증, 신장동맥 협착증 또는 폐동맥 혈관병증인 것인 키트.
9. 실시간 중합효소연쇄반응에 의해 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병의 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법으로서,
   검체로부터 분리된 DNA를 주형으로, 서열번호 1 및 2의 프라이머 쌍, 및 서열번호 3 및 4의 프로브 쌍을 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 수행하는 단계; 및
   RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이 부위의 유전자형을 확인하는 단계를 포함하고,
   상기 프로브는 5'-말단에 형광물질로 표지되고, 3'-말단에 소광물질로 표지되며,
   상기 프로브 쌍은 RNF213 유전자의 야생형에 결합하는 야생형 검출용 프로브와 RNF213 유전자의 돌연변이에 결합하는 돌연변이 검출용 프로브로 이루어진 것인 방법.
10. 청구항 9에 있어서, 상기 RNF213 유전자의 c.14429G>A 돌연변이를 원인으로 하는 질병은 모야모야병, 뇌혈관 협착증, 뇌혈관 동맥경화증, 신장동맥 협착증 또는 폐동맥 혈관병증인 것인 방법.
11. 청구항 9에 있어서, 상기 RNF213 돌연변이 부위의 유전자형을 확인하는 단계에서 상기 RNF213 돌연변이 부위에 대한 야생형 검출용 프로브 신호와 돌연변이 검출용 프로브 신호의 동시 검출은 상기 검체가 이형접합자라는 것을 나타내는 것인 방법.
12. 청구항 9에 있어서, 상기 형광물질은 6-FAM, VIC, TET, 6-JOE, HEX, Cy3, 또는 Cy5인 것인 방법.
13. 청구항 9에 있어서, 상기 소광물질은 MGB-NFQ, 6-TAMRA, BHQ-1, BHQ-2, BH3-3, 또는 ROX인 것인 방법.
14. 청구항 9에 있어서, 상기 야생형 검출용 프로브와 돌연변이 검출용 프로브는 상이한 형광물질에 의해 표지되는 것인 방법.

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