CN104024410A - Hla-a*24组的判定方法 - Google Patents

Hla-a*24组的判定方法 Download PDF

Info

Publication number
CN104024410A
CN104024410A CN201280064968.XA CN201280064968A CN104024410A CN 104024410 A CN104024410 A CN 104024410A CN 201280064968 A CN201280064968 A CN 201280064968A CN 104024410 A CN104024410 A CN 104024410A
Authority
CN
China
Prior art keywords
hla
base
bit base
group
bit
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201280064968.XA
Other languages
English (en)
Inventor
牧野洋一
山根明男
东友彦
中山雅人
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Toppan Inc
Original Assignee
Toppan Printing Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Toppan Printing Co Ltd filed Critical Toppan Printing Co Ltd
Publication of CN104024410A publication Critical patent/CN104024410A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6881—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for tissue or cell typing, e.g. human leukocyte antigen [HLA] probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers

Abstract

本发明提供一种歧义少且简便地判定HLA-A*24组的分型的方法。本发明的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，以受试者的基因组DNA中的HLA基因的起始密码子的A(腺嘌呤)作为第1位，基于(a)第211位碱基和(b)第395位碱基的分型结果进行判定。另外，在前述HLA-A*24组的判定方法中，其特征在于，还基于选自由(c)第437位碱基、第441位碱基、第443位碱基、第444位碱基、第447位碱基和第449位碱基所组成的组中的一个以上碱基的分型结果进行判定。

Description

HLA-A*24组的判定方法
技术领域
本发明涉及一种判定HLA型是否是HLA-A*24组的方法。
本申请基于2011年12月28日在日本提出的“特愿2011-289336号”申请主张优先权，特将其内容援引于此。
背景技术
HLA(Human Leukocyte Antigen，人类白细胞抗原)是在位于第六染色体短臂部的MHC(Major Histocompatibility Complex：主要组织相容性复合体)区域所编码的基因簇的基因产物。HLA具有非常丰富的多样性，特别是在造血干细胞的移植、输血等临床实践操作中，提高HLA的拟合优度很重要。因此，在临床实践中要求以尽量少的劳力进行准确的HLA分型。
HLA分型的方法，大致可分为血清学分型方法和DNA分型方法。与血清学分型方法相比，DNA分型方法能够更详细地确定HLA型。但是，即使在DNA分型方法中，也存在两种以上根据DNA分型的结果无法辨别的等位基因，有时会发生无法准确地确定HLA型的所谓歧义(Ambiguity)的问题。
例如，在专利文献1中公开了在基因水平上对HLA-A抗原的亚类(亚型)进行分型的方法。具体而言，将HLA-A等位基因(allele)分类成特定的组，使用可特异性地扩增各组的HLA-A等位基因的引物进行PCR反应，对所得到的PCR产物实施RFLP法、PCR-RFLP法、SSOP法、PCR-SSOP法、PCR-SSP法或者PCR-SSCP法的操作，由此将HLA-A型进行分型。通过像该方法那样进行多阶段的测定(assay)，虽然能够期待消除歧义、对HLA-A型详细进行分型，但是存在耗费大量劳力的问题。
另外，HLA型的分布是根据人种而存在差异。根据日本特定非营利活动法人HLA研究所的报告，在对日本人的5538个家族的21705人进行分型的结果(当时是2011年12月19日)中，如表1所示，日本人的HLA-A型的基因频率是HLA-A*24:02型为最高的35.936％(例如，参照非专利文献1)。
表1
等位基因型 基因频率 顺序 等位基因型 基因频率 顺序 等位基因型 基因频率 顺序
A*24:02 35.936％ 1 A*02:07 3.488％ 8 A*24:04 0.014％ 27
A*02:01 11.532％ 2 A*26:03 2.414％ 9 A*24:07 0.014％ 27
A*02:06 9.247％ 3 A*26:02 1.857％ 10 A*24:03 0.009％ 31
A*11:01 9.15％ 4 A*24:20 0.71％ 11 A*24:88 0.005％ 36
A*31:01 8.685％ 5 A*24:08 0.041％ 20
A*26:01 7.528％ 6 A*32:01 0.032％ 22
A*33:03 7.192％ 7 A*24:25 0.018％ 25
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开平11-216000号公报
非专利文献
非专利文献1：“等位基因频率检索1座/A检索”[on line(联机在线)]，特定非营利活动法人HLA研究所，[平成23年(2011年)12月19日检索]，互联网<URL:http://www.hla.or.jp/haplo/haplo_search.php？type＝aril&loci＝A&lang＝ja>
发明内容
发明要解决的课题
本发明的目的在于，提供一种歧义少且简便地判定HLA-A*24组的分型的方法。
解决课题的方法
本发明人为了解决上述课题进行了精心研究的结果，获得了如下发现，即，将HLA基因的起始密码子的A(腺嘌呤)作为第1位，基于(a)第211位碱基和(b)第395位碱基的分型结果，能够以非常少的工序且充分减少歧义而高精度地判定HLA-A*24组的等位基因，从而完成了本发明。
即，本发明提供了如下技术方案。
(1)一种HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，以受试者的基因组DNA中的HLA基因的起始密码子的A(腺嘌呤)作为第1位，基于(a)第211位碱基和(b)第395位碱基的分型结果进行判定。
(2)如前述(1)的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，还基于选自由(c)第437位碱基、第441位碱基、第443位碱基、第444位碱基、第447位碱基和第449位碱基所组成的组中的一个以上碱基的分型结果进行判定。
(3)如前述(2)的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，对前述受试者的HLA型是否是HLA-A*24:02进行判定。
(4)如前述(3)的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，在至少一个等位基因中，当第211位碱基是C(胞嘧啶)、第395位碱基是G(鸟嘌呤)、第437位碱基是C、第441位碱基是T(胸腺嘧啶)、第443位碱基是G、第444位碱基是C、第447位碱基是T、第449位碱基是C时，判定前述受试者的HLA型是HLA-A*24:02。
(5)如前述(1)～(4)中任一项所述的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，采用序列分析方法或者单碱基检测方法进行前述(a)和(b)的碱基的分型。
(6)如前述(2)～(5)中任一项所述的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，采用序列分析方法或者单碱基检测方法进行前述(c)的碱基的分型。
(7)如前述(2)～(5)中任一项所述的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，当通过使用由序列号7表示的碱基序列构成的引物的聚合酶进行的延伸反应获得了延伸产物时，将前述(c)的碱基分型为第437位碱基是C、第441位碱基是T、第443位碱基是G、第444位碱基是C、第447位碱基是T、第449位碱基是C。
(8)一种HLA-A*24:02判定用试剂盒，其特征在于，包含由序列号7表示的碱基序列构成的HLA-A*24:02判定用引物。
发明效果
通过本发明的HLA-A*24组的判定方法，能够以良好的精度且更简便地判定HLA-A*24组的分型。本发明的HLA-A*24组的判定方法，由于能够以特别高的精度判定日本人中基因频率高的HLA-A*24组的等位基因，因此特别适于受试者是日本人时的判定。
附图说明
图1A是表示HLA基因的基因组DNA的碱基序列中以HLA基因的起始密码子的A作为第1位的第-300位碱基至第600位碱基的图。
图1B是表示HLA基因的基因组DNA的碱基序列中以HLA基因的起始密码子的A作为第1位的第601位碱基至第1500位碱基的图。
图1C是表示HLA基因的基因组DNA的碱基序列中以HLA基因的起始密码子的A作为第1位的第1501位碱基至第2400位碱基的图。
图1D是表示HLA基因的基因组DNA的碱基序列中以HLA基因的起始密码子的A作为第1位的第2401位碱基至第3202位碱基的图。
图2是表示HLA基因的基因组DNA的第2外显子中的第211位碱基(图中“(a)”)及其附近、第395位碱基(图中“(b)”)及其附近、以及第437位～第449位碱基(图中“(c)”)及其附近的各等位基因的碱基序列图。
图3是(a)～(c)碱基的分型方法的一实施方式的示意图。
图4是(a)～(c)碱基的分型方法的一实施方式的示意图。
具体实施方式
在本发明和本申请说明书中，所谓“对碱基进行分型”是指，对该碱基是A(腺嘌呤)、是G(鸟嘌呤)、是C(胞嘧啶)还是T(胸腺嘧啶)进行确定的意思。
本发明的HLA-A*24组的判定方法(下面，有时也称“本发明的判定方法”)，是判定HLA-A*24组的等位基因的方法，其特征在于，以受试者的基因组DNA中的HLA基因的起始密码子的A作为第1位碱基，基于(a)第211位碱基和(b)第395位碱基的分型结果进行判定。
另外，在本发明的判定方法中，除了基于前述(a)的碱基和前述(b)的碱基的分型结果之外，还可以进一步基于选自由(c)第437位碱基、第441位碱基、第443位碱基、第444位碱基、第447位碱基和第449位碱基所组成的组中的一个以上碱基的分型结果进行判定。此外，由于第437位碱基、第441位碱基、第443位碱基、第444位碱基、第447位碱基和第449位碱基是链接的，因此，对第437位碱基、第441位碱基、第443位碱基、第444位碱基、第447位碱基和第449位碱基而言，只要对它们中的至少一个碱基进行分型即可。另外，只要是赋予HLA-A*24:02特征的SNP(Single NucleotidePolymorphism，单核苷酸多态性)就不限定于以上所述，但优选为能够与以等位基因频率0.001％以上存在的HLA-A组区别的碱基。
图1中示出HLA基因的基因组DNA的碱基序列(序列号1)。图1A～1D中，以四角形围起来的区域是编码区域，各碱基的编号是以HLA基因的起始密码子的A作为第1位进行排列分配的。第211位碱基(C)、第395位碱基(G)、第437位碱基(C)、第441位碱基(T)、第443位碱基(G)、第444位碱基(C)、第447位碱基(T)和第449位碱基(C)附加有网点阴影。另外，序列号2中示出与HLA基因的编码区域的碱基序列对应的氨基酸序列。
这些碱基均存在于第2外显子。图2中示出第2外显子中的第211位碱基(图中“(a)”)及其附近、第395位碱基(图中“(b)”)及其附近、以及第437位～第449位的6个碱基(图中“(c)”)及其附近的各等位基因的碱基序列。图中的各等位基因的碱基中，“－”是表示与HLA-A*24:02相同的碱基。
将各等位基因在日本人中的基因频率和前述(a)～(c)的碱基示于表2中。此外，作为(c)的碱基，使用了第437位碱基。另外，在表2中，“其它”是指除了在表2中具体示出的HLA-A型以外的剩余的全部HLA-A型。
表2
基因频率(％) 等位基因型 (a) (b) (c)
35.936 A*24:02 C G C
0.71 A*24:20 A G C
0.032 A*32:01 C C C
0.041 A*24:08 A C C
0.014 A*24:07 C G C
0.009 A*24:03 C G C
0.014 A*24:04 C G G
0.018 A*24:25 C G C
0.005 A*24:88 A G C
63.22 其它 C C G
在至少一个等位基因中，当第211位碱基(前述(a))是A或C、第395位碱基(前述(b))是G或C、并且第211位碱基与第395位碱基均不是C时，判定前述受试者的HLA型属于HLA-A*24组。
基于对受试者的基因组DNA中所含的HLA基因中的前述(a)和(b)的碱基进行分型而得到的分型结果，对该受试者的HLA-A型进行判定，将该判定的结果和实际的基因型与基因频率一起示于表3中。表3中的“A”栏表示等位基因型(HLA-A型)，“其它”与其在表2中的意思相同。另外，“类型”栏的“+”是表示含有HLA-A*24组的等位基因的基因组DNA，“－”是表示不包含HLA-A*24组的等位基因的基因组DNA。另外，当“(a)”栏中有至少一个A或C、“(b)”栏中有至少一个G或C时(其中排除“(a)”栏只有C(两等位基因都是C)且“(b)”栏只有C的情况)，判定该基因组DNA含有HLA-A*24组的等位基因(即“判定”栏为“+”)，除此以外的情况下，判定该基因组DNA不包含HLA-A*24组的等位基因(即“判定”栏为“－”)。并且，当“类型”栏与“判定”栏一致时“正误”栏为“○”、不一致时为“×”。“基因频率”是各等位基因的基因频率的积(例如，当A*24:02的同型时为35.936％×35.936％＝12.91％)。如表3所示，在本发明的判定方法中，仅基于前述(a)和(b)的碱基的分型结果，就能够以非常良好的精度判定受试者的基因组DNA中是否含有HLA-A*24组的等位基因。
表3
A A (a) (b) 类型 判定 正误 频率(％)
A*24:02 A*24:02 C/C G/G + + 〇 12.91
A*24:02 A*24:20 A/C G/G + + 〇 0.51
A*24:02 A*32:01 C/C C/G + + 〇 0.02
A*24:02 A*24:08 A/C C/G + + 〇 0.03
A*24:02 A*24:07/03/25 C/C G/G + + 〇 0.03
A*24:02 A*24:04 C/C G/G + + 〇 0.01
A*24:02 A*24:88 A/C G/G + + 〇 0.00
A*24:02 其它 C/C C/G + + 〇 45.44
A*24:20 A*24:20 A/A G/G + + 〇 0.01
A*24:20 A*32:01 A/C C/G + + 〇 0.00
A*24:20 A*24:08 A/A C/G + + 〇 0.00
A*24:20 A*24:07/03/25 A/C G/G + + 〇 0.00
A*24:20 A*24:04 A/C G/G + + 〇 0.00
A*24:20 A*24:88 A/A G/G + + 〇 0.00
A*24:20 其它 A/C C/G + + 〇 0.90
A*32:01 A*32:01 C/C C/C － － 〇 0.00
A*32:01 A*24:08 A/C C/C + + 〇 0.00
A*32:01 A*24:07/03/25 C/C C/G + + 〇 0.00
A*32:01 A*24:04 C/C C/G + + 〇 0.00
A*32:01 A*24:88 A/C C/G + + 〇 0.00
A*32:01 其它 C/C C/C － － 〇 0.04
A*24:08 A*24:08 A/A C/C + + 〇 0.00
A*24:08 A*24:07/03/25 A/C C/G + + 〇 0.00
A*24:08 A*24:04 A/C C/G + + 〇 0.00
A*24:08 A*24:88 A/A C/G + + 〇 0.00
A*24:08 其它 A/C C/C + + 〇 0.05
A*24:07/03/25 A*24:07/03/25 C/C G/G + + 〇 0.00
A*24:07/03/25 A*24:04 C/C G/G + + 〇 0.00
A*24:07/03/25 A*24:88 A/C G/G + + 〇 0.00
A*24:07/03/25 其它 C/C C/G + + 〇 0.05
A*24:04 A*24:04 C/C G/G + + 〇 0.00
A*24:04 A*24:88 A/C G/G + + 〇 0.00
A*24:04 其它 C/C C/G + + 〇 0.02
A*24:88 A*24:88 A/A G/G + + 〇 0.00
A*24:88 其它 A/C C/G + + 〇 0.01
其它 其它 C/C C/C － － 〇 39.97
另外，如表2所示，在HLA-A*24组中，除了HLA-A*24：04以外，前述
(c)的碱基与HLA-A*24组以外的等位基因有差异。因此，除了前述(a)和(b)的碱基的分型结果以外，也可以使用前述(c)的碱基的分型结果。
虽然仅基于前述(a)和(b)的碱基的分型结果，就能够充分判定受试者的基因组DNA中是否含有HLA-A*24组的等位基因，但是，通过进一步并用其它碱基的分型结果，则能够更详细地判定HLA型。例如，通过采用除了前述(a)和(b)的碱基的分型结果以外还有采用前述(c)的碱基的分型结果，能够以更优良的精度判定HLA-A*24组中的HLA-A*24:02。由于HLA-A*24:02是日本人中基因频率最高的，因此上述实施方式尤其在受试者是日本人的临床检验等中是特别有用。
具体而言，当在至少一个等位基因中，这些碱基均与HLA-A*24:02相同时，即，当第211位碱基是C、第395位碱基是G、第437位碱基是C、第441位碱基是T、第443位碱基是G、第444位碱基是C、第447位碱基是T、第449位碱基是C时，判定前述受试者的HLA型是HLA-A*24:02。此外，当第437位碱基是C时，通常第441位碱基是T、第443位碱基是G、第444位碱基是C、第447位碱基是T、第449位碱基是C。即，在本发明的判定方法中，根据对3个碱基的分型结果，能够判定受试者的基因组DNA中是否含有HLA-A*24:02。
如表2所示，前述(a)～(c)的碱基的分型结果是，HLA-A*24:07、HLA-A*24:03和HLA-A*24:25与HLA-A*24:02相同，但其它的HLA-A型的等位基因与HLA-A*24:02不同。
即，根据前述(a)～(c)的碱基的分型结果，HLA-A*24:02不能与HLA-A*24:07、HLA-A*24:03和HLA-A*24:25辨别，但能够与其它型的等位基因辨别。
基于对受试者的基因组DNA中所含的HLA基因中的前述(a)～(c)碱基进行分型而得到的分型结果和表4中所示的判定标准，对该受试者的HLA-A型进行判定，并将该判定结果和实际的基因型与基因频率一起示于表5中。表5中的“A”栏表示等位基因型(HLA-A型)，“其它”与其在表2中的意思相同。另外，“类型”栏的“+”是表示含有HLA-A*24:02的基因组DNA，“－”是表示不包含HLA-A*24:02的基因组DNA。在表4和表5中，“判定”栏的“+”是表示判定受试者的基因组DNA含有HLA-A*24:02，“－”是表示判定受试者的基因组DNA不包含HLA-A*24:02。即，当“(a)”栏中至少有一个C、“(b)”栏中至少有一个G、“(c)”栏中至少有一个C并且在“(a)”栏中有A的情况下“(c)”栏中没有G时，判定该基因组DNA含有HLA-A*24:02(即“判定”栏为“+”)；当“(a)”栏中没有C时、当“(b)”栏中没有G时、当“(c)”栏中没有C时以及当“(a)”栏中至少有一个A、“(b)”栏中有至少一个G、“(c)”栏中至少有一个G时，判定该基因组DNA不包含HLA-A*24:02(即“判定”栏是“－”)。并且，当“类型”栏与“判定”栏一致时“正误”栏为“○”、不一致时为“×”。
表4
表5
A A (a) (b) (C) 类型 判定 正误 频率(％)
A*24:02 A*24:02 C/C G/G C/C + + 〇 12.91
A*24:02 A*24:20 A/C G/G C/C + + 〇 0.51
A*24:02 A*32:01 C/C C/G C/C + + 〇 0.02
A*24:02 A*24:08 A/C C/G C/C + + 〇 0.03
A*24:02 A*24:07/03/25 C/C G/G C/C + + 〇 0.03
A*24:02 A*24:04 C/C G/G C/G + + 〇 0.01
A*24:02 A*24:88 A/C G/G C/C + + 〇 0.00
A*24:02 其它 C/C C/G C/G + + 〇 45.44
A*24:20 A*24:20 A/A G/G C/C － － 〇 0.01
A*24:20 A*32:01 A/C C/G C/C － + × 0.00
A*24:20 A*24:08 A/A C/G C/C － － 〇 0.00
A*24:20 A*24:07/03/25 A/C G/G C/C － + × 0.00
A*24:20 A*24:04 A/C G/G C/G － － 〇 0.00
A*24:20 A*24:88 A/A G/G C/C － － 〇 0.00
A*24:20 其它 A/C C/G C/G － － 〇 0.90
A*32:01 A*32:01 C/C C/C C/C － － 〇 0.00
A*32:01 A*24:08 A/C C/C C/C － － 〇 0.00
A*32:01 A*24:07/03/25 C/C C/G C/C － + × 0.00
A*32:01 A*24:04 C/C C/G C/G － + × 0.00
A*32:01 A*24:88 A/C C/G C/C － + × 0.00
A*32:01 其它 C/C C/C C/G － － 〇 0.04
A*24:08 A*24:08 A/A C/C C/C － － 〇 0.00
A*24:08 A*24:07/03/25 A/C C/G C/C － + × 0.00
A*24:08 A*24:04 A/C C/G C/G － － 〇 0.00
A*24:08 A*24:88 A/A C/G C/C － － 〇 0.00
A*24:08 其它 A/C C/C C/G － － 〇 0.05
A*24:07/03/25 A*24:07/03/25 C/C G/G C/C － + × 0.00
A*24:07/03/25 A*24:04 C/C G/G C/G － + × 0.00
A*24:07/03/25 A*24:88 A/C G/G C/C － + × 0.00
A*24:07/03/25 其它 C/C C/G C/G － + × 0.05
A*24:04 A*24:04 C/C G/G G/G － － 〇 0.00
A*24:04 A*24:88 A/C G/G C/G － － 〇 0.00
A*24:04 其它 C/C C/G G/G － － 〇 0.02
A*24:88 A*24:88 A/A G/G C/C － － 〇 0.00
A*24:88 其它 A/C C/G C/G － － 〇 0.01
其它 其它 C/C C/C G/G － － 〇 39.97
根据前述(a)～(c)碱基的分型结果，当受试者具有表5中的“正误”栏为“×”的基因组DNA时，尽管实际上不含有HLA-A*24:02，但是会导致错误判定该受试者具有HLA-A*24:02(假阳性)。但是，在日本人中，充当这些假阳性的基因组DNA的基因频率均极低，被判定为假阳性的受试者的比例被控制在仅为0.05％。例如，基于本发明的判定方法中采用除了前述(a)和(b)以外还有前述(c)的碱基的分型结果对受试者的HLA型是否是HLA-A*24:02进行判定的方法(下面也称作“本发明的HLA-A*24:02判定方法”)，对100万日本人进行实施时，尽管仅是基于3个碱基的分型结果，但如表6所示地，在理论上假阴性为0人、假阳性为530人，人数非常少。
表6
检测100万人时(人) 频率(％)
阳性 589573 59
阴性 409877 41
假阴性 0 0.00
假阳性 530 0.05
HLA-A的等位基因中的大多数是涉及多种多态性的组合的等位基因，因此，当仅仅对等位基因中与其它等位基因不同的部位(多态性部位)的局部进行分型时，难以将多种等位基因相互辨别。当以判定某个特定等位基因作为目的而实施检测时，若发生歧义，则会导致将并非实际目的等位基因也判定为该目的等位基因(假阳性)。虽通过全部消除歧义可以解决该假阳性的问题，但为了全部消除歧义需要对非常多的碱基进行分型，检测成本过大。
即，为了将HLA判定方法应用于临床检验等医疗实践中，取得检测精度与成本的平衡十分重要。
在本发明的HLA-A*24:02判定方法中，为了判定HLA-A*24:02，采取基因频率以尽量减少因歧义而产生的假阳性发生概率，而且对用于分型中的碱基进行确定，以使应该分型的碱基数目也达到最小限度。即，对本发明的HLA-A*24:02判定方法而言，由于其HLA-A*24:02的判定精度高，并且从检测成本的观点出发也优良，因此也适于临床检验等方面。
当假设仅基于前述(a)和(b)的碱基的分型结果进行判定时，如表7所示，会导致将作为基因频率高的“HLA-A*24:20及其它(除了表2中记载的等位基因以外的等位基因)”的受试者错误地判定为含有HLA-A*24:02。其结果，假阳性的概率增大至0.97％，当检测100万日本人时在理论上也会有9749人被判定为假阳性。根据该估算也明确了本发明的HLA-A*24:02的判定方法的判定精度是优良的。
表7
A A (a) (b) 类型 判定 正误 频率(％)
A*24:02 A*24:02 C/C G/G + + 〇 12.91
A*24:02 A*24:20 A/C G/G + + 〇 0.51
A*24:02 A*32:01 C/C C/G + + 〇 0.02
A*24:02 A*24:08 A/C C/G + + 〇 0.03
A*24:02 A*24:07/03/25 C/C G/G + + 〇 0.03
A*24:02 A*24:04 C/C G/G + + 〇 0.01
A*24:02 A*24:88 A/C G/G + + 〇 0.00
A*24:02 其它 C/C C/G + + 〇 45.44
A*24:20 A*24:20 A/A G/G － － 〇 0.01
A*24:20 A*32:01 A/C C/G － + × 0.00
A*24:20 A*24:08 A/A C/G － － 〇 0.00
A*24:20 A*24:07/03/25 A/C G/G － + × 0.00
A*24:20 A*24:04 A/C G/G － + × 0.00
A*24:20 A*24:88 A/A G/G － － 〇 0.00
A*24:20 其它 A/C C/G － + × 0.90
A*32:01 A*32:01 C/C C/C － － 〇 0.00
A*32:01 A*24:08 A/C C/C － － 〇 0.00
A*32:01 A*24:07/03/25 C/C C/G － + × 0.00
A*32:01 A*24:04 C/C C/G － + × 0.00
A*32:01 A*24:88 A/C C/G － + × 0.00
A*32:01 其它 C/C C/C － － 〇 0.04
A*24:08 A*24:08 A/A C/C － － 〇 0.00
A*24:08 A*24:07/03/25 A/C C/G － + × 0.00
A*24:08 A*24:04 A/C C/G － + × 0.00
A*24:08 A*24:88 A/A C/G － － 〇 0.00
A*24:08 其它 A/C C/C － － 〇 0.05
A*24:07/03/25 A*24:07/03/25 C/C G/G － + × 0.00
A*24:07/03/25 A*24:04 C/C G/G － + × 0.00
A*24:07/03/25 A*24:88 A/C G/G － + × 0.00
A*24:07/03/25 其它 C/C C/G － + × 0.05
A*24:04 A*24:04 C/C G/G － + × 0.00
A*24:04 A*24:88 A/C G/G － + × 0.00
A*24:04 其它 C/C C/G － + × 0.02
A*24:88 A*24:88 A/A G/G － － 〇 0.00
A*24:88 其它 A/C C/G － + × 0.01
其它 其它 C/C C/C － － 〇 39.97
作为用于本发明判定方法的核酸试样，只要包含能够反映含有受试者的基因组DNA的前述(a)和(b)的碱基(在本发明的HLA-A*24:02的判定方法的情况下，受试者的基因组DNA的前述(a)～(c)的碱基)的区域的碱基序列的核酸即可，即可以是来自受试者的基因组DNA也可以是mRNA。
mRNA中的各碱基的分型，既可以对mRNA直接进行分型，也可以使用通过mRNA逆转录反应而合成的cDNA进行分型。来自受试者的基因组DNA或mRNA，既可以是从采自受试者的生物试样中提取、纯化所得到的核酸，也可以是纯化前的核酸。并且，还可以是通过PCR等将来自受试者的基因组DNA或mRNA中的含有前述(a)和(b)的碱基的区域或含有前述(a)～(c)的碱基的区域进行扩增所得到的扩增产物。
本发明的判定方法中，对前述(a)～(c)的碱基的分型方法并没有特别限定，既可以是以桑格法(Sanger method)为基础的序列分析法，也可以是单碱基检测方法。作为单碱基检测方法，能够使用在基因的突变、多态性的检测等中所用的公知的各种方法，例如PCR-SSO(Polymerase chainreaction-sequence specific oligonucleotide，聚合酶链反应-序列特异性寡核苷酸)法、PCR-SSP(Polymerase chain reaction-sequence specific primer，聚合酶链反应-序列特异性引物)法或者对这些方法进行改变的方法等。PCR-SSO法，是使用与特定的等位基因进行特异性杂交的探针(等位基因特异性探针)而根据有没有形成与该探针的会合体来进行分型的方法。PCR-SSP法，是使用与特定的等位基因进行特异性杂交的引物(等位基因特异性探针)实施PCR并根据有没有PCR产物来进行分型的方法。作为对这些进行改变的方法，例如，可以举出Invader法或者Taqman探针法、QProbe法、Scorpion-ARMS法等。为了使检测灵敏度优良，优选为利用荧光进行检测的方法。为了使检测灵敏度和精度优良，优选诸如Invader法或Taqman探针法、QProbe法、Scorpion-ARMS法等的使用识别特定等位基因的探针或引物的方法。前述(a)～(c)的碱基的分型所用的探针或引物，例如，可基于碱基序列1或2并根据通常的方法进行设计、合成。
当采用序列分析法进行分型时，例如，如图3所示，以从受试者提取的基因组DNA或mRNA(下面有时简称为“基因组DNA”)作为模板，并使用对插入有前述(a)的碱基的区域进行扩增的PCR引物(图3中引物-1和引物-2)实施PCR，通过分析所得到的扩增产物的碱基序列，能够对前述(a)的碱基进行分型。同样，使用对插入有前述(b)和(c)的碱基的区域进行扩增的PCR引物(图3中引物-3和引物-4)实施PCR，通过分析所得到的扩增产物的碱基序列，能够对前述(b)和(c)的碱基进行分型。位于图3的(c)中的6个碱基，表示从上游开始的第437位碱基、第441位碱基、第443位碱基、第444位碱基、第447位碱基和第449位碱基。
作为引物-1～引物-4，只要是能够对包含前述(a)～(c)的各碱基的目的区域进行扩增的引物就没有特别限定。例如，可以举出由表8所示的碱基序列所构成的引物。此外，当通过序列分析法仅仅对前述(a)和(b)的碱基进行分型时，也可以使用对不含前述(c)的碱基并且含有前述(b)的碱基的区域进行扩增的PCR引物来实施PCR，并分析所得到的扩增产物的碱基序列。
表8
引物 碱基序列(5’→3’) 序列号
引物-1 AGGGTCGGGCGGGTCTCAGCCACT 3
引物-2 AACCGCACGAACTGCGTGTCGTCCACGTA 4
引物-3 TACGTGGACGACACGCAGTTCGTGCGGTT 5
引物-4 TCACCGGCCTCGCTCTGGTTGTAGTAG 6
另外，也可以通过组合序列分析法和单碱基检测法来进行碱基的分型。例如，也可以使用将前述(a)～(c)的碱基中的任一者与HLA-A*24组的等位基因进行特异性杂交的引物来实施PCR，并根据有没有PCR产物而进行分型，通过对剩余的碱基进行序列分析而进行分型。
此外，“与某个特定的等位基因进行特异性杂交的引物”并不限定于具有与作为靶标的等位基因完全互补的碱基序列的引物，只要是与其它等位基因相比优先和作为靶标的等位基因进行杂交的引物即可，也可以在与作为靶标的等位基因进行杂交的区域内含有1个～几个碱基的错配碱基。
本发明的HLA-A*24:02判定方法中，例如，也可以使用将前述(a)～(c)的碱基中的任一者与HLA-A*24:02进行特异性杂交的引物(HLA-A*24:02特异性引物)实施PCR，并根据有没有PCR产物进行分型，通过剩余碱基的序列分析进行分型。
例如，如图4所示，以从受试者提取的基因组DNA作为模板，使用与含有前述(c)的6个碱基的区域进行特异性杂交的引物(图4中引物-5)以及识别前述(b)的碱基的上游区域的引物(图4中引物-3)，实施PCR等的聚合酶延伸反应，检查有无PCR产物且分析该PCR产物的碱基序列，由此能够对前述(b)和(c)的碱基进行分型。前述(a)的碱基的分型，能够与图3同样地进行操作而实施。
在图3所示的分型方法的情况下，以基因组DNA中所含的HLA基因的大量等位基因作为模板来获得PCR产物。因此，当HLA基因是异型的情况下，对前述(a)～(c)的碱基而言，根据分型方法有时能对两种碱基进行分型，有时使用(a)～(c)的分型结果也会有错误判定。与此相比，如图4所示的分型方法，当用引物识别含有(c)的6个碱基的区域之后通过序列分析法等对(b)的碱基进行分型时，获得综合了(b)的碱基和(c)的碱基的结果。即，当使用特异性的引物扩增含有HLA-A*24:02的组时，即使基因组DNA是含有HLA-A*24:02的异型的情况下，通过仅检测(a)和(b)的碱基，就能够比图3的分型方法更高精度且更简便地判定HLA-A*24:02的分型。
作为引物-5，只要是能够与含有前述(c)的6个碱基中的至少一个碱基的区域进行特异性杂交的引物，就没有特别的限定。作为HLA-A*24:02特异性引物所用的引物，例如，可以举出由表9所示的碱基序列所构成的引物-5。表9中所示的引物-6～引物-8也与引物-5同样地，能够用作分型前述(c)的碱基的HLA-A*24:02特异性引物。
表9
引物 碱基序列(5’→3’) 序列号
引物-5 GGTTGTAGTAGCGGAGCGCGATCCG 7
引物-6 TAGCGGAGCGCGATCCGCAGG 8
引物-7 TAGCGGAGCGCGATCCGCAG 9
引物-8 CCTCGCTCTGGTTGTAGTAGCGGAGCGCTA 10
如图4所示，当根据有无PCR产物进行分型时，在无法获得PCR产物的情况下，难以判断其原因是作为模板的基因组DNA未包含HLA-A*24组，还是反应体系自身产生了问题。因此，优选使用以在基因组DNA未包含HLA-A*24组时一定获得PCR产物的方式设计的引物，并以该基因组DNA作为模板施行PCR。当采用本发明的HLA-A*24:02判定方法时，也同样优选使用以在基因组DNA未包含HLA-A*24时一定获得PCR产物的方式设计的引物，并以该基因组DNA作为模板施行PCR。作为以在通过用于对前述(c)的碱基进行分型的HLA-A*24:02特异性引物(即，与第437位碱基是C、第441位碱基是T、第443位碱基是G、第444位碱基是C、第447位碱基是T、第449位碱基是C的等位基因进行特异性杂交的引物)得不到PCR产物时一定获得PCR产物的方式设计的引物，例如，可以举出如表10所示的引物-9～引物-12。
表10
引物 碱基序列(5’→3’) 序列号
引物-9 GGTTGTAGTAGCCGCGCAGGGTCCC 11
引物-10 TAGCCGCGCAGGGTCCCCAGG 12
引物-11 TAGCCGCGCAGGGTCCCCAG 13
引物-12 CTCGCTCTGGTTGTAGTAGCCGCGCAGTG 14
通过将用于前述(a)～(c)的碱基分型的探针或引物进行试剂盒化，能够更简便地进行本发明的判定方法。例如，可将使图3所示的引物-1～引物-4组合而成的试剂盒作为HLA-A*24组判定用试剂盒。在本发明中，优选制成包含作为HLA-A*24:02特异性引物的引物-5的HLA-A*24组判定用试剂盒。包含HLA-A*24:02特异性引物的试剂盒，优选用于是否是HLA-A*24:02的判定中。
另外，在HLA-A*24组判定用试剂盒中，也优选包括用于从采自受试者的生物试样中提取、纯化核酸的试剂、器具等。
实施例
下面，通过描述实施例来具体说明本发明，但本发明并不局限于下述实施例。
[实施例1]
以采自HLA-A型是[A*24:02/A*24:02]同型、[A*24:02/A*24:08]的异型、[A*24:20/A*32:01]的异型以及[A*32:01/A*24:04]的异型的受试者的生物试样中提取的基因组DNA作为模板，使用表8所示的引物-1和引物-2实施PCR，以及使用引物-3和引物-4实施PCR，对各PCR产物进行了序列分析。
将序列分析的结果以及基于所得到的分型结果进行的判定结果示于表11中。在表中，分别地，“判定”栏的“+”是表示基因组DNA包含HLA-A*24:02的判定，“－”是表示基因组DNA不包含HLA-A*24:02的判定。其结果，[A*24:02/A*24:02]同型、[A*24:02/A*24:08]的异型和[A*32:01/A*24:04]的异型均得到了准确判定。另一方面，如推测的那样，[A*24:20/A*32:01]的异型是假阳性。
表11
(a) (b) (c) 类型 判定 正误
A*24:02/A*24:02 C G C + + 〇
A*24:02/A*24:08 A/C C/G C + + 〇
A*24:20/A*32:01 A/C C/G C － + ×
A*32:01/A*24:04 C C/G C/G － － 〇
[实施例2]
除了使用表9所示的引物-5代替引物-4以外，与实施例1同样地进行操作，以采自HLA-A型是[A*24:02/A*24:02]同型、[A*24:02/A*24:08]的异型、[A*24:20/A*32:01]的异型和[A*32:01/A*24:04]的异型的受试者的生物试样中提取的基因组DNA作为模板，实施PCR。其结果，基于使用了引物-3和引物-5的PCR，即使以任一基因组DNA作为模板均获得了PCR产物。因而，将全部受试者的基因组DNA分型为：第437位碱基是C、第441位碱基是T、第443位碱基是G、第444位碱基是C、第447位碱基是T、第449位碱基是C。在对各PCR产物进行序列分析时，如表12所示，得到与实施例8同样的判定结果。然而，当使用来自[A*32:01/A*24:04]的异型的基因组DNA时，在实施例1中(b)的碱基被分型为C和G两种，但在本实施例中(b)的碱基仅被分型为C一种。
表12
(a) (b) 类型 判定 正误
A*24:02/A*24:02 C G + + 〇
A*24:02/A*24:08 A/C C/G + + 〇
A*24:20/A*32:01 A/C C/G － + ×
A*32:01/A*24:04 C C － － 〇
工业实用性
通过本发明的判定方法，能够以良好的精度且更简便地判定HLA-A*24组的分型，因此，可利用于临床用基因诊断事业等领域中，特别是可利用于细胞或器官移植的HLA型判定中。

Claims (8)

1.一种HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，
以受试者的基因组DNA中的HLA基因的起始密码子的A腺嘌呤作为第1位，基于(a)第211位碱基和(b)第395位碱基的分型结果进行判定。
2.如权利要求1所述的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，
还基于选自由(c)第437位碱基、第441位碱基、第443位碱基、第444位碱基、第447位碱基和第449位碱基所组成的组中的一个以上碱基的分型结果进行判定。
3.如权利要求2所述的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，
对所述受试者的HLA型是否是HLA-A*24:02进行判定。
4.如权利要求3所述的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，
在至少一个等位基因中，当第211位碱基是C胞嘧啶、第395位碱基是G鸟嘌呤、第437位碱基是C、第441位碱基是T胸腺嘧啶、第443位碱基是G、第444位碱基是C、第447位碱基是T、第449位碱基是C时，判定所述受试者的HLA型是HLA-A*24:02。
5.如权利要求1～4中任一项所述的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，
采用序列分析方法或者单碱基检测方法进行所述(a)和(b)的碱基的分型。
6.如权利要求2～5中任一项所述的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，
采用序列分析方法或者单碱基检测方法进行所述(c)的碱基的分型。
7.如权利要求2～5中任一项所述的HLA-A*24组的判定方法，其特征在于，
当通过使用由序列号7表示的碱基序列构成的引物的聚合酶进行的延伸反应获得了延伸产物时，将所述(c)的碱基分型为第437位碱基是C、第441位碱基是T、第443位碱基是G、第444位碱基是C、第447位碱基是T、第449位碱基是C。
8.一种HLA-A*24:02判定用试剂盒，其特征在于，包含由序列号7表示的碱基序列构成的HLA-A*24:02的判定用引物。
CN201280064968.XA 2011-12-28 2012-12-28 Hla-a*24组的判定方法 Pending CN104024410A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2011-289336 2011-12-28
JP2011289336 2011-12-28
PCT/JP2012/084130 WO2013100139A1 (ja) 2011-12-28 2012-12-28 Ｈｌａ－ａ*２４グループの判定方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN104024410A true CN104024410A (zh) 2014-09-03

Family

ID=48697616

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201280064968.XA Pending CN104024410A (zh) 2011-12-28 2012-12-28 Hla-a*24组的判定方法

Country Status (6)

Country Link
US (1) US20150132752A1 (zh)
EP (1) EP2808385A4 (zh)
JP (1) JP6233022B2 (zh)
CN (1) CN104024410A (zh)
SG (1) SG11201403630RA (zh)
WO (1) WO2013100139A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399503A (zh) * 2016-09-20 2017-02-15 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 用于检测AEDs引起的SJS/TEN的引物、试剂盒及方法
CN109097463A (zh) * 2018-09-15 2018-12-28 西北大学 一种用于检测hla-a*24:02等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及检测方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1954084A (zh) * 2004-03-24 2007-04-25 博康有限公司 用于分析人类白细胞抗原(hla)基因型的寡聚核苷酸组合物及其检测方法
JP2009528060A (ja) * 2006-02-27 2009-08-06 ジェノミックス ユーエスエイ 集団ｈｌａタイピングとその使用

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2300369A1 (en) * 1997-08-11 1999-02-18 Visible Genetics Inc. Method and kit for hla class i typing dna
US7205104B2 (en) * 2000-03-24 2007-04-17 Eppendorf Array Technologies Sa (Eat) Identification of biological (micro) organisms by detection of their homologous nucleotide sequences on arrays
EP1536021A1 (en) * 2003-11-27 2005-06-01 Consortium National de Recherche en Genomique (CNRG) Method for HLA typing
JP4416497B2 (ja) * 2003-12-25 2010-02-17 キヤノン株式会社 Ｈｌａ−ａアレルを同定するためのプローブセット及び特定方法
US8969254B2 (en) * 2010-12-16 2015-03-03 Dana-Farber Cancer Institute, Inc. Oligonucleotide array for tissue typing

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1954084A (zh) * 2004-03-24 2007-04-25 博康有限公司 用于分析人类白细胞抗原(hla)基因型的寡聚核苷酸组合物及其检测方法
JP2009528060A (ja) * 2006-02-27 2009-08-06 ジェノミックス ユーエスエイ 集団ｈｌａタイピングとその使用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
K. WITTER 等: "A novel A*24 allele, A*2442, was detected through routine bone marrow donor screening", 《TISSUE ANTIGENS》, vol. 65, 31 December 2005 (2005-12-31) *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106399503A (zh) * 2016-09-20 2017-02-15 深圳荻硕贝肯精准医学有限公司 用于检测AEDs引起的SJS/TEN的引物、试剂盒及方法
CN109097463A (zh) * 2018-09-15 2018-12-28 西北大学 一种用于检测hla-a*24:02等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及检测方法
CN109097463B (zh) * 2018-09-15 2021-08-06 西北大学 一种用于检测hla-a*24:02等位基因的特异性引物探针组合、试剂盒及检测方法

Also Published As

Publication number Publication date
WO2013100139A1 (ja) 2013-07-04
JPWO2013100139A1 (ja) 2015-05-11
JP6233022B2 (ja) 2017-11-22
SG11201403630RA (en) 2014-10-30
EP2808385A1 (en) 2014-12-03
EP2808385A4 (en) 2015-08-26
US20150132752A1 (en) 2015-05-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gettings et al. A 50-SNP assay for biogeographic ancestry and phenotype prediction in the US population
US9562269B2 (en) Haplotying of HLA loci with ultra-deep shotgun sequencing
CN103221551B (zh) Hla基因型别-snp连锁数据库、其构建方法、以及hla分型方法
CN104520443A (zh) 使用序列标签的序列确定方法
CN105385755A (zh) 一种利用多重pcr技术进行snp-单体型分析的方法
CN104293946A (zh) 单核苷酸多态性rs663743在检测麻风病易感基因中的应用
CN104293952A (zh) 单核苷酸多态性rs10817758在检测麻风病易感基因中的应用
CN105463116A (zh) 一种基于20个三等位基因snp遗传标记的法医学复合检测试剂盒及检测方法
Fuller et al. Extensive recombination suppression and epistatic selection causes chromosome-wide differentiation of a selfish sex chromosome in Drosophila pseudoobscura
CN110541041B (zh) 与中国家马矮小性状相关的snp标记及其应用
CN106939334B (zh) 一种孕妇血浆中胎儿dna含量的检测方法
CN104024410A (zh) Hla-a*24组的判定方法
CN103290108A (zh) 一种线粒体snp荧光标记复合扩增试剂盒及其应用
CA2909479A1 (en) Method of determining the fraction of fetal dna in maternal blood using hla markers
JP2013236627A (ja) Ｙ染色体及びｙ染色体上精子形成領域の欠失部位の分析方法
CN113621696B (zh) 一种用于检测高原适应性的snp标志物及试剂盒
CN114657269A (zh) 一组高效能常染色体微单倍型遗传标记以及用于检测该组遗传标记的引物组
CN104531850B (zh) 一种检测slc26a4基因突变的试剂盒及其应用
CN109280697B (zh) 利用孕妇血浆游离dna进行胎儿基因型鉴定的方法
CN110423826A (zh) 一种c57bl/6亚系小鼠kasp遗传检测试剂盒及引物
CN102605052B (zh) 一种聋病易感基因GJB2 235delC荧光检测试剂盒及其应用
JP6245796B2 (ja) 原発性胆汁性肝硬変の発症リスク予測マーカー、プローブ、プライマー及びキット並びに原発性胆汁性肝硬変の発症リスク予測方法
CN115927661A (zh) 一种鉴别肉鸡黄皮肤性状的snp分子标记及其在检测鸡黄色皮肤性状上的应用
CN105861707B (zh) 与早产发生相关的IL-1β基因多态性及其检测方法
CN113136436A (zh) 大鼠遗传背景相关snp及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20140903