JP6233022B2 - Ｈｌａ−ａ＊２４グループの判定方法 - Google Patents

Description

本発明は、ＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*２４グループか否かを判定する方法に関する。
本願は、２０１１年１２月２８日に、日本に出願された特願２０１１−２８９３３６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

ＨＬＡ（Ｈｕｍａｎ Ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ Ａｎｔｉｇｅｎ）は、第６染色体短腕部に存在するＭＨＣ(Ｍａｊｏｒ Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ Ｃｏｍｐｌｅｘ) 領域にコードされた遺伝子群の遺伝子産物である。ＨＬＡは非常に多様性に富んでおり、特に造血幹細胞の移植や輸血等の医療現場の作業においては、ＨＬＡの適合度を向上させることが重要である。このため、できるだけ少ない労力で正確なＨＬＡタイピングを行うことが、医療現場で要求されている。

ＨＬＡタイピングの方法は、血清学的タイピング方法とＤＮＡタイピング方法とに大別される。ＤＮＡタイピング方法では、血清学的タイピング方法と比較して詳細にＨＬＡ型を特定できる。但し、ＤＮＡタイピングの方法でも、ＤＮＡタイピング結果では判別出来ないアリルが２種類以上存在し、正確にＨＬＡ型を特定することができない、というアンビギュイティ（Ａｍｂｉｇｕｉｔｙ）の問題が生じる場合がある。

例えば、特許文献１には、ＨＬＡ−Ａ抗原のサブタイプ（型）を遺伝子レベルでタイピングする方法が開示されている。具体的には、ＨＬＡ−Ａ対立遺伝子（アリル）を特定のグループに分類し、各グループのＨＬＡ−Ａアリルを特異的に増幅可能なプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られたＰＣＲ産物に対してＲＦＬＰ法、ＰＣＲ−ＲＦＬＰ法、ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＯＰ法、ＰＣＲ−ＳＳＰ法又はＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を行うことにより、ＨＬＡ−Ａ型をタイピングする。当該方法のように多段階のアッセイによって、アンビギュイティを解消し、ＨＬＡ−Ａ型を詳細にタイピングできることが期待されるが、多大な労力を有する、という問題がある。

また、ＨＬＡ型の分布は人種によって異なっている。特定非営利活動法人ＨＬＡ研究所の報告によれば、日本人５５３８家族２１７０５人のタイピング結果（２０１１年１２月１９日現在）では、日本人のＨＬＡ−Ａ型の遺伝子頻度は、表１に示すように、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２型が３５．９３６％で最も高い（例えば、非特許文献１参照。）。

特開平１１−２１６０００号公報

"アリル頻度検索 １座／Ａ検索"［ｏｎ ｌｉｎｅ］、特定非営利活動法人ＨＬＡ研究所、［平成２３年１２月１９日検索］、インターネット<URL: http://www.hla.or.jp/haplo/haplo_search.php?type=aril&loci=A&lang=ja>

本発明は、ＨＬＡ−Ａ*２４グループのタイピングを、アンビギュイティが少なく、かつ簡便に判定するための方法を提供することを目的とする。

本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡ（アデニン）を第１番目として、（ａ）第２１１番目の塩基と、（ｂ）第３９５番目の塩基とのタイピング結果に基づくことにより、非常に少ない工程で、アンビギュイティを充分に少なくして高精度に、ＨＬＡ−Ａ*２４グループのアリルを判定できることを見出し、本発明を完成させた。

すなわち、本発明は、
（１） ＨＬＡ−Ａ*２４グループを判定する方法であって、
被験者のゲノムＤＮＡ中の、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡ（アデニン）を第１番目として、（ａ）第２１１番目の塩基及び（ｂ）第３９５番目の塩基のみのタイピング結果に基づいて判定することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法、
（２） ＨＬＡ−Ａ*２４グループを判定する方法であって、
被験者のゲノムＤＮＡ中の、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡ（アデニン）を第１番目として、（ａ）第２１１番目の塩基と、（ｂ）第３９５番目の塩基と、（ｃ）第４３７番目の塩基、第４４１番目の塩基、第４４３番目の塩基、第４４４番目の塩基、第４４７番目の塩基、及び第４４９番目の塩基からなる群より選択される１以上の塩基とのタイピング結果に基づいて判定することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法、
（３） 前記被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*２４：０２であるか否かを判定することを特徴とする前記（２）のＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法、
（４） 少なくとも１のアリルにおいて、第２１１番目の塩基がＣ（シトシン）であり、第３９５番目の塩基がＧ（グアニン）であり、前記（ｃ）の塩基について、第４３７番目の塩基を含む場合に当該塩基がＣであり、第４４１番目の塩基を含む場合に当該塩基がＴ（チミン）であり、第４４３番目の塩基を含む場合に当該塩基がＧであり、第４４４番目の塩基を含む場合に当該塩基がＣであり、第４４７番目の塩基を含む場合に当該塩基がＴであり、第４４９番目の塩基を含む場合に当該塩基がＣである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*２４：０２であると判定することを特徴とする前記（３）のＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法、
（５） 前記（ａ）及び（ｂ）の塩基のタイピングを、シークエンス解析又は一塩基検出方法により行うことを特徴とする前記（１）〜（４）のいずれか一つのＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法、
（６） 前記（ｃ）の塩基のタイピングを、シークエンス解析又は一塩基検出方法により行うことを特徴とする前記（２）〜（５）のいずれか一つのＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法、
（７） 前記（ｃ）の塩基のタイピングを、配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応により、伸長産物が得られた場合に、第４３７番目の塩基がＣであり、第４４１番目の塩基がＴであり、第４４３番目の塩基がＧであり、第４４４番目の塩基がＣであり、第４４７番目の塩基がＴであり、第４４９番目の塩基がＣであるとタイピングすることを特徴とする前記（２）〜（５）のいずれか一つのＨＬＡ−Ａ＊２４グループの判定方法、
（８） 配列番号７に示す塩基配列からなるＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定用プライマーを含むことを特徴とするＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定用キット、
を提供するものである。

本発明のＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法により、ＨＬＡ−Ａ*２４グループのタイピングを精度よくかつより簡便に判定することができる。本発明のＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法は、特に日本人において遺伝子頻度の高いＨＬＡ−Ａ*２４グループのアリルを高精度に判定できるため、被験者が日本人である場合の判定に特に好適である。

ＨＬＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列中、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として、−３００番目の塩基から６００番目の塩基までを示した図である。 ＨＬＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列中、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として、６０１番目の塩基から１５００番目の塩基までを示した図である。 ＨＬＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列中、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として、１５０１番目の塩基から２４００番目の塩基までを示した図である。 ＨＬＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列中、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として、２４０１番目の塩基から３２０２番目の塩基までを示した図である。 ＨＬＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの第２エキソン中の第２１１番目の塩基（図中、「（ａ）」）及びその付近、第３９５番目の塩基（図中、「（ｂ）」）及びその付近、並びに第４３７番目〜第４４９番目の塩基（図中、「（ｃ）」）及びその付近の各アリルの塩基配列を示した図である。 （ａ）〜（ｃ）の塩基のタイピング方法の一態様を模式的に示した図である。 （ａ）〜（ｃ）の塩基のタイピング方法の一態様を模式的に示した図である。

本発明及び本願明細書において、「塩基をタイピングする」とは、当該塩基が、Ａ（アデニン）であるか、Ｇ（グアニン）であるか、Ｃ（シトシン）であるか、Ｔ（チミン）であるかを特定することを意味する。

本発明のＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法（以下、「本発明の判定方法」ということがある。）は、ＨＬＡ−Ａ*２４グループのアリルを判定する方法であって、被験者のゲノムＤＮＡ中の、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として、（ａ）第２１１番目の塩基と、（ｂ）第３９５番目の塩基とのタイピング結果に基づいて判定することを特徴とする。

また、本発明の判定方法では、前記（ａ）の塩基と前記（ｂ）の塩基のタイピング結果に加えて、さらに（ｃ）第４３７番目の塩基、第４４１番目の塩基、第４４３番目の塩基、第４４４番目の塩基、第４４７番目の塩基、及び第４４９番目の塩基からなる群より選択される１以上の塩基のタイピング結果に基づいてもよい。なお、第４３７番目の塩基、第４４１番目の塩基、第４４３番目の塩基、第４４４番目の塩基、第４４７番目の塩基、及び第４４９番目の塩基は連鎖しているため、第４３７番目の塩基、第４４１番目の塩基、第４４３番目の塩基、第４４４番目の塩基、第４４７番目の塩基、及び第４４９番目の塩基については、これらのうちの少なくとも１の塩基をタイピングすればよい。また、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２を特徴付けるＳＮＰ（Ｓｉｎｇｌｅ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）であれば上記に限定されないが、アリル頻度が０．００１％以上で存在するＨＬＡ−Ａグループと区別できる塩基であることが好ましい。

図１に、ＨＬＡ遺伝子のゲノムＤＮＡの塩基配列（配列番号１）を示す。図１Ａ〜Ｄ中、四角で囲われた領域がコーディング領域であり、各塩基の番号は、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡを第１番目として振られている。第２１１番目の塩基（Ｃ）、第３９５番目の塩基（Ｇ）、第４３７番目の塩基（Ｃ）、第４４１番目の塩基（Ｔ）、第４４３番目の塩基（Ｇ）、第４４４番目の塩基（Ｃ）、第４４７番目の塩基（Ｔ）、及び第４４９番目の塩基（Ｃ）は、網掛けしている。また、配列番号２に、ＨＬＡ遺伝子のコーディング領域の塩基配列と対応するアミノ酸配列を示す。

これらの塩基は、いずれも第２エキソンに存在する。図２に、第２エキソン中の第２１１番目の塩基（図中、「（ａ）」）及びその付近、第３９５番目の塩基（図中、「（ｂ）」）及びその付近、並びに第４３７番目〜第４４９番目の６塩基（図中、「（ｃ）」）及びその付近の各アリルの塩基配列を示す。図中の各アリルの塩基において、「−」はＨＬＡ−Ａ*２４：０２と相同な塩基であることを示す。

各アリルの日本人における遺伝子頻度及び前記（ａ）〜（ｃ）の塩基を表２に示す。なお、（ｃ）の塩基としては、第４３７番目の塩基を用いた。また、表２中、「他」は、表２に具体的に示したＨＬＡ−Ａ型以外の残りの全てのＨＬＡ−Ａ型を意味する。

少なくとも１のアリルにおいて、第２１１番目の塩基（前記（ａ））がＡ又はＣであり、第３９５番目の塩基（前記（ｂ））がＧ又はＣであり、かつ第２１１番目の塩基と第３９５番目の塩基がいずれもがＣではない場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ^＊２４グループであると判定する。

被験者のゲノムＤＮＡに含まれるＨＬＡ遺伝子中の前記（ａ）及び（ｂ）の塩基をタイピングし、得られたタイピング結果に基づいて当該被験者のＨＬＡ−Ａ型を判定した場合の判定結果と、実際の遺伝子型とを、遺伝子頻度と共に表３に示す。表３中、「Ａ」欄はアリルタイプ（ＨＬＡ−Ａ型）を示し、「他」は表２と同じ意味である。また、「タイプ」欄の「＋」はＨＬＡ−Ａ*２４グループのアリルを含むゲノムＤＮＡを、「−」はＨＬＡ−Ａ*２４グループのアリルを含まないゲノムＤＮＡを示す。また、「（ａ）」欄に少なくとも１のＡ又はＣがあり、「（ｂ）」欄に少なくとも１のＧ又はＣがある場合（但し、「（ａ）」欄がＣのみであり（両アリルが共にＣである）、かつ「（ｂ）」欄がＣのみである場合を除く。）に、当該ゲノムＤＮＡはＨＬＡ−Ａ*２４グループのアリルを含むと判定し（すなわち、「判定」欄を「＋」）、それ以外の場合に、当該ゲノムＤＮＡはＨＬＡ−Ａ*２４グループのアリルを含まないと判定した（すなわち、「判定」欄を「−」）。さらに、「タイプ」欄と「判定」欄が一致する場合に「正誤」欄を「○」とし、不一致の場合に「×」とした。「遺伝子頻度」は、各アリルの遺伝子頻度の積とした（例えば、Ａ*２４：０２のホモタイプの場合には、３５．９３６％×３５．９３６％＝１２．９１％）。表３に示すように、本発明の判定方法では、前記（ａ）及び（ｂ）の塩基についてのタイピング結果のみに基づいて、被験者のゲノムＤＮＡ中にＨＬＡ−Ａ*２４グループのアリルが含まれているかどうかを、非常に精度よく判定することができる。

また、表２に示すように、ＨＬＡ−Ａ*２４グループのうち、ＨＬＡ−Ａ*２４：０４以外は、前記（ｃ）の塩基が、ＨＬＡ−Ａ*２４グループ以外のアリルと相違する。そこで、前記（ａ）及び（ｂ）の塩基についてのタイピング結果に加えて、前記（ｃ）の塩基のタイピング結果を用いてもよい。

被験者のゲノムＤＮＡ中にＨＬＡ−Ａ*２４グループのアリルが含まれているかどうかの判定には、前記（ａ）及び（ｂ）の塩基についてのタイピング結果のみで充分であるが、さらにその他の塩基のタイピング結果を併用することにより、より詳細にＨＬＡ型を判定することができる。例えば、前記（ａ）及び（ｂ）の塩基についてのタイピング結果に加えて、さらに前記（ｃ）の塩基のタイピング結果を用いることにより、ＨＬＡ−Ａ*２４グループのうちのＨＬＡ−Ａ*２４：０２を、より精度よく判定することができる。ＨＬＡ−Ａ*２４：０２は日本人で最も遺伝子頻度の高いため、当該態様は、特に被験者が日本人である臨床検査等に特に有用である。

具体的には、少なくとも１のアリルにおいて、これらの塩基がいずれもＨＬＡ−Ａ*２４：０２と同じである場合、すなわち、第２１１番目の塩基がＣであり、第３９５番目の塩基がＧであり、第４３７番目の塩基がＣであり、第４４１番目の塩基がＴであり、第４４３番目の塩基がＧであり、第４４４番目の塩基がＣであり、第４４７番目の塩基がＴであり、第４４９番目の塩基がＣである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ^＊２４：０２であると判定する。なお、第４３７番目の塩基がＣの場合、常に、第４４１番目の塩基はＴであり、第４４３番目の塩基はＧであり、第４４４番目の塩基はＣであり、第４４７番目の塩基はＴであり、第４４９番目の塩基はＣである。つまり、本発明の判定方法では、３つの塩基についてのタイピング結果に基づいて、被験者のゲノムＤＮＡ中にＨＬＡ−Ａ*２４：０２が含まれているかどうかを判定することができる。

表２に示すように、前記（ａ）〜（ｃ）の塩基のタイピング結果は、ＨＬＡ−Ａ*２４：０７、ＨＬＡ−Ａ*２４：０３、及びＨＬＡ−Ａ*２４：２５がＨＬＡ−Ａ*２４：０２と同じであるが、その他のＨＬＡ−Ａ型のアリルはＨＬＡ−Ａ*２４：０２と相違する。
つまり、前記（ａ）〜（ｃ）の塩基のタイピング結果からは、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２は、ＨＬＡ−Ａ*２４：０７、ＨＬＡ−Ａ*２４：０３、及びＨＬＡ−Ａ*２４：２５と判別不可能であるが、その他の型のアリルとは判別可能である。

被験者のゲノムＤＮＡに含まれるＨＬＡ遺伝子中の前記（ａ）〜（ｃ）の塩基をタイピングし、得られたタイピング結果及び表４に示す判定規準に基づいて当該被験者のＨＬＡ−Ａ型を判定した場合の判定結果と、実際の遺伝子型とを、遺伝子頻度と共に表５に示す。表５中、「Ａ」欄はアリルタイプ（ＨＬＡ−Ａ型）を示し、「他」は表２と同じ意味である。また、「タイプ」欄の「＋」はＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含むゲノムＤＮＡを、「−」はＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含まないゲノムＤＮＡを示す。表４及び５において、「判定」欄の「＋」は被験者のゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含むと判定することを、「−」は被験者のゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含まないと判定することを示す。すなわち、「（ａ）」欄に少なくとも１のＣがあり、「（ｂ）」欄に少なくとも１のＧがあり、「（ｃ）」欄に少なくとも１のＣがあり、かつ「（ａ）」欄にＡがある場合には「（ｃ）」欄にＧがない場合に、当該ゲノムＤＮＡはＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含むと判定し（すなわち、「判定」欄を「＋」）、「（ａ）」欄にＣがない場合と、「（ｂ）」欄にＧがない場合と、「（ｃ）」欄にＣがない場合と、「（ａ）」欄に少なくとも１のＡがあり、「（ｂ）」欄に少なくとも１のＧがあり、「（ｃ）」欄に少なくとも１のＧがある場合に、当該ゲノムＤＮＡはＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含まないと判定した（すなわち、「判定」欄を「−」）。さらに、「タイプ」欄と「判定」欄が一致する場合に「正誤」欄を「○」とし、不一致の場合に「×」とした。

前記（ａ）〜（ｃ）塩基のタイピング結果からは、被験者が、表５中の「正誤」欄が×のゲノムＤＮＡを有する場合には、実際にはＨＬＡ−Ａ*２４：０２が含まれていないにもかかわらず、当該被験者はＨＬＡ−Ａ*２４：０２を有すると誤って判定してしまう（偽陽性）。しかしながら、日本人においては、これらの偽陽性となるゲノムＤＮＡの遺伝子頻度はいずれも極めて低く、偽陽性と判定される被験者の割合はわずか０．０５％にまで抑えられる。例えば、本発明の判定方法のうち、前記（ａ）及び（ｂ）に加えて前記（ｃ）の塩基のタイピング結果を用いて、被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*２４：０２であるか否かを判定する方法（以下、「本発明のＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定方法」ということがある。）を日本人１００万人に対して実施した場合、たった３塩基のタイピング結果に基づくにも関わらず、表６に示すように、理論的には、偽陰性は０人であり、偽陽性は５３０人と非常に少なくなる。

ＨＬＡ−Ａのアリルの多くは、複数の多型の組み合わせに係るものであるため、アリル中の他のアリルと異なる部位（多型部位）の一部分のみをタイピングした場合には、複数のアリルを互いに判別することが難しい。ある特定のアリルの判定を目的とする検査を行う場合、アンビギュイティが発生していると、実際には目的のアリルではないアリルであっても、当該目的のアリルである、と判定されてしまう（偽陽性）。アンビギュイティを全て解消することによりこの偽陽性の問題を解消し得るが、アンビギュイティを全て解消するためには非常に多数の塩基をタイピングする必要があり、検査コストが過大となる。
つまり、ＨＬＡ判定方法を臨床検査等の医療現場に適用するためには、検査精度とコストのバランスを図ることが重要となる。

本発明のＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定方法では、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２を判定するために、遺伝子頻度を加味してアンビギュイティによる偽陽性の発生確率をできるだけ小さくし、かつタイピングすべき塩基の数も最小限にするように、タイピングに用いる塩基を特定している。つまり、本発明のＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定方法は、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２の判定精度が高く、かつ検査コストの点からも優れているため、臨床検査等にも好適である。

仮に、前記（ａ）及び（ｂ）の塩基のタイピング結果のみで判定した場合には、表７に示すように、遺伝子頻度の高い「ＨＬＡ−Ａ*２４：２０と他（表２に記載されたアリル以外のアリル）」である被験者が、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含むと誤って判定されてしまう。この結果、偽陽性の確率が０．９７％と大きくなり、日本人１００万人に検査した時に、理論上、９，７４９人もが偽陽性と判定されてしまう。この試算からも、本発明のＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定方法の判定精度が優れていることが明らかである。

本発明の判定方法に供される核酸サンプルとしては、被験者のゲノムＤＮＡの前記（ａ）及び（ｂ）の塩基（本発明のＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定方法の場合、被験者のゲノムＤＮＡの前記（ａ）〜（ｃ）の塩基）を含む領域の塩基配列が反映されている核酸が含まれていればよく、被験者由来のゲノムＤＮＡであってもよく、ｍＲＮＡであってもよい。
ｍＲＮＡ中の各塩基のタイピングは、ｍＲＮＡを直接タイピングしてもよく、ｍＲＮＡから逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを用いて行ってもよい。被験者由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡは、被験者から採取された生体試料から抽出・精製された核酸であってもよく、精製前の核酸であってもよい。さらに、被験者由来のゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ中の前記（ａ）及び（ｂ）の塩基を含む領域又は前記（ａ）〜（ｃ）の塩基を含む領域をＰＣＲ等により増幅して得られた増幅産物であってもよい。

本発明の判定方法において、前記（ａ）〜（ｃ）の塩基のタイピング方法は特に限定されるものではなく、サンガー法を基礎とするシークエンス解析法であってもよく、一塩基検出方法であってもよい。一塩基検出方法としては、遺伝子の変異や多型の検出等において用いられる公知の各種手法、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＯ(ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ)法、ＰＣＲ−ＳＳＰ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃ プライマー)法や、それらを改変した方法等を用いることができる。ＰＣＲ−ＳＳＯ法は、特定のアリルと特異的にハイブリダイズするプローブ（アリル特異的プローブ）を用いて、当該プローブとの会合体形成の有無によりタイピングする方法である。ＰＣＲ−ＳＳＰ法は、特定のアリルと特異的にハイブリダイズするプライマー（アリル特異的プローブ）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無によりタイピングする方法である。これらを改変した方法としては、例えば、インベーダー法やＴａｑｍａｎプローブ法、ＱＰｒｏｂｅ法、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ−ＡＲＭＳ法等が挙げられる。検出感度に優れているため、蛍光を利用して検出する方法であることが好ましく、検出感度及び精度に優れているため、インベーダー法やＴａｑｍａｎプローブ法、ＱＰｒｏｂｅ法、Ｓｃｏｒｐｉｏｎ−ＡＲＭＳ法等のように、特定のアリルを認識するプローブやプライマーを用いる方法であることが好ましい。前記（ａ）〜（ｃ）の塩基のタイピングに用いられるプローブやプライマーは、例えば、塩基配列１又は２に基づき、常法により設計し、合成することができる。

シークエンス解析法によりタイピングする場合、例えば、図３に示すように、被験者から抽出されたゲノムＤＮＡ又はｍＲＮＡ（以下、単に「ゲノムＤＮＡ」ということがある。）を鋳型として、前記（ａ）の塩基を挟む領域を増幅するＰＣＲプライマー（図３中、プライマー−１及びプライマー−２）を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列を解析することによって、前記（ａ）の塩基をタイピングすることができる。同様に、前記（ｂ）及び（ｃ）の塩基を挟む領域を増幅するＰＣＲプライマー（図３中、プライマー−３及びプライマー−４）を用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列を解析することによって、前記（ｂ）及び（ｃ）の塩基をタイピングすることができる。図３の（ｃ）にある６塩基は、上流から第４３７番目の塩基、第４４１番目の塩基、第４４３番目の塩基、第４４４番目の塩基、第４４７番目の塩基、及び第４４９番目の塩基を示す。
プライマー−１〜４としては、前記（ａ）〜（ｃ）の各塩基を含む目的の領域を増幅し得るプライマーであれば特に限定されるものではない。例えば、表８に示す塩基配列からなるプライマーが挙げられる。なお、前記（ａ）及び（ｂ）の塩基のみをシークエンス解析法によりタイピングする場合には、前記（ｃ）の塩基は含まず、かつ前記（ｂ）の塩基を含む領域を増幅するＰＣＲプライマーを用いてＰＣＲを行い、得られた増幅産物の塩基配列を解析してもよい。

また、塩基のタイピングは、シークエンス解析法と一塩基検出方法とを組み合わせて行ってもよい。例えば、前記（ａ）〜（ｃ）の塩基のいずれかを、ＨＬＡ−Ａ*２４グループのアリルと特異的にハイブリダイズするプライマーを用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無によりタイピングし、残る塩基をシークエンス解析によりタイピングしてもよい。

なお、「ある特定のアリルに特異的にハイブリダイズするプライマー」は、標的とするアリルと完全に相補的な塩基配列を有するプライマーに限定されず、その他のアリルよりも標的とするアリルに優先的にハイブリダイズするプライマーであればよく、標的とするアリルとハイブリダイズする領域内に１〜数塩基のミスマッチ塩基を含んでいてもよい。

本発明のＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定方法では、例えば、前記（ａ）〜（ｃ）の塩基のいずれかを、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２と特異的にハイブリダイズするプライマー（ＨＬＡ−Ａ*２４：０２特異的プライマー）を用いてＰＣＲを行い、ＰＣＲ産物の有無によりタイピングし、残る塩基をシークエンス解析によりタイピングしてもよい。

例えば、図４に示すように、被験者から抽出されたゲノムＤＮＡを鋳型として、前記（ｃ）の６塩基を含む領域と特異的にハイブリダイズするプライマー（図４中、プライマー−５）と、前記（ｂ）の塩基の上流の領域を認識するプライマー（図４中、プライマー−３）とを用いて、ＰＣＲ等のポリメラーゼによる伸長反応を行い、ＰＣＲ産物の有無を調べ、かつ当該ＰＣＲ産物の塩基配列を解析することによって、前記（ｂ）及び（ｃ）の塩基をタイピングすることができる。前記（ａ）の塩基のタイピングは、図３と同様にして実施することができる。

図３に示すタイピング方法の場合には、ゲノムＤＮＡに含まれているＨＬＡ遺伝子の多くのアリルが鋳型となってＰＣＲ産物が得られる。このため、ＨＬＡ遺伝子がヘテロタイプの場合、前記（ａ）〜（ｃ）の塩基は、タイピング方法によっては、２種類の塩基がタイピングされる場合があり、（ａ）〜（ｃ）のタイピング結果を用いても誤判定になる場合がある。これに対して、図４に示すタイピング方法のように、（ｃ）の６塩基を含む領域をプライマーで識別したうえで（ｂ）の塩基をシークエンス解析法等によりタイピングした場合には、（ｂ）の塩基と（ｃ）の塩基を総合した結果が得られる。すなわち、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含むグループに特異的なプライマーを用いて増幅する場合には、ゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含むヘテロタイプであった場合でも、（ａ）及び（ｂ）の塩基の検出のみにより、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２のタイピングを、図３のタイピング方法よりも精度よくかつより簡便に判定できる。

プライマー−５としては、前記（ｃ）の６塩基の少なくとも１塩基を含む領域に特異的にハイブリダイズし得るプライマーであれば特に限定されない。ＨＬＡ−Ａ*２４：０２特異的プライマーとして用いられるものとしては、例えば、表９に示す塩基配列からなるプライマー−５が挙げられる。表９に示すプライマー−６〜８も、プライマー−５と同様に、前記（ｃ）の塩基をタイピングするためのＨＬＡ−Ａ*２４：０２特異的プライマーとして用いることができる。

図４に示す場合のように、ＰＣＲ産物の有無によりタイピングする場合には、ＰＣＲ産物が得られなかった場合に、鋳型としたゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*２４グループを含んでいなかったためか、それとも反応系自体に問題が生じていたためかの判断が難しい。そこで、ゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*２４グループを含んでいなかった場合に必ずＰＣＲ産物が得られるように設計されたプライマーを用いて、当該ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことも好ましい。本発明のＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定方法の場合も同様に、ゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含んでいなかった場合に必ずＰＣＲ産物が得られるように設計されたプライマーを用いて、当該ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行うことが好ましい。前記（ｃ）の塩基をタイピングするためのＨＬＡ−Ａ*２４：０２特異的プライマー（すなわち、第４３７番目の塩基がＣであり、第４４１番目の塩基がＴであり、第４４３番目の塩基がＧであり、第４４４番目の塩基がＣであり、第４４７番目の塩基がＴであり、第４４９番目の塩基がＣであるアリルと特異的にハイブリダイズするプライマー）によってはＰＣＲ産物が得られない場合に必ずＰＣＲ産物が得られるように設計されたプライマーとしては、例えば、表１０に示すようなプライマー−９〜１２が挙げられる。

前記（ａ）〜（ｃ）の塩基のタイピングに用いられるプローブやプライマーをキット化することにより、本発明の判定方法をより簡便に行うことができる。例えば、図３に示すプライマー−１〜４を組み合わせたものをＨＬＡ−Ａ*２４グループ判定用キットとすることができる。本発明においては、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２特異的プライマーであるプライマー−５を含むＨＬＡ−Ａ*２４グループ判定用キットとすることが好ましい。ＨＬＡ−Ａ*２４：０２特異的プライマーを含むキットは、ＨＬＡ−Ａ*２４：０２であるか否かの判定に好適に用いられる。

また、ＨＬＡ−Ａ*２４グループ判定用キットには、被験者から採取された生体試料から核酸を抽出・精製するための試薬や器具等を含ませることも好ましい。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。

［実施例１］
ＨＬＡ−Ａ型が［Ａ*２４：０２／Ａ*２４：０２］ホモタイプ、［Ａ*２４：０２／Ａ*２４：０８］のヘテロタイプ、［Ａ*２４：２０／Ａ*３２：０１］のヘテロタイプ、及び［Ａ*３２：０１／Ａ*２４：０４］のヘテロタイプである被験者から採取された生体試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、表８に示すプライマー−１及びプライマー−２を用いたＰＣＲと、プライマー−３及びプライマー−４を用いたＰＣＲとを行い、各ＰＣＲ産物についてシークエンス解析した。
シークエンス解析の結果及び、得られたタイピング結果に基づいて判定した結果を表１１に示す。表中、「判定」欄の「＋」はゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含むという判定を、「−」はゲノムＤＮＡがＨＬＡ−Ａ*２４：０２を含まないという判定を、それぞれ示す。この結果、Ａ＊２４：０２／Ａ*２４：０２］ホモタイプ、［Ａ*２４：０２／Ａ*２４：０８］のヘテロタイプ、及び［Ａ*３２：０１／Ａ*２４：０４］のヘテロタイプはいずれも正確に判定された。一方で［Ａ*２４：２０／Ａ*３２：０１］のヘテロタイプは、想定どおり、偽陽性となった。

［実施例２］
プライマー−４に代えて表９に示すプライマー−５を用いた以外は、実施例１と同様にして、ＨＬＡ−Ａ型が［Ａ*２４：０２／Ａ*２４：０２］ホモタイプ、［Ａ*２４：０２／Ａ*２４：０８］のヘテロタイプ、［Ａ*２４：２０／Ａ＊３２：０１］のヘテロタイプ、及び［Ａ*３２：０１／Ａ*２４：０４］のヘテロタイプである被験者から採取された生体試料から抽出したゲノムＤＮＡを鋳型として、ＰＣＲを行った。この結果、いずれのゲノムＤＮＡを鋳型とした場合でも、プライマー−３及びプライマー−５を用いたＰＣＲによってＰＣＲ産物が得られた。よって、全被験者のゲノムＤＮＡが、第４３７番目の塩基がＣであり、第４４１番目の塩基がＴであり、第４４３番目の塩基がＧであり、第４４４番目の塩基がＣであり、第４４７番目の塩基がＴであり、第４４９番目の塩基がＣである、とタイピングされた。各ＰＣＲ産物についてシークエンス解析したところ、表１２に示すように、実施例８と同様の判定結果となった。但し、［Ａ*３２：０１／Ａ*２４：０４］のヘテロタイプ由来のゲノムＤＮＡを用いた場合には、実施例１では（ｂ）の塩基はＣとＧの２種類がタイピングされたが、本実施例では（ｂ）の塩基はＣの１種類のみタイピングされた。

本発明の判定方法により、ＨＬＡ−Ａ*２４グループのタイピングを精度よくかつより簡便に判定できることから、臨床用遺伝子診断事業等の分野、特に細胞又は臓器移植のためのＨＬＡ型判定において利用が可能である。

Claims (8)

1. ＨＬＡ−Ａ*２４グループを判定する方法であって、
   被験者のゲノムＤＮＡ中の、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡ（アデニン）を第１番目として、（ａ）第２１１番目の塩基及び（ｂ）第３９５番目の塩基のみのタイピング結果に基づいて判定することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法。
2. ＨＬＡ−Ａ*２４グループを判定する方法であって、
   被験者のゲノムＤＮＡ中の、ＨＬＡ遺伝子の開始コドンのＡ（アデニン）を第１番目として、（ａ）第２１１番目の塩基と、（ｂ）第３９５番目の塩基と、（ｃ）第４３７番目の塩基、第４４１番目の塩基、第４４３番目の塩基、第４４４番目の塩基、第４４７番目の塩基、及び第４４９番目の塩基からなる群より選択される１以上の塩基とのタイピング結果に基づいて判定することを特徴とする、ＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法。
3. 前記被験者のＨＬＡ型がＨＬＡ−Ａ*２４：０２であるか否かを判定することを特徴とする請求項２に記載のＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法。
4. 少なくとも１のアリルにおいて、第２１１番目の塩基がＣ（シトシン）であり、第３９５番目の塩基がＧ（グアニン）であり、前記（ｃ）の塩基について、第４３７番目の塩基を含む場合に当該塩基がＣであり、第４４１番目の塩基を含む場合に当該塩基がＴ（チミン）であり、第４４３番目の塩基を含む場合に当該塩基がＧであり、第４４４番目の塩基を含む場合に当該塩基がＣであり、第４４７番目の塩基を含む場合に当該塩基がＴであり、第４４９番目の塩基を含む場合に当該塩基がＣである場合に、前記被験者のＨＬＡ型はＨＬＡ−Ａ*２４：０２であると判定することを特徴とする請求項３に記載のＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法。
5. 前記（ａ）及び（ｂ）の塩基のタイピングを、シークエンス解析又は一塩基検出方法により行うことを特徴とする請求項１〜４のいずれか一項に記載のＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法。
6. 前記（ｃ）の塩基のタイピングを、シークエンス解析又は一塩基検出方法により行うことを特徴とする請求項２〜５のいずれか一項に記載のＨＬＡ−Ａ*２４グループの判定方法。
7. 前記（ｃ）の塩基のタイピングを、配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーを用いたポリメラーゼによる伸長反応により、伸長産物が得られた場合に、第４３７番目の塩基がＣであり、第４４１番目の塩基がＴであり、第４４３番目の塩基がＧであり、第４４４番目の塩基がＣであり、第４４７番目の塩基がＴであり、第４４９番目の塩基がＣであるとタイピングすることを特徴とする請求項２〜５のいずれか一項に記載のＨＬＡ−Ａ＊２４グループの判定方法。
8. 配列番号７に示す塩基配列からなるＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定用プライマーを含むことを特徴とするＨＬＡ−Ａ*２４：０２判定用キット。

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