CN116970692A - 用于检测hla-b*15:11等位基因的探针引物组、试剂盒及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明实施例公开了用于检测HLA‑B*15:11等位基因的探针引物组、试剂盒及应用；探针引物组包括：特异性引物组及特异性探针和内标基因引物组及内标探针；特异性引物组及特异性探针包括：HLA‑B*15:11‑F，其碱基序列为SEQ ID NO：001；HLA‑B*15:11‑R，其碱基序列为SEQ ID NO：002；HLA‑B*15:11‑Probe，其碱基序列为SEQ ID NO：003；内标基因引物组及内标探针包括：TUBB‑F，其碱基序列为SEQ ID NO：004；TUBB‑R，其碱基序列为SEQ ID NO：005；TUBB‑probe，其碱基序列为SEQ ID NO：006。
Description
技术领域
本发明属于基因诊断技术领域，具体涉及用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组、试剂盒及应用。
背景技术
人类白细胞抗原(human leukocyte antigen，HLA)，是编码人类的主要组织相容性复合体(MHC)的基因，HLA基因位于6号染色体的短臂上(6p21.31)，包括一系列紧密连锁的基因座，由360万个碱基对组成，是目前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域，HLA基因包含I类、II类和Ⅲ类HLA基因，其中I类HLA基因包括HLA-A，HLA-B和HLA-C，与多种药物的药效和毒副作用相关，对HLA基因进行分型可以让医生根据基因型选择治疗药物，提高药物的有效性，避免不良反应的发生。
卡马西平是一种常见的精神类药物，临床适应症为癫痫和三叉神经痛。较其他抗癫痫药物而言，卡马西平耐受性良好，常见嗜睡、疲劳、低钠血症等药物不良反应，这些不良反应一般与药物的药理作用相关，成剂量相关性；目前已有多项研究表明卡马西平所致的皮肤不良反应SJS/TEN与HLA-B基因型密切相关。CPIC指南指出，除常见的携带HLA-B*15:02等位基因患者之外，在东亚、东南亚人群中携带HLA-B*15:08、HLA-B*15:11和HLAB*15:21等位基因的患者发生危及生命的皮肤不良事件SJS/TEN的风险显著增加，建议仔细权衡服用卡马西平所带来的SJS/TEN的风险和治疗收益，选择替代治疗方案。根据中华骨髓库统计的中国人群常见及确认HLA等位基因表(CWD表，2.2版本)的统计结果显示，HLA-B*15:11在中国人中的人群频率为1.83％，CWD等位基因分类为C(Common alleles)，即常见等位基因，在中国人群与卡马西平所致的皮肤严重不良反应SJS/TEN相关的HLA-B基因多态性中，仅次于HLA-B*15:02等位基因(中国人群频率3.58％)，因此对中国人群进行HLA-B*15:11基因检测对指导卡马西平的合理用药具有重要意义。
目前，常用的HLA-B基因分型方法有限制性片段长度多态性分析PCR-RFP、序列特异性寡核苷酸探针PCR-SSO、序列特异性引物PCR技术PCR-SSP等。对于复杂的HLA等位基因来说，PCR-RFP技术尚不能检出所有的HLA等位基因；PCR-SSO不具有集成化的优点，而且洗脱条件比较繁琐，耗时较长，难以标准化和自动化；PCR-SSP也具有操作耗时长和特异性较差的缺点。世界卫生组织推荐的HLA-B基因分型方法是以PCR为基础的直接测序法PCR-SBT方法，此方法是最准确可靠HLA-B基因分型方法，具有分辨率高，可大规模进行，精确度高的优势，并且能直接发现新的等位基因，但是，直接测序法存在操作繁琐、耗时长、成本高昂的缺点，另外，测序结果容易出现重叠峰，不利于结果的判读，这与现代医学检验所要求的“快速、简便”的理念相悖。
发明内容
有鉴于此，一方面，一些实施例公开了用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组，包括：特异性引物组及特异性探针，和内标基因引物组及内标探针；
其中，特异性引物组及特异性探针包括：
HLA-B*15:11-F上游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：001所示；
HLA-B*15:11-R下游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：002所示；
HLA-B*15:11-Probe特异性探针，其碱基序列如SEQ ID NO：003所示；
内标基因引物组及内标探针包括：
TUBB-F上游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：004所示；
TUBB-R下游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：005所示；
TUBB-probe内标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：006所示。
另一方面，一些实施例公开了用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂，包括用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组。
再一方面，一些实施例公开了用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒，包括用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组，或用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂。
一些实施例公开的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒，还包括扩增试剂。
再一方面，一些实施例公开了用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组在检测HLA-B*15:11等位基因中应用。
一些实施例公开的用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用，利用探针引物组对待测样品进行PCR扩增。
一些实施例公开了用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用。
一些实施例公开的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用，利用试剂对待测样品进行PCR扩增。
一些实施例公开了用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用。
一些实施例公开的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用，利用试剂盒对待测样品进行PCR扩增。
一些实施例公开的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用，待测样品为血液、血斑或口腔黏膜。
本发明实施例公开的用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组、试剂、试剂盒能够用于对HLA-B*15:11等位基因进行快速、简单、可靠、高精度、高灵敏度的检测特异性检测，对HLA-B*15:11的阳性检出率为100％，且非HLA-B*15:11基因型的样本均无明显指数扩增，特异性符合率为100％。
附图说明
图1实施例1公开的HLA-B*15:11基因型阳性样本PCR扩增反应体系检测曲线示意图；
图2实施例2公开的HLA-B*15:11基因扩增引物组引入错配突变与未引入错配突变的比较；
图3实施例3公开的HLA-B*15:11及其它HLA-B等位基因阳性样本PCR扩增反应体系检测曲线示意图；
图4实施例4公开的87个已知HLA-B基因型临床样本PCR扩增反应体系检测曲线示意图。
探针引物组碱基序列表。
具体实施方式
在这里专用的词“实施例”，作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。本发明实施例中性能指标测试，除非特别说明，采用本领域常规试验方法。应理解，本发明实施例中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明实施例公开的内容。
除非另有说明，否则本文使用的技术和科学术语具有本发明实施例所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义；作为本发明实施例中其它未特别注明的试验方法和技术手段均指本领域内普通技术人员通常采用的实验方法和技术手段。
本文所用的术语“基本”和“大约”用于描述小的波动。例如，它们可以是指小于或等于±5％，如小于或等于±2％，如小于或等于±1％，如小于或等于±0.5％，如小于或等于±0.2％，如小于或等于±0.1％，如小于或等于±0.05％。在本文中以范围格式表示或呈现的数值数据，仅为方便和简要起见使用，因此应灵活解释为不仅包括作为该范围的界限明确列举的数值，还包括该范围内包含的所有独立的数值或子范围。例如，“1～5％”的数值范围应被解释为不仅包括1％至5％的明确列举的值，还包括在所示范围内的独立值和子范围。因此，在这一数值范围中包括独立值，如2％、3.5％和4％，和子范围，如1％～3％、2％～4％和3％～5％等。这一原理同样适用于仅列举一个数值的范围。此外，无论该范围的宽度或所述特征如何，这样的解释都适用。
在本文中，包括权利要求书中，连接词，如“包含”、“包括”、“带有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“容纳”等被理解为是开放性的，即是指“包括但不限于”。只有连接词“由……构成”和“由……组成”是封闭连接词。
为了更好的说明本发明内容，在下文的具体实施例中给出了众多的具体细节。本领域技术人员应当理解，没有某些具体细节，本发明同样可以实施。在实施例中，对于本领域技术人员熟知的一些方法、手段、仪器、设备等未作详细描述，以便凸显本发明的主旨。
在不冲突的前提下，本发明实施例公开的技术特征可以任意组合，得到的技术方案属于本发明实施例公开的内容。
在一些实施方式中，用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组，包括：特异性引物组及特异性探针，和内标基因引物组及内标探针；
其中，特异性引物组及特异性探针包括：HLA-B*15:11-F上游引物，HLA-B*15:11-R下游引物和HLA-B*15:11-Probe特异性探针；
内标基因引物组及内标探针包括：TUBB-F上游引物、TUBB-R下游引物和TUBB-probe内标探针；其中，各引物与探针的碱基序列见表1；各引物在人参考基因组(版本GRCh37)中的设计区间见表2；
表1引物碱基序列表
表2引物在人参考基因组中的设计区间列表
通常地，利用用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组，与其他试剂，例如扩增试剂，与待测样本混合配置成扩增反应体系，进一步进行PCR扩增反应，进行测HLA-B*15:11等位基因的检测、分析。
发明人在研究检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组的过程中，依据中华骨髓库统计的中国人群常见及确认HLA等位基因表(CWD表，版本2.2)统计的常见及确认HLA-B等位基因型信息，和IPD-IMGT/HLA数据库(版本号3.51，2023-01)中HLA-B基因所有亚型的序列信息，选取HLA-B*15:11:01亚型的基因序列(ID：HLA00174)、中国人群常见及确认HLA-B等位基因中人群频率大于0.001％的序列，共计140亚型序列，进行alignment序列对齐比对。
在进行等位基因特异性位点和引物设计区域的筛选过程中，因HLA-B基因多态性主要位于2号和3号外显子，因此首先划定范围为HLA-B基因2号～3号外显子中间的区域为设计区域；然后通过上下游引物和探针的组合，使其在设计上能够区别于其他139种不同亚型，排除其它HLA-B等位基因的结合、识别，如常见的HLA-B*46:01，HLA-B*58:01，HLA-B*57:01，HLA-B*15:02，HLA-B*27等位基因型，使得针对特异性位点的探针引物组仅可以扩增HLA-B*15:11等位基因。
同时，发明人根据特异性位点附近区域的特征和测试实验的结果，结合等位基因阻滞突变系统ARMS等方法，引入错配突变碱基，增强引物的特异性，如反向引物在扩增区域仅与HLA-B*54:01:01:01(ID：HLA00367)和HLA-B*07:02:01:01(ID：HLA00132)在3’端相差一个碱基，而经过试验测试发现一个碱基的差异不能在扩增曲线上完全区分出HLA-B*15:11和HLA-B*54:01、HLA-B*07:02基因位点，因此经过多轮测试筛选在反向引物上的-4位置上引入错配突变G>A，增强引物的特异性同时又保证了扩增效率。
进一步，通过PCR扩增曲线分析结果，来判断未知样本是否携带HLA-B*15:11等位基因，同时反应体系中还加入检测内标基因的特异性引物与探针，确保反应体系中人DNA的加入，防止出现假阴性结果。
一些实施例公开的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂，包括用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组。通常地，用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂中，包含有用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组，以及扩增试剂；探针引物组、扩增试剂与待测样本混合配置成扩增反应体系，进一步进行PCR扩增反应，进行测HLA-B*15:11等位基因的检测、分析。
一些实施例公开的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒，包括用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组，或用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂。通常地，用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒中，包含有用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组或试剂，以及扩增试剂；探针引物组或试剂、扩增试剂与待测样本混合配置成扩增反应体系，进一步进行PCR扩增反应，进行HLA-B*15:11等位基因的检测、分析。
一些实施例公开了用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组在检测HLA-B*15:11等位基因中应用。
一些实施例公开了用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用。通常地，用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂中，包含有用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组，以及扩增试剂；探针引物组、扩增试剂与待测样本混合配置成扩增反应体系，进一步进行PCR扩增反应，进行HLA-B*15:11等位基因的检测、分析。
一些实施例公开了用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用。通常地，用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒中，包含有用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组或试剂，以及扩增试剂；探针引物组或试剂、扩增试剂与待测样本混合配置成扩增反应体系，进一步进行PCR扩增反应，进行HLA-B*15:11等位基因的检测、分析。
一些实施例中，利用用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组对待测样品进行PCR扩增。通常，利用检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组，与待测样品、扩增试剂，配置成扩增反应体系，进一步在PCR扩增仪中设定反应程序对配置好的扩增反应体系进行扩增，并采集荧光信号，对采集的信息进行分析；以判定待测样品是否为HLA-B*15:11等位基因的携带者。
一些实施例中，利用用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂对待测样品进行PCR扩增。通常，利用检测HLA-B*15:11等位基因的试剂与待测样品，配置成扩增反应体系，进一步在PCR扩增仪中设定反应程序对配置好的扩增反应体系进行扩增，并采集荧光信号，对采集的信息进行分析；以判定待测样品是否为HLA-B*15:11等位基因的携带者。
一些实施例中，利用用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒对待测样品进行PCR扩增。通常，利用检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒中的试剂，与待测样品配置成扩增反应体系，进一步在PCR扩增仪中设定反应程序对配置好的扩增反应体系进行扩增，并采集荧光信号，对采集的信息进行分析；以判定待测样品是否为HLA-B*15:11等位基因的携带者。
一些实施例中，利用用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒对血液样品进行PCR扩增。通常地，可以利用检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒对生物样本检测，例如血液、血斑、口腔黏膜等，较为优选的检测样本为血液样本。
以下结合实施例对技术细节做进一步示例性说明。
实施例1
(1)样品处理和核酸提取
使用商业化的DNA提取试剂盒提取待测样本DNA，并使用分光光度计对提取的DNA进行浓度和纯度测定，其中，当待测样本的OD260/OD280为1.8～2.0，DNA浓度大于等于0.5ng/μL，即为合格样品，可进行后续实验；
(2)配置扩增反应体系
在PCR扩增管中分别加入HLA-B*15:11特异性上游引物HLA-B*15:11-F、下游引物HLA-B*15:11-R和探针HLA-B*15:11-Probe，及内标基因上游引物TUBB-F、下游引物TUBB-R和探针TUBB-probe，并加入待测样本DNA、以及PCR buffer、dNTP、热稳定性Taq聚合酶等。表1中，Taq Master Mix为商品化的扩增试剂，其中包含有PCR buffer、dNTP、热稳定性Taq聚合酶；
表1扩增反应体系的配置
(3)进行PCR扩增反应
使用qPCR仪ABI 7500对配置好的扩增体系进行扩增，ABI 7500对应的程序设定中，Reporter选择FAM和CY5，Quencher选择MGB-NFQ，Passive reference选择None。
设置反应体系为20μL，qPCR反应程序设置如表2所示，保存并运行程序。
表2qPCR反应程序设置列表
实施例1结果分析：
反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值，一般地可根据实际情况自行调整阈值线，使阈值线位于扩增曲线指数期；HLA-B*15:11检测通道为FAM荧光通道，内标基因检测通道为CY5通道；点击Analysis自动获得分析结果，在“Report”窗口读取检测结果；
如图1所示，CY5通道和FAM通道均有明显的指数扩增，且Ct≤35，则判定实施例1中的待测样本为HLA-B*15:11等位基因型携带者。
实施例2
发明人在实验过程中发现，在引物的测试和筛选过程，通过引入错配突变碱基来提高引物的特异性，反向引物(HLA-B*15:11-R)的3’端存在G>A多态性，而仅靠该位点多态性的差异不足使得扩增引物组将HLA-B*15:11(A碱基)和HLA-B*54:01、HLA-B*07:02等(G碱基)更好的区分开来，发明人经过大量实验验证后发现，在反向引物上的-4位置上引入错配突变G>A，以3’端第一个碱基定义为-1位置，见引物HLA-B*15:11-R序列，可以增强引物的特异性，同时又保证了扩增效率高效性。
在本实施例2中，分别选取经一代测序验证过的HLA-B*15:11、HLA-B*54:01和HLA-B*07:02阳性临床样本。选取引入错配突变的引物组，如表1所示，和没有引入错配突变的引物组，将表1中HLA-B*15:11-R引物序列改为5’-CTCGCCGGTCGAGGGTT-3’，参照实施例1中步骤2和步骤3所示步骤进行配置扩增反应体系和PCR扩增，对三个临床样本进行检测。
检测结果如图2所示，所有样本的内标基因通道，即CY5通道，均有正常扩增曲线，引入错配突变的引物组在对HLA-B*54:01、HLA-B*07:02阳性样本进行检测时FAM通道基本无明显扩增曲线，而没有引入错配突变的引物组则有明显的扩增曲线，说明本发明引入错配突变的引物组可以明显降低假阳性的发生，提升HLA-B*15:11引物组的特异性，同时引入突变对HLA-B*15:11的阳性样本的扩增效率基本无影响，从而保证了扩增引物组的灵敏性。
实施例3
(1)分别选取包含HLA-B*57:01，HLA-B*58:01，HLA-B*15:02，HLA-B*27的质评样本以及经一代测序结果验证(PCR-SBT)后的HLA-B*15:11阳性样本。
(2)以四个质评样本DNA分别作为模板，分别选取四个PCR反应管，参照实施例1的步骤，分别配制四个扩增反应体系并进行PCR上机扩增反应。
实施例3的PCR扩增结果如图3所示，所有样本的内标基因通道，即CY5通道，均有正常指数扩增曲线，且Ct≤35(Ct值为26-27)，靶基因通道，即FAM通道，HLA-B*15:11阳性样本有正常指数扩增曲线且Ct≤35(Ct值约为28)，而HLA-B*57:01、HLA-B*58:01、HLA-B*15:02和HLA-B*27阳性样本则无指数扩增曲线。
实施例3的结果说明，实施例2实现了对HLA-B*15:11等位基因的特异性扩增，完全排除了HLA-B*57:01、HLA-B*58:01、HLA-B*15:02和HLA-B*27等位基因的干扰。
实施例4
(1)选取87个临床样本，该87个临床样本均具有全外显子组测序(WES)数据，参照实施例1中的步骤对87个临床样本进行检测，检测结果如图4和表3所示，在87个临床样本中共检测到4例HLA-B*15:11阳性携带者样本，所有临床样本的检测及判定结果Ct值如表3所列。表3中，FAM通道为靶基因通道，CY5通道为内标基因通道，PCR判定结果为HLA-B*15:11基因型的判定结果，阳性或阴性。
(2)利用HLA-HD软件对该87个临床样本的全外显子组测序数据进行HLA-B基因分型分析，得到所有样本的HLA-B基因高分辨率分型结果。将PCR检测结果与全外显子组测序数据分析结果进行对比，对比结果如表3所列；
结果表明，该87个临床样本中，与全外显子组测序结果相比，本发明申请对HLA-B*15:11的阳性检出率为100％，且非HLA-B*15:11基因型的样本均无明显指数扩增，特异性符合率为100％。
表3实施例3临床样本HLA-B*15:11检测结果与全外显子测序结果对比列表
本发明实施例公开的用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组、试剂、试剂盒能够用于对HLA-B*15:11等位基因进行快速、简单、可靠、高精度、高灵敏度的检测特异性检测，对HLA-B*15:11的阳性检出率为100％，且非HLA-B*15:11基因型的样本均无明显指数扩增，特异性符合率为100％。
本发明实施例公开的技术方案和实施例中公开的技术细节，仅是示例性说明本发明的发明构思，并不构成对本发明实施例技术方案的限定，凡是对本发明实施例公开的技术细节所做的常规改变、替换或组合等，都与本发明具有相同的发明构思，都在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (10)
1.用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组，其特征在于，包括：特异性引物组及特异性探针，和内标基因引物组及内标探针；
其中，所示特异性引物组及特异性探针包括：
HLA-B*15:11-F上游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：001所示；
HLA-B*15:11-R下游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：002所示；
HLA-B*15:11-Probe特异性探针，其碱基序列如SEQ ID NO：003所示；
所述内标基因引物组及内标探针包括：
TUBB-F上游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：004所示；
TUBB-R下游引物，其碱基序列如SEQ ID NO：005所示；
TUBB-probe内标探针，其碱基序列如SEQ ID NO：006所示。
2.用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂，其特征在于，包括权利要求1所述的探针引物组。
3.用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的探针引物组，或权利要求2所述的试剂。
4.根据权利要求3所述的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒，其特征在于，还包括扩增试剂。
5.权利要求1所述的用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组在检测HLA-B*15:11等位基因中应用。
6.根据权利要求5所述的用于检测HLA-B*15:11等位基因的探针引物组在检测HLA-B*15:11等位基因中应用，其特征在于，利用所述探针引物组对待测样品进行PCR扩增。
7.权利要求2所述的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用，其特征在于，利用所述试剂对待测样品进行PCR扩增。
8.权利要求3或4所述的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用。
9.根据权利要求8所述的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用，其特征在于，利用所述试剂盒对待测样品进行PCR扩增。
10.根据权利要求8所述的用于检测HLA-B*15:11等位基因的试剂盒在检测HLA-B*15:11等位基因中的应用，其中在于，所述待测样品为血液、血斑或口腔黏膜。
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