KR101754076B1 - 리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 ｈｌａ-ｄｒｂ１ 및 ｈｌａ-ｄｒｂ３/４/５ 유전자형 분석 방법 및 키트 - Google Patents

리얼타임 ｐｃｒ을 이용한 ｈｌａ-ｄｒｂ１ 및 ｈｌａ-ｄｒｂ３/４/５ 유전자형 분석 방법 및 키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 일대일 대응방식의 프라이머 및 프로브의 각 조합을 제공할 수 있어 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석이 간편하고 명확하여, 종래의 방법에 비해 다량의 시료에 대한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 짧은 시간 내에 간단하고 정확하게 수행할 수 있어 법과학 수사에서의 개인식별 및/또는 수술시 조직이식적합 여부를 유전학적 수준에서 효과적으로 판단할 수 있는 새로운 리얼타임 PCR 분석 방법 및 키트를 제공한다. 본 발명에 따르면, 리얼타임 PCR을 이용하여 분석 대상이 되는 시료로부터 HLA-DRB1 뿐만아니라 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 수행할 수 있고, 이에 따라 법과학 수사의 개인식별이나 수술시 조직이식적합 여부 판단에 있어 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 신뢰도 높고 효율적으로 수행할 수 있다. 특히, 본 발명에 따르면, 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 복잡한 분석표의 비교 과정 없이 바로 간편하고 명확하게 수행할 수 있어, 다량의 시료에 대한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 유전학적 수준에서 효과적으로 수행할 수 있다.

Description

리얼타임 ＰＣＲ을 이용한 ＨＬＡ-ＤＲＢ１ 및 ＨＬＡ-ＤＲＢ３/４/５ 유전자형 분석 방법 및 키트{Method and kit for genotyping HLA-DRB1 and HLA-DRB3/4/5 using real-time PCR}
본 발명은 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형을 분석하는 방법 및 키트에 관한 것으로서, 분석 대상이 되는 시료에서 HLA-DRB1 대립형질에 관한 정보 뿐만아니라 하나의 유전자 단위에서 HLA-DRB1과 연관되어 있는 HLA-DRB3, HLA-DRB4 및/또는 HLA-DRB5에 관한 추가적인 유전 정보를 제공하여 보다 정확한 개인식별 및/또는 수술시 조직이식적합 여부를 판정할 수 있는 새로운 리얼타임 PCR 분석 방법 및 키트에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 분석 대상이 되는 시료로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 수행할 수 있고, 종래의 방법에 비해 다량의 시료에 대한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 짧은 시간 내에 간단하고 정확하게 수행할 수 있어 법과학 수사에서의 개인식별 및/또는 수술시 조직이식적합 여부를 유전학적 수준에서 효과적으로 판단할 수 있는 새로운 리얼타임 PCR 분석 방법 및 키트에 관한 것이다.
특히, 본 발명은 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 일대일 대응방식의 프라이머 및 프로브의 각 조합을 제공할 수 있어 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석이 간편하고 명확하여, 종래의 분석방법에서 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 바로 HLA-DRB1 대립유전자를 판정할 수 없고 복잡한 대립유전자 조합들의 분석표에 기초하여 복잡하게 판정하여야 하는 불편과 분석 결과의 모호성을 획기적으로 해결할 수 있는 기술의 제공에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석에 사용되는 양성 표준자(positive standard 또는 positive control)로서 변이가 적은 HLA-DRA 유전자를 선정하여 사용함으로써 리얼타임 PCR 실험과정의 무결성 확인 및 정량 분석을 가능하게 하고, 새우흰점바이러스 VP28 유전자의 증폭유무를 이용하여 분석 대상 시료 내에 리얼타임 PCR 저해제의 존재 유무 및 리얼타임 PCR 반응 조성액의 무결성을 확인할 수 있는 새로운 리얼타임 PCR 분석 방법 및 키트에 관한 것이다.
주 조직적합성 항원(Major Histocompatibility Antigen, MHC)은 동종 또는 이종 간의 이식 시 면역거부 반응에 주요한 역할을 수행한다. 또한, 인간 주 조직적합성 항원인 HLA(Human Leukocyte Antigen)의 유전자는 인간 유전자 중 가장 변이가 다양하여 각 개인을 유전자 수준에서 분석하여 식별할 때 유용하게 이용될 수 있다.
HLA 항원의 특징으로는 다형성을 들 수 있는데, 다형성은 특정 펩티드에 대한 면역반응의 개체차이 형성으로 자기면역질환에 대한 감수성의 개체차를 결정하거나, 장기이식에서 거부반응을 유도하므로 이를 검출하는 HLA 타이핑은 매우 중요하다. HLA 항원을 코딩하는 HLA 유전자는 염색체 6번 단완에 위치하여 면역과 관련된 유전자들과 인접하게 존재한다. 이중 HLA-DR 유전자가 코딩하는 HLA-DR 항원은 MHC 클래스 II 항원으로 알파-서브유닛(alpha subunit)과 베타-서브유닛(beta subunit)으로 구성된다(도 1 참조). 알파-서브유닛은 HLA-DRA에 의해, 그리고 베타-서브유닛은 DRB1, DRB3, DRB4, DRB5로 구성되어 있다. 그 밖에도 DRB2, 6, 7, 8, 9가 존재하지만 기능을 하지 않는 위유전자(pseudogene)이다. 또한, HLA-DRB1 유전자는 모든 사람에게 존재하지만 HLA-DRB3, 4, 5는 존재할 수도 있고 존재하지 않을 수도 있다.
HLA-DR 유전자는 도 2에 도시된 바와 같이 서로 연관(linkage)되어 존재할 수 있다. 예를 들어 HLA-DRB5 유전자를 가지는 사람은 HLA-DRB1*15, *16을 가질 수 있으며, HLA-DRB4 유전자를 가지는 사람은 HLA-DRB1*04, *07, *09를 가질 수 있다(도 2 및 도 3 참조). 이러한 일배체형(Haplotype)은 서로 다른 유전자가 가깝게 위치할 경우 다음 세대로 유전될 때 교차반응에 영향을 받지 않고 하나의 유전자군으로 유전되는 현상으로 발생할 수 있다. 이러한 일배체형(haplotype)은 법과학 분석에 있어서 서로 다른 사람의 DNA가 혼합되어 있는 시료의 경우 개인식별을 위한 특유의 유전형으로 예측할 수 있어 하나의 유전자 단위에서 추가적인 유전적인 정보를 제공할 수 있는 장점이 있다. 이러한 일배체형은 HLA-DR 유전자 내에서 뿐만 아니라 HLA-A, HLA-B, HLA-C도 함께 적용될 수 있다.
또한, HLA 유전자는 매우 높은 다형성을 가지기 때문에 일반적인 상염색체 내 존재하는 단일염기다형성 마커보다 더 많은 유전정보를 제공할 수 있다. 하나의 단일염기다형성 마커가 3가지의 유전적인 정보를 제공하는 반면, HLA 유전자는 다양한 대립형질 정보를 제공하여 더 높은 개인식별력을 제공할 수 있다. HLA-DRB1 유전자의 경우 낮은 해상도 수준에서 *01, *03, *04, *07, *08, *09, *10, *11, *12, *13, *14 등의 대립형질이 존재하고 한 사람이 2개까지의 대립형질을 보유할 수 있어 다양한 조합으로 대립형질이 존재할 수 있다. 또한, HLA-DRB3, 4, 5 유전자를 포함할 경우 더 많은 유전적인 정보를 제공할 수 있어 개인식별 마커 및/또는 수술시 조직이식적합 마커로서 매우 유용하게 이용될 수 있다.
뿐만 아니라, HLA-DR 유전자는 다양한 질병과 연관성이 높은 것으로 알려져 있다. 대표적으로 관절염(arthritis), 류머티즘(rheumatoid), 당뇨병(diabetes) 등이 있으며, 특정약물에 대한 과민증을 특정 HLA 대립형질을 가지는 사람의 경우 일으킬 수 있어 일부 약물을 처방하기 전에는 이러한 HLA 유전형의 존재 유무를 확인하는 것을 권고하고 있다.
한편, 분자 생물학의 발달로 HLA 항원을 지배하는 대립 유전자의 염기 서열이 자세히 밝혀짐에 따라 염기서열의 차이로써 HLA 유전자형의 다양성을 확인하는 HLA 유전자 분석이 가능해 졌고, 이를 통해 HLA 유전자형 분석에 의해 개인식별과 수술시 조직이식적합 여부 판단을 할 수 있는 다양한 방법론적 방안이 제시되고 있다.
특히 PCR 방법의 도입으로 HLA의 DNA 타이핑 분야는 급진적으로 발전하였고 HLA 항원의 거의 모든 다형성이 DNA 수준에서 밝혀지고 있으나, HLA 유전자를 분석하기 위해 사용되고 있는 종래의 PCR 방법, 파이로시퀀싱, 직접적인 염기서열 결정법 등은 HLA-A, -B, -Cw, -DRB1을 동시에 타이핑 하기에는 많은 시간과 노동력이 요구되며 특히 대량의 검체를 분석하기에는 부적합하다는 문제가 있었다. 따라서, 최근에는 미세한 크기의 슬라이드글라스나 실리콘 등의 기판 위에 아주 적은 양의 DNA를 고밀도로 붙일 수 있고, 동시에 많은 수를 검색할 수 있는 DNA 칩 기술을 통해 유전자 발현분석, 유전자 진단, 유전자의 돌연변이 검색 등을 수행할 수 있게 되었는데, HLA 타이핑에도 이러한 DNA 칩 기술이 사용되어 전술한 바와 같은 종래 기술의 단점을 보완할 수 있게 되었다(대한민국 등록특허공보 제10-0581002호 참조).
그러나, 종래기술에서 사용하고 있는 HLA 유전자형 분석을 위한 마이크로어레이 기술의 경우에는 PCR 증폭 과정 외에 프로브를 설계·제작하고 제작된 프로브를 유리 기판에 집적하여 마이크로어레이 칩을 제작하는데 많은 시간이 소요되는 단점과, PCR 증폭산물과 프로브의 혼성화 과정에서 양성 신호 및 음성 신호를 판단하는 기준이 되는 형광신호의 컷오프 값을 정하기 어려운 문제점, 그리고 잘못 정해진 컷오프 값에 따라 위양성 및 위음성의 오류결과를 낳을 수 있다는 문제점을 내포하고 있는 것이 사실이다.
이와 관련하여 대한민국 등록특허공보 제10-1320622호는 실시간 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 이용하여 HLA-A, B, DR 대립유전자를 동시에 검사할 수 있는 방법 및 키트를 개시하고 있으나, 상기 선행기술은 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 바로 대립유전자를 판정할 수 없고 복잡한 대립유전자 조합들의 분석표에 기초하여 복잡하게 판정하여야 하는 불편과 분석 결과의 모호성을 갖는 문제점이 있었다.
따라서, 본 발명이 속하는 기술분야에서는 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석이 간편하고 명확하여, 종래의 방법에 비해 다량의 시료에 대한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 짧은 시간 내에 간단하게 수행할 수 있고 법과학 수사에서의 개인식별 및/또는 수술시 조직이식적합 여부를 유전학적 수준에서 정확하면서도 효과적으로 판단할 수 있는 기술의 개발에 대한 요구가 꾸준히 지속되고 있다.
대한민국 등록특허공보 제10-0581002호 (2006. 05. 17) 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0049256호 (2015. 05. 08) 대한민국 공개특허공보 제10-2015-0116643호 (2015. 10. 16) 대한민국 등록특허공보 제10-1320622호 (2013. 10. 23)
본 발명은 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 분석 대상이 되는 시료에서 HLA-DRB1 대립형질에 관한 정보 뿐만아니라 하나의 유전자 단위에서 HLA-DRB1과 연관되어 있는 HLA-DRB3, HLA-DRB4 및/또는 HLA-DRB5에 관한 추가적인 유전 정보를 제공하여 보다 정확한 개인식별 및/또는 수술시 조직이식적합 여부를 판정할 수 있는 새로운 리얼타임 PCR 분석 방법 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 분석 대상이 되는 시료로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 수행할 수 있고, 종래의 방법에 비해 다량의 시료에 대한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 짧은 시간 내에 간단하고 정확하게 수행할 수 있어 법과학 수사에서의 개인식별 및/또는 수술시 조직이식적합 여부를 유전학적 수준에서 효과적으로 판단할 수 있는 새로운 리얼타임 PCR 분석 방법 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
특히, 본 발명은 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 일대일 대응방식의 프라이머 및 프로브의 각 조합을 제공할 수 있어 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석이 간편하고 명확하여, 종래의 분석방법에서 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 바로 HLA-DRB1 대립유전자를 판정할 수 없고 복잡한 대립유전자 조합들의 분석표에 기초하여 복잡하게 판정하여야 하는 불편과 분석 결과의 모호성을 획기적으로 해결할 수 있는 기술을 제공하는데 그 목적이 있다.
추가로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석에 사용되는 양성 표준자(positive standard 또는 positive control)로서 변이가 적은 HLA-DRA 유전자를 선정하여 사용함으로써 리얼타임 PCR 실험과정의 무결성 확인 및 정량 분석을 가능하게 하고, 새우흰점바이러스 VP28 유전자의 증폭유무를 이용하여 분석 대상 시료 내에 리얼타임 PCR 저해제의 존재 유무 및 리얼타임 PCR 반응 조성액의 무결성을 확인할 수 있는 새로운 리얼타임 PCR 분석 방법 및 키트를 제공하는데 그 목적이 있다.
상기한 발명의 기술적 과제를 해결하고 상기한 발명의 목적에 부합되도록 예의 연구를 거듭한 결과, 본 발명자는 개인식별을 할 수 있고 이식수술시 조직적합성 판단을 위한 유전자 마커로서 HLA-DR 유전자를 적용하되 HLA-DRB1 뿐만 아니라 HLA-DRB3, 4, 5도 한 번의 실험으로 동시에 유전자형 분석이 가능한 리얼타임 PCR 분석기술을 고안하기에 이르렀다. 본 발명은 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 일대일 대응방식의 프라이머 및 프로브의 각 조합을 제공할 수 있어 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석이 간편하고 명확하여, 종래의 방법에 비해 다량의 시료에 대한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 짧은 시간 내에 간단하고 정확하게 수행할 수 있어 법과학 수사에서의 개인식별 및/또는 수술시 조직이식적합 여부를 유전학적 수준에서 효과적으로 판단할 수 있는 새로운 리얼타임 PCR 분석 방법 및 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 변이가 적은 HLA-DRA 유전자를 양성 표준자(positive standard 또는 positive control)로 사용하여 리얼타임 PCR 실험과정의 무결성을 확인하고 이를 이용한 정량분석을 통하여 어느 정도의 게놈 DNA가 주형으로 사용되었는지도 분석할 수 있으며, 추가로 새우흰점바이러스 VP28 유전자를 IPC(Internal Positive Control)로 사용하여 시료 내에 PCR 저해제의 존재 유무도 확인할 수 있는 기술을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어인 "시료"란 이식되는 조직의 공여자와 수여자의 인체에 위해를 가하지 않고 채취가능한 혈액, 조직이나 세포 등이거나, 범죄 현장이나 대형 참사 현장에서 채취 가능한 다양한 시료로서 혈액, 타액, 모근, 구강상피세포 등 유전자 추출이 가능한 시료를 포괄하는 의미로서 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 "리얼타임(real-time) PCR"이란 형광물질(fluorescent material)을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있는 방법이다. 이러한 리얼타임(real-time) PCR은 SYBR 그린(SYBR Green)을 사용하는 방법과 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로 나누어진다.
SYBR 그린(SYBR green) 기법은 리얼타임 PCR 증폭 과정에서 증폭된 DNA에 SYBR 그린 염색약이 끼어들어가 PCR 반응으로 합성된 이중가닥 DNA에 결합하여 형광신호를 발생하게 되고 이러한 형광신호를 검출하여 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 또한, 이중 표지된 프로브(dual labeled probe)를 이용한 리얼타임 PCR 기법은 5'말단에 형광물질이 표지되어 있고 3'말단에 소광물질(Quencher)이 표지된 이중 표지된 프로브를 이용하는 방법으로서, 이중 표지된 프로브에 의한 형광신호를 통해 이중 표지된 프로브가 표적 유전자의 PCR 증폭 산물과 어닐링되었는지 여부를 확인할 수 있고, 표적 유전자의 존재 여부와 이로부터의 증폭산물의 생성량을 측정할 수 있는 방법이다. 본 발명에서는 상기 방법 이외에 TaqMan 프로브법 등 당업계에 알려진 리얼타임 PCR이 적용가능함은 물론이다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트는, HLA-DRB1*01 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 1 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제1조합과, HLA-DRB1*03 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 3 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제2조합과, HLA-DRB1*11 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 3 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제3조합과, HLA-DRB1*13 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 3 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제4조합과, HLA-DRB1*14 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 3 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제5조합과, HLA-DRB1*04 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 8 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제6조합과, HLA-DRB1*07 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 9 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제7조합과, HLA-DRB1*08 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 11 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제8조합과, HLA-DRB1*12 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 11 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제9조합과, HLA-DRB1*09 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 14 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제10조합과, HLA-DRB1*10 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 16 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제11조합과, HLA-DRB1*15 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 18 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제12조합과, HLA-DRB1*16 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 18 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제13조합과, HLA-DRB3 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 22 및 26의 프라이머 쌍과 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제14조합과, HLA-DRB4 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 22 및 26의 프라이머 쌍과 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제15조합과, HLA-DRB5 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 22 및 26의 프라이머 쌍과 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제16조합을 포함한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트는, 리얼타임 PCR 실험과정의 무결성 확인 및 정량 분석을 위한 양성 표준자인 HLA-DRA 유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 27 및 28의 프라이머 쌍과 서열번호 29의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 서열번호 30 및 31의 프라이머 쌍과 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 서열번호 33 및 34의 프라이머 쌍과 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 서열번호 36 및 37의 프라이머 쌍과 서열번호 38의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 및 서열번호 39 및 40의 프라이머 쌍과 서열번호 41의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 및 프로브의 조합을 더 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트는, 리얼타임 PCR 저해제의 존재 유무 확인을 위한 IPC(Internal Positive Control)인 새우흰점바이러스 VP28 유전자를 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 42 및 43의 프라이머 쌍과 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 서열번호 45 및 46의 프라이머 쌍과 서열번호 47의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 서열번호 48 및 49의 프라이머 쌍과 서열번호 50의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 및 서열번호 51 및 52의 프라이머 쌍과 서열번호 53의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 및 프로브의 조합을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트는, DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함한다. 상기 표지물질은, 상기 프라이머 및 프로브의 각 조합을 구성하는 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브의 조합들 중 동일한 PCR 반응 튜브에 넣어지는 2개 또는 3개의 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다.
이와 같이 동일한 PCR 반응 튜브에 넣어지는 2개 또는 3개의 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 PCR 반응 튜브에서 2개 또는 3개의 유전자형을 한번에 분석할 수 있고, 8개의 PCR 반응 튜브로 구성된 8-스트립 튜브(8-strip tube)를 이용할 경우 HLA-DRB1 뿐만 아니라 HLA-DRB3, 4, 5도 한 번의 실험으로 동시에 유전자형 분석이 가능한 장점이 있다.
특히, 전술한 바와 같은 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트를 이용하면, 상기 프라이머와 프로브의 각 조합이 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자에 일대일 방식으로 대응하기 때문에 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 복잡한 분석표의 비교 과정 없이 바로 수행할 수 있다. 예를 들어, HLA-DRB1*10 유전자형 분석을 위한 제11조합이 포함된 리얼타임 PCR 반응 튜브에서 제11조합의 프로브가 표지된 형광물질(예를 들어, FAM)의 파장이 검출되면, 바로 분석 대상 시료가 HLA-DRB1*10 대립유전자를 포함하고 있는 것을 간편하고 명확하게 판단할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 분석 대상 대립유전자의 증폭량을 산출할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법은,
시료로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
상기 준비한 유전자 샘플을 주형으로 사용하고, 전술한 바와 같은 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트를 이용하여, HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자에 대해 리얼타임(real-time) PCR 증폭을 수행하는 단계와,
상기 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자에 대한 리얼타임 PCR 증폭 후, 리얼타임 PCR 결과를 확인하여 상기 시료의 HLA-DR 유전자형을 결정하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법은,
증폭 전, 카피수를 알고 있는 HLA-DRA 유전자의 양성 표준자를, 전술한 바와 같은 HLA-DRA 유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브의 조합과, 상기 HLA-DRA 유전자의 양성 표준자의 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
전술한 바와 같은 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트를 이용하여 상기 시료의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
상기 시료의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자를 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 시료 내의 상기 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자를 정량적으로 측정하는 단계를 더 포함한다.
또한, 본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법은, 상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정한 결과로부터 리얼타임 PCR 실험과정의 무결성을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
추가로, 본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법은, 전술한 바와 같은 IPC(Internal Positive Control)인 새우흰점바이러스 VP28 유전자를 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브의 조합을 이용하여 리얼타임 PCR 과정에서의 새우흰점바이러스 VP28 유전자의 증폭유무를 분석함으로써 상기 시료 내에 리얼타임 PCR 저해제의 존재 유무를 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법에 있어서, 상기 표지물질은, 상기 프라이머 및 프로브의 각 조합을 구성하는 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단에 표지될 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법에 있어서, 상기 프라이머 및 프로브의 조합들 중 동일한 PCR 반응 튜브에 넣어지는 2개 또는 3개의 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것이 바람직하다.
이와 같이 동일한 PCR 반응 튜브에 넣어지는 2개 또는 3개의 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 PCR 반응 튜브에서 2개 또는 3개의 유전자형을 한번에 분석할 수 있고, 8개의 PCR 반응 튜브로 구성된 8-스트립 튜브(8-strip tube)를 이용할 경우 HLA-DRB1 뿐만 아니라 HLA-DRB3, 4, 5도 한 번의 실험으로 동시에 유전자형 분석이 가능한 장점이 있다.
특히, 전술한 바와 같은 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법을 이용하면, 상기 프라이머와 프로브의 각 조합이 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자에 일대일 방식으로 대응하기 때문에 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 복잡한 분석표의 비교 과정 없이 바로 수행할 수 있다. 예를 들어, HLA-DRB1*10 유전자형 분석을 위한 제11조합이 포함된 리얼타임 PCR 반응 튜브에서 제11조합의 프로브가 표지된 형광물질(예를 들어, FAM)의 파장이 검출되면, 바로 분석 대상 시료가 HLA-DRB1*10 대립유전자를 포함하고 있는 것을 간편하고 명확하게 판단할 수 있다.
본 발명의 일실시예의 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법에 있어서, 상기 표지물질은 형광물질이고, 상기 표지물질로부터의 형광의 세기를 측정하여 분석 대상 대립유전자의 증폭량을 산출할 수 있다.
한편, 본 발명에 있어서 프로브의 한쪽 말단, 예를 들어 5'말단은 Cy5, Cy3, x-로다민, 텍사스 레드(TEXAS RED), SYBR 그린 (SYBR green), FAM, VIC, JOE, NED, HEX, TET 및 TAMRA 등과 같은 형광물질로 표지될 수 있고, 프로브의 다른쪽 말단, 예를 들어 3'말단은 IABkFQ, DABCYL, BHQ (BHQ-1, BHQ-2 등), EBQ, ZEN-IBFQ 등과 같은 소광물질로 표지될 수 있다. 그러나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니고 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명에 따르면, 리얼타임 PCR (실시간 중합효소 연쇄반응)을 이용하여 분석 대상이 되는 시료에서 HLA-DRB1 대립형질에 관한 정보 뿐만아니라 하나의 유전자 단위에서 HLA-DRB1과 연관되어 있는 HLA-DRB3, HLA-DRB4 및/또는 HLA-DRB5에 관한 추가적인 유전 정보를 제공하여 보다 정확한 개인식별 및/또는 수술시 조직이식적합 여부를 판정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 리얼타임 PCR을 이용하여 분석 대상이 되는 시료로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 수행할 수 있고, 종래의 방법에 비해 다량의 시료에 대한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 짧은 시간 내에 간단하고 정확하게 수행할 수 있어 법과학 수사에서의 개인식별 및/또는 수술시 조직이식적합 여부를 유전학적 수준에서 정확하면서도 효과적으로 판단할 수 있다.
특히, 본 발명은 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 일대일 대응방식의 프라이머 및 프로브의 각 조합을 제공할 수 있어 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석이 간편하고 명확하여, 종래의 분석방법에서 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 바로 HLA-DRB1 대립유전자를 판정할 수 없고 복잡한 대립유전자 조합들의 분석표에 기초하여 복잡하게 판정하여야 하는 불편과 분석 결과의 모호성을 획기적으로 해결할 수 있는 장점이 있다.
추가로, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석에 사용되는 양성 표준자(positive standard 또는 positive control)로서 변이가 적은 HLA-DRA 유전자를 선정하여 사용함으로써 리얼타임 PCR 실험과정의 무결성 확인 및 정량 분석을 가능하게 하고, 새우흰점바이러스 VP28 유전자의 증폭유무를 이용하여 분석 대상 시료 내에 리얼타임 PCR 저해제의 존재 유무 및 리얼타임 PCR 반응 조성액의 무결성을 확인할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 HLA-DR 항원 구조를 설명하는 도면이다.
도 2는 HLA-DR 일배체형(haplotype)에서 혈청형 및 대립유전자의 대응 관계와 대립유전자 간의 연관(linkage)을 설명하는 도표이다.
도 3은 HLA-DR 유전자 구조를 개략적으로 설명하는 도면이다.
도 4는 NIBSC HLA-DRB1 유전자형 패널 리스트를 나타내는 도표이다.
도 5는 본 발명의 일실시예의 방법을 이용한 HLA-DRB1*10 대립형질에 대한 리얼타임 PCR 결과를 나타내는 그래프이다(좌측으로부터 10ng, 1ng, 0.1ng 3회 반복하여 실험을 실시하였음).
도 6은 본 발명의 일실시예의 방법을 이용한 HLA-DRB1*12 대립형질에 대한 리얼타임 PCR 결과를 나타내는 그래프이다(좌측으로부터 10ng, 1ng, 0.1ng 3회 반복하여 실험을 실시하였음).
도 7은 본 발명의 일실시예의 방법을 이용한 HLA-DRB1*13 대립형질에 대한 리얼타임 PCR 결과를 나타내는 그래프이다(좌측으로부터 10ng, 1ng, 0.1ng 3회 반복하여 실험을 실시하였음).
도 8은 본 발명의 일실시예의 방법을 이용한 HLA-DRB1*14 대립형질에 대한 리얼타임 PCR 결과를 나타내는 그래프이다(좌측으로부터 10ng, 1ng, 0.1ng 3회 반복하여 실험을 실시하였음).
도 9는 본 발명의 방법이 HLA-DRB1 유전자형 분석과 관련하여 정량적인 재현성을 갖는다는 것을 보이는 리얼타임 PCR 결과 그래프이다.
도 10은 본 발명의 방법이 HLA-DRB1*01 대립유전자 분석에 대한 특이도를 갖는다는 것을 보이는 리얼타임 PCR 결과 그래프이다.
도 11은 본 발명의 방법이 HLA-DRB1*03 대립유전자 분석에 대한 특이도를 갖는다는 것을 보이는 리얼타임 PCR 결과 그래프이다.
도 12는 본 발명의 방법이 HLA-DRB1*07 대립유전자 분석에 대한 특이도를 갖는다는 것을 보이는 리얼타임 PCR 결과 그래프이다.
도 13은 본 발명의 방법이 HLA-DRB1*04/*14 대립유전자 분석에 대한 특이도를 갖는다는 것을 보이는 리얼타임 PCR 결과 그래프이다.
도 14는 본 발명의 방법에 대한 가속노화실험을 통한 안정성 테스트 결과를 나타내는 리얼타임 PCR 그래프이다.
이하, 본 발명의 실시예에 기초하여 보다 상세하게 기술한다. 본 발명의 하기 실시예는 본 발명을 구체화하기 위한 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아님은 물론이다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 전문가가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌은 본 발명에 참고로서 통합된다.
실시예 1: HLA-DRB1 대립형질 분석을 위한 특이적인 프라이머 및 프로브의 설계
각각의 HLA-DRB1 대립형질을 분석할 수 있는 특이적인 프라이머와 프로브를 선정하기 위해 IMGT-HLA(https://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/) 상동성 분석 툴을 이용하였다. 낮은 해상도 수준에서 구분이 가능하도록 서열을 선정하였으며, 적용된 유전자 서열은 엑손 2(exon 2) 염기서열로, 1차적으로 프라이머 수준에서 대립형질을 구분할 수 있도록 서열을 선정한 후 프라이머 수준에서 구분이 어려울 경우 2차로 프로브 수준에서 구분이 가능하도록 하였다. 특이도를 높이기 위하여 우선적으로 프라이머, 프로브 모두 각 대립형질에 특이적으로 디자인하고, 만약 이것이 어려울 경우 프라이머 단계에서 구분하고 프로브는 상동성이 높은 부분을 선택하거나 이와 반대의 방법으로 서열을 선정하였다.
HLA-DRB1 유전자형 분석을 위한 리얼타임 PCR용 프라이머와 프로브는 아래의 표 1과 같고, 이들 프라이머 및 프로브는 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다. HLA-DRB1 유전자형 분석을 위한 프라이머와 프로브 설계용 참조서열(GenBank NCBI 데이터 참조)은 하기 표 2와 같고, HLA-DRB1 대립유전자 각각을 특이적으로 증폭하고 검출하는 프라이머쌍 및 프로브의 각 조합은 하기 표 3과 같은 서열번호 조합으로 표기하였다. 한편, 하기 표 1의 명칭란에서 F는 정방향 프라이머, R은 역방향 프라이머, P는 프로브를 나타낸다.
HLA-DRB1 유전자형 분석을 위한 프라이머와 프로브 (Y:C/T, W:A/T)
서열번호 명칭 5'표지
물질		 염기서열 (5'→3') 3'표지
물질		 Tm 위치
서열번호 1 sq1-F TTCTTGTGGCAGCTTAAGTTTGA 55.1 5968-5990
서열번호 2 sq2-P FAM ATTTCTTCAAYGGGACGGAGCGGG BHQ1 62.4 5996-6019
서열번호 3 sq3-F CGTTTCTTGGAGTACTCTACGTC 54.7 3-25
서열번호 4 sq4-P FAM CGGGGCCGGGTGGACAAC BHQ1 64.7 201-218
서열번호 5 sq5-P FAM CGGCCTGATGAGGAGTACTGG BHQ1 59.3 150-170
서열번호 6 sq6-P JOE CGGCCCGCTCGTCTTCC BHQ1 61.9 191-207
서열번호 7 sq7-P JOE CCTGCTGCGGAGCACTGGAAC BHQ1 63.3 153-173
서열번호 8 sq8-F CGTTTCTTGGAGCAGGTTAAACAT 55.9 1-24
서열번호 9 sq9-F TTTCCTGTGGCAGGGTAAGTATA 55.5 5-27
서열번호 10 sq10-P JOE CGGGGCCAGGTGGACACCGTGTGC BHQ1 70.3 202-225
서열번호 11 sq11-F TTTCTTGGAGTACTCTACGGG 53.5 5-25
서열번호 12 sq12-P FAM CGGGCCCTGGTGGACACC BHQ1 64.2 201-218
서열번호 13 sq13-P JOE AGGAGGAGCTCCTGCGCTTC BHQ1 61.8 88-107
서열번호 14 sq14-F CGTTTCTTGAAGCAGGATAAGTTT 53.8 3-26
서열번호 15 sq15-P JOE CGGTATCTGCACAGAGGCATCTAT BHQ1 58.3 63-83
서열번호 16 sq16-F CGTTTCTTGGAGGAGGTTAAGTTT 55.2 3-26
서열번호 17 sq17-P FAM CTGGAAAGACGCGTCCATAACCAA BHQ1 59.3 66-89
서열번호 18 sq18-F CTGTGGCAGCCTAAGAGG 55.3 9-26
서열번호 19 sq19-P FAM ACATCCTGGAGCAGGCGCG BHQ1 63.2 184-202
서열번호 20 sq20-P JOE AGGACWTCCTGGAAGACAGGCG BHQ1 61 181-202
서열번호 21 sq21-R CTCGCCGCTGCACYGTGAA 62.3 6232-6214
HLA-DRB1 유전자형 분석을 위한 프라이머와 프로브 설계용 참조서열 (GenBank NCBI 데이터 참조)
서열번호 Accession Number 서열번호 Accession Number
서열번호 1, 2, 21 AB829523.1 서열번호 11, 12 LN609290.1
서열번호 3, 4 KP693395.1 서열번호 13 LN626694.1
서열번호 5 KP716823.1 서열번호 14, 15 LN609295.1
서열번호 6 LN830748.1 서열번호 16, 17 HF937416.1
서열번호 7 KM453233.1 서열번호 18, 19 LN626695.1
서열번호 8 KP716824.1 서열번호 20 KP768452.1
서열번호 9, 10 HF937425.2
HLA-DRB1 각 대립유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 프라이머와 프로브 각 조합 (각각의 대립유전자에 대해 프라이머 및 프로브의 각 조합은 일대일 대응)
대립유전자 서열번호 조합 (표지물질) 대립유전자 서열번호 조합 (표지물질)
HLA-DRB1*01 1 + 2 + 21 (제1조합)(FAM) HLA-DRB1*08 11 + 12 + 21 (제8조합)(FAM)
HLA-DRB1*03 3 + 4 + 21 (제2조합)(FAM) HLA-DRB1*12 11 + 13 + 21 (제9조합)(JOE)
HLA-DRB1*11 3 + 5 + 21 (제3조합)(FAM) HLA-DRB1*09 14 + 15 + 21 (제10조합)(JOE)
HLA-DRB1*13 3 + 6 + 21 (제4조합)(JOE) HLA-DRB1*10 16 + 17 + 21 (제11조합)(FAM)
HLA-DRB1*14 3 + 7 + 21 (제5조합)(JOE) HLA-DRB1*15 18 + 19 + 21 (제12조합)(FAM)
HLA-DRB1*04 8 + 2 + 21 (제6조합)(FAM) HLA-DRB1*16 18 + 20 + 21 (제13조합)(JOE)
HLA-DRB1*07 9 + 10 + 21 (제7조합)(JOE)
실시예 2: HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 설계
전술한 바와 같은 실시예 1의 방법에 기초하여 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 위한 프라이머와 프로브 서열을 하기의 표 4와 같이 설계하였다. 이들 프라이머 및 프로브는 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다. HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5 유전자 각각을 특이적으로 증폭하고 검출하는 프라이머쌍 및 프로브의 각 조합은 하기 표 5와 같은 서열번호 조합으로 표기하였으며, HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 위한 프라이머와 프로브 설계용 참조서열(GenBank NCBI 데이터 참조)도 같이 표기하였다. 한편, 하기 표 4의 명칭란에서 F는 정방향 프라이머, R은 역방향 프라이머, P는 프로브를 나타낸다.
HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 위한 프라이머와 프로브(Y:C/T, K:G/T, S:C/G, R:A/G)
서열번호 명칭 5'표지
물질		 염기서열 (5'→3') 3'표지
물질		 Tm 위치
서열번호 22 sq22-F TGYCCCCACAGCACGTTTC 59.7 5952-5970
서열번호 23 sq23-P FAM TGGAGCTGCKTAAGTCTGAGTGTC BHQ1 59.5 10-33
서열번호 24 sq24-P JOE TGGAGCAGGCTAAGTSTGAGTGTC BHQ1 60.4 10-33
서열번호 25 sq25-P TEXAS RED TGCAGCAGGATAAGTATGAGTGTC BHQ1 56.5 10-33
서열번호 26 sq26-R CGCTCCGTCCCRTTGARGAA 59.8 36-55
HLA-DRB3/4/5 유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 프라이머와 프로브 각 조합 그리고 이들을 설계용 참조서열 (GenBank NCBI 데이터 참조)
대립유전자 서열번호 조합 (표지물질) 서열번호 Accession Number
HLA-DRB3 22 + 23 + 26 (제14조합)(FAM) 서열번호 22 AB829523.1
서열번호 23 KP784418.1
HLA-DRB4 22 + 24 + 26 (제15조합)(JOE) 서열번호 24, 26 LN589839.1
HLA-DRB5 22 + 25 + 26 (제16조합)(TEXAS RED) 서열번호 25 KJ630806.1
실시예 3: HLA-DRA 유전자를 이용한 PC 프라이머 및 프로브의 설계
리얼타임 PCR의 무결성과, 리얼타임 PCR 반응에 적용된 DNA 총량을 정량적으로 분석하기 위해 양성표준자(positive control) 서열을 선정하였다. 양성표준자로서 적용되는 유전자로는 DR 단백질의 알파-서브유닛(alpha subunit)를 코딩하는 HLA-DRA를 선정하였고 염기서열 변이가 적은 부분을 선택하여 동일한 온도 조건에서 적용이 가능하도록 하였다. 상기 양성표준자를 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브는 하기 표 6과 같고, 이들 프라이머 및 프로브는 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다. 한편, 하기 표 6의 명칭란에서 F는 정방향 프라이머, R은 역방향 프라이머, P는 프로브를 나타낸다.
양성표준자 증폭 및 검출용 프라이머 및 프로브
서열번호 명칭 5'표지
물질		 염기서열 (5'→3') 3'표지물질 Tm 위치
서열번호 27 sq27-F ATCATCCAGGCCGAGTTCTA 55.3 51413-51432
서열번호 28 sq28-R CCGTCTCCTTCTTTGCCATATC 55.4 51518-51497
서열번호 29 sq29-P JOE TGAATCCTGACCAATCAGGCGAGT BHQ1 60.2 51435-51458
서열번호 30 sq30-F CTGGCGGCTTGAAGAATTTG 54.8 51520-52539
서열번호 31 sq31-R GGAGCGCTTTGTCATGATTTC 54.6 51625-51605
서열번호 32 sq32-P JOE ACATAGCTGTGGACAAAGCCAACCT BHQ1 60.7 51579-51603
서열번호 33 sq33-F TGACCAATCAGGCGAGTTTAT 54.1 51442-51462
서열번호 34 sq34-R GCCTCAAAGCTGGCAAATC 54.9 51561-51543
서열번호 35 sq35-P JOE CGGTCTGGCGGCTTGAAGAATTTG BHQ1 60.8 51516-51539
서열번호 36 sq36-F CAGGCCGAGTTCTATCTGAATC 54.9 51419-51440
서열번호 37 sq37-R CTGGCAAATCGTCCAAATTCTT 54 51552-51531
서열번호 38 sq38-P JOE ACCGTCTCCTTCTTTGCCATATCCAC BHQ1 60.5 51519-51494
서열번호 39 sq39-F TGTGGATATGGCAAAGAAGGAG 54.8 51493-51514
서열번호 40 sq40-R CATGATTTCCAGGTTGGCTTTG 54.8 51613-51592
서열번호 41 sq41-P JOE TTGGACGATTTGCCAGCTTTGAGG BHQ1 60.1 51537-51560
실시예 4: WSSV(White Spot Syndrome virus) VP28 유전자를 이용한 IPC 프라이머 및 프로브 설계
리얼타임 PCR 실험 시 검체에서 유발하는 다양한 증폭저해제의 존재 유무와, HLA-DR 표적유전자의 주된 DNA 주형이 배제된 상태의 반응 조성액의 무결성을 확인하기 위해서 양식새우의 흰점바이러스(White Spot Syndrome virus) VP28(Viral Protein 28) 유전자를 IPC(Internal Positive Control)로 선택하여 4개의 리얼타임 PCR 증폭 조건을 확립하였다(참조서열: KR083838.1). WSSV(White Spot Syndrome virus) VP28 유전자를 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브는 하기 표 7과 같고, 이들 프라이머 및 프로브는 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)에 의뢰하여 합성하였다. 한편, 하기 표 7의 명칭란에서 F는 정방향 프라이머, R은 역방향 프라이머, P는 프로브를 나타낸다.
WSSV VP28 유전자 증폭 및 검출용 프라이머 및 프로브 (R:A/G, K:G/T, Y:C/T)
서열번호 명칭 5'표지물질 염기서열 (5'→3') 3'표지물질 Tm 위치
서열번호 42 sq42-F GTTGGRTCAGGCTACTTCAA 53.4 178-197
서열번호 43 sq43-R ATCCGCATCTTCTTCCTTCAT 54 291-271
서열번호 44 sq44-P TEXAS RED CCGCAATGGAAAGTCTGATGCACA BHQ1 60.1 246-269
서열번호 45 sq45-F ACAGRCAATATCGAGACAAACA 53.1 121-142
서열번호 46 sq46-R TCGCTGTCAAAGGACACATC 55.1 224-205
서열번호 47 sq47-P TEXAS RED CATTCCTGTGACTGCTGAGGTTGG BHQ1 59.8 159-182
서열번호 48 sq48-F GCARATGGTGCCAAAGATTAAC 53.9 411-432
서열번호 49 sq49-R KGTGCCAACTTCATCCTCAT 54.7 510-491
서열번호 50 sq50-P TEXAS RED AGGCYTTTGTCGGTAGCTCCAAC BHQ1 60.5 440-462
서열번호 51 sq51-F GRCAATATCGAGACAAACATGGA 54 124-146
서열번호 52 sq52-R ATCTTGAAGTAGCCTGAYCCAAC 55.7 200-178
서열번호 53 sq53-P TEXAS RED CCTCCGCATTCCTGTGACTGC BHQ1 60.7 153-173
실시예 5: HLA-DRB1 패널 DNA를 이용한 HLA 대립형질 분석
상기에서 기술한 서열정보(표 1, 표 3, 표 4, 표 5, 표 6 및 표 7)을 토대로 표준 패널 DNA(도 4 참조)를 주형으로 하여 리얼타임 PCR 증폭실험을 실시하였다.
리얼 타임 PCR 증폭 실험은 PikoReal96 리얼타임 PCR 장비(Thermo Scientific, 미국)를 이용하여 수행하였다. 그리고, 표 3 및 표 5의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5의 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 각 조합, HLA-DRA 증폭 및 검출용 프라이머 및 프로브 조합(표 6), 그리고 WSSV VP28 유전자 증폭 및 검출용 프라이머 및 프로브 조합(표 7)을 리얼타임 PCR 증폭 조성물에 포함시키되, 하나의 8-스트립 튜브(8-strip tube)에 후술하는 표 8과 같은 조성표에 해당하는 프라이머 쌍과 프로브의 각 조합을 포함하도록 리얼타임 PCR 증폭 조성물을 구성하였다. 리얼타임 PCR 반응 조성액으로는 제넷바이오(대한민국, 대전광역시 소재)에서 구매한 2X 리얼타임 qPCR 마스터 믹스(real-time qPCR master mix)를 사용하였다. 마스터 믹스 10㎕에 NIBSC(UK)에서 구매한 HLA-DRB1 패널 DNA 10ng, 표 8의 조성에 해당하는 각각의 프라이머 500nM, 프로브 250nM을 첨가하되 최종 반응액이 20㎕가 될 때까지 증류수를 첨가하였다. 리얼타임 PCR은 95℃에서 10분간 변성과정을 거친 후 95℃ 10초, 55℃ 30초 조건을 37회 반복하여 수행하였다.
또한, 리얼 타임 PCR 증폭 반응결과물을 확인하고 이를 정량적으로 분석하기 위해 각 프로브는 형광물질 및 소광물질로 이중 표지되는데, 본 실시예에서는 (주)바이오니아(대한민국 대전광역시 소재)의 합성서비스를 이용하여 표 1, 표 4, 표 6 및 표 7에 나타낸 바와 같이 5'말단에 형광물질인 FAM (최대 흡수파장: 495nm, 최대 방출 파장: 520nm), JOE(최대 흡수 파장: 520nm, 최대 방출 파장: 548nm) 또는 텍사스레드(TEXASRED)(최대 흡수 파장: 586nm, 최대 방출 파장: 605nm)로 표지하였고, 3'말단에는 소광물질인 BHQ-1을 표지하였다. 한편, 프로브를 표지하는 형광물질 및 소광물질로는 전술한 예시에 한정되는 것이 아니고, 당업계에 알려진 다양한 형광물질 및 소광물질이 사용될 수 있음은 물론이다. 하기 표 8의 A 부터 H 튜브 에서 분석하고자 하는 유전자형에 일대일로 대응되는 프라이머 쌍과 프로브의 각 조합을 구성하는 프로브의 5'말단에는 하기 표 8에서 기재된 순서의 표지물질로 표지되어 있음을 알 수 있다.
HLA-DR 대립형질 분석을 위한 8-스트립 튜브 조성표 (Triplex 조건: FAM/JOE/TEXASRED 순서로 표지, Duplex 조건: FAM/JOE 순서로 표지)
A B C D E F G H
*04/DRA/WSSV *01/*07 *03/*13 *11/*14 *08/*12 *10/*09 *15/*16 DRB3/4/5
리얼타임(real-time) PCR 방법은 이러한 형광물질과 소광물질을 PCR 기법에 응용한 것으로 반응 중 검체 내에 존재하는 표적 유전자의 증폭과 함께 형광물질의 발광(emission) 정도를 실시간으로 검출하고 정량 분석하여 표적 유전자의 증폭 유무 및 그 양상을 신속하고 정확하게 분석할 수 있다. 리얼타임 PCR의 기본 원리는 중합효소와 형광공명 에너지 이동(Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광의 검출과 정량에 있다.
리얼타임 PCR에서의 정량은 PCR시 매 주기의 진행 상황을 감시하여 지수 증가기(exponential phase) 범위 내에서 실시간으로 증폭산물을 측정하는 방법으로서, 이때 중요한 개념이 Ct(threshold cycle) 또는 Cp(crossing point)라는 수치이다. 이 값은 전술한 이중 표지된 프로브에 의해 생기는 형광의 세기가 기본값(baseline level)을 넘어서 감지될 수 있을 정도로 두드러지게 증가하는 시점의 주기수이며, 이는 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자의 초기 주형량을 정확하게 반영한다. 따라서, 양성표준자인 HLA-DRA 유전자를 포함하는 시료를 PCR 증폭하여 전체 PCR 증폭 기간에 대한 형광물질의 형광세기의 변화를 측정하고 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하고 형광세기의 표준 곡선을 얻은 후, 시료에 대한 리얼타임 PCR을 수행하여 시료 내에 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자가 존재하는지 여부와 시료 내에 포함된 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자의 초기 주형량을 정량적으로 분석할 수 있다.
이와 같이 동일한 PCR 반응 튜브에 넣어지는 2개(doublet) 또는 3개(triplet)의 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 PCR 반응 튜브에서 2개 또는 3개의 유전자형을 한번에 분석할 수 있고, 8개의 PCR 반응 튜브로 구성된 8-스트립 튜브(8-strip tube)를 이용할 경우 HLA-DRB1 뿐만 아니라 HLA-DRB3, 4, 5도 한 번의 실험으로 동시에 유전자형 분석이 가능한 장점이 있다.
특히, 전술한 바와 같은 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트를 이용하면, 상기 프라이머와 프로브의 각 조합이 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자에 일대일 방식으로 대응하기 때문에 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형을 복잡한 분석표의 비교 과정 없이 바로 판정할 수 있다.
실시예 6: 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석방법의 민감도 평가
본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석법의 민감도를 측정하기 위해서 HLA-DR 유전형을 알고 있는 패널 DNA를 이용하여 10ng, 1ng, 0.1ng 3단계의 주형을 준비한 후, 실시예 5와 동일하게 실험을 진행하였다. 각각의 DNA 농도 모두 올바른 결과값을 확인할 수 있었으며, 최소농도 0.1 ng까지 검출이 가능하였다.
예를 들어, 도 5 내지 도 8에서 확인되는 바와 같이 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5의 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브 해당 조합은 HLA-DRB1*10, HLA-DRB1*12, HLA-DRB1*13, 및 HLA-DRB1*14 유전자를 유효하게 증폭시키고 증폭 사이클에 대한 형광세기의 곡선 역시 각 대립유전자의 존재 여부 판단과 정량적 분석에 적합한 것을 확인할 수 있었다. 각 대립유전자 패널 10ng, 1ng, 0.1ng에 대해 3회 반복실험하여 리얼타임 PCR을 수행한 결과는 실험 대상 대립유전자 모두에 대해 0.1 ng까지 민감도 높게 정량검출이 가능함을 확인시켜 주었다.
따라서, 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석법은 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자를 유효하게 증폭시키고 민감도 높게 검출할 수 있어 리얼 타임 PCR 증폭 반응을 통한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 판정과 정량적 분석에 적합한 것을 확인할 수 있었다.
실시예 7: 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석방법의 재현성 평가
본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석법의 재현성 평가를 위해서 HLA-DRB1*04 대립형질을 가지는 DNA 주형 1ng을 이용하여 실시예 5에 기재된 방식에 따라 반복 실험을 진행하였다(FAM으로 표지된 프로브와 프라이머 쌍의 조합인 제6조합 이용). 총 16회 반복을 실험을 진행한 후 Cp 값의 표준편차를 확인한 결과 25%이내 구간을 유지하여 정량적인 재현성이 있음을 확인하였다(도 9 및 표 9 참조).
HLA-DRB1 재현성 실험결과
HLA-DRB1 특이도 평가 (16회 반복)
27.94 27.91 28.14 28.16 28.24 28.40 28.49 28.41
28.60 28.72 28.35 28.19 28.01 28.03 28.11 27.90
표준편차 0.24
실시예 8: 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석방법의 특이도 평가
본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석법의 특이도 평가를 위하여 각 대립형질을 확인할 수 있는 리얼타임 PCR 반응조성물을 준비한 후 준비된 해당 패널 DNA를 적용하여 각 대립형질에 부합되는 실험결과를 확인하였고, 다른 대립형질을 확인하는 리얼타임 PCR 반응조성물과는 교차반응이 없음을 확인하였다. 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석법의 특이도 평가 관련 실험은 실시예 5에 기재된 방식에 따라 진행하였으며, 각 실험결과는 정확하게 특이적인 조성물에만 반응함을 확인하였다.
예를 들어, 표 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 제1조합(FAM 표지)을 포함하는 반응조성물(HLA-DRB1*01 대립형질을 확인할 수 있는 반응조성물)에 부합되는 패널 DNA를 적용하여 리얼타임 PCR을 수행한 결과, 하기 표 10의 조성표의 B 튜브에서만 FAM의 형광신호(즉, HLA-DRB1*01 대립유전자에 대한 양성 신호)가 명확하게 관찰되었고(도 10 및 하기 표 10 참조), 다른 대립형질을 확인하기 위한 반응조성물들로부터는 형광신호가 관찰되지 않아 이들과 비특이적 교차반응을 일으키지 않는다는 것을 확인하였다.
HLA-DRB1*01 대립유전자에 대한 특이도를 확인할 수 있는 리얼타임 PCR 결과
A B C D E F G H
*04 *01/*07 *03/*13 *11/*14 *08 *12 *09/*10 *15/*16
- 29.06/- -/- -/- -/- -/- -/- -/-
다른 예로서, 표 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 제2조합(FAM 표지)을 포함하는 반응조성물(HLA-DRB1*03 대립형질을 확인할 수 있는 반응조성물)에 부합되는 패널 DNA를 적용하여 리얼타임 PCR을 수행한 결과, 하기 표 11의 조성표의 C 튜브에서만 FAM의 형광신호(즉, HLA-DRB1*03 대립유전자에 대한 양성 신호)가 명확하게 관찰되었고(도 11 및 하기 표 11 참조), 다른 대립형질을 확인하기 위한 반응조성물들로부터는 형광신호가 관찰되지 않아 이들과 비특이적 교차반응을 일으키지 않는다는 것을 확인하였다.
HLA-DRB1*03 대립유전자에 대한 특이도를 확인할 수 있는 리얼타임 PCR 결과
A B C D E F G H
*04 *01/*07 *03/*13 *11/*14 *08 *12 *09/*10 *15/*16
- -/- 28.38/- -/- - - -/- -/-
또 다른 예로서, 표 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 제7조합(JOE 표지)을 포함하는 반응조성물(HLA-DRB1*07 대립형질을 확인할 수 있는 반응조성물)에 부합되는 패널 DNA를 적용하여 리얼타임 PCR을 수행한 결과, 하기 표 12의 조성표의 B 튜브에서만 JOE의 형광신호(즉, HLA-DRB1*07 대립유전자에 대한 양성 신호)가 명확하게 관찰되었고(도 12 및 하기 표 12 참조), 다른 대립형질을 확인하기 위한 반응조성물들로부터는 형광신호가 관찰되지 않아 이들과 비특이적 교차반응을 일으키지 않는다는 것을 확인하였다.
HLA-DRB1*07 대립유전자에 대한 특이도를 확인할 수 있는 리얼타임 PCR 결과
A B C D E F G H
*04 *01/*07 *03/*13 *11/*14 *08 *12 *09/*10 *15/*16
- -/28.48 -/- -/- - - -/- -/-
추가의 다른 예로서, 표 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 제5조합(JOE 표지)을 포함하는 반응조성물((HLA-DRB1*14 대립형질을 확인할 수 있는 반응조성물)과 표 3에 기재된 프라이머 및 프로브의 제6조합(FAM 표지)을 포함하는 반응조성물(HLA-DRB1*04 대립형질을 확인할 수 있는 반응조성물)에 부합되는 패널 DNA를 적용하여 리얼타임 PCR을 수행한 결과, 하기 표 13의 조성표의 D 튜브에서 JOE의 형광신호(즉, HLA-DRB1*14 대립유전자에 대한 양성 신호)가, 그리고 A 튜브에서 FAM의 형광신호(즉, HLA-DRB1*04 대립유전자에 대한 양성 신호)가 동시에 명확하게 관찰되었고(도 13 및 하기 표 13 참조), 다른 대립형질을 확인하기 위한 반응조성물들로부터는 형광신호가 관찰되지 않아 이들과 비특이적 교차반응을 일으키지 않는다는 것을 확인하였다.
HLA-DRB1*04/*14 대립유전자에 대한 특이도를 확인할 수 있는 리얼타임 PCR 결과
A B C D E F G H
*04 *01/*07 *03/*13 *11/*14 *08 *12 *09/*10 *15/*16
29.18 -/- -/- -/30.46 - - -/- -/-
상기와 같은 결과들을 종합하면, 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석법과 이를 위한 프라이머 및 프로브의 각 조합은 비특이적 교차반응을 일으키지 않고 해당 대립유전자를 특이적으로 분석할 수 있고, 여러 개의 대립유전자에 대해서도 동시에 특이적으로 검출할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 9: 본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석방법의 안정성 평가
본 발명의 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석법의 안정성 평가를 위해서 가속노화 실험을 실시하였다. 실험법은 "의료기기의 안정성시험 기준 제정고시"를 참조하였으며, 가속노화계수(AAF)산정은 다음 식에 따라 측정하였다.
AAF ＝ Q 10 [( TAA-TRT ) / 10]
T AA ＝ 가속노화온도 (℃)
T RT ＝ 주변 온도 (℃)
가속노화시간(AAT) ＝ 설정된 (RT)/AAF
40℃의 온도의 조건으로 7일간 노출시킨 후 실험을 진행하여 동일한 결과를 얻을 수 있어(Cp 값 기준으로 ±1 이내) 영하 20℃ 기준으로 환산하였을 때 총 448일간 안정성을 유지할 수 있음을 확인하였다(도 14 및 하기 표 14 참조).
가속노화계수를 이용한 안정성 환산결과
1 일 2 일 3 일 4 일 5 일 6 일 7 일
25℃ 2.8 일 5.7 일 8.5 일 11.3 일 14.1 일 17.0 일 19.8 일
4℃ 12.1 일 24.3 일 36.4 일 48.5 일 60.6 일 72.8 일 84.9 일
-20℃ 64 일 128 일 192 일 256 일 320 일 384 일 448 일
이상과 같이 설명한 결과들을 종합하면, 본 발명은 리얼타임 PCR을 이용하여 분석 대상이 되는 시료로부터 HLA-DRB1 뿐만아니라 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 동시에 신속하면서도 정확하게 그리고 정량화된 데이터에 기초하여 특이도 및 민감도 높게 수행할 수 있고, 이에 따라 법과학 수사의 개인식별이나 수술시 조직이식적합 여부 판단에 있어 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 신뢰도 높고 효율적으로 수행할 수 있음을 알 수 있다.
특히, 본 발명은 리얼타임 PCR 형광곡선 결과로부터 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석을 복잡한 분석표의 비교 과정 없이 바로 간편하고 명확하게 수행할 수 있어, 다량의 시료에 대한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형을 유전학적 수준에서 효과적으로 판단할 수 있다.
이상 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> YOON, HYUN KYU <120> Method and kit for genotyping HLA-DRB1 and HLA-DRB3/4/5 using real-time PCR <130> P15-0031KR <160> 53 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq1-F <400> 1 ttcttgtggc agcttaagtt tga 23 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq2-P <400> 2 atttcttcaa ygggacggag cggg 24 <210> 3 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq3-F <400> 3 cgtttcttgg agtactctac gtc 23 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq4-P <400> 4 cggggccggg tggacaac 18 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq5-P <400> 5 cggcctgatg aggagtactg g 21 <210> 6 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq6-P <400> 6 cggcccgctc gtcttcc 17 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq7-P <400> 7 cctgctgcgg agcactggaa c 21 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq8-F <400> 8 cgtttcttgg agcaggttaa acat 24 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq9-F <400> 9 tttcctgtgg cagggtaagt ata 23 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq10-P <400> 10 cggggccagg tggacaccgt gtgc 24 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq11-F <400> 11 tttcttggag tactctacgg g 21 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq12-P <400> 12 cgggccctgg tggacacc 18 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq13-P <400> 13 aggaggagct cctgcgcttc 20 <210> 14 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq14-F <400> 14 cgtttcttga agcaggataa gttt 24 <210> 15 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq15-P <400> 15 cggtatctgc acagaggcat ctat 24 <210> 16 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq16-F <400> 16 cgtttcttgg aggaggttaa gttt 24 <210> 17 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq17-P <400> 17 ctggaaagac gcgtccataa ccaa 24 <210> 18 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq18-F <400> 18 ctgtggcagc ctaagagg 18 <210> 19 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq19-P <400> 19 acatcctgga gcaggcgcg 19 <210> 20 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq20-P <400> 20 aggacwtcct ggaagacagg cg 22 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq21-R <400> 21 ctcgccgctg cacygtgaa 19 <210> 22 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq22-F <400> 22 tgyccccaca gcacgtttc 19 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq23-P <400> 23 tggagctgck taagtctgag tgtc 24 <210> 24 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq24-P <400> 24 tggagcaggc taagtstgag tgtc 24 <210> 25 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq25-P <400> 25 tgcagcagga taagtatgag tgtc 24 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq26-R <400> 26 cgctccgtcc crttgargaa 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq27-F <400> 27 atcatccagg ccgagttcta 20 <210> 28 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq28-R <400> 28 ccgtctcctt ctttgccata tc 22 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq29-P <400> 29 tgaatcctga ccaatcaggc gagt 24 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq30-F <400> 30 ctggcggctt gaagaatttg 20 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq31-R <400> 31 ggagcgcttt gtcatgattt c 21 <210> 32 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq32-P <400> 32 acatagctgt ggacaaagcc aacct 25 <210> 33 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq33-F <400> 33 tgaccaatca ggcgagttta t 21 <210> 34 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq34-R <400> 34 gcctcaaagc tggcaaatc 19 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq35-P <400> 35 cggtctggcg gcttgaagaa tttg 24 <210> 36 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq36-F <400> 36 caggccgagt tctatctgaa tc 22 <210> 37 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq37-R <400> 37 ctggcaaatc gtccaaattc tt 22 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq38-P <400> 38 accgtctcct tctttgccat atccac 26 <210> 39 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq39-F <400> 39 tgtggatatg gcaaagaagg ag 22 <210> 40 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq40-R <400> 40 catgatttcc aggttggctt tg 22 <210> 41 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq41-P <400> 41 ttggacgatt tgccagcttt gagg 24 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq42-F <400> 42 gttggrtcag gctacttcaa 20 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq43-R <400> 43 atccgcatct tcttccttca t 21 <210> 44 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq44-P <400> 44 ccgcaatgga aagtctgatg caca 24 <210> 45 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq45-F <400> 45 acagrcaata tcgagacaaa ca 22 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq46-R <400> 46 tcgctgtcaa aggacacatc 20 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq47-P <400> 47 cattcctgtg actgctgagg ttgg 24 <210> 48 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq48-F <400> 48 gcaratggtg ccaaagatta ac 22 <210> 49 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq49-R <400> 49 kgtgccaact tcatcctcat 20 <210> 50 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq50-P <400> 50 aggcytttgt cggtagctcc aac 23 <210> 51 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq51-F <400> 51 grcaatatcg agacaaacat gga 23 <210> 52 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq52-R <400> 52 atcttgaagt agcctgaycc aac 23 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> sq53-P <400> 53 cctccgcatt cctgtgactg c 21

Claims (14)

  1. 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트로서,
    HLA-DRB1*01 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 1 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제1조합과,
    HLA-DRB1*03 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 3 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 4의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제2조합과,
    HLA-DRB1*11 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 3 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 5의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제3조합과,
    HLA-DRB1*13 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 3 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 6의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제4조합과,
    HLA-DRB1*14 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 3 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 7의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제5조합과,
    HLA-DRB1*04 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 8 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 2의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제6조합과,
    HLA-DRB1*07 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 9 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 10의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제7조합과,
    HLA-DRB1*08 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 11 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 12의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제8조합과,
    HLA-DRB1*12 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 11 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 13의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제9조합과,
    HLA-DRB1*09 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 14 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 15의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제10조합과,
    HLA-DRB1*10 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 16 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 17의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제11조합과,
    HLA-DRB1*15 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 18 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 19의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제12조합과,
    HLA-DRB1*16 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 18 및 21의 프라이머 쌍과 서열번호 20의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제13조합과,
    HLA-DRB3 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 22 및 26의 프라이머 쌍과 서열번호 23의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제14조합과,
    HLA-DRB4 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 22 및 26의 프라이머 쌍과 서열번호 24의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제15조합과,
    HLA-DRB5 유전자형 분석을 위한 프라이머 및 프로브의 조합으로서 서열번호 22 및 26의 프라이머 쌍과 서열번호 25의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 제16조합을 포함하고,
    상기 프라이머 쌍과 프로브와의 제1조합 내지 제16조합 각각은, HLA-DRB1*01 대립유전자, HLA-DRB1*03 대립유전자, HLA-DRB1*11 대립유전자, HLA-DRB1*13 대립유전자, HLA-DRB1*14 대립유전자, HLA-DRB1*04 대립유전자, HLA-DRB1*07 대립유전자, HLA-DRB1*08 대립유전자, HLA-DRB1*12 대립유전자, HLA-DRB1*09 대립유전자, HLA-DRB1*10 대립유전자, HLA-DRB1*15 대립유전자, HLA-DRB1*16 대립유전자, HLA-DRB3 유전자, HLA-DRB4 유전자 및 HLA-DRB5 유전자 각각을 일대일 대응방식으로 특이적으로 증폭 및 검출하는 것을 특징으로 하는, 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트.
  2. 제1항에 있어서,
    리얼타임 PCR 실험과정의 무결성 확인 및 정량 분석을 위한 양성 표준자인 HLA-DRA 유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 27 및 28의 프라이머 쌍과 서열번호 29의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 서열번호 30 및 31의 프라이머 쌍과 서열번호 32의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 서열번호 33 및 34의 프라이머 쌍과 서열번호 35의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 서열번호 36 및 37의 프라이머 쌍과 서열번호 38의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 및 서열번호 39 및 40의 프라이머 쌍과 서열번호 41의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 및 프로브의 조합을 더 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트.
  3. 제1항에 있어서,
    리얼타임 PCR 저해제의 존재 유무 확인을 위한 IPC(Internal Positive Control)인 새우흰점바이러스 VP28 유전자를 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브의 조합으로서, 서열번호 42 및 43의 프라이머 쌍과 서열번호 44의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 서열번호 45 및 46의 프라이머 쌍과 서열번호 47의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 서열번호 48 및 49의 프라이머 쌍과 서열번호 50의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합, 및 서열번호 51 및 52의 프라이머 쌍과 서열번호 53의 올리고뉴클레오티드 또는 이와 상보적인 올리고뉴클레오티드 프로브와의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 하나의 프라이머 및 프로브의 조합을 더 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    DNA 중합효소, dNTPs, PCR 완충용액 및 PCR 증폭산물의 표지물질을 더 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 표지물질은 상기 프라이머 및 프로브의 각 조합을 구성하는 프로브의 한쪽 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 프라이머 및 프로브의 조합들 중 동일한 PCR 반응 튜브에 넣어지는 2개 또는 3개의 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트.
  7. 제6항에 있어서,
    동일한 PCR 반응 튜브에 넣어지는 2개 또는 3개의 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 PCR 반응 튜브에서 2개 또는 3개의 유전자형을 한번에 분석할 수 있고,
    8개의 PCR 반응 튜브로 구성된 8-스트립 튜브(8-strip tube)를 이용할 경우, HLA-DRB1*01 대립유전자, HLA-DRB1*03 대립유전자, HLA-DRB1*11 대립유전자, HLA-DRB1*13 대립유전자, HLA-DRB1*14 대립유전자, HLA-DRB1*04 대립유전자, HLA-DRB1*07 대립유전자, HLA-DRB1*08 대립유전자, HLA-DRB1*12 대립유전자, HLA-DRB1*09 대립유전자, HLA-DRB1*10 대립유전자, HLA-DRB1*15 대립유전자, HLA-DRB1*16 대립유전자, HLA-DRB3 유전자, HLA-DRB4 유전자 및 HLA-DRB5 유전자 모두를 한 번의 실험으로 동시에 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는, 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트.
  8. 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법에 있어서,
    시료로부터 유전자 샘플을 준비하는 단계와,
    상기 준비한 유전자 샘플을 주형으로 사용하고, 청구항 제4항에 기재된 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트를 이용하여, HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자에 대해 리얼타임(real-time) PCR 증폭을 수행하는 단계와,
    상기 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자에 대한 리얼타임 PCR 증폭 후, 리얼타임 PCR 결과를 확인하여 상기 시료의 HLA-DR 유전자형을 결정하는 단계를 포함하고,
    상기 프라이머 쌍과 프로브와의 제1조합 내지 제16조합 각각은, HLA-DRB1*01 대립유전자, HLA-DRB1*03 대립유전자, HLA-DRB1*11 대립유전자, HLA-DRB1*13 대립유전자, HLA-DRB1*14 대립유전자, HLA-DRB1*04 대립유전자, HLA-DRB1*07 대립유전자, HLA-DRB1*08 대립유전자, HLA-DRB1*12 대립유전자, HLA-DRB1*09 대립유전자, HLA-DRB1*10 대립유전자, HLA-DRB1*15 대립유전자, HLA-DRB1*16 대립유전자, HLA-DRB3 유전자, HLA-DRB4 유전자 및 HLA-DRB5 유전자 각각을 일대일 대응방식으로 특이적으로 증폭 및 검출하는 것을 특징으로 하는, 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    증폭 전, 카피수를 알고 있는 HLA-DRA 유전자의 양성 표준자를, 상기 HLA-DRA 유전자를 특이적으로 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브의 조합과, 상기 HLA-DRA 유전자의 양성 표준자의 증폭량을 나타내는 표지물질을 이용하여 리얼타임(real-time) PCR로 증폭하는 단계와,
    상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
    상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하여 얻어진 표준곡선으로부터 상기 양성 표준자의 카피수와, Cp값 또는 Ct값을 대응시키는 단계와,
    상기 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 키트를 이용하여 상기 시료의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정하고, 일정한 형광세기에 도달하는 PCR 반응회수(Cp값 또는 Ct값)를 분석하는 단계와,
    상기 시료의 유전자 샘플 내에 존재하는 상기 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자를 PCR 증폭하여 얻은 Cp값 또는 Ct값을 상기 양성 표준자의 카피수에 대응시켜, 상기 시료 내의 상기 HLA-DRB1의 각 대립유전자 및 HLA-DRB3/4/5 유전자를 정량적으로 측정하는 단계를 더 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 양성 표준자의 전체 PCR 증폭 기간에 대한 상기 표지물질의 형광세기의 변화를 측정한 결과로부터 리얼타임 PCR 실험과정의 무결성을 결정하는 단계를 더 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 새우흰점바이러스 VP28 유전자를 증폭 및 검출하는 프라이머 및 프로브의 조합을 이용하여 리얼타임 PCR 과정에서의 새우흰점바이러스 VP28 유전자의 증폭유무를 분석함으로써 상기 시료 내에 리얼타임 PCR 저해제의 존재 유무를 결정하는 단계를 더 포함하는, 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 표지물질은 상기 프라이머 및 프로브의 각 조합을 구성하는 프로브의 한쪽 말단에 표지되는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 프라이머 및 프로브의 조합들 중 동일한 PCR 반응 튜브에 넣어지는 2개 또는 3개의 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브는 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지되는 것을 특징으로 하는 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    동일한 PCR 반응 튜브에 넣어지는 2개 또는 3개의 프라이머 및 프로브의 조합들을 구성하는 각 프로브가 각기 서로 다른 파장에서 검출할 수 있는 표지물질로 표지된 경우 1개의 PCR 반응 튜브에서 2개 또는 3개의 유전자형을 한번에 분석할 수 있고,
    8개의 PCR 반응 튜브로 구성된 8-스트립 튜브(8-strip tube)를 이용할 경우, HLA-DRB1*01 대립유전자, HLA-DRB1*03 대립유전자, HLA-DRB1*11 대립유전자, HLA-DRB1*13 대립유전자, HLA-DRB1*14 대립유전자, HLA-DRB1*04 대립유전자, HLA-DRB1*07 대립유전자, HLA-DRB1*08 대립유전자, HLA-DRB1*12 대립유전자, HLA-DRB1*09 대립유전자, HLA-DRB1*10 대립유전자, HLA-DRB1*15 대립유전자, HLA-DRB1*16 대립유전자, HLA-DRB3 유전자, HLA-DRB4 유전자 및 HLA-DRB5 유전자 모두를 한 번의 실험으로 동시에 분석할 수 있는 것을 특징으로 하는, 리얼타임 PCR을 이용한 HLA-DRB1 및 HLA-DRB3/4/5 유전자형 분석 방법.
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