KR101320622B1 - 스피드 멀티플렉스 pcr법을 이용한 hla 대립유전자 검사방법 및 검사키트 - Google Patents

스피드 멀티플렉스 pcr법을 이용한 hla 대립유전자 검사방법 및 검사키트 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실시간 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 이용하여 HLA-A, B, DR 대립유전자를 동시에 검사할 수 있는 방법 및 키트에 관한 것으로 시료에서 추출한 DNA를 대상으로 HLA 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 시발체들과 이들 시발체에 의하여 증폭된 증폭산물을 탐지할 수 있는 형광탐침자들을 이용하여 나타나는 형광값을 가지고 HLA 대립유전자의 형별을 구분하는 방법 및 HLA 대립유전자의 형별을 구분하기 위한 키트에 관한 것이다.

Description

스피드 멀티플렉스 PCR법을 이용한 HLA 대립유전자 검사방법 및 검사키트{HLA genotyping method and kit using speed multiplex PCR method}
본 발명은 실시간 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 이용하여 HLA-A, B, DR 대립유전자를 동시에 검사할 수 있는 방법 및 키트에 관한 것으로 시료에서 추출한 DNA를 대상으로 HLA 대립유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 시발체들과 이들 시발체에 의하여 증폭된 증폭산물을 탐지할 수 있는 형광탐침자들을 이용하여 나타나는 형광 값을 가지고 HLA 대립유전자의 형별을 구분하는 방법 및 HLA 대립유전자의 형별을 구분하기 위한 키트에 관한 것이다.
사람의 백혈구 항원 (Human Leukocyte Antigen; 이하 HLA라 함)은 사람에서 발견되는 가장 다형성을 지닌 유전적 시스템으로 장기 및 조혈모세포이식의 성공에 있어서 주요한 인자로 알려져 있다. HLA 분자는 외래항원을 CD8+ T세포와 CD4+ T세포에 전달해주는 역할을 하고 있다. HLA 분자의 형별은 혈청학적 방법을 이용하여 형별을 분석하였으나 중합효소연쇄반응이 개발되면서 DNA 수준에서의 형별분석이 이루어지게 되었다. 이러한 DNA 수준의 HLA 형별검사가 이루어지면서 많은 수의 새로운 HLA 대립유전자가 밝혀지게 되어 현재 HLA-A는 2,013종류, HLA-B는 2,605종류, HLA-C는 1,551종류, HLA-DRB은 1,260종류가 밝혀져 있다 (2012년 7월 기준).
HLA 검사 방법으로는 항체-항원 반응에 의한 혈청학적 방법(Serotyping)과 HLA 유전자 염기서열 차이를 판별하는 분자생물학적 방법(DNA typing)이 있다. 혈청학적 방법은 검사 방법의 복잡함과 결과의 신뢰도가 분자생물학적 방법보다 상대적으로 낮아 현재 전 세계적으로 분자생물학적 방법을 많이 사용하고 있다.
분자생물학적 방법으로는 크게 세 종류의 방법을 사용하는 데 첫 번째로 중합효소연쇄반응을 실시한 후 그 결과를 전기영동으로 확인하여 분석하는 PCR-SSP(sequence specific primers)방법, 두 번째로 중합효소연쇄반응을 실시한 후 탐침자를 이용하여 그 결과를 분석하는 PCR-SSOP(sequence specific oligonucleotide probes)방법, 세 번째로 중합효소연쇄반응을 실시한 후 염기서열분석에 의해 그 결과를 분석하는 PCR-SBT(sequence based typing)방법이 있고 이들 방법을 이용한 제품들이 개발되어 판매되고 있다. 그러나 종래의 방법은 사용자가 중합효소 연쇄반응을 기본적으로 실시하고 이후 다른 여러 반응 즉 혼성화반응(hybridization)과 전기영동을 하여야 HLA 검사를 할 수 있는 불편함과 시간적인 소모가 요구되었다.
따라서, 중합효소연쇄반응만으로 HLA 검사를 할 수 있는 실시간 중합효소 연쇄반응에 대한 방법이 계속적으로 요구되고 있다. 본 기술과 유사한 PCR-SSP법은 한 튜브에서 하나의 단일염기만을 볼 수 있는 방법으로 HLA 검사를 하는데 많은 수의 튜브를 이용하여야 하는 단점을 가지고 있어 한 튜브에서 여러 유전자를 증폭하는 multiplex PCR법에 대한 요구 또한 계속적으로 요구되었다.
본 발명의 목적은 HLA유전자에 다형성이 있는 부위를 검출함에 있어서 하나의 튜브에서 두 유전자 (HLA-A와 HLA-B, HLA-B와 HLA-DRB)의 다형성이 있는 부위를 특이적으로 증폭할 수 있는 멀티플렉스 중합효소연쇄반응을 실시하고 증폭 유무를 형광탐침자를 이용하여 검출하여 HLA 대립유전자 형별을 할 수 있는 방법 및 키트를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 유전자에 대한 HLA 대립유전자를 실시간 PCR에 의해 특이적으로 증폭할 수 있는 시발체 세트, 및 상기 실시간 PCR에 의해 증폭된 산물을 탐침 할 수 있는 탐침자 세트를 포함하는 HLA 대립유전자 형별 키트를 제공한다. 또한 본 발명은 또한 시료에서 추출한 DNA를 대상으로 본 발명의 HLA 대립유전자용 검출세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 실시하는 단계; 및 상기 실시간 PCR 결과를 확인하여 HLA 대립유전자를 형별하는 단계를 포함하는 HLA 대립유전자의 형별 방법을 제공한다.
본 발명의 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 HLA 대립유전자 형별 선별 키트는 형광시발체 대신 HLA 대립유전자에 특이적인 일반 시발체로 상기 유전자를 멀티플렉스로 증폭하고, 각각의 종류 유전자의 증폭 유무만을 검출할 수 있는 형광탐침자를 사용함으로써 전기영동 없이 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 HLA 대립유전자를 형별 가능하며, 또한 현재 상품으로 나와 있는 HLA 검사키트(96 well/1인) 및 검사방법 (일반 전기영동법)보다 더 경제적이고 효율성이 높은 키트(96 well/2인)와 검사방법 (Real-time multiplex PCR)을 사용함으로써, 하나의 검사 키트로 장기이식 희망 환자와 공여자를 동시에 검사할 수 있어 기술적 편의성과 경제성이 우수한 시스템으로 한 유전자에 여러 단일염기변이가 존재하는 유전자의 형별 분석 시 용이하게 사용될 수 있다.
도 1a 내지 도 1e는 HLA-A, B, DR 대립유전자 형별을 구분하기 위한 분석표를 나타낸 것이다.
도 2는 HLA-A, B, DR 대립유전자 형별을 유전자 증폭 후의 결과그림을 나타낸 것이다.
도 3은 HLA-A, B, DR 대립유전자 형별 유전자 증폭 후 CT값을 나타낸 것이다.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 유전자에 대한 HLA 대립유전자를 실시간 PCR에 의해 특이적으로 증폭할 수 있는 시발체 세트, 및 상기 실시간 PCR에 의해 증폭된 산물을 탐침 할 수 있는 탐침자 세트를 포함하는 HLA 대립유전자 형별 키트에 관한 것이다.
본 발명의 HLA 대립유전자를 실시간 중합효소연쇄반응으로 검출 할 수 있는 멀티플렉스 HLA 대립유전자형별 세트는 HLA-A, B, DRB유전자의 대립유전자에 각각 특이적으로 결합하여 증폭할 수 있는 시발체들과 각 HLA 유전자 별로 증폭산물에 혼성 가능하여 증폭산물을 확인할 수 있는 형광 표지된 탐침자를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 HLA 대립유전자를 검사할 수 있다.
본 발명의 검출세트를 통해 검출할 수 있는 HLA 대립유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-DRB유전자이다.
본 발명에서 언급한 실시간 중합효소연쇄반응법은 열순환기(thermal cycler)와 분광 형광 광도계가 일체화된 장치를 이용하여, 실시간으로 PCR 증폭산물의 생성과정을 모니터링하여 얻고자 하는 DNA의 양을 분석하는 방법을 의미한다. 실시간 PCR 방법은 PCR 증폭산물의 확인을 위한 전기영동이 필요 없으며, 증폭이 지수 함수적으로 일어나는 영역에서 증폭 산물의 양을 비교하여 더욱 정확한 정량이 가능한, 신속성과 정량성이 뛰어난 방법이다.
상기 시발체는 HLA 대립유전자를 종류별로 특이적으로 증폭시킬 수 있는 것으로, 일 구체예에 따르면, HLA 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치를 기점으로 하여 17 내지 22 nt의 길이로 작재할 수 있다.
상기 시발체는 통상의 PCR을 통해 HLA-A 대립유전자, 예를 들어 HLA-A*01, A*02, A*03, A*11, A*23, A*24, A*25, A*26, A*29, A*30, A*31, A*32, A*33, A*34, A*36, A*43, A*66, A*68, A*69, A*74, A*80 등, 또는 HLA-B 대립유전자, 예를 들어, B*07, B*08, B*13, B*14, B*15(B62), B*15(63), B*15(70), B*15(71), B*15(72), B*15(75), B*15(76), B*15(77), B*15, B*18, B*27, B*35, B*37, B*38, B*39, B*40, B*40(B60), B*40(B61), B*41, B*42, B*44, B*45, B*46, B*47, B*48, B*49, B*50, B*51, B*52, B*53, B*54, B*55, B*56, B*57, B*58, B*59, B*67, B*78, B*81, B*82, B*83, Bw4, Bw6등, 또는 HLA-DRB 대립유전자, 예를 들어, DRB1*01, DRB1*15, DRB1*16, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13, DRB1*14, DRB1*07, DRB1*08, DRB1*09, DRB1*10, DRB3, DRB4, DRB5 등을 증폭시킬 수 있다.
본 발명에서는 상기 시발체들을 이용하여 멀티플렉스 실시간 중합효소연쇄반응을 통해 HLA-A와 HLA-B, HLA-B와 HLA-DRB 유전자를 동시에 증폭시키는데 사용하였다.
일 구체예에 따르면, 비특이적 반응이 일어나지 않는 조건을 고려하여 상기 시발체를 통해 증폭될 수 있는 증폭산물의 크기는 91 내지 274bp이고, 이때 모든 시발체의 Tm 값은 58 내지 65 이었다.
상기 각 시발체가 특이적으로 증폭할 수 있는 HLA-A, B, DRB 대립유전자의 종류는 다음과 같다.
1)
- 시발체 쌍 : 서열번호 1, 21, 78, 117
- 검출 HLA 대립유전자 : A*01, A*36, B*07, B*40(B60), B*40, B*42, B*48, B*81
2)
- 시발체 쌍 : 서열번호 2, 22, 79, 118
- 검출 HLA 대립유전자 : A*02, A*03, A*30, B*07, B*08, B*35, B*37, B*41, B*42, B*44, B*78
3)
- 시발체 쌍 : 서열번호 3, 23, 80, 119
- 검출 HLA 대립유전자 : A*02, A*03, A*32, B*08, B*15, B*51
4)
- 시발체 쌍 : 서열번호 4, 24, 81, 119
- 검출 HLA 대립유전자 : A*01, A*03, A*11, B*08, B*18, B*35, B*37, B*38, B*44, B*51, B*53, B*78
5)
- 시발체 쌍 : 서열번호 5, 25, 82, 120
- 검출 HLA 대립유전자 : A*24, A*33, B*27, B*44
6)
- 시발체 쌍 : 서열번호 6, 26
- 검출 HLA 대립유전자 : A*02,A*24, A*25
7)
- 시발체 쌍 : 서열번호 7, 27, 81, 121
- 검출 HLA 대립유전자 : A*01, A*11, A*25, A*66, A*26, A*33, A*34, B*58
8)
- 시발체 쌍 : 서열번호 8, 28, 83, 122
- 검출 HLA 대립유전자 : A*29, B*41, B*44, B*45
9)
- 시발체 쌍 : 서열번호 9, 27, 84, 122
- 검출 HLA 대립유전자 : A*01, A*03, A*11, A*25, A*66, A*26, A*34, A*43, B*08, B*37
10)
- 시발체 쌍 : 서열번호 10, 29, 85, 123
- 검출 HLA 대립유전자 : A*30, B*44, B*83
11)
- 시발체 쌍 : 서열번호 11, 26, 86, 124
- 검출 HLA 대립유전자 : A*02, A*25, A*32, B*35, B*41, B*44, B*45, B*53, B*82
12)
- 시발체 쌍 : 서열번호 8, 30, 87, 125
- 검출 HLA 대립유전자 : A*33, B*15(B63), B*15, B*27, B*51, B*57
13)
- 시발체 쌍 : 서열번호 12, 31, 88, 126
- 검출 HLA 대립유전자 : A*02, A*25, A*66, A*26, A*34, A*43, B*18, B*27, B*40, B*44, B*49, B*51, B*57
14)
- 시발체 쌍 : 서열번호 13, 32, 89, 122
- 검출 HLA 대립유전자 : A*29, A*31, B*07, B*08, B*35, B*37, B*41, B*42, B*44, B*78
15)
- 시발체 쌍 : 서열번호 14, 33, 90, 126
- 검출 HLA 대립유전자 : A*01, A*02, A*03, A*11, A*24, A*29, A*30, A*32, A*33, A*34, A*36, A*68, B*44, B*49, B*51, B*52, B*58
16)
- 시발체 쌍 : 서열번호 15, 34, 91, 127
- 검출 HLA 대립유전자 : A*01, A*03, A*11, A*24, A*29, A*80, B*08, B*15, B*35, B*40, B*40(60), B*44, B*41, B*44, B*45, B*47, B*49, B*50, B*57
17)
- 시발체 쌍 : 서열번호 16, 35
- 검출 HLA 대립유전자 : A*11, A*43
18)
- 시발체 쌍 : 서열번호 17, 36, 92, 128
- 검출 HLA 대립유전자 : A*02, A*69, B*15, B*40, B*47, B*53
19)
- 시발체 쌍 : 서열번호 18, 37, 93, 129
- 검출 HLA 대립유전자 : A*29, A*74, B*27, B*40, B*40(B60), B*48, B*81
20)
- 시발체 쌍 : 서열번호 19, 38, 94, 118
- 검출 HLA 대립유전자 : A*80, B*07, B*15, B*27, B*35, B*37, B*40, B*40(60), B*42, B*44, B*48, B*53, B*55
21)
- 시발체 쌍 : 서열번호 20, 39, 95, 130
- 검출 HLA 대립유전자 : A*23, A*24, A*29, A*31, B*13, B*18, B*40, B*40(60), B*40(61), B*44
22)
- 시발체 쌍 : 서열번호 6, 40
- 검출 HLA 대립유전자 : A*11, A*34, A*66, A*68, A*69
23)
- 시발체 쌍 : 서열번호 41, 55, 96, 131
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*01, B*08, B*14, B*15, B*15(70), B*15(71), B*38, B*39, B*56
24)
- 시발체 쌍 : 서열번호 42, 56, 97, 132
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*15, B*46
25)
- 시발체 쌍 : 서열번호 42, 57, 98, 133
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*16, B*07, B*14, B*38, B*42, B*55, B*56, B*67, B*78, B*81, B*82, B*83
26)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 58, 99, 134
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*03, B*13, B*15, B*15(75), B*15(77), B*18, B*35, B*51, B*55
27)
- 시발체 쌍 : 서열번호 44, 59, 99, 135
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*04, B*13, B*15, B*15(62), B*15(76), B*27, B*40, B*44, B*52
28)
- 시발체 쌍 : 서열번호 45, 60, 100, 136
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*07, B*07, B*13, B*38, B*44, B*48, B*51, B*53, B*57
29)
- 시발체 쌍 : 서열번호 46, 61, 101, 137
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*08, B*15, B*18, B*35, B*37, B*40, B*44, B*49, B*51, B*52, B*53, B*78
30)
- 시발체 쌍 : 서열번호 47, 62, 97, 138
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*09, B*15, B*15(75), B*55
31)
- 시발체 쌍 : 서열번호 48, 63, 102, 133
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*10, B*54
32)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 64, 103, 139
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*03, DRB1*11, B*08, B*15(B70), B*15(B72), B*27, B*37, B*38, B*39, B*40(B60). B*48, B*52, B*55
33)
- 시발체 쌍 : 서열번호 46, 65, 104, 140
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*08, DRB1*12, B*07, B*08, B*14, B*15, B*15(B70), B*15(B71), B*15(B72), B*18, B*35, B*39, B*40, B*40(B60), B*48, B*58
34)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 66, 97, 141
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*11, DRB1*13, DRB1*14, B*13, B*15(B77), B*44
35)
- 시발체 쌍 : 서열번호 49, 67, 105, 142
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*08, DRB1*11, DRB1*13, DRB1*14, B*07, B*08, B*15, B*27, B*35, B*40, B*40(B60), B*40(B61), B*41, B*44, B*45, B*50
36)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 68, 106, 123
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*03, DRB1*08, DRB1*13, DRB1*14, B*15(B76)
37)
- 시발체 쌍 : 서열번호 50, 69, 83, 143
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*11, DRB1*14, B*41, B*45
38)
- 시발체 쌍 : 서열번호 50, 70, 107, 144
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*14, B*18
39)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 71, 108, 125
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*03, DRB1*13, DRB1*14, B*13, B*15(B62), B*40(B61), B*44, B*45, B*46, B*49, B*50, B*51, B*52, B*54, B*56, B*59, B*82
40)
- 시발체 쌍 : 서열번호 50, 71, 109, 125
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*03, DRB1*13, DRB1*14, B*15, B*15(B62), B*35, B*40, B*44, B*49, B*50, B*51, B*52, B*56, B*58, B*78
41)
- 시발체 쌍 : 서열번호 44, 72, 110, 143
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*04, DRB1*14, B*08, B*13, 15, B*35, B*39, B*41, B*42, B*45, B*46, B*54, B*55, B*59, B*78
42)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 73, 111, 145
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*08, DRB1*11, DRB1*14, B*38, B*39, B*40, B*58, B*67
43)
- 시발체 쌍 : 서열번호 51, 74, 112, 125
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB1*13, DRB1*14, B*57, B*58
44)
- 시발체 쌍 : 서열번호 52, 75, 86, 146
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB3, B*13, B*15(B62), B*18, B*35, B*40, B*40(B60), B*40(B61), B*44, B*48, B*49, B*53, B*54, B*55, B*56, B*57, B*58
45)
- 시발체 쌍 : 서열번호 53, 76, 106, 125
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB4, B*13, B*15, B*15(B62), B*15(B63), B*15(B70), B*15(B71), B*15(B72), B*15(B75), B*15(B76), B*15(B77), B*18, B*35, B*44, B*45, B*46, B*48, B*49, B*51, B*53, B*54, B*56, B*57, B*58
46)
- 시발체 쌍 : 서열번호 54, 77, 91, 133
- 검출 HLA 대립유전자 : DRB5, B*7, B*15, B*35, B*40, B*44, B*45, B*54, B*55, B*56, B*83
47)
- 시발체 쌍 : 서열번호 113, 114, 115, 116, 147
- 검출 HLA 대립유전자 : Bw4
48)
- 시발체 쌍 : 서열번호 113, 114, 115, 116, 148
- 검출 HLA 대립유전자 : Bw6
또한, 형광탐침자는 상기 시발체를 통해 증폭된 산물을 모두 검출할 수 있도록 HLA 유전자 중 다형성이 없는 부위를 선택하여 27내지 33 nt의 길이로 작재할 수 있으며 구체적으로, 서열번호 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160, 161 또는 162에 기재된 서열을 가질 수 있다.
보다 구체적으로, HLA-A 대립유전자에 대해서는 서열번호 151, 152, 153, 154 또는 155에 기재된 서열을 갖는 형광탐침자를 통해 증폭 유무를 검출할 수 있다. HLA-B 대립유전자에 대해서는 서열번호 156, 157, 158, 159 또는 160에 기재된 서열을 갖는 형광탐침자를 통해 증폭 유무를 검출할 수 있다. HLA-DRB1 대립유전자에 대해서는 서열번호 161 또는 162에 기재된 서열을 갖는 형광탐침자를 통해 증폭 유무를 검출할 수 있다. 이때 형광탐침자의 Tm 값은 60 내지 65℃ 일 수 있다.
상기 형광탐침자는 탐침자의 5' 및 3' 말단에 형광 표지 인자로 표지되어 있는 것으로, HLA 대립유전자의 검출세트의 종류에 따라 각각의 탐침자는 서로 상이한 형광 표지 인자로 표지된다. 형광 표지 인자는 종류에 따라 여기 및 방사 파장이 다르며, 사용방법 또한 상이하므로, 이를 고려하여 하나의 PCR 반응물에 함께 사용하는 형광 표지 인자는 별개로 검출가능한지 여부를 판단하여 선택 사용하여야 하며, 서로 다른 색상을 사용할 수 있다. 상기 형광 표지 인자에 대한 구체적인 사항 및 선택은 본원 발명에 속하는 기술분야의 당업자들에게 자명한 것이다.
일 구체예에 따르면, 형광 표지 인자는 통상의 방법으로 본 발명에 따른 HLA 대립유전자 검사세트에 포함된 탐침자에 표지되며, 표지 방법은 인터컬레이팅 (interchelating) 방법, TaqManTM 프로브법 및 분자 비콘(Molecualr beacon) 방법들이 있다. 본 발명에서 사용하고 있는 TaqManTM 프로브법은 5'말단을 형광 표지인자(FAM 등)로 3'말단을 quencher 물질(TAMRA 등)로 수식한 올리고뉴클레오티드(TaqMan probe)를 PCR 반응액에 첨가하는 방법으로, TaqManTM 프로브가 어닐링 단계에서 주형 DNA에 특이적으로 혼성화하지만, 프로브상의 형광 억제 물질(Quencher)에 의해 형광 발생이 억제되고, 연장 단계에서 Taq DNA 중합효소가 갖는 5'→3' 엑소뉴클레아제 활성으로 주형에 혼성화한 TaqManTM 프로브만 분해되어 형광색소가 프로브에서 유리됨으로써 quencher에 의한 억제가 해제되어 형광을 발하게 된다.
이때 상기 프로브는 5'말단이 FAM, VIC, TET, JOE, HEX, CY3, CY5, ROX, RED610, TEXAS RED, RED670 및 NED로 이루어진 군으로부터 선택되는 1종의 형광 표지 인자로 표지되며, 3' 말단이 6-TAMRA, BHQ-1,2,3 및 MGBNFQ(molecular grove binding non-fluorescence quencher)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종의 형광 억제 물질(Quencher)로 표지될 수 있다.
또한, 본 발명의 검출세트는 검사의 신뢰도를 높이고, 실험 과정에서 사용되는 전체 PCR 튜브에 포함되어 주형 및 PCR 조건의 상태 확인을 위해 내부 양성대조군 유전자를 증폭하기 위한 시발체를 더 포함할 수 있다. 바람직하게는, -글로빈, 인간 -액틴, GAPDH(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase), 또는 Homo sapiens adenomatous polyposis coli (APC) 유전자 등을 사용할 수 있다. 보다 바람직하게는, Homo sapiens adenomatous polyposis coli (APC) 유전자를 증폭할 수 있는 서열번호 149 및 150에 기재된 서열로 이루어진 시발체 쌍을 사용하는 것이 좋다.
따라서, 본 발명의 검출세트는 양성대조군 유전자의 증폭 유무를 탐지하기 위한 형광탐침자를 추가로 포함할 수 있으며, 바람직하게는 서열번호 163에 기재된 서열을 갖는 것을 사용할 수 있다.
일 구체예에 따르면, HLA-A, B, DRB1 대립유전자를 위한 시발체 및 형광탐침자를 포함하는 검출세트의 상세한 사항은 다음과 같다. 또한, 모든 검출세트에서 양성대조군 시발체 쌍(서열번호 149 및 150)과 형광탐침자(서열번호 163)의 종류는 동일하다.
1)
- 시발체 쌍 : 서열번호 1, 21, 78, 117
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 151, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 103bp, 257bp
2)
- 시발체 쌍 : 서열번호 2, 22, 79, 118
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 152, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 147bp, 226bp
3)
- 시발체 쌍 : 서열번호 3, 23, 80, 119
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 155, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 206bp, 216bp
4)
- 시발체 쌍 : 서열번호 4, 24, 81, 119
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 155, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 216bp, 101bp
5)
- 시발체 쌍 : 서열번호 5, 25, 82, 120
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 155, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 190bp, 147bp
6)
- 시발체 쌍 : 서열번호 6, 26
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 152
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 234bp
7)
- 시발체 쌍 : 서열번호 7, 27, 81, 121
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 154, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 116bp, 98bp
8)
- 시발체 쌍 : 서열번호 8, 28, 83, 122
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 152, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 201bp, 213bp
9)
- 시발체 쌍 : 서열번호 9, 27, 84, 122
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 153, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 274bp, 208bp
10)
- 시발체 쌍 : 서열번호 10, 29, 85, 123
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 152, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 189bp, 189bp
11)
- 시발체 쌍 : 서열번호 11, 26, 86, 124
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 152, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 240bp, 186bp
12)
- 시발체 쌍 : 서열번호 8, 30, 87, 125
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 152, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 201bp, 176bp
13)
- 시발체 쌍 : 서열번호 12, 31, 88, 126
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 155, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 131bp, 254bp
14)
- 시발체 쌍 : 서열번호 13, 32, 89, 122
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 152, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 182bp, 212bp
15)
- 시발체 쌍 : 서열번호 14, 33, 90, 126
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 155, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 180bp, 206bp
16)
- 시발체 쌍 : 서열번호 15, 34, 91, 127
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 155, 160
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 191bp, 100bp
17)
- 시발체 쌍 : 서열번호 16, 35
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 152
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 199bp
18)
- 시발체 쌍 : 서열번호 17, 36, 92, 128
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 155, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 185bp, 232bp
19)
- 시발체 쌍 : 서열번호 18, 37, 93, 129
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 154, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 156bp, 173bp
20)
- 시발체 쌍 : 서열번호 19, 38, 94, 118
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 152, 158
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 186bp, 127bp
21)
- 시발체 쌍 : 서열번호 20, 39, 95, 130
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 155, 160
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 177bp, 127bp
22)
- 시발체 쌍 : 서열번호 6, 40
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 152
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 207bp
23)
- 시발체 쌍 : 서열번호 41, 55, 96, 131
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 196bp, 142bp
24)
- 시발체 쌍 : 서열번호 42, 56, 97, 132
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 207bp, 97bp
25)
- 시발체 쌍 : 서열번호 42, 57, 98, 133
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 213bp, 98bp
26)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 58, 99, 134
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 222bp, 91bp
27)
- 시발체 쌍 : 서열번호 44, 59, 99, 135
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 162, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 176bp, 89bp
28)
- 시발체 쌍 : 서열번호 45, 60, 100, 136
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 230bp, 248bp
29)
- 시발체 쌍 : 서열번호 46, 61, 101, 137
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 213bp, 102bp
30)
- 시발체 쌍 : 서열번호 47, 62, 97, 138
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 195bp, 100bp
31)
- 시발체 쌍 : 서열번호 48, 63, 102, 133
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 206bp, 100bp
32)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 64, 103, 139
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 206bp, 91bp
33)
- 시발체 쌍 : 서열번호 46, 65, 104, 140
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 162bp, 189bp
34)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 66, 97, 141
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 188bp, 139bp
35)
- 시발체 쌍 : 서열번호 49, 67, 105, 142
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 194bp, 181bp
36)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 68, 106, 123
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 173bp, 278bp
37)
- 시발체 쌍 : 서열번호 50, 69, 83, 143
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 148bp, 234bp
38)
- 시발체 쌍 : 서열번호 50, 70, 107, 144
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 159
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 148bp, 113bp
39)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 71, 108, 125
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 160bp. 177bp
40)
- 시발체 쌍 : 서열번호 50, 71, 109, 125
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 111bp, 161bp
41)
- 시발체 쌍 : 서열번호 44, 72, 110, 143
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 270bp, 240bp
42)
- 시발체 쌍 : 서열번호 43, 73, 111, 145
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 224bp, 162bp
43)
- 시발체 쌍 : 서열번호 51, 74, 112, 125
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 248bp, 235bp
44)
- 시발체 쌍 : 서열번호 52, 75, 86, 146
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 225bp, 207bp
45)
- 시발체 쌍 : 서열번호 53, 76, 106, 125
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 156
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 213bp, 176bp
46)
- 시발체 쌍 : 서열번호 54, 77, 91, 133
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 161, 160
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 263bp, 201bp
47)
- 시발체 쌍 : 서열번호 113, 114, 115, 116, 147
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 181bp
48)
- 시발체 쌍 : 서열번호 113, 114, 115, 116, 148
- 양성대조군 시발체 쌍 : 서열번호 149과 150
- HLA 형광탐침자 : 서열번호 157
- 양성대조군 형광탐침자 : 서열번호 163
- 증폭산물의 크기 : 181bp
본 발명의 검출세트는 HLA 대립유전자의 종류에 특이적인 적어도 둘 이상의 시발체와 형광탐침자를 한 세트로 하여, 이들의 1종 이상의 조합을 동시에 사용하여 멀티플렉스 실시간 PCR을 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 검출세트를 포함하는 HLA 대립유전자 형별 선별 키트에 관한 것이다.
본 발명의 HLA 대립유전자 형별 선별 키트를 통해 형별할 수 있는 HLA 대립유전자는 HLA-A, HLA-B, HLA-DRB1 대립유전자이다.
상기 시발체 쌍 및 형광탐침자는 스트립 또는 마이크로플레이트에 패키징 될 수 있으며, 당업계에 공지된 방법으로 패키징 된다. 또한, 본 발명의 키트는 텍 중합효소(Taq polymerase), MgCl2를 포함한 반응 완충액, dNTP 및 안정화제(stabilizer)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으며, 그 외에도 당업계에 공지된 다른 시약, 예컨대 실시간 PCR용 마스터 믹스를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명의 HLA 대립유전자 형별 선별 키트를 사용할 경우, 주조직적합성항원 복합체를 유전자 수준에서 구별할 수 있으므로, 보다 정확한 조직적합성 판단에 널리 활용될 수 있다.
본 발명은 또한,
시료에서 추출한 DNA를 대상으로 본 발명의 HLA 대립유전자용 검출세트를 이용하여 실시간 중합효소연쇄반응(real time PCR)을 실시하는 단계; 및 상기 실시간 PCR 결과를 확인하여 HLA 대립유전자를 형별하는 단계를 포함하는 HLA 대립유전자의 형별 방법에 관한 것이다.
본 발명의 HLA 대립유전자의 형별 방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
제1단계는 HLA 대립유전자 증폭을 위한 시발체를 제작하는 단계로, HLA 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치를 기점으로 하여 17 내지 24 nt 길이의 시발체를 작재한다.
바람직하게는, 상기 시발체는 HLA-A 대립유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 서열번호 1 내지 40에 기재된 서열로부터 선택된 2종을 사용, HLA-DRB1 대립유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 서열번호 41 내지 77에 기재된 서열로부터 선택된 2종을 사용, HLA-B 대립유전자를 선택적으로 증폭할 수 있는 서열번호 78 내지 148에 기재된 서열로부터 선택된 2종 이상을 사용한다.
상기 시발체는 검사의 신뢰도를 높이고, 실험 과정에서 사용되는 전체 PCR 튜브에 포함되어 주형 및 PCR 조건의 상태 확인을 위해 내부 양성대조군 유전자를 증폭하기 위한 서열번호 149 및 150에 기재된 서열로 이루어진 시발체 쌍을 더 포함할 수 있다.
제2단계는 형광탐침자의 제작단계로 상기에서 작재된 시발체를 증폭하고, 이 증폭 산물을 검출할 수 있는 형광탐침자를 HLA 각 유전자별로 HLA-A는 5종류, HLA-B는 5종류, HLA-DRB1은 2종류 작재한다. 작재된 형광탐침자는 HLA 유전자 중 다형성이 없는 부위를 선택하여 27 내지 33 nt 길이로 작재한다.
구체적으로, HLA-A 대립유전자의 증폭 유무를 검출할 수 있는 서열번호 151, 152, 153, 154, 155에 기재된 서열일 수 있다. 또한, HLA-B 대립유전자의 증폭 유무를 검출할 수 있는 서열번호 156, 157, 158, 159, 160에 기재된 서열일 수 있다. 또한, HLA-DRB1 대립유전자의 증폭 유무를 검출할 수 있는 서열번호 161 또는 162에 기재된 서열일 수 있다.
또한, 양성대조군 유전자의 증폭 유무를 탐지하기 위한 서열번호 163에 기재된 서열을 갖는 형광탐침자를 더 포함할 수 있다.
제3단계는 실시간 PCR을 통해 상기 시발체를 증폭하는 단계와 형광탐침자로 증폭 시 증폭 유무를 실시간 측정하는 단계가 동시에 이루어지는 단계이다.
본 발명의 HLA 대립유전자를 형별하는 방법에 있어, 단일 또는 멀티플렉스 실시간 PCR 반응 조건은 통상적인 조건을 취할 수 있다. 또한, 단일 실시간 PCR과 멀티플렉스 실시간 PCR 반응은 동일한 조건으로 수행될 수 있으며, 일 예로 초기 변성(initial denaturation)을 95℃에서 10분간 수행한 후, 1단계로 변성(denaturation, 95℃에서 25초), 결합(annealing, 70℃에서 45초) 및 연장(extension, 72℃에서 30초) 을 5회 실시하고, 2단계로 변성(denaturation, 95℃에서 25초), 결합(annealing, 70℃에서 45초) 및 연장(extension, 72℃에서 30초) 을 30회 실시하여 총 35회 실시하는 조건을 취할 수 있다. 실시간 PCR 중 2단계의 연장단계에서 형광탐침자에 의해 생성된 형광을 측정한다.
또한, 본 발명의 HLA 대립유전자 형별 방법은 통상적인 실시간 PCR 방법 및 장치를 사용하여 실시할 수 있다. 상기 실시간 PCR 방법은 DNA 중합효소와 형광공명 에너지이동 (Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET)의 원리에 의해 PCR의 매 주기마다 실시간으로 시행되는 형광을 검출하고 정량하는 방법이다. 이러한 방법은 특이적인 증폭 산물을 비 특이적인 증폭산물로부터 구별하여 확인할 수 있으며, 자동화된 양상으로 분석 결과를 쉽게 입수할 수 있다.
본 발명에 사용 가능한 실시간 PCR 기기로는 AB 사의 Real-time PCR 기기 7900, 7500, 7300, Roche 사의 LightCycler 480, Stratagene사의 Mx3000p, 및 BioRad 사의 Chromo 4 기기 등이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. PCR 종료 시 이러한 실시간 PCR 기기의 레이저는 증폭된 PCR 산물의 형광탐침자에 표지된 형광 표지 인자를 감지하여 도 2 와 같은 피크를 구현한다. 이에, 전기영동 과정 없이 기기에 내장된 프로그램을 실행시켜 자동으로 결과를 분석할 수 있다.
본 발명에서는 일 예로, 자동화 프로그램으로 KoRASTM (코젠바이오텍)을 사용할 수 있다. 상기 자동화 프로그램을 사용하는 경우 분석된 결과를 O/X 타입 또는 Ct 타입으로 나타낼 수 있어 비숙련자라도 분석된 결과를 쉽게 알 수 있다.
본 발명의 HLA 대립유전자용 검출세트 및 이를 이용한 HLA 대립유전자 형별 방법에 의해, 기존의 HLA 대립유전자를 식별하기 위한 PCR 과정을 현저하게 단축시킬 수 있을 뿐만 아니라, 그 결과를 실시간으로 신속하게 확인할 수 있다.
이러한 방법은 전기영동법으로는 분별하기 어려웠던 적은 농도의 DNA 절편의 유무나 100 bp 미만의 PCR 산물의 확인을 레이저 감광으로 구분할 수 있고, 증폭된 두 유전자간의 PCR산물의 크기가 유사한 경우, PCR 산물에 의한 오염에 대한 우려가 없으며, 결과가 분석되어 검사가 종료되기까지 모든 시험과정이 자동 시스템으로 운영되기 때문에 시험자의 실수, 검사의 오류 등이 발생할 확률이 낮으며, 데이터의 수집, 분석이 용이하고 소요되는 검사시간과 노동력을 최소화시킬 수 있다는 점에서 매우 유용하다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 및 본 발명에 따르지 않는 비교 예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 특이 HLA-A, B, DRB1 대립 유전자 증폭을 위한 시발체 제조
HLA-A 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치 부위를 3' 말단으로 하여 17 mer에서 24 mer의 시발체를 작재하였다. 각 시발체에 사용한 염기서열은 다음과 같다:
HLA-A
시발체 1 : GACGCCGCGAGCCAGAA (서열번호 1)
시발체 2 : AGCCCCGCTTCATCGCA(서열번호 2)
시발체 3 : TGGCTGCGACGTGGGGT (서열번호 3)
시발체 4 : GTTCTCACACCATCCAGATA (서열번호 4)
시발체 5 : CACACCCTCCAGATGATGTT (서열번호 5)
시발체 6 : CCCATGAGGTATTTCTACACC (서열번호 6)
시발체 7 : GGAGTATTGGGACCGGAAC (서열번호 7)
시발체 8 : CCACTCCATGAGGTATTTCAC (서열번호 8)
시발체 9 : CACAGACTGACCGAGTGG (서열번호 9)
시발체 10 : CCGTGTCCCGGCCCGGCAGT (서열번호 10)
시발체 11 : CCACTCCATGAGGTATTTCTT (서열번호 11)
시발체 12 : CGGGTACCAGCAGGACGCT (서열번호 12)
시발체 13 : CCCACTCCATGAGGTATTTCA (서열번호 13)
시발체 14 : CCTCCGCGGGTACCGG (서열번호 14)
시발체 15 : TCCTCCGCGGGTACCGGC (서열번호 15)
시발체 16 : CTCCATGAGGTATTTCTACTCC (서열번호 16)
시발체 17 : GCGACGTGGGGTCGGACT (서열번호 17)
시발체 18 : ACGCAGTTCGTGCGGTTT (서열번호 18)
시발체 19 : GAGCCCCGCTTCATCGCA (서열번호 19)
시발체 20 : CACACCCTCCAGATGATGTT (서열번호 20)
시발체 21 : TCTGTGAGTGGGCCTTCAT (서열번호 21)
시발체 22 : CACTTTCCGTGTCTCCCC (서열번호 22)
시발체 23 : CCACTCCACGCACGTGCCA (서열번호 23)
시발체 24 : GCCCTCCAGGTAGGCTCTCT (서열번호 24)
시발체 25 : CCTCCAGGTAGGCTCTCTG (서열번호 25)
시발체 26 : GCGCGATCCGCAGGCTCT (서열번호 26)
시발체 27 : CCGGGGTCACTCACCGT (서열번호 27)
시발체 28 : CTTCACATTCCGTGTCTGCA (서열번호 28)
시발체 29 : GTCTGTGAGTGGGCCTTCAC (서열번호 29)
시발체 30 : CTTCACATTCCGTGTGTTCCG (서열번호 30)
시발체 31 : CTCCGCCTCATGGGCCGT (서열번호 31)
시발체 32 : GGTCCCAATACTCAGGCCT (서열번호 32)
시발체 33 : GAGCCACTCCACGCACGT (서열번호 33)
시발체 34 : AGGTATCTGCGGAGCCCG (서열번호 34)
시발체 35 : CCTTCATATTCCGTGTCTGCA (서열번호 35)
시발체 36 : CCTCCAGGTAGGCTCTCAA (서열번호 36)
시발체 37 : GCAGGGTCCCCAGGTCCA (서열번호 37)
시발체 38 : TCCCCAGGTTCGCTCGGTT (서열번호 38)
시발체 39 : TCTCAACTGCTCCGCCACAC (서열번호 39)
시발체 40 : CACTCGGTCAGTCTGTGAC (서열번호 40)
HLA-DRB
시발체 41 : CTTGTGGCAGCTTAAGTTTGAA (서열번호 41)
시발체 42 : CCTGTGGCAGCCTAAGAGG (서열번호 42)
시발체 43 : GTTTCTTGGAGTACTCTACGTC (서열번호 43)
시발체 44 : GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA (서열번호 44)
시발체 45 : CCTGTGGCAGGGTAAGTATA (서열번호 45)
시발체 46 : AGTACTCTACGGGTGAGTGTT (서열번호 46)
시발체 47 : GACGGAGCGGGTGCGGTA (서열번호 47)
시발체 48 : GCGGTTGCTGGAAAGACGCG (서열번호 48)
시발체 49 : GTTTCTTGGAGTACTCTACGTC (서열번호 49)
시발체 50 : GGTTCCTGGACAGATACTTCC (서열번호 50)
시발체 51 : TACTCTACGTCTGAGTGTCAA (서열번호 51)
시발체 52 : ACAGCACGTTTCTTGGAGCT (서열번호 52)
시발체 53 : GAGCGAGTGTGGAACCTGAT (서열번호 53)
시발체 54 : GTTTCTTGCAGCAGGATAAGTA (서열번호 54)
시발체 55 : CCGCCTCTGCTCCAGGAG (서열번호 55)
시발체 56 : TCCACCGCGGCCCGCGC (서열번호 56)
시발체 57 : TAGGTGTCCACCGCGGCG (서열번호 57)
시발체 58 : GCAGTAGTTGTCCACCCGGC (서열번호 58)
시발체 59 : CGCACGTACTCCTCTTGGTG (서열번호 59)
시발체 60 : CCCGTAGTTGTGTCTGCACAC (서열번호 60)
시발체 61 : TGCAGTAGGTGTCCACCAG (서열번호 61)
시발체 62 : ACCCCGTAGTTGTGTCTGCACAC (서열번호 62)
시발체 63 : GCTGCACTGTGAAGCTCTCAC (서열번호 63)
시발체 64 : CTGGCTGTTCCAGTACTCCT (서열번호 64)
시발체 65 : CTGTTCCAGGACTCGGCGA (서열번호 65)
시발체 66 : CCCGCTCGTCTTCCAGGAT (서열번호 66)
시발체 67 : CCCGCCTGTCTTCCAGGAA (서열번호 67)
시발체 68 : CTGGCTGTTCCAGTACTCGG (서열번호 68)
시발체 69 : CACCTCGGCCCGCCTCC (서열번호 69)
시발체 70 : CACCGCGGCCCGCCTCT (서열번호 70)
시발체 71 : CTGTTCCAGTGCTCCGCAG (서열번호 71)
시발체 72 : GCTYACCTCGCCKCTGCAC (서열번호 72)
시발체 73 : TCTGCAGTAGGTGTCCACCAG (서열번호 73)
시발체 74 : GCTGCACTGTGAAGCTCTCCA (서열번호 74)
시발체 75 : GCAGTAATTGTCCACCCGGC (서열번호 75)
시발체 76 : CTGCACTGTGAAGCTCTCCA (서열번호 76)
시발체 77 : CCGCTGCACTGTGAAGCTCT (서열번호 77)
HLA-B
시발체 78: GGTCTCACACCCTCCAGT (서열번호 78)
시발체 79: GCCTCCTCCGCGGGCATA (서열번호 79)
시발체 80: CCCACTCCATGAGGTATTTCGA (서열번호 80)
시발체 81: CGCGAGTCCGAGGACGGA (서열번호 81)
시발체 82: GCTACGTGGACGACACGCT (서열번호 82)
시발체 83: GGTCTCACACTTGGCAGAG (서열번호 83)
시발체 84: CACACCATCCAGAGGATGTC (서열번호 84)
시발체 85: TCCGCGGGTATGACCAGGA (서열번호 85)
시발체 86: GCTGCGACCTGGGGCCC (서열번호 86)
시발체 87: CCGCGGGTACCACCAGGA (서열번호 87)
시발체 88: CCCACTCCATGAGGTATTTCC (서열번호 88)
시발체 89: GTCTCACACCCTCCAGAGC (서열번호 89)
시발체 90: GGAGCCCCGCTTCATTG (서열번호 90)
시발체 91: GAGGTATTTCYACACCGCCA (서열번호 91)
시발체 92: GAGGTATTTCTACACCGCCA (서열번호 92)
시발체 93: GTCTCACACCCTCCAGAGC (서열번호 93)
시발체 94: AGATCACCCAGCGCAAGTG (서열번호 94)
시발체 95: CATGAGGTATTTCCACACCT (서열번호 95)
시발체 96: CTACGTGGACGACACGCA (서열번호 96)
시발체 97: CGCGAGTCCGAGGATGGC (서열번호 97)
시발체 98: GCCGCGAGTCCGAGAGA (서열번호 98)
시발체 99: CGCCGCGAGTCCGAGGAT (서열번호 99)
시발체 100: ATGAGGTATTTCTACACCTCCG (서열번호 100)
시발체 101: GCCGCGAGTCCGAGGAC (서열번호 101)
시발체 102: ACGCCGCGAGTCCGACAGG (서열번호 102)
시발체 103: GCCGCGAGTCCGAGAGA (서열번호 103)
시발체 104: GGGGAGCCCCGCTTCATCT (서열번호 104)
시발체 105: GCTACGTGGACGACACGCT (서열번호 105)
시발체 106: CCGCGGGCATGACCAGTC (서열번호 106)
시발체 107: CTCAGTGGGCTACGTGGACGG (서열번호 107)
시발체 108: TCCGCGGGCATAACCAGTTA (서열번호 108)
시발체 109: AGTACGCCTACGACGGCAAA (서열번호 109)
시발체 110: GGCCAGGGTCTCACACTTGG (서열번호 110)
시발체 111: CCGCGGGCATAACCAGTTC (서열번호 111)
시발체 112: GGGTCTCACATCATCCAGGT (서열번호 112)
시발체 113: GACGACACGCAGTTCGTGA (서열번호 113)
시발체 114: GACGACACGCTGTTCGTGA (서열번호 114)
시발체 115: GACGACACCCAGTTCGTGA (서열번호 115)
시발체 116: GACGGCACCCAGTTCGTGA (서열번호 116)
시발체 117: CTTCCCGTTCTCCAGGTG (서열번호 117)
시발체 118: CTAGCGCGCTCCAGCTTGT (서열번호 118)
시발체 119: CAGTCTGTGTGTTGGTCTTGA (서열번호 119)
시발체 120: GGTCAGTCTGTGCCTTGGC (서열번호 120)
시발체 121: TCTGCGCGGAGGCCTTCAT (서열번호 121)
시발체 122: CCTCCAGGTAGGCTCTGTCC (서열번호 122)
시발체 123: CCAGGTATCTGCGGAGCGA (서열번호 123)
시발체 124: CCTCCAGGTAGGCTCTGTCA (서열번호 124)
시발체 125: GGAGCCACTCCACGCACAG (서열번호 125)
시발체 126: CTTGTAGTAGCGGAGCGCGA (서열번호 126)
시발체 127: CGCTGTCGAACCTCACGAACA (서열번호 127)
시발체 128: GAGCAGGGTCCGCAGGTC (서열번호 128)
시발체 129: CCTCCAACTTGCGCTGGGA (서열번호 129)
시발체 130: CTCCTTCCTCGGACTCGT (서열번호 130)
시발체 131: AGTCTGTGTGTTGGTCTTGC (서열번호 131)
시발체 132: CTGTGCCTGGCGCTTGTACT (서열번호 132)
시발체 133: TGTGCCTGGGCCTTGTA (서열번호 133)
시발체 134: GGTCTTGDAGATCTGTGTGTTC (서열번호 134)
시발체 135: TGGTCTTGGAGATCTGTGTCTC (서열번호 135)
시발체 136: TGGTTGTAGTAGCGGAGCGC (서열번호 136)
시발체 137: AGTCTGTGTGTTGGTCTTGG (서열번호 137)
시발체 138: GTCTGTGTGTTGGTCTTGTAG (서열번호 138)
시발체 139: TGGTCTTGGAGATCTGTGTCTC (서열번호 139)
시발체 140: GTTCCGCAGGCTCTCTCGGTA (서열번호 140)
시발체 141: GTTGTAGTAGCGGAGCGCGG (서열번호 141)
시발체 142: TTGTAGTAGCCGCGCAGGT (서열번호 142)
시발체 143: GGAGCCACTCCACGCACGT (서열번호 143)
시발체 144: CCCAATACTCCGGCCCCTCT (서열번호 144)
시발체 145: CACGTGCCCTCCAGGTAGGT (서열번호 145)
시발체 146: GGAGCCACTCCACGCACAG (서열번호 146)
시발체 147: CGCTCTGGTTGTAGTAGCG (서열번호 147)
시발체 148: CGCTCTGGTTGTAGTAGCC (서열번호 148)
<실시예 2> 증폭 유무를 측정하기 위한 형광 탐침자의 제조
HLA-A, B, DRB1 유전자의 증폭유무를 측정하기 위하여 보편적인 형광탐침자를 12종류 작재하고 양성대조군 표준유전자 증폭 유무를 측정할 수 있는 보편적인 형광탐침자 1종류를 작재하였다. 각 형광탐침자에 사용한 염기 서열과 형광물질은 다음과 같다:
HLA-A 형광탐침자1: FAM 5'-CGT GGA TAG AGC AGG AGG GGC CGG AGT 3' BHQ1(서열번호 151)
HLA-A 형광탐침자2: FAM 5'-CGA CAC GCA GTT CGT GCG GTT CGA CAG C 3' BHQ1(서열번호 152)
HLA-A 형광탐침자3: FAM 5'-CCC TGC GCG GCT ACT ACA ACC AGA GC 3' BHQ1(서열번호 153)
HLA-A 형광탐침자4: FAM 5'-TGA AGG CCC ACT CAC AGA CTG ACC GA 3' BHQ1(서열번호 154)
HLA-A 형광탐침자5: FAM 5'-AGG ACC TGC GCT CTT GGA CCG CGG CGG AC 3' BHQ1(서열번호 155)
HLA-B 형광탐침자1: Cy5 5'-CAA RGA TTA CAT CGC CCT GAA CGA GGA CC 3' BHQ1(서열번호 156)
HLA-B 형광탐침자2: Cy5 5'-AGA GCA RGA GGG GCC GGA RTA TTG GGA C 3' BHQ1(서열번호 157)
HLA-B 형광탐침자3: Cy5 5'-TGG AGT GGC TCC GCA GAT ACC TGG AGA ACG 3' BHQ1(서열번호 158)
HLA-B 형광탐침자4: Cy5 5'-CGT GAG GTT CGA CAG CGA CGC CGC GAG TCC 3' BHQ1(서열번호 159)
HLA-B 형광탐침자5: Cy5 5'-CCC GGC CGC GGG GAG CCC CGC TTC ATC 3' BHQ1(서열번호 160)
HLA-DRB1 형광탐침자1: FAM 5'-CGC TTC GAC AGC GAC GTG GGG GAG TWC CG 3' BHQ1(서열번호 161)
HLA-DRB1 형광탐침자2: FAM 5'-TCA TTT CTT CAA CGG GAC GGA GCG GGT GC 3' BHQ1(서열번호 162)
양성대조군 표준유전자 형광탐침자 2: Cyanine 3 5'-CCA CAC AGA ACT AAC CTC CAA CCA ACA ATC AGC 3'BHQ2(서열번호 163)를 작재하였다.
<실시예 3> 실시간 중합효소연쇄반응을 이용한 HLA-A, B, DRB1 대립 유전자 형별
혈액에서 분리한 DNA를 2mM dATP, dGTP, dCTP, dTTP와 HLA-A, B, DRB1 대립유전자를 증폭할 수 있는 특이 시발체 쌍과 양성대조군 표준유전자를 증폭하기 위한 시발체 쌍, 증폭 유무를 측정하기 위한 HLA-A, B, DRB1 형광탐침자, 양성대조군 표준유전자 형광탐침자, 중합반응 완충용액, 중합반응효소, DNA를 넣고 실시간 중합효소연쇄반응 기기를 이용하여 96에서 1분간 1회, 1단계로 변성(denaturation, 95℃에서 25초), 결합(annealing, 70℃에서 45초) 및 연장(extension, 72℃에서 30초) 을 5회 실시하고, 2단계로 변성(denaturation, 95℃에서 25초), 결합(annealing, 70℃에서 45초) 및 연장(extension, 72℃에서 30초) 을 30회 실시하여 총 35회 실시하고 실시간 증폭 유무 측정은 2단계 72℃에서 30초 되는 단계에서 측정하였다. 실시간 중합효소연쇄반응 기기에서의 증폭 유무 측정은 FAM은 490 nm에서, Cyanine 3은 532 nm, cyanine 5은 670 nm 로 측정하였다.
이때 사용된 특이 시발체의 농도는 각각 1.0 M로 실시하였고 양성대조군은 0.5 M로 사용하였다. 또한 사용한 중합효소 연쇄반응 완충용액은 트리스염기(Tris base) 67 mM, 암모늄 설페이트(ammonium sulphate) 16.6 mM Tween 0.1%, MgCl2 0.2 mM이다. 사용된 dNTP농도는 0.2 mM로 사용하였고 Taq 폴리머라아제(GLS)를 사용하였다. 사용된 real time PCR 기기는 ABI 7500의 제품을 사용하였다.
도 3에 나타난 바와 같이, 시작점이 측정된 튜브의 번호는 A1(HLA-A CT값 : 23.383, IC CT값 : 25.039), A3(HLA-A CT값 : 22.186, IC CT값 : 27.259), A10(HLA-B CT값: 22.092, IC CT값: 22.092), B3(HLA-A CT값 : 20.735, IC CT값 : 24.040), B4(HLA-A CT값 : 22.013, HLA-B CT값 : 28.033, IC CT값 : 26.093), C4(HLA-DR CT값 : 23.597, IC CT값 : 25.301), C10 (HLA-DR CT값 : 24.170, IC CT값 : 25.495), D7 (HLA-B CT값 : 23.106, IC CT값 : 26.308), D8 (HLA-DR CT값 : 21.199, IC CT값 : 26.180), D9 (HLA-B CT값 : 22.568, HLA-DR CT값 : 22.433, IC CT값 : 25.708), D11 (HLA-B CT값 : 22.735, IC CT값 : 24.678)이 측정되었고 그 외 튜브에서는 IC 유전자에서만 CT값이 20~28사이로 측정되었다. 이를 분석표 도1을 보고 분석하면 HLA-A 유전자에서 A1, A3, B3, B4 튜브가 증폭되어 HLA-A*01, HLA-A*03으로 판명되었고, HLA-B 유전자에서 보면 A10, B4, D7, D9, D11 튜브가 증폭되어 HLA-B*44, HLA-B*57, HLA-Bw4 양성으로 판명되고, C4, C10, C12, D8, D9 튜브가 증폭되어 HLA-DRB1*07, HLA-DRB1*13, HLA-DRB3 양성, HLA-DRB4 양성으로 판명되었다.
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Claims (9)

  1. HLA-A, HLA-B 및 HLA-DRB로 이루어진 군에서 선택된 2 이상의 유전자에 대한 HLA 대립유전자를 실시간 PCR에 의해 특이적으로 증폭할 수 있는 시발체 세트; 및
    상기 실시간 PCR에 의해 증폭된 산물을 탐침 할 수 있는 탐침자 세트를 포함하는 HLA 대립유전자 형별 키트.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 탐침자 세트는 유전자 종류의 구별이 가능하도록 다른 색을 발광하는 2 이상의 형광탐침자인 것을 특징으로 하는 키트.
  3. 제 1 항에 있어서,
    상기 HLA 유전자의 대립유전자는
    HLA-A*01, A*02, A*03, A*11, A*23, A*24, A*25, A*26, A*29, A*30, A*31, A*32, A*33, A*34, A*36, A*43, A*66, A*68, A*69, A*74, A*80;
    B*07, B*08, B*13, B*14, B*15(B62), B*15(63), B*15(70), B*15(71), B*15(72), B*15(75), B*15(76), B*15(77), B*15, B*18, B*27, B*35, B*37, B*38, B*39, B*40, B*40(B60), B*40(B61), B*41, B*42, B*44, B*45, B*46, B*47, B*48, B*49, B*50, B*51, B*52, B*53, B*54, B*55, B*56, B*57, B*58, B*59, B*67, B*78, B*81, B*82, B*83, Bw4, Bw6;
    DRB1*01, DRB1*15, DRB1*16, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*11, DRB1*12, DRB1*13, DRB1*14, DRB1*07, DRB1*08, DRB1*09, DRB1*10, DRB3, DRB4, 및 DRB5로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 HLA 대립유전자 형별 키트.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서,
    상기 시발체는 HLA 대립유전자의 다양성을 나타내는 위치를 기점으로 17 내지 24 nt의 길이로 작재한 것을 특징으로 하는 키트.
  6. 제 2 항에 있어서,
    상기 형광탐침자는 HLA-A 대립유전자의 증폭 유무를 검출할 수 있는 서열번호 151, 152, 153, 154 또는 155에 기재된 서열을 갖는 형광탐침자;
    HLA-B 대립유전자의 증폭 유무를 검출할 수 있는 서열번호 156, 157, 158, 159 또는 160에 기재된 서열을 갖는 형광탐침자;
    HLA-DRB1 대립유전자의 증폭 유무를 검출할 수 있는 서열번호 161 또는 162에 기재된 서열인 것을 특징으로 하는 키트.

  7. 제 1 항에 있어서,
    양성대조군 유전자를 증폭하기 위한 시발체 및 양성대조군 유전자의 증폭 유무를 탐지하기 위한 형광탐침자를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
  8. 제 7 항에 있어서,
    대조군 유전자를 증폭하기 위한 시발체는 서열번호 149 및 150에 기재된 서열을 갖고, 대조군 유전자의 증폭 유무를 탐지하기 위한 형광탐침자는 서열번호 163에 기재된 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 키트.
  9. 시료로부터 DNA를 추출 정제하는 단계;
    상기 정제된 DNA를 대상으로 제 1 항에 따른 키트를 사용하여 실시간 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하는 단계; 및
    실시간 PCR 결과를 판독하여 HLA 대립유전자를 형별하는 단계를 포함하는, HLA 대립유전자의 형별 방법.
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KR20190059780A (ko) * 2017-11-23 2019-05-31 (주)오상헬스케어 실시간 중합 효소 연쇄 반응을 이용한 ｈｌａ 대립유전자 검사 키트

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